FI119973B - Painetta sietäviä kaasutäytteisiä mikrorakkuloita sisältävät pitkäikäiset, vesipitoiset dispersiot ja suspensiot ja näiden valmistusmenetelmät - Google Patents

Description

Painetta sietäviä kaasutäyttelsiä mikrorakkuloita sisältävät pitkäikäiset, vesipitoiset dispersiot ja suspensiot ja näiden valmistusmenetelmät 5 Tekniikan alue Tämä keksintö koskee kaasutäytteisten mikrorakkuloiden stabiileja dispersioita tai koostumuksia vesipitoisissa kantajanesteissä. Nämä dispersiot ovat yleensä käyttökelpoisia useimmissa Sovellutuksissa, joissa tarvitaan 10 homogeenisesti nesteisiin dispergoituneita kaasuja. Eräs merkittävä sovellutus tällaisille dispersioille on injek-tointi eläviin olentoihin, esimerkiksi ultraäänikaikuku-vausta ja muita lääketieteellisiä sovellutuksia varten* Keksintö koskee myös edellä mainittujen koostumusten väliä. mistusmenetelmiä mukaan lukien muutamat materiaalit, jotka liittyvät valmistukseen, esimerkiksi painetta kestävät kaasutäytteiset mikrokuplat, mikrokapselit ja mikropallot.

Keksinnön tausta

On hyvin tunnettua, että ilman tai kaasun mikrokap-20 paleet tai mikropalloset {tässä kutsuttu mikrorakkuloiksi), esim. mikrokuplat tai mikropallot, jotka on suspen-doitu nesteeseen, ovat poikkeuksellisen tehokkaita ultra-äänireflektoreita kaikukuvauksessa. Tässä esityksessä termi "mikrokupla" tarkoittaa spesifisesti onttoja pyörylöitä 25 tai pallosia, jotka on täytetty ilmalla tai kaasulla ja jotka on suspendoitu nesteeseen, mikä yleensä on saatu aikaan tuomalla nesteeseen ilmaa tai kaasua jaetussa muodossa, nesteen edullisesti sisältäessä myös pinta-aktiivi-siä aineita tai tensidejä pintaominaisuuksien ja kuplien 30 stabiiliuden kontrolloimiseksi. Termi "mikrokapseli" tai "mikropaIlo” tarkoittaa edullisesti ilma- tai kaasutäyt-teisiä kappaleita, joilla on aineellinen rajapinta tai kuori, so. polymeerimembraaniseinämä. Sekä mikrokuplat että mikropallot ovat hyödyllisiä ultraäänivarjoaineina. 35 Esimerkiksi injektoimalla elävän olennon verenkiertoon 2 ilmatäytteisten mikrokuplien tai mikropallojen (alueella 0,5 - 10 pm) suspensioita kantajanesteessä vahvistetaan merkittävästi ultraäänikaikukuvauksen kuvaa, siten auttaen sisäelinten visualisointia. Suonien ja sisäelinten kavauk-5 sella voidaan suuresti auttaa lääketieteellisen diagnoosin tekoa, esimerkiksi sydän- ja verisuonitautien ja muiden tautien havaitsemista.

Mikrokuplasuspen s i o i den muodostuminen injekt o itavassa kaikukuvaukseen sopivassa kantajanesteessä voidaan 10 saada aikaan vapauttamalla kaasu, joka paineen alaisena on liuotettu tähän nesteeseen tai generoimalla kaasumaisia tuotteita kemiallisen reaktion kautta tai lisäämällä nesteeseen liukenevia tai liukenemattomia kiinteitä aineita, jotka sisältävät ilmaa tai kaasua loukkuuntuneena tai ad-15 sorboituneena.

Esimerkiksi US-julkaisu 4 446 442 (Schering) kuvaa sarjaa erilaisia tekniikoita, joilla voidaan tuottaa kaa-sumikrokuplasuspensioita steriloidussa inj ektoitavassa kantajanesteessä käyttäen (a) tehsidiliuosta (pinta-aktii-20 visen aineen liuosta) kantajanesteessä (vesipitoinen) ja (b) viskositeettia suurentavaa liuosta stabiloijana. Kuplien aikaansaamiseksi kuvatut tekniikat sisältävät sen, että pakotetaan (a):n, (b):n ja ilman seos suurella nopeudella pienen reiän läpi? tai injektoidaan (a) (b);heh juu-25 ri ennen käyttöä yhdessä fysiologisesti hyväksyttävän kaasun kanssa; tai lisätään happoa (a):hän ja karbonaattia (b):hen ja molemmat komponentit sekoitetaan toisiinsa juuri ennen käyttöä, jolloin happo reagoi karbonaatin kanssa aikaan saaden C02-kuplia; tai lisätään ylipaineistettua 30 kaasua (a): n ja (b):n seokseen varastoinnin aikana, mainitun kaasun vapautuessa mikrokupliksi, kun seosta käytetään injektointiin.

EP-julkaisu 131 540 (Schering) kuvaa sellaisten mikrokuplasuspensioiden valmistusta, joissa stabiloitu 35 injektoitava kantajaneste, esim. fysiologinen vesipitoinen 3 suolaliuos, tai sokeriliuos, kuten maltoosin, dekstroosin, laktoosin tai galaktoosln liuos, sekoitetaan samojen sokerien kiinteisiin mikröpartikkelelhin (alueella 0,1 -1 pm), jotka sisältävät loukkuuntunutta ilmaa. Jotta pys-5 tyttäisiin kehittämään kuplasuspensip kantajanesteessä, sekä neste- että kiintöainekomponentteja ravistetaan yhdessä steriileissä olosuhteissa muutamien sekuntien ajan ja kun suspensio on tehty, se on käytettävä välittömästi, so. se pitää injektoida 5 - 10 minuutin sisällä kaikuku-10 vausmittauksia varten; koska kuplat ovat todellakin nopeasti haihtuvia, kuplakonsentraatio tulee liian alhaiseksi ollakseen käyttökelpoinen tuon ajan jälkeen.

Yritettäessä parantaa haihtumisongeimaa on kehitetty mikröpallot, so. mikrorakkulat, joilla on aineellinen 15 seinämä. Kuten aiemmin on sanottu, kun mikrokuplilla on vain ei-aineellinen tai helposti haihtuva kuori, so. niitä ympäröi vain nesteseinämä, jonka pintajännitystä on modifioitu pinta-aktiivisen aineen läsnäololla, mikropalloilla tai mikrokapseleilla on kouriintuntuva kuori, joka on teh-20 ty todellisesta materiaalista, esim. polymeerimembraanis- ta, jolla on määrätty mekaaninen lujuus. Toisin sanoen, ne ovat aineellisia mikrorakkuloita, jossa ilma tai kaasu on enemmän tai vähemmän tiiviisti kapseloituna.

Esimerkiksi US-julkaisu 4 276 885 (Tickner et ai.) 25 kuvaa sellaisten pintamembraanimikrokapseleiden käyttöä, jotka sisältävät kaasua ultraäänikuvien parantamiseksi membraanin sisältäessä monenlaisia myrkyttömiä orgaanisia molekyylejä, jotka eivät aiheuta vasta-aineenmuodostusta. Kuvatussa muodossa näillä mikrokuplilla on gelatiinimem-30 braani, joka vastustaa yhteensulautumista ja niiden edullinen koko on 5 - 10 pm. Näiden mikrokuplien membraanin on sanottu olevan riittävän stabiili kaikukuvausmittausten tekemiseen.

US-julkaisu 4 718 433 (Feinstein) kuvaa ilmatäyt-35 teisiä mikropalloja, joissa ei ole gelatiinia. Nämä mikro- 4 rakkulat on tehty sonikoimalla (5 - 30 kHz) proteiini-liuoksia, kuten 5 %:sta seerumialbumixnia, ja niiden halkaisijat ovat välillä 2 - 20 pm, pääosin 2 - 4 pm. Mikrorakkulat stabiloidaan denaturoimalla mambraanin muodostava 5 proteiini sonikaation jälkeen, esimerkiksi käyttämällä lämpöä tai kemiallisin keinoin, esim. reaktiolla formaldehydin tai glutaarialdehydin kanssa. Tällä tekniikalla saatujen stabiilien mikrorakkuloiden konsentraation on sanottu olevan noin 8 x 106/ml alueella 2 - 4 pm, noin 106/ml 10 alueella 4 - 5 pm ja vähemmän kuin 5 x 105 alueella 5 -6 pm. Näiden mikrorakkuloiden stabiilius-ajan. on sanottu olevan 48 tuntia tai pidempi, ja ne mahdollistavat tarkoituksenmukaisen sydämen vasemman puoliskon kuvauksen laski-monsisäisen injektion jälkeen. Esimerkiksi, kun sonikoitu-15 ja albumiinimikrokuplia injektoidaan ääreislaskimoon ne kykenevät kulkemaan keuhkojen läpi. Tämä johtaa vasemman kammion onkalon samoin kuin sydänlihaskudosten varjostuuliseen sydämen kaikukuvauksessa.

Äskettäin EP-julkaisu 324 938 (Widder) on rapor-20 toimit injektoitavista vielä edelleen parannetuista mikro-palloista ultraäänikaikukuvausta varten. Tässä dokumentissa on kuvattu suuria konsentraatioita (yli 108/ml) ilma-täytteisiä proteiinilla ympäröityjä mikrorakkuloita, jotka ovat pienempiä kuin 10 pm ja joiden elinaika on useita 25 kuukausia tai enemmän. Näiden mikropallojen vesisuspensioita on tuotettu lämmöllä denaturoitujen proteiinien, esim. ihmisen seerumialbumiinin, liuosten ultraäänikavi-taatiolla, joka toimenpide johtaa myös jonkin asteiseen membraanin muodostavan proteiinin vaahtoutumiseen ja sen 30 kovettumiseen jatkossa lämmön vaikutuksesta. Muidenkin proteiinien, kuten hemoglobiinin ja kollageenin, on sanottu olevan sopivia tähän menetelmään. EP-julfcaisussa 324 938 kuvattujen mikropalipsuspensioiden hyvä varastoin-tistabiilius mahdollistaa sen, että niitä voidaan markki-35 noida sellaisenaan, so. kantajanestefaasin kanssa, mikä on 5 vahva kaupallinen etu, koska valmistusta ennen käyttöä ei enää tarvita.

Samanlaisia etuja on äskettäin löydetty vesipitoisten mikrokuplasuspensioiden valmistuksen yhteydessä, so.

5 on keksitty varastointistabiili, kuiva pulverimainen koostumus, joista saadaan pitkäikäisiä kuplasuspensioita vettä lisäämällä. Tätä kuvataan hakemuksessa PCT/EP 91/00 620, jossa liposomejä sisältävät membraanin muodostavat lipidit on pakastekuivattu ja pakastekuivatut lipidit, oltuaan 10 jonkin aikaan alttiina ilmalle tai kaasulle, tuottavat pitkäikäisiä kuplasuspensioita, kun niihin yksinkertaisesti lisätään vesipitoinen kantaj aneste.

Huolimatta monista edistysaskelista vesipitoisten mikrokuplasuspensioiden varastointistabliliuden paranta-15 misessa, tapahtuipa varastointi sitten esiastevaiheessa tai lopullisessa valmistusvaiheessa, on edelleen jäänyt Ongelmaksi rakkuloiden kestävyys, kun suspensiot ovat joutuneet ylipaineeseen, esim. sellaisissa paineen vaihteluissa, joita tapahtuu, kun injektio on annettu potilaan 20 verenkiertoon, ja jatkossa sydämenlyöntien seurauksena, erityisesti vasemmassa kammiossa. Itse asiassa tämän keksinnön tekijät ovat havainneet, että paineen vaihtelut esimerkiksi nukutetuissa kaneissa eivät ole riittävän suuria, jotta ne oleellisesti muuttaisivat kuplamäärää jonkin 25 aikaa injektion jälkeen. Sitä vastoin koirissa ja ihmispo- j tilaissa tyypilliset mikrokuplat tai mikropallot, jotka on täytetty tavallisilla kaasuilla, kuten ilmalla, metaanilla tai C02:lla, menevät kasaan täydellisesti joidenkin sekuntien sisällä injektion antamisesta verenpaineen vaikutuk-30 sen takia. Tämän havainnon ovat muut vahvistaneet:: Esimerkiksi, S. Gottlieb et ai., J. Am. Soc. of Echocardiography 3 (1990) 238, ovat raportoineet, että sonikaatiomenetel— mällä valmistetut ristisidotun albumiinin mikropailot menettivät kaikki kaikukuvausominaisuutensa, kun ne joutui-35 vat 60 torrin ylipaineeseen. Siten tuli tärkeäksi ratkais- ! :6 ta ongelma ja lisätä mikrokuplien ja membraanilla ympäröityjen mikpöpallojen käyttökelpoista elinaikaa paineen alla, jotta voitaisiin varmistaa se, että kai kukuvausmit tanks et voitaisiin tehdä in vivo turvallisesti ja toistettavasti.

5 Tässä vaiheessa on syytä mainita, että on ehdotettu toisenlaistakin ryhmää kaikukuvausta parantavia aineita, jotka sietävät ylipainetta, koska ne koostuvat yksinkertaisista mikropyörylöistä, jotka ovat rakenteeltaan huokoisia, huokosten sisältäessä ilmaa tai kaasua. Tällaisia mikropyö-10 rylöitä kuvaavat esimerkiksi W0-A-91/12 823 (Delta Biotechnology) , EP~julkaisu 327 490 (Schering) ja EP-julkaisu 458 079 (Hoechst) . Yksinkertaisten huokoisten mikropyöry-löiden haittana on se, että sisälle jäävä: kaasutäytteinen vapaa. tila. on yleensä liian pieni hyvän kaikukuvausvasteen 15 aikaansaamiseksi ja pyörylöiltä puuttuu tarpeellinen elastisuus, Siten yleensä onttoja mikrorakkuloita pidetään edullisempina: ja sen vuoksi niiden kokoonpuristumisongelmaa tutkittiin.

Keksinnön kuvaus 20 Tämä ongelma on nyt ratkaistu käyttämällä varjo ainetta ultraäänikaikukuvausta varten, joka varjoaine käsittää suspensiona vesipitoisessa nestekantajafaasissa mikrorakkuloita, jotka on täytetty kaasulla tai kaasuseoksel-la, jotka mikrorakkulat ovat joko mikrokuplia, joissa on 25 aineeton tai haihtuva kuori, eli niitä ympäröi vain neste-seinä, jonka pintajännitystä modifioidaan pinta-aktiivisen aineen läsnäololla, tai mikropalloja, joita rajoittaa orgaanisesta polymeetimembräänistä tehty aineellinen kuori. Varjoaineelle on tunnusomaista, että kaasuseos käsittää vä-30 hintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää halogenoitua hii-livetykaasua tai stabiilia fluorattua kalkogenidia, jonka vesiliukoisuuden, ilmaistuna kaasulitroina vesilitraa kohden standardiolosuhteissa, suhde molekyylipainon neliöjuureen, daltoneina, on alle 0,0027, lukuun ottamatta mikro-3:5 palloja, jotka käsittävät SFe:a tai ,GF4fä ja joilla on ei-proteiinipitoisista silloitetuista tai poiymeroiduista am- 7 fifiilisistä ryhmistä muodostunut kuori tai biohajoavilla siiloa, tusryhmillä silloitetusta proteiinista muodostunut kuori,

Lyhyesti sanoen, on havaittu, että kun käikukuvauk-5 seen soveltuvat mikrorakkulat, jotka on tehty kaasun läsnä ollessa, vastaavasti täytetään ainakin osittain kaasulla, jonka fysikaaliset ominaisuudet vastaavat alla olevaa yhtälöä, mikrorakkulat pystyvät silloin merkittävästi sietämään > 60 torrin painetta injektoinnin jälkeen riittävän ajan, 10 jotta voidaan tehdä toistettavia kalkukuvausmittauksia:

Skaasu - X - < 1

Siima Λ/MWkaasu

IS

Edellä olevassa yhtälössä "s" tarkoittaa liukoisuuksia veteen ilmaistuna "BUNSEN’1-vakioina, so. sinä tilavuutena kaasua, joka liukenee yhteen veden tilavuusyksik-köön standardiolosuhteissa (1 bar, 25 °C) ja annetun, kaasun 20 osapaineen ollessa 1 atm (kts, Gas .Encyclopaedia, Elsevier 197:6) , Koska tällaisissa olosuhteissa ja näillä määrityksillä, ilman liukoisuus On 0,0167 ja sen keskimääräisen rno-lekyylipainon (Mw) neliöjuuri on 5,39, yllä oleva kaava yksinkertaistuu muotoon; 25

Skaasv/< 0,0031 Tämän jälkeen esitetyissä esimerkeissä on kuvattu useilla eri kaasuilla ja niiden seoksilla täytettyjen kai-30 kukiavaukseen soveltuvien mikrökupllen ja mikropallojen tes tausta, ja niiden vastaavaa sietokykyä paineen noustessa, sekä in vivo että in vitro. Taulukoissa: vesi 1 iukoisuusker-toimet on myös Otettu aiemmin mainitusta Gas Encyclopaedia -kirjasta kohdasta "L'Air Liquide", Elsevier Publisher 35 (1976).

8

Keksinnön mukaisia kaasuja sisältävät mikrorakkulat vesipitoisina suspensioina sisältävät useimmat mikrokuplat ja mikroaallot, joita toistaiseksi on kuvattu käytettäväksi varjoaineina kaikukuvauksessa. Edullisimmat, mikroaallot 5 ovat ne, joita on kuvattu EP-julkaisussa 324 938, PCT/EP91/O1 706:ssa ja EP-julkaisussa 458 745; edullisimmat mikrokuplat ovat ne, joita on kuvattu PGT/EP91/00620: ssä; näiden mikrokuplien Ori hyväksi olla muodostettu vesipitoisesta nesteestä ja 'kilivasta jauheesta 10 (mikrorakkulan esiasteet) , joka sisältää laiteli oltu ja, pa- kastekuivattuja fosfolipidejä ja stabilointiaineita; mikro-kuplat kehitetään ravistamalla tätä jauhetta yhdessä vesipitoisen kantajanesteen kanssa. Mikropa!loilla, joita kuvataan EP-julkaisussa 458 745, on joustava pinnalle saostunut 1,5 polymeerimembraani, jolla on kontrolloitu huokoisuus. Ne saadaan yleensä emulsioista polymeeriliuosten mikropisaroi-na vesipitoisissa nesteissä, jonka jälkeen polymeeri sak-kautetaan liuoksestaan, niin että muodostuu kalvon muodostava membraani pisara/neste-rajapinnalle, joka prosessi 20 johtaa aluksi nestetäytteisten mikrorakkuloiden muodostumiseen, näiden nesteydinten korvautuessa lopuksi kaasulla.

Jotta voitaisiin toteuttaa tämän keksinnön menetelmä, so. muodostaa tai täyttää edellä esitetyn kaavan mukaisten kaasujen avulla mikrorakkuloita, joiden suspensiot 25 vesipitoisissa kantajanesteissä ovat kaikukuvaukseen soveltuvia lisäaineita, voidaan joko käyttää, ensimmäisenä vaihtoehtona, kaksivaiheista reittiä, joka koostuu 1) mikrorakkuloiden tekemisestä sopivista lähtöaineista millä tahansa konventionaalisella tekniikalla minkä tahansa sopivan kaa— 30 sun läsnä ollessa ja 2} tämän alkuperäisen mikrorakkuloiden tekemiseen käytetyn kaasun (ensimmäisen kaasun) korvaamisesta uudella kaasulla (toinen kaasu), joka on keksinnön mukainen {kaasunvaihtotekni ikka).

Toisaalta, toisen vaihtoehdon mukaan, voidaan suo-35 raan valmistaa halutut suspensiot sopivilla tavallisilla menetelmillä keksinnön mukaisen uuden kaasun läsnä ollessa.

i α

Jos käytetään kaksivaiheista reittiä, alkuperäinen kaasu voidaan ensin poistaa rakkuloista {esimerkiksi imemällä tyhjäksi) ja sen jälkeen .korvata, se tuomalla töinen kaasu kosketuksiin: tyhjennetyn tuotteen kanssa, tai vaihto-5 ehtoisesti rakkulat, jotka yhä sisältävät ensimmäistä kaasua voidaan tuoda kosketuksiin toisen kaasun kanssa olosuhteissa, joissa toinen kaasu syrjäyttää ensimmäisen kaasun rakkuloissa (kaasusubstituutio). Esimerkiksi rakkulasuspen-.siat tai edullisesti niiden esiasteet (esiasteilla voidaan: 10 tässä tarkoittaa materiaaleja, joista mikrorakkuloiden kuoret on tehty, täi materiaaleja, jotka ravistettaessa niitä vesipitoisen kantajääesteen, kanssa, aiheuttavat tai kehittävät mikrokuplien muodostusta tässä nesteessä), voidaan saattaa alttiiksi alipaineelle, jotta poistettava kaasu 15 saadaan tyhjennettyä ja sitten ympäristönpaine palauttaa halutulla kaasulla substituutiota varten. Tämä vaihe voidaan toistaa kerran tai useamman kerran, jotta voidaan varmistua alkuperäisen kaasun täydellisestä korvautumisesta uudella kaasulla. Tämä tapa; sopii erityisen hyvin esiaste-2 0 valmisteille, jotka varastoidaan kuivana, esim. kuiville jauheille, jotka aikaansaavat tai kehittävät kaikukuvauksen lisäaineiden kuplia, kun. ne lisätään kantajanestemäärään. Siten eräässä edullisessa tapauksessa, jossa mikrokuplat muodostetaan Vesipitoisesta faasista ja kuivista, laminari-25 soiduista fösfolipideistä, esim. dehydrätoitujen lyofillisten liposomien ja stabilointiaineiden pulvereista, jotka sitten äispergoidaan ravistaen vesipitoiseen kantajaneste-faasiin, oh edullista varastoida tämä kuiva jauhe keksinnön mukaisen valitun kaasun ilmakehässä. Tällainen valmiste 30 säilyy määrättömän ajan tässä tilassa ja voidaan käyttää milloin tahansa diagnoosia varten, kunhan se öispergoidaan steriiliin veteen ennen injektiota.

Toisella tavalla tehden, ja tämä sopii erityisesti silloin, kuri kaasunvaihtoa sovelletaan mikrorakkulasuspen-35 sioon kantajarestefaasissa, viimeksimainittua huuhdellaan toisella kaasulla kunnes korvautuminen ('osittainen tai täy- 10 deUinen} on riittävä haluttuun tarkoitukseen. Huuhtelu voidaan toteuttaa kuplittamalla kaasuputkesta tai, joissakin tapauksissa, yksinkertaisesti antamalla uuden kaasun virran (jatkuvana tai epäjatkuvana} pyyhkäistä yli kevyesti 5 ravistellun rakkuloita sisältävän nesteen pinnan. Tässä ta-pauksessa korvauskaasu voidaan lisätä vain kerran pulloon, joka sisältää suspensiota, sen voidaan antaa seistä sellaisenaan hetken, tai se voidaan uudistaa kerran tai useamman kerran,: jotta voitaisiin varmistaa, että uusiutumisaste 10 (kaasunvaihto): on enemmän tai vähemmän täydellinen.

Vaihtoehtoisesti toisessa menetelmässä, kuten edellä on sanottu, kaikukuvaukseen soveltuvien lisäaineiden suspension täydellinen valmistaminen toteutetaan aloittamalla niiden tavallisista esiasteista (lähtöaineista), ku-15 ten aiemmin alalla on esitetty ja toimimalla mainittujen aiempien menetelmien mukaisilla tavallisilla tavoilla, mutta keksinnön mukaisten haluttujen kaasujen tai kaasuseosten läsnä ollessa sen sijaan että aiemmissa menetelmissä yleensä puhutaan sellaisista kaasuista kuten; ilma, typpi, C02 ja 20 vastaavat.

Gn huomattava, että yleensä valmistustavalla, jossa ensin yhdentyyppi s tä kaasua käytetään mikrorakkuloiden valmistamiseksi ja sitten korvataan alkuperäinen, kaasu toisen tyyppisellä kaasulla, jonka tarkoituksena on antaa erilai-25 siä kaikukuvaukseen soveltuvia ominaisuuksia mainituille mikrorakkuloille, on seuraava etu: kuten parhaiten nähdään seuraavassa esitettyjen esimerkkien tuloksissa, sen kaasun luonteella, jota käytetään mikrorakkuloiden ja erityisesti polymeerikuoristen mikropa!lojen valmistamiseen, on selvä 30 vaikutus mainittujen mikrorakkuloiden kokoon (so. keskimää räiseen keskihalkaisijaan); esimerkiksi tarkoin määrätyissä olosuhteissa ilmassa valmistettujen mikropallojen koko voidaan tarkasti kontrolloida osumaan halutulle välille, esim. välille 1 - 10 pm, joka sopii vasemman ja oikean sydämen 35 kammion kaikukuvaukseen. Tämä ei ole niin helppoa muilla kaasuilla, ja erityisesti ei tämän keksinnön vaatimuksiin 11 sopivilla kaasuilla; siten, kun halutaan saada tietyn koko-alueen mikrorakkuloita, mutta täytettynä kaasuilla, joiden ominaisuudet tekisivät suoran valmistamisen mahdottomaksi tai hyvin vaikeaksi, on hyvin edullista luottaa kaksiyai-5 heiseen valmistusreittiin, so. valmistetaan ensin mikrorakkulat käyttäen kaasua, joka mahdollistaa tarkemman halkaisija- ja määräkontrolIin ja korvataan sitten ensimmäinen 'kaasu toisella kaasulla kaasunvaihdolla.

Seuraavan kokeellisen osan (esimerkit) kuvauksessa 10 kaasutäytteiset mikrorakkulat, jotka on Suspendoitu veteen tai muihin vesipitoisiin liuoksiin, on alistettu ympäristön painetta korkeammille paineille. Huomattiin, että kun ylipaine saavutti tietyn arvon (joka yleensä oli tyypillinen tietylle yhdistelmälle mikropyöryiäparametreja: ja työsken-15 telyö1osuhteita, kuten lämpötila, kompressionopeus, kanta-janesteeii luonne ja sen sisältämä liuenneen kaasun määrä (tämän parametrin suhteellista tärkeyttä kuvataan yksityiskohtaisesti myöhemmin), täytekaasun luonne, kaikukuvausma-teriaalin tyyppi jne.), mikrorakkulat alkoivat painua ka-20 saan kuplamäärän jatkuvasti pienentyessä, kun painetta edelleen nostettiin, kunnes tapahtui ääniheijastusvaikutuksen täydellinen häviäminen. Tätä ilmiötä voitiin paremmin seurata optisesti (nefelometrisillä mittauksilla), koska sen kanssa yhdessä tapahtui vastaava muutos optisessa ti-25 heydessä, so. aineen läpinäkyvyys kasvaa kuplan kasaanpu-ristumisen edetessä. Tätä varten vesipitoista mikrorakku-lasuspensiota (tai sopivaa laimennosta siitä) laitettiin spektrofotometriseen kennoon, joka pidettiin 25; °C:ssa (standardiolosuhteet} ja absorbanssi mitattiin jatkuvasti 30 600 tai 700 mussä, kun käytettiin hydrostaattista yli painetta, jota asteittain nostettiin. Paine saatiin aikaan peristalttisella pumpulla (Gilson's Mini-puis):, joka syötti vaihtelevan korkuista nestepyIvasta, joka oli liitetty spektrofotometriseen kennoon, viimeksi mainitun ollessa: 35 vuototilyiisti suljettu. Paine mitattiin elohopearnanomet- rilla, joka oli kalibroitu torreissa. Kompressionopeuden j 12 ajan suhteen todettiin lineaarisesti korreloivan pumpun nopeuden (rpirnnä) kanssa. Absorbanssin edellä mainitulla alueella todettiin olevan verrannollinen kantajanesteen mikro-rakku1akonsentraatioon.

5 Kuviossa 1 on käyrä, joka esittää kuplakonsentraa tien (kuplamäärän), joka on ilmaistu optisena tiheytenä edellä mainitulla alueella, suhdetta kuplasuspensioon kohdistettuun paineeseen. Tiedot käyrän tekemiseksi on otettu kokeista, jotka on raportoitu esimerkissä 4, 10 Kuviosta 1 näkyy graafisesti, että absorbanssin muutosta paineen suhteen kuvaa s-rnuotoinen käyrä. Tiettyyn paineen arvoon asti käyrä on lähes tasainen, mikä viittaa siihen, että kuplat ovat stabiileja. Sitten tapahtuu suhteellisen nopea absorbanssin pudotus, mikä viittaa suhteel-15 lisen kapean kriittisen alueen o1emäs sao1oon, jolloin pienelläkin paineen muutoksella on dramaattinen vaikutus kup-lamäärään. Kun kaikki mikrorakkulat ovat kadonneet käyrä tasoittuu jälleen. Kriittinen piste tällä käyrällä valittiin ylempien ja alempien optisten lukemien keskeltä, so. 20 "kaikki"-kuplat (OD max) ja "ei"-kuplia {OD min) mittausten väliltä, jolloin tämä itse asiassa vastaa tilannetta, jossa noin 50 % alkuperäisistä kuplista on hävinnyt, so. jolloin optinen tiheyslukema on noin puolet alkuperäisestä, joka on käyrässä suhteutettu siihen korkeuteen, jossa paineistetun 25. suspension läpinäkyvyys on maksimaalinen (pohjaviiva) . Tämä piste, joka on myös lähellä kohtaa, jossa käyrän jyrkkyys on maksimaalinen, on määritetty kriittiseksi paineeksi PC, Havaittiin, että annetulle kaasulle PC ei riipu ainoastaan edellä mainituista parametreistä, vaan myös, ja erityises-30 ti, kanta j anes tees een jo liuenneen kaasun tai liuenneiden kaasujen todellisesta konsentraatiosta: mitä korkeampi kaa-sukonsentraatio sitä korkeampi on kriittinen paine. Tässä yhteydessä voidaan siten lisätä mikrorakkuloiden vastustuskykyä kokponpuristumista vastaan paineessa kyllästämällä 35 kantajataasi liukoisella kaasulla, viimeksi mainitun ollessa sama tai ollessa olematta sama (sö, eri kaasu) kuin se 13 kaasu, jolla rakkulat on täytetty. Esimerkkinä, ilmatäyt-teiset mikrorakkulat saatiin kestämään ylipainetta (> 120 torr) erittäin hyvin käyttämällä kantajanesteenä CGarlla kyllästettyä liuosta. Valitettavasti tällä havainnolla on 5 hyvin rajoitetusti arvoa diagnostisella alueella, koska kun varjoaine on injektoitu potilaiden verenkiertoon (jonka kaasusisältö on tietenkin kontrollin ulkopuolella), se laimenee siellä siinä määrin, että alunperin injektoituun näytteeseen liuotetun kaasun määrän vaikutus tulee merki-10 tykse1t ömäks i.

Toinen helposti saatava parametri, jonka avulla voidaan toistettavaati vertailla eri kaasuj en suorituskykyä mikropyörylöiden täytteenä, on sen paineintervallin (ΔΡ) leveys, jota rajoittavat painoarvot, joiden kohdalla kupla-15 määrät (ilmaistuina optisina tiheyksinä) vastaavat 75 %:a ja 25 %:a alkuperäisestä kuplamäärästä, Nyt on yllättäen havaittu, että kaasuilla, joilla pairie-ero DP = ihs - P75 ylittää noin 25 - 30 torrin arvon, verenpaineen tappajavai-kutus kaasutäytteisiin mikrorakkuloihin minimoituu, so. to-2 0 del linen lasku kuplamäärassä pn riittävän hidas, niin että se ei heikennä kaikukuvausmittausten merkitystä, tarkkuutta ja toistettavuutta.

Lisäksi havaittiin, että PC- ja ΔΡ-arvot riippuvat myös paineen nousunopeudesta testikokeissa, jolta kuvio 1 25 kuvaa, so. tietyllä, paineen nousunopeusvälillä (esim. välillä useita kymmeniä — useita satoja torr/min), mitä suurempi: nopeus, sitä suuremmat PC- ja Δρ-arvot, Tästä syystä vertailut, jotka: suoritettiin standardiläit^ötilaolosuhteis-ss, toteutettiin myös vakionpusunopeudellä 100 torr/min. On 30 kuitenkin huomattava, että tämä paineen nousunopeuden vaikutus PC- ja ΔΡ-arvojen mittaustuloksiin tasoittuu hyvin suurilla nopeuksilla; esimerkiksi arvot, jotka mitattiin nopeuksilla, jotka olivat useita satoja torreja/min eivät merkittävästi eroa mittauksista, jotka tehtiin sydämen 35 lyöntien määrittämissä olosuhteissa:.

14

Vaikkakaan ne nimenomaiset syyt siihen, miksi tietyt kaasut noudattavat edellä mainittuja ominaisuuksia ja toiset eivät, eivät ole täysin selkiytyneet* vaikuttaisi siltä, että mahdollisesti on olemassa jokin yhteys, johon molekyyli-5 painon ja vesiliukoisuuden lisäksi vaikuttavat liukenemis-kinetiikka ja ehkä muut parametrit. Näitä parametrejä ei kuitenkaan tarvitse tietää tämän keksinnön hyödyntämiseksi/ koska kaasujen sopivuus voidaan helposti määritellä aiemmin käsiteltyjen kriteerien pohjalta, 10 Kaasumaiset aineet, jotka ovat keksinnön kannalta erityisen sopivia, ovat esimerkiksi halogenoidut hiilivedyt, kuten freonit ja stabiilit fluoratut kalkogenidit, kuten SF$, SeFe ja vastaavat.

Edellä on mainittu, että keksinnön mukaisten mikro-15 rakkuloiden kantajana käytetyn nesteen kyllästymisaste kaasulla on tärkeää mikrorakkuloiden stabiiliuden kannalta paineen vaihteluissa. Todellakin, kun kantajaneste, johon mikrorakkulat on dispergoitu keksinnön mukaista kaikukuvaussus-pension tekemistä varten, kyllästetään tasapainoon kaasulla, 20 edullisesti samalla kaasulla, jolla mikrorakkulat on täytetty, mikrorakkuloiden vastustuskyky kasäanpuristumista vastaan paineenvaihteluissa kasvaa merkittävästi. Siten, kun varjoaineena käytettävä tuote myydään kuivana ja sekoitetaan juuri ennen käyttöä kantajanesteeseen (kts. esimerkiksi 25: tuotteet, joita on kuvattu PCT/EP91/ 00620:ssa ja mainittu edellä), on hyvin hyödyllistä käyttää dispersioon kaasulla kyllästettyä kantajanestettä. Vaihtoehtoisesti, kun. markkinoidaan käyttövalmiita mikrorakkulasuspensioita kaikukuvak-sen varjoaineiksi, on hyödyllistä käyttää valmistuksessa 30 kantajanesteenä kaasulla kyllästettyä vesipitoista liuosta; tässä tapauksessa suspension varastointiaika kasvaa merkittävästi ja tuote voi pysyä oleellisesti muuttumattomana (ei oleellista muutosta kuplamäärässä) pitkiä aikoja, esimerkiksi useista viikoista useisiin kuukausiin, ja jopa erityista-35 pauksissa yli vuoden. Nesteen kyllästäminen kaasulla voidaan 15 toteuttaa kaikkein helpoimmin yksinkertaisesti kuplittamal-la kaasua nesteeseen jonkin aikaa huoneenlämpötilassa,

Esimerkki 1

Ilmalla tai eri kaasuilla täytettyjä albumiinimik-5 rorakkuloita valmistettiin, kuten on kuvattu EP-julkaisussa 324 938, käyttäen 10 ml:n kalibroitua ruiskua, joka oli täytetty 5-%:isella ihmisen seerumialbumiinilla (HSA), jonka alkuperä oli Blood Transfusion Service, Red-Cross Organization, Bern, Sveitsi. Sonikaattorianturi (Sonifier Mo-10 del 250, Branson Ultrasonic Corp., USA) laskettiin nesteeseen ruiskun 4 ml:n merkkiin asti ja sonikaatiota tehtiin 25 sekunnin ajan (energia-asetus ~ 8) . Sitten sonikaattorianturi nostettiin nestepinnan yläpuolelle 6 ml:n merkkiin saakka ja sonikaatiO aloitettiin uudelleen pulssimoodissa 15 (sykli - 0,3) 40 sekunniksi. Neste seisoi yli yön 4 °C:ssa, ja siinä ajassa oli nosteen vaikutuksesta muodostunut yläkerros, joka /Sisälsi suurimman osan mikrorakkuloista ja pohjakerros, joka sisälsi denaturoidusta proteiinista ja muista liukenemattomista aineista muodostuvaa käyttämätöntä 20 albumiini jätettä, joka heitettiin pois. Kun mikrorakkulat oli uudelleen suspendoltu tuoreeseen albumiiniliuokseen, tämän annettiin jälleen laskeutua ja lopuksi ylempi kerros kerättiin talteen. Kun edellä esitetyt vaiheet oli suoritettu ympäristön ilmakehässä saatiin ilmatäytteisiä mikro-25 palloja. Jotta saataisiin muilla kaasuilla täytettyjä mik-ropalloja albumiiniliuosta huuhdeltiin ensin uudella kaasulla, sitten edellä esitetyt toimintavaiheet suoritettiin siten, että tämän kaasun annettiin virrata nesteen pinnan yli; sitten työn lopuksi, suspensio pantiin lasipulloon, 30 jota huuhdeltiin runsaasti halutulla kaasulla ennen sulkemista.

Eri kaasuilla täytettyjen mikropallojen eri suspensiot laimennettiin 1:10 tislatulla vedellä, joka oli kyllästetty tasapainoon ilmalla, sitten ne pantiin optiseen 35 kennoon kuten edellä on kuvattu ja absorbanssi rekisteröitiin, kun painetta tasaisesti nostettiin suspension yllä.

16

Mittausten aikana suspensioiden lämpötila pidettiin 25 QC:ssa.

Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 1 ja siinä on esitetty kriittisen paineen arvot, jotka on re-5 kisteröity sarjalle kaasuja, jotka on määritelty nimillä tai kaavoilla, näiden kaasujen karakteristiset parametrit, so. molekyylipaino ja vesiliukoisuus on annettu, kuten myös alkuperäinen kuplamäärä j a kuplan keskimääräinen koko (tilavuuden keskihalkaisijä).

10

Taulukko 1

Kupla- Kupla-

Liukoi- määrä koko PC S^„J

Käyte Kaasu Mw suus (10B/ml) (pm) (torr) /Mw 15 AFrel CF4 88 0,0038 0,8 5,1 120 0,0004 AFre2 CBrF3 149 0,0045 0,1 11,1 104 0,0004 ASF1 SF6 146 0,005 13,9 6,2 150 0,0004 ASF2 SF6 146 0,005 2,0 7,9 140 0,0004 ANI Na 28 0,0144 0,4 7,8 62 0,0027 20 A14 ilma 29 0,0167 3,1 11,9 53 0,0031 A18 ilma 29 0,0167 3, S 9,2 52 A19 ilma 29 0,0167 1,9 9,5 51 AMel CH4 16 0,32 0,25 8,2 34 0,008 AKrl Kr 84 0,59 0,02 9,2 86 0,006 25 AX1 Xe 131 0,108 0,06 17,2 65 0,009 AX2 Xe 131 0,108 0,03 16,5 89 0,009

Taulukon 1 tuloksista nähdään, että kriittinen paine PC kasvaa, kun kaasun liukoisuus vähenee ja molekyyli-30 paino kasvaa. Siksi voidaan odottaa, että tällaisilla kaasuilla täytetyt mikrorakkulat antavat kestävämpiä kaiku-kuvaussignaaleja in vivo. Voidaan myös nähdä, että keskimääräinen kuplakoko yleensä kasvaa kaasun liukoisuuden kasvaessa.

17

Esimerkki 2 1 mlm määriä joitakin esimerkissä 1 valmistettuja mikropallosuspensioita injektoitiin koekaniinien kaulalas-kimoon, jotta voitaisiin testata kaikukuvaukseen sopivuut-5 ta in vivo. Vasemman ja oikean sydänkammion kuvaus suoritettiin harmaaskaalamoodissa käyttäen Acuson 128-XP5 -kai-kukuvauslaitteistoa ja 7,5 MHz:n muutinta. Kontrastin paranemisen kestoaika vasemmassa kammiossa määritettiin rekisteröimällä signaali jonkin aikaa. Tulokset on kerätty 10 alla olevaan taulukkoon 2, jossa näkyy myös käytettyjen kaasujen kriittinen paine.

Taulukko 2 Kontrastin 15 Näyte (kaasu) kestoaika (sek) PC (torr) AMel (CH4) nolla 34 Äl4 (ilma) 10 53 AI8 (ilma 11 52 AX1 (Xe) 20 65 20 AX2 (Xe.) 30 89 ASF2 (SF6) > 60 140

Yllä olevista tuloksista voidaan nähdä se, että on olemassa selvä korrelaatio kokeiltujen kaasujen kriittisen 25 paineen ja kaikukuvausslgnaalin kestoajan välillä.

Esimerkki 3

Kaikukuvaukseen soveltuva ilmatäytteisten galaktoo-simikropartikkeleiden (Echovist* Schering Ag:lta) suspensio saatiin sekoittamalla 5 sekunnin ajan 3 g:aa kiinteitä 30 mikropartikkeleita 8,5 ml:ssa 2Ö-%:ista gaiaktQQsiliuosta.

Muissa valmisteissa ilma, joka oli yläpuolella osaa EchovistR-partikkeleita poistettiin (0,2 torr) ja korvattiin SF6~ilmakehällä, jolloin kun oli lisätty 2Ö-%:ista ga-laktoosiliuosta, saatiin mikropartikkelisuspensio, joka 35 sisälsi mukaan tullutta rikkiheksafluoridia. 1 ml:n sus- j | 18 pensioeriä annettiin koekaniineille (injektoimalla kaula-laskimoon) ja sydämen kuvaus suoritettiin kuten on kuvattu edellisessä esimerkissä. Tässä tapauksessa kaikukuvausmik-ropartikkelit eivät kulje keuhkokapi11aarien läpi, joten 5 kuvaus on rajoitettu oikeaan kammioon ja signaalin koko-naispysyvyydellä ei ole erityistä merkitystä, ällä olevan taulukon 3 tulokset esittävät signaalin huippuintensitee-ttn muutama sekunti injektion jälkeen.

10 Taulukko 3

Signaalipiikki (mieliva1taiset Näyte nro Kaasu yksiköt)

Gall ilma 114 15 Gal2 ilma 108

Gal3 SF6 131

Gal 4 SF6 140

Voidaan havaita, että rikkiheksafluoridilla, joka 20 on inertti kaasu, jolla on alhainen vesiliuköisuus, saadaan kaikukuvaukseen soveltuvia suspensioita, jotka generoivat voimakkaampia kaikukuvaussignaaleja kuin vertailukelpoiset iImatäytteiset suspensiot. Nämä tulokset ovat erityisen mielenkiintoisia ajatellen EP-julkaisujert 25 441 468 ja 357 163 (Schering) opetuksia, joissa kuvataan sellaisten kaikukuvaukseen tarkoitettujen mikropartik-keleiden käyttöä, joissa vastaavasti kavitaatti- ja klatraattiyhdisteitä on täytetty erilaisilla kaasuilla mukaan lukien SFe; näissä dokumenteissa ei kuitenkaan ra-30 portoida SF6:n erityisistä eduista muihin tavallisimpiin kaasuihin nähden, mitä tulee kaikukuvausvasteeseen.

Esimerkki 4

Sarja kaasutäytteisten mikrokuplien kaikukuvaussus-pensioita valmistettiin yleisellä menetelmällä, joka on 35 esitetty seuraavassa: j 19 1 g hydratun soijalesitiinin (Nattermann Phospholipids GmbH, Saksa) jadisetyylifosfaatin (DCPj seosta, mpolisuhteessa 9/1, liuotettiin 50 ml:aan kloroformia, ja liuos laitettiin 100 ml:ή pyöreään tislauskolviin ja haih-5 dutettiln kuivaksi Rotavapor-laitteella. Sitten lisättiin 20 ml tislattua vettä ja seosta ravisteltiin hitaasti 75 eG:ssa tunnin ajan. Tämä johti multilamellaaristen li-posomieh (MLV) suspension muodostumiseen, joka sen jälkeen puristettiin 75 °C:ssa peräkkäin 3 pm:n ja 0,8 pm:n poly-10 karbonaattimembräänien (Nuclepore") läpi. Jäähdytyksen jäi- keen 1 ml:n määrät läpipuristettua suspensiota laimennettiin 9 ml:11a konsentroitua laktoosiliuosta (83 g/1) ja laimennetut suspensiot jäädytettiin -45 °G:ssa. jäädytetyt näytteet pakastekuivattiin sitten suurtyhjössä vapaasti 15 liikkuvaksi jauheeksi astiassa, joka lopulta täytettiin ilmalla tai kaasulla, joka oli otettu kaasuvalikoimasta, joka on esitetty alla olevassa taulukossa 4. Jauhemaiset näytteet suspendoitiin sitten uudestaan käyttäen 10 ml:aa yettä kantajanesteenä ja tämä toteutettiin saman kaasun 20 virtauksen alla, jota käytettiin mainittujen astioiden täyttämiseen. Suspensio saatiin aikaan voimakkaalla ravistuksella 1 minuutin ajan pyörresekoittimessa.

Eri suspensiot laimennettiin 1:20reen tislatulla vedellä, joka oli etukäteen kyllästetty tasapainoon ilmal-25 la 25 °C:ssa ja laimennokset painetestatiin sitten 25 °G:ssa, kuten on kuvattu esimerkissä 1, mittaamalla optinen tiheys spektrofolömetrlsessä kennossa, johon kohdistui jatkuvasti kasvava hydrostaattinen paine kunnes kaikki kuplat olivat menneet kasaan. Tulokset on kerätty alla 30 olevaan taulukkoon 4, jossa kriittisen paineen PC lisäksi annetaan myös ΔΡ-arvot (kts. kuvio 1).

20

Taulukko 4 Liukoisuus Kupla- Näyte veteen määrä PC ΔΡ nro Kaasu Mm H2Ö:ssa (108/ml) (torr) (torr) 5 LFrel CF4 88 0,0038 1,2 97 35 LFre2 CBrF3 149 0,0045 0,9 116 64 LSF1 SF6 146 0,005 1,2 92 58 LFre3 C4F8 200 0,016 1,5 136 145

Li ilma 29 0,0167 15,5 68 17 10 L2 Ilma 29 0,0167 11,2 63 17 LArl Ar 40 0,031 14,5 71 18 LKrl Kr 84 0,059 12,2 86 18 LXel Xe 131 0,108 10,1 92 23 LFre4 CHC1F2 86 0,78 - 83 25 15

Edellä esitetyt tulokset osoittavat selvästi, että suurimman vastustuskyvyn, paineen nousulle antavat kaasut, jotka vähiten liukenevat veteen. Mikrokuplien käyttäytyminen on siten tässä suhteessa samanlaista kuin mikropallo-20 jen. Vähiten veteeniiukenevat kaasut, joilla on korkeammat j

molekyylipainot antavat myös tasaisimmat kuplan kökoonpu- I

ristuvuus/paine-käyrät (so. ΔΡ on laajin), mikä myös on | tärkeä tekijä ajatellen kaikukuvausvasteen pysyvyyttä in ! j vivo, kuten aiemmin on tässä tekstissä osoitettu. j 25 Esimerkki 5 i

Joitakin esimerkin 4 mikrokuplasuspensioita injek- f toitiin· koekaniinien kauialaskimoon, kuten on esitetty j esimerkissä 2, ja vasemman sydänkammiön kuvaus suoritettiin aiemmin esitetyllä tavalla. Havaitun, käyttökelpoisen j 30 kaikukuvaussignaalin kestoaika rekisteröitiin, ja tulokset \ on esitetty alla olevassa taulukossa 5, jossa C4Fe tarkoit- | taa oktailuörisykiobutaania. | $ | | $ | 21

Taulukko 5

Kontrastin Näyte nro Kaasun tyyppi kestoaika (Sek) LI ilma 38 5 L2 ilma 29 LMel CH4 47 LKrl krypton! 37 LFrel GF4 >120 LFre2 CBrF3 92 10 IiSFl SFs > 112 LFreS :G4Fe > 120 Nämä tulokset osoittavat, että jälleen mikrokuplien ollessa kyseessä, tämän keksinnön kriteerien mukaiset kaa-15 sut antavat ultraäänikaikusignaalin paljon pitemmän aikaa kuin useimmat tähän asti käytössä olleet kaasut*

Esimerkki 6

Mikrokuplasuspensioita valmistettiin käyttäen erilaisia kaasuja aivan kuin on kuvattu esimerkissä 4, mutta 20 korvaten lesitiinfosfolipidiainesosa raooliekvivalentilla di arakidoyy1i fos fa tidyy1ikoliinia (C20-rasvahappoj äännös), jonka myyjä on Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, USA. Fosfolipidin moolisuhde DCPrhen oli yhä 9/1. Sitten suspensiot painetestattiin kuten esimerkissä 4; tuloksia, 25 jotka on kerätty taulukkoon 6A on verrattava taulukon 4 tuloksiin.

! 22

Taulukko 6Ä

Kaa- Liukoi- Kupla- Näyte Kaasun sun suus määrä PC ΔΡ nro tyyppi Mw veteen (108/ml) (torr) (torr) 5 LFrel CF4 88 0,0038 3,4 251 124 LFre2 CBrF3 149 0,0045 0,7 121 74 1SF1 SF6 146 0,005 3,1 347 > 150

IiFre3 C4F8 200 0,016 1,7 > 350 > 200

Li ilma 29 0,0167 3,8 60 22 10 LBul butaani 58 0,027 0,4 64 26 LArl argoni 40 0,031 3,3 84 47 LMel CH4 16 0,032 3,0 51 19 LEtl C2H6 44 0,034 1,4 61 26 LKrl Kr 84 0,059 2,7 63 18 15 LXel Xe 131 0,108 1,4 60 28 LFre4 GHC1F2 86 0,78 0,4 58 28

Yllä olevat tulokset, verrattuna taulukon 4 tuloksiin, osoittavat, että ainakin niukkaliukoisten kaasujen 20 ollessa kyseessä, voidaan fosfolipidirasvahappojäännöksen ketjua pidentämällä dramaattisesti lisätä kaikukuvaussus-pension stabiiliutta paineen nousua vastaan. Tälle tulokselle saatiin lisävahvistusta toistamalla edellä esitetyt kokeet, mutta korvaamalla fosfolipidikomponentti sen kor-25 keammalla homologilla, so. dibehenoyylifosfatidyylikolii-nilla {C2?-rasvahappojäännös). Tässä tapauksessa mikrokup-lasuspensioiden kyky vastustaa kokoonpuristumista paineessa lisääntyi yhä.

Joitakin tämän esimerkin mikrokuplasuspensioita 30 testa-ttiin koirissa kuten on aiemmin kuvattu kaniinien osalta (sydänkammioiden kuvaus, kun injektoitiin 5 ml näytteitä etummaiseen etujalan laskimoon). Havaittiin merkittävä käyttökelpoisen in vivo kaikukuvausvasteen paraneminen verx'attuna esimerkissä 4 esitettyjen valmisteiden 35 käyttäytymiseen, so, rasvahappojäännöksen ketjun pituuden

S

23 lisäys fosfolipidifeomponerstissa lisää kaikukuvausaineen käyttökelpoisia ikää in vivo.

Seuiaavässa alla olevassa taulukossa esitetään sellaisten mlkrokuplien (SFs) suhteellinen stabiilius kaniinin 5 vasemmassa kammiossa, jotka on valmistettu suspensioista, jotka on tehty sarjasta fasfolipidejä, joiden rasvahappo-jäännöksillä on erilainen ketjun pituus (< injektoitu annos : 1 mi/kaniini)).

10 Taulukko 6B

Ketjun Kontrastin

Fosfo- pituus PC δΡ kesto lipidi (Cn) (torr) (torr} (sek) DMPC 14 57 37 31 15 DPPC 16 100 75 105 DSPC 18 115 95 120 0APC 20 266 190 > 300 Tässä tekstissä on aiemmin mainittu, että näissä 20 esimerkeissä kuvattujen paineen sietokykymittausten aikana \ ylläpidetään paineen vakionousunopeus 100 torr/min. Tämä j .

on perusteltua tarkasteltaessa alla esitettyjä tuloksia, jotka osoittavat PC-arvojen vaihtelut eri kaasuilla paineen nousunopeuden funktiona. Näissä näytteissä käytetty 25 fosfolipidi oli DMPC. j

Kaasu- PC (torr) j näyte Paineen nousunopeus (torr/min) \ 40 100 200 30 SF6 51 57 82 | ilma 39 50 62 | CH4 47 61 69 |

Xe 38 43 51 j

Freon 22 37 54 67 j 35 | } l i | j 24

Esimerkki 7

Sar ja alhumiinimikropalloja vesisuspensiona valmistettiin ilmassa tavalla, jolla voitiin kontrolloida pyöry-läkoko käyttäen esimerkissä 1 annettuja ohjeita. Sitten 5 joistakin näytteistä ilma korvattiin muilla kaasuilla käyttäen kaasunvaihdossa pyyhkäisymenstelmää ympäristön paineessa. Sitten sen jälkeen kun näytteet oli laimennettu 1:10reen tislatulla vedellä kuten tavallista, ne laitettiin esimerkin 1 mukaisesti painetestiin. Alla olevaan 10 taulukkoon 7 kerätyistä tuloksista voidaan nähdä, että kaksivaiheinen valmistusmenetelmä antaa joissakin tapauksissa kaikua aikaansaavia aineita, joilla on parempi paineen sietokyky kuin esimerkin 1 yksivaiheisella menetelmällä saaduilla aineilla.

15

Taulukko 7 Älkup.

Liukoi- kupla- Näyte Kaasun Kaasun suus määrä pc 20 nro tyyppi Mw veteen { 10*/ml ) (torr) A14 ilma 29 0,0167 3,1 53 j A IS· ilma 29 0,0167 3,8 52

Al-8/S'F.g SF6 146 0,005 0,8 115 A18/C3H6 C2H5 30 0,042 3,4 72 25 AI9 ilma 29 0,0167 1,9 51 AI 9/SF*. SF6 146 0,005 0,6 140 |

A19/Xe Xe 131 0,108 1,3 67 J

A22/CF4 CF4 88 0,0038 1,0 167 j Α22/ΚΓ Kr 84 0,059 0,6 85 j 30 ]

X

Esimerkki 8 s Tämän keksinnön mukaista menetelmää käytettiin j aiemmin alalla kuvattuun kokeeseen, esimerkiksi esimerkis- j sä 1 W0-92/11873: ssa. 3 g PluronicRF68: aa (polyoksieteeni-35 polyoksipropeenikopolymeeri, jonka molekyylipaino on 8 400), 1 g dipalmitoyylifosfatidyyliglyserolia (Na-suola, i i5 j 25 AVANTI Polar Lipids) ja 3,6 g glyserolia lisättiin 80 mi:aan tislattua vettä. Kun seosta kuumennettiin noin 80 °C:ssa saatiin kirkas homogeeninen liuos. Tensidiliuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja tilavuus säädettiin 5 100 ml:aan. Joissakin kokeissa (kis. taulukko 8) dipalmi” toyylifösfatidyyliglyseroli korvattiin seoksella, jossa oli diarakidoyyiifosfatidyylikoliinia (920 mg) ja 80 mg dipalmitoyylifosfatidihappoa (Na-suola, AVANTI Polar Lipids), 10 Kuplasuspensiot saatiin käyttämällä kahta ruiskua, jotka oli yhdistetty kolmitiehanalla. Toinen ruiskuista täytettiin 5 ml:11a tensidiliuosta, kun taas toinen täytettiin 0,5 ml:11a ilmaa tai kaasua. Kolmitiehana täytettiin tensidiliuoksella ennen kuin se yhdistettiin kaasua 15 sisältävään ruiskuun. Käyttäen vaihdellen kahta mäntää tendisiliuosta siirrettiin edestakaisin kahden ruiskun välillä (5 kertaa molempiin suuntiin) ja muodostui maitomaisia suspensioita. Kun suspensio oli laimennettu (l:lÖ:stä 1:50teen) ilmalla tasapainoon kyllästetyllä tis-20 latulla vedellä, valmisteiden paineen sietokyky määriteltiin esimerkin 1 mukaisesti. Paineen nousundpeus oli 240 torr/min. Saätiin seuraavat tulokset:

Taulukko 8 25 Fosfolipidi Kaasu PC (ram Hg) DP (mm Hg) DPPG ilma 28 17 DPPG SFÖ 138 134 ÖAPC/DPPA 9/1 ilma 46 30 DAPC/DPPa 9/1 SF6 269 253 30 Tästä seuraa, että käyttäen keksinnön menetelmää ja korvattaessa ilma muilla kaasuilla, esim. SF6:11a, jopa tunnetuilla valmisteilla saadaan merkittäviä parannuksia, SO- voidaan saavuttaa lisääntynyt paineen sietokyky. Tämä 35 pitää paikkansa sekä silloin kun on kyse negatiivisesti ϊ 26 varautuneista fosfolipideistä että silloin kun on kyse neutraalien ja negatiivisesti varautuneiden fosfolipidien (DAPC/DPPA) seoksista,

Edellä kuvattu koe osoittaa edelleen, että keksin-5 nön menetelmä on edullisesti ratkaissut tunnetun ongelman, joka johtui raikrokuplien ja mikropallojen herkkyydestä puristus kokoon paineessa, so. kun suspensiot injektoitiin eläviin olentoihin. Mikrokupla- tai mikropallosuspensioi-ta, joilla on suurempi kyky vastustaa kokoonpuristuvuutta 10 ja parempi stabiilius, voidaan edullisesti valmistaa, jolloin saadaan suspensioita, joilla On parempi toistettavuus ja jotka ovat turvallisempia kaikukuvausmittauksissa, joita suoritetaan in vivo ihmis- tai eläinkehossa.

Claims (24)

1. Varjoaine ui traääni hai ku kuvaus ta varten, joka käsittää suspensiona vesipitoisessa nestekantajafaasissa 5 mikrorakkuloita,: jotka on täytetty kaasulla tai käasuseok-sella, jotka mikrorakkulat ovat joko mikrokuplia, joissa on aineeton tai haihtuva kuori, eli niitä ympäröi vain nesteseinä, jonka: pintajännitystä modifioidaan pinta-· aktiivisen aineen läsnäololla, tai mikropalloja, joita ra-•10 joit taa- orgaanisesta polymeerimembraanista tehty aineellinen kuori, t u m n e t t u siitä, että kaasu seos käsittää vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää halogenoi-tua h.ii li vety ka asua tai stabiilia fluorattua kalkogenidia, jonka vesiliukoisuuden, ilmaistuna kaasulitroina vesilit-15 raa kohden standardi olosuhteissa:, suhde molekyylipainon neliöjuureen, daltonelna, On alle 0,0027, lukuun ottamatta ..mik^Qpalloja, jotka käsittävät SFg:a tai CF<]: ä ja joilla on ei-proteiinipitoisista silloitetuista tai polyme-roiduista amxifiilisistä ryhmistä muodostunut kuori tai 20 biohajoavilla silloitusryhmiilä Silloitetusta proteiinista muodostunut kuori.

2. Kontrastmedel enligt patentkrav 1, kanne- tecknat, av att den halogenerade kolvätegasen eller den stabila, fluorerade kalkogeniden är SF6 eller en freon vald bland CF4, C4Fg, CCIP3, CaFs, C2CIF5, CBrClF^, CsClsF^ och. 25 CijFia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen varjoaine, tunnettu siitä, että halogenoitu hi i 1 i vety kaasupa .1 stabiili fluorattu kalkogenidi on ,3Fs, tai freoni va- 2. lit su joukosta CF*, C*F8, C:Ci F-j, C2F,-, C2CiF5, CBrClEr, C2.Cl.2F4, ja C..]Fio·

3. Kontrastmedel enligt patentkrav 1, kanne- tecknat av att mikrovesiklarna är mikrobubblor och vat-tenfasen innehäller ett upplöst filmbildande ytaktivt ämne i lamellärform eller laminär form som innefattar en eller 30 flera fosfolipider.

3. Patenttivaa timuksen 1 mukainen var joaine, t annettu siitä, että mikrorakkulat ovat mikr.okuplia ja että vesipitoinen faasi sisältää liuennutta kalvon 30 muodostavaa pinta-aktiivista ainetta latte11aarisessa tai laminaarlsessa muodossa, joka käsittää yhtä tai useampaa fosfolipidiä.

4. Kontrastmedel enligt patentkrav 3, klnne- tecknat av att ätminstone en del av fosfolipiderna har f o nnen av liposomer.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen varjoaine, t u n n ettu. siitä, että ainakin osa fosfolipideistä | 35 on liposomimuodossa. I

5. Kontrastmedel enligt patentkrav 4, känne- 35 tecknat av att den vätskeformiga bärarfasen vidare in- nehaller stabiliseringsmedel.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen varjoaine, t u n n e t t u siitä, että nestekanta j afa.asi sisältää lisäksi stabilointiaineita.

6. Konti'astmedei enligt patentkrav 3,: kanne - tecknat av att minst en av fosfolipiderna är en diaeyl-foefatidylförening, i vilken acylgruppen ar en Cie-fett-syrarest elder en. högre homolog till clenna.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen varjoaine, 5. u n n e c t u. siitä, että ainakin yksi fosfolipideistä on di a s y y i i f o s f at i cl y y 1 i y h d i s e e, jossa asyyliryhmä on Cie-rasvahappotähde tai sen korkeampi homologi,

7. Kontrastmedel enligt patentkrav 1, känne- tecknat av att polymererna i membranet väljä bland po-lymjolksyra eller polyglykDlsyra och sampolymerer darav, tvärbundet serumalbumin, tvärbundet hemoglobin, polystyren och estrar av polyglutamin- och polyasparaginsyror.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen varjoaine, tunne t t u siitä, että membraanin polymeerit on va- 10 littu ryhmästä, johon kuuluvat pölyittä itohäppo tai poi^glykoli-happo ja niiden kopolymeerit, verkkomainen seerumial-bumiini, verkkomainen hemoglobiini, polystyreani ja poly-glutamiini- ja polyasparagiinihappojen esterit.

8. Kontrastmedel enligt patentkrav 7, kanne- tecknat av att mikrovesiklarna är fyllda med SFe-

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen varjoaine, 15 tunnet t u siitä, että mikrorakkulat on täytetty SFg; 1 la .

9. Kontrastmedel enligt. patentkrav 1, kanne- tecknat av att gasen i mikrovesiklarna väljs bland CF4, C4F8, CClFa, C2F6, C?.C1FS, CBrClFa, C2CI2F4 eller C4F10.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen varjoaine, t u n n e t t u siitä, että mikrorakkuloissa oleva kaasu valitaan ryhmästä CF«CbFg, CC1F3, C-Fs, C.2C1F5, CBrCl.F2,

10. Fdrfarande för framstäiIning av kontrastmedel, innefattande Suspensiotter av gasfyllda mikrovesiklar i en vattenhaltig vätskeformig bärarfas enligt patentkrav 1, kanne tecknat av att mikrovesiklarna bildas i ai at mosfär av en gasblandning, innefattande: minst en fysiolo- 20 giskt godtagbar halogenerad kolvätegas eller stabil fluo-rerad kalkogenid med ett förhällande mellan lösligheten i vatten, uttryckt sort) liter gas per liter vat ten vid stan-dardbetingelser, och kvadratrpten av raolekylvikten i dal-ton är under 0,0027. 25 11. Förfarande för framställning av kontrastmedel, innefattande suspensioner av gasfyllda mikrovesiklar i en vattenhaltig vätskeformig bärarfas enligt patentkrav 1, kännetecknat av att redan framställda mikrovesiklar fylls med en gasblandning, innefattande minst en fysiolo- 30 giskt godtagbar halogenerad kolvätegas eller stabil fluo-rerad kalkogenid med ett förhällande mellan lösligheten i vatten, uttryckt som liter gas per liter vatten vid stan-dar dbe t inge 1 s er, och kva dr at r 01 en av molekylvikten i dal-ton är under 0,0027. 35 12. Förfarande enligt patentkrav 10 eller 11, kännetecknat av att den vattenhaltiga bäraren inne- häller upplösta lamelliserade fosfolipider ooh stabiliser-ingsmedel som stabiliserar mikrobubblorna.

10. Menetelmä varjoaineiden valmistamiseksi, jotka j käsittävät vaatimuksen 1 mukaisia kaasutäyhteisten mikro-rakkuloiden suspensioita vesipitoisessa nestekantaj afaasissa , t u n net t u siitä, että mikrorakkulat muodos- 25 telaan kaasuseoksen ilmakehässä, joka käsittää vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää halogenoitua hiilivety-kaasua tai stabiilia Huorattua kalkogenidiä, jonka vesiliukoisuuden, ilmaistuna kaasulitroina vesilitraa kohden s t a n d a r d i o 1 c s uhkeissa, suhde ino 1 e kyy 1 i painon neliöjuureen, 30 daltoneina, on alle 0,0027.

11. Menetelmä varjoaineiden valmistamiseksi, jotka 1 käsittävät patenttivaatimuksen 1 mukaisten kaasutäytteis- ten mikrorakkuloiden suspensioita vesipitoisessa nestekafi- | tajafaasissa, tunnet t u siitä, että jo valmistetut I 35 mikrorakkulat täytetään kaasuseoksella, joka käsittää va- j hintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää halogenoitua ] j 'hiili vety kaasua, tai stabiilia fluorattua kalkogenidiä, jonka vesiliukoisuuden, ilmaistuna kaäsulitroina vesilit-raä kohden standardioiosuhteissa, suhde molekyylipainon neliöjuureen, daltoneina, on alle 0,0027.

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen mene telmä, t u n n e t t u siitä, että vesipitoinen kantaja sisältää liuenneita lamellisoituheita fosfolipidejä ja stabilointiaineita, jotka stabiloivat mikrokuplia.

13. Förfarande enligt patentkrav 11, kanneta cknat av att mikrovesiklarna bildas i tvä st eg, var- 5: vid i det första steget .mikrovesiklarna eller torra för- stadier tili dessa i förväg bildas i en atmosfär av en första gas, varefter inoiri: det andra steget ätminstone en del av den första gasen byts ut mot den fysioiogiskt god-tagbara halogenerade kolvätegasen eller en stabil fluore- 10 rad kalkogenid.

13. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, 10. u n n e t t u siitä, että mikrorakkulat muodostetaan kahdessa vaiheessa,: ensimmäisessä vaiheessa, jossa mikro rakkulat tai niiden kuivaesiasteet muodostetaan ennakolta ensimmäisen kaasun ilmakehässä ja sitten toisessa vaiheessa vähintään osa ensimmäisestä kaasusta korvataan fysio- 15 logisesti hyväksyttävällä halogenoiclulla hiilivetykaasulia tai stabiililla fluoratulla kalkogenidi i.la .

14. Förf arande enligt; patentkrav 13, kanne-tecknat av att bildandet av mikrovesiklarha tied gas-blandningen genomförs genom att de torra förstadierna tili dessa omväxlande utsätts för undertryek ooh normalt tryck, 15 äterställt med den nänuida gasblandningen, varpä första- dierna slutligen loses i en vätskeformig bärare.

14. Patentti'vaatimuksen 13 mukainen menetelmä, t ύ n n e t t u siitä, että mikrorakkuloiden muodostaminen mainitulla kaasus ©akselia suoritetaan vuorotellen ai- 20 tistamalla niiden kuivat esiasteet alipaineelle ja palauttamalla paine mainitulla kaasuseoksella ja dispergoimalla esiasteet lopuksi nestekantajaan.

15. Förfarahde enligt patentkrav 13, k ä miete cknat av att den första gasen är luft, kväve eller co2. 20 16. Förfarande enligt paten tkr aven 10 - 15, k ä n n e t e c k n a t av att den halogenerade kolvätegasen eller den stabila fluorerade kalkogeniden är SF6 ellei" en freon vald bland CF4, C4Fe, CC1F3, C2F5, C2C1F5, CBrClF2, C 2 C12 F λ eller C4F1G- 25 17. Förfarande enligt pätentkrav 13, kanne - tecknat av att den första gasen belt ooh hället ersätts av den andra fysioiogiskt godtagbara halogenerade kolvätegasen eller stabila £ luorerade kalkogeniden, vald bland CF4, C4F8, GCIF3, C2F6, G2DIF5, CBrGlFj, C2CX2F4 eller C4F10. 30 18. Förfarande enligt patentkrav 11, k anne- tecknat av att fyllandet av mikrovesiklarna med gasblandningen genoioförs genom att suspensionen av mikrovesiklarna genoströminäs med gasblandnihgen.

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että ensimmäinen kaasu on ilmaa, 25 typpeä tai CQ2:a.

16. Patenttivaatimusten 10 - 15 mukainen menetelmä, t u n h e t t u siitä, että halogenoitu hiilivety-kaasu tai stabiili fluotatta kalkogenidi on SF6, tai freoni valittuna ryhmästä CFi5, G4F8., CG 1F 3, C-FV, C2CIF5,

30 CBrClF?, C2CI2F4 tai ChF2o·

17. Paten tt iva at imuksen 13 mukainen menetelmä:, t u n n e t t u siitä, että ensimmäinen kaasu korvataan täysin toisella fysiologisesti hyväksyttävällä halo-genoidullä hiilivetykaasulla tai stabiililla fluoratulla 35 kalkogenidillä, joka valitaan ryhmästä CF*., C^Fg, CCIF3, C2F6, C2CIF5, CBrCiFj, C2C12F4 tai C4F:l0.

18, Patenttivaatimuksen. 11 mukainen menetelmä, t u n n e t t ti siitä# että mikrorakkuloiden täyttäminen k aa s u s e o ks e11a toteut et aan h u uht e1emalia mikrorakku1oiden suspens iota kaasuskokse11a.

19. Förstadier tili kontrastmedel, bestaende av 35 ett torrt pulver innefattande lyofiliserade liposomer och stabiliseringsmedel, varvid pulvret är äispergex"bart i en vattenhaltig vätskeformig bärare till att ge ekogeniska suspensioner av gasfyllda mikrovesiklar enligt patentkrav 1, varvid pulvret lagras i en atmosfär av en gasblandning, innefattande minst en fysiologiskt godtagbar halogenerad 5 kolvätegas ellei* en s tahi 1 fluorerad kalkogenid rned ett förhctllande mellan lösligheten i vatten, uttryckt som liter gas per liter vatten vid s tandardbetingelser, och kvadratroten av πιο 1 eky 1 vikcen i dalton är under 0,0027.

19. Varjoaine-esiasteet, jotka koostuvat kuivajau heesta , joka käsittää lyofilisoitujä liposomejä ja stabilointia ineit a, jauhe on di spergcituva vesipitoiseen neste-kantajaan muodostaakseen patenttivaatimuksen 1 mukaisia k ai ku ku vaus s usp en s io i t a kaa s u t äytteisistä mi krora kku1oi s-10 ta, jolloin mainittu jauhe varastoidaan kaasuseoksen ilmakehässä, joka käsittää vähintään yhtä fysiologisesti hyväksyttävää halogenoitua hiilivety-kaasua tai stabiilia fluorattua kalkogenidiä, jonka vesiliukoisuuden, ilmaistuna kaa sulit roina ves.il it raa kohden standardiolosuhteissa, 15 suhde molekyylipainon neliöjuureen, da 1 poneina, ori alle 0, 0027.,

20. Förstadier till kontrastmedel, bestäende av 10 ett torrt pulver innefattande lyofiliserade liposomer och stabiliseringsmedel, varvid pulvret är dispergerbart i en vattenhaltig vätskeformig bärare till att ge ekogeniska suspensioner av gasfyllda mikrovesiklar enligt patentkrav 1, varvid pulvret lagras i en atmosfär av en fysiologiskt 15 godtagbar halogenerad kolvätegas eller en stabil fluorerad kalkogenid med ett förhällanäe mellan lösligheten i vatten, uttryckt som liter gas per liter vatten vid standard-bet ingelser, och kvadratroten av molekylvikten i dalton är under 0,0027. 20 21. Förstadier till kontrastmedel enligt patent krav 19 eller 20, k ä n n e t e c k n. a d e av att liposomerna innefattar fosfolipider vilkas fettsyraester innehdller 16 kolatomer eller fler.

20. Varjoaine-esiasteet, jotka koostuvat kuivajauheesta, joka käsittää lyofilisoitujä liposomeja ja stabilointiaineita, jauhe on dispergoituva vesipitoiseen neste- 20 kantajaan muodostaakseen patenttivaatimuksen 1 mukaisia k a i k u k uv a u s s u s p e n s i o i t a k a a s u t ä y 11 e i s i s t ä mi kr o ra k kulo i s-ta, jolloin mainittu jauhe varastoidaan fysiologisesti hyväksyttävän halogenoidun hiilivetykaasun tai stabiilin fluoratun kalkogenidin ilmakehässä, jonka vesiliukoisuu-25 den, ilmaistuna kaasuiitroina vesilitraa kohden standardi-olosuhteissa, suhde molekyylipainon neliöjuureen, dalto-neina, on alle 0,0027.

20 CoCl,!! tai C^Fia- I

21. Patenttivaatimuksen 19 tai 20 mukaiset; varjoaine-esiasteet, t u n n e t tu siitä:, että liposömit kä- 30 sittävät fosfolipideja, joiden räsVahappotähteessä on vähintään 16 'hiiliatomia.

22. Förstadier till 'kontrastmedel enligt patent-2 5 krav 19 eller 20, kä n n e t e c k n a d e av att den halogene- rade kolvätegasen eller den stabila fluorerade kalkogeni-den är SFg eller en freon vald bland CF4, C4F8, CC1f3, C2F6:, C2CIF5, CBrClF2, C2CI2F4 eller C<F)0.

22. Patenttivaatimuksen 19 tai 20 mukaiset varjoaine-esiasteet, t u n n e t t u siitä, että halogenoitu ! hiilivetykaasu tai stabiili fluorattu kalkogenidi on SF6 35: tai freoni, joka valitaan ryhmästä CF*, C4F8, CC1F3, C2F6, CsClFs:, CBrClFs, .CaClgF* tai C^o.

23. Kontrastmedel enligt patentkrav 1 - 9 for an-30 vändning vid ultraljudsavbildning av en mämniskas eller ett djurs kropp.

23. Patenttivaatimusten 1-9 mukaisia varjoaineita käytettäväksi ihmisen tai eläimen kehon ultraäänikuvauksessa .

24. Patenttivaatimusten 19 - 22 mukaisten varjoai-5 ne-esiasteiden käyttö ultraäänivarjoaineiden valmistamiseksi. 1,. Kontrastmedei för ultral judsekograf i innerat-tande, i form av en suspension i en vattehhaitig fiytande 5 bärarfas, mikroyesiklar fyllda med en gas slier en gas-hlandning, vilka mikrovesiklai" ant ingen Sr irtikrobnbblor med ett immateriellt slier flyktigt liöl je, d. v. s . som en-dast omges av en vftgg av vätska, vars ytspanning modi-fieras av närvaron av ett ytaktivt amne, eller mikrobal-10 longer omgivna ay ett konkret hölje, av en organisk poly-rttermembran, kanne tecknat av att gasblandningen inne-fattar minst. en fysiolpgiskt godtaghar halogenerad kolvä-tegas eller en stabil fluorerad kalkogenid med ett förhal-lande mellan lqsliglieten i vat ten, utfcryekt som liter gas 15 per liter vatten vid sfcandardbetingelser, och kvadratroten av molekylvikten i dalton är under 0,0027, med undantag ay mikroballonger innefattande SFs eller CF4 och med ett skal av icke-proteinhaltiga tvärbundna eller polymeriserade am-fifila enheter eller av protein tvärbundet med biologiskt 20 nedbrytbara grupper.

24. Mivändning av förstadier till kontrastmedel enligt patentkrav 19 ~ 22 för framstäilning av ultraljuds-kontrastmedel.