FI120877B - DNA-sekvens, som kodar ett A. thaliana-protein med delta-5,7-sterol, delta-7-reduktasaktivitet, dvs. delta-7-Red-protein, förfarande för framställning av detta, ändrade jäststammar samt tillämpningar - Google Patents

Claims (25)

1. Isolerad nukleinsyrasekvens, som innehäller en sekvens som kodar för ett sädant protein som har delta- 5 5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet, varvid nukleinsyran i fräga är DNA, med en nukleotidsekvens enligt sekvens SEQ ID nr 1, eller RNA.

2. Nukleinsyrasekvens enligt patentkrav 1, kän-netecknad av att nukleinsyran är cDNA.

3. DNA-sekvens enligt patentkrav 1, som kodar för ett sädant protein som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduk-tasaktivitet och som hybridiseras med sekvensen enligt patentkrav 1 i mellankrävande eller krävande förhällanden och som har med denna sekvens minst 60 %:s sekvensidenti- 15 tet.

4. DNA-sekvens enligt patentkrav 1, som kodar för ett sädant protein som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduk-tasaktivitet och som kan dupliceras med en PCR-teknik ge-nom användning av oligonukleotider som primers, vilka oli- 20 gonukleotider kodar för en konsensussekvens med aminosyra- sekvens SEQ ID nr 3: Leu Leu Xaa Xaa Gly Xrp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Tyr 15 10 15 25 väri Xaa i ställning 7 är Trp eller Tyr och Xaa i ställ-ning 12 är His eller Lys.

5. Isolerat A. thalianas protein som har delta-5, 7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet och med aminosyrasek-vens SEQ ID nr 2. 30 6.A. thalianas protein enligt patentkrav 5, om vilket används namnet delta-7-Red.

7. Isolerat A. thalianas protein enligt patentkrav 6 som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet och som har erhällits genom expression i en värdcell, som in- 35 nehäller en DNA-sekvens, som kodar för aminosyrasekvensen SEQ ID nr 2.

8. Isolerat protein som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet och med en aminosyrasekvens en-ligt sekvens SEQ ID nr 2.

9. Isolerat protein enligt patentkrav 8 som har 5 delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet och som har er- hallits genom expression i en värdcell, som innehäller en DNA-sekvens enligt nägot av patentkraven 1-4.

10. Protein enligt patentkrav 7 eller 9, k anne-tecknat av att värdcellen är jäst.

11. Expressionsvektor, som innehäller en DNA-sek vens enligt nägot av patentkraven 1-4.

12. Värdcell transformerad med en vektor enligt patentkrav 11.

13. Transformerad värdcell enligt patentkrav 12, 15 kännetecknat av att värden är jäst eller trädsvamp.

14. Förfarande för kloning av en nukleinsyra enligt nägot av patentkraven 1-4, som kodar för ett protein som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet, i en mikroorganism, kännetecknat av att följande steg 20 förverkligas: - sällningsförfarande genom användning av mikroor-ganismens resistens för nystatin eller en analog förening, vars toxicitet beror pä förekomsten av sädana steroler som är omättade i ställning C-7 25. analys av steroler med RP-HPLC och/eller gaskro- matografi - duplicering av en plasmid som härstammar frän en klon i E. coli.

15. Framställningsförfarande för ett sädant prote- 30 in som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet, kän netecknat av att en transformerad värdcell enligt 12 eller 13 odlas och det exprimerade proteinet isoleras.

16. Förfarande enligt patentkrav 15, kännetecknat av att värdcellen är transformerad jäst, i vil- 35 ken DNA-sekvensen som ska kodas är placerad under regiering av jästens promotor.

17. In vitro-reduceringsförfarande för omättad sterol frän ställning C-7, kännetecknat av att sterolen som ska reduceras inkuberas med proteinet som erhallits enligt patentkrav 15 eller 16 och eventuellt isoleras den 5 reducerade sterolen.

18. In vivo-reduceringsförfarande för omättad exo-gen sterol frän ställning C-7, kännetecknat av att sterol inkuberas med den transformerade värdcellen enligt patentkrav 12 eller 13 och eventuellt isoleras den erhäll- 10 na reducerade sterolen.

19. In vivo-reduceringsförfarande för omättad en-dogen sterol frän ställning C-7, kännetecknat av att den transformerade värdcellen enligt patentkrav 13 odlas och eventuellt isoleras den erhällna reducerade sterolen.

20. In vitro- eller in vivo-reduceringsf örfarande enligt nägot av patentkraven 17 - 19, kännetecknat av att den erhällna reducerade sterolen är ett substrat av ett enzym (P45oSCC) som bryter en sidokedja av kolesterol.

21. In vivo-reduceringsförfarande enligt patent- 2. krav 20, kännetecknat av att den endogena sterolen som ska reduceras är ergosta-5,7-dien-3-ol, ergosta-5,7,24(28)-trien-3-ol eller ergosta-5,7,22-trien-3-ol eller en blandning av dessa.

22. Framställningsförfarande för pregnenolon, kän-25 netecknat av att den trans f ormerade värdcellen enligt patentkrav 13 odlas, eventuellt isoleras en eller flera erhällna frän ställning C-7 reducerade endogena steroler, de reducerade sterolerna inkuberas i närvaro av P450SSC och eventuellt adrenodoxinreduktas (ADR) och adrenodoxin (ADX), 30 och eventuellt isoleras erhället pregnenolon.

23. Förfarande enligt patentkrav 22, kännetecknat av att värdcellen är jäst.

24. Framställningsförfarande för pregnenolon, kännetecknat av att jäst odlas, som hör tili s tammen

35 EC01/pCD63 (CNCM-depositionsnummer 1-1538) och som är trans-formerad med eller flera vektorer, som möjliggör att tili- sammans exprimeras A. thaliana delta-7Red-protein som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet, ooh P450SSC, ADR och ADX, och eventuellt isoleras fritt eller förestrat pregnenolon.

25. Transformerad jäststam med namnet EC01/pCD63 (CNCM-depositionsnummer 1-1538), som exprimerar tillsam-mans A. thaliana delta-7Red-protein som har delta-5,7-sterol-delta-7-reduktasaktivitet, P45oSSC; ADR och ADX och som ackumulerar fritt eller förestrat pregnenolon.