FI103670B - Yhdisteen FO-1289 valmistaminen - Google Patents

Description

103670

Yhdisteen FO-1289 valmistaminen

Esillä oleva keksintö koskee uuden yhdisteen FO-1289 valmistusmenetelmää, joka 5 yhdiste vaikuttaa inhiboivasti asyylikoentsyymi-A-kolesteroliasyylitransferaasiin (tästä eteenpäin siitä käytetään nimitystä asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasi).

Tähän mennessä tunnetaan farmaseuttisia tuotteita hyperlipemian hoitamiseksi. Sellaisia ovat muun muassa lääkeaineet, jotka vaikuttavat 1) kolesterolisynteesiä inhi-10 boivasti, 2) kolesteroliabsorptiota inhiboivasti, 3) kolesterolikataboliaa stimuloivasti ja 4) lipoproteiinilipaasia aktivoivasti (lipoproteiinisynteesiä suppressoivasti).

Viime vuosina kolesterolin kertymisestä aikuisissa in vivo, esimerkiksi hyperlipemi-assa (veren lipidien runsaus) ja arterioskleroosissa (valtimonkovetustauti), johtuvista 15 oireista on alkanut muodostua maailmanlaajuisia ongelmia. Hyperlipemia on tunnettu arterioskleroosin kehittymistä stimuloivana, ja iskeemisiä sydänsairauksia voidaan siis vähentää alentamalla veren kolesterolitasoa. Hyperlipemian aiheuttamia sydänlihasinfarkteja on havaittavissa runsaasti. Entistä tehokkaampi ja turvallisempi lääke hyperlipemian hoitoon, erityisesti hyperkolesterolemian hoitoon, on siis toi-20 voitava.

Kolesteroli konvertoituu kolesteroliesteriksi asyyliryhmien siirtymisen myötä asyy-: li-CoA:sta, joka akkumuloituu soluihin ja veren lipoproteiiniin. Eräs asyyliryhmien :Y: siirtoreaktiota katalysoiva entsyymi on asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasi, ja 25 se liittyy erityisesti kolesterolin adsorptioon suolistosta ja vaahtosolujen muodos- • « tumiseen sepelvaltimossa. Tämän vuoksi asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasi-’ .·, inhibiittorin oletetaan tehoavan hyperkolesterolemiaa hoitavasti. Asyyli-CoA-ko- lesteroliasyylitransferaasi-inhibiittorin aikaansaamisen oletetaan olevan käyttökel- • « « ' poinen aikuisten ihmisten sairauksien hoidossa, esimerkiksi hyperlipemian tai siitä 30 johtuvan arterioskleroosin hoidossa.

M» - · · « • · · t · · ; Olemme havainneet mikro-organismien tuottamia aineenvaihduntatuotteita koske- vissa pitkäaikaisissa kokeissa, että yhdisteet, jotka vaikuttavat inhiboivasti asyyli- .··. CoA-kolesteroliasyylitransferaasiin, saadaan tuotettua maaperänäytteestä eristetyn 35 mikro-organismikannan FO-1289 fermentointiliemessä. Olemme myös eristäneet • * · '·* ' yhdisteitä, jotka vaikuttavat inhibitorisesti asyyli-CoA-kolesterolitransferaasiin; nii- den fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia kuvataan tuonnempana. Nämä yhdisteet ovat uudenlaisia yhdisteitä, ja olemme antaneet niille yleisnimeksi yhdiste FO-1289.

2 103670

Esillä olevan keksinnön kohde on yhdisteen FO-1289 valmistaminen.

Eräs toinen esillä olevan keksinnön kohde on valmistaa yhdistettä FO-1289A, jonka molekyylikaava on C31H37NO10, yhdistettä FO-1289B, yhdistettä FO-1289C sekä 5 yhdistettä F01289D. Näiden kolmen viimeksi mainitun molekyylikaava on C32H39NO10.

Fermentointiliemestä eristetyt yhdisteet voidaan modifioida kemiallisesti tunnetun tekniikan mukaisilla standardimenetelmillä. Esimerkiksi asyloitujen yhdisteiden 10 valmistamiseksi eristettyjä yhdisteitä käsitellään asyloivalla aineella sopivassa liuot-timessa lämpötilan ollessa ympäröivästä lämpötilasta refluksointilämpötilaan.

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä yhdisteen FO-1289 valmistamiseksi. Siinä valmistetaan yhdisteitä FO-1289 viljelemällä Aspergillus-lajiin kuuluvaa 15 mikro-organismia ravinneväliaineessa, akkumuloimalla yhdistettä FO-1289 siinä ja eristämällä yhdiste FO-1289 siitä.

~ Keksinnön kohteisiin kuuluu myös saada aikaan Aspergillus-lajiin kuuluva mikro- 1 organismikanta, joka pystyy tuottamaan yhdistettä FO-1289.

1 20

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksisa.

I· « 1 · :f Mikro-organismi, joka pystyy tuottamaan yhdistettä FO-1289 (yhdistettä FO-1289 f ]·*' tuottava mikro-organismi), kuuluu Aspergillus-lajiin. Esimerkiksi Aspergillus-lajiin ! '.· 25 kuuluva mikro-organismikanta FO-1289, jonka esillä olevan keksinnön tekijät ovat • · · • - · eristäneet, on eräs esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäväksi 'i' suositeltavimmista kannoista.

• · · · * * · • · * * * *

Kannan FO-1289 taksonomiset ominaisuudet on tuotu esiin seuraavassa: : 30 • · » *

Taksonomiset ominaisuudet: • · « I. Kanta FO-1289 kasvaa hyvin mallasuuteagarväliaineessa, Czapek-hiivauuteagar-:: väliaineessa ja 20 % sakkaroosi-Czapek-hiivauuteagarväliaineessa, kuroutumia r . : . 35 muodostuu hyvin. Mikroskoopilla tarkasteltaessa Czapek-hiivauuteagarväliaineessa kasvatetussa pesäkkeessä nähdään konidioforeja, jotka kasvavat pääasiallisesti suo-. ^ *'' raan sileäpintaisesta huovastosubstraatista. Konidioforien reuna on turpoava, siinä sms 103670 3 on pullistuneita rakkuloita (läpimitta 10-25 pm). Ei metulamuodostusta. Fialidi muodostuu suoraan rakkulan päälle. Konidian läpimitta on 2-3 pm, muoto pyöreä ' tai subsfeerinen.

5 Π. Havaintoja eri väliaineista: (1) Taulukkoon 1 on koottu viljelyyn liittyviä havaintoja. Havainnot on tehty makroskooppisesti kun on suoritettu viljely 7 päivän ajan 25 °C:ssa.

Taulukko 1 10

I Väliaine Kasvun ulkonäkö (pesäk- Pesäkkeen väri Liukeneva I

keen läpimitta (mm)) __ pigmentti |

Pinta Kääntö- 0

puoli I

Mallas-uute- Hyvä (55) Vaalean- Vaalean- Ei lainkaan | agar Vanumainen-villava ohut kellertävän- kellertä- f

litteä kasvu valkoinen vänvalkoi- U

Konidia.melko tiheä nen |

I muodostus I

Czapek-hiiva- Hyvä (>60) Sinertävän- Vaalean- Ei lainkaan 0 uute-agar Samettimainen kasvu vihreä keltainen |

Konidia: Il tiheä muodostus | 20 % Hyvä (55) Sinertävän- Vaalean- Ei lainkaan | sakkaroosi Samettimainen kasvu vihreä oliivi |

Czapek-hiiva- Konidia: | uute-agar tiheä muodostus | • · «« • · · • · ·

• I I

(2) Kasvun ulkonäkö Czapek-hiivauuteagarväliaineessa 37 °C:ssa 7 päivän viljelyn .... t jälkeen on runsas (yli 80 mm). Ei havaittavaa kasvua 5 °C:ssa 7 päivän viljelyssä. Ei mikro-organismin kasvuun liittyvää eksudaatti- tai sclerotia-muodostusta missään * · · * 15 edellä esiin tuodussa väliaineessa.

4 103670 - ΙΠ. Fysiologiset ominaisuudet

(1) Kasvulämpötila: 15-47 °C

(2) Optimaalinen kasvulämpötila: 27-40 °C

5 (3) Kasvu pH : 5-8 (5) Luonne: aerobinen

Vertailussa edellä esiin tuotuihin kannan FO-1289 ominaisuuksiin, morfologisiin ominaisuuksiin, erilaisiin viljelyominaisuuksiin ja fysiologisiin ominaisuuksiin ja 10 tunnettujen mikro-organismilajien taksonomisiin ominaisuuksiin perustuen nyt esillä oleva kanta FO-1289 määritetään Aspergillus-sukuun kuuluvaksi kannaksi ja siitä käytetään nimitystä Aspergillus sp. FO-1289. Kanta on talletettu: the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, talletusnumero FERM BP-4242.

i 15

Vaikka edellä annettiin kannan FO-1289 kuvaus, mikro-organismikannan taksonomiset ominaisuudet ovat yleensä helposti mutatoituvat eivätkä stabiilit. Tunnetaan j spontaaneja mikro-organismin mutaatioita ja keinotekoisia mutaatioita, jotka on ai heutettu ultraviolettisäteilytyksellä tai käsittelemällä mutageenilla kuten N-metyyli-^ 20 N-nitro-N-nitrosoguanidiniilla tai etyylimetaanisulfonaatilla. Tämän vuoksi nyt £ esillä olevassa keksinnössä voidaankin käyttää sekä keinotekoisia että spontaaneja : mutantteja, jotka kuuluvat Aspergillus-lajiin ja joilla on yhdisteen FO-1289 muodos- : : ·' tuskyky. Myös mutatoidut kannat, jotka saadaan soluteknologisin keinoin, kuten solufuusiolla, ja geeniteknisin menetelmin ja tuottavat voidaan lukea esillä olevan -~™ · '.· 25 keksinnön mukaisiin yhdistettä FO-1289 tuottaviin mikro-organismeihin.

.•*Sf · * · • » ♦ · :.ia . i_ ··· Edullisena esimerkkinä esillä olevan keksinnön mukaisen yhdisteen FO-1289 tuot- tamiseen sopivasta kannasta voidaan mainita Aspergillus sp. FO-1289, FERM BP-43242, jonka esillä olevan keksinnön tekijä on eristänyt turveuutteesta.

7“ ... 30 · · « I « · : Nyt esillä olevassa keksinnössä Aspergillus-lajiin kuuluvaa mikro-organismia, joka tuottaa yhdistettä FO-1289, viljellään ravinneväliaineessa. Esillä olevassa keksin- nössä voidaan käyttää tavallisia sienien viljelyyn käytettyjä menetelmiä. Voidaan ; : käyttää ravinneväliainetta, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, assimiloituvan i| , |·. 35 typpilähteen, tarvittaessa yhdessä epäorgaanisen suolan kanssa. Esimerkkeinä as- • · · • I,. similoituvista hiililähteistä voidaan mainita glukoosi, sakkaroosi, maltoosi, dekstrii- ' ni, selluloosa jne. ja niitä voidaan käyttää yhdistelminä tai yksin. Esimerkkeinä as- 5

U 3 C' / C

similoituvista typpilähteistä voidaan mainita orgaaniset typpilähteet kuten peptoni, mallasuute, hiivauute, kuivahiiva, soijajauho, maissiliotusneste, puuvillansiemen-kakku, kaseiini, soijaproteiinihydrolysaatti, aminohappo ja urea, ja epäorgaaniset typpilähteet, kuten nitraattisuola ja ammoniumsuola. Tarvittaessa väliaineeseen voi-5 daan lisätä epäorgaanisia suoloja, kuten natriumsuolaa, kaliumsuolaa, kalsiumsuo-laa, magnesiumsuolaa, tai fosfaattisuolaa samoin kuin raskasmetallisuolaa. Tarvittaessa väliaineeseen voidaan lisätä myös hivenainetta, kasvustimulaattoria tai prekur-soria.

10 Viljely voidaan suorittaa aerobisissa olosuhteissa ravistellen tai sekoittamalla. Pinnan alaista ilmastussekoitusta käyttäen suoritettava viljely on teollista tuotantoa ajatellen sopivinta. Viljely on edullista suorittaa neutraalissa pH:ssa. Tavallinen viljelylämpötila on 20-37 °C, suositeltava 24-30 °C. Yhdiste FO-1289 akkumuloituu väliaineeseen 2-3 päivän viljelyn aikana, ja kun saavutetaan maksimaalinen yhdis-15 teen FO-1289 tuotanto viljely voidaan lopettaa.

Näitä viljelyolosuhteita, esimerkiksi väliaineen koostumusta, väliaineen pH-arvoa, viljelylämpötilaa, sekoitusnopeutta ja ilmastusmäärää voidaan vaihdella sen mukaan mitä mikro-organismikantaa käytetään, ja ilmakehän olosuhteita edullisten tulosten 20 saavuttamiseksi. Tarvittaessa voidaan käyttää vaahdonestoaineita, kuten silikoniöl- jyä, kasviöljyä tai pinta-aktiivista ainetta. Yhdisteet FO-1289 akkumuloituvat huo- vastossa ja viljelyliemessä. Yhdiste FO-1289 on edullista eristää supematantista ja : ·’ erottaa huovasto sentrifugoimalla viljelylientä.

* · · « * •« · 25 Yhdiste FO-1289 voidaan ekstrahoida supematantista veteen sekoittumattomalla or- • # · • V gaanisella liuottimella, kuten etyyli-asetaatilla, butyyliasetaatilla tai bentseenillä, ja ' ’l’ raaka yhdiste FO-1289 voidaan saada konsentroimalla ekstraktia tyhjiössä. Raa’alle yhdisteelle käytetään lipofiilisille yhdisteille tarkoitettua tunnettua puhdistusmenetelmää, esimerkiksi pylväskromatografiaa kantajana esimerkiksi silikageeli tai alu-30 miinioksidi, ja saadaan eristettyä kaikki yhdisteen FO-1289 komponentit.

• · · • · ·

Yhdiste FO-1289 voidaan myös eristää huovastosoluista ekstrahoimalla huovasto ..,; veteen sekoittuvalla orgaanisella liuottimella. Ekstrakti konsentroidaan alennetussa : paineessa ja konsentraatti ekstrahoidaan vielä veteen sekoittumattomalla orgaanisel- 35 la liuottimella, kuten etyyliasetaatilla, butyyliasetaatilla tai bentseenillä. Ekstrakti, .··. joka valinnaisesti voidaan yhdistää edellä esiin tuotuun viljelyfiltraattiekstraktiin, i 6 103670 voidaan puhdistaa, tai se voidaan puhdistaa ja erottaa samoilla menetelmillä kuin edellä ja saada kaikki yhdisteen FO-1289 komponentit.

IV. Fysikaaliskemialliset ominaisuudet: 5

Taulukko 2 tuo esiin yhdisteen FO-1289A, yhdisteen FO-1289B, yhdisteen FO-1289C ja yhdisteen FO- 1289D fysikaaliskemialliset ominaisuudet.

Taulukko 2 1°

| Yhdiste FO-1289A FO-1289B FO-1289C FO-1289D

Molekyylikaava C31H37NO10 C32H39NO10 C32H39NOK) C32H39NO10

Suuren erottelutarkkuuden elektronitörmäysmassaspektri 1 583,242356 597,25697 597,25603 597,25701

Nopea atomipommitusmassaspektri I 584(M+H)+ 598(M+H)+ 598(M+H)+ 598(M+H)+ 606(M+Na)+ 620(M+Na)+ 620(M+Na)+ 620(M+Na)+

Optinen rotaatio [a] d 28 (Cl, CHC13) +65,8 +62,0 +9,4 +64,5 UV-spektri (metanoli, nm) 1

Kuvio 1 Kuvio 5 Kuvio 9 Kuvio 13 IR-spektri (CCI4)

Kuvio 2 Kuvio 6 Kuvio 10 Kuvio 14 'H-NMR-spektri (CDCl3:ssa)

Kuvio 3 Kuvio 7 Kuvio 11 Kuvio 15 ,3C-NMR-spektri (CDCl3:ssa)

Kuvio 4 Kuvio 8 Kuvio 12 Kuvio 16 ' ""rns· 103670 7

Liukenevuus liuottimeen: liukenee metanoliin, etanoliin, asetonitriiliin, etyyliasetaattiin ja bentseeniin, ei liukene veteen Yhdisteen luonne: neutraali Ulkonäkö : kellertävä jauhe 5

Kemiallinen rakenne: lOl ch3

Ia. o xh3 / ch3 ORj 10 Yhdiste FO-1289A: R, : -CO-CH3 R2: -CO-CH3

R3: -CO-CH3 R,: -H

. . ·. Yhdiste FO- 1289B: Rt: -CO-CH2-CH3 R2 : -CO-CH3

R3: -CO-CH3 R4: -H

Yhdiste FO-1289C: Ri : -CO-CH3 R2 : -CO-CH2-CH3

15 r3 : -CO-CH3 R4.-H

V* Yhdiste FO-1289D: Rj : -CO-CH3 R2 : -CO-CH3

•:-f R3: -CO-CH2-CH3 R4: -H

• · - 1 4 « « V. Biologiset ominaisuudet: :T: 20 (1) Inhibitorinen vaikutus rotan asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasiin: :T: Yhdisteen FO-1289 inhiboivaa vaikutusta asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasiin testattiin Kyoda-menetelmällä (Kyoda et ai, J. Antibiotics, 44:136, 1991). Rotan maksan mikrosomifraktiosta valmistettu raaka entsyymi lisätään 100 mM fosfaatti-, puskuriliuokseen (pH 7,4) 200 pm, joka sisältää 300 μΜ naudan seerumialbumiinia, 25 30 μΜ [1-!4C] oleoyyli-CoA (0,02 pCi) ja 30 μΜ kolesterolia (liuotettuna 1/30 paino/paino Triton WR-1339), ja inkuboidaan 37 °C:ssa 30 minuuttia. Koko-naislipidi ekstrahoi-daan kloroformin:metanolin seoksella (2:1), sitten jokainen li- 103670 > 8 ! pidi erotetaan ohutkerroskromatografian avulla (silikageeli, GF254, kehitin: petroli-eetteri - dietyylieetteri -etikkahappo = 90:10:1). Kolesteroliesterifiraktioon sisältyvä radioaktiivisuus mitataan RI-skannerilia (Ambis Corp.) analysoitaessa asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasin aktiviivisuutta. Entsyymin 50 % inhiboitumispitoisuus 5 näkyy taulukossa 3.

Taulukko 3

IFO-1289A FO-1289B FO-1289C FO-1289D

ΙΟ50(μΜ) 0,04 0,1 0,03 0,15 10 Keksinnön vaikutus:

Kuten edellä on kuvattu, yhdiste FO-1289 ja sen yksittäiset komponentit vaikuttavat voimakkaan inhiboivasti asyyli-CoA-kolesteroliasyylitransferaasiin. Sen mukaan nämä yhdisteet ovat käyttökelpoisia runsaan seerumikolesterolin hoitoon nisäkkäil- 4 lä, ihminen mukaan lukien. Tässä hoidolla tarkoitetaan sekä suuren seerumikoleste- ] 15 rolin määrän ehkäisyä että lievitystä. Yhdisteet voidaan antaa hoidon tarpeessa ole- ; valle kohteelle monin tavallisin eri antotavoin, esimerkiksi oraalisesti tai parente- • raalisesti. Yleisesti ottaen näitä yhdisteitä annetaan oraalisesti tai parenteraalisesti annosten ollessa noin 0,1 - noin 10 mg / hoidettavan kohteen ruumiinpainokilo- gramma per päivä, edullisesti noin 0,5-5 mg/kg. Annostus riippuu luonnollisesti 20 hoidettavan kohteen tilasta ja käytettävän yhdisteen aktiivisuudesta. Antamisesta t _ vastaava henkilö pystyy kaikissa tapauksissa määrittämään jokaiselle kohteelle sopi- • · van annoksen.

_____ ·· · • · · • · • ·

Keksinnön mukaisesti valmistettua yhdistettä voidaan antaa yksin tai yhdessä farma- • ·· v ' 25 seuttisesti hyväksyttävien kantaja-aineiden kanssa sekä yhtenä että useampana an- noksena. Sopivia farmaseuttisia kantaja-aineita ovat muun muassa inertit kiinteät fi laimentunet tai täyteaineet, steriilit vesipitoiset liuokset ja useat eri orgaaniset liuot- « y timet. Saadut farmaseuttiset koostumukset ovat sitten valmiita annettavaksi monen- · · · Iäisinä annosmuotoina kuten erilaisina tabletteina, jauheina, siirappeina, injektoita-30 vina liuoksina ja vastaavina. Nämä farmaseuttiset koostumukset voivat haluttaessa : sisältää vielä lisäaineosia, esimerkiksi maustavia aineita, sideaineita, täyteaineita ja f ,'; vastaavia. Oraalisesti annettavat tabletit voivat näin ollen sisältää erilaisia täyteainei- y ta, kuten natriumsitraattia, kalsiumkarbonaattia ja kalsiumfosfaattia, samoin kuin — erilaisia desintegraattoreita kuten tärkkelystä, algiinihappoa tai joitain tiettyjä >- m 103670 9 kompleksisilikaatteja samoin kuin sideaineita, kuten polyvinyylipyrrolidonia, sakkaroosia, gelatiinia ja arabikumia. Lisäksi sellaiset voiteluaineet kuin magnesiumstea-raatti, natriumlauryylisulfaatti ja talkki ovat usein käyttökelpoisia tabletoinnissa. Saman tyyppisiä kiinteitä koostumuksia voidaan käyttää myös täyteaineina pehmeis-5 sä ja kovissa täytetyissä kapseleissa. Tähän sopivia materiaaleja ovat muun muassa laktoosi eli maitosokeri sekä suurimolekyylipainoiset polyeteeniglykolit. Kun halutaan oraaliseen antoon sopivia vesipitoisia suspensioita tai eliksiirejä pääasiallinen aktiivinen aineosa voi olla yhdistetty erilaisiin makeuttaviin tai maustaviin aineosiin, erilaisiin väriaineisiin ja haluttaessa emulgoiviin tai suspendoiviin aineisiin yhdessä 10 sellaisten laimentimien kanssa kuin vesi, etanoli, propyleeniglykoli, glyseriini ja niiden yhdistelmät.

Parenteraalista antoa varten voidaan käyttää yhdisteen liuoksia seesami- tai maapähkinäöljyssä, vesipitoisessa propeeniglykolissa tai steriilissä vesipitoisessa liuok-15 sessa. Tällaiset vesipitoiset liuokset tulee tarvittaessa sopivasti puskuroida ja nestemäinen liuotin saattaa ensin isotoniseksi käyttämällä tarpeeksi suolaliuosta tai glukoosia. Tällaiset liuokset sopivat erityisen hyvin intravenoosiseen, intramuskulaari-seen, subkutaaniseen ja intraperitoneaaliseen antoon.

20 Lyhyt kuvioiden selostus:

Kuvioi: Yhdisteen FO-1289A UV-spektri Kuvio 2: Yhdisteen FO-1289A IR-spektri

Kuvio 3: Yhdisteen FO-1289A 'H-NMR-spektri . . 25 Kuvio 4: Yhdisteen FO-1289A 13C-NMR-spektri

Kuvio 5: Yhdisteen FO-1289B UV-spektri -; · Kuvio 6: Yhdisteen 60-1289B IR-spektri ;·:· Kuvio 7: Yhdisteen FO-1289B !H-NMR-spektri

Kuvio 8: Yhdisteen FO-1289B I3C-NMR-spektri 30 Kuvio 9: Yhdisteen FO-1289C UV-spektri l..' Kuvio 10: Yhdisteen FO-1289C IR-spektri ’ * Kuvio 11: Yhdisteen FO-1289C 'H-NMR-spektri

Kuvio 12: Yhdisteen FO-1289C 13C-NMR-spektri

Kuvio 13: Yhdisteen FO-1289D UV-spektri 35 Kuvio 14: Yhdisteen FO-1289D IR-spektri ;,. Kuvio 15: Yhdisteen FO-1289D ^-NMR-spektri ja " ' Kuvio 16: Yhdisteen FO-1289D 13C-NMR-spektri 10 103670

Seuraava esimerkki kuvaa esillä olevaa keksintöä rajoittamatta sitä millään tavoin. Esimerkki 1 5 100 ml väliainetta (pH säädettynä arvoon 6,0), joka sisälsi 2,0 % glukoosia, 0,5 % polypeptonia, 0,2 % hiivauutetta, 0,05 % magnesiumsulfaattia, 0,1% kaliumdivety-fosfaattia ja 0,1 % agaria 500 ml -puuvillasulkimellisessa Erlenmeyer kolvissa höy-rysteriloitiin. Yhtä silmukanista mikro-organismikantaa Aspergillus sp. FO-1289 FERM BP-4242, jota oli kasvatettu ravinneagarväliaineessa inokuloitiin väliainee-10 seen ja ravistus viljeltiin 27 °C:ssa 48 tuntia levitysviljelynesteen valmistamiseksi.

Väliainetta, joka sisälsi 1,0 % glukoosia, 0,5 % Triptonia, 0,3 % hiivauutetta ja 0,3 % agaria (pH 6,0) 50 litran täryfermenttorissa steriloitiin ja jäähdytettiin. 200 ml levity s viljelmää siirrettiin siihen aseptisesti ja inokuloitua väliainetta viljeltiin aero-15 bisesti samalla sekoittaen nopeudella 250 rpm, ilmastus 10 1/min 27 °C:ssa 72 tunnin ajan. 30 1 viljeltyä nestettä ekstrahoitiin 18 litralla etyyliasetaattia. Ekstrakti j konsentroitiin alennetussa paineessa raa'an yhdisteen aikaan saamiseksi. Raaka yh diste pantiin silikageelikolonniin (250 g, Merck, Art 9385) ja eluoitiin seoksella klo-i roformi - metanoli (99:1). Aktiiviset fraktiot, jotka sisälsivät yhdistettä FO-1289, jo- 20 kainen 100 ml:n fraktio, koottiin ja konsentroitiin tyhjiössä ja saatiin 1,5 g raakaa yhdistettä.

-E .1*,

Raaka yhdiste puhdistettiin erikseen jaettuna 5 kertaa HPLC-kromatografian avulla t§ (Trirota V, Nihon Bunko Co., pylväs YMC-Pack A-343, ODS-hartsi, Yamamura . . 25 Kagaku Kenkyusho) liuotinsysteeminä 55 % vesipitoinen asetonitriili, UV-havain- :***: nointi 280 nm:ssa, virtausnopeus 8 ml/min. Saatiin 50 mg yhdistettä FO-1289A, ♦·· 5 mg yhdistettä FO-1289B, 5 mg yhdistettä FO-1289C ja 4,5 mg yhdistettä • FO-1289D.

.1^ IM

* v • · ·

Ml * · · • * · 1538

Claims (2)

1. Menetelmä yhdisteen FO-1289 käsittäen yhdisteet FO-1289A, FO-1289B, FO-1289C ja FO-1289D valmistamiseksi, jolla on kaava 5 .O ch3 I xh3 / nch3 OR, jossa Ri, R2 ja R3 ovat asetyyli ja R4 on vety, kun yhdiste on FO-1289A; jossa Ri on propionyyli, R2 ja R3 ovat asetyyli ja R, on vety, kun yhdiste on 10 FO-1289B; jossa Ri ja R3 ovat asetyyli, R2 on propionyyli ja R4 on vety, kun yhdiste on FO-1289C; jossa Ri ja R2 ovat asetyyli, R3 on propionyyli ja R4 on vety, kun yhdiste on FO-1289D; ; 15 tunnettu siitä, että viljellään yhdistettä FO-1289A-D tuottavaa mikro-organismia • · · : Aspergillus sp. FO-1289 FERM BP-4242 ravinneväliaineessa, akkumuloidaan saatu f M • < ’ yhdiste väliaineessa ja erotetaan yhdiste FO-1289A-D siitä. • » « • ·- ·

2. Aspergillus-lajiin kuuluva mikro-organismikanta, tunnettu siitä, että se on :Y; 20 Aspergillus sp. FO-1289 FERM BP-4242. «M P * « • · f 12 103670 ( { I Patentkrav