JPH05255127A - 耐圧性気体封入微小気泡の長寿命懸濁物及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の安定な、水性担体液中の気体封入微
小気泡の分散体又は組成物の提供を目的とする。 【構成】 超音波エコグラフィーにおける増影剤として
利用される気体封入微小気泡に、加圧のもとでの破裂に
対する顕著な耐久性を、標準条件のもとでの水１リット
ルに溶解する気体のリットル数を分子量の平方根で割っ
た値として表わす水における溶解度が０．００３を超え
ることのない充填気体を利用することによって授けるこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は水性担体液中の気体封入
微小気泡の安定な分散体又は組成物に関する。このよう
な分散体は一般に、液体の中で気体が均質に分散されて
いることを必要とするようなほとんどの種類の用途にと
って有用である。このような分散体に関する注目すべき
用途の一つは、例えば超音波エコグラフィー及びその他
の医療用途のために生体に注射されることにある。本発
明は製剤の中に包括されている数種の物質、例えば耐圧
気体封入マイクロバブル、マイクロカプセル及びマイク
ロバルーンを含む上記の組成物の製造方法にも関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】液体に
懸濁されている、空気又は気体の微小体又は微小球（本
明細書では微小気泡と定義する）、例えばマイクロバブ
ル又はマイクロバルーンはエコグラフィーにとって特に
有効な超音波リフレクターである。本明細書において、
「マイクロバブル」なる語は特に、液体の中に懸濁され
ている、空気又は気体の封入された中空球体又は小球を
意味し、これは一般に分割された状態において空気又は
気体を液体の中に導入することに由来し、この液体は好
ましくはこのバブルの表面特性及び安定性をコントロー
ルするために界面活性剤も含んでいる。「マイクロカプ
セル」又は「マイクロバルーン」なる語は、好ましくは
境界又は囲い、例えばポリマー膜壁を有する空気又は気
体封入体を意味する。マイクロバブル及びマイクロバブ
ルは両者とも超音波造影剤として有用である。例えば生
体の血流の中に、担体液中の空気封入マイクロバブル又
はマイクロバルーン（０．５〜１０μｍの範囲におけ
る）の懸濁物を注射することは、超音波エコグラフィー
イメージングを強く補強し、それ故内臓の識別化に役立
つ。血管及び内臓のイメージングは医療診断、例えば心
臓血管及びその他の疾患の検査に大いに役立つことがで
きる。

【０００３】注射可能な液状担体におけるエコグラフィ
ーに適するマイクロバブルの懸濁物の生成は、この液体
の中に加圧のもとで溶解せしめた気体を放出させること
により、又は気体状生成物を発生せしめる化学反応によ
り、又は液体と、空気もしくは気体が捕促又は吸着され
ている可溶性又は不溶性固体とを混合せしめることによ
って提供されうる。

【０００４】例えば米国出願第４，４４６，４４２号
（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）において、（ａ）担体液（水性）
中の界面活性剤の溶液及び（ｂ）安定剤としての増粘剤
の溶液を利用した、無菌の注射可能な液状担体の中での
気体マイクロバブルの懸濁物の製造に関する一連の種々
の技術が開示されている。バブルを発生させるためのそ
の中に開示されている技術には、（ａ），（ｂ）及び空
気の混合物を高速で小さな開口部に押し通すこと；又は
使用直前に、生理学的に許容されている気体と一緒に
（ａ）を（ｂ）の中に導入すること；又は酸を（ａ）
に、そして炭酸塩を（ｂ）に加え、この両組成物を使用
直前に一緒に混合し、これによって酸を炭酸塩と反応さ
せてＣＯ₂ バブルを発生させること；又は保存下にある
（ａ）と（ｂ）の混合物に過剰加圧気体を付加すること
（この気体はこの混合物が注射に利用されるときにマイ
クロバブルとなって放出される）が含まれている。

【０００５】ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−１３１，５
４０号（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）は、安定化注射可能担体
液、例えば塩の生理学的水溶液、又はマルトース、デキ
ストロース、ラクトースもしくはガラクトースのような
糖の溶液を、封入された空気を含む同種類の糖の固体微
粒子（０．１〜１μｍの範囲）と混合する、マイクロバ
ブル懸濁物の調製を開示する。液状担体の中においてバ
ブルの懸濁物を発生させるため、液体及び固体成分の両
者を一緒に無菌状態のもとで数秒間攪拌しており、そし
て作製されたらこの懸濁物は直ちに利用されなければな
らない。即ち、これはエコグラフィー測定のために５〜
１０分以内に注射されるべきである。事実、これらは消
失性であるため、バブル濃度はこの時期経過後は実用に
則するには低くなりすぎる。

【０００６】消失性の問題を解決するための試みにおい
て、マイクロバルーン、即ち物質壁を有する微小気泡が
開発されている。前記した通り、マイクロバブルは無形
の消失性境界を有するにすぎないもの、即ちこれらは液
体の壁によって囲まれているにすぎず、その表面張力は
界面活性剤の存在によって改質されているものであり、
マイクロバルーン又はマイクロカプセルは実存する物
質、例えば一定の機械力を有するポリマー膜より成る実
体的な境界を有している。換言すれば、これらは、空気
又は気体が幾分強く封入されているような物質の微小気
泡である。

【０００７】例えば、米国特許出願ＵＳ−Ａ−４，２７
６，８８５号（Ｔｉｃｋｎｅｒら）は超音波イメージを
強めるための気体を含む表層膜マイクロカプセルの利用
を開示しており、この膜は複数の無毒且つ非抗原性有機
分子を含んでいる。開示態様において、これらのマイク
ロバブルは癒着を阻止するようなゼラチン膜を有してお
り、そしてそれらの好ましい大きさは５−１０μｍであ
る。このようなマイクロバブルの膜はエコグラフィー測
定を行うのに十分に安定であるとされている。

【０００８】ゼラチンを有さない空気封入マイクロバル
ーンがＵＳ−Ａ−４，７１８，４３３号（Ｆｅｉｎｓｔ
ｅｉｎ）に開示されている。これらの微小気泡は５％の
血清アルブミンのようなタンパク質溶液の音波処理（５
〜３０kHz ）によって作られており、そしてこれらは２
〜２０μｍの範囲、主としては２〜４μｍの直径を有し
ている。この微小気泡は音波処理後に、例えば熱又は化
学的手段、例えばホルムアルデヒドもしくはグルタルア
ルデヒドとの反応を利用することによる膜形成タンパク
質の変性によって安定化されている。この操作により得
られる安定な微小気泡の濃度は、２〜４μｍの範囲にお
いて約８×１０⁶ 個／ml，４〜５μｍの範囲において約
１０⁶ 個／ml、そして５〜６μｍの範囲において５×１
０⁵ 個以下であるとされている。このような微小気泡の
安定時間は４８時間以上とされており、従ってこれは静
脈内注射の後に有利な左心臓イメージングを可能とす
る。例えば、末梢血管の中に注射された際の音波処理ア
ルブミンマイクロバブルは肺動脈を通過することができ
る。このことは、左心室腔及び心筋組織の心エコー検査
的不透明化をもたらす。

【０００９】最近、注射型超音波エコグラフィーのため
に更に改良されたマイクロバルーンがＥＰ−Ａ−３２
４，９３８号（Ｗｉｄｄｅｒ）において報告されてい
る。この明細書においては、高濃度（１０⁸ 個／ml）の
１０μｍ以下の空気封入タンパク質境界された微小気泡
が開示され、これは数ケ月以上の半減期を有する。この
ようなマイクロバルーンの水性懸濁物は熱変性するタン
パク質、例えば人血清アルブミンの溶液の超音波キャビ
テーション（空洞形成）（この操作は膜形成タンパク質
の多少の発泡をももたらす）及び加熱によるその後の硬
化によって作られる。その他のタンパク質、例えばヘモ
グロビン及びコラーゲンもこの処理において好都合であ
るとされている。ＥＰ−Ａ−３２４，９３８号に開示さ
れているマイクロバルーンの懸濁物の高い保存安定性
は、それらを液状担体相と一緒に市販されることを可能
とし、このことは使用前の調製を必要としないことによ
り、強い商業的価値である。

【００１０】水性マイクロバブル懸濁物の調製に関して
似たような利点が最近になって発見されており、即ち、
水の添加に基づいて寿命の長いバブル懸濁物を発生せし
めうるような保存安定性乾燥粉末組成物が見い出されて
いる。これは出願ＰＣＴ／ＥＰ９１／００６２０に開示
されており、ここでは膜形成脂質を含んで成るリポソー
ムを凍結乾燥しており、一定期間にわたり空気又は気体
に暴露せしめた後のこの凍結乾燥脂質は、それへの水性
液状担体の単なる添加に基づいて寿命の長いバブル懸濁
物を提供しうる。

【００１１】水性マイクロバブル懸濁物の保存のもとで
の安定性に関して数多くの進歩が達成されているにもか
かわらず、これらは予備又は最終のいづれかの調製段階
に属し、この懸濁物が過剰圧力、例えば患者の血流及び
その後の心臓脈拍、特に左心室に注射された後に起こり
うるような圧力変化にさらされるときの気泡耐久性の問
題がまだ残っている。実際、例えば麻酔したウサギにお
いて、この圧力変化は、注射の後の一定期間にわたって
バブル数を実質的に変えるほど十分でないことを本発明
者は観察した。一方、イヌ及びヒト患者においては、一
般の気体例えば空気、メタン又はＣＯ₂ が封入されてい
る典型的なマイクロバブル又はマイクロバルーンは注射
の後に血圧効果に基づいて数秒間で完全に破裂するであ
ろう。この所見は他の者によって確認されている：例え
ばＳ．ＧＯＴＴＬＩＥＢら著、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ｏｆ
Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ３（１９９０）
２３８には、音波法によって調製された架橋アルブミン
マイクロバルーンが６０トルの過剰圧力にかけられた後
に反響的性質の全てを失うことを報告している。従っ
て、エコグラフィー測定が生体内において安全且つ再現
性よく行われることを保証するため、このような問題を
解決し且つ加圧のもとでマイクロバブル及び膜境界化マ
イクロバルーンの懸濁物の利用寿命を伸ばすことが重要
である。

【００１２】他に分類される反響性イメージ増強剤が提
案されていることをこの段階にて言及すべきであり、こ
れは多孔質構造を有し、その孔が空気又は気体を含んで
いるような単純な微小球体より成るために過剰圧力に耐
久性である。このような微小球体は例えばＷＯ−Ａ−９
１／１２８２３号（ＤＥＬＴＡ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ
ＯＧＹ），ＥＰ−Ａ−３２７，４９０号（ＳＣＨＥＲＩ
ＮＧ）及びＥＰ−Ａ−４５８，０７９号（ＨＯＥＣＨＳ
Ｔ）に開示されている。この単純な多孔質微小球の欠点
は、囲まれている気体封入自由空間がよい反響応答にと
っては一般的に小さすぎること、及びこの球体が適切な
弾性を欠くことにある。それ故、中空微小気泡が一般的
に好ましく、従って破裂問題の解決が探索されている。

【００１３】

【課題を解決するための具体的手段】この問題は請求項
に記載の範囲に従う気体又は気体混合物を利用すること
によりここで解決される。簡単に述べると、反響性微小
気泡を気体の存在下において作ったとき、それぞれは以
下の式に従う物理的性質を有する気体を部分的に封入し
ており、従ってこの微小気泡は注射後に再現性のあるエ
コグラフィー測定を得るのに十分な時間にわたり６０ト
ル以上の圧力にめざましく耐久することを発見した：

【数１】

【００１４】上記の式において、「Ｓ」は「ブンゼン」
（Ｂｕｎｓｅｎ）係数として表わす水における溶解度、
即ち標準条件（１バール、２５℃）のもとで且つ１atm
での一定の気体の部分圧（Ｇａｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａ
ｅｄｉａ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ１９７６を参照のこと）の
もとで単位容量水に溶解される気体の容量を示してい
る。このような条件及び定義のもとでは、空気の溶解度
は０．０１６７であり、且つその平均分子量（Ｍｗ）の
平方根は５．３９であるため、上記の関係は、 Ｓ_gas ／√Ｍｗ_gas ≦０．０３１ に略される。

【００１５】以降に記載の実施例においてわかる通り、
数多くの異なる種類の気体及びそれらの混合物を封入し
ている反響性マイクロバブル及びマイクロバルーン（表
を参照のこと）の試験、並びに圧力増加に対するそれら
の対応の耐久性を、生体内及び試験内試験の両方におい
て開示する。表において、溶解度係数も「Ｌ′ＡｉｒＬ
ｉｑｕｉｄｅ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ
（１９７６）の前記したＧａｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅ
ｄｉａから抜粋している。

【００１６】本発明に関する気体を含む水懸濁物中の微
小気泡は、エコグラフィー用造影剤として現在までに利
用されている開示されたほとんどの種類のマイクロバブ
ル及びマイクロバルーンを含んでいる。好ましいマイク
ロバルーンはＥＰ−Ａ−３２４，９３８号，ＰＣＴ／Ｅ
Ｐ９１／０１７０６号及びＥＰ−Ａ−４５８，７４５号
に開示されているものであり；好ましいマイクロバブル
はＰＣＴ／ＥＰ９１／００６２０号に開示されているも
のであり；これらのマイクロバブルは好都合には水性液
体、並びに層状（ｌａｍｅｌｌａｒｉｚｅｄ）の凍結乾
燥されたリン脂質及び安定剤を含む乾燥粉末（微小気泡
前駆体）より形成される。マイクロバブルはこの粉末を
この水性液状担体と一緒に攪拌することにより発生す
る。ＥＰ−Ａ−４５８，７４５号のマイクロバルーン
は、多孔率がコントロールされた弾性的な界面沈澱化ポ
リマー膜を有する。これらは一般に水性液の中で浮濁物
をポリマー溶液の微小液滴にし、次にこのポリマーをこ
の溶液から沈殿させて液滴／液界面にフィルム形成膜を
形成せしめることにより獲得し（この工程はまず液体封
入微小気泡の形成をもたらす）、その液状コアを最後に
気体により置換することより成る。

【００１７】本発明の方法を実施するため、即ち微小気
泡であって水性担体におけるその懸濁物が前記の式に従
う気体と一緒に所望の反響性補助剤を構成するようなも
のを形成又は封入するため、第一の態様として（１）任
意の種類の適当な気体の存在下において任意の常用の技
術によって適当な出発材料から微小気泡を作ること、及
び（２）はじめに利用した気体（第一気体）を交換し
て、本発明に関する新しい種類の気体（第二気体）を有
する微小気泡を調製すること（気体交換技術）、より成
る二段階工程を利用することができる。

【００１８】そうでなければ第二の態様に従い、本発明
に関する新しい種類の気体の雰囲気下で、適当な常法に
よって所望の懸濁物を直接調製することができる。

【００１９】二段階工程を用いる場合、最初の気体をま
ずこの気泡から除去し（例えば吸引のもとで排気するこ
とにより）、その後第二気体をこの排気産物と接触させ
ることにより交換するか、又はそうでなければ第一の気
体を含み続けている気泡を第二気体と、この第二気体が
この気泡から第一気体を追い出すような条件のもとで接
触させること（気体置換）により交換することができ
る。例えば、この気泡懸濁物又は好ましくはその前駆体
（ここでは前駆体はこの微小気泡境界を構成する材料で
あるか、又は水性担体液との攪拌に基づいてこの液体の
中でマイクロバブルの形成を発生せしめうる材料を意味
しうる）を減圧にさらして除去すべき気体を排気し、次
いで置換のために所望される気体で周囲圧を回復させる
ことによって行うことができる。この工程は新たな気体
によるもとの気体の完全なる交換を保証するために１回
又は複数回繰り返されうる。この態様は、一定量の担体
液との混合に基づいて反響補助剤のバブルを再生又は発
生せしめるであろう乾燥保存されている前駆体調製品、
例えば乾燥粉末に特に適応する。従い、マイクロバブル
を水性相と乾燥層状リン脂質から形成する場合、例えば
脱水化凍結乾燥リポソームと安定剤との粉末をその後液
状水性担体相の中での攪拌のもとで分散せしめることに
より形成する場合、この乾燥粉末は本発明に従って選ん
だ気体の雰囲気のもとで保存することが好都合である。
このような種類の調製品はこの状態において無限に保た
れることができ、そして注射前に無菌水の中に分散させ
ることを条件として診断のためにあらゆるときに利用さ
れうる。

【００２０】他方、そして特に気体交換を液状担体相の
中の微小気泡の懸濁物に適用するとき、この液状担体相
の中に第二気体をフラッシュし、所望の目的にとって十
分な交換（部分的又は完全に）を行う。フラッシングは
ガス管から吹き込むことによって行うか、又はある場合
においては、気泡を含む液体の表層をゆっくり攪拌しな
がらこれに新たな種類の気体の気流（連続的又は不連続
的に）を単に流すことによって行う。この場合、この懸
濁物を含むフラスコの中に交換気体を一回だけ付加しそ
してしばらく放置させるか、又は１又は数回繰り返して
この繰り返しの程度（気体交換）がある程度完全なもの
となることを保証することができる。

【００２１】他方、前記した第二の態様において、反響
性補助剤の懸濁物の完全調製は、従来技術に挙げられる
通常の前駆体（出発材料）から出発し、そして従来技術
の通常の手段に従って操作することにより行われるが、
ただし、例えば空気、窒素、ＣＯ₂ 等を通常挙げる従来
技術のそれに代わって本発明に関する所望の気体又は混
合気体の存在下においてそれを行う。

【００２２】一般に、微小気泡を調製するための第一種
類の気体の利用、及びその後の第二種類の気体によるは
じめの気体の置換を包括する調製方法（この第二気体は
前記微小気泡に異なる反響特性を授けることを意図す
る）は以下の利点を有する。以降の実施例における結果
からよくわかる通り、微小気泡、特にポリマー境界を有
するマイクロバルーンを作製するために用いている気体
の性質は、前記微小気泡の全体的な大きさ（即ち直径の
平均値）に一定の影響を及ぼしている；例えば、精密な
条件によって空気のもとで調製したマイクロバルーンの
大きさを左及び右心室のエコグラフィーにとって所望さ
れる大きさの範囲、例えば１〜１０μｍの範囲内に属す
るように正確にコントロールすることができる。これは
他の種類の気体、特に本発明の要件に従う気体ではあま
り容易ではない。従って、一定の範囲の大きさにあり、
且つ直接的な調製を不可能又は非常に困難にするであろ
う性質の気体を封入している微小気泡を獲得することを
希望するとき、その方法は二段階調製工程、即ち、まず
より正確な直径及び数のコントロールを可能にするよう
な気体によって微小気泡を調製し、その後この第一気体
を気体交換によって第二気体と交換することよりなるで
あろう。

【００２３】本実施例の説明において、水又はその他の
水性溶液の中に懸濁した気体封入微小気泡は周囲よりも
高い圧力にかけている。この過剰圧力が一定の値（これ
は一連の微小球パラメーター及び作業条件、例えば温
度、圧縮率、担体液の性質及び溶存気体の含有量〔この
パラメーターの相対的な重要性は以降に詳細する〕、気
体充填剤の性質、反響性材料の種類、等にとっての一般
に典型的な値）に到達したとき、この微小気泡は破裂し
始め、バブル数は圧力の増大に伴って徐々に減少し、音
響リフレクター効果の完全なる消失が生ずるようにな
る。この現象は光学的によりよく追尾でき、なぜならこ
れは光学濃度における対応の変化に平行するから、即ち
バブルが連続的に破裂するに従って媒質の透過性は上昇
するからである。このため、微小気泡の水性懸濁物（又
はその適当な希釈物）を２５℃に維持した（標準条件）
光度計セルの中に入れ、そして６００又は７００nmに
て、陽圧静水過剰圧を適用し且つ徐々に増加させながら
吸光度を連続的に測定する。この圧力はベリスターポン
プ（ＧＩＬＳＯＮ社のＭｉｎｉ−ｐｕｌｓ）により、光
度計セル（これは漏れ止めシールされている）に接続さ
れている種々の高さの液状カラムを給水することによっ
て発生させる。圧力はトルで較正した水銀マノメーター
によって測定した。圧縮比は経時的に、ポンプスピード
（rpm ）と直線関係にあることが見い出された。上記の
範囲における吸光度は担体液中の微小気泡濃度に比例す
ることが見い出された。

【００２４】図１は、吸光度対圧力の変化がシグモイド
型曲線によって表わされていることを示す。一定の圧力
の値までこの曲線はほぼ平らであり、これはバブルが安
定であることを示唆している。次に、相対的に急速な吸
光度落下が起こり、これはわずかな圧力増加がバブル数
に幾分劇的な効果を及ぼす比較的狭い臨界領域の存在を
示唆する。全ての微小気泡が消失すると、この曲線は再
び水平になる。この曲線の臨界点を最高及び最低光学値
の中間、即ち、「完全なバブル」（ＯＤｍａｘ）及び
「バブルなし」（ＯＤｍｉｎ）測定値の中間値として選
び、これは事実上最初に存在していたバブルの約５０％
が消失したこと、即ち、光度濃度値が初期測定値の約半
分であることに相当し、これをグラフの中に、加圧せし
めた懸濁物の透過性の最大（基底線）の高さに対して記
載した。曲線の傾きが最大である箇所にも近いこの点を
臨界圧ＰＣと定義する。一定の気体に関して、ＰＣは上
記のパラメーターに依存するだけでなく、担体液に既に
溶存している気体の実際の濃度にも特に依存することが
見い出されている：気体濃度が高いほど、臨界圧は高く
なる。これに関連して、担体相を可溶性気体によって飽
和にすることによって微小気泡の加圧のもとでの破裂に
対する耐久性を高めることができ、この可溶性気体はこ
の気泡の充填物と同一種類であっても異なっていてもよ
い。例えば、空気封入微小気泡は、担体液としてＣＯ₂
の飽和溶液を用いることによって過剰圧（＞１２０ト
ル）に非常に耐性にすることができる。残念ながら、こ
の発見は診断分野においては規制された価値を有し、な
ぜなら造影剤を患者の血流に注射すると（その気体含有
量はむろん外でコントロールしてある）、これは注射さ
れたサンプル中にはじめから溶存している気体の効果が
無視されるような程度にまでその中で希釈されてしまう
からである。

【００２５】微小球充填剤としての種々の気体の性能を
再現よく比較するためのその他の容易に得られるパラメ
ーターは、バブル数がはじめのバブル数の７５％と２５
％に相当する圧力値によって規定される圧力間隔（Δ
Ｐ）の幅である。驚くべきことには、差圧ＤＰ＝Ｐ₂₅−
Ｐ₇₅が約２５〜３０トルの値を超える気体に関しては、
気体封入微小気泡に対する血圧の破壊効果は小さい、即
ち、バブル数の実際の減少が十分にゆっくりとなり、エ
コグラフィー測定の有意性、精度及び再現性を悪くしな
いほどとなることが見い出された。

【００２６】他に、ＰＣ及びΔＰの値は図１に示す試験
実験における圧力の上昇速度にも依存する、即ち、圧力
上昇速度の一定の間隔において（例えば数十から数百ト
ル／分の範囲において）、その速度が高くなるほど、Ｐ
Ｃ及びΔＰに関する値は高くなることが見い出せた。こ
の理由のため、標準温度条件のもとで行った比較も１０
０トル／分の一定上昇速度で行った。ところで、ＰＣ及
びΔＰ値の測定における圧力上昇速度の効果は非常に速
い速度で水平となることに注目すべきである；例えば数
百トル／分の速度のもとで測定した値は心拍動により規
定される条件のもとで測定される値と有意の差がない。

【００２７】なぜ一定の種類の気体が上記の特性に従
い、そして他の種がそれに従わないかの本当の理由はよ
くわかっていないが、いくつかの関係がおそらくは存在
していることが考えられ、それには分子量及び水溶解度
の他に、溶解速度及びその他のパラメーターが含まれる
であろう。しかしながらこれらのパラメーターは本発明
の実施のために知る必要はなく、なぜなら気体の適格性
は上記の臨界に従って容易に決定されうるからである。

【００２８】本発明に特に適する気体の種類は例えばハ
ロゲン化炭化水素、例えばＣＦ₄ ，ＣＢｒＦ₃ ，Ｃ₄ Ｆ
₈ ，ＣＣｌＦ₃ ，ＣＣｌ₂ Ｆ₂ ，Ｃ₂ Ｆ₆ ，Ｃ₂ ＣｌＦ
₅ ，ＣＢｒＣＣｌＦ₂ ，Ｃ₂ Ｃｌ₂ Ｆ₄ ，ＣＢｒ₂ Ｆ₂
及びＣ₄ Ｆ₁₀、フレオン並びに安定なフッ素化カルコゲ
ニド、例えばＳＦ₆ ，ＳｅＦ₆ 等が挙げられる。

【００２９】本発明に関する微小気泡のための担体とし
て利用される液体の気体飽和の程度は圧力変化のもとで
の気泡安定性に重要であることを前記した。実際には、
本発明の反響性懸濁物を作るために微小気泡を分散せし
めてある担体液は気体、好ましくはこの微小気泡に封入
されているものと同じ種類の気体によって平衡に飽和さ
れており、圧力の変化のもとで破裂する微小気泡の耐久
性はめざましく上昇している。従って、造影剤として利
用される製品が、使用直前に担体液と混合するように乾
燥状態で販売されているとき（例えば前記したＰＣＴ／
ＥＰ９１／００６２０に開示されている製品）、気体飽
和水性担体をその分散のために利用することが有利であ
る。他方、エコグラフィーの造影剤としてすぐに利用で
きる微小気泡懸濁物が販売されているとき、気体飽和水
性溶液を準備のための担体液として利用することが有利
であろう。この場合、この懸濁物の貯蔵寿命は相当長く
なり、従ってこの製品は長期間、例えば数週間から数ケ
月間、そして更には特別のケースとして１年間ほど実質
的に変質することなく（バブル数の実質的な変化なし
で）保存されることができるであろう。気体による液体
の飽和化は最も簡単には単に気体を室温にて一定の時間
にわたって液体の中に吹き込むことにより行われうる。

【００３０】

【実施例】実施例１ 空気又は種々の気体により充填されているアルブミン微
小気泡をＥＰ−Ａ−３２４，９３８号に記載の通り、ブ
ラッド トランスフュージョン サービス、赤十字機
構、ベルン、スイス国より入手した５％ヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）により充填された１０mlの目盛シリンジ
を用いて調製した。ソニケータープローブ（ブランソン
ウルトラソニック社、米国のソニファーモデル２５
０）をこのシリンジの４mlの標線に至るまでこの溶液の
中に浸し、そして音波処理を２５秒行った（エネルギー
設定値＝８）。次にこのソニケータープローブこの溶液
の水平面の６mlの標線までもち上げ、そして音波処理を
パルスモード（周期＝０．３）のもとで再び４０秒間行
った。４℃で一夜放置させた後、微小気泡をほとんど含
む最上層が浮力によって形成され、そして利用されなか
った変性タンパク質のアルブミン塊及びその他の不溶物
を含む最下層を廃棄した。この微小気泡を新鮮なアルブ
ミン溶液の中に懸濁させた後、この混合物を室温で再び
放置し、そして最後に最上層を集めた。以上の順序を周
囲雰囲気下で行ったときは空気封入マイクロバルーンが
得られる。その他の種類の気体を封入したマイクロバル
ーンを得るには、このアルブミン溶液にまず新しい種の
気体をパージし、次いで上記の操作順序を、この溶液の
表層上にこの気体の気流を流すことで行う。次にこの操
作の終了時に、ガラスボトルの中にこの懸濁物を入れ、
これをシールする前にこの所望の気体を大量に吹き込
む。

【００３１】種々の気体を封入した種々のマイクロバル
ーン懸濁物を、空気で平衡に飽和化させた蒸留水で１：
１０に希釈し、次いでこれらを前記した光学セルに入
れ、そしてこの懸濁物のまわりの圧力を徐々に上げなが
らその吸光度を記録した。測定の際、この懸濁物の温度
は２５℃に保った。

【００３２】この結果を以下の第１表に示し、これは名
称又は化学式により定義する一連の気体に関して表示し
た臨界ＰＣ値、この気体の特徴的パラメーター、即ちＭ
ｗ及び一定の溶解度、並びにもとのバブル数及びバブル
の平均サイズ（容量における平均直径）を表わしてい
る。

【００３３】

【表１】

【００３４】第１表の結果より、臨界圧ＰＣは溶解度が
低い及び分子量の高い気体に関して高いことがわかる。
従って、このような気体を封入した微小気泡は生体内に
おいてより耐久性な反響性信号を提供するであろうこと
が予測されうる。平均バブルサイズが一般に気体溶解度
に伴って大きくなることもわかる。

【００３５】実施例２ 実施例１で調製した数種のマイクロバルーン懸濁物のア
リコート（１ml）を、生体内における反響性を試験する
ために実験用ウサギの頸動脈に注射した。左及び右心室
のイメージングは、アキュソン（Ａｃｕｓｏｎ）１２８
−ＸＰ５エコグラフィー装置及び７．５MHz のトランデ
ューサーを用いるグレースケールモードで行った。左心
室におけるコントラスト増強の持続時間を一定時間にわ
たって信号を記録することによって決定した。この結果
を第２表にまとめ、これは用いた気体のＰＣも示す。

【００３６】

【表２】

【００３７】以上の結果より、試験した気体の臨界圧と
反響性信号との一定の関係の存在がわかる。

【００３８】実施例３ 反響性空気封入ガラクトース微粒子（ＳＣＨＥＲＩＮＧ
ＡＧのＥｃｈｏｖｉｓｔ（商標））の懸濁物を、２０
％のガラクトース溶液８．５ml中のこの固体微粒子３ｇ
を５秒間振騰させることによって得た。他の種類の調製
品においては、Ｅｃｏｈｖｉｓｔ粒子の上の一部の空気
を吸引し（０．２トル）、そしてＳＦ₆雰囲気により置
換させ、これにより、２０％のガラクトース溶液の添加
後、このヘキサフルオリド硫黄を含む微粒子の懸濁物が
得られる。この懸濁物のアリコート（１ml）を実験用ウ
サギに投与し（頸動脈に注射することにより）、そして
心臓のイメージングを前記の実施例に記載の通りに行っ
た。この場合、この反響性微粒子は肺毛細管にわたって
輸送されず、従ってこのイメージングは右心室に限定さ
れ、そして全信号の持続性は特に有効でなかった。第３
表の結果は注射して数秒経過後の信号ピーク強度の値を
示す。

【００３９】

【表３】

【００４０】低い水溶解度を有す不活性気体であるヘキ
サフルオリド硫黄は、空気を封入した比較の懸濁物より
も強い反響性信号を発生する反響性懸濁物を提供するこ
とがわかる。これらの結果は、ＳＦ₆ を含む種々の気体
を封入した空洞及び包接化合物である微粒子のエコグラ
フィー目的のための利用をそれぞれ開示しているＥＰ−
Ａ−４４１，４６８号及び３５７，１６３号（ＳＣＨＥ
ＲＩＮＧ）の教示の観点において特に興味深い。これら
の明細書はしかしながら、反響性応答に関してその他の
より一般的な気体より勝っているＳＦ₆ の特別なる利点
を報告していない。

【００４１】実施例４ 以下の一般的な方法により、気体封入マイクロバブルの
一連の反響性懸濁物を調製した：モル比９／１の水素化
ダイズマメ レシチン（ナターマン ホスホリピドＧｍ
ｂＨ、ドイツ）及びジセチル−ホスフェート（ＤＣＰ）
の混合物１ｇを５０mlのクロロホルムに溶かし、そして
この溶液を１００mlの丸底フラスコに入れ、次いでロー
ターベーパー装置で乾燥するまでエバポレートした。次
に２０mlの蒸留水を加え、そしてこの混合物を７５℃で
１時間ゆっくりと攪拌した。これにより多重層リポソー
ム（ＭＬＶ）の懸濁物の形成がもたらされ、その後これ
を７５℃にて３μｍ及び０．８μｍのポリカーボネート
膜（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ（商標））に順に押し通した。
冷却後、この押し出した懸濁物の１mlのアリコートを９
mlの濃ラクトース溶液（８３ｇ／ｌ）に希釈し、そして
この希釈懸濁物を−４５℃で凍結した。この凍結サンプ
ルを次に高真空のもとで容器の中で自由流動性粉末とな
るまで凍結乾燥し、最後にこれに、空気又は以下の第４
表に挙げる気体から選ばれる気体を封入した。次にこの
粉末状サンプルを担体液としての水１０mlに再懸濁し、
これは前記の容器を充満するために用いたものと同一種
類の気体の気流のもとで行った。この懸濁物をボルテッ
クス ミキサーで１分間、強く振騰させた。

【００４２】種々の懸濁物を事前に２５℃で空気により
平衡にした蒸留水により１：２０に希釈し、次いでこの
希釈物を実施例１に開示の通り、全てのバブルが破裂す
るまで静水圧を徐々に上昇させることにかけた光度計セ
ルにおける光学濃度の測定により、２５℃で加圧試験し
た。この結果を以下の第４表にまとめ、これには更に臨
界圧ＰＣ，ΔＰ値（図１参照）も示している。

【００４３】

【表４】 以上の結果は、圧力上昇に対する最も高い耐久性はほと
んど水の不溶性気体によって提供されることを明確に示
唆する。従ってマイクロバブルの挙動はこの点でマイク
ロバルーンのそれと類似している。更に、高分子量のあ
まり水溶性でない気体は最も平坦なバブル−破裂／圧力
曲線（即ちΔＰが最も広い）を提供し、このことは上記
した通り、反響性応答の持続性の重要な要因である。

【００４４】実施例５ 実施例４の数種のマイクロバブル懸濁物を実施例２に示
した通り実験用ウサギの頸動脈に注射し、そして左心室
のイメージングを前記の通りに行った。有効な反響性信
号が検出される持続時間を記録し、そしてその結果を以
下の第５表に示し、ここでＣ₄ Ｆ₈ はオクタフルオロシ
クロブタンを表わしている。

【００４５】

【表５】 これらの結果は、マイクロバブルのケースにおいても、
本発明の臨界に関する気体は、現在までに利用されてき
たほとんどの気体よりもより長い時間にわたって超音波
エコー信号を提供するであろうことを示唆している。

【００４６】実施例６ マイクロバブルの懸濁物をまさに実施例４に記載の通り
に種々の気体を用いて調製したが、ただしレシチンリン
脂質成分をアバンチ ポラー リピッド，バーミングハ
ム，アラバマ州，米国より入手した等モルのジアラキド
イルホスファチジルコリン（Ｃ₂₀の脂肪酸残基）に代え
た。リン脂質対ＤＣＰのモル比は９／１のままとした。
次にこの懸濁物を実施例４の通りに加圧試験し、以下の
第６Ａ表にまとめた結果を第４表のそれと比較した。

【００４７】

【表６】

【００４８】第４表の結果と比べて上記のそれは、少な
くとも低溶解性気体に関して、リン脂質脂肪酸残基の鎖
を伸ばすことにより、圧力増加に対する反響性懸濁物の
安定性を劇的に高めることができることを示している。
このことは、上記の実験を繰り返すが、ただしリン脂質
成分をそれより高級な類似体、即ち、ジーベヘノイルホ
スファチジルコリン（Ｃ₂₂の脂肪酸残基）に代えること
によって更に確認された。この場合、このマイクロバブ
ル懸濁物の圧力による破裂に対する耐久性は更に上昇し
続けた。

【００４９】本実施例の数種のマイクロバブル懸濁物を
ウサギに関して前記した通りにイヌにおいて試験した
（前側頭血管に５mlのサンプルを注射した後にイメージ
ングした）。実施例４に開示した調製品の挙動と比べて
有効な生体内反響応答の有意なる増強、即ちリン脂質成
分における脂肪酸残基の鎖長の増大は生体内におけるこ
の反響剤の有効寿命を伸ばすことが認められた。

【００５０】以下の表においては、脂肪酸残基が種々の
鎖長を有している一連のリン脂質の懸濁物から調製した
マイクロバブル（ＳＦ₆ ）の、ウサギの左心室における
相対的安定性を示す（投与量：１ml／ウサギ）。

【００５１】

【表７】

【００５２】上記した通り、これらの実施例に記載した
耐久性対圧力の測定に関して、１００トル／分の定常な
圧力上昇速度を維持した。これは、圧力増大の速度の関
数としての種々の気体のＰＣ値の変動を示している以下
の結果により証明される。これらのサンプルにおいて、
用いたリン脂質はＤＭＰＣとした。

【００５３】

【表８】

【００５４】実施例７ 水における懸濁物としての一連のアルブミンマイクロバ
ルーンを、実施例１に記載の方法を利用して空気のもと
で、コントロールされた球体サイズ状態において調製し
た。次に数種のサンプルにおける空気を、周囲圧力にて
気体変換吹き付け法により他の種類の気体と交換した。
次にこれを蒸留水で１：１０に希釈した後、このサンプ
ルを実施例１の通りの加圧試験にかけた。以下の第７表
にまとめた結果より、この二段階調製方法はある場合に
おいて、実施例１の一段階調製方法よりも圧力に対して
より耐性であるエコー発生剤を提供することが見い出せ
うる。

【００５５】

【表９】

【００５６】実施例８ 本発明の方法を従来技術、例えばＷＯ−９２／１１８７
３の実施例１に開示されている実験に適用した。３ｇの
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８（分子量８，４００
の、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンのコポ
リマー）、１ｇのジパルミトイルホスファチジルグリセ
ロール（Ｎａ塩、アバンチ ポラー リピッド）及び
３．６ｇのグリセロールを８０mlの蒸留水に加えた。約
８０℃に熱した後、透明な均質溶液が得られた。この界
面活性溶液を室温に冷やし、そしてこの容量を１００ml
に合わせた。いくつかの実験において（第８表を参照の
こと）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
を、ジアラキドイルホスファチジルコリン（９２０mg）
と８０ｇのジパルミトイルホスファチジン酸（Ｎａ塩、
アバンチ ポラー リピッド）の混合物に代えた。

【００５７】バブル懸濁物は、三方弁を介して連結され
た二本のシリンジを用いて得た。一方のシリンジには５
mlの界面活性溶液で充填し、そして他方は０．５mlの空
気又は気体で充填した。この三方弁はそれを気体含有シ
リンジに接続させる前にこの界面活性溶液で充填した。
二つのピストンを交互に作動させることにより、この界
面活性溶液をこの二本のシリンジの前後に移動させて
（各方向に５回）乳白な懸濁物を作った。空気で平衡に
飽和させた蒸留水で希釈後（１：１０〜１：５０）、実
施例１に従ってこの調製品の圧力に対する耐久性を決定
した。圧力の上昇速度は２４０トル／分とした。以下の
結果が得られた。

【００５８】

【表１０】 本発明の方法を用いること、更には空気をその他の種類
の気体により既知の方法においてさえも交換すること
は、かなりの改善、即ち圧力に対する耐久性が得られる
ことがわかる。これは陰性荷電されているリン脂質（例
えばＤＰＰＧ）の場合及び中性と陰性に荷電されている
リン脂質の混合物（ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ）の場合の両方
において真実である。

【００５９】以上の実験は更に、圧力に暴露されたと
き、即ち、懸濁物を生体に注射したときの破裂に対する
マイクロバブル及びマイクロバルーンの感受性の認識さ
れた問題が本発明の方法によって有利に解決されること
を実証する。破裂に対する高い耐久性及び高い安定性を
有するマイクロバブル又はマイクロバルーンの懸濁物
が、再現性のよさ及び人間又は動物の身体に基づいて生
体内において行われるエコグラフィー測定の向上した安
全性を有する懸濁物を提供しながら有利に製造されるこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】光学濃度において表わすバブル濃度（バブル
数）とこのバブル懸濁物に適用した圧力の関係を示すグ
ラフ。このグラフを作成するためのデーターは実施例４
に記載の実験より得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パスカル グレニー フランス国，エフ−74100 アンビリー, リュ ド ポイ ノア，10 ビス (72)発明者 ジェローム プジニール フランス国，エフ−74160 レ シャブル ボーモン，プラス ドゥ ラシエンヌ マリー （番地なし) (72)発明者 マリー−ベルナデット バロウ スイス国，ツェーハー−1233 ベルネ，シ ュマン デ コテネ 14

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性液状担体において懸濁状態にある気
   体封入微小気泡、即ち、消失性気体／液体界面状封鎖表
   層により覆われているマイクロバブル又は物質境界によ
   り覆われているマイクロバルーンのいづれかより成る超
   音波エコグラフィー用造影剤に破裂に対する耐久性を授
   ける方法であって（ここで前記破裂は少なくともある程
   度は、圧力が有意に上昇したとき、例えば前記懸濁物を
   患者の血流の中に注射したときに由来する）、ある気体
   の存在下において前記微小気泡を形成せしめること、又
   はもしこの微小気泡が既に作成されているとき、これを
   生理学的に許容されている気体又は気体混合物であっ
   て、その少なくとも一部が０．００３を超えることのな
   い溶解度（これは標準条件のもとで水１リットルに溶解
   する気体のリットル数をダルトンにおけるその分子量で
   割った値として表わしている）を有するような気体によ
   って充満させることを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 二段階において行う方法であって、第一
   段階においてこの微小気泡又はその乾燥前駆体をまず第
   一気体の雰囲気下で調製し、次いで第二段階においてこ
   の第一気体の少なくとも一部分をこの第二気体により実
   質的に置換し、ここでこの第二気体は生理学的に許容さ
   れている気体であることを特徴とする、請求項１に記載
   の方法。
3. 【請求項３】 利用する生理学的に許容されている気体
   が、ＳＦ₆ ，ＳｅＦ ₆ 、フレオン（商標）、例えばＣＦ
   ₄ ，ＣＢｒＦ₃ ，Ｃ₄ Ｆ₈ ，ＣＣｌＦ₃ ，ＣＣｌ
   ₂ Ｆ₂ ，Ｃ₂ Ｆ₆ ，Ｃ₂ ＣｌＦ₅ ，ＣＢｒＣｌＦ₂ ，Ｃ
   ₂ Ｃｌ₂ Ｆ₄ ，ＣＢｒ₂ Ｆ₂ 及びＣ₄ Ｆ₁₀より成る群か
   ら選ばれる、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 第一段階において使用する気体が、担体
   液中の微小気泡の平均サイズ及び濃度の効果的なコント
   ロールを可能とするような種類のものであり、そして第
   二段階に付加される生理学的に許容されている気体が生
   体内超音波イメージングのためのこの懸濁物に長い有効
   な反響性寿命を保証する、請求項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 マイクロバブルを搬送する水性相が層状
   又は単層状の溶解されたフィルム形成界面活性剤を含
   み、ここで前記界面活性剤は気体と液体の界面のマイク
   ロバブル境界を安定化せしめることを特徴とする、請求
   項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記界面活性剤が１又は複数種のリン脂
   質を含んで成る、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 このリン脂質の少なくとも一部がリポソ
   ームの形態にある、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 このリン脂質の少なくとも一種がジアシ
   ルホスファチジル化合物であり、ここでそのアシル基は
   Ｃ₁₆の脂肪酸残基又はそれより高級な類似体である、請
   求項６に記載の方法。
9. 【請求項９】 マイクロバルーン物質境界が有機ポリマ
   ー膜より成る、請求項１又は２に記載の方法。
10. 【請求項１０】 膜のポリマーが、ポリ乳酸又はポリグ
    リコール酸及びそのコポリマー、細網血清アルブミン、
    細網ヘモグロビン、ポリスチレン、並びにポリグルタミ
    ン酸及びポリアルパラギン酸のエステルより成る群から
    選ばれる、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記の生理学的に許容されている気体
    を有する微小気泡の形成が、その乾燥前駆体を減圧と前
    記気体による圧力復帰に交互にかけ、そして最後にこの
    前駆体を液状担体に分散せしめることにより行う、請求
    項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記の生理学的に許容されている気体
    によるマイクロバルーンの充填が、この懸濁物に前記気
    体を周囲圧のもとで単にフラッシュせしめることにより
    行う、請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 当業界に知られている任意の標準的方
    法、ただし少なくとも部分的に前記気体により構成され
    ている雰囲気のもとで操作することによって微小気泡を
    作製する、請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 超音波エコグラフィーにおいて造影剤
    として利用される、水性担体液の中に分配されている気
    体封入微小気泡の懸濁物であって、その気体が生理学的
    に許容されており、且つその少なくとも一部が０．００
    ３を超えることのない水における溶解度（これは標準条
    件のもとで水１リットルに溶解する気体のリットル数を
    その分子量の平方根で割った値で表わしている）を有す
    ることを特徴とする懸濁物。
15. 【請求項１５】 懸濁物に標準条件及び約１００トル／
    分の速度で適用したときに約７５％、約２５％の破裂を
    生じせしめうるような圧力それぞれの間の差圧ΔＰが少
    なくとも２５トルであることを気体が特徴とする、請求
    項１４に記載の懸濁物。
16. 【請求項１６】 前記生理学的に許容されている気体を
    封入している微小気泡が、１６個以上の炭素原子を含む
    脂肪酸残基であるリン脂質を含む水性担体液の中に懸濁
    されている、請求項１４に記載の水性懸濁物。
17. 【請求項１７】 凍結乾燥リポソーム及び安定剤を含ん
    で成る乾燥粉末より成る前駆体形態にあるエコグラフィ
    ー用造影剤であって、気体封入マイクロバブルの反響性
    懸濁物を形成するようこの粉末は水性液状担体の中に分
    散可能であり、０．００３を超えることのない水におけ
    る溶解度（これは標準条件のもとで水１リットルに溶解
    する気体のリットル数をその分子量の平方根で割った値
    で表わしている）を有する生理学的に許容されている気
    体を含んで成る雰囲気のもとで保存されることを特徴と
    する、造影剤。
18. 【請求項１８】 リポソームが、１６個以上の炭素原子
    を有する脂肪酸残基であるリン脂質を含んで成る、請求
    項１７に記載の造影剤前駆体。