FI59925B - Foerfarande foer framstaellning av ett bakteriepreparat anvaendbart foer foerhindrande av salmonellainfektion hos fjaederfae - Google Patents

Description

(g) SUOMI—FINLAND patenttijulkaisu—patentskrift 59925

Kv Ikkt Cl3 AJ ,61 K 35/74/ C 12 N V20 ® (a) Kv.ik7int.cr // c 12 r 1/225 ~ (g) Patenttihakemus — Patentansökning 800077 #53jnr Ä (g) Hakemispäivä — Ansöknlngsdag 11.01.80 ® Alkupäivä — Glltlghetsdag 11.01.80 (g) Tullut julkiseksi — Bllvlt offentllg 12.07-81 @ Nähtäväksi panon Ja kuul.julkalsun pvm.—

Ansökan utlagd och utl.skrlften publicerad 31.07.81

Patentti- ja rekisterihallitus ® Patenttl myönnetty-Patent meddelat 10.11.8l

Patent- och registerstyrelsen @@(g) Pyydetty etuoikeus — Begärd prloritet (73) Farmos-Yhtymä Oy, PL U25, 20101 Turku 10, Suomi -Finland. (FI) (72) Esko Viljo Nurmi, Helsinki, Carita Elisabeth Schneitz, Helsinki,

Pirjo Helena Mäkelä, Helsinki, Suomi-Finland(FI) (5U) Menetelmä siipikarjan salmonellainfektioita ehkäisevän bakteeripre-paraatin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av ett bak-teriepreparat användbart för förhindrande av salmonellainfektion hos fjäderfä

Siipikarja muodostaa huomattavimman ihmisten salmonellatartuntojen lähteen. Kanadassa on laskettu, että 77 % ihmisen salmonelloositapauksista oli siipikarjasta peräisin (B.J.Finn ja B.Mehr, Proceedings of the International Symposium on Salmonella and Prospects for Control; Ontario,

Canada 1977). Suomessa tämä on todettu erityisen selvästi 1970-luvulla.

Vuonna 1971 alkoi maassamme laaja salmonellaepidemia broilereissa yleisimmän salmonellatyypin ollessa S. infantis. Epidemia aiheutti suuria taloudellisia tappiolta kasvattamoille sekä teurastamoille. Yli satatuhatta lintua on jouduttu hävittämään ihmisravinnoksi kelpaamattomina ja satojatuhansia kuumentamaan ennen markkinointia, mikä vähentää niiden myyntiarvoa. Vastaavasti vuodesta 1971 lähtien ovat S. infantiksen aiheuttamat ihmissalmonella tapaukset olleet toiseksi yleisimmät. Vuonna 1972 todettiin noin viidensadan ihmisen sairastuneen S. infantiksen aiheuttamaan suolistoinfektioon. Saastuneet broilerit aiheuttivat siten vakavan kansanterveydellisen ja -taloudellisen probleeman.

- 2 - 59925

Ruotsissa, jossa vastustetaan, kuten meilläkin, valtiovallan toimesta lakiperäisesti siipikarjan salmonellatartuntoja, joudutaan hävitetyistä poikasista korvaamaan kasvattamoille vuosittain yli kymmenen miljoonaa kruunua. Kanadassa on aivan viime aikoina esitetty, että siipikarjan salmonellatartunnat muodostavat erittäin suuren kansanterveydellisen riskin. Sekä ihmis- että elälntartunnoista aiheutuvat tappiot ovat n. 30 miljoonaa dollaria vuodessa. USArssa tappioiksi arvioidaan yli 300 miljoonaa dollaria vuodessa.

Salmonellatartuntoja vastustetaan perinteisesti valvomalla bakteriologisin näyttein eläinten rehuja, eläinten pitopaikkojen hygieniaa, suorittamalla teurastuksen valvontaa sekä myynnissä olevien elintarvikkeiden bakteriologista tutkimusta. Näillä menetelmillä voidaan salmonellatilanne pitää kohtalaisen hyvin valvonnassa useilla kotieläimillä.

Siipikarja ja erityisesti joukkokasvatuksen tuote, broileri, tekevät poikkeuksen. Valtion eläinlääketieteellisessä laitoksessa suoritetuissa tutkimuksissa todettiin, että todennäköisenä syynä broilereitten suureen herkkyyteen salmonellojen kolonlsoitumiseen (lisääntymiseen ja kiinnittymiseen) suolistossa oli normaalin suollstoflooran kehittymisen viivästyminen, mikä johtuu nykyaikaisista eläinten joukkokasvatusmenetelmistä (E. Nurmi ja M. Rantala, Nature 241, 210-211, 1973).

Mainittu tutkimus antoi aiheen selvitellä aivan uusia mahdollisuuksia ehkäistä siipikarjan salmonellatartuntoja aivan nuorilla poikasilla. Todettiin, että aikuisen kanan suolistosta rikastettu bakteerisoluviljelmä annettuna 1-2 vrk:n ikäisille poikasille ehkäisi salmonellojen kiinnittymisen ja lisääntymisen suolistossa. Menetelmän teho on ollut hyvä laboratorioissa suoritetuissa pienryhmäkokeissa ja myös lupauksia antava suurissa kenttäkokeissa. Menetelmän haittana ja sen käytön esteenä laajalti eri maissa on ollut se, että valmisteen koostumusta ei tunneta. Valmistetta ei pystytä standardisoimaan eikä säilyttämään koostumukseltaan ja teholtaan muuttumattomana. Koska valmisteen viljely aloitetaan aina aikuisen kanan suolen sisällöstä, voi se sisältää poikasten terveydelle haitallisia tai vaarallisia viruksia, bakteereita ja loisia.

- 3 - 59925

Eurooppalaisessa patenttihakemuksessa EPÄ 0006695 kuvataan siipikarjan salmonellainfektiota ehkäisevää bakteeripreparaattia. Oleellisilta osiltaan tämä patenttihakemus nojautuu yllä mainittuun tutkimustulokseen.

Ainoat erot ovat siinä, että bakteerisoluviljelmästä, joka on lähtöisin aikuisen kanan suoliston sisällöstä, on poistettu patogeenisiä bakteereita ja bakteerisoluviljelmä on lopuksi käsitelty preparaattimuotoon esim. kylmäkuivaarnalla.

Ruotsalainen patenttihakemus n:o 6913996-2 (kuulutusjulkaisu n:o 371209) kuvaa menetelmän porsaiden ja vasikoiden suolistoinfektion estämiseksi tarkoitetun Streptococcus faecium -bakteeripreparaatin valmistamiseksi.

Englantilainen patentti n:o 1 208 599 kuvaa menetelmän Lactobacillus-bakteeripreparaatin valmistamiseksi, jolloin suolistosta lähtöisin olevia bakteereja viljellään mahdollisesti suoliston limakalvon kanssa.

Englantilaisessa patentissa n:o 1 167 196 kuvataan suolistoinfektioita estävän Lactobacillus-preparaatin valmistusta siten, että suoliston sisältöä pidetään happamessa liuoksessa, jolloin haitalliset bakteerit kuolevat. Eloonjääneet Lactobacillus-bakteerit erotetaan ja viljellään preparaatiksi. Preparaattia syötetään ihmiselle tai eläimelle, jonka jälkeen suoliston sisältö otetaan talteen ja eristetään Lactobacillus-bakteerit .

U.S.-patentti n:o 3 953 609 kuvaa menetelmää Lactobacillus lactis-lajiin kuuluvan tietyn biotyypin käyttämiseksi eläinten suolistoinfektioiden ehkäisemiseksi.

Näissä patenteissa ei ole kuitenkaan esitetty mitään hyvää bakteeripreparaattia siipikarjan suolistoinfektioiden estämiseksi. Tällaiset preparaatit eivät ole saavuttaneet laajempaa käyttöä, koska niiden ei ole todettu käytännössä suojaavan siipikarjaa tartunnoilta. Tulokset bakteerivalmis-teista sioilla ja vasikoilla ovat olleet jossain määrin parempia. Kaupallisten valmisteiden suurimpana puutteena on ollut se, että valmisteen bakteerit eivät ole säilyttäneet kykyään kiinnittyä suoliston limakalvoille.

- 4 - 59925

Myös antibiootteja ja kemoterapeutteja on käytetty salmonellainfektioiden ehkäisyyn ja hoitoon. Tästä menetelmästä on jouduttu luopumaan, koska näitä aineita ei voida antaa koko kasvatuskauden ajan teurastukseen asti. Tämän antotavan seurauksena todetaan jäämiä lihassa ja munissa, ja jäämiä sisältävää elintarviketta ei saa myydä ihmisravinnoksi. Katkaistu hoitomenetelmä antibiooteilla tai kemoterapeuteilla on taas haitallinen, koska nämä aineet tuhoavat myös normaalia suolistoflooraa, ja siten herkistävät eläimet tartunnoille hoidon loputtua.

Tämän keksinnön tarkoitus on aikaansaada bakteeripreparaatti, jolla voidaan tehokkaasti estää siipikarjan salmonellatartuntoja ja muita suolis-tohäiriöitä taloudellisesti edullisella tavalla.

Edellä esitetyillä bakteriologisilla valvontamenetelmillä, sekä rehun ja elintarvikkeiden pakollisella kuumentamisella tai hylkäämisellä voidaan ihmisten salmonellatartuntoja melko tehokkaasti ehkäistä. Menetelmät ovat kuitenkin siksi kalliita kansantaloudellisesti, että niitä ei voida oikeastaan missään maassa läpiviedä riittävän tehokkaasti. Kanadassa mm. todettiin vuonna 1977, että tunnetuilla menetelmillä maksaisi salmonellojen tehokas valvonta ja vastustus n. 300 miljoonaa dollaria. Saavutetun hyödyn laskettiin olevan 23 miljoonaa dollaria.

Kehitetty oheinen menetelmä on kustannuksiltaan erittäin edullinen. Sillä on todettu kokeissa voitavan estää, tai huomattavasti alentaa siipikarjan salmonellatartuntoja. Sillä ei ole aikaisemmin koemielessä käytetyn, koostumukseltaan tunnistamattoman valmisteen haittoja ja terveydellisiä vaaroja, vaan se koostuu tunnetuista puhdasviljelmistä ja se voidaan standardisoida.

Suoritetuissa tutkimuksissa todettiin, että tehokkaan preparaatin aikaansaamiseksi on välttämätöntä, että viljelyyn valitaan juuri sellaisia bakteerikantoja, joilla on hyvä kyky kiinnittyä ruuansulatuskanavan pinta-epiteeliin. Näin aikaansaadussa bakteeripreparaatissa on siten valtaosa bakteereista sellaisia, jotka kiinnittyvät hyvin eläimen ruuansulatuskanavan pintaepiteeleihin.

-5- 59925

Tunnusomaista keksinnönmukaiselle menetelmälle on seuraavaa:

Preparaatin viljelyyn käytetään bakteerikantoja, jotka ovat luonnollisesti ruuansulatuskanavassa esiintyviä bakteerilajeja. Bakteerikantoja viljellään joko erillään tai yhdessä sinänsä tunnetulla tavalla anaerobisissa olosuhteissa mahdollisesti siipikarjayksilön ruuansulatuskanavan, lähinnä kuvun, pintaepiteelisolujen kanssa. Viljelyn jälkeen bakteerit erotetaan kasvatusliemestä ja käsitellään preparaatiksi, esim. kylmäkui-vaamalla.

Olennaista on se, että preparaatti valmistetaan oleellisesti vain sellaisista bakteerikannoista, joilla on esimerkiksi jonkin tunnetun kiin-nittymistestin avulla todettu olevan hyvä kyky kiinnittyä siipikarjayksi-18n ruuansulatuskanavan pintaepiteelisoluihin. Jos käytetään esim.

Fullerin kilnnittymistestiä (Fuller R, J.Appl.Bact. 36, 1973, 131-139), valitaan preparaattiviljelyyn oleellisesti vain sellaisia bakteerilajeja, joiden kiinnittyrniskyky on vähintään 10 bakteeria epiteelisolua kohti.

Varsin hyvään tulokseen päästään, jos käytetään useita bakteerikantoja.

Sopivien bakteerikantojen eristäminen voidaan suorittaa esim. seuraavasti: Täysikasvuisen siipikarjayksilön ruuansulatuskanavasta poistetaan sen sisältö mekaanisesti, jonka jälkeen se puhdistetaan oleellisesti vapaaksi irtonaisista ja heikosti kiinnittyneistä bakteereista, esim. pesemällä puskuroidulla keittosuolaliuoksella. Puhdistettu ruuansulatuskanava tai joku sen osa, erityisesti kupu tai umpisuoli, jäljelle jääneine, kiinnit-tyneine bakteereineen hienonnetaan, laimennetaan sopivasti ja viljellään. Edullisesti viljely suoritetaan pintaviljelynä erityiselatusai-neella, joka on selektiivinen Lactobacillus- ja Clostridium-bakteereiden suhteen. Tämän jälkeen testataan tunnetulla menetelmällä viljeltyjen bakteerikantojen kiinnittymiskyky pintaepiteelisoluihin, ja valitaan preparaatin valmistusta varten hyvin kiinnittyviä bakteerikantoja.

Näiden bakteerikantojen hyvän kiinnittymiskyvyn tehostamiseksi tai säilyttämiseksi ne voidaan haluttaessa syöttää siipikarjayksilölle ja eristää siitä uudestaan toistamalla yllä mainitut toimenpiteet.

- 6 - 59925

Hyvin kiinnittyneitä bakteerikantoja voidaan myös ylläpitää viljelemällä niitä yhdessä siipikarjayksilön ruuansulatuskanavan, erityisesti kuvun, pintaepiteelisolujen kanssa.

Keksinnönmukaisen preparaatin valmistusta sekä sen käyttöä broilereiden salmonellainfektioita ehkäisevänä aineena kuvataan lähemmin seuraavissa esimerkeissä. Vaikka esimerkeissä on käsitelty ainoastaan broilereissa havaittua vaikutusta, voidaan preparaattia käyttää hyväksi yleisesti siipikarjataloudessa.

Esimerkki 1 kuvaa bakteeripreparaatin valmistusta ja poikaskokeet n:o 1-5 preparaatin terapeuttista vaikutusta.

Esimerkki 1

Bakteeripreparaatin valmistus.

Täysikasvuisen kukon tai kanan kupu ja/tai umpisuoli poistetaan,aukaistaan aseptisesti ja puhdistetaan mekaanisesti. Tämän jälkeen kupu ja/tai umpisuoli pestään neljä kertaa 100 ml:esa puskuroitua keittosuolaliuosta, jonka koostumus on (Fuller and Turvey, 1971):

NaCl 8,0 g K2HP04 1,21 g KH2P04 0,34 g tislattua vettä 1000 ml Tämän pesun avulla poistetaan irtonaisia ja heikosti kiinnittyneitä bakteereita. Tämän jälkeen kupu ja/tai umpisuoli kiinnittyneine bakteerei-neen hienonnetaan yllä mainittuun suolaliuokseen käyttäen tavanomaista mikrobiologisen näytteen homogenoimistekniikkaa. Näin saadusta homoge-naatista tehdään laimennussarja laimennuslluokseen, joka on muunnos Virginia Polytechnic Institute'n käsikirjassa esitetystä laimennusliuok-sesta.

59925 - 7 - Käytetyn Laimennusliuoksen koostumus on gelatiinia 2,0 g K2HP04 4,105 g KH2P04 1,636 g tislattua vettä 1000 ml Tämän jälkeen suoritetaan pintaviljely LBS-maljoille käyttäen "Lactobacillus selective medium" -elatusainetta (Wadsworth Anaerobic Bacteriology Manual, 1975). Tämän elatusaineen koostumus on LBS-agaria (BBL) 8,40 g tomaattimehua 40,00 ml tislattua vettä 60,00 ml jääetikkaa 0,13 ml

Maljoja kasvatetaan 5 vrk + 35°C:ssa anaerobisissa olosuhteissa. Kasvatuksen loputtua maljoilta eristetään silmämääräisesti pesäkkeiden ulkonäköön perustuen sellaisia bakteerikantoja, joilla on todettu olevan hyvä kiinnittymiskyky kanan pintaepiteelisoluihin, esim. Fullerin esittämässä kiinnittymistestissä (Fuller R, J.Appl.Bact. 1973, 131-139). Valitut bakteerikannat kasvatetaan MRS-liemessä jaetaan pieniin eriin ja pakastetaan. MRS-liemen koostumus on seuraava: (de Man, Rogosa, Sharpe; 0X01D Ltd, Hampshire koodi CM 359) bakteriologinen peptoni 10,0 g/1 (Oxoid L34) 'lab lemco' lihauute (Oxoid L29) 8,0 hiivauute (Oxoid L21) 4,0 " dekstroosi 20,0 tween 80 1,0 ml/1 K2HPOA 2,0 g/1 natriumasetaatti x 3 1^0 5,0 triammoniumsitraatti 2,0 "

MgS04 x 7 H20 0,2 "

MnS04 x 4 H20 0,05 " pHcw» 6,2 •'v' »· ' ' - 8 - 59925

Fullerin testi suoritetaan seuraavasti: a) pintaepiteelisolususpension valmistaminen

Testissä käytetään 1-2 viikon vanhojen poikasten kuvun pintaepiteelisolu-ja. Poikasia pidetään 2 päivää pelkällä vedellä ennen lopettamista, jotta kupu puhdistuu osaksi bakteereista. Kupu poistetaan ja aukaistaan mahdollisimman aseptisesti. Tämän jälkeen se pestään 2 kertaa 100 ml:ssa puskuroitua keittosuolaliuosta. Pestyn kuvun pintaepiteelisuoluja raavitaan irti steriilillä peitinlasilla ja suspendoldaan ne noin 10 ml:aan puskuroitua keittosuolaliuosta; pintaepiteelisolususpension solutiheyden pitää olla noin 3,5 x 10^/0,4 ml.

b) bakteerisuspension valmistaminen

Bakteeri-puhdasviljelmiä kasvatetaan edullisesti hapettomassa tilassa 2 vrk +35°C:ssa. 10 ml kasvanutta bakteerisuspensiota sentrifugoidaan (10 min/2600 kierrosta). Sentrifugoinnin jälkeen liuos kaadetaan pois ja bakteerinappi suspendoldaan 10 ml:aan puskuroitua keittosuolaliuosta; bakteerisuspension solutiheyden pitää olla noin 1,5 x 10^/0,1 ml.

c) kiinnittyminen kuvun pintaepiteelisoluihin 0,4 ml:aan pintaepiteelisuspensiota lisätään 0,1 ml bakteerisuspensiota. Pintaepiteelisolu-bakteerisuspensiota inkuboidaan 30 min + 35°C:ssa solu-sekoittajassa, jonka pyörimisnopeus on 20 kierrosta minuutissa. Käytetty laite on HETO-merkkinen (FASEMOTORTYPE RD 12 x R; BIRKEROD, DENMARK).

Inkuboinnin loputtua tehdään tavallinen Gram-värjäyspreparaatti kiinnittymisen toteamiseksi. Gram-värjäyksessä pintaepiteelisolut värjäytyvät negatiivisesti ts. näkyvät punaisina ja bakteerisolut positiivisesti eli näkyvät tumman sinisinä. Kiinnittymisen voi todeta suoraan myös värjää-mättömästä preparaatista faasi-kontrastimikroekopiaa käyttäen.

V5V ' ‘ - 9 - 59925

Valikoidut kannat ovat tyypillisesti Lactobacillus acidophilus-, L.fermentum-, L.lactis- sekä eri Clostridium-lajeja. Kannat voidaan haluttaessa tunnistaa esim. API 50 Lactobacillus-testiä käyttäen (API system, La Balme-Les Grottes, France). Kantojen tunnistusta biokemiallisin menetelmin ei ole kuitenkaan välttämätöntä suorittaa. Oleellista keksinnön suorittamiseksi on vain se, että valikoidut kannat ovat hyvin kiinnittyviä. Kokenut mikrobiologi pystyy tunnistamaan hyvin kiinnittyvät kannat pesäkemorfologiansa perusteella. Kuvat 1 ja 2 ovat valomik-roskooppikuvia ja esittävät pintaepiteelisolun siihen kiinnittyneine bak-teereineen. Nämä kuvat havainnollistavat selvästi eron hyvin ja heikosti kiinnittyvien bakteerikantojen välillä. Kuva 1 esittää hyvin kiinnittyneen bakteerikannan ja kuva 2 esittää heikosti kiinnittyneen kannan.

Pakastetut bakteerikannat sulatetaan ja runsas siirros siirretään 10 ml:aan MRS-lientä tai VL-lientä (Barnes, E.M. ja Impey, C.S.,

Br.Poult.Sei., 11 , 1970, 467-481).

VL-liemen koostumus on seuraava: trypticase peptoni (BBL 11921) 10,0 g/1 hiivauute (Oxoid L 21) 5,0 lihauute (Oxoid 'lab lemeo' L 30) 3,0 agar 0,6

NaCl 5,0 " kysteiinihydrokloridi 0,4 glukoosi 2,5 pHw 7,2-7,4 Tässä esiherätysvaiheessa kantoja kasvatetaan erillään yli yön anaerobi-olosuhteissa + 35°C:ssa. Kasvatuksen jälkeen tehdään seossuspensio siten, että kutakin kantaa siirretään muutama tippa MRS-liemeen. Anaerobiolosuh-teissa tapahtuvan, kaksi vuorokautta kestävän kasvatuksen jälkeen bakteerit erotetaan kasvatusliemestä ja käsitellään preparaatiksi esim. kylmä-kuivaamalla. Bakteeripreparaatin voi valmistaa myös esiherättämättömistä kannoista. Tällöin pakastetut kannat sulatetaan ja niistä valmistetaan suoraan seossuspensio, jota kasvatetaan kuten edellä.

- 10 - 59925

Terapeuttisia kokeita:

Poikaskoe n:o 1*

Preparaatti valmistettiin kasvattamalla yhdessä 4 kukon kuvun ja 4 kukon umpisuolen seinämistä eristettyä Lactobacillus-kantaa edellä esitetyllä tavalla. Yksi kannoista oli Lactobacillus fermentum-lajia, yksi L. lactis ja kuusi L. acidophilus-lajia. Huonoimmln kiinnittyvän bakteerikannan kiinnittymisarvo oli noin 10 bakteeria/pintaepiteelisolu. Muiden valikoitujen bakteerisolujen arvot olivat korkeampia. Puhdasviljel-mät olivat esiherätettyjä. Bakteerisuspensiota annettiin 1 ml poikasta kohti letkulla suoraan kupuun. Poikaset olivat 1 vrksn vanhoja.

Salmonella infantista kasvatettiin 1 vrk lihaliemessä 35°C:ssa ja annettiin seuraavana päivänä noin 1000 kpl poikasta kohti letkulla suoraan kupuun. Viikon kuluttua poikaset tapettiin, ja umpisuoli ja osa ohutsuolta siirrettiin salmonella-rikastusliemeen, kasvatettiin 1 vrk 35°C:ssa ja viljeltiin enterobakteeri-erityisalustalla. 1 vrk 33°C:ssa kasvatuksen jälkeen mahdolliset salmonellapesäkkeet tunnistettiin tavanomaisin menetelmin.

Poikasryhmiä oli kaksi, hoitoryhmä ja salmonellakontrolliryhmä. Poikasia oli molemmissa ryhmissä 6 kpl.

Tulos: Hoitoryhmästä ei löytynyt yhtään salmonellatartuntaa saanutta poikasta, kun taas kontrolliryhmässä kaikki poikaset olivat saaneet tartunnan.

Poikaskoe n:o 2.

Preparaatti valmistettiin ja poikaskoe suoritettiin kuten kokeessa 1, paitsi että kokeessa 1 käytetyistä 8 bakteerikannasta valittiin 6 parhaiten kiinnittyvää, 4 kuvun ja 2 umpisuolen seinämästä eristettyä kantaa (kilnnlttymlearvon alaraja 20-30 bakteeria/pintaepiteelisolu). Kokeessa käytettiin 6 erilaista L. acidophilus-kantaa.

Tulos: Hoitoryhmästä ei löytynyt yhtään salmonellatartuntaa saanutta poikasta, kun taas kontrolliryhmässä viisi polkasta kuudesta oli saanut tartunnan.

- 11 - 59925

Poikaskoe n:o 3.

Preparaatti valmistettiin ja poikaskoe suoritettiin kuten kokeissa 1 ja 2, paitsi että kokeessa 2 käytetyistä 6 kannasta karsittiin edelleen 2 huonoimmin kiinnittyvää kantaa, jolloin jäljelle jäi 4 kantaa, 2 kuvun ja 2 umpisuolen seinämistä eristettyä kantaa. Näiden kantojen kiinnittymis-arvon alaraja oli 40-50 bakteeria/pintaepiteelisolu.

Tulos: Hoitoryhmästä ei löytynyt yhtään salmonellatartuntaa saanutta poikasta, kun taas kontrolliryhmässä kaikki poikaset olivat saaneet tartunnan.

Poikaskoe n:o 4.

Preparaatti valmistettiin ja poikaskoe suoritettiin kuten kokeessa 3, paitsi että puhdasviljelmiä ei esiherätetty. Samalla kokeiltiin puhdas-viljelmien kasvattamista erikseen 2 vrk 35°C:ssa ja yhdistämistä vasta juuri ennen poikasille antamista. Edelleen kokeiltiin pastöroidun (kuum.

10 min. 80°C:ssa) ja pastöroimattoman kupumassan stimuloivaa vaikutusta preparaatin tehoon. Kupumassa saatiin 6 vrk vanhojen 2 vrk pelkällä vedellä pidettyjen kananpoikien kuvuista pesemällä ne ennen hienontamista 5 kertaa 100 ml:ssa puskuroitua keittosuolaliuosta.

Ryhmät: I ryhmä: Puhdasviljelmät kasvatettu erikseen 2 vrk 35°C:ssa yhdessä pastöroidun kupumassan kanssa.

11 ryhmä: Puhdasviljelmät kasvatettu yhdessä 2 vrk 35°C:ssa, mukana pastöroitua kupumassaa.

III ryhmä: Samanlainen kuin I ryhmä, mukana pastöroimatonta kupumassaa.

IV ryhmä: Samanlainen kuin II ryhmä paitsi, että mukana pastöroimatonta kupumassaa.

V ryhmä: Puhdasviljelmät kasvatettu erikseen 2 vrk 35°C:ssa ja yhdis tetty juuri ennen poikasille antamista. Kasvatus ilman kupu-massaa.

. ► * I ’’ ' i - 12 - 59925 VI ryhmä: Samanlainen kuin V ryhmä paitsi, että kaikki kannat kasvatet tu yhdessä alusta asti.

VII ryhmä: salmonellakontrolliryhmä

Tulos:

RYHMÄT

Poikanen I II III IV V VI VII

1+ — — — + — + 2+--- + -- 3+___ + _ + 4+___ + _ + 5+--- + - + 6+--- + - +

Taulukossa + tarkoittaa salmonellatartunnan saanutta poikasta ja - sitä, ettei salmonellaa ole poikasesta löytynyt.

Suojavaikutus näkyy kaikissa ryhmissä (II, IV ja VI), joissa kiinnittyviä bakteereita on kasvatettu yhdessä.

Ryhmän III hyvä tulos johtunee siitä, että pastöroimattoman kupuma ssan mukana on tullut preparaatin tehoa parantavia bakteereita.

Poikaskoe n:o 5.

Preparaatti valmistettiin kasvattamalla täysikasvuisen kukon umpisuolen sisällöstä eristettyjä Clostridium-kantoja ja Lactobacillus-kantoja erikseen 2 vrk 35°C:ssa omissa elatusalustoissaan ja yhdistämällä ne juuri ennen poikasille antamista. Poikaskoe suoritettiin kuten edellä.

Tulos: Hoitoryhmässä kaksi poikasta kuudesta sai salmonellatartunnan, kun taas kontrolliryhmässä kaikki poikaset saivat tartunnan.

Salmonellan estymisen lisäksi on kaikissa poikaskoeryhmissä todettu yleisen terveydentilan parantuminen ja kasvun lisäys puhdasviljelmän käytön seurauksena.

Claims (3)

1. Menetelmä siipikarjan salmonellainfektioita ehkäisevän bakteeriprepa-raatin valmistamiseksi viljelemällä bakteerikantoja, jotka ovat täysikasvuisen siipikarjayksilön ruuansulatuskanavassa luonnollisesti esiintyviä bakteerilajeja, edullisesti Lactobacillus- ja mahdollisesti Clostridium-sukuun kuuluvia, joko erillään tai yhdessä sinänsä tunnetulla tavalla anaerobisissa olosuhteissa elatusaineella, johon on mahdollisesti lisätty siipikarjayksilön ruuansulatuskanavan, lähinnä kuvun, pintaepiteelisoluja ja erottamalla bakteerit viljelyn jälkeen kasvatusliemestä sekä käsittelemällä preparaatiksi, esim. kylmäkuivaa-malla, tunnettu siitä, että preparaattiviljelyyn valitaan vain sellaisia bakteerikantoja, joilla on niin hyvä kyky kiinnittyä siipikarjayksilön ruuansulatuskanavan pintaepiteelisoluihin, että niiden kiinnittymisarvo on vähintään 10 bakteeria epiteelisolua kohti Fullerin kiinnittymistestillä mitattuna.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että preparaattiviljelyyn valitaan vähintään 2, edullisesti 4-8 eri bakteerikantaa.

3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaikki preparaattiviljelyyn valikoidut kannat ovat Lactobacillus-sukua. . » , \