ES3039652T3

ES3039652T3 - Single b-cell cultivation method

Info

Publication number: ES3039652T3
Application number: ES20214670T
Authority: ES
Inventors: Josef Endl; Sonja Offner; Josef Platzer; Natalie Schuhmacher; Basile Siewe; Irmgard Thorey
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2010-05-28
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2025-10-23
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: EP2400298B1; MX2012013437A; EP3825690B1; JP2013526286A; PL2400298T3; CN102918395B; EP2577304B1; DK2400298T3; MX345884B; HK1212731A1; RU2015155197A3; CN105039252A; CN102918395A; EP3239708B1; JP5779239B2; JP6204415B2; RU2012153785A; US20130084637A1; PL3825690T3; EP3825690C0

Abstract

Se describe un método para obtener un linfocito B que comprende los siguientes pasos: a) marcaje de los linfocitos B, b) depósito de los linfocitos B marcados como células individuales, c) cocultivo de los linfocitos B depositados con células alimentadoras, d) selección de un linfocito B que prolifera y secreta IgG en el paso c) para obtener así un linfocito B. El marcaje puede ser de linfocitos B IgG + CD19 + , linfocitos B IgG + CD38 + , linfocitos B IgG + CD268 + , linfocitos B IgG - CD138 + , linfocitos B CD27 + CD138 + o linfocitos B CD3 - CD27 + . El método puede comprender la incubación de dichos linfocitos B a 37 °C durante una hora en medio EL-4 B5 antes del depósito. El método también puede incluir la centrifugación de dichas células B depositadas individualmente antes del cocultivo. En el cocultivo, se puede utilizar una mezcla de alimentación que comprende interleucina-Ibeta, factor de necrosis tumoral alfa y células de Staphylococcus aureus de la cepa Cowans, BAFF, interleucina-2, interleucina-10, interleucina-6 o interleucina-4. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de cultivo de linfocitos B simples

En el presente documento, se informa de un procedimiento de selección de un linfocito B que secreta un anticuerpo monoclonal que se une a un antígeno diana y un procedimiento de producción de dicho anticuerpo monoclonal secretado por un linfocito B simple que se ha obtenido a partir de una población de linfocitos B de un animal de laboratorio por depósito de células simples y cocultivo con células alimentadoras en presencia una mezcla alimentadora.

Antecedentes de la invención

Para obtener células que secreten anticuerpos monoclonales se usa ampliamente la tecnología de hidridoma desarrollada por Koehler y Milstein. Sin embargo, en la tecnología de hibridoma, solo se puede fusionar y propagar una fracción de linfocitos B obtenidos de un animal de laboratorio inmunizado. La fuente de los linfocitos B es, en general, un órgano de un animal de laboratorio inmunizado tal como el bazo.

Zubleret al.comenzaron en 1984 a desarrollar un enfoque diferente para obtener células que secretan anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Eur. J. Immunol. 14 (1984) 357-63, J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). En dichos documentos, los linfocitos B se obtienen a partir de la sangre del animal de laboratorio inmunizado y se cocultivan con células alimentadoras EL-4 B5 murinas en presencia de una citocina que comprende mezcla alimentadora. Con esta metodología, se pueden obtener hasta 50 ng/ml de anticuerpo después de 10-12 días de cocultivo.

Weitkamp, J-H.,et al.,(J. Immunol. Meth. 275 (2003) 223-237) informan de la generación de anticuerpos monoclonales humanos recombinantes para rotavirus a partir de linfocitos B específicos de antígeno simples seleccionados con partículas similares a virus fluorescentes. Se informa de un procedimiento de producción de una pluralidad de anticuerpos aislados para una pluralidad de antígenos análogos en el documento US 2006/0051348. En los documentos WO 2008/144763 y WO 2008/045140, se informa de anticuerpos para IL-6 y usos de los mismos y un procedimiento de cultivo para obtener una población clonal de linfocitos B específicos de antígeno, respectivamente. En el documento US 2007/0269868, se informa de un procedimiento de cultivo para obtener una población clonal de linfocitos B específicos de antígeno. Masriet al.(en Mol. Immunol. 44 (2007) 2101 2106) informan de la clonación y expresión enE.colide un fragmento Fab funcional obtenido de un linfocito humano simple contra la toxina de carbunco. En el documento WO 2007/031550, se informa de un procedimiento para preparar colecciones de inmunoglobulina.

Sumario de la invención

En el presente documento, se informa de un procedimiento para el aislamiento de un linfocito B de una población de linfocitos B que presenta propiedades especiales. En primer lugar, ya en un plazo de cuatro semanas después de la primera inmunización de un animal de laboratorio, las células que producen anticuerpos inducidos se pueden aislar y se puede determinar la especificidad de unión de los anticuerpos. En segundo lugar, es posible mejorar el número y/o la calidad (por ejemplo, la capacidad de producción/secreción de anticuerpos) de células productoras de anticuerpos mediante una cualquiera de las siguientes etapas: i) una etapa de preincubación, y/o ii) una etapa de centrifugación, y/o iii) una etapa de adsorción. En tercer lugar, la mezcla alimentadora usada para el cocultivo de linfocitos B y células alimentadoras se puede mejorar con la adición de IL-21, o IL-6, o SAC, o BAFF.

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto.

En el presente documento, se informa, como un aspecto de la invención, de un procedimiento de selección de un linfocito B que comprende las siguientes etapas:

a) marcar linfocitos B de una población de linfocitos B,

b) depositar linfocitos B marcados de forma simple de una población de linfocitos B en un recipiente individual que comprende células alimentadoras,

c) centrifugar cada uno de los linfocitos B de una población de linfocitos B, que se ha depositado como célula simple en un recipiente individual que comprende células alimentadoras,

d) cocultivar cada uno de los linfocitos B de una población de linfocitos B, que se ha depositado como célula simple en un recipiente individual, con las células alimentadoras,

e) seleccionar un clon de linfocito B que prolifera y secreta anticuerpo en la etapa d).

En el presente documento, se informa, como otro aspecto de la invención, de un procedimiento para la producción de un anticuerpo que se une de forma específica a un antígeno diana que comprende las siguientes etapas a) marcar linfocitos B de una población de linfocitos B con al menos un tinte fluorescente,

b) depositar linfocitos B simples de una población de linfocitos B en un recipiente individual que comprende células alimentadoras,

c) centrifugar cada linfocito B de una población de linfocitos B, que se ha depositado como célula simple en un recipiente individual que comprende células alimentadoras,

d) cocultivar cada linfocito B de una población de linfocitos B, que se ha depositado como célula simple en recipientes individuales, en presencia de las células alimentadoras y una mezcla alimentadora,

e) seleccionar un clon de linfocito B que produce un anticuerpo que se une específicamente al antígeno diana, f) cultivar una célula, que contiene un ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido por el clon de linfocito B seleccionado en la etapa e), o una variante humanizada del mismo, y recuperar el anticuerpo del sobrenadante celular o de cultivo y, de este modo, producir el anticuerpo.

En un modo de realización, el procedimiento comprende una o más de las siguientes etapas:

después de la etapa c): c1), determinar la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera y el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo mediante PCR con retrotranscriptasa, después de la etapa c1): c2), transfectar una célula con un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera y el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo.

En el presente documento, también se informa, como un aspecto, de un procedimiento para la producción de un anticuerpo que comprende las siguientes etapas

a) proporcionar una población de linfocitos B (maduros) (obtenidos de sangre de un animal de laboratorio), b) marcar las células de la población de linfocitos B con al menos un tinte fluorescente (en un modo de realización, con uno a tres, o dos a tres tintes fluorescentes),

c) depositar células simples de la población marcada de linfocitos B en recipientes individuales (en un modo de realización, el recipiente es un pocillo de una placa multipocillo),

d) centrifugar cada linfocito B de una población de linfocitos B, que se ha depositado como célula simple en un recipiente individual que comprende células alimentadoras,

e) cultivar los linfocitos B individuales depositados en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora (en un modo de realización, las células alimentadoras son células EL-4 B5, en un modo de realización, la mezcla alimentadora es TSN natural, en un modo de realización, la mezcla alimentadora es una mezcla alimentadora sintética),

f) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el medio de cultivo de los linfocitos B individuales,

g) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera y pesada de anticuerpos que se unen específicamente mediante una PCR con retrotranscriptasa y secuenciación de nucleótidos y, de este modo, obtener un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera y pesada de anticuerpo monoclonal,

h) introducir el ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera y pesada variable de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo,

i) introducir el ácido nucleico en una célula,

j) cultivar la célula y recuperar el anticuerpo de la célula o del sobrenadante de cultivo celular y, de este modo, producir un anticuerpo.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el procedimiento comprende la etapa de incubar la población de linfocitos B en el medio de cocultivo antes del depósito de células simples. En un modo de realización, la incubación es a aproximadamente 37 °C. En un modo de realización, la incubación es durante 0,5 a dos horas. En un modo de realización específico, la incubación es durante aproximadamente una hora. En un modo de realización, la incubación es aproximadamente a 37 °C durante aproximadamente una hora.

Los procedimientos de los que se informa en el presente documento comprenden la etapa de centrifugar los linfocitos B depositados en células simples antes del cocultivo. En un modo de realización, la centrifugación es durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos. En un modo de realización específico, la centrifugación es durante aproximadamente 5 minutos. En un modo de realización, la centrifugación es a de aproximadamente 100 x g a aproximadamente 1000 x g. En un modo de realización específico, la centrifugación es a aproximadamente 300 x g. En un modo de realización, la centrifugación es durante aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 300 x g.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el procedimiento comprende inmediatamente antes de la etapa de marcado la siguiente etapa: adsorción de los linfocitos B con antígeno inmovilizado.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se obtiene de sangre de un animal mediante una centrifugación por gradiente de densidad.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se obtiene de sangre de un animal de laboratorio después de 4 días de la inmunización. En otro modo de realización, la población de linfocitos B se obtiene de sangre de un animal de laboratorio de 4 días a al menos 9 días después de la inmunización En otro modo de realización, la población de linfocitos B se obtiene de sangre de un animal de laboratorio de 4 días a 9 días después de la inmunización

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se aísla mediante centrifugación por gradiente de densidad.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son linfocitos B maduros.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el marcado es con de uno a tres tintes fluorescentes. En un modo de realización específico, el marcado es con dos o tres tintes fluorescentes.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el marcado de los linfocitos B da como resultado el marcado de un 0,1 % a un 2,5 % de las células de la población total de linfocitos B.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son linfocitos B de ratón, o linfocitos B de hámster o linfocitos B de conejo.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el depósito de células simples se produce en los pocillos de una placa multipocillo.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, las células alimentadoras son células EL-4 B5 murinas.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el marcado es de linfocitos B IgG+CD19+, linfocitos B IgG+CD38+, linfocitos B IgG+CD268+, linfocitos B IgG-CD138+, linfocitos B CD27+CD138+ o linfocitos B CD3-CD27+.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son de origen de ratón y el marcado es de linfocitos B IgG+CD19+, y/o linfocitos B IgG-CD138+.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son de origen de hámster y el marcado es de linfocitos B IgG+IgM-.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, los linfocitos B son de origen de conejo y el marcado es de linfocitos B IgG+ y/o linfocitos B CD138+, o linfocitos B CD138+IgG+ y/o linfocitos B IgG+IgM-.

En un modo de realización de todos los aspectos como se informa en el presente documento, el cocultivo es en un medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%(v/v), un 1%(p/v) de una solución de glutamina 200 mM que comprende penicilina y estreptomicina, un 2 % (v/v) de una solución de piruvato de sodio 100 mM y un 1 % (v/v) de un tampón de ácido 2-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazin)-etanosulfónico 1 M (HEPES). En otro modo de realización, el medio de cocultivo comprende además beta-mercaptoetanol 0,05 mM.

En todos los aspectos como se informa en el presente documento, el cocultivo de los linfocitos B es con células alimentadoras y una mezcla alimentadora. En un modo de realización, la mezcla alimentadora es un sobrenadante de cultivo de timocitos (TSN) natural o una mezcla alimentadora sintética.

En un modo de realización específico, la mezcla alimentadora es una mezcla alimentadora sintética. En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-1 beta y factor de necrosis tumoral alfa. En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-10 (IL-10). En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende además células Cowans de cepas deStaphylococcus aureus(SAC). En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-21 (IL-21). En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende factor de activación de linfocitos B de la familia del factor de necrosis tumoral (BAFF). En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-6 (IL-6). En un modo de realización, la mezcla alimentadora sintética comprende interleucina-4 (IL-4).

En un modo de realización, el cocultivo es en presencia de un sobrenadante de cultivo de timocitos como mezcla alimentadora. En un modo de realización específico, el sobrenadante de cultivo de timocitos se obtiene de timocitos del timo de un animal joven.

En un modo de realización, el procedimiento de selección de un clon de linfocito B y/o el procedimiento de producción de un anticuerpo que se une a un antígeno diana comprende además la etapa de

f) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera y pesada del anticuerpo producido por el clon de linfocito B seleccionado de la etapa e) mediante una PCR con retrotranscriptasa y secuenciación de nucleótidos y, de este modo, obtener una secuencia del dominio variable de aminoácidos del anticuerpo monoclonal.

En un modo de realización, el animal de laboratorio se selecciona de ratón, hámster y conejo.

Descripción detallada de la invención

El procedimiento del que se informa en el presente documento, permite una caracterización rápida de la especificidad de unión de anticuerpos monoclonales obtenidos de clones de linfocitos B individuales, es decir, en las cuatro semanas después de la primera inmunización del animal de laboratorio, las células que producen anticuerpo inducido se pueden aislar y se puede determinar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos a partir de las mismas, con lo que se puede llevar a cabo al menos 4 experimentos diferentes debido a la cantidad/concentración de anticuerpo en el sobrenadante de cocultivo de los linfocitos B.

Inmunización:

A menudo se usan animales no humanos, tales como ratones, conejos, hámsteres y ratas, como modelo animal para evaluar tratamientos basados en anticuerpos. Por tanto, a menudo se requiere proporcionar anticuerpos con reactividad cruzada que se unan al antígeno de animal no humano así como al antígeno humano. El procedimiento como se informa en el presente documento, se puede usar para proporcionar anticuerpos con reactividad cruzada. En el procedimiento como se informa en el presente documento, se pueden usar linfocitos B obtenidos, por ejemplo, de ratón, hámster y conejo. En un modo de realización, el ratón es un ratón NMRI o un ratón balb/c. En otro modo de realización, el hámster se selecciona de hámster armenio(Cricetulus migratorius),hámster chino(Cricetulus griseus)y hámster siro(Mesocricetulus auratus).En un modo de realización específico, el hámster es el hámster armenio. En un modo de realización, el conejo se selecciona de conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW), conejos Zimmermann (ZIKA), conejos de cepa mutante Alicia, conejos de cepa mutante Basilea, conejos transgénicos con un locus de inmunoglobulina humana, conejos conrbIgMinactivado y cruces de los mismos.

En un modo de realización, los animales de laboratorio, por ejemplo, ratones, hámsteres y conejos, seleccionados para inmunización no son mayores de 12 semanas.

Fuente y aislamiento de linfocitos B:

La sangre de un animal de laboratorio proporciona una gran diversidad de linfocitos B que producen anticuerpos. Los anticuerpos secretados por linfocitos B obtenidos de la misma que apenas tienen secuencias de aminoácidos idénticas o solapadas dentro de las CDR, muestran, por tanto, una gran diversidad.

En un modo de realización, los linfocitos B de un animal de laboratorio, por ejemplo, de sangre, se obtienen desde los 4 días después de la inmunización hasta al menos 9 días después de la inmunización o la inmunización de refuerzo más reciente. Este intervalo de tiempo permite una gran flexibilidad en el procedimiento como se informa en el presente documento. En este intervalo de tiempo, es probable que los linfocitos B proporcionen la migración de los anticuerpos más afines desde el bazo a la sangre (véase, por ejemplo, Paus, D.,et al.,JEM 203 (2006) 1081-1091; Smith, K.G.S.,et al.,The EMBO J. 16 (1997) 2996-3006; Wrammert, J.,et al.,Nature 453 (2008) 667 672).

Los linfocitos B de sangre de un animal de laboratorio se pueden obtener con cualquier procedimiento conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, se puede usar centrifugación por gradiente de densidad (DGC) o lisis de eritrocitos (lisis). La centrifugación por gradiente de densidad, en comparación con la lisis hipotónica, proporciona un mayor rendimiento global, es decir, número de clones de linfocitos B. Adicionalmente de las células obtenidas por centrifugación por gradiente de densidad, un gran número de células se divide y crece en la etapa de cocultivo. También es mayor la concentración de anticuerpo secretado en comparación con las células obtenidas con un procedimiento diferente. Por lo tanto, en un modo de realización, la proporción de una población de linfocitos B es por centrifugación por gradiente de densidad.

Tabla 1:Número de pocillos productores de IgG/clones de células cuando se obtienen células por centrifugación por gradiente de densidad (DGC) o lisis hipotónica o de eritrocitos.

Etapas de selección antes del cocultivo:

Los linfocitos B que producen anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno se pueden enriquecer a partir de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC). Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la población de linfocitos B se enriquece a partir de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC).

El término "unión específica" y los equivalentes gramaticales del mismo indican que el anticuerpo se une a su diana con una constante de disociación (Kd) de 10-7 M o menos, en un modo de realización, de desde 10-8 M a 10-13 M, en otro modo de realización, de desde 10-9 M a 10-13 M. El término se usa además para indicar que el anticuerpo no se une específicamente a otras biomoléculas presentes, es decir, se une a otras biomoléculas con una constante de disociación (Kd) de 10-6 M o más, en un modo de realización, de desde 10-6 M a 1 M.

En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, los PBMC tienen agotamiento de macrófagos. Esto es ventajoso como se ha explicado anteriormente, por ejemplo, como en un modo de realización para linfocitos B de origen de conejo, para la etapa de cocultivo.

Se pueden agotar los macrófagos en PBMC mediante adhesión a la superficie de la placa de cultivo celular (véase la etapa de preincubación).

En un modo de realización de los procedimientos como se informa en el presente documento, las células son de un animal inmunizado con proteínas y tienen agotamiento de macrófagos antes del marcado.

Se ha encontrado que incubar la población de linfocitos B en medio de cocultivo antes del depósito de células simples incrementa el número total de células que secretan anticuerpo obtenidas después del depósito de células simples en comparación con un depósito de células simples inmediatamente después del aislamiento y enriquecimiento opcional de la población de linfocitos B de la sangre de un animal de laboratorio (ejemplo conejo, véanse las tablas 2a y 2b). Específicamente, la incubación es a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente una hora en medio EL-4 B5, por ejemplo, usando una estufa de incubación de cultivo celular.

Tabla 2a:Pocillos positivos para IgG/clones de células con y sin incubación durante una hora en medio EL-4 B5 antes del depósito en células simples de todas las células (rb = conejo).

Pocilios de rbIgG+ [% total de pocilios]

* con agotamiento de

macrófagos y monocitos

Tabla 2b:Pocillos positivos para IgG/clones de células con y sin incubación durante una hora en medio EL-4 B5 antes del depósito en células simples de linfocitos B.

En un modo de realización de los procedimientos como se informa en el presente documento, las células se obtienen de un animal inmunizado con proteínas y con agotamiento de macrófagos.

Las células que no producen un anticuerpo que se une a antígeno o, asimismo, las células que producen un anticuerpo que se une al antígeno se pueden reducir o enriquecer, respectivamente, usando un enfoque de adsorción. En el mismo, se presenta un ligando fijado a una superficie y las células que se unen a la misma se enriquecen selectivamente en la población de células en caso de que las células unidas sean tratadas adicionalmente, o se reducen en la población de células en caso de que las células que permanecen en solución sean tratadas adicionalmente.

Tabla 3:Enriquecimiento de linfocitos B que secretan un anticuerpo especifico de antígeno mediante adsorción con el antígeno respectivo.

Los procedimientos como se informan en el presente documento comprenden, antes del depósito de células simples, una etapa de selección en la que linfocitos B que producen anticuerpos específicos y/o sin reactividad cruzada se seleccionan en base a marcadores de superficie celular y separación/elección celular activado por fluorescencia. En un modo de realización, los linfocitos B maduros se separan/enriquecen/seleccionan. Para la selección de linfocitos B de diferentes especies de animales de laboratorio se pueden usar diferentes marcadores de superficie celular. Se ha encontrado que muchos de los marcadores de superficie celular disponibles, bien individualmente o en combinación, no proporcionan un marcado adecuado.

Con el marcado de poblaciones celulares no diana y linfocitos que no se unen específicamente es posible agotar selectivamente estas células. En esta etapa de agotamiento, solo se puede conseguir un agotamiento no total. Aunque el agotamiento no es cuantitativo, proporciona una ventaja en el posterior marcado por fluorescencia de las células restantes, ya que el número de células de interferencia se puede reducir o, incluso, minimizar. Mediante el depósito en células simples de linfocitos B maduros (linfocitos B de memoria, plasmablastos madurados por afinidad y células plasmocitos) por separación de células activadas con fluorescencia usando el marcado, como se ha explicado anteriormente, se puede obtener un número mayor de pocillos de IgG+/células de clones en la etapa de cocultivo.

El término "marcado" indica la presencia o ausencia de un marcador de superficie que se puede determinar por la adición de un anticuerpo anti-marcador de superficie marcado y que se une específicamente. Por tanto, la presencia de un marcador de superficie se determina, por ejemplo, en el caso de un marcador de fluorescencia por la aparición de fluorescencia, mientras que la ausencia de un marcador de superficie se determina por la ausencia de fluorescencia después de la incubación con el anticuerpo anti-marcador de superficie marcado respectivo y que se une específicamente.

Se pueden marcar diferentes poblaciones celulares usando diferentes marcadores de superficie tales como células CD3+ (linfocitos T), células CD19+ (linfocitos B), células IgM+ (linfocitos B maduros indiferenciados), células IgG+ (linfocitos B maduros), células CD38+ (por ejemplo, plasmablastos) y células IgG+CD38+ (preplasmocitos).

Como se informa en el presente documento, se ha desarrollado un marcado por inmunofluorescencia para la selección de linfocitos B IgG+ maduros, tales como linfocitos B de memoria, plasmablastos y plasmocitos. Para una selección o enriquecimiento de linfocitos B, las células se marcan de forma simple, se marcan de forma doble o bien se marcan de forma triple. También se requiere un marcado que dé como resultado aproximadamente de un 0,1 % a un 2,5 % de células marcadas de la población de células total. En un modo de realización, se depositan linfocitos B como células simples seleccionados mediante el marcado de moléculas de superficie presentes en de un 0,1 % a un 2,5 % de los linfocitos B en la población, en otro modo de realización, en de un 0,3 % a un 1,5 % de los linfocitos B de la población, en otro modo de realización, en de un 0,5 % a un 1 % de los linfocitos B de la población.

De un 0,5 % a un 1 % de los linfocitos B IgG+ dentro de la población de PBMC se pueden marcar doblemente como células IgG+CD19+, células IgG+CD38+ y células IgG+CD268+. Por tanto, en un modo realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B IgG+CD19+, linfocitos B IgG+CD38+ o linfocitos B IgG+CD268+.

De los linfocitos B IgG' dentro de la población de PBMC, de un 0,5 % a un 1 % se pueden marcar doblemente como células IgG'CD138+. Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B IgG'CD138+.

El marcado de células CD27+CD138+ o células CD3'CD27+ da como resultado que se marque aproximadamente un 1,5% de las células de la población celular que va a marcarse, respectivamente. Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B CD27+CD138+ o linfocitos B CD3'CD27+.

De los linfocitos B de hámster IgG' dentro de la población de PBMC, un 0,6 % ± 0,1 %se pueden marcar doblemente como linfocitos B de hámster IgG+IgM-. Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B de hámster IgG+IgM-

En un modo de realización, se depositan linfocitos B IgG'CD138+ como células simples a partir de linfocitos B obtenidos de un animal inmunizado. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan linfocitos B IgG+CD19+ como células simples a partir de linfocitos B obtenidos de un animal no inmunizado. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan linfocitos B IgG+IgM- como células simples a partir de linfocitos B obtenidos de un animal no inmunizado o inmunizado. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B IgG+CD19+ murinos. Esta etapa de selección da como resultado un rendimiento mejor o, incluso, el mayor de los pocillos de IgG+ en la etapa de cocultivo posterior. En otro modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B IgG+CD138+ murinos. Con esto, las células que producen la mayor cantidad de clones de linfocitos B se seleccionan en primer lugar y en segundo lugar la mayor concentración de IgG (véase la tabla 5). En otro modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B IgG+CD19+ murinos y linfocitos B IgG' CD138+ murinos. En un modo de realización específico el procedimiento, tiene lugar con la condición de que, si las células son de conejo, el marcado no es de linfocitos B IgG+ y/o linfocitos B CD138+.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+ murinos con el anticuerpo anti-IgG de ratón 227 (Ab 227), se pueden marcar linfocitos B IgG+ de hámster con el anticuerpo anti-IgG de hámster 213 (AB 213) y/o el anticuerpo anti-IgG de hámster 225 (AB 225), y se pueden marcar linfocitos B de conejo con el anticuerpo anti-IgG 184 (véase la tabla 4).

Tabla 4:Marcado con inmunofluorescencia de linfocitos B, la tabla presenta la fracción marcada promedio de la población de linfocitos B murinos (A-E), linfocitos B de hámster (F-H) y linfocitos B de conejo (I-J).

AB 120 - anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo Southern Biotech 4030-09

AB 184 - anticuerpo Fc de cabra anti-IgG de ratón AbDSerotech STAR121F

AB 185 - anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Caltag M35004-3

AB 200 - anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Invitrogen M31504

AB 212 - anticuerpo de cabra anti-IgG de hámster AbDSerotech STAR79F

AB 213 - anticuerpo de ratón anti-IgG de hámster Becton Dickinson 554010

AB 215 - anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Sigma B 0529

AB 217 - anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón AbDSerotech STAR120F

AB 218 - anticuerpo de cabra anti-CD19 de ratón Abcam ab22480

AB 219 - anticuerpo de cabra anti-IgM de ratón Rockland 710-1607

AB 222 - anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Abcam ab7064

AB 223 - anticuerpo de ratón anti-IgM de hámster Becton Dickinson 554035

AB 224 - anticuerpo de ratón anti-IgM de hámster Becton Dickinson 554033

AB 225 - anticuerpo de ratón anti-IgG de hámster Becton Dickinson 554056

AB 227 - anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Sigma F 8264

PE: Ficoeritrina

APC: Aloficocianina

FITC: Isotiocianato de fluoresceína

Se tiene que indicar que no todos los anticuerpos comercialmente disponibles se pueden usar para el marcado debido a su baja o inexistente especificidad.

Se pueden marcar linfocitos B de ratón con el anticuerpo anti-IgG 227, se pueden marcar linfocitos B de hámster con el anticuerpo anti-IgG 213.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+CD19+ murinos con anticuerpo 227 y anticuerpo 218.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+IgM- murinos con anticuerpo 227 y anticuerpo 219.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+IgM- de hámster con anticuerpo 213 y anticuerpo 224.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+ de conejo con anticuerpo 184.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+IgM- de conejo con anticuerpo 184, y anticuerpo 254 y SA 263.

Se pueden marcar linfocitos B IgG+CD138+ de conejo con anticuerpo 259 y anticuerpo 256.

Se pueden marcar linfocitos B de ratón con el anticuerpo anti-CD27 235 o 236 (AB 235, AB 236), el anticuerpo anti-CD38 192 (AB 192), el anticuerpo anti-CD138233 (AB 233) y el anticuerpo anti-CD268246 (AB 246).

Tabla 5:Marcado por inmunofluorescencia para la determinación de linfocitos B maduros de ratón (A-J), hámster (K) y conejo (L-N).

AB 184 - anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo AbD Serotec STAR121F

AB 189 - anticuerpo anti-CD3 de ratón de hámster Becton Dickinson 553062

AB 192 - anticuerpo de rata anti-CD38 de ratón Becton Dickinson 553764

AB 213 - anticuerpo anti-IgG de hámster de ratón Becton Dickinson 554010

AB 218 - anticuerpo de cabra anti-CD19 de ratón Abcam ab22480

AB 224 - anticuerpo anti-IgM de hámster de ratón Becton Dickinson 554033

AB 227 - anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón Sigma F 8264

AB 233 - anticuerpo de rata anti-CD138 de ratón Becton Dickinson 553714

AB 235 - anticuerpo anti-CD27 de ratón de hámster Becton Dickinson 558754

AB 236 - anticuerpo anti-CD27 de ratón de hámster Becton Dickinson 558753

AB 241 - anticuerpo anti-CD3 de ratón de hámster Becton Dickinson 553060

AB 246 - anticuerpo de rata anti-BAFF-R de ratón eBioscience 51-5943

AB 254 - anticuerpo de ratón anti-IgM de conejo Becton Dickinson personalizado

AB 256 - anticuerpo de cabra anti-IgG de rata Southern Biotech 3030-09

AB 259 - anticuerpo de rata anti-CD138 de conejo Roche Glycart AG

SA 263 - Estreptavidina Invitrogen S866

A647: Alexa Fluor® 647

FITC: Isotiocianato de fluoresceína

En un modo de realización, los procedimientos comprenden la etapa de agotar los macrófagos de la población de linfocitos B y enriquecer los linfocitos B de la población de linfocitos B que secretan anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno diana.

Depósito de células simples:

El procedimiento como se informa en el presente documento, comprende la etapa de depositar los linfocitos B de una población de linfocitos B como células simples. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, el depósito como células simples es por separación celular activada con fluorescencia (FACS). El marcado requerido para el depósito de células simples por FACS se puede llevar a cabo como se indica en la sección previa.

En los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B marcados específicamente. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, el marcado es un marcado de marcadores de superficie celular con anticuerpos marcados con fluorescencia. En otro modo de realización, los procedimientos, como se informan en el presente documento, proporcionan anticuerpos monoclonales. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B maduros.

Se ha encontrado también que una etapa de centrifugación adicional después del depósito en células simples y antes del cocultivo proporciona un número incrementado de células que secretan anticuerpos e incrementa la cantidad de IgG secretada (ejemplo de animal de laboratorio con locus de inmunoglobulina humana, véase la tabla 6).

Tabla 6:Pocillos positivos para IgG/clones de células con y sin etapa de centrifugación tras el depósito en células simples.

Los procedimientos como se informan en el presente documento, comprenden la etapa de centrifugar las células depositadas simples antes del cocultivo. En un modo de realización específico, la centrifugación es durante 5 minutos a 300 * g.

Cocultivo

La etapa de cocultivo con células alimentadoras puede estar precedida y también seguida de un número de etapas adicionales.

En los procedimientos como se informa en el presente documento, los linfocitos B depositados simples se cocultivan con células alimentadoras en presencia de una mezcla alimentadora. En un modo de realización específico, los linfocitos B se cocultivan con células alimentadoras EL-4 B5 murinas. Mediante marcado por inmunofluorescencia adecuado como se ha explicado anteriormente, se puede conseguir un incremento del rendimiento de la etapa de cocultivo (número de pocillos con IgG+/clones de células así como concentración de IgG) y también un enriquecimiento o aislamiento de linfocitos B IgG+ maduros de PBMC.

Con el depósito en células simples de linfocitos B IgG+CD19+ y/o IgG+CD38+ de PBMC aislados frescos, se puede obtener el mayor número de pocillos de IgG+/clones de células. Con el depósito en células simples de linfocitos B IgG+CD19+, IgG+CD38+ y/o IgG-CD138+ tras el agotamiento de macrófagos o células específicas para KLH (hemocianina de lapa), se pueden obtener buenos resultados. Con el depósito en células simples de linfocitos B IgG+CD19+, IgG+CD38+ y/o IgG-CD138+ tras el agotamiento de linfocitos B específicos del antígeno, se pueden obtener mejores resultados. Por tanto, en un modo realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan linfocitos B IgG+CD19+, IgG+CD38+ y/o IgG-CD138+ como células simples. Se ha encontrado que una célula simple que se deposita en base a un marcado como se ha explicado anteriormente, da como resultado la mayor fracción de pocilios de IgG+/clones de células en los pocillos/clones de célula con la mayor concentración de IgG en el sobrenadante. Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simple linfocitos B IgG+CD19+ y/o IgG-CD138+ murinos. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B IgG+IgM- de hámster. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se depositan como células simples linfocitos B CDl38+ IgG+ y/o IgG+, y/o linfocitos B CD138+ y/o IgG+IgM- de conejo.

Tabla7:Rendimiento en el cocultivo dependiendo del marcado por inmunofluorescencia.

Para linfocitos B murinos con el depósito en células simples de células IgG+CD19+ después de cada etapa de enriquecimiento (enr.) y/o agotamiento (agot.), se puede obtener el mayor número de pocillos de IgG+/clones de células después del cocultivo. De forma alternativa, con el depósito en células simples de células IgG-CD138+, se puede obtener pocillos/clones de células con la mejor concentración de IgG en el sobrenadante. El depósito en células simples de células IgG-CD138+ se puede usar para linfocitos B de animales inmunizados. El depósito en células simples de células IgG-CD19+ se puede usar para linfocitos B de animales no inmunizados. El depósito en células simples de células IgG+IgM- se puede usar para linfocitos B de hámster de animales inmunizados y no inmunizados. El depósito en células simples de linfocitos B IgG+, y/o IgG+CD138+, y/o CD138+ y/o IgG+IgM- se puede usar para linfocitos B de conejo.

El marcado por inmunofluorescencia usado para linfocitos B obtenidos de sangre de un animal de laboratorio se puede usar también para el marcado de linfocitos B obtenidos del bazo y otros órganos inmunitarios de un animal de laboratorio, tal como ratón, hámster y conejo. Para linfocitos B de ratón, la fracción de linfocitos B IgG+ del bazo fue de aproximadamente un 0,8 % en comparación con un 0,4 % para células IgG+CD19+. Para linfocitos B de hámster, los números respectivos son un 1,9 % y un 0,5 % de células IgG+IgM-. Para linfocitos B derivados de sangre de conejo, se encontró un 0,2 % de células IgG+ después del agotamiento de macrófagos. Las placas de Peyer de conejo mostraron un 0,4 % de células IgG+ y el bazo mostró un 0,3 % de células IgG+ después del agotamiento de macrófagos.

Con los procedimientos como se informa en el presente documento después de aproximadamente siete (7) días, es decir, después de 5, 6, 7 u 8 días, especialmente después de 7 u 8 días, de cocultivo, se pueden obtener concentraciones de anticuerpo de aproximadamente 30 ng/ml hasta 15 |jg/ml o más (valor promedio de aproximadamente 500 ng/ml). Con la cantidad de anticuerpo proporcionada de este modo, se puede realizar un alto número de análisis diferentes para caracterizar el anticuerpo, por ejemplo, con respecto a la especificidad de unión, con más detalle. Con la caracterización mejorada del anticuerpo en esta fase temprana del procedimiento de cribado/selección, es posible reducir el número de aislamientos y reacciones de secuenciación de ácido nucleico que se tienen que realizar. Adicionalmente, el clon de linfocito B proporciona una cantidad de ARNm que codifica la región variable de la cadena ligera y pesada monoclonal, permitiendo el uso de un cebador de PCR degenerado y obvia el requerimiento de un cebador de alta especificidad. También se reduce el número requerido de ciclos de PCR. Por tanto, en un modo de realización, la PCR con retrotranscriptasa es con un cebador de PCR degenerado para el dominio variable de la cadena ligera y pesada.

En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora es un sobrenadante de cultivo de timocitos. En un modo de realización específico, el sobrenadante de cultivo de timocitos se obtiene de los timocitos del timo del animal joven respectivo. Es especialmente adecuado usar el timo de animales jóvenes en comparación con el aislamiento de timocitos de la sangre de animales adultos. El término "animal joven" indica un animal antes de que se produzca la madurez sexual. Un hámster joven, por ejemplo, es de una edad de menos de 6 semanas, especialmente menos de 4 semanas. Un ratón joven, por ejemplo, es de una edad de menos de 8 semanas, especialmente menos de 5 semanas.

Debido al origen de la mezcla alimentadora, que se deriva del sobrenadante de timocitos cultivados("thymocyte cultivation supernatant'- TSN), se producen variaciones entre lotes considerables. Para superar esta variabilidad, se ha desarrollado una mezcla alimentadora sintética que consiste en componentes sintéticos. Una mezcla alimentadora que consiste en IL-1 p (interleucina-1 beta), TNFa (factor de necrosis tumoral alfa), IL-2 (interleucina-2) e IL-10 (interleucina-10) es conocida de Tucci, A.,et al.,J. Immunol. 148 (1992) 2778-2784.

Los procedimientos informados en el presente documento comprenden una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B depositados simples y células alimentadoras. Estas mezclas alimentadoras pueden comprender aditivos específicos de especie de linfocitos B para incrementar la cantidad de anticuerpo secretado por el clon de linfocito B respectivo. Las células altamente productoras simultáneamente contienen más ARNm que, a su vez, facilita la transcripción inversa y secuenciación del ácido nucleico codificante, por ejemplo, con un conjunto de cebadores no específicos redundantes.

Con la adición de SAC (células Cowans de la cepaStaphylococcus aureus,se usó un lote de SAC único) se puede incrementar el número de linfocitos B que secretan anticuerpo y la concentración de IgG promedio en el sobrenadante después del cocultivo. Se ha encontrado que, para la adición de SAC en el cocultivo, se puede definir un intervalo de concentración, ya que concentraciones reducidas o incrementadas de SAC reducen la cantidad de anticuerpo secretado.

Tabla 8a:Resultados de un ELISA de huCk (huCk = C kappa humano) o ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B obtenidos de un animal de laboratorio con locus de IgG humana o un conejo de tipo natural (NZW) cocultivado con células alimentadoras EL-4 B5 y TSN como mezcla alimentadora con o sin SAC añadido.

Se puede apreciar que una relación de SAC de 1:20000 a 1:150000 proporciona un número mayor de pocillos de IgG+/clones de células, por lo que la relación de 1:50000 a 1:100000 muestra los mayores números. En un modo de realización, la cantidad de SAC añadido al medio de cultivo se determina proporcionando una serie de dilución y determinando la dilución a la que el SAC añadido proporciona el mayor número de pocilios positivos para IgG/clones de células.

Se ha observado que mediante la adición de SAC a la mezcla alimentadora el cocultivo de linfocitos B, se modificaba de forma sorprendente de manera que solo linfocitos B depositados simples tenían un beneficio en el crecimiento, mientras que el crecimiento de los linfocitos B estaba inhibido cuando se usaba una mezcla de PBL (por ejemplo, linfocitos B y linfocitos T endógenos) para cocultivo.

Tabla 8b:Resultados de un ELISA de huCk o ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de PBL y linfocitos B depositados simples cocultivados con células alimentadoras EL-4 B5 y TSN como mezcla alimentadora con SAC añadido.

* agotamiento de

macrófagos

Se presentan datos adicionales obtenidos con diferentes mezclas alimentadoras en las siguientes tablas 9 y 10.

En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B comprende IL-1 p, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-21 (interleucina-21). En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B comprende IL-1p, TNFa, IL-2, IL-10 y SAC. En un modo de realización específico, IL-1 p, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-21 son IL-1 p murina, TNFa murino, IL-2 murina, IL-10 murina e IL-21 murina recombinantes.

En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B murinos comprende IL-113, iL-2, IL-10, TNF-a y BAFF. En un modo de realización específico, se añade BAFF a una concentración de 5 ng/ml.

En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B de hámster comprende IL-113, IL-2, IL-10, TNF-a, IL-6 y SAC. En un modo de realización específico, se añade la IL-6 a una concentración de 10 ng/ml. En un modo de realización específico, se añade SAC en una proporción de 1:75.000.

Tabla 9:Resultados de un ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B de conejo cocultivados con células alimentadoras EL-4 B5 y diferentes mezclas alimentadoras sintéticas que comprenden sustancias murinas recombinantes en diferentes concentraciones.

Tabla 10:Pocillos de IgG+ de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B de conejo cocultivados con células alimentadoras EL-4 B5 y TSN o una mezcla alimentadora que comprende sustancias murinas recombinantes y SAC (rb = conejo, m = ratón).

Un cocultivo de células alimentadoras y linfocitos B murinos sin IL-2, sin IL-10, así como sin IL-2 e IL-10, da como resultado un incremento del rendimiento de pocillos de IgG+ a pesar de que se reduce la concentración de IgG. Sin TNFa, la concentración de IgG se reduce también. Sin IL-113, no se encuentra IgG en el sobrenadante.

Un cocultivo de linfocitos B de hámster sin IL-2 o sin IL-10, respectivamente, da como resultado pocillos de IgG+ con concentración de IgG detectable. En cambio, en un cocultivo sin IL-2 ni IL-10 casi no se puede detectar crecimiento de linfocitos B. En ausencia de TNF-a o IL-113, no se puede determinar secreción de IgG.

En presencia de células alimentadoras EL-4 B5, se requieren al menos IL-113 y TNFa para el cocultivo de linfocitos B de ratón, hámster y conejo. Se pueden omitir IL-2 e IL-10 para el cocultivo de células murinas. Se pueden cultivar linfocitos B de hámster en ausencia de IL-2 o bien IL-10. Se pueden cultivar linfocitos B de conejo en ausencia de IL-2 o IL-10 o bien IL-6.

Para linfocitos B murinos y de hámster, la adición de IL-4 a la mezcla alimentadora incrementa el número de pocillos de IgG+/clones de célula, así como la concentración de IgG en el sobrenadante. Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora para el cocultivo de linfocitos B murinos o de hámster comprende IL-4.

La adición de IL-6 a la mezcla alimentadora para el cocultivo de linfocitos B murinos o linfocitos B de hámster da como resultado un número mayor de pocillos de IgG+/clones de células o una mayor concentración de IgG, respectivamente. Por tanto, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la mezcla alimentadora para el cocultivo de linfocitos B murinos o linfocitos B de hámster comprende IL-6. En un modo de realización específico, se añade la IL-6 a una concentración de 50 ng/ml. En un modo de realización específico, se añade IL-6 a una concentración de 10 ng/ml si se requiere una concentración de IgG alta. En un modo de realización específico, la adición de IL-6 es después de tres días de cocultivo de los linfocitos B seleccionados y células EL-4 B5.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B y células alimentadoras que comprende IL-1p, TNFa, IL-10, y uno o más seleccionados de IL-21, SAC, BAFF, IL-2, IL-4 e IL-6.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B y células alimentadoras que comprende IL-1p, TNFa, IL-2, IL-10 y SAC.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B murinos y células alimentadoras que consiste en IL-1p, TNFa y comprende opcionalmente IL-21 y/o SAC y/o BAFF y/o IL-6.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B murinos y células alimentadoras que comprende IL-113, IL-2, IL-10, TNF-a y BAFF.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B murinos o de hámster y células alimentadoras que comprende IL-1p, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-6

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B de hámster y células alimentadoras que consiste en IL-1 p, TNFa e IL-2 o IL-10, y comprende opcionalmente IL-21 y/o SAC y/o BAFF.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B de hámster y células alimentadoras comprende IL-113, IL-2, IL-10, TNF-a, IL-6 y SAC.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células alimentadoras que comprende IL-1p, TNFa, IL-10 e IL-6.

Un aspecto de los procedimientos como se informa en el presente documento comprende una etapa de cocultivo de cada uno de los linfocitos B que se ha depositado como una célula simple en un recipiente individual en presencia de células alimentadoras y una mezcla alimentadora sintética para el cocultivo de linfocitos B de conejo y células alimentadoras que comprende IL-1p, TNFa, IL-10, IL-6 o IL-2 y SAC

En un modo de realización específico, I L-1 p, TNFa, IL-2, IL-10 e IL-21 son IL-1p murina, TNFa murino, IL-2 murina, IL-10 murina e IL-21 murina recombinantes.

En un modo de realización específico, se añade BAFF a una concentración de 5 ng/ml.

En un modo de realización específico, se añade la IL-6 a una concentración de 10 ng/ml.

En un modo de realización específico, se añade SAC en una proporción de 1:75.000.

En un modo de realización específico, las células alimentadoras son células EL-4 B5 murinas.

La adición de un inhibidor de cierto canal de potasio (= PAP-1, 5-(4-fenoxibutoxi)psoraleno) incrementa de forma sorprendente la secreción de rbIgG de linfocitos B de forma dependiente de la concentración sin reducción del número de clones de linfocitos B. Normalmente, una citocina que induce rbIgG se puede correlacionar productivamente con una reducción del número total de clones de linfocitos B. Esto no fue el caso con PAP-1.Tabla 11:Resultados de ELISA de rbIgG de sobrenadantes de cultivo celular de linfocitos B cocultivados con células alimentadoras EL-4 B5 en presencia de TSN y SAC (=con) y concentraciones diferentes de PAP-1. DMSO: disolvente para PAP-1 (1 |<j>M).

Con una concentración de TSN de un 7,5 %, se puede obtener la mayor concentración de IgG en el sobrenadante.

Tabla 12:Influencia de TSN en el cocultivo. Una concentración de TSN de un 7,5 % da como resultado una mejora del crecimiento y la productividad de linfocitos B.

Con un número de 30.000 células alimentadoras por pocilio de una placa de 96 pocilios, se puede obtener el mayor número de pocillos de IgG+ en combinación con concentración de IgG en el sobrenadante. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, el número de células alimentadoras por linfocito B depositado simple es aproximadamente 30.000.

Tabla 13:Influencia de la cantidad de células alimentadoras EL-4 B5 en el cocultivo.

El cocultivo es, en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, en placas multipocillo de poliestireno con pocillos con un fondo redondo. El volumen de trabajo de los pozos, es en un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, de 50 |jl a 250 jl. En un modo de realización específico, los pocillos se recubren al menos parcialmente con un sustrato no fibroso preparado a partir de una combinación de resina plástica polimérica y moléculas anfipáticas, en la que la molécula anfipática comprende un resto hidrófilo y una región hidrófoba, en la que las regiones hidrófobas se anclan dentro del sustrato y los restos hidrófilos se exponen en el sustrato. En un modo de realización específico, las moléculas anfipáticas se seleccionan de alquilamina etoxilada, poli(etilenimina), octildecamina o mezclas de las mismas (véase, por ejemplo, el documento EP 1860 181).

Caracterización de células cocultivadas:

Para la determinación (cualitativa y cuantitativa) de IgG secretada después del cocultivo, se pueden usar, en general, todos los procedimientos conocidos por un experto en la técnica tales como un ELISA. En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, se usa un ELISA. En un modo de realización específico para la determinación de IgG secretada por linfocitos B murinos, se usa un ELISA con los anticuerpos anti-IgG AB 216 (anticuerpo de captura) y AB 215 (anticuerpo trazador). En un modo de realización específico para la determinación de IgG secretada por linfocitos B de hámster, se usa un ELISA con los anticuerpos monoclonales AB 220 (anticuerpo de captura) y<a>B 213 (anticuerpo trazador).

Dependiendo de los resultados de caracterización, se puede obtener, es decir seleccionar, un clon de linfocito B. El término "clon" indica una población de linfocitos B que secretan anticuerpos y se dividen que surgen de/se originan a partir de un linfocito B simple. Por tanto, un clon de linfocito B produce un anticuerpo monoclonal.

Aislamiento de ARNm, clonación y secuenciación:

A partir de los linfocitos B, el ARNm total se puede aislar y transcribir en ADNc. Con cebadores específicos, se puede amplificar el ácido nucleico que codifica la región VH y VL análoga. Con la secuenciación del ácido nucleico así obtenido, se confirmó que los anticuerpos obtenidos son anticuerpos monoclonales en la mayoría de los casos (71-95 %). También se puede observar de la secuenciación de los linfocitos B individuales que casi no se obtienen secuencias idénticas. Por tanto, el procedimiento proporciona anticuerpos de gran diversidad que se unen al mismo antígeno.

Los cebadores usados para la amplificación del ácido nucleico que codifica VH se pueden usar para ADNc obtenido de células del ratón NMRI, el hámster armenio, el ratón Balb/c, así como el hámster sirio y el conejo.

En un modo de realización de todos los procedimientos como se informa en el presente documento, la secuencia de aminoácidos se deriva del ácido nucleico que codifica VH amplificado y el punto exacto de inicio y final se identifica localizando las secuencias de aminoácido de EVQL/Qv Ql a Vs S (región VH) y DIVM/DIQM a KLEIK (región VL).

El término "anticuerpo" indica una proteína que consiste en una o más cadenas polipeptídicas codificadas sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los diferentes genes de la región constante así como la miríada de genes de la región variable de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formatos, incluyendo, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)<2>, así como cadenas sencillas (scFv), diacuerpos, formas monovalentes, bivalentes, trivalentes o tetravalentes, y también como forma biespecífica, triespecífica o tetraespecífica (por ejemplo, Huston, J.S,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E.,et al.,Science 242 (1988) 423-426; en general, Hoodet al.,Immunology, Benjamín N.Y., 2.a edición (1984); y Hunkapiller, T. y Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16).

En el presente documento, también se informa de un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una población de linfocitos B (maduros) (obtenidos de sangre de un animal de laboratorio), b) teñir las células de la población de linfocitos B con al menos un tinte de fluorescencia (en un modo de realización ,con de uno a tres o de dos a tres tintes de fluorescencia),

c) depositar células simples de la población teñida de linfocitos B en recipientes individuales (en un modo de realización, el recipiente es un pocillo de una placa multipocillo),

f) determinar la especificidad de unión de los anticuerpos secretados en el cultivo de los linfocitos B individuales, g) determinar la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera y pesada de anticuerpos que se unen específicamente mediante una PCR con retrotranscriptasa y secuenciación de nucleótidos y, de este modo, obtener un ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera y pesada de anticuerpo monoclonal,

h) introducir el ácido nucleico que codifica el dominio variable de la cadena ligera y pesada de anticuerpo monoclonal en un casete de expresión para la expresión de un anticuerpo,

i) introducir el ácido nucleico en una célula,

Un "casete de expresión" se refiere a una construcción que contiene los elementos reguladores necesarios, tales como promotor y sitio de poliadenilación, para la expresión de al menos el ácido nucleico contenido en una célula. El término "animal de laboratorio" indica un mamífero no humano. En un modo de realización, el animal de laboratorio se selecciona de rata, ratón, hámster, conejo, primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollo, anfibios y reptiles.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, exponiéndose su alcance real en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Medios y tampones:

El tampón de bloqueo para ELISA comprende 1X PBS y BSA al 1 %.

El tampón de recubrimiento para ELISA comprende 4,29 g de Na2CO3*10 H2O y 2,93 g de NaHCO3; añadir agua hasta un volumen final de 1 litro, pH 9,6 ajustado con HCl 2 N.

La solución de etanol para aislamiento de ARN comprende etanol al 70 % o etanol al 80 %.

El tampón de FACS para tinción de inmunofluorescencia comprende 1X PBS y BSA al 0,1 %.

El tampón de IMDM para ELISA comprende 1X PBS, IMDM al 5 % y BSA al 0,5 %.

El tampón de incubación 1 para ELISA comprende 1X PBS, CroteinC al 0,5 %.

El tampón de incubación 2 para ELISA comprende 1X PBS, CroteinC al 0,5%y Tween 20 al 0,02 %.

El tampón de incubación 3 para ELISA comprende 1X PBS, BSA al 0,1%.

El tampón de incubación 4 para ELISA comprende 1X PBS, BSA al 0,5 %, Tween al 0,05 %, PBS (10X), KH2PO4 0,01 M, Na2HPO40,1 M, NaCl 1,37 M, KCl 0,027 M, pH 7,0.

El tampón de PCR comprende KCl 500 mM, MgCl2 15 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 9,0.

El tampón de lavado 1 para ELISA comprende 1X PBS, Tween 20 al 0,05 %.

El tampón de lavado 2 para ELISA comprende 1X PBS, Tween 20 al 0,1 %.

El tampón de lavado 3 para ELISA comprende agua, NaCl al 0,9 %, Tween 20 al 0,05 %.

El medio EL-4 B5 comprende RPMI 1640, FCS al 10 %, mezcla de glutamina/penicilina/estreptomicina al 1 %, piruvato de sodio 100 mM al 2 %, tampón HEPES 1 M al 1 %.

Ejemplo 2

Cuidado de los animales e inmunización

Los animales de laboratorio se mantuvieron de acuerdo con la legislación de protección animal alemana (TierSCHG), así como de acuerdo con las directrices europeas respectivas.

Se recibieron ratones y hámsteres a una edad de 6 a 8 semanas y se inmunizaron antes de una edad de 12 semanas. El antígeno se aplicó en primer lugar junto con adyuvante de Freud completo (CFA). Otras aplicaciones fueron con adyuvante de Freud incompleto (TFA). La emulsión que contiene antígeno se aplicó por vía subcutánea con lo que la emulsión comprendió una cantidad de desde 50 a 100 |jg de antígeno dependiendo del peso del animal de laboratorio receptor.

Se usaron conejos NZW (Charles River Laboratories International, Inc.) para inmunización. Se disolvió el antígeno en tampón de K<3>PO<4>pH 7,0 a una concentración de 1 mg/ml y se mezcló (1:1) con adyuvante de Freud completo (CFA) hasta la generación de emulsión estable. Los conejos recibieron una inyección intradérmica (i.d.) de 2 ml de emulsión seguida de una segunda inyección intramuscular (i.m.) y una tercera subcutánea (s.c.), cada una de 1 ml, en un intervalo de una semana. La cuarta inyección i.m. de 1 ml se realizó dos semanas después, seguida de otras dos inyecciones s.c. de 1 ml en un intervalo de cuatro semanas.

Durante la inmunización, se determinó el valor de anticuerpo sérico con un ensayo específico de antígeno. A un valor de anticuerpo con una CI<50>de 1:10000, se extrajo la sangre o el bazo del animal inmunizado. Para la reactivación de linfocitos B específicos de antígeno, se aplicaron de 30 jg a 50 jg del antígeno por vía intravenosa al animal de laboratorio tres días antes de la extracción de la sangre o del bazo.

Ejemplo 3

Extracción de órganos, sangre y macrófagos

Se obtuvo sangre de ratones y hámsteres por punción de la vena retrobulbérica. Se obtuvo sangre de conejos por punción de la vena de la oreja o, para volúmenes más grandes, de la arteria de la oreja. Se recogió sangre completa (10 ml) de los conejos 4-6 días después de la tercera, cuarta, quinta y sexta inmunización y se usó para separación de células simples por FACS.

Se aislaron macrófagos de la sangre obtenida por fijación al plástico de cultivo celular. Para ratones y hámsteres, se pueden obtener aproximadamente 3*105 macrófagos de cada animal por este procedimiento.

Si se requirió una cantidad más grande de macrófagos de ratón o hámster, se aislaron macrófagos peritoneales. Para esto, los animales tienen que ser de al menos 3 meses de edad. Para la extracción de macrófagos peritoneales, se sacrificaron los animales y se inyectó inmediatamente 5 ml de medio El-4 B5 con una temperatura de 37 °C en la cavidad peritoneal. Después de masajear el vientre del animal durante 5 minutos, se retiró la solución que contenía las células.

Ejemplo 4

Cultivo de células EL-4 B5

Se descongelaron rápidamente células EL-4 B5 congeladas en un baño de agua a 37 °C y se diluyeron con 10 ml de medio EL-4 B5. T ras centrifugación a 300 * g durante 10 minutos se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en el medio. Tras una etapa de centrifugación, se desechó de nuevo el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1 ml de medio.

Se inocularon células EL-4 B5 a una densidad celular de 3 * 104 células/ml en matraces de cultivo de 175 m2 La densidad celular se determinó cada segundo día y se ajustó a 3 * 104 célula/ml. Las células tienen un tiempo de duplicación de aproximadamente 12 horas y tienen que cultivarse a una densidad celular inferior a 5 * 105 células/ml porque con mayor densidad celular se pierden las propiedades estimuladoras de las células. Cuando el número de células totales era de aproximadamente 1,5 * 109 células se extrajo el medio mediante centrifugación. Después de esto, se irradiaron las células con 50 gray (5000 rad). Después de la determinación del número de células viables mediante tinción con azul de tripano, se obtuvieron partes alícuotas de entre 5 x 106 y 1 x 107 células y se congelaron a -80 °C.

Para el cocultivo, se descongelaron las células y se lavaron dos veces con medio EL-4 B5. Para la determinación del número de células viables, se diluye la suspensión celular 1:10 con solución de azul de tripano al 0,4 % (p/v) y se transfieren 10 |jl de la mezcla a una cámara de conteo de NeuBauer y se contó el número de células.

Ejemplo 5

Centrifugación por gradiente de densidad

El aislamiento de leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC), se llevó a cabo por separación por gradiente de densidad con Lympholyte® de acuerdo con las instrucciones del fabricante A (Lympholyte®-mammal, cedarlane).

Se diluyó la sangre extraída a 2:1 con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En un vial de centrífuga, se proporcionó el mismo volumen de medio de separación por densidad y se añadió cuidadosamente la sangre diluida por medio de la pared del vial. Se centrifugó el vial durante 20 minutos a 800 x g sin frenado. Se obtuvieron los linfocitos de la capa intermedia blanca. Se complementaron las células retiradas con 10 ml de PBS y se centrifugaron a 800 x g durante 10 minutos. Se desechó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió, se lavó y se centrifugó. El sedimento final se resuspendió en PBS.

Ejemplo 6

Lisis hipotónica de eritrocitos

Para la destrucción de eritrocitos por lisis hipotónica, se diluyó una solución de cloruro de amonio (BD Lyse™) a 1:10 con agua y se añadió en una proporción de 1:16 a sangre completa. Para la lisis de eritrocitos, se incubó la mezcla durante 15 minutos a oscuras. Para la separación de los residuos celulares de células intactas, se centrifugó la solución durante 10 minutos a 800 x g. El sobrenadante se desechó, se resuspendió el sedimento en PBS, se lavó de nuevo, se centrifugó y se resuspendió el sedimento en PBS.

Ejemplo 7

Preparación de células de órganos internos de un animal de laboratorio

Para la preparación de células de bazo y timo, se diseccionó el órgano respectivo en una placa de Petri y se recogieron las células en PBS. Para la extracción del tejido restante, se filtró la suspensión celular a través de un tamiz de 100 jm . Para la obtención de linfocitos de células de bazo, se usó centrifugación por gradiente de densidad. Para las células del timo, no se requirió una etapa de enriquecimiento adicional.

Ejemplo 8

Agotamiento de macrófagos

Se usaron placas de 6 pocillos estériles (calidad para cultivo celular) para agotar los macrófagos y monocitos a través de adhesión inespecífica. Se recubrieron los pocillos con KLH (hemocianina de lapa californiana) o bien con estreptavidina y los péptidos de control. Cada pocillo se rellenó con 3 ml hasta un máximo 4 ml de medio y hasta 6x106 leucocitos monomorfonucleares en sangre periférica del conejo inmunizado y se dejaron unirse durante 60 a 90 minutos a 37 °C en la estufa de incubación. Después de esto, se transfirió el sobrenadante que contiene linfocitos a un vial de centrifugación y se centrifugó a 800 x g durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en PBS. Se usaron el 50 % de las células en el sobrenadante para la etapa de adsorción; el 50 % de células restantes se sometieron directamente a tinción inmunofluorescente y separación de células simples.

Ejemplo 9

Agotamiento de linfocitos B específicos de KLH

Se incubaron cuatro mililitros de una solución que contenía hemocianina de lapa (KLH) con tampón de recubrimiento a una concentración de 2 |jg/ml en los pocillos de una placa multipocillo durante la noche a temperatura ambiente. Antes de la etapa de reducción, se extrajo el sobrenadante y se lavaron los pocillos dos veces con PBS. Después, se ajustaron las células sanguíneas a una densidad celular de 2 * 106 células/ml y se añadieron 3 ml a cada pocillo de una placa multipocillo. Después, se incubó la placa multipocillo durante 60 a 90 minutos a 37 °C. Se transfirió el sobrenadante a un vial de centrifugación y se lavaron los pocillos dos veces con PBS y se combinaron los sobrenadantes en el vial de centrifugación. Se sedimentaron las células por centrifugación a 800 * g durante 10 minutos y se resuspendió el sedimento en PBS.

Ejemplo 10

Enriquecimiento de linfocitos B específicos de antígeno

El antígeno respectivo se diluyó con tampón de recubrimiento hasta una concentración final de 2 jg/ml. Se añadieron 3 ml de esta solución al pocillo de una placa multipocillo de 6 pocillos y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Antes del uso, se retiró el sobrenadante y se lavaron los pocillos dos veces con PBS. Se ajustó la solución de linfocitos B hasta una concentración de 2 * 106 células/ml y se añadieron 3 ml a cada pocillo de una placa multipocillo de 6 pocillos. Se incubó la placa durante 60 a 90 minutos a 37 °C. Se extrajo el sobrenadante y se lavaron los pocillos de dos a cuatro veces con PBS. Para la recuperación de linfocitos B específicos del antígeno, se añadió 1 ml de una solución de tripsina/EDTA a los pocillos de la placa multipocillo y se incubó durante 10 a 15 minutos a 37 °C. Se detuvo la incubación mediante adición de medio y se transfirió el sobrenadante a un vial de centrifugación. Se lavaron los pocillos dos veces con PBS y se combinaron los sobrenadantes con los otros sobrenadantes. Se sedimentaron las células por centrifugación durante 10 minutos a 800 * g. Se resuspendió el sedimento en PBS.

Ejemplo 11

Cocultivo de linfocitos B y células EL-4 B5

a) Se realizó el cocultivo en placas multipocillo de 96 pocillos con fondo redondo. Se preparó una solución base que comprendía células EL-4 B5 (1,6 x 106 células/15,2 ml) y citocinas en medio EL-4 B5. Se añadieron 200 |jl de la solución base a cada pocillo de la placa multipocillo. A cada pocillo, se añadió un linfocito B simple por separación celular activada por fluorescencia. Después de la adición de los linfocitos B, se centrifugó la placa durante 5 minutos a 300 x g. La placa se incuba durante siete días a 37 °C.

b) Se cultivaron linfocitos B separados simples en placas de 96 pocillos con 210 jl/pocillo de medio EL-4 B5 con Pansorbin Cells (1:20000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemania), sobrenadante de timocitos de conejo al 5 % y células de timoma murino EL-4-B5 irradiadas con radiación gamma (2 x 104/pocillo) durante 7 días a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO<2>en la estufa de incubación. Se retiraron los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B para el cribado y se obtuvieron las células de inmediato para la clonación génica de la región variable o congelación a -80 °C en 100 j l de tampón RLT (Qiagen, Hilden, Alemania).

Ejemplo 12

Cultivo de linfocitos T

Se aislaron los linfocitos T del timo de ratones y hámsteres de 3-4 semanas de edad o de conejos de 4-5 semanas de edad, respectivamente. Se centrifugaron las células y se cultivaron o congelaron de inmediato en partes alícuotas de 3 x 107 células. Se sembraron los timocitos con una densidad celular mínima de 5 x 105 células/ml de medio EL-4 B5 en matraces de cultivo de 175 cm2 y se incubaron durante 48 horas a 37 °C.

Ejemplo 13

Cultivo de macrófagos

Se aislaron macrófagos de la cavidad peritoneal de ratones y hámsteres, respectivamente, de una edad de al menos tres meses. Se cultivaron macrófagos peritoneales de ratones y hámsteres, o leucocitos monomorfonucleares de sangre de conejos en medio EL-4 B5 a una densidad celular de al menos 1 * 105 células/ml en matraces de cultivo de 175 cm2 durante 1,5 horas a 37 °C. Después, se extrajo el medio y se extrajeron las células no fijadas de los macrófagos fijados por lavado con medio EL-4 B5 caliente, seguido de cultivo durante 48 horas en 35 ml de medio.

Ejemplo 14

Cocultivo de linfocitos T y macrófagos

Se cultivaron linfocitos T y macrófagos durante 48 horas en matraces separados. Antes de combinar ambas poblaciones celulares, se centrifugaron los linfocitos T durante 10 minutos a 800 x g. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 10 ml de medio. Se ajustaron los linfocitos T a una densidad celular mínima de 5 x 105 células/ml y se añadieron 10 pg de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) y 5 ng o 50 ng de fitohemaglutinina M (PHA-M) por ml de medio. Se retiró el medio de cultivo de los macrófagos y se añadió la suspensión de linfocitos T a los matraces que contenían macrófagos. Después de 36 horas de cocultivo, se retiró el medio de cultivo y se denominó solución TSN. Para la retirada de las células restantes se filtró la solución TSN a través de un filtro de 0,22 |jm. Se congeló la solución TSN a -80 °C en partes alícuotas de 4 ml.

Ejemplo 15

Tinción de inmunofluorescencia

Dependiendo del número de células que se van a teñir, se proporcionaron las células en 100 |jl de medio (menos de 106 células) o 200 j l de medio (más de 106 células), respectivamente. El anticuerpo marcado fluorescente se diluyó con suero al 5 % del animal de laboratorio y tampón FACS hasta un volumen final de 100 j l o 200 jl, respectivamente. Se incubó la mezcla de reacción en un soporte de rodillos durante 40 minutos a 4 °C a oscuras. Después de la incubación, se lavaron las células dos veces a 300 x g durante 5 minutos. El sedimento se resuspendió en 400 j l de PBS y se filtró a través de un tamiz de 70 jm . La solución filtrada se transfirió a un vial de FACS y, directamente antes del experimento de FACS, se tiñeron las células muertas por adición de yoduro de propidio (6,25 jg/ml). Si se marcó el anticuerpo marcado con biotina, el anticuerpo se detectó en una segunda etapa con Alexa Flour(R) 647 marcado con estreptavidina (anticuerpo 197).

Ejemplo 16

Cuantificación de IgG

La placa multipocillo de 96 pocillos en la que se realizó el cocultivo se centrifugó después de siete días de cocultivo a 300 x g durante 5 minutos. Se retiraron 150 j l de sobrenadante y se diluyeron en una proporción de 2:1 con PBS en una segunda placa multipocillo de 96 pocillos.

Se llevó a cabo el ELISA como se explica en el ejemplo 17.

Se usó el anticuerpo a una concentración de 50 ng/ml. Si la DO era igual o superior a 1 después de un tiempo de incubación de 5 minutos, se sometió a prueba una serie de dilución de 0,8 a 108 ng/ml de IgG.

Ejemplo 17

Detección de IgG específica de antígeno

Se pueden caracterizar anticuerpos producidos por linfocitos B depositados y cocultivados simples o de linfocitos B obtenidos de un animal de laboratorio inmunizado con respecto a la unión a antígeno específica. Se realizó el ELISA a temperatura ambiente y se incubó la solución de ELISA entre las etapas individuales en un agitador a 20 x g. En la primera etapa, el antígeno se unió a los pocillos de una placa multipocillo de 96 pocillos. Si el antígeno era una proteína, se había diluido en tampón de recubrimiento y se aplicó directamente a la placa. Se unieron antígenos peptídicos por medio del par de unión específica biotina/estreptavidina. Los pocillos de la placa multipocillo pueden estar ya recubiertos con CroteinC (CrC) soluble por el fabricante. Si no, se incubaron los pocillos después de la inmovilización del antígeno con 200 j l de tampón de bloqueo. Después de la incubación con 100 j l de solución de antígeno por pocillo (placa multipocillo prerrecubierta) o 200 j l de tampón de bloqueo, respectivamente, se retiró el antígeno no unido o el tampón de bloqueo lavando con tampón de lavado. Se añadieron sobrenadantes de linfocitos B diluidos en un volumen de 100 j l por pocillo y se incubaron. Después de la incubación, se lavaron los pocillos. Después, se añadió el anticuerpo de detección en un volumen de 100 j l por pocillo. El anticuerpo se puede conjugar con peroxidasa de rábano picante o bien marcarse con biotina. Se determinó el anticuerpo de detección con un conjugado estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. Después de la incubación, se lavó la placa multipocillo y, después, se añadieron 50 j l de una solución sustrato que contenía 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) por pocillo y se incubó durante un periodo como se da en la tabla X. Se detuvo la reacción enzimática mediante la adición de 50 j l de ácido sulfúrico y se determinó la densidad óptica a 450 nm y 680 nm con un fotómetro (Rainbow Thermo ELISA Reader) y el programa informático Xread plus.

Ejemplo 18

Aislamiento de ácido ribonucleico (ARN)

Las células de las que se tenía que aislar el ARN se sedimentaron en primer lugar por centrifugación. El sedimento celular se lisó por la adición de 100 |jl de tampón RLT con 10 |jl/ml de beta-mercaptoetanol. Se resuspendieron las células por mezclado múltiple con una pipeta. Se transfirió la solución a un pocillo de una placa multipocillo. Se agitó brevemente la placa a 200 x g y se congeló a -20 °C.

Se realizó el aislamiento del ARN con el kit RNeasy® (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 19

Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

Se llevó a cabo la transcripción inversa en un volumen de 20 jl. Para cada reacción, se realizó un control con y sin retrotranscriptasa. Por reacción, se premezclaron 1 |jl de dNTP (cada uno a 10 mM), 0,4 |jl de oligo(dT)i<2>-i<8>(0,2 jg ) y 0,6 j l de hexámero aleatorio (0,03 jg ) y se añadieron a 8,5 j l de ARN en H2O. Se incubó la mezcla de reacción durante 5 minutos a 65 °C y, después, se transfirió directamente a hielo. Después de esto, se premezclaron 2 j l de tampón RT (10x), 4 j l de MgCl2 (25 mM), 2 j l de DTT (0,1 M) y 1 j l de RNAse Out™ (40 unidades) y se añadieron a la mezcla de reacción helada. Después de un tiempo de incubación de 2 minutos a temperatura ambiente. se añadieron 0,5 j l de retrotranscriptasa Superscript™ II (25 unidades). Se incubó la mezcla de reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Se llevó a cabo la traducción durante 50 minutos a 42 °C. Después de la traducción, se inactivó la retrotranscriptasa por incubación durante 15 minutos a 70 °C. El ADNc se almacenó a -20 °C.

Ejemplo 20

Reacción en cadena de la polimerasa

Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa con el kit TaqPCR Core (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se llevó a cabo la PCR en un volumen de 20 jl. Se transfirieron las muestras al Mastercyler® a una temperatura de 95 ° C.

Ejemplo 21

Secuenciación

Se determinaron todas las secuencias por SequiServe (Vaterstetten, Alemania).

Ejemplo 22

Adsorción en antígeno

a) Recubrimiento de placas

Biotina/estreptavidina: Se incubaron placas de 6 pocillos (calidad de cultivo celular) recubiertas con estreptavidina estériles con antígeno biotinilado a una concentración de 0,5 a 2 jg/ml en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso.

Proteína unida covalentemente: Se recubrieron placas de 6 pocillos de cultivo celular con 2 jg/m l de proteína en tampón de carbonato (bicarbonato de sodio 0,1 M, hidrogenocarbonato de disodio 34 mM, pH 9,55) durante la noche a 4 °C. Se lavaron las placas en PBS estéril tres veces antes de su uso.

b) Adsorción de linfocitos B en péptidos

Se sembraron placas de cultivo tisular de 6 pocillos recubiertas con el antígeno respectivo con hasta 6 x 106 células por 4 ml de medio y se dejó que se unieran durante una hora a 37 °C en la estufa de incubación. Se retiraron las células no adherentes lavando cuidadosamente los pocillos 1-2 veces con 1x PBS. Se desprendieron las células adherentes restantes por tripsina durante 10 minutos a 37 °C en la estufa de incubación y, a continuación, se lavaron dos veces en medio. Se mantuvieron las células en hielo hasta la tinción con inmunofluorescencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de selección de un linfocito B que comprende las siguientes etapas:

a) marcar linfocitos B de una población de linfocitos B,

2. Un procedimiento de producción de un anticuerpo que se une a un antígeno diana que comprende las siguientes etapas

a) marcar linfocitos B de una población de linfocitos B con al menos un tinte fluorescente,

d) cocultivar cada linfocito B de una población de linfocitos B, que se ha depositado como célula simple en un recipiente individual, en presencia de las células alimentadoras y una mezcla alimentadora,

3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además la etapa de incubar la población de linfocitos B en el medio de cocultivo antes del depósito de células simples.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3,caracterizado porquela incubación es a aproximadamente 37 °C durante aproximadamente una hora.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4,caracterizado porquela centrifugación es durante de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 30 minutos.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5,caracterizado porquela centrifugación es a de aproximadamente 100 x g a aproximadamente 1000 x g.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6,caracterizado porquela centrifugación es durante aproximadamente 5 minutos, a aproximadamente 300 * g.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porquela población de linfocitos B se aísla mediante centrifugación por gradiente de densidad.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porquelos linfocitos B son linfocitos B maduros.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porqueel marcado es con dos o tres tintes fluorescentes.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores,caracterizado porquese marcan de un 0,1 % a un 2,5 % de las células de la población total de linfocitos B.

12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porquelos linfocitos B son linfocitos B de ratón, o linfocitos B de hámster o linfocitos B de conejo.

13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes,caracterizado porquelas células alimentadoras son células EL-4 B5 murinas.

14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 13,caracterizado porquelos linfocitos B son de origen de ratón y el marcado es de linfocitos B IgG+CD19+ y/o linfocitos B IgG-CD138+.

15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 13,caracterizado porquelos linfocitos B son de origen de hámster y el marcado es de linfocitos B IgG+IgM-.