ES2098015T5

ES2098015T5 - Dispersiones o suspensiones acuosas de larga duracion de microvesiculas llenas de gas y resistentes a la presion, y metodos para su preparacion.

Info

Publication number: ES2098015T5
Application number: ES93810026T
Authority: ES
Inventors: Michel Schneider; Feng Dr. Yan; Pascal Grenier; Jereme Puginier; Marie-Bernadette Barrau
Original assignee: Bracco International BV
Current assignee: Bracco International BV
Priority date: 1992-01-24
Filing date: 1993-01-19
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2013-01-19
Also published as: DE69307351T3; US6881397B2; KR100221950B1; ZA9210127B; US20020150538A1; US5413774A; DK0554213T4; HUT65225A; EP0554213B1; DK0554213T3; IL104084A0; CA2085525A1; NZ245724A; US20010001657A1; EP0554213A1; CA2085525C; KR930016105A; AU658470B2; CN1079678C; FI930258A0

Abstract

SE PUEDE IMPARTIR RESISTENCIA DESTACADA CONTRA COLAPSO BAJO PRESION DE MICROVESICULAS LLENAS DE GAS UTILIZADAS COMO AGENTE DE CONTRASTE EN ECOGRAFIA ULTRASONICA MEDIANTE LA UTILIZACION COMO GASES DE LLENADO AQUELLOS CUYAS SOLUBILIDAD EN AGUA EXPRESADA EN LITROS DE GAS POR LITRO DE AGUA BAJO CONDICIONES STANDARD DIVIDIDO POR LA RAIZ CUADRADA DEL PESO MOLECULAR NO EXCEDE 0.003.

Description

Dispersiones o suspensiones acuosas de larga duración de microvesículas llenas de gas y resistentes a la presión, y métodos para su preparación.

Campo técnico

La presente invención se refiere a dispersiones o composiciones inyectables de microvesículas llenas de gas en vehículos líquidos acuosos. Estas dispersiones son utilizables generalmente para un gran número de las clases de aplicaciones que requieren gases dispersados homogéneamente en líquidos. Una aplicación notable para dichas dispersiones es la inyección en seres vivos, por ejemplo para ecografía ultrasónica y otras aplicaciones médicas. La invención se refiere también a los métodos para fabricar las composiciones que anteceden con inclusión de algunos materiales implicados en las preparaciones, por ejemplo microburbujas, microcápsulas y microbalones llenos de gas y resistentes a la presión.

Fundamentos de la invención

Es bien sabido que los microcuerpos o microglóbulos de aire o gas (definidos en esta memoria como microvesículas), p.ej. microburbujas o microbalones, suspendidos en un líquido, son reflectores ultrasónicos excepcionalmente eficientes para ecografía. En esta descripción, el término de "microburbuja" designa específicamente esferas o glóbulos huecos, llenos con aire u otro gas, en suspensión en un líquido, que son generalmente resultado de la introducción en el mismo de aire o gas en forma dividida, conteniendo también el líquido preferiblemente agentes tensioactivos o agentes con actividad superficial para controlar las propiedades de superficie y la estabilidad de las burbujas. El término de "microcápsula" o "microbalón" designa preferiblemente cuerpos llenos con aire u otro gas con un límite o envoltura material, es decir una pared de membrana de polímero. Tanto las microburbujas como los microbalones son útiles como agentes de contraste ultrasónicos. Por ejemplo la inyección, en el torrente sanguíneo de los seres vivos, de suspensiones de microburbujas o microbalones llenos de aire (en el intervalo de 0,5 a 10 \mum) en un vehículo líquido reforzará fuertemente las imágenes de ecografía ultrasónica, favoreciendo así la visualización de los orgános internos. La formación de imágenes de vasos y órganos internos puede ayudar notablemente al diagnóstico médico, por ejemplo para la detección de enfermedades cardiovasculares y de otros tipos.

La formación de suspensiones de microburbujas en un vehículo líquido inyectable adecuado para ecografía puede producirse por la liberación de un gas disuelto a presión en este líquido, o por una reacción química que genere productos gaseosos, o por mezcla con los ácidos solubles o insolubles en el líquido que contiene aire u otro gas atrapado o adsorbido en ellos.

Por ejemplo, en el documento US-A-4.446.442 (Schering), se describen una serie de técnicas diferentes para producir suspensiones de microburbujas de gas en un vehículo líquido inyectable esterilizado utilizando (a) una solución de un agente con actividad superficial (tensioactivo) en un vehículo líquido (acuoso) y (b) una solución de un aumentador de la viscosidad como estabilizador. Para generar las burbujas, las técnicas descritas en esta memoria incluyen hacer pasar a velocidad elevada una mezcla de (a), (b) y aire a través de una pequeña abertura; o inyectar (a) en (b), poco tiempo antes de su uso, junto con un gas fisiológicamente aceptable; o añadir un ácido a (a) y un carbonato a (b), mezclándose ambos componentes entre sí inmediatamente antes de su empleo, y haciendo reaccionar el ácido con el carbonato para generar burbujas de CO_{2}; o añadir un gas sometido a sobrepresión a una mezcla de (a) y (b) en almacenamiento, liberándose dicho gas en forma de microburbujas en el momento en que la mezcla se utiliza para inyección.

El documento EP-A-131.540 (Schering) describe la preparación de suspensiones de microbrubujas, en la cual un vehículo líquido inyectable estabilizado, p.ej., una solución acuosa fisiológica de sal común, o una solución de un azúcar tal como maltosa, dextrosa, lactosa o galactosa, se mezcla con micropartículas sólidas (en el intervalo de 0,1 a 1 \mum) de los mismos azúcares que contienen aire atrapado. Con objeto de desarrollar la suspensión de burbujas en el vehículo líquido, tanto los componentes líquidos como los sólidos se agitan juntos en condiciones estériles durante unos cuantos segundos y, una vez producida, la suspensión tiene que utilizarse inmediatamente después, es decir debe inyectarse en el transcurso de 5-10 minutos para medidas ecográficas; de hecho, debido a que son evanescentes, la concentración de burbujas se hace demasiado baja para ser válida después de dicho período.

En un intento de resolver el problema de la evanescencia, se han desarrollado microbalones, es decir microvesículas con una pared material. Como se ha dicho anteriormente, mientras que las microburbujas tienen solamente una envoltura inmaterial o evanescente, es decir están rodeadas solamente por una pared de líquido cuya tensión superficial está siendo modificada por la presencia de un agente tensioactivo, los microbalones o microcápsulas tienen una envoltura tangible hecha de material individualizado, p.ej. una membrana polímera con resistencia mecánica definida. En otros términos, se trata de microvesículas de material en las cuales el aire o gas está encapsulado más o menos fuertemente.

Por ejemplo, el documento US-A-4.276.885 (Tickner y colaboradores) describe la utilización de microcápsulas de membrana superficial que contienen un gas para intensificar las imágenes ultrasónicas, incluyendo la membrana una multiplicidad de moléculas orgánicas no tóxicas y no antigénicas. En una realización descrita, estas microburbujas tienen una membrana de gelatina que resiste la coalescencia y cuyo tamaño preferido es 5-10 \mum. Se dice que la membrana de estas microburbujas es suficientemente estable para realizar determinaciones ecográficas.

Microbalones llenos de aire sin gelatina se describen en el documento US- A-4.718.433 (Feinstein). Estas microvesículas se fabrican por tratamiento con ultrasonidos (5 a 30 KHz) de soluciones de proteína tales como sero-albúmina al 5% y tienen diámetros comprendidos en el intervalo de 2-20 \mum, principalmente 2-4 \mum. Las microvesículas se estabilizan por desnaturalización de la proteína que forma la membrana después del tratamiento ultrasónico, por ejemplo por empleo de calor o por medios químicos, p.ej. por reacción con formaldehído o aldehído glutárico. Se dice que la concentración de microvesículas estables, obtenidas por esta técnica, es aproximadamente 8 x 10^{6}/ml en el intervalo de 2-4 \mum, aproximadamente 10^{6}/ml en el intervalo de 4-5 \mum y menos de 5 x 10^{5} en el intervalo de 5-6 \mum. Se dice que el tiempo de estabilidad de estas microvesículas es 48 horas o mayor, y que las mismas permiten la obtención de imágenes convenientes del lazo izquierdo del corazón después de inyección intravenosa. Por ejemplo, las microburbujas de albúmina tratadas por ultrasonidos, una vez que se inyectan en una vena periférica, son capaces de pasar a través de los pulmones. Esto da como resultado la opacificación eocardiográfica de la cavidad del ventrículo izquierdo así como de los tejidos de miocardio.

Recientemente, en el documento EP-A-324.938 (Widder) se ha informado de microbalones mejorados todavía adicionalmente para ecografía ultrasónica por inyección. En este documento se describen concentraciones elevadas (mayores que 10^{8}/ml) de microvesículas con pared proteínica llenas de aire de tamaño menor que 10 \mum, que tienen tiempos de vida de varios meses o mayores. Se producen suspensiones acuosas de estos microbalones por cavitación ultrasónica de soluciones de proteínas desnaturalizables por calentamiento, p.ej. sero-albúmina humana, operación que conduce también a cierto grado de formación de espuma de la proteína formadora de membrana y a su endurecimiento subsiguiente por calentamiento. Se decía también que otras proteínas tales como hemoglobina y colágeno eran convenientes en este procedimiento. La alta estabilidad al almacenamiento de las suspensiones de microbalones descritas en el documento EP-A-0.324.938 permite que las mismas se comercialicen como tales, es decir con la fase de vehículo líquido, lo cual es una ventaja comercial importante, dado que no es necesaria la preparación antes de su empleo.

Se han descubierto recientemente ventajas similares en relación con la preparación de suspensiones acuosas de microburbujas, es decir se ha descubierto una composición pulverulenta seca, estable al almacenamiento, que generará suspensiones de burbujas de larga duración después de la adición de agua. Esto se describe en la Solicitud WO-A-91/15244, en la que se liofilizan liposomas que comprenden lípidos formadores de membrana, y los lípidos liofilizados, después de exposición al aire u otro gas durante cierto período de tiempo, producirán suspensiones de burbujas de larga duración por simple adición a los mismos de un vehículo líquido acuoso. De hecho, esta referencia describe un agente de contraste para formación de imágenes ultrasónicas del cuerpo humano o del cuerpo de los animales, que comprende una suspensión de microburbujas de aire u otro gas, en la cual las microburbujas están estabilizadas por al menos un agente tensioactivo formador de película, que se encuentra al menos parcialmente en forma de laminillas o laminar. Los gases contenidos en las microburbujas incluyen gases inocuos fisiológicamente aceptables, tales como CO_{2}, nitrógeno, N_{2}O, metano, butano, freón y sus mezclas, y gases radiactivos tales como xenón y kriptón que presentan interés en medicina nuclear para medidas de la circulación sanguínea, escintigrafía pulmonar, etc.

El documento EP-A-0.458.745 (Sintética) describe microbalones llenos de aire u otro gas, limitados por una membrana de polímero depositada interfacialmente, que pueden dispersarse en vehículos líquidos acuosos destinados a ser inyectados en seres vivos o administrados por vía oral, rectal y uretral para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Las propiedades de la membrana polímera de los microbalones (elasticidad, permeabilidad, biodegradabilidad) pueden controlarse a voluntad por la selección del polímero, las condiciones de los depósitos interfaciales y los aditivos del polímero. Como gases posibles descritos se encuentran gases fisiológicamente aceptables tales como CO_{2}, N_{2}O, metano, freón, helio y otros gases raros.

A pesar de los muchos progresos realizados en relación con la estabilidad al almacenamiento de las suspensiones acuosas de microburbujas, refiriéndose ésta a la etapa precursora o a la etapa de preparación final, persistía todavía hasta ahora el problema de la duración de las vesículas cuando las suspensiones se exponen a sobrepresión, p.ej. variaciones de presión tales como las que se producen después de la inyección en el torrente sanguíneo de un paciente y a consecuencia de los impulsos cardíacos, en particular en el ventrículo izquierdo. De hecho, los autores de la presente invención han observado que, por ejemplo en conejos anestesiados, las variaciones de presión no son suficientes para alterar sustancialmente el cómputo de burbujas durante un período de tiempo después de la inyección. En contraste, en los perros y los pacientes humanos, las microburbujas o los microbalones típicos, llenados con gases comunes tales como aire, metano o CO_{2} se colapsarán completamente en cuestión de segundos después de la inyección debido al efecto de la presión de la sangre. Esta observación ha sido confirmada por otros autores: por ejemplo, S. GOTTLIEB y colaboradores en J. Am. Soc. of Echocardiografy 3 (1990) han informado de que microbalones de albúmina reticulados preparados por el método de tratamiento por ultrasonidos están perdiendo todas las propiedades ecogénicas después de ser sometidas a una sobrepresión de 60 Torr. Por consiguiente, resultó importante resolver el problema y aumentar la vida útil de las suspensiones de microburbujas y microbalones, fijadas a la membrana a presión con objeto de asegurar que las medidas ecográficas puedan llevarse a cabo in vivo de manera segura y reproducible.

Debe mencionarse en esta etapa que se ha propuesto otra categoría de agentes intensificadores de las imágenes ecogénicas, que resisten sobrepresiones, dado que los mismos están constituidos por microesferas ordinarias con una estructura porosa, conteniendo dicha porosidad aire u otro gas. Tales microesferas se describen por ejemplo en los documentos WO-A91/12823 (DELTA BIOTECHNOLOGY), EP-A-327.490 (SCHERING) y EP-A-4580,079 (HOECHST). El inconveniente en el caso de las microesferas porosas ordinarias es que el espacio libre lleno de gas encapsulado es generalmente demasiado pequeño para una respuesta ecogénica satisfactoria, y las esferas carecen de una elasticidad adecuada. Por consiguiente, la preferencia general sigue correspondiendo a las microvesículas huecas y se buscó una solución al problema del colapsado.

El documento WO 92/17212 describe microbalones que comprenden SF_{6} ó CF_{4} y que tienen una envoltura de restos anfífilos no proteínicos, reticulados o polimerizados.

El documento WO 92/17213 describe microbalones que comprenden SF_{6} ó CF_{4} y que tienen una envoltura de proteína reticulada con grupos reticulantes biodegradables.

Los documentos WO 92/17212 y WO 92/17213 representan una técnica anterior de acuerdo con el artículo 54(3) del EPC y son el objeto de la exclusión en las reivindicaciones.

Descripción de la invención

De acuerdo con la invención, este problema se ha resuelto mediante un agente de contraste para ecografía por ultrasonidos, que comprende, como una suspensión en una fase de vehículo líquido acuoso, microvesículas llenas con un gas o una mezcla de gases, siendo las microvesículas o bien microburbujas que tienen una envoltura inmaterial o evanescente, es decir que están rodeadas solamente por una pared de líquido cuya tensión superficial está siendo modificada por la presencia de un agente tensioactivo, o microbalones delimitados por una envoltura material hecha de una membrana de polímero orgánico, caracterizado porque la mezcla de gases comprende al menos un hidrocarburo halogenado gaseoso aceptable fisiológicamente o un calcogenuro fluorado estable cuya relación de la solubilidad en agua, expresada en litros de gas por litro de agua en condiciones estándar, a la raíz cuadrada del peso molecular, en daltons, está por debajo de 0,0027, estando excluidos los microbalones que comprenden SF_{6} ó CF_{4} y tienen una envoltura de restos anfífilos o de una proteína reticulada con grupos reticulantes biodegradables.

Resumidamente, se ha encontrado que cuando las microvesículas ecogénicas se fabrican en presencia de un gas, o se llenan respectivamente al menos en parte con un gas, que tiene propiedades físicas de acuerdo con la ecuación siguiente, entonces las microvesículas resisten notablemente una presión mayor que 80\cdot10^{2} N/m^{2} (60 Torr) después de inyección durante un tiempo suficiente para obtener determinaciones ecográficas reproducibles:

\frac{S_{gas}}{S_{aire}} x \frac{\surd{Mw_{aire}}}{\surd{Mw_{gas}}} \leq 1

En la ecuación que antecede, "S" designa las solubilidades en agua expresadas como los coeficientes "BUNSEN", es decir como volumen de gas disuelto por unidad de volumen de agua en condiciones estándar (1 bar, 25ºC), y a una presión parcial del gas dado de 1 atm (véase la Gas Encyclopaedia, Elsevier 1976). Dado que, en dichas condiciones y definiciones, la solubilidad del aire es 0,0167, y que la raíz cuadrada de su peso molecular medio (Mw) es 5,39, la relación anterior se simplifica para dar:

S_{gas}/\surdMw_{gas} \leq 0,0031

En los Ejemplos que se encuentran más adelante en esta memoria, se describe el ensayo de microburbujas y microbalones ecogénicos (véanse las tablas) llenos con cierto número de gases diferentes y mezclas de los mismos, y la resistencia correspondiente de aquéllos a los aumentos de presión, tanto in vivo como in vitro. En las tablas, los factores de solubilidad en agua se han tomado también de la obra Gas Encyclopaedia citada anteriormente de "L'Air Liquide", Elsevier Publisher (1976).

Las microvesículas en suspensión acuosa que contienen gases de acuerdo con la invención incluyen la mayoría de las microburbujas y microbalones que se han descrito hasta ahora para uso como agentes de contraste para ecografía. Los microbalones preferidos son los descritos en los documentos EP-A-324 938, PCT/EP91/01706 y EP-A-458 745; las microburbujas preferidas son las del documento PCT/EP91/00620; estas microburbujas se forman ventajosamente a partir de un líquido acuoso y de un polvo seco (precursores de microvesículas), que contienen fosfolípidos liofilizados en forma de laminillas y estabilizadores; las microburbujas se desarrollan por agitación de este polvo en mezcla con el vehículo líquido acuoso. Los microbalones del documento EP-A-458.745 tienen una membrana de polímero elástica precipitada interfacialmente, de porosidad controlada. Los mismos se obtienen generalmente a partir de emulsiones en microgotitas de soluciones de polímero en líquidos acuosos, haciéndose subsiguientemente que el polímero precipite de su solución para formar una membrana filmógena en la interfase gotita/líquido, procedimiento que conduce a la formación inicial de microvesículas llenas de líquido, sustituyéndose eventualmente el núcleo líquido de las mismas por un gas.

Con objeto de llevar a cabo el método de la presente invención, es decir formar o llenar las microvesículas, cuyas suspensiones en vehículos acuosos constituyen los aditivos ecogénicos deseados, con los gases de acuerdo con la relación que antecede, puede utilizarse, como primera realización, una vía de dos pasos constituida por (1) fabricación de las microvesículas a partir de materiales de partida apropiados por cualquier técnica convencional adecuada en presencia de cualquier gas adecuado, y (2) reemplazamiento de este gas utilizado originalmente (primer gas) para preparar las microvesículas con un gas nuevo (segundo gas) de acuerdo con la invención (técnica de cambio de gases).

Por otra parte, de acuerdo con una segunda realización, se pueden preparar directamente las suspensiones deseadas por métodos usuales adecuados en una atmósfera del nuevo gas de acuerdo con la invención.

Si se utiliza la vía de dos pasos, el gas inicial puede separarse primeramente de las vesículas (por ejemplo por evacuación con aspiración) y reemplazarse después de ello poniendo el segundo gas en contacto con el producto evacuado, o alternativamente, las vesículas, que contienen todavía el primer gas, pueden ponerse en contacto con el segundo gas en condiciones en las que el segundo gas desplazará al primer gas de las vesículas (sustitución de gases). Por ejemplo, las suspensiones de vesículas, o preferiblemente precursores de las mismas (en esta memoria, precursores puede significar los materiales de los cuales están hechas las envolturas de las microvesículas, o los materiales que, por agitación con un vehículo líquido acuoso, generarán o desarrollarán la formación de microburbujas en este líquido), pueden exponerse a una presión reducida para evacuar el gas a eliminar, después de lo cual se restablece la presión ambiente con el gas deseado para sustitución. Este paso puede repetirse una o más veces hasta asegurar el reemplazamiento completo del gas original por el gas nuevo. Esta realización se aplica particularmente bien a preparaciones precursoras almacenadas en seco, es decir polvos secos que regenerarán o desarrollarán las burbujas del aditivo ecogénico por mezcla con una cantidad de vehículo líquido. Por consiguiente, en un caso preferido en el que las microburbujas deben formarse a partir de una fase acuosa y de fosfolípidos secos en forma de laminillas, p.ej. polvos de liposomas liofilizados deshidratados más estabilizadores, cuyos polvos tienen que dispersarse subsiguientemente con agitación en una fase de vehículo líquido acuoso, es ventajoso almacenar este polvo seco en una atmósfera de un gas seleccionado de acuerdo con la invención. Una preparación de dicha clase se mantendrá indefinidamente en este estado puede utilizarse en cualquier momento para diagnóstico, con tal que la misma se disperse en agua estéril antes de la inyección.

Por otra parte, y esto ocurre particularmente cuando el cambio de gases se aplica a una suspensión de microvesículas en una fase de vehículo líquido, la última se lava abundantemente con el segundo gas hasta que el reemplazamiento (parcial o completo) sea suficiente para el propósito deseado. El lavado abundante puede efectuarse por borboteo desde una tubería de gas, o en algunos casos, por simple barrido de la superficie del líquido que contiene las vesículas con agitación suave en una corriente (continua o discontinua) del gas nuevo. En este caso, el gas de reemplazamiento puede añadirse solamente una vez al recipiente que contiene la suspensión y dejarse en reposo como tal durante cierto tiempo, o el mismo puede renovarse una o más veces con objeto de asegurarse de que el grado de renovación (cambio de gases) sea más o menos completo.

Alternativamente, en una segunda realización como se ha indicado anteriormente, se efectuará la preparación completa de la suspensión de los aditivos ecogénicos a partir de los precursores usuales de los mismos (materiales de partida), como se indica en la técnica anterior y operando de acuerdo con medios usuales de dicha técnica anterior, pero en presencia de los gases o mezclas de gases deseados de acuerdo con la invención en lugar del gas de la técnica anterior que usualmente cita gases tales como aire, nitrógeno, CO_{2} y análogos.

Debe indicarse que, en general, el modo de preparación que implica un primer tipo de gas para preparación de las microvesículas y, después de ello, sustitución del gas original por una segunda clase de gas, estando destinado el último a conferir propiedades ecogénicas diferentes a dichas microvesículas, tiene la ventaja siguiente: Como se verá mejor a partir de los resultados indicados en los ejemplos que siguen, la naturaleza del gas utilizado para fabricar las microvesículas, en particular los microbalones con una envoltura de polímero, tiene una influencia definitiva sobre el tamaño global (es decir, el diámetro medio aritmético) de dichas microvesículas; por ejemplo, el tamaño de los microbalones preparados en atmósfera de aire, con condiciones ajustadas de manera precisa, puede controlarse exactamente de modo que caiga dentro de un intervalo deseado, p.ej. el intervalo de 1 a 10 \mum adecuado para ecografía de los ventrículos izquierdo y derecho del corazón. Esto no es tan fácil con otros gases, particularmente los gases en conformidad con los requerimientos de la presente invención, por consiguiente, cuando se desea obtener microvesículas en un intervalo dado de tamaños pero llenas con gases cuya naturaleza haría imposible o muy difícil la preparación directa, se puede tomar como base muy ventajosamente la vía de preparación de dos pasos, es decir se prepararán primeramente las microvesículas con un gas que permita un diámetro y un control de cómputo más exactos, y después de ello se reemplazará el primer gas por un segundo gas mediante cambio de gases.

En la descripción de la Parte experimental que sigue (Ejemplos), microvesículas llenas de gas suspendidas en agua u otras soluciones acuosas se han sometido a presiones superiores a la del ambiente. Se observó que cuando la sobrepresión alcanzaba cierto valor (que es generalmente típico para un conjunto de parámetros de las microesferas y condiciones de trabajo tales como temperatura, ritmo de compresión, naturaleza del vehículo líquido y su contenido de gas disuelto (la importancia relativa de este parámetro se detallará más adelante en esta memoria), naturaleza de la carga de gas, tipo de material ecogénico, etc.), las microvesículas comenzaban a colapsarse, decreciendo progresivamente el cómputo de burbujas con aumento adicional de la presión hasta que se producía una desaparición completo del efecto reflector de los sonidos. Este fenómeno se siguió mejor ópticamente, (medidas nefelométricas), dado que el mismo se producía en paralelo con un cambio correspondiente en la densidad óptica, es decir la transparencia del medio aumenta a medida que las burbujas se colapsan progresivamente. Para esto, la suspensión acuosa de microvesículas (o una dilución apropiada de la misma) se opuso en una cubeta espectrofotométrica mantenida a 25ºC (condiciones estándar) y se midió continuamente la absorbancia a 600 ó 700 nm, mientras que se aplicaba y aumentaba gradualmente una sobrepresión hidrostática positiva. La presión se generó por medio de una bomba peristáltica (GILSON's Mini-puls) que alimentaba una columna de líquido de altura variable conectada a la cubeta espectrofotométrica, estando la última cerrada herméticamente a prueba de fugas. La presión se midió con un manómetro de mercurio calibrado en Torr. Se encontró que el ritmo de compresión con el tiempo guardaba una correlación lineal con la velocidad de la bomba (rpm). Se encontró que la absorbancia en el intervalo indicado anteriormente era proporcional a la concentración de microvesículas en el vehículo líquido.

La Figura 1 es un gráfico que representa la concentración de burbujas (cómputo de burbujas), expresado en términos de densidad óptica en el intervalo mencionado anteriormente, y la presión aplicada a la suspensión de burbujas. Los datos para preparación del gráfico se toman de los experimentos consignados en el Ejemplo 4.

Figura 1

1

La Figura 1 muestra gráficamente que el cambio de absorbancia en función de la presión está representado por una curva de forma sigmoidea. Hasta cierto valor de la presión, la curva es aproximadamente plana, lo cual indica que las burbujas son estables. Después de ello, se produce una disminución de absorbancia relativamente rápida, lo que indica la existencia de una región crítica relativamente estrecha dentro de la cual cualquier aumento de presión tiene un efecto más bien espectacular sobre el cómputo de burbujas. Cuando todas las microvesículas han desaparecido, la curva se nivela de nuevo. Se seleccionó un punto crítico en esta curva en la zona media entre las lecturas ópticas superior e inferior, es decir en una posición intermedia entre las determinaciones "llena de burbujas" (OD max) y "sin burbujas" (OD min), correspondiendo esto realmente a un punto en el que había desaparecido aproximadamente el 50% de las burbujas presentes inicialmente, es decir en el que la lectura de la densidad óptica es aproximadamente la mitad de la lectura inicial, ajustándose este valor, en el gráfico, con relación a la altura a la que la transparencia de la suspensión sometida a presión es máxima (línea base). Este punto, que se encuentra también en las proximidades del lugar en el que la pendiente de la curva es máxima, se define como la presión crítica PC. Se encontró que, para un gas dado, PC depende no sólo de los parámetros mencionados anteriormente sino también, y en particular, de la concentración real de gas (o gases) disueltos ya en el vehículo líquido: cuanto mayor es la concentración de gas, tanto mayor es la presión crítica. Por consiguiente, en relación con esto puede aumentarse la resistencia al colapsado a presión de las microvesículas haciendo que la fase vehículo esté saturada con un gas soluble, siendo el último el mismo, o no (es decir un gas diferente) que el gas que llena las vesículas. Como ejemplo, podría hacerse que las microvesículas llenas de aire fuesen muy resistentes a las sobrepresiones [> 120 Torr (160 \cdot 10^{2} N/m^{2})] empleando, como vehículo líquido, una solución saturada de CO_{2}. Desafortunadamente, este descubrimiento tiene un valor limitado en el campo diagnóstico, dado que una vez que se inyecta el agente de contraste al torrente sanguíneo de los pacientes (cuyo contenido de gas está por supuesto fuera de control), el mismo se diluye en él en tal proporción que el efecto del gas disuelto originalmente en la muestra inyectada se hace despreciable.

Otro parámetro fácilmente accesible para comparar de manera reproducible el comportamiento de diversos gases como cargas de llenado de microesferas es la anchura del intervalo de presión (\DeltaP) limitado por los valores de presión en los cuales los cómputos de burbujas (expresado por las densidades ópticas) son iguales a 75% y 25% del cómputo de burbujas original. Ahora bien, se ha encontrado sorprendentemente que para gases en los cuales la diferencia de presión DP = P_{25} - P_{75} excede de un valor de aproximadamente 33-40 N/m^{2} (25-30 Torr), el efecto destructor de la presión sanguínea sobre las microvesículas llenas de gas se minimiza, es decir la disminución real en el cómputo de burbujas es lo bastante lenta para no empeorar el significado, la exactitud y la reproducibilidad de las determinaciones ecográficas.

Se encontró, adicionalmente, que los valores de PC y \DeltaP dependen también del ritmo de aumento de la presión en los experimentos de ensayo ilustrados por la Fig. 1, es decir en un cierto intervalo de ritmos de aumento de presión (p.ej. en el intervalo de varias decenas a varios centenares de Torr/min), cuanto mayor es el ritmo, tanto mayores son los valores de PC y \DeltaP. Por esta razón, las comparaciones efectuadas en condiciones de temperatura estándar se llevaron a cabo también al ritmo de aumento constante de 100 Torr/min. Sin embargo, debería indicarse que este efecto del ritmo de aumento de presión sobre la medida de los valores PC y \DeltaP se nivela para ritmos muy altos; por ejemplo, los valores medidos bajo ritmos de varios centenares de Torr/min no son significativamente diferentes de los medidos en las condiciones determinadas por los latidos cardíacos.

Aunque no se han esclarecido por completo las verdaderas razones por las cuales ciertos gases obedecen las propiedades mencionadas anteriormente, mientras que otros no lo hacen, parece ser que existe cierta relación en la cual están involucrados, además del peso molecular y la solubilidad en agua, la cinética de la disolución, y quizás otros parámetros. Sin embargo, estos parámetros no precisan ser conocidos para llevar a la práctica la presente invención, dado que la elegibilidad del gas puede determinarse fácilmente de acuerdo con los criterios expuestos anteriormente.

Las especies gaseosas de la invención son, por ejemplo, hidrocarburos halogenados tales como los freones y calcogenuros fluorados estables tales como SF_{6}.

Se ha mencionado anteriormente que el grado de saturación de gas respecto del líquido utilizado como vehículo para las microvesículas de acuerdo con la invención tiene cierta importancia en cuanto a la estabilidad de las vesículas a las variaciones de presión. De hecho, cuando el vehículo líquido, en el cual están se dispersan las microvesículas para la fabricación de las suspensiones ecogénicas de la invención, está saturado en equilibrio con un gas, preferiblemente en el mismo gas con el que se llenan las microvesículas, la resistencia de las microvesículas al colapsado bajo variaciones de presión se incrementan notablemente. Así, cuando el producto a utilizar como agente de contraste se vende en condiciones secas para mezclarlo inmediatamente antes de su empleo con el vehículo líquido (véanse por ejemplo los productos descritos en el documento PCT/EP91/00620 mencionado anteriormente en esta memoria), es sumamente ventajoso utilizar, para la dispersión, un vehículo acuoso saturado con gas. Alternativamente, cuando se comercializan suspensiones de microvesículas listas para su empleo como agente de contraste para ecografía, se utilizará ventajosamente como el vehículo líquido para la preparación una solución acuosa saturada con gas; en este caso, la vida de almacenamiento de la suspensión se incrementará considerablemente y el producto puede mantenerse sustancialmente inalterado (sin variación sustancial del cómputo de burbujas) durante períodos prolongados, por ejemplo desde varias semanas a varios meses, e incluso durante un año en casos especiales. La saturación del líquido con un gas puede efectuarse muy fácilmente por simple borboteo del gas en el líquido durante cierto período de tiempo a la temperatura ambiente.

En los siguientes ejemplos se incluyen realizaciones que no caen bajo la protección de las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Microvesículas de albúmina llenas con aire o diversos gases se prepararon como se describe en el documento EP-A-324.938 utilizando una jeringuilla calibrada de 10 ml llena con una sero-albúmina humana (HSA) al 5% obtenida del Blood Transfusion Service, Red-Cross Organization, Berna, Suiza. Una sonda de un equipo de ultrasonidos (Sonifier Model 250, de Branson Ultrasonic Corp. EE.UU.) se hizo descender dentro de la solución hasta la marca de 4 ml de la jeringuilla y se efectuó el tratamiento por ultrasonidos durante 25 s (ajuste de energía = 8). Después de ello, la sonda del equipo de ultrasonidos se elevó por encima del nivel de la solución hasta la marca de 6 ml y se reanudó el tratamiento por ultrasonidos en el modo de pulsos (ciclo = 0,3) durante 40 s. Después de dejar en reposo durante la noche a 4ºC, se había formado por empuje ascendente una capa superior que contenía la mayor parte de las microvesículas y se desechó la capa del fondo, que contenía albúmina sin utilizar, residuos de proteína desnaturalizada y otras materias primas insolubles. Después de suspender de nuevo las microvesículas en solución de albúmina de nuevo aporte, se dejó que la mezcla se sedimentara de nuevo a la temperatura ambiente y se recogió por último la capa superior. Cuando las secuencias que anteceden se llevaron a cabo en las condiciones de la atmósfera ambiente, se obtuvieron microbalones llenos de aire. Para obtener microbalones llenos con otros gases, la solución de albúmina se purgó primeramente con un gas nuevo, se efectuaron después las secuencias operativas que anteceden en una corriente de este gas que fluía sobre la superficie de la solución; y por último, al final de las operaciones, la suspensión se introdujo en una botella de vidrio que se purgó extensamente con el gas deseado antes de cerrarla herméticamente.

Las diversas suspensiones de microbalones llenos con gases diferentes se diluyeron en relación 1:10 con agua destilada saturada en equilibrio con aire, se pusieron luego en una cubeta óptica como se ha descrito anteriormente y se registró la absorbancia mientras que se aumentaba continuamente la presión sobre la suspensión. Durante las medidas, la temperatura de las suspensiones se mantuvo a 25ºC.

Los resultados se muestran en la Tabla 1 siguiente, y se expresan en términos de los valores de la presión crítica PC registrados para una serie de gases definidos por nombres o fórmulas, dándose los parámetros característicos de dichos gases, es decir Mw y la solubilidad en agua, así como el cómputo de burbujas original y el tamaño medio de las burbujas (diámetro medio en volumen).

TABLA 1

2

Por los resultados de la Tabla 1, se ve que la presión crítica PC aumenta para gases de menor solubilidad y peso molecular mayor. Por consiguiente, puede esperarse que las microvesículas llenas con dichos gases proporcionarán señales ecogénicas más duraderas in vivo. Se puede ver también que el tamaño medio de las burbujas aumenta generalmente con la solubilidad del gas.

Ejemplo 2

Se inyectaron partes alícuotas (1 ml) de algunas de las suspensiones de microbalones preparadas en el Ejemplo 1 en la vena yugular de conejos experimentales con objeto de ensayar la ecogenicidad in vivo. La formación de imágenes de los ventrículos cardíacos izquierdo y derecho se llevó a cabo en el modo de escala de grises utilizando un aparato de ecografía Acuson 128-XP5 y un transductor de 7,5 MHz. La duración de mejora del contraste en el ventrículo izquierdo se determinó por registro de la señal durante cierto período de tiempo. Los resultados se recogen en la Tabla 2 siguiente, la cual muestra también el valor PC de los gases utilizados.

TABLA 2

3

A partir de los resultados anteriores, se puede ver la existencia de una correlación definida entre la presión crítica de los gases ensayados y la persistencia en el tiempo de la señal ecogénica.

Ejemplo 3

Se obtuvo una suspensión de micropartículas ecogénicas de galactosa llenas de aire (Echovist®, de SCHERING AG) sometiendo a sacudidas durante 5 s 3 g de las micropartículas sólidas en 8,5 ml de una solución de galactosa al 20%. En otras preparaciones, se evacuó el aire existente sobre una porción de partículas Echovist® [0,2 Torr (27 N/m^{2})] y se reemplazó por una atmósfera de SF_{6}, con lo cual, después de la adición de la solución de galactosa al 20%, se obtuvo una suspensión de micropartículas que contenían hexafluoruro de azufre asociado. Se administraron partes alícuotas (1 ml) de las suspensiones a conejos experimentales (por inyección en la vena yugular) y se llevó a cabo la formación de imágenes del corazón como se describe en el ejemplo anterior. En este caso, las micropartículas ecogénicas no atraviesan los capilares pulmonares, por lo que la formación de imágenes está restringida al ventrículo derecho y la persistencia de la señal global no tiene significado particular alguno. Los resultados de la Tabla 3 siguiente muestran el valor de la intensidad máxima de la señal unos pocos segundos después de la inyección.

TABLA 3

4

Se puede ver que el hexafluoruro de azufre, un gas inerte con baja solubilidad en agua, proporciona suspensiones ecogénicas que generan señales ecogénicas más fuertes que suspensiones comparables llenas de aire. Estos resultados son particularmente interesantes teniendo en cuenta la doctrina de los documentos EP-A-441.468 y 357.163 (SCHERING) que describen el uso para propósitos ecográficos de micropartículas, respectivamente, compuestos de tipo cavitato y clatrato llenos con diversos gases entre los que se incluyen SF_{6}; estos documentos no informan, sin embargo, de ventajas particulares de SF_{6} sobre otros gases más comunes con relación a la respuesta ecogénica.

Ejemplo 4

Se prepararon una serie de suspensiones ecogénicas de microburbuja llenas de gas por el método general indicado a continuación.

Un gramo de una mezcla de lecitina de soja hidrogenada (procedente de Nattermann Phospholipids GmbH, Alemania) y fosfato de dicetilo (DCP), en relación molar 9/1, se disolvió en 50 ml de cloroformo, y la solución se puso en un matraz redondo de 100 ml y se evaporó a sequedad en un aparato Rotavapor. A continuación, se añadieron 20 ml de agua destilada y la mezcla se agitó lentamente a 75ºC durante una hora. Esto dio como resultado la formación de una suspensión de liposomas constituidos por laminillas múltiples (MLV) que se extruyó después a 75ºC a través, sucesivamente, de membranas de policarbonato de 3 \mum y 0,8 \mum (Nuclepore®). Después de enfriar, se diluyeron partes alícuotas de 1 ml de la suspensión extruida con 9 ml de una solución concentrada de lactosa (83 g/l), y las suspensiones diluidas se congelaron a -45ºC. Las muestras congeladas se liofilizaron posteriormente a un vacío elevado para dar un polvo que fluía libremente, en un recipiente que se llenó por último con aire o un gas tomado de una selección de gases como se indica en la Tabla 4 siguiente. Las muestras de polvo se resuspendieron luego en 10 ml de agua como el vehículo líquido, efectuándose esto bajo una corriente del mismo gas utilizado para llenar dichos recipientes. La suspensión se efectuó por agitación mediante sacudidas vigorosas durante 1 min en un mezclador turbulento.

Las diversas suspensiones se diluyeron en relación 1:20 con agua destilada equilibrada previamente con aire a 25ºC, y las diluciones se ensayaron luego a presión a 25ºC como se describe en el Ejemplo 1 midiendo la densidad óptica en una cubeta espectrofotométrica que se sometió a una presión hidrostática progresivamente creciente hasta que todas las burbujas se hubieron colapsado. Los resultados se recogen en la Tabla 4 siguiente que, además de la presión crítica PC, proporciona también los valores \DeltaP (véase Fig. 1).

TABLA 4

5

Los resultados que anteceden indican claramente que la resistencia máxima a los aumentos de presión es proporcionada por los gases más insolubles en agua. A este respecto, el comportamiento de las microburbujas es por consiguiente similar al de los microbalones. Asimismo, los gases menos solubles en agua con los pesos moleculares mayores proporcionan las curvas más planas colapsado de la burbuja/presión (es decir, \DeltaP alcanza la amplitud máxima), lo que es también un factor importante de durabilidad de la respuesta ecogénica in vivo, como se ha indicado anteriormente en esta memoria.

Ejemplo 5

Algunas de las suspensiones de microburbujas del Ejemplo 4 se inyectaron en la vena yugular de conejos experimentales como se indica en el Ejemplo 2 y se efectuó la formación de imágenes del ventrículo cardíaco izquierdo como se ha indicado anteriormente. Se registró la duración del período durante el cual se detectó una señal ecogénica útil y los resultados se muestran en la Tabla 5 siguiente, en la cual C_{4}F_{8} indica octafluorociclobutano.

TABLA 5

6

Estos resultados indican que, de nuevo en el caso de las microburbujas, los gases de acuerdo con los criterios de la presente invención proporcionarán señal de eco ultrasónico durante un período mucho más largo que la mayoría de los gases utilizados hasta ahora.

Ejemplo 6

Se prepararon suspensiones de microburbujas utilizando gases diferentes, exactamente como se ha descrito en el Ejemplo 4, pero reemplazando el ingrediente fosfolípido de lecitina por un equivalente molar de diaraquidoil-fosfatidilcolina (resto de ácido graso C_{20}) asequible de Avanti Polar Lipids, Birmingham, Alabama, EE.UU. La relación molar de fosfolípido a DCP era todavía 9/1. Después de ello se ensayaron las suspensiones a presión como en el Ejemplo 4; los resultados, recogidos en la Tabla 6A siguiente, deben compararse con los de la Tabla 4.

TABLA 6A

7

Los resultados anteriores, comparados con los de la Tabla 4, muestran que al menos con gases de solubilidad baja, por alargamiento de la cadena de los restos de ácido graso del fosfolípido, se puede aumentar espectacularmente la estabilidad de la suspensión ecogénica frente a los aumentos de presión. Esto se confirmó ulteriormente repitiendo los experimentos que anteceden pero reemplazando el componente fosfolípido por un homólogo superior, es decir di-behenoil-fosfatidilcolina (resto de ácido graso C_{22}). En este caso, la resistencia al colapsado con la presión de las suspensiones de microburbujas se incrementó todavía más.

Algunas de las suspensiones de microburbujas de este ejemplo se ensayaron en perros como se ha descrito anteriormente para los conejos (formación de imágenes de los ventrículos izquierdos después de inyección de muestras de 5 ml en la vena cefálica anterior). Se observó una intensificación significativa de la respuesta ecogénica útil in vivo, en comparación con el comportamiento de las preparaciones descritas en el Ejemplo 4, es decir que el aumento de la longitud de cadena del resto de ácido graso en el componente fosfolípido aumenta la vida útil del agente ecogénico in vivo.

En la Tabla siguiente se muestra la estabilidad relativa en el ventrículo izquierdo del conejo de microburbujas (SF_{6}) preparadas a partir de suspensiones de una serie de fosfolípidos cuyos restos de ácido graso tienen longitudes de cadena diferentes (< dosis inyectada:1 ml/conejo).

TABLA 6B

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Se ha mencionado anteriormente en esta memoria que para la determinación de la resistencia a la presión descrita en estos ejemplos, se mantuvo un ritmo constante de aumento de presión de 133 x 10^{2} N/m^{2} (100 Torr)/min. Esto se justifica por los resultados dados a continuación, que muestran las variaciones de los valores de PC para diferentes gases en función del ritmo de aumento de la presión. En estas muestras, DMPC era el fosfolípido utilizado.

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Ejemplo 7

Se prepararon una serie de microbalones de albúmina en forma de suspensiones en agua bajo aire en una modalidad de tamaños de esfera controlados, utilizando las indicaciones dadas en el Ejemplo 1. A continuación, el aire contenido en algunas de las muestras se reemplazó por otros gases por el método de barrido con cambio de gases a la presión ambiente. Posteriormente, después de diluir en relación 1:10 con agua destilada como habitualmente, se sometieron las muestras a ensayo a presión como en el Ejemplo 1. A partir de los resultados recogidos en la Tabla 7 siguiente, se puede ver que el modo de preparación en dos pasos proporciona, en algunos casos, agentes generadores de eco con mejor resistencia a la presión que el modo de preparación en un solo paso del Ejemplo 1.

TABLA 7

10

Ejemplo 8

Se aplicó el método de la presente invención a un experimento como se describe en la técnica anterior, por ejemplo el Ejemplo 1 del documento WO-92/11873. Tres gramos de Pluronic® F68 (un copolímero de polioxietileno-polioxipropileno con un peso molecular de 8400), 1 g de dipalmitoilfosfatidilglicerol (sal de sodio, AVANTI Polar Lipids) y 3,6 g de glicerol se añadieron a 80 ml de agua destilada. Después de calentar a aproximadamente 80ºC, se obtuvo una solución homogénea transparente. La solución del agente con actividad superficial se enfrió a la temperatura ambiente y el volumen se ajustó a 100 ml. En algunos experimentos (véase Tabla 8), se reemplazó el dipalmitoil-fosfatidilglicerol por una mezcla de diaraquidoilfosfatidilcolina (920 mg) y 80 mg de ácido dipalmitoilfosfatídico (sal de sodio, AVANTI Polar Lipids).

Las suspensiones de burbujas se obtuvieron empleando dos jeringuillas conectadas por una válvula de tres vías. Una de las jeringuillas se llenó con 5 ml de la solución de agente con actividad superficial, mientras que la otra se llenó con 0,5 ml de aire u otro gas. La válvula de tres vías se llenó con la solución de agente con actividad superficial antes de conectar la misma a la jeringuilla que contenía el gas. Operando alternativamente los dos pistones, se transfirieron las soluciones de agente con actividad superficial hacia atrás y hacia adelante entre las dos jeringuillas (cinco veces en cada dirección), con lo que se formaron suspensiones lechosas. Después de dilución (1:10 a 1:50) con agua destilada saturada en equilibrio con aire, se determinó la resistencia a la presión de las preparaciones de acuerdo con el Ejemplo 1. El ritmo de aumento de la presión era 319\cdot10^{2} N/m^{2} (240 Torr)/min. Se obtuvieron los resultados siguientes:

TABLA 8

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Se deduce que, empleando el método de la invención y reemplazando el aire por otros gases, p.ej. SF_{6}, incluso con preparaciones conocidas, pueden alcanzarse mejoras considerables, es decir aumento de la resistencia a la presión. Esto es cierto tanto en el caso de fosfolípidos cargados negativamente (p.ej. DPPG) como en el caso de mezclas de fosfolípidos neutros y cargados negativamente (DAPC/DPPA).

El experimento anterior demuestra adicionalmente que la sensibilidad del problema reconocido de las microburbujas y los microbalones al colapsado cuando se exponen a presión, es decir cuando se inyectan las suspensiones a seres vivos, ha sido resuelta ventajosamente por el método de la invención. Las sustancias de microburbujas o microbalones con mayor resistencia contra el colapsado y mayor estabilidad pueden producirse ventajosamente proporcionando suspensiones con mejor reproducibilidad y seguridad incrementada de las medidas ecográficas realizadas en vivo sobre el cuerpo de un ser humano o de un animal.

Claims

1. Un agente de contraste para ecografía ultrasónica que comprende, como una suspensión en una fase de vehículo líquido acuoso, microvesículas llenas con un gas o una mezcla de gases, siendo las microvesículas o bien microburbujas que tienen una envoltura inmaterial o evanescente, es decir que están rodeadas solamente por una pared de líquido cuya tensión superficial está siendo modificada por la presencia de un agente tensioactivo, o microbalones delimitados por una envoltura material hecha de una membrana de polímero orgánico, caracterizado porque la mezcla de gases comprende al menos un hidrocarburo halogenado gaseoso aceptable fisiológicamente o un calcogenuro fluorado estable cuya relación de la solubilidad en agua, expresada en litros de gas por litro de agua en condiciones estándar, a la raíz cuadrada del peso molecular, en daltons, está por debajo de 0,0027, estando excluidos los microbalones que comprenden SF_{6} o CF_{4} y tienen una envoltura de restos anfífilos o de una proteína reticulada con grupos reticulantes biodegradables.

2. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el cual el hidrocarburo halogenado gaseoso es SF_{6}, o un freón seleccionado de CF_{4}, C_{4}F_{8}, CClF_{3}, C_{2}F_{6}, C_{2}ClF_{5}, CBrClF_{2}, C_{2}Cl_{2}F_{4}, ó C_{4}F_{10}.

3. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el cual las microvesículas son microburbujas y en el que la fase acuosa contiene un agente tensioactivo en forma de laminillas o láminas, que comprende uno o más fosfolípidos.

4. El agente de contraste de la reivindicación 3, en el cual al menos una parte de los fosfolípidos se encuentran en forma de liposomas.

5. El agente de contraste de la reivindicación 4, en el cual la fase de vehículo líquido contiene adicionalmente estabilizadores.

6. El agente de contraste de la reivindicación 3, en el cual al menos uno de los fosfolípidos es un compuesto de dacilfosfatidilo en el cual el grupo acilo es un resto de ácido graso C_{16} o un homólogo superior del mismo.

7. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el cual los polímeros de la membrana se seleccionan de ácido poliláctico o poliglicólico y sus copolímeros, sero-albúmina reticulada, hemoglobina reticulada, poliestireno, y ésteres de los ácidos poliglutámico y poliaspártico.

8. El agente de contraste de la reivindicación 7, en el cual las microvesículas están llenas con SF_{6}.

9. El agente de contraste de la reivindicación 1, en el cual el gas contenido en las microvesículas se selecciona de CF_{4}, C_{4}F_{8}, CClF_{3}, C_{2}F_{6}, C_{2}ClF_{5}, CBrClF_{2}, C_{2}Cl_{2}F_{4}, ó C_{4}F_{10}.

10. Un método de fabricación de agentes de contraste que comprenden las suspensiones de microvesículas llenas de gas en una fase acuosa de vehículo líquido de la reivindicación 1, caracterizado por formar las microvesículas en una atmósfera de una mezcla de gases que comprende al menos un hidrocarburo halogenado gaseoso o un calcogenuro fluorado estable cuya relación de la solubilidad en agua, expresada en litros de gas por litro de agua en condiciones estándar, a la raíz cuadrada del peso molecular, en daltons, está por debajo de 0,0027.

11. Un método de fabricación de agentes de contraste que comprenden las suspensiones de microvesículas llenas de gas en una fase acuosa de vehículo líquido de la reivindicación 1, caracterizado por llenar microvesículas ya fabricadas con una mezcla de gases que comprende al menos un hidrocarburo halogenado gaseoso o un calcogenuro fluorado estable cuya relación de la solubilidad en agua, expresada en litros de gas por litro de agua en condiciones estándar, a la raíz cuadrada del peso molecular, en daltons, está por debajo de 0,0027.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en el cual el vehículo acuoso contiene fosfolípidos disueltos en forma de laminillas y estabilizadores que confieren estabilidad a las microburbujas.

13. El método de la reivindicación 11, en el cual las microvesículas se forman en dos pasos, el primer paso en el cual las microvesículas o sus precursores secos de preforman en una atmósfera de un primer gas, y después, en el segundo paso, al menos una fracción del primer gas se sustituye por el hidrocarburo halogenado gaseoso fisiológicamente aceptable o un calcogenuro florado estable.

14. El método de la reivindicación 13, en el cual la formación de las microvesículas con dicha mezcla de gases se efectúa sometiendo alternativamente los precursores secos de las mismas a presión reducida y restableciendo la presión con dicha mezcla de gases, y dispersando por último los precursores en un vehículo líquido.

15. El método de la reivindicación 13, en el cual el primer gas es aire, nitrógeno, o CO_{2}.

16. El método de las reivindicaciones 10 - 15, en el cual el hidrocarburo halogenado gaseoso o calcogenuro fluorado estable es SF_{6}, o un freón seleccionado de CF_{4}, C_{4}F_{8}, CClF_{3}, C_{2}F_{6}, C_{2}ClF_{5}, CBrClF_{2}, C_{2}Cl_{2}F_{4}, ó C_{4}F_{10}.

17. El método de la reivindicación 13, en el cual el primer gas se sustituye completamente por el segundo hidrocarburo halogenado gaseoso fisiológicamente aceptable o calcogenuro fluorado estable seleccionado de CF_{4}, C_{4}F_{8}, CClF_{3}, C_{2}F_{6}, C_{2}ClF_{5}, CBrClF_{2}, C_{2}Cl_{2}F_{4}, ó C_{4}F_{10}.

18. El método de la reivindicación 11, en el cual el llenado de las microvesículas con la mezcla de gases se efectúa lavando abundantemente la suspensión de las microvesículas con la mezcla de gases.

19. Precursores de agentes de contraste constituidos por un polvo seco que comprende liposomas liofilizados y estabilizadores, siendo el polvo dispersable en un vehículo líquido acuoso para formar suspensiones ecogénicas de microvesículas llenas de gas de la reivindicación 1, en el cual dicho polvo se almacena en una atmósfera constituida por una mezcla de gases que comprende al menos un hidrocarburo halogenado gaseoso fisiológicamente aceptable o un calcogenuro fluorado estable cuya relación de solubilidad en agua, expresada en litros de gas por litro de agua en condiciones estándar, a la raíz cuadrada del peso molecular, en daltons, es inferior a 0,0027.

20. Precursores de agentes de contraste constituidos por un polvo seco que comprende liposomas liofilizados y estabilizadores, siendo el polvo dispersable en un vehículo líquido acuoso para formar suspensiones ecogénicas de microvesículas llenas de gas de la reivindicación 1, en el cual dicho polvo se almacena en una atmósfera constituida por un hidrocarburo halogenado gaseoso fisiológicamente aceptable o un calcogenuro fluorado estable cuya relación de solubilidad en agua, expresada en litros de gas por litro de agua en condiciones estándar, a la raíz cuadrada del peso molecular, en daltons, es inferior a 0,0027.

21. Los precursores de agentes de contraste de las reivindicaciones 19 ó 20, en los cuales los liposomas comprenden fosfolípidos cuyos restos de ácido graso tienen 16 átomos de carbono o más.

22. El precursor de agente de contraste de la reivindicación 19 ó 20, en el cual el hidrocarburo halogenado gaseoso o el calcogenuro fluorado estable es SF_{6}, o un freón seleccionado de CF_{4}, C_{4}F_{8}, CClF_{3}, C_{2}F_{6}, C_{2}ClF_{5}, CBrClF_{2}, C_{2}Cl_{2}F_{4}, ó C_{4}F_{10}.

23. Agentes de contraste de las reivindicaciones 1 - 9 para uso en formación de imágenes ultrasónicas del cuerpo de un ser humano o de un animal.

24. El uso de precursores de agentes de contraste de las reivindicaciones 19 - 22 para la fabricación de agentes de contraste ultrasónicos.