ES2952394T3 - Antagonistas quiméricos del receptor IL-1 de tipo I - Google Patents

Antagonistas quiméricos del receptor IL-1 de tipo I Download PDF

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Abstract

En el presente documento se presentan dominios de citoquinas no naturales que pueden usarse, entre otras cosas, para modular la señalización celular en respuesta al receptor I de interleucina-1 (IL-1RI), para tratar trastornos y para detectar y/o unirse a receptores celulares, como así como otros agentes. Los dominios de citocinas ejemplares pueden contener residuos de aminoácidos de al menos dos dominios de citoquinas parentales, por ejemplo, características de unión al receptor, características de superficie, 2 hebras y bucles de al menos dos dominios de citoquinas parentales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Antagonistas quiméricos del receptor IL-1 de tipo I
Antecedentes
La interleucina-1 alfa (IL-1 a) y la interleucina-1 beta (IL-1p) son miembros prototípicos de una familia de citoquinas inmunorreguladoras y desempeñan diversas funciones destacadas en la regulación del sistema inmunitario. La IL-1a y la IL-1p se unen al receptor I de la interleucina-1 (RI de la IL-1), lo que provoca la participación del receptor secundario, la proteína accesoria del receptor de la interleucina-1 (IL-1RAcP). La señalización agonizada por IL-1a e IL-1p conduce a respuestas amplificadas de células T, que incluyen la proliferación y supervivencia de células T simples y el desarrollo de células TH17.
Dinarello et al. (Annu Rev Immunol. 2009;27:519-50) divulga las funciones inmunológicas e inflamatorias de la familia de la interleucina-1.
Wingren et al. (Cell Immunol. 1996 May 1;169(2):226-37) divulga que la fusión de una secuencia señal al gen de la interleucina-1 beta dirige la proteína de la acumulación citoplasmática a la liberación extracelular.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Las referencias a procedimientos de tratamiento en los párrafos siguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a las proteínas, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante cirugía o terapia (o para diagnóstico).
En un aspecto, la presente divulgación presenta una proteína aislada que incluye un dominio de citoquina que contiene residuos de aminoácidos de dos dominios de citoquina parentales como se define en las reivindicaciones. El dominio de citoquina se une a IL-1 RI e incluye características de unión al receptor de dos dominios de citoquina parentales diferentes IL-1 p e IL-1 Ra como se define en las reivindicaciones. En el contexto de la presente invención, el primer dominio de citoquina parental es IL-1 p, y el segundo dominio de citoquina parental es IL-1 Ra, tal como se define en las reivindicaciones. De acuerdo a como se divulga en el presente documento pero no se reivindica, el primer dominio de citoquina parental puede ser IL-1 a, y el segundo dominio de citoquina parental puede ser IL-1 Ra.
El dominio de citoquina de la proteína aislada reivindicada también puede incluir aminoácidos de un segundo dominio de citoquina parental en una o más posiciones del dominio que perjudican la interacción con un receptor secundario de citoquina (por ejemplo, IL-1RAcP).
El dominio de citoquina no reivindicado puede ser un dominio quimérico que tenga segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud y que sean al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% idénticos a los segmentos correspondientes de al menos dos dominios de citoquina parentales diferentes, tales como un primer y un segundo dominio de citoquina parental.
El dominio de citoquina no según la reivindicación incluye al menos dos segmentos de al menos 6, 10, 15, 20, o 25 aminoácidos de longitud que son al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, o 100% idénticos a segmentos correspondientes de un primer dominio de citoquina parental, y los aminoácidos que no están en dichos segmentos son predominantemente (por ejemplo, al menos 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, o 100%) idénticos a residuos correspondientes en el segundo dominio de citoquina parental.
El dominio de citoquina no según la reivindicación incluye (i) al menos dos segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud que son al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% idénticos a los segmentos correspondientes de un primer dominio de citoquina parental, y (ii) al menos uno, dos o tres segmentos, por ejemplo, de al menos 5, 6, 7, 8, 10 o 15 aminoácidos de longitud, que son idénticos a un segundo dominio de citoquina parental.
Por ejemplo, el dominio de citoquina no según la reivindicación puede incluir un primer segmento de 20-50, 25-50, 30-45, o 30-40 aminoácidos (por ejemplo, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40), y un segundo segmento de 20-45, 20-40, 25-40, o 25-35 aminoácidos (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 35), cada uno idéntico (o al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, o 98% idéntico) a un primer dominio de citoquina parental (por ejemplo, IL-1 Ra), y un tercer segmento que es idéntico (o al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, o 98% idéntico) a un segundo dominio de citoquina parental (por ejemplo, 1p o IL-1 a). Por ejemplo, el tercer segmento puede tener entre 55-90, 60-90, 60-85, o 70-85 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, u 85 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones: el primer segmento puede ser un segmento de al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% a WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9, también denominado segmento A1 en el presente documento, y correspondiente a los residuos 16-40 de SEQ ID NO:3 y a los residuos 11-36 según la numeración de 1p). El segundo segmento puede ser un segmento al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98, o 100% a los residuos 120­ 140 o 120-141 de SEQ ID NO:3 (IL-1 Ra), correspondiente a los residuos 121-139 o 121-140 (según la numeración de 1p). El tercer segmento puede ser al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% a los residuos 45-100 o 42-120 de 1P (SEQ ID NO:1).
En algunas realizaciones, el primer segmento puede ser un segmento al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98, o 100% a los residuos 14-45 de SEQ ID NO:3 (correspondiente a los residuos 9-41 de acuerdo con la numeración IL- 1p). El segundo segmento puede ser un segmento al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% a los residuos 120-145 de SEQ ID NO:3 (correspondientes a los residuos 121-145 de acuerdo con la numeración IL- 1p) o a los residuos 120­ 147 de SEQ ID NO:3 (correspondientes a los residuos 121-147 de acuerdo con la numeración IL-1 p). Según se define en las reivindicaciones anexas, al menos los residuos 11-41 y 120-147 (de acuerdo con la numeración de IL-1p) son colectivamente al menos 90, 92, 95, 98 o 100% idénticos a los residuos correspondientes en IL-1 Ra.
En algunas realizaciones, una terminación de uno de los segmentos del primer dominio de citoquina de la familia IL-1 se localiza dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 41 de la SEQ ID NO:1 y una terminación de uno de los segmentos del primer dominio de citoquina de la familia IL-1 se localiza dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 121 de la SEQ ID NO:1.
El dominio no según la reivindicación incluye un segmento que tiene un N-terminal en una posición dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 42 de SEQ ID NO:1 y un C-terminal dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 120 de SEQ ID NO:1, y/o un segmento que tiene un N-terminal en una posición dentro de cinco, cuatro, tres, dos, o un aminoácido del aminoácido 121 de SEQ ID NO:1 y un C-terminal dentro de cinco, cuatro, tres, dos, o un aminoácido del aminoácido 145 de SEQ ID NO:1.
Como se define en las reivindicaciones anexas, los residuos en el dominio en las posiciones correspondientes a 11­ 41 y 120-147 (de acuerdo con la numeración de IL-1 p) son colectivamente al menos 90, 92, 95, 98, o 100% idénticos a los residuos correspondientes en IL-1 Ra.
En algunas realizaciones, el dominio de citoquina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9); NLEEK (SEQ ID NQ:10); RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11); AMEADQP(SEQ ID NO:12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO:13); y/o secuencias al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98, o 100% idénticas a las anteriores. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: VQGEESNDKI (SEQ ID NO:14); KKKMEKRF (SEQ ID NO:15); y FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN YPKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO:16); y/o secuencias al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98, o 100% idénticas a las anteriores.
El dominio de citoquina no según lo reivindicado incluye secuencias que son al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% idénticas a una, dos, tres o todas las cadenas beta p2, p3, p10 y p11 de IL- 1Ra. El dominio de citoquina no según lo reivindicado incluye secuencias que son al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % idénticas a uno, dos, tres o todos los p4, p6, p7 y p8 de IL-1 p , oa p4, p5, p6, p7 y p8 de IL-1 p.
El dominio de citoquina no como se reivindica no contiene un segmento que sea mayor que 80, 85, 90, 95, o 100% idéntico a los aminoácidos I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46- I46-S110, V49-S110, o I46-G118 de SEQ ID NO:3. El dominio de citoquina no según la reivindicación no contiene un segmento que sea mayor del 80, 85, 90, 95 o 100% idéntico a los aminoácidos N7-V41, R11-M36, N102-D145 o Y121-D145 de SEQ ID NO:1.
Por lo general, el dominio citoquina no se produce de forma natural. Difiere de los dominios de la citoquina humana de la familia IL-1. Por ejemplo, es menos del 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60 o 55% idéntica a IL-1 Ra (SEQ ID NO:3) y/o IL-1 p (SEQ ID n O:1). El dominio de citoquina también puede ser al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% idéntico a dicha citoquina. Por ejemplo, el dominio quimérico puede ser entre 30-95%, 40-90% o 45-85% idéntico a IL-1Ra y/o IL-1 p. Por ejemplo, el dominio quimérico puede ser entre 40-90% idéntico a IL-1 p y 35-85% idéntico a IL-1Ra; entre 40-80% idénticos a IL-1 p y 45-80% idénticos a IL-1Ra; entre 45-72% idéntico a IL-1p y 45-80% idéntico a IL-1Ra; entre 45-72% idénticos a IL-1p y 53-80% idénticos a IL-1Ra; entre 50-72% idéntico a IL-1 p y 53-70% idéntico a IL-1Ra; entre 60-72% idénticos a IL-1p y 53-68% idénticos a IL-1Ra; entre 65-72% idéntico a IL-1 p y 54-60% idéntico a IL-1Ra; o entre 68-72% idénticos a IL-1 p y 54-57% idénticos a IL-1Ra. El dominio quimérico que no es el reivindicado puede ser entre un 40-90% idéntico a IL-1a y un 35-85% idéntico a IL-1Ra; entre 40-80% idénticos a IL-1a y 45-80% idénticos a IL-1Ra; entre 45-72% idéntico a IL-1a y 45-80% idéntico a IL-1Ra; entre 45-72% idénticos a IL-1a y 53-80% idénticos a IL-1Ra; entre 50-72% idénticos a IL-1 a y 53-70% idénticos a IL-1Ra; entre 60-72% idéntico a IL-1 a y 53-68% idéntico a IL-1Ra; entre 65-72% idénticos a iL-1 a y 54-60% idénticos a IL-1Ra; o entre 68-72% idénticos a IL-1 a y 54-57% idénticos a IL-1Ra.
El dominio de citoquina tal como se define en las reivindicaciones difiere de la IL-1 Ra, y se une al receptor mientras incluye un Sitio C y/o Sitio D característico de un antagonista de receptor natural (tal como la IL-1 Ra). Por ejemplo, el dominio es menos del 98, 95, 92, 90, 85 y 80 % idéntico a la IL-1p y/la IL-1Ra humana. Por ejemplo, el dominio es entre 40-95%, 40-90% o 45-85% idéntico a IL-1 Ra. El dominio también puede estar entre 40-95%, 40-90% o 4585% a IL-1p. El dominio de citoquina no según lo reivindicado incluye: al menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 o 85 % de aminoácidos de un primer dominio de citoquina parental que es un agonista de la señalización de citoquina. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones tiene una mayor identidad de aminoácidos (p. ej., al menos un 5, 10, 15 o un 20 % más) con un agonista del receptor (como IL-1p o IL-1 a) que con un antagonista del receptor (IL-1Ra), pero funciona como un antagonista de IL-1RI.
En algunas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones es completamente quimérico, por ejemplo, cada aminoácido en el dominio es de uno de los dominios de citoquina parentales como se define en las reivindicaciones, por ejemplo, uno de dos dominios de citoquina parentales o uno de tres o más dominios de citoquina parentales como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, los dominios de citoquinas parentales son dominios de citoquinas humanas o dominios de citoquinas de primates no humanos. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones es parcialmente quimérico, por ejemplo, no todos los aminoácidos del dominio proceden de uno de los dominios de citoquina parentales.
Como se define en las reivindicaciones, la proteína aislada se une a IL-1RI y antagoniza la actividad de señalización del receptor de IL-1RI. La proteína puede no inducir sustancialmente la producción de IL-6 cuando se pone en contacto con células humanas sensibles a IL-1 p y/o no induce sustancialmente la producción de un gen informador sensible a IL-1 p, p. ej., a concentraciones de 10 μg/ml, 100 μg/ml , o 1 mg/ml. Generalmente, la proteína inhibe la señalización por IL-1 p (p. ej., a una concentración de 0,1 ng/ml, como en un ensayo celular descrito en este documento) con una IC50 de menos de 100, 50, 20, 10 o 5 nM. La proteína puede inhibir la señalización por IL-1 p con una IC50 inferior a la de IL-1 Ra, por ejemplo, al menos un 10, 20 o 50% inferior.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina se une, por ejemplo, con la misma o mejor afinidad que uno de los dominios de citoquina parentales. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina se une a IL-1RI RI con Kd inferior a 100, 50, 20, 10, 5 o 1 nM, o inferior a 500, 400, 100 o 50 μM. Por ejemplo, la constante de asociación puede ser mayor que 1*104, 3*104, 1x105 o 1*106M 'V , y la disociación puede ser menor que 1*10'3, 1*10'4 , 6* 10'4 o 6* 10'5 s-1.
En algunas realizaciones, el dominio de citoquina se une a IL-1RI con una mejor afinidad (p. ej., menor Kd) y/o una tasa de disociación más lenta que IL-1p o IL-1Ra. Por ejemplo, el dominio de citoquinas puede unirse a IL-1RI con una constante de disociación menor o igual a la de IL-1Ra y/o con una constante de asociación mayor o igual a la de IL-1 p.
El dominio de citoquina no reivindicado puede tener una longitud entre aproximadamente 120-180 o 140-170 aminoácidos. En el contexto de la presente invención, la proteína definida en las reivindicaciones anexas comprende un dominio de citoquina quimérico de la familia de la interleucina-1 (IL-1) de 148-160 aminoácidos de longitud, tal como 150-156 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio tiene 152 o 153 aminoácidos de longitud. Normalmente, el dominio incluye al menos 10, 11 o 12 cadenas p y se pliega de forma estable. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina tiene una Tm de al menos 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64°C, como se describe en el presente documento. Puede tener un Tm de entre 51-61, 51-66, 56-61 o 56-66 ° C. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina no comienza a desplegarse hasta al menos 48, 50, 51, 55, 57, 58 o 59 °C. Por ejemplo, tiene un Tm que está al menos dentro de 10 ° C o 5 ° C de la Tm de IL-1Ra y/o IL-1 p en un tampón fisiológico. En algunas realizaciones, es más termoestable que la IL-1 Ra y/o la IL-1 p en un tampón fisiológico. Por ejemplo, el dominio puede tener una Tm que sea al menos 2, 4, 6, 7 u 8 °C mayor que la Tm de la IL-1 Ra y/o la IL-1p en un tampón fisiológico, por ejemplo, entre aproximadamente 5-12, 5-10 o 7-10 °C mayor que la Tm de la IL-1 Ra y/o la IL-1p a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
Los ejemplos de miembros de la familia de citoquinas IL-1 incluyen IL-1a, IL-1 p, IL-1Ra, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 y IL-33.
El dominio quimérico no según la reivindicación incluye al menos un segmento de longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70 aminoácidos y que tiene identidad de aminoácidos con (o al menos 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% de identidad con) a una primera citoquina de la familia IL-1, y otro segmento de longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos y que tiene identidad de aminoácidos con (o al menos 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con) una segunda citoquina de la familia IL-1. El dominio quimérico no según la reivindicación puede ser menos del 90, 85, 80 o 75% idéntico a una o ambas de la primera y segunda citoquina de la familia IL-1. La primera y segunda citoquinas de la familia IL-1 son IL-1 p e IL-1 Ra, tal como se definen en las reivindicaciones. La primera y segunda citoquinas de la familia IL-1 no reivindicadas se seleccionan del grupo formado por IL-1 IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7 e IL-1F8.
En una realización, el dominio quimérico como se define en las reivindicaciones es idéntico a la primera citoquina de la familia IL-1 en al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 posiciones y es idéntico a la segunda citoquina de la familia IL-1 en al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 posiciones (que incluyen posiciones que pueden ser individualmente idénticas a ambas citoquinas).
En una realización, el dominio quimérico incluye al menos dos, tres o cuatro segmentos discontinuos, cada uno de los cuales tiene una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15 o 20 aminoácidos y tiene identidad de aminoácidos con (o al menos 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad con) segmentos correspondientes de IL-1p humana e incluye aminoácidos predominantemente de IL-1 Ra humana como se define en las reivindicaciones en posiciones restantes. Tal como se define en las reivindicaciones, el dominio quimérico incluye 5, 6 o 7 segmentos, en los que los segmentos adyacentes proceden de diferentes dominios parentales de citoquinas de la familia IL-1, tal como se define en las reivindicaciones. El dominio quimérico no según la reivindicación incluye al menos uno, dos o tres de: (i) un segmento de al menos 50, 60, 65, 70, o 75 aminoácidos de longitud de IL-1 p, (ii) un segmento de al menos 15, 20, 25 aminoácidos de longitud de IL-1 Ra; y (iii) otro segmento de al menos 15, 20, 25 aminoácidos de longitud de IL- 1Ra.
Según se define en las reivindicaciones anexas, los segmentos discontinuos incluyen residuos (i) 1-6 y 45-61, (ii) 1-6 y 86-95, (iii) 45-61 y 86-95, (iv) 1-6 y 148-153, (v) 45-61 y 148-153, o (vi) 86-95 y 148-153, de acuerdo con la numeración de dichas posiciones en IL-1 p. Los tres segmentos discontinuos de IL-1 p como se definen en las reivindicaciones anexas incluyen, por ejemplo, los residuos 1-8, 42-120, y 141-153, los residuos 1-10, 37-125, y 131­ 153, o los residuos 1-6, 45-61, 86-95, y 148-153, de acuerdo con la numeración de tales posiciones en IL-1 p. En una realización, uno o más de los bordes de los segmentos discontinuos están situados en posiciones en las que la primera y la segunda citoquinas de la familia IL-1 son idénticas o están conservadas.
En algunas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye: (a) aminoácidos idénticos a IL-1 Ra en las siguientes posiciones ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130, y GLN141 (de acuerdo con la numeración de IL-1 p) y (b) aminoácidos idénticos a IL-1 p en las siguientes posiciones: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152.
En algunas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye secuencias que son al menos un 80% idénticas (colectivamente) a las cadenas beta p2, p3, p10 y p11 de IL-1Ra y secuencias que son al menos un 80% idénticas (colectivamente) a las cadenas beta p4, p6, p7 y p8 de IL-1 p. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye secuencias que son idénticas a las cadenas beta p2, p3, p10 y p11 de IL-1Ra y secuencias que son idénticas a las cadenas beta p4, p6, p7 y p8 de IL-1p.
El dominio de citoquinas como se define en las reivindicaciones difiere de IL-1Ra, por ejemplo, el dominio de citoquinas es menos del 99, 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60% idéntico a IL-1Ra, y /o al menos 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% idénticos a IL-1Ra, por ejemplo, entre 40-95%, 40-90% o 45-85% idénticos a IL-1Ra. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina no contiene un segmento que sea mayor que 80, 85, 90, 95, o 100% idéntico a los aminoácidos I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110, o I46-G118 de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina no contiene un segmento que sea mayor de 80, 85, 90, 95 o 100% idéntico a los aminoácidos N7-V41, R11-M37, N102-D144 o Y121-D144 de SEQ ID NO:1.
En algunas realizaciones, el inhibidor se une a la IL-1RI RI con una Kd inferior a 100, 50, 20, 10, 5 o 1 nM. En algunas realizaciones, el inhibidor se une a la IL-1 RI con una mejor afinidad (p. ej., menor Kd) y/o una velocidad de disociación más lenta que la IL-1p o la IL-1 Ra.
En algunas realizaciones, el inhibidor no induce sustancialmente la expresión de IL-6 cuando se pone en contacto con células humanas sensibles a IL-1 p. Generalmente, el inhibidor inhibe la señalización por IL-1 p, por ejemplo, con una IC50 inferior a 100, 50, 20, 10 o 5 nM.
En algunas realizaciones, el dominio de citoquina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO:9); NLEEK (SEQ ID NQ:10); RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11); AMEADQP(SEQ ID NO:12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO:13); y/o secuencias al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98, o 100% idénticas a las anteriores. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: VQGEESNDKI (SEQ ID NO:14); KKKMEKRF (SEQ ID NO:15); y FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN YPKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO:16); y/o secuencias al menos 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98, o 100% idénticas a las anteriores. El inhibidor puede incluir otras características descritas en el presente documento.
En una realización, la proteína aislada incluye una secuencia de aminoácidos al menos 80, 82, 85, 87, 88, 89% idéntica a la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04 o P05; en tales realizaciones, la secuencia de aminoácidos incluye al menos una sustitución, inserción o deleción; en tales realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede incluir menos de 15,12,8,7,6, 5, 4, 3, o 2 sustituciones no conservativas o menos de 15,12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 sustituciones totales; en tales realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede incluir al menos 2, 3, 4, o 5 sustituciones, e.g., sustituciones conservadoras.
En una realización son proteínas aisladas que incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 80, 82, 85, 87, 88, 89% idéntica a la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, o P05 y que incluyen una metionina N-terminal a la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, o P05; y proteínas aisladas que incluyen una secuencia de aminoácidos al menos 80, 82, 85, 87, 88, 89% idéntica a la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, o P05 en la que la alanina en el N-terminal está ausente. Las secuencias anteriores pueden incluir otras características descritas en el presente documento. Por ejemplo, la secuencia puede incluir además una etiqueta, tal como una secuencia de hexa-histidina, por ejemplo, N- o C-terminal en relación con la secuencia de unión a IL-1RI RI. La secuencia puede incluir además una fracción que modifique la estabilidad o farmacocinética de la secuencia de unión a IL-1RI. La secuencia puede incluir además una albúmina sérica y/o un dominio Fc, o uno o más dominios de los mismos, por ejemplo, uno o más dominios constantes de inmunoglobulina o uno o más dominios de albúmina. En aún otro aspecto, la invención proporciona una proteína aislada como se define en las reivindicaciones anexas que incluye un dominio que tiene una forma permutada circularmente de un dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones. La proteína puede incluir además una secuencia heteróloga (tal como un dominio Fc o albúmina) en el extremo N- o C-terminal de la forma permutada, opcionalmente espaciada por un enlazador.
La invención también presenta composiciones farmacéuticas tal como se definen en las reivindicaciones. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas oftálmicas, composiciones tópicas o composiciones para administración parenteral.
Se desvela pero no se reivindica un procedimiento de modulación de una respuesta inmunitaria o inflamatoria en un individuo; el procedimiento puede incluir la administración de una composición que incluye un agente de unión a receptores descrito en el presente documento a un individuo en una cantidad eficaz para modular la respuesta inmunitaria o inflamatoria en el individuo.
La invención proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones para su uso como medicamento, y para su uso en el tratamiento del cáncer.
También se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar un trastorno mediado por IL-1 en un individuo. El procedimiento incluye administrar al individuo una composición que incluye una proteína que puede unirse a IL-1RI, por ejemplo, un agente de unión a receptores descrito en el presente documento. Por ejemplo, el trastorno puede ser un trastorno autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide o artritis crónica juvenil, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondilitis anquilosante, síndrome de Behcet, una enfermedad inflamatoria intestinal, asma, vasculitis o psoriasis. El trastorno puede ser un trastorno asociado a la formación de agregados, por ejemplo, hiperuricemia, gota, diabetes (incluida la diabetes no insulinodependiente), enfermedad de Alzheimer, amiloidosis reactiva secundaria, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington o enfermedad de Parkinson. El trastorno también puede ser un trastorno CAPS (Síndromes Periódicos Asociados a CIAS1) u otro trastorno descrito en el presente documento.
La invención proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones que es una composición farmacéutica oftálmica. También se divulga, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar un trastorno ocular mediado por IL-1 en un sujeto. El procedimiento puede incluir la administración al individuo de una composición que incluye una proteína que puede unirse a IL-1RI, por ejemplo, un agente de unión al receptor descrito en el presente documento. Por ejemplo, la composición es una composición oftálmica que se administra tópicamente a un ojo del individuo o región circundante, por ejemplo cuando el trastorno es un trastorno de ojo seco; o cuando el individuo no presenta manifestaciones de enfermedad autoinmune sistémica; o cuando el individuo tiene síndrome de Sjogren; o cuando el individuo tiene enfermedad de injerto contra huésped (EICH); o cuando el trastorno es uveítis.
También se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para inhibir la actividad de IL-1. El procedimiento incluye poner en contacto un agente de unión a receptores que puede unirse a IL-1 RI con células que responden a IL-1 o con un individuo. Generalmente, la proteína se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir la actividad de la IL-1 asociada a las células o en el sujeto. La proteína puede ponerse en contacto con células de un sujeto ex vivo. En otro aspecto, la presente divulgación presenta un ácido nucleico aislado como se define en las reivindicaciones anexas
También se presenta una célula huésped recombinante como se define en las reivindicaciones anexas. Un agente de unión a receptores puede producirse mediante un procedimiento no reivindicado que incluye mantener la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del agente de unión a receptores y, opcionalmente, recuperar el agente de unión a receptores, por ejemplo, a partir de células o medios asociados con la célula huésped. Por ejemplo, el agente de unión al receptor puede purificarse a partir del lisado de las células. El agente de unión al receptor purificado puede formularse, por ejemplo, con uno o más de un excipiente, un estabilizador y un tampón. También se desvela, pero no se reivindica, un procedimiento para proporcionar un dominio proteico quimérico. El procedimiento incluye identificar al menos dos proteínas parentales que tienen un pliegue común (por ejemplo, una primera proteína parental y una segunda proteína parental), localizar al menos dos segmentos dentro de la primera proteína parental y construir un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos quimérica que incluye los dos segmentos de la primera proteína parental y residuos que son predominantemente de la segunda proteína parental en posiciones restantes. El dominio puede estar compuesto principalmente por láminas p, por hélices a o por una combinación de estos elementos. Por ejemplo, el dominio puede tener el pliegue de una citoquina. La primera y la segunda proteínas parentales pueden estar relacionadas por homología, por ejemplo, entre un 10-40% de identidad de aminoácidos. Los segmentos de la primera proteína se localizan dentro de un único dominio proteico plegado, y la secuencia de aminoácidos quimérica incluye una forma del dominio proteico plegado que no es idéntica al dominio correspondiente en la primera y segunda proteína parental. Las dos proteínas parentales tienen propiedades funcionales diferentes, y el dominio quimérico puede tener propiedades de una o de las dos proteínas parentales. El dominio quimérico tiene una interfaz de unión de la primera proteína parental y otra interfaz de unión de la segunda proteína parental.
En el presente documento se hace referencia a diversas regiones, segmentos y residuos de las citoquinas de la familia IL-1 en relación con los sitios A, B, C y D. La ubicación de dichos residuos, segmentos y regiones en la secuencia de IL-1p humana (SEQ ID NO:1) y las posiciones correspondientes se proporcionan a continuación y en la Fig. 1:
Sitio A. Los residuos del sitio A en IL-1p incluyen: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, SER21, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLU128, ASN129, y MET130, y residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citoquinas IL1 (denominados en el presente documento "residuos del sitio A"). En ciertos contextos, en particular en relación con la IL-1 p, se hace referencia a "residuos del sitio A extendidos" que incluyen residuos del sitio A así como GLN149, y PHE150, y residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citoquinas IL1. Además, es posible definir una "región del sitio A" como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento A i (correspondiente en IL-1p a 11-36 de SEQ ID NO:1) y un segmento A2 (correspondiente en IL-1p a 125-131 de SEQ ID NO:1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citoquinas IL1.
Sitio B. Los residuos del sitio B en IL-1 p incluyen: ALA1, PRO2, ARG4, GLN48, GLU51, ASN53, ILE56, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, y ASN108, y residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citoquinas IL1 (denominados en el presente documento "residuos del sitio B"). En ciertos contextos, particularmente en relación con la IL-1 p, se hace referencia a "residuos del sitio B extendidos" que incluyen residuos del sitio B así como PHE46 y SER152 que están fuera de la región del sitio B en la Fig. 4. Además, es posible definir una "región del sitio B" como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento B1 (correspondiente en IL-1 p a 1-5 de SEQ ID NO:1), un segmento B2 (correspondiente en IL-1 p a 48-56 de SEQ ID NO:1), y un segmento B3 (correspondiente en IL-1p a 92-98 de SEQ ID NO:1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citoquinas IL1.
Sitio C. Los residuos del sitio C en IL-1 p incluyen: ILE104, ILE106, ASN107, LYS109, GLU111, THR137, LYS138, GLY139, GLY140, GLN141, THR144, y ASP145 y residuos correspondientes de otros miembros de la familia de la citoquina IL1 (denominados en el presente documento "residuos del sitio C"). Además, es posible definir una "región del sitio C" como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento C1 (correspondiente en IL-1 p a 136-145 de SEQ ID NO:1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citoquinas IL1.
Sitio D. Los residuos del sitio D en IL-1 p incluyen: LEU6, THR9, LYS63, GLU64, LYS65 y ASN66 y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de la citoquina IL1 (denominados en el presente documento "residuos del sitio D"). Además, es posible definir una "región del sitio D" como se muestra en la Fig. 4, incluyendo, por ejemplo, un segmento D1 (correspondiente en IL-1p a 6-9 de SEQ ID NO:1), un segmento D2 (correspondiente en IL-1 p a 37-41 de SEQ ID nO:1), y un segmento D3 (correspondiente en IL-1p a 63-66 de SEQ iD NO:1), un segmento D4 (correspondiente en IL-1 p a 86-91 de SEQ ID NO:1), y un segmento D5 (correspondiente en IL-1 p a 150-153 de SEQ ID NO:1) y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citoquinas IL1.
La localización de los residuos y las regiones de los sitios A, B, C y D puede identificarse mejor alineando la citoquina en cuestión con las secuencias mostradas en la Fig. 4.
La secuencia de aminoácidos de la IL-1 p (humana) a la que se hace referencia en el presente documento es:
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLK EKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAE NMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID NO:1).
La secuencia de aminoácidos de la IL-1 a (humana) a la que se hace referencia en el presente documento es:
SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSSKDDA KITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIAT KQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA (SEQ ID NO:2).
La secuencia de aminoácidos de la IL-1 Ra (humana) a la que se hace referencia en el presente documento es: RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGK MCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEAD QPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED (SEQ ID NO:3). Los términos IL-1p, IL-1a e IL-1Ra, tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a las respectivas proteínas maduras.
Las hojas p a las que se hace referencia en el presente documento y que se muestran en la FIG. 4 se refieren a las secuencias siguientes:
Tabla 1
Figure imgf000008_0001
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se utilizan indistintamente en el presente documento) se realizan del siguiente modo. Las secuencias se alinean de acuerdo con las alineaciones proporcionadas en el presente documento o, en ausencia de una alineación apropiada, la alineación óptima determinada como la mejor puntuación utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch tal como se implementa en el algoritmo Needle del paquete EMBOSS utilizando una matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por hueco de 10, y una penalización por extensión de hueco de 1. Véase Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453; Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley, y herramientas disponibles en el Instituto Europeo de Bioinformática (Cambridge UK) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P et al., A., Trends in Genetics 16, (6) pp. 276--277 y disponible en línea en http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html y http://emboss.openbio.org/wiki/Appdoc:Needle. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o nucleótidos correspondientes. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición (en el presente documento, "identidad" de aminoácidos o ácidos nucleicos equivale a "homología" de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Para determinar la identidad colectiva de una secuencia de interés con un grupo de secuencias de referencia, se considera que una posición es idéntica si es idéntica al menos a un aminoácido en una posición correspondiente en cualquiera de las secuencias del grupo de referencia. Con respecto a las listas de segmentos, características o regiones, la identidad puede calcularse colectivamente para todos los miembros de dicha lista para obtener un porcentaje global de identidad.
En el presente documento, el término "correspondiente a" se utiliza para designar la posición de un residuo de aminoácido en un polipéptido de interés con respecto a un polipéptido de referencia. En las reivindicaciones anexas, los segmentos y residuos correspondientes son los indicados en la alineación de la Fig. 4.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "hibrida en condiciones de alta rigurosidad" describe las condiciones de hibridación y lavado. Encontrará orientaciones para llevar a cabo reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En dicha referencia se describen procedimientos acuosos y no acuosos, pudiendo utilizarse cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad incluyen la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65°C, o condiciones sustancialmente similares. Se proporcionan en el presente documento ácidos nucleicos aislados que contienen secuencias que hibridan en condiciones de alta rigurosidad con ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento y con los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento, p. ej., en el Ejemplo 1.
Las proteínas de origen natural a las que se hace referencia en el presente documento incluyen específicamente la forma humana de dicha proteína, así como formas de otras especies de mamíferos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico de la estructura de P04 determinada a partir de datos cristalográficos de rayos X. La columna vertebral de los residuos de IL-1Ra se muestra en negro y la columna vertebral de los residuos de IL-1p se muestra en gris.
La Fig. 2 representa tres vistas de un modelo de la proteína P05 unida al dominio extracelular de la IL-1RI humana. En P05, los residuos de IL-1 Ra aparecen en negro y los residuos de IL-1p en blanco
La Fig. 3 muestra modelos de proteínas quiméricas en las que los residuos de IL-1Ra se representan en negro y los residuos de IL-1 p se representan en blanco. El modelo representa las proteínas: P01 (Fic. 3A), P03 (FIG. 3B), P04 (FIG. 3C), P05 (Fig. 3D), P07 (Fig. 3E), y P06 (FIG. 3F).
La FIG. 4 proporciona una alineación de varias citoquinas humanas de la familia IL-1: IL-1 p (SEQ ID NO:1), IL-1a (SEQ ID NO:2), IL-1Ra (SEQ ID NO:3), IL-33 (SEQ ID NO:4), IL-36Ra (SEQ ID NO:5), IL-36a (SEQ ID NO:6), IL-36p (SEQ ID NO:7) e IL-36y (SEQ ID NO:8). Los segmentos a los que se hace referencia en el texto se identifican bajo la alineación. Además, se identifican las láminas p y los bucles entre dichas láminas.
La Fig. 5A es un listado de la secuencia de aminoácidos de P01 (SEQ ID NO:17). La Fig. 5B es un listado de la secuencia de aminoácidos de P02 (SEQ ID NO:18). La Fig. 5C es un listado de la secuencia de aminoácidos de P03 (SEQ ID NO:19). La Fig. 5D es un listado de la secuencia de aminoácidos de P04 (SEQ ID NO:20). La Fig. 5E es un listado de la secuencia de aminoácidos de P05 (SEQ ID NO:21). Los segmentos de IL-1 p se muestran en negrita y cursiva. Véase también el Ejemplo 1 a continuación.
La FIG. 6 es una imagen de un gel SDS-PAGE que muestra muestras ejemplares de proteínas purificadas a partir de células E. coli que expresan agentes de unión a receptores. Los marcadores de peso molecular de 15 y 20 kDa se indican a la izquierda. Los carriles son los siguientes: marcador de peso molecular (carriles 1 y 6), extracto (carriles 2 y 7), material purificado por cromatografía de intercambio catiónico (carriles 3 y 8), material purificado adicionalmente por cromatografía de intercambio aniónico (carriles 4 y 9), y muestras reducidas de dicho material (carriles 5 y 10). Los carriles 2-5 son de purificación P05, y los carriles 6-10 son de purificación P04. Véase también el Ejemplo 2.
La Fig. 7A es una tabla y un gráfico de barras adjunto que muestran la capacidad de las proteínas P06, P07 y P01 para agonizar la señalización en relación con la IL-1p y un control negativo, la proteína p-glucuronidasa (GUS). La Fig. 7B es un gráfico que representa el antagonismo de IL-1 p a varias concentraciones de IL-1 p por P01.
La Fig. 8A es un gráfico que representa el antagonismo de IL-1 p por P03 (marcado con hexa-histidina), P04 (marcado con hexahistidina), P05 (marcado con hexa-histidina) e IL-1Ra en presencia de 0,1 ng/ml de IL-1 p (humana). La Fig. 8B es un gráfico que representa el antagonismo de IL-1 p por lisados que contienen formas no etiquetadas de P01, P02, P03, P04 y P05, e IL-1 Ra en presencia de 0,1 ng/ml de IL-1 p (humana) y mediante el uso de estimaciones de la concentración de proteína en los respectivos lisados.
La FIG. 9 contiene gráficos de datos SPR que muestran la cinética de unión a IL-1RI soluble inmovilizada para las siguientes proteínas: IL-1 p( la FIG.9A), IL-1Ra ( la FIG. 9B), P04 (la FIG.9C), y P05 (la FIG.9D).
La Fig. 10A es un gráfico que representa la desnaturalización térmica de IL-1Ra, IL-1 p, P03, P04 y P05 como se describe en el Ejemplo 7. La Fig. 10B representa la primera derivada negativa del gráfico de la Fig. 10A.
La Fig. 11A es un gráfico de barras que muestra la puntuación media de tinción de la córnea ± SEM comprobada por medio de tinción con fluoresceína de la córnea por ojo de dos estudios independientes, en los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron ningún tratamiento (n = 18), 10 mg/ml de P05 (n = 19), o 1,25,25x PBS, el vehículo (n = 20). Los asteriscos indican la significación estadística de P05 en relación con el vehículo, como se indica a continuación: * (P < 0,05) y ** (P < 0,005).
La Fig. 11B es un gráfico de barras que representa datos de un experimento separado que muestra la puntuación media de tinción corneal ± SEM de la córnea por ojo, en los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron ningún tratamiento (n = 8), 1,25* PBS vehículo (n = 8), 10 mg/ml de albúmina sérica murina (MSA) (n = 8) o 10 mg/ml de P05 (n = 9). Los asteriscos indican la significación estadística de P05 en relación con la albúmina sérica murina, como se indica a continuación: * (P < 0,05) y *** (P < 0,0005).
La Fig . 11C es un gráfico de barras que incluye datos de ratones que fueron tratados con Restasis® (emulsión de ciclosporina al 0,05%) (n = 8) en el mismo experimento que la Fig. 11B. 11B. Los asteriscos indican la importancia estadística de P05 en relación con Restasis® de la siguiente manera: ** (P < 0,005) y *** (P < 0,0005).
La Fig. 12A representa la estructura cristalográfica de rayos X (negro) de P04 superpuesta a un modelo computarizado (gris) de su estructura. La FIG. 12B ilustra las interacciones entre K64 y E39 de P04; la FIG. 12C ilustra las interacciones entre los residuos C-terminales Q149 y S152 con K40 y R9 deP04.
Descripción detallada
La familia de citoquinas IL-1 incluye varios miembros, todos con un pliegue de trébol p común compuesto por seis cadenas p que forman un barril p rematado por otras seis cadenas p. Se conocen las estructuras primarias de las formas humanas y de otros mamíferos de estas citoquinas. En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de alineación estructural de varios miembros humanos de la familia IL-1.
Hemos descubierto, entre otras cosas , que el pliegue de la IL-1 es muy plástico. En particular, elementos de diferentes miembros pueden combinarse para proporcionar proteínas que agonizan o antagonizan la señalización de citoquinas. Ejemplos de estas proteínas incluyen dominios de citoquinas quiméricas que incluyen, por ejemplo, dos o más segmentos o residuos de superficie de una citoquina en el contexto de otra citoquina o de una secuencia consenso de citoquinas, para de este modo crear combinaciones no naturales de sitios de interacción de receptores de diferentes citoquinas de la familia IL-1.
Las citoquinas de la familia IL-1 p pueden incluir al menos dos sitios de interacción con receptores primarios, denominados sitio A y sitio B. Los sitios A y B intervienen en los contactos con el receptor primario de la citoquina (por ejemplo, IL-1 RI). En el caso de IL-1Ra e IL-1 p, por ejemplo, las dos proteínas difieren sustancialmente con respecto a los sitios A y B, de forma que IL-1Ra hace menos contactos con el receptor en el Sitio B que en el Sitio A. Hemos encontrado que es posible construir dominios quiméricos funcionales de citoquinas que incluyan un Sitio A derivado de una citoquina y un Sitio B derivado de otra citoquina. La plasticidad del pliegue de la IL-1 ppermite la construcción de una variedad de dominios de citoquinas quiméricas para antagonizar la señalización de la IL-1. Además, las citoquinas de la familia IL-1 p pueden incluir dos sitios de interacción con receptores secundarios, denominados Sitio C y Sitio D, que intervienen en el agonismo y/o antagonismo, y pueden ser determinantes de la capacidad de una citoquina para interactuar con su receptor secundario de citoquinas (por ejemplo, IL- 1RAcP). La inclusión de residuos del sitio C y/o del sitio D de antagonistas de receptores naturales (tal como IL- 1Ra) puede conferir propiedades antagonistas. Se pueden construir dominios de citoquinas quiméricos que incluyan uno o ambos sitios A y B de uno o más agonistas de IL-1 (tales como IL-1 p e IL-1 a) y/o un antagonista del receptor de IL-1 (tal como IL-1Ra ) y uno o ambos Sitios C y D de un antagonista del receptor de IL-1 (tal como IL-1Ra). En consecuencia, es posible producir un dominio de citoquina quimérico que antagonice la señalización y que incluya residuos del sitio B de un agonista de IL-1.
En la Tabla 2 también se ofrecen combinaciones ejemplares:
Tabla 2
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Un dominio de citoquina quimérico como se define en las reivindicaciones adjuntas puede tener la capacidad de unirse a un receptor de la familia IL-1, por ejemplo, IL-1RI humana con una Kd de menos de 1°'8, 1°'9 o 1°'10, por ejemplo, una Kd dentro de 1° o 10° veces la de un ligando de receptor natural (p. ej., IL-1 p, IL-1a o IL-1Ra) en las mismas condiciones o menos que la de un ligando natural (p. ej., IL-1 p, IL- 1a o IL-1Ra) en las mismas condiciones. Además, en ciertas realizaciones, el dominio de citoquina quimérico se une con un Kd menor que, un Kon más rápido que, o un Koff más lento que al menos uno de sus dominios de citoquina parentales.
Los dominios quiméricos de citoquinas como se define en las reivindicaciones adjuntas que se unen al receptor de la familia IL-1 y que antagonizan la señalización del receptor pueden utilizarse como agentes de unión al receptor, por ejemplo, para tratar trastornos mediados por la señalización de citoquinas de la familia IL-1 como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, la proteína aislada según se define en las reivindicaciones adjuntas tiene un IC50 inferior a 10°, 1°, 1,0,6 o 0,3 nM según se define en las reivindicaciones adjuntas.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina puede ser al menos 4°, 45 o 50% idéntico, pero menos que completamente idéntico, por ejemplo, menos de 95, 9°, 85 u 80% idéntico a IL-1p humana. Al mismo tiempo, el dominio de citoquina también puede ser al menos 40, 45 o 50% idéntico, pero menos que completamente idéntico, por ejemplo, menos de 95, 90, 85 u 80% idéntico a un IL-1Ra humano.
En algunas realizaciones, al menos 80, 85, 90, 92, 94, 95, 97, 98, 99, o 100% de las posiciones dentro del dominio de citoquina tienen la propiedad de que, en cada una de dichas posiciones, el aminoácido presente es o bien idéntico al primer dominio de citoquina de la familia IL-1 en la que la primera citoquina de la familia IL-1 es IL-1 p, o al segundo dominio de citoquina de la familia IL-1 en la que la segunda citoquina de la familia IL-1 es IL-1Ra, (o a ambos si la primera y la segunda citoquina de la familia IL-1 son idénticas en la posición concreta). Cuando el 100% de las posiciones de aminoácidos en el dominio de la citoquina tienen esta propiedad, el dominio es una quimera completa de dos citoquinas. Los dominios de citoquinas quiméricas según se definen en las reivindicaciones anexas también pueden estar hechos de más de dos citoquinas y también pueden tener mutaciones en relación con sus citoquinas parentales (por ejemplo, una o más posiciones particulares en las que el aminoácido presente difiere del aminoácido correspondiente en cada una de sus citoquinas parentales).
Diversos residuos de la IL-1p están en contacto o en proximidad con la IL-1RI, por ejemplo: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, ALA127, GLU128, ASN129, MET130, GLN141, GLN149, PHE150 y SER152. Además de la designación en sitios descrita anteriormente, estos residuos pueden clasificarse en dos conjuntos: Conjunto 1 y Conjunto 2.
Los residuos ejemplares del Conjunto 1 en IL-1p incluyen: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130, y GLN141 y los residuos correspondientes en otros miembros de la familia de la citoquina IL-1. Los residuos del Conjunto Ampliado 1 incluyen los residuos del conjunto de interacción 1 y los residuos situados a menos de 4 Angstroms de los anteriores en la estructura 11TB. Los residuos ejemplares del Conjunto 2 en IL-1 p incluyen: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150, y SER152 y residuos correspondientes en otros miembros de la familia de la citoquina IL-1. Los residuos del Conjunto Ampliado 2 incluyen los residuos del conjunto de interacción 2 y los residuos situados a menos de 4 Angstroms de los anteriores en la estructura 11TB. En ciertas realizaciones, un dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones anexas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 del Conjunto 1 de residuos identificado anteriormente. En ciertas realizaciones, un dominio de citoquina incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 del Conjunto 2 de residuos identificado anteriormente. En algunas realizaciones, un dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones anexas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Conjunto 1 extendido. En algunas realizaciones, un dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones anexas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Conjunto 2 extendido.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 1-8 de SEQ ID NO:1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a IL-1 p en posiciones correspondientes a 3, 4, o todos los 5 de: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4 y LEU6.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 45-61 de SEQ ID NO:1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de: PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56 y PRO57.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos 5, 6, 7, 8, 9, o 10 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 86-95 de SEQ ID NO:1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a los de la IL-1 p en posiciones correspondientes a una, dos o las tres LYS92, LYS93 y LYS94. En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos 3, 4, 5 o 6 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 148-153 de SEQ ID NO:1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a los de la IL-1 p en posiciones correspondientes a una, dos o las tres GLN149, PHE150 y SER152.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina no incluye una treonina en la posición correspondiente a THR147 en IL-1 p. Por ejemplo, esta posición puede ser un aromático, tal como una tirosina. El aromático en la posición correspondiente a THR147 en IL-1 p puede empaquetarse contra otro aromático (por ejemplo, triptófano) presente en varias realizaciones en la posición 11 (de acuerdo con la numeración de IL-1p).
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina no incluye un aromático en la posición correspondiente a CYS8 en IL-1 p. Por ejemplo, esta posición puede ser un aminoácido distinto de la fenilalanina, o distinto de un aromático. Por ejemplo, puede ser cisteína, valina, serina, treonina o alanina. Esta posición se encuentra cerca de otros residuos voluminosos, en particular MET44 y MET148 (de acuerdo con la numeración de IL-1 p). Preferiblemente, no las tres posiciones 8, 43 y 148 son residuos voluminosos.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos cinco, seis o siete residuos idénticos a IL-1Ra en las posiciones correspondientes a 30-36 de SEQ ID NO:1, por ejemplo, al menos cinco, seis o siete residuos idénticos a YLQGPNV (SEQ ID NO:43). Por ejemplo, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, o 26 residuos idénticos a IL-1Ra en posiciones correspondientes a 11-36 de SEQ ID NO:1. El dominio de citoquina también puede incluir un residuo básico en la posición correspondiente a 145 de SEQ ID NO:1.
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina incluye: (a) ácido glutámico en la posición correspondiente a Val40 de IL-1p y lisina en la posición correspondiente a Lys65 de IL-1p; (b) arginina en la posición correspondiente a Thr9 de IL-1 p y glutamina en la posición correspondiente a Gln149 de IL-1 p; y/o (c) lisina en la posición correspondiente a V41 de IL-1p y serina en la posición correspondiente a Ser152 de IL-1p.
El dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones también puede incluir al menos cuatro, cinco, seis o siete residuos idénticos a IL-1Ra en las posiciones correspondientes a 126-132, por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis o siete residuos idénticos a MEADQPVS (SEQ ID NO:44).
En ciertas realizaciones, el dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones incluye al menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 22, 23 o 24 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 62-85 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el dominio de citoquina incluye una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos (por ejemplo, las cuatro): RSLAFR (SEQ ID NO:45), IDVSFV (SEQ ID NO:46), KKMDKR (SEQ ID NO:47), y KFYMQF (s EQ ID NO:48); una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro) RSLAFR (SEQ ID NO:45), IDv SfV (SEQ ID NO:46), NKLSFE (SEQ ID NO:49), y KFYMQF (SEQ ID NO:48); una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro siguientes) RSLAFR (SEQ ID NO:45), EEKFSM (SEQ ID NO:50), RFVFIR (SEQ ID NO:51), y VTKFTM (SEQ ID NO:52); una o más de las siguientes (por ejemplo, una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro) RSLAFR (SEQ ID NO:45), EEKFSM (SEQ ID NO:50), FESAAC (SEQ ID NO:53) y VTKFTM (SEQ ID NO:54); o una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro) LNCRIW (SEQ ID NO:55), EEKFSM (SEQ ID NO:50), PNWFLC (SEQ ID NO:56) y KFYMQF (SEQ ID NO:48).
Ejemplos específicos de dominios de citoquinas quiméricas que se basan en IL-1 p e IL-Ra se proporcionan en el Ejemplo 1 a continuación e incluyen los siguientes dominios de citoquinas ejemplares que antagonizan la señalización de IL-1:
P01. El dominio P01 incluye tres segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Val48, Ile60-Val83 y Asp95-Tyr147 de SEQ ID NO:3, y los cuatro segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio P01 tiene 74 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente 48 % de identidad) y 119 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente 77 % de identidad). Estos porcentajes suman más del 100 % porque una cantidad de aminoácidos en P01 y otras proteínas ejemplares descritas en el presente documento son aminoácidos que se conservan entre IL-1p e IL-1Ra y, en consecuencia, contribuyen al porcentaje de identidad tanto para IL-1p como para IL-1Ra.
P02. El dominio P02 incluye tres segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Val48, Ile60-Val83 y Ser110-Tyr147 de SEQ ID NO:3, y los cuatro segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio P02 tiene 85 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente 55 % de identidad) y 108 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente 70 % de identidad).
P03. El dominio P03 incluye dos segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Lys45 y Phe100-Lys145 de SEQ ID NO:3, y los tres segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio P03 tiene 94 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente 61 % de identidad) y 91 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente 64 % de identidad).
P04. El dominio P04 incluye dos segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Lys45 y Ala114-Lys145 de SEQ ID NO:3, y los tres segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio P04 tiene 104 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente 68 % de identidad) y 89 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente 58 % de identidad).
P05. El dominio P05 incluye dos segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Arg14-Lys45 y Phe120-Tyr147 de SEQ ID NO:3, y los tres segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio P05 tiene 108 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente 70 % de identidad) y 85 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente 55 % de identidad).
Otras proteínas quiméricas pueden construirse de forma similar. Por ejemplo, se pueden producir proteínas quiméricas entre IL-1 a e IL-1Ra, por ejemplo, dominios específicos que incluyen los segmentos identificados de IL-1Ra en combinación con los residuos correspondientes de IL-1 a en lugar de IL-1 p para cada uno de los ejemplos anteriores. pero eso no se reivindica.
Modificaciones y sustituciones de proteínas
Las secuencias de proteínas, tales como las descritas en el presente documento, se pueden variar, por ejemplo, al llevar a cabo una o más sustituciones conservativas. Se pueden realizar sustituciones conservadoras para mantener la función o introducir cambios modestos en ella. En la tabla siguiente se describen ejemplos de sustituciones conservadoras:
Tabla 3
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Las sustituciones pueden elegirse en función de su efecto potencial sobre (a) la estructura de la espina dorsal en las proximidades de la sustitución, por ejemplo, una conformación en lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el lugar objetivo, o (c) el volumen y ramificación de la cadena lateral. Los residuos de aminoácidos pueden clasificarse en función de las propiedades de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;(2) hidrófilos neutros: cis, ser, tr; asn; gin; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lis, arg; (5) residuos que afectan a la conformación de la columna vertebral: gli, pro; y (6) aromáticos: trp, tir, fe.
Las sustituciones no conservadoras pueden incluir la sustitución de un miembro de una de estas clases por un miembro de una clase diferente. Las sustituciones conservadoras pueden incluir la sustitución de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase.
La importancia de un residuo concreto también puede evaluarse en el contexto del índice hidropático del aminoácido. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en función de sus características de hidrofobicidad y carga: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1.8); glicina (- -0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (- -4,5). Para un análisis del índice de aminoácidos hidropáticos y su importancia, véase, por ejemplo, Kyte etal., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131.
La secuencia de una proteína puede modificarse por cualquier procedimiento, incluida la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), (Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487, 1987), mutagénesis en casete (Wells et al., Gene, 34:315, 1985), mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. Londres, 317:415, 1986), y mutagénesis por PCR. Véase también Protocolos de mutagénesis in vitro: Tercera edición, Braman (ed.), Humana Press, (2010) ISBN: 1607616513 y Protocolos de clonación PCR: From Molecular Cloning to Genetic Engineering, Chen y Janes (ed.), Humana Press, (2002) ISBN: 0896039730.
El análisis de aminoácidos por barrido puede emplearse para evaluar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. El procedimiento puede implicar la mutación de cada o casi cada aminoácido de una región a un aminoácido particular, por ejemplo, a un aminoácido neutro relativamente pequeño como alanina, serina o valina. Normalmente se elige la alanina porque elimina la cadena lateral más allá del beta-carbono y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244.): 1081-1085, 1989). También es el aminoácido más común y se encuentra con frecuencia tanto en posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1, 1976). El proceso de escaneado también puede adaptarse para realizar cambios más marcados, por ejemplo, los residuos cargados pueden cambiarse por residuos de carga opuesta, los residuos con cadenas laterales cortas pueden sustituirse por otros con cadenas laterales gruesas. Por ejemplo, la exploración de arginina es un enfoque que puede utilizarse en lugar o además de la exploración de alanina. El escaneo puede aplicarse a cada residuo de una región o a residuos de una propiedad particular, por ejemplo, residuos en o cerca de la superficie de una proteína o que es probable que estén en o cerca de la superficie de la proteína.
La estructura de una proteína, uno de sus dominios o un complejo en el que participe la proteína puede modelarse, por ejemplo, al llevar a cabo un modelado basado en la homología, la minimización de la energía y/u otro modelado mediante el uso de estructuras resueltas conocidas. Estos procedimientos incluyen: Accelrys Software Inc., Discovery Studio®, Release 3.0 , San Diego: Accelrys Software Inc., 2010, AMBER™ modeling software (Case et al. (2005) J. Computat. Química. 26, 1668-1688 y Case et al. (2010), AMBER 11, Universidad de California, San Francisco, CA EE.UU.) y el software de modelado CHARMM™ (Molecular Simulations Inc.). Véase también, en general, Baker y Sali, Science 294(5540):93-6, 2001). La estructura también puede determinarse directamente, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y/o espectroscopia de RMN.
Las estructuras PDB ejemplares que describen la estructura de las citoquinas de la familia IL-1 incluyen: 1I1B, 1ILR, 1IRA, 1ITB, 2I1B, 2ILA, 2KLL, 4I1B, 5I1B, 6I1B, 7I1B, 8I1B, 9ILB y 1MD6 (disponible en http desde www.pdb.org desde RCSB-Rutgers, Piscataway NJ, EE. UU., y desde la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE. UU.)). Por ejemplo, se han resuelto las estructuras de la IL-1p sola y en complejo con el receptor IL-1 RI. Véase, por ejemplo, Finzel et al. (1989) J. Mol. Biol. 209: 779-791, PDB 1ITB, y Vigers et al. (1997) Nature 386: 190-194. También se ha resuelto la estructura de IL-1Ra con IL-1RI. Véase, por ejemplo, PDB 1IRA y Schreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200.
El modelado de la homología puede ser asistido por la alineación de secuencias, por ejemplo, mediante el uso de programas informáticos tales como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), pSi-BlAsT, PHI-BLAST, WU- WU-BLAST-2, y/o MEGABLAST Véase Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266, 460-480; y Karlin et al., 1993, PNAS USA 90, 5873- 5787. Otros algoritmos para alinear macromoléculas (secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos) son FASTA (Pearson, 1995, Protein Science 4, 1145-1160), ClustalW (Higgin et al., 1996, Methods Enzymol. 266, 383-402), DbClustal (Thompson et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28, 2910-2926), y el Molecular Operating Environment (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec Canada H3A 2R7). Además, se puede utilizar el algoritmo de Myers y Miller (Myers & Miller, CABIOS 4, 11-17, 1988) que está incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) del paquete de software de alineación de secuencias GCG.
Se puede obtener una secuencia de consenso para la IL-1p y la IL-1 Ra al comparar las dos secuencias e identificar los residuos que son idénticos o que están muy conservados. Un ejemplo de secuencias consensuadas es: DXXQKX{8-9}L-AXXLQGX{18-28}LGX{7>LSCVXXXDXXXLQLEXVX{8-9}KXXKRFXFX{10}FESAXXPXWXXXTXXXXXXPVXLX{5-6}GXXXTXFXXQ (SEQ ID NO:57), en la que X es independientemente cualquier aminoácido y el número o intervalo en subíndice es el número de ocurrencias. Otras secuencias de consenso pueden identificarse de forma similar.
Pueden fabricarse y evaluarse otras variantes de un miembro de la familia de citoquinas IL-1 mediante el uso de un sistema basado en la visualización u otro cribado basado en bibliotecas. Por ejemplo, las variantes proteicas pueden visualizarse o expresarse y evaluarse para determinar su capacidad de unirse a un receptor del miembro de la familia de la citoquina IL-1. Por ejemplo, las variantes de IL-1 p, IL-1Ra o un dominio de citoquina descrito en el presente documento pueden evaluarse en cuanto a su capacidad para unirse al dominio extracelular soluble de IL-1RI. Una descripción general de los sistemas basados en la visualización incluye lo siguiente: para la visualización de células, Chao et al. Nat Protoc. 2006;1 (2):755-68; Colby et al. Methods Enzymol. 2004;388:348-58; Boder et al., Methods Enzymol. 2000;328:430-44), para la visualización de fagos (por ejemplo, Viti et al., Methods Enzymol.
2000;326:480- 505 y Smith (1985) Science 228:1315-1317), y para la visualización de ribosomas (por ejemplo, Mattheakis etal. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; and Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-3.
Las citoquinas IL-1, por ejemplo, de otras especies, son conocidas y están disponibles y pueden encontrarse en bases de datos públicas tales como Entrez (la Biblioteca Nacional de Medicina, Bethesda Md ) y EBI-EMBL (Hinxton, Cambridge UK). Ejemplos de este tipo de secuencias de la base de datos UNIPROT (disponible en UniProt.org y véase The UniProt Consortium, Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)), incluyen las siguientes:
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Los dominios de citoquina definidos en las reivindicaciones también pueden incluir sustituciones presentes en variantes de dominios de citoquina capaces de unirse a IL-1RI. Por ejemplo, la posición 15 de SEQ ID NO:1 (correspondiente a la posición 20 de SEQ ID NO:3) puede ser Met o Asn. La posición 30 de SEQ ID NO:1 (correspondiente a la posición 34 de SEQ ID NO:3) puede ser Gly, His, Trp o Met.
Otras variantes ejemplares de IL-1 p e IL-1 Ra incluyen las descritas en Boraschi et al. (1996) Fronteras de la biociencia: A Journal and Virtual Library 1, d270-308, Evans et al., J. Biol. Chem., 270:11477 (1995) and Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995). Por ejemplo, las variantes de IL-1p incluyen R11G, R11A, Q15H, E105G y T147G. Véase, por ejemplo, Evans et al. Las variantes de IL-1 Ra incluyen W16Y, Q20M, Q20N, Y34G, Y34H, Y34W, Y34M, Y147G, Y147H, Y147M, K145D, H54P, V18S, T108K, C116F, C122S, C122A, Y147G, H54P, H54I, y otras en Evans et al. y Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995). Un dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones puede incluir un residuo idéntico a IL-1 Ra en una de las posiciones anteriores. Un dominio de citoquina como se define en las reivindicaciones también puede incluir un residuo que difiera de una de las mutaciones anteriores en una posición correspondiente.
Además, las citoquinas de la familia IL-1p pueden incluir uno o más residuos de cisteína no apareados. Uno o más, por ejemplo, dos, tres o todos estos residuos de cisteína no apareados pueden mutarse a otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no cargado como la alanina o la serina. Por ejemplo, P01 incluye cisteínas en las posiciones 67, 70, 116 y 122 de SEQ ID NO:17. Una, dos, tres o las cuatro cisteínas pueden sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no cargado como la alanina o la serina. P02 incluye cisteínas en las posiciones 67, 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: Una, dos, tres o las cuatro cisteínas pueden sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no cargado como la alanina o la serina. P03 incluye cisteínas en las posiciones 70, 116 y 122 de SEQ ID NO:19. Una, dos o las tres cisteínas pueden sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no cargado como la alanina o la serina. P04 incluye cisteínas en las posiciones 70, 116 y 122 de SEQ ID NO:20. Una, dos o las tres cisteínas pueden sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no cargado como la alanina o la serina. P05 incluye cisteínas en las posiciones 8, 70 y 122 de SEQ ID NO:21. Una, dos o las tres cisteínas pueden sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido no cargado como la alanina o la serina.
Un dominio de citoquina de la familia IL-1, incluidos los dominios de citoquina quiméricos descritos en el presente documento, también puede permutarse cíclicamente. Por ejemplo, un segmento C-terminal del dominio puede reposicionarse de modo que sea N-terminal al N-terminal original y a un segmento N-terminal (que generalmente comprende el resto de la proteína original tras la escisión del segmento C-terminal). Los dos segmentos reposicionados pueden estar separados por un enlazador (por ejemplo, de entre aproximadamente tres y diez aminoácidos). Por lo general, se conservan todos los aminoácidos del dominio antes de la permutación, salvo el cambio de orden. El punto de corte para la permutación puede estar en una región flexible, por ejemplo, un bucle flexible como el bucle p6-p7 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 71-80 de la SEQ ID NO:3) o el bucle p7-p8 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 84-99 de la SEQ ID NO:3).
En algunas realizaciones, la proteína aislada definida por las reivindicaciones tiene un peso molecular inferior a 30, 25, 22, 20, 19, 18 o aproximadamente 17 kDa. En algunas realizaciones, el agente de unión al receptor tiene un peso molecular superior a 18, 19, 20, 22, 25, 30, 40, 45 o 50 kDa. Por ejemplo, la proteína aislada definida por las reivindicaciones puede incluir otros componentes polipeptídicos, poliméricos o no poliméricos, por ejemplo, componentes que modifican la farmacocinética, la estabilidad, la inmunogenicidad y/o el peso molecular de los agentes. La proteína definida por las reivindicaciones puede incluir otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones postraduccionales o sintéticas. En ciertas realizaciones, la proteína aislada definida por las reivindicaciones no está glicosilada. En otras realizaciones, la proteína aislada definida por las reivindicaciones incluye al menos una glicosilación.
Por ejemplo, la proteína aislada definida por las reivindicaciones puede incluir dominios y características adicionales. Por ejemplo, la proteína aislada definida por las reivindicaciones puede fusionarse, directa o indirectamente, a un dominio de una proteína de anticuerpo, por ejemplo, a un dominio Fc o a uno o más dominios constantes (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3). Por ejemplo, los dominios pueden ser dominios humanos o variantes de dominios humanos. El dominio Fc o el uno o más dominios constantes pueden estar situados N-terminal o C-terminal al agente de unión al receptor.
Los dominios Fc pueden obtenerse de cualquier inmunoglobulina adecuada, por ejemplo, de un anticuerpo humano, tal como un anticuerpo de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. En un ejemplo, el dominio Fc incluye una secuencia desde un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición Cys226, o desde aproximadamente la posición Pro230, hasta el extremo carboxilo del dominio Fc. Un dominio Fc generalmente incluye dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente incluye un dominio CH4. Los anticuerpos con sustituciones en una región Fc de los mismos y vidas medias séricas aumentadas también se describen en WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Química. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Química. 2796213-6216 (2004)). La numeración de los residuos en una cadena pesada de IgG es la del índice UE como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) con referencia a la numeración del anticuerpo IgG1 EU humano en el mismo.
En una realización, la proteína aislada definida por las reivindicaciones incluye un epítopo de unión a receptor de salvamento que aumenta la semivida sérica in vivo, como se describe, por ejemplo, en la patente US 5.739.277 y Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000)). En algunas realizaciones, el epítopo está incluido en una región Fc que está fusionada al agente de unión al receptor.
En una realización, la proteína aislada definida por las reivindicaciones incluye una secuencia de albúmina sérica, o una porción de dicha secuencia que se une al receptor FcRn, o una secuencia que se une a albúmina sérica, por ejemplo, albúmina sérica humana. Por ejemplo, ciertos péptidos que se unen a la albúmina sérica pueden asociarse con el agente de unión al receptor, por ejemplo, la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:22). Véase también, Dennis et al. J. Biol. Química. 277:35035-35043 (2002).
La proteína aislada definida en las reivindicaciones puede modificarse para incluir una secuencia que aumente el tamaño y la estabilidad del agente, por ejemplo, una secuencia descrita en WO2008/155134 o WO2009/023270. Tales secuencias pueden ser generalmente biológicamente inactivas, por ejemplo, no modulan la señalización mediada por miembros de la familia de citoquinas IL-1. Pueden utilizarse diversas secuencias polipeptídicas estabilizadoras, por ejemplo, secuencias ricas en glicina y/o serina, así como otros aminoácidos como glutamato, aspartato, alanina o prolina. Por ejemplo, las secuencias pueden diseñarse para tener al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de residuos de glicina y/o serina. En algunas realizaciones, la longitud combinada de las secuencias polipeptídicas estabilizadoras que se unen a una proteína puede ser de al menos 20, 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más de 1000 o 2000 aminoácidos. Las secuencias estabilizadoras pueden, por ejemplo, fusionarse a un polipéptido biológicamente activo, por ejemplo al N­ o al C-terminal del agente de unión al receptor. La fusión de secuencias estabilizadoras puede dar lugar a un aumento significativo del radio hidrodinámico de la proteína de fusión en relación con la proteína no modificada, que puede detectarse mediante ultracentrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño o dispersión de luz, por ejemplo. En algunas realizaciones, las secuencias estabilizadoras para contener pocos o ninguno de los siguientes aminoácidos: cisteína (para evitar la formación de disulfuro y la oxidación), metionina (para evitar la oxidación), asparagina y glutamina (para evitar la desamidación) y aspartato. Las secuencias estabilizadoras pueden diseñarse para contener residuos de prolina que tienden a reducir la sensibilidad a la degradación proteolítica.
Ensayos de unión
La interacción de un agente de unión a receptores y sus dianas puede analizarse mediante el uso de cualquier enfoque adecuado, incluidos, por ejemplo, radioinmunoensayos, ensayos de unión celular y resonancia de plasmón superficial (SPR). En Boraschi, J. Immunol., 155(10):4719-25 (1995), se describe un ensayo ejemplar de unión celular que utiliza la competencia de proteínas radio yodadas.
La SPR o el análisis de interacciones biomoleculares (BIA) pueden detectar interacciones biespecíficas en tiempo real y sin etiquetar ninguno de los interaccionantes. Los cambios de masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) del chip BIA dan lugar a alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Los procedimientos para utilizar SPR se describen, por ejemplo, en Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolanderand Urbaniczky, 1991, Anal. Química. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opinen. Estructurar. Biol.
5:699-705 y recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia). Se puede utilizar un sistema BIACORE® o un Reichert SR7000DC Dual Channel SPR para comparar y clasificar interacciones en tiempo real, en términos de cinética, afinidad o especificidad sin utilizar etiquetas. Las afinidades de unión de un agente de unión de receptores para un dominio extracelular de receptor de citoquina (por ejemplo, el dominio extracelular de IL- IL-1RI) pueden medirse mediante el uso de SPR en condiciones aproximadamente fisiológicas, por ejemplo, 10 mM HEp ES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Tween-20. También pueden utilizarse otros procedimientos que no dependan de la SPR, por ejemplo, para medir la unión y la afinidad.
La información de los ensayos de unión puede utilizarse para proporcionar una medida precisa y cuantitativa de la constante de disociación de equilibrio (Kd), y los parámetros cinéticos (por ejemplo, Kon y Kof para la unión de un agente de unión de receptores a una diana. Estos datos pueden utilizarse para comparar diferentes proteínas, objetivos y condiciones. Esta información también puede utilizarse para desarrollar relaciones estructura-actividad (SAR). Por ejemplo, los parámetros cinéticos y de equilibrio de unión de las proteínas variantes pueden compararse con los parámetros de una proteína de referencia o parental. Se pueden identificar aminoácidos variantes en determinadas posiciones que se correlacionan con parámetros de unión particulares, por ejemplo, alta afinidad y K f lento. Esta información puede combinarse con el modelado estructural (por ejemplo, utilizando el modelado homológico, la minimización de la energía o la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o RMN).
Las proteínas utilizadas para evaluar las afinidades pueden producirse en forma recombinante y pueden incluir etiquetas adecuadas para la purificación o la inmovilización, por ejemplo, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta hemaglutinina, una etiqueta His o una fusión de dominio Fc. Los dominios extracelulares de las proteínas receptoras (tal como IL-1RI RI, e IL-1RAcP) pueden producirse en forma recombinante por expresión, por ejemplo, en células bacterianas o de insecto, por ejemplo, mediante el uso de la expresión de baculovirus en células Sf9. Las proteínas receptoras solubles pueden inmovilizarse en el sistema BIAcore, por ejemplo, utilizando chips que incluyen reactivos que se unen a sus etiquetas, por ejemplo, un chip recubierto con IgG específica para el dominio Fc u otra etiqueta.
Ensayos de actividad celular
La capacidad de los agentes de unión a receptores para funcionar como antagonistas de receptores puede evaluarse, por ejemplo, en un ensayo basado en células. Por ejemplo, es posible evaluar la inhibición de la IL-1RI RI por un agente de unión al receptor. Varios ensayos ejemplares para la actividad de IL-1 se describen en Boraschi et al. e incluyen ensayos de proliferación de células T, ensayos de producción de IL-6 e IL-8, e inhibición de la afluencia de calcio.
En un ensayo ejemplar, se evalúa la capacidad de un agente de unión al receptor para inhibir la liberación de IL-6 estimulada por IL-1 p de fibroblastos humanos. La inhibición de la liberación de citoquinas estimulada por IL-1p en células MRC5 se correlaciona con la capacidad del agente para inhibir la actividad mediada por IL-1 in vivo. Los detalles del ensayo se describen en Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, Ch. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., 2000. En resumen, los fibroblastos humanos MRC5 (ATCC # CCL-171, Manassas VA, EE.UU.) se cultivan hasta confluencia en placas de múltiples pocillos. Las células se tratan con dosis tituladas del agente de unión al receptor y controles. Posteriormente, las células se ponen en contacto con 100 μg/ml de IL-1p en presencia del agente titulado y/o controles. Las células de control negativo no se estimulan con IL-1 p. Las cantidades de IL-6 liberadas en cada grupo de células tratadas se miden mediante el uso de un kit ELISA de IL-6 (p. ej., BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Los controles que se pueden usar incluyen tampón solo, IL-1Ra y anticuerpos contra IL-1 p.
La eficacia de un agente de unión a receptores también puede evaluarse in vivo. Un ensayo ejemplar se describe en Economides et al., Nature Med., 9:47-52 (2003). En resumen, se inyecta a los ratones por vía intraperitoneal dosis tituladas del agente de unión al receptor y de los controles. Veinticuatro horas después de la inyección, a los ratones se les inyecta por vía subcutánea IL-1 p humana recombinante a una dosis de 1 μg/kg. Dos horas después de la inyección de la IL-1 p (tiempo de respuesta máxima de la IL-6), se sacrifican los ratones y se recoge sangre que se procesa para obtener suero. Los niveles séricos de IL-6 se analizan mediante ELISA. El porcentaje de inhibición puede calcularse a partir de la relación entre la IL-6 detectada en el suero del animal experimental y la IL-6 detectada en los controles.
Otros ensayos ejemplares de la actividad de la IL-1 in vivo se describen en Boraschi et al. e incluyen un ensayo de anorexia, hipoglucemia y neutrofilia.
Producción
Los agentes de unión a receptores pueden producirse por expresión en células huésped recombinantes, pero también por otros procedimientos tales como la transcripción y traducción in vitro y la síntesis química.
Para la expresión celular, uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifican un agente de unión a receptores pueden insertarse en un vector replicable para clonación o para expresión. Hay varios vectores a disposición del público. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un genoma viral, un fagémido, el genoma de un fago u otra secuencia de replicación autónoma. La secuencia de ácido nucleico codificante adecuada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. Por ejemplo, se pueden diseñar sitios de endonucleasas de restricción apropiados (por ejemplo, mediante PCR). A continuación, se puede utilizar la digestión de restricción y la ligadura para insertar la secuencia de ácido nucleico codificante en un lugar apropiado. Los componentes del vector generalmente incluyen uno o más de un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
El agente de unión a receptores puede producirse de forma recombinante, bien aislado, pero también por fusión con uno o más componentes, tales como una secuencia señal, un epítopo o una fracción de purificación, y una etiqueta. El agente de unión al receptor puede incluir el dominio pro de un miembro de la familia de la interleucina-1, por ejemplo, que posteriormente puede eliminarse mediante procesamiento proteolítico.
Para la expresión bacteriana, el agente de unión al receptor puede producirse con o sin una secuencia señal. Por ejemplo, puede producirse dentro de las células de modo que se acumule en cuerpos de inclusión, o en la fracción soluble. También puede secretarse, por ejemplo, añadiendo una secuencia señal procariota, por ejemplo, una secuencia líder apropiada como la de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa o la enterotoxina II termoestable. Las células huésped bacterianas ejemplares para la expresión incluyen cualquier cepa transformable de E. coli K-12 (tal como E. coli BL21, C600, ATCC 23724; E. coli HB101 NRRLB-11371, ATCC-33694; E. coli MM294 ATCC-33625; E. coli W3110 ATCC-27325), cepas de B. subtilis, Pseudomonas y otros bacilos. Las proteínas producidas en sistemas bacterianos suelen carecer de glicosilación. Por consiguiente, en algunas realizaciones, los agentes de unión a receptores definidos en las reivindicaciones están sustancialmente libres de glicosilación, por ejemplo, libres de modificaciones de glicosilación de una célula de mamífero u otra célula eucariota.
El agente de unión al receptor puede expresarse en una célula huésped de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Hanseula o Pichia pastoris. Para la expresión en levadura, el agente de unión a receptores también puede producirse intracelularmente o por secreción, por ejemplo, mediante el uso del líder invertasa de levadura o el líder factor alfa (incluyendo las formas Saccharomyces y Kluyveromyces ), o el líder fosfatasa ácida, o el líder glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179 publicado el 4 de abril de 1990). En la expresión en células de mamíferos, pueden utilizarse secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, así como líderes secretores virales. Alternativamente, el agente de unión al receptor puede producirse con un dominio pro de un miembro de la familia de la interleucina-1, por ejemplo, un dominio pro de IL-1 a o IL- 1p.
Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas; el origen del plásmido 2|j es adecuado para la levadura; y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación suelen contener un gen o marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas (tal como el marcador URA3 en Saccharomyces), o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli. También se dispone de varios marcadores para células de mamíferos, por ejemplo, DHFR o timidina quinasa. La DHFR puede utilizarse junto con una línea celular (tal como una línea celular CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como describen Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980).
Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de unión al receptor para dirigir la síntesis de ARNm. Entre los promotores ejemplares adecuados para su uso con huéspedes procariotas se incluyen los sistemas promotores de la plactamasa y la lactosa (Chang etal., Nature, 275:615 (1978); Goeddel etal, Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); eP 36.776) y promotores híbridos como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también pueden contener una secuencia Shine-Dalgarno situada adecuadamente. El sistema de la polimerasa T7 también puede utilizarse para impulsar la expresión de una secuencia codificante de ácido nucleico colocada bajo el control del promotor T7. Véanse, por ejemplo, los vectores pET (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, EE.UU.) y las células huésped, por ejemplo, como se describe en el Protocolo de usuario TB053 de Novagen disponible en EMD Chemicals y en US 5,693,489. Por ejemplo, dichos vectores pueden utilizarse en combinación con células BL21(DE3) y células BL21(DE3) μLysS para producir proteína, por ejemplo, al menos 0,05, 0,1 o 0,3 mg por ml de cultivo celular. Otras líneas celulares que pueden utilizarse son las lisógenas DE3 de B834, BLR, HMS174, NovaBlue, incluidas las células que llevan un plásmido μLysS.
Algunos promotores ejemplares para su uso con células de levadura son los promotores de la 3-fosfo-glicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chern., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexocinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructocinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa y la piruvato cinasa. Otros promotores de levadura ejemplares son inducibles y tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento. Algunos ejemplos de promotores inducibles son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa ácida, la metalotioneína y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa.
La expresión de ARNm que codifica un agente de unión a receptor a partir de vectores en células hospedadoras de mamíferos puede controlarse, por ejemplo, por medio de promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis-B y el virus Simian 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por ej., el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores de choque térmico. También pueden utilizarse sistemas promotores heterólogos, por ejemplo, promotores que respondan a la tetraciclina. Véase Urlinger, S., et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968. La transcripción también puede ser impulsada por una secuencia potenciadora, situada en cis o en trans. Las secuencias potenciadoras de mamíferos ejemplares incluyen las de globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina. Otros ejemplos son el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante para el agente de unión al receptor, pero preferiblemente se sitúa en un sitio 5' respecto al promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias suelen obtenerse de las regiones no traducidas 5' y, en ocasiones, 3' de ADN eucariótico o viral o de ADNcd. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el agente de unión al receptor. El vector de expresión también puede incluir una o más secuencias intrónicas.
El agente de unión al receptor también se puede expresar en células de insecto, por ejemplo, células Sf9 o SF21, por ejemplo, mediante el uso del sistema pFAST-BAC™. Otros ejemplos de vectores de expresión de baculovirus están disponibles en Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad CA, Estados Unidos. El agente de unión al receptor también puede expresarse en células de mamífero. Por ejemplo, también pueden emplearse líneas celulares de origen mamífero. Entre los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos se incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (aTc C CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) descrita por McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821,1991). Se han descrito procedimientos establecidos para introducir ADN en células de mamíferos (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 1569).
En Molecular Cloning se describen otros procedimientos, vectores y células huésped adecuados para la adaptación a la síntesis de agentes de unión a receptores en células recombinantes: A Laboratory Manual, Third Ed., Sambrook et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773).
Una vez expresados en las células, los agentes de unión a receptores pueden recuperarse del medio de cultivo, de los cuerpos de inclusión o de los lisados celulares. Las células pueden alterarse por diversos medios físicos o químicos, como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o agentes de lisis celular (por ejemplo, detergentes).
Los agentes de unión a receptores pueden purificarse a partir de otras proteínas o polipéptidos celulares que pueden encontrarse en lisados celulares o en el medio celular. Pueden emplearse diversos procedimientos de purificación de proteínas, conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (2010) (ISBN: 1441928332). Algunos ejemplos de procedimientos de purificación son: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel mediante el uso de, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharose para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas de afinidad (por ejemplo, columnas de quelación de metales para unir formas de la proteína marcadas con epítopos y columnas con diversos ligandos para unir cualquier fracción de purificación que esté asociada con el agente de unión al receptor). Un procedimiento de purificación puede incluir una combinación de dos etapas diferentes de cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico seguida de cromatografía de intercambio aniónico, o viceversa. Los agentes de unión a receptores pueden eluirse de la resina de intercambio iónico mediante diversos procedimientos que incluyen gradientes o pasos de sal y/o pH. En algunas realizaciones, el agente de unión a receptores definido en las reivindicaciones incluye una fracción de purificación (tal como etiquetas epitópicas y asas de afinidad). Dichas moléculas pueden utilizarse para cromatografía de afinidad y, opcionalmente, pueden eliminarse mediante escisión proteolítica.
La cromatografía de intercambio iónico también puede utilizarse como técnica de separación por intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas basándose en las diferencias entre la carga global de las moléculas y puede utilizarse para separar la forma intacta de los agentes de unión a receptores de otras formas de dichas proteínas.
Los sustituyentes aniónicos o catiónicos pueden unirse a las matrices para formar soportes aniónicos o catiónicos para cromatografía. Los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amina cuaternaria (Q). Los sustitutos catiónicos incluyen carboximetil (CM), sulfoetil (SE), sulfopropil (SP), fosfato (P) y sulfonato (S). Las resinas celulósicas de intercambio iónico como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 y CM-52 pueden adquirirse en Whatman Ltd. (Maidstone, Kent, Reino Unido). (Maidstone, Kent, Reino Unido). También se conocen el SEPHADEX™ y otros intercambiadores de iones reticulados. Por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM- y SP-SEPHADEX™ y DEAE-, Q-, CM- y S-SEPHAROSE™ y SEPHAROSE™ Fast Flow están disponibles en Pharmacia AB. Los copolímeros de etilenglicol-metacrilato derivados de DEAE y CM, como TOYOPEARL DEAE-650S o M y TOYOPEARL CM-650S o M, se pueden adquirir en Toso Haas Co. (Filadelfia, PA, EE.UU.).
Una superficie de intercambio catiónico es una superficie de intercambio iónico con ligandos de carga negativa unidos covalentemente y que, por tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución en contacto con la superficie. Las superficies ejemplares incluyen resinas de intercambio catiónico, como aquellas en las que los grupos unidos covalentemente son carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen CMC-celulosa, SP-Sephadex™ y Fast S-Sepharose™ (Pharmacia).
Una superficie de intercambio aniónico es una superficie de intercambio iónico con grupos de carga positiva unidos covalentemente, tales como los grupos amino cuaternarios. Una superficie de intercambio aniónico ejemplar es una resina de intercambio aniónico, tales como DEAE celulosa, TMAE, QAE Sephadex™ y Fast Q Sepharose™ (Pharmacia).
Un esquema de purificación ejemplar para un agente de unión a receptores incluye la lisis de células E. coli en tampón de lisis seguida de filtración en profundidad. A continuación, el material se somete a cromatografía de intercambio catiónico (CEX). A continuación, el eluido CEX se hace fluir sobre un medio de intercambio aniónico en una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (AEX). El AEX FT puede someterse a una fase de pulido. A continuación, el material puede procesarse mediante ultrafiltración/diafiltración, por ejemplo, para concentrarlo o desalarlo. Las membranas de ultrafiltración/diafiltración pueden seleccionarse en función del corte de peso molecular nominal ("NMWCO") para retener la proteína en el retentado, permitiendo al mismo tiempo que materiales de bajo peso molecular, como las sales, pasen al filtrado. Puede utilizarse cualquier solución tampón o agua estéril durante la etapa final de intercambio tampón, por ejemplo, en función del pH final deseado y de la conductividad del producto.
Un agente de unión a receptores puede almacenarse en diversas soluciones, tales como agua, PBS y soluciones tamponadas. Entre las soluciones tamponadas ejemplares se incluyen acetato de sodio pH 4,5, acetato de sodio pH 4.7, acetato de sodio pH 4,9, acetato de sodio pH 5,1, acetato de sodio pH 5,3, acetato de sodio pH 5,5, succinato pH 5,2, succinato pH 5,4, succinato pH 5,6, succinato pH 5,8, histidina pH 5.7, histidina pH 6,0, histidina pH 6,3, histidina 6,6, fosfato sódico pH 6,5, fosfato sódico pH 6,7, fosfato sódico 7,0, fosfato sódico pH 7,3, fosfato sódico pH 7.7, imidazol pH 6,5, imidazol pH 6,8, imidazol pH 7,2, Tris pH 7,0, Tris pH 7,5, Tris pH 7,7. Los agentes tamponadores pueden estar presentes, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 1-100mM, 5-50mM, 10-50mM, o 5-25 mM. La solución puede incluir además una sal como NaCl (p. ej., 50 mM, 150 mM o 250 mM, e intervalos entre ellos), arginina (p. ej., en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5%, e intervalos entre ellos), sacarosa (p. ej., en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5%, 8,5%, 10%, 15%, e intervalos entre ellos), y/o glicerol (p. ej., en aproximadamente 0,5%, 1%, 4%, 5%, 8%, 15%, e intervalos entre ellos), en torno al 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5%, 8,5%, 10%, 15%, y e intervalos entre ambos), y/o glicerol (por ejemplo, en torno al 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7,5%, 8,5%, 10%, 15%, e intervalos entre ambos).
El agente de unión al receptor puede estar presente en la composición en una cantidad de al menos 50 mg, 100 mg, 500 mg, 1 g, 5 g, 10 g, o más.
Procedimientos analíticos
Las proteínas de la célula huésped (HCP) se refieren a las proteínas de una preparación que difieren de un agente de unión a receptores y, por ejemplo, son proteínas endógenas de la célula huésped a partir de la cual se preparó el agente de unión a receptores, normalmente proteínas de E. coli. Preferiblemente, las proteínas de la célula huésped están presentes en menos de 10000, 1000, 900, 800 o 700 ppm (partes por millón). Las HCP pueden detectarse, por ejemplo, mediante ELISA u otros procedimientos de detección. Por ejemplo, el ELISA puede utilizar anticuerpos policlonales frente a HCP Un kit de ejemplo está disponible en Cygnus Technologies (Cn# F410; South port NC USA). Otro kit de ejemplo utiliza la tecnología AlphaScreen (Kit AlphaLisa® E. coli HCP, número de producto AL261 C/F, Perkin Elmer, Waltham MA, EE. UU.).
El material que contenga o pueda contener un agente de unión a receptores puede evaluarse, por ejemplo, mediante el uso de cromatografía líquida de alta presión. Entre las técnicas analíticas ejemplares se incluyen la cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio catiónico débil (wCEX-HPLC), la cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC), la cromatografía líquida de fase inversa, la ESI-MS, la espectrometría de masas de ionización por turboaspersión, la espectrometría de masas de ionización por nanoaspersión, la espectrometría de masas de ionización por termoaspersión, la espectrometría de masas de ionización por aspersión sónica, la SELDI-MS y la MALDI- MS.
En diversas realizaciones, la región N-terminal de un agente de unión a receptores incluye secuencias idénticas a péptidos de la región N-terminal de IL-1p, por ejemplo, el péptido APVRS (SEQ ID NO:58). Las células recombinantes (en particular las células E. co li) que expresan dichas proteínas pueden producir la proteína intacta, así como otras isoformas, incluida la isoforma des-Ala y una isoforma con una metionina adicional (por ejemplo, N-terminal a Alai). Los agentes de unión a receptores que incluyen una prolina en la posición 2 del aminoácido (en el que el residuo terminal N está en la posición 1) pueden ser susceptibles a la escisión por proteasas de E. co li, tales como la aminopeptidasa P que tiene especificidad de escisión para X- PRO. Esta escisión puede eliminar el aminoácido N-terminal. Por ejemplo, P03, P04 y P05 tienen una prolina en la posición 2. Las formas intactas de P03, P04 y P05 tienen una longitud de 153 aminoácidos y empiezan por alanina, mientras que las especies des-Ala tienen una longitud de 152 aminoácidos y empiezan por prolina.
Se pueden utilizar técnicas analíticas como las anteriores para distinguir entre formas intactas y otras formas, por ejemplo, una especie des-Ala. Una técnica analítica ejemplar es la wCEX- HPLC. Por ejemplo, P05 puede evaluarse mediante el uso de una columna Dionex ProPac® WCX-10 4x250 mm (número de producto 054993) como se describe en el Ejemplo 9. Los picos de WCX-HPLC pueden evaluarse mediante C4 en fase reversa (RP)-HPLC en línea con espectrometría de masas. El P05 intacto tiene masa teórica: 17700.4 Da y es detectable como 17700,4 Da. La especie des-Ala es detectable en 17629,4 Da, es decir 71 Da menos que la masa del P05 intacto. La reducción de 71 Da en la masa corresponde a la eliminación de un único residuo de alanina.
Composiciones farmacéuticas
Un agente de unión a receptores puede formularse como una composición farmacéutica. La invención proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones adjuntas. Típicamente, la composición es estéril e incluye uno o más de un tampón, una sal farmacéuticamente aceptable, y un excipiente o estabilizador. Por ejemplo, la composición puede ser una composición acuosa. Un agente de unión a receptores puede formularse según procedimientos estándar para un biológico. Véase, por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed.., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X); Protein formulation and delivery, McNally y Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007).
Un agente de unión a receptores para una composición farmacéutica suele tener una pureza de al menos el 10, 20, 50, 70, 80, 90, 95, 98, 99 o 99,99% y suele estar libre de proteínas humanas. Puede ser la única proteína de la composición o la única proteína activa de la composición. También puede combinarse con otra u otras proteínas activas, por ejemplo, otra u otras proteínas activas purificadas, por ejemplo, una proteína relacionada o no relacionada. En algunas realizaciones, la composición puede contener el agente de unión al receptor en una concentración de entre aproximadamente 0,001 -10%, por ejemplo, 0,001 0,1%, 0,01 1%, o 0,1% 10%.
En consecuencia, también se presentan en la presente memoria formas purificadas y aisladas de los agentes definidos en las reivindicaciones adjuntas. El término "aislado" se refiere al material que se retira de su entorno original (por ejemplo, las células o los materiales a partir de los cuales se produce el agente de unión a receptores). Las composiciones farmacéuticas pueden estar sustancialmente libres de materiales pirogénicos, sustancialmente libres de ácidos nucleicos y/o sustancialmente libres de enzimas y componentes celulares, como polimerasas, proteínas ribosómicas y proteínas chaperonas.
Una composición farmacéutica puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en el presente documento, el "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Una "sal farmacéuticamente aceptable" es una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto original y no tiene efectos toxicológicos no deseados (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19), por ejemplo, sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
En una realización, el agente de unión a receptores se formula con uno o más excipientes, tales como cloruro de sodio, y un tampón fosfato (por ejemplo, fosfato dibásico de sodio heptahidratado, fosfato monobásico de sodio), y polisorbato. Puede proporcionarse, por ejemplo, en una solución tamponada, por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5-100, 5-30, 30-50, o 50-100 mg/ml y puede almacenarse a 2-8°C. Las composiciones farmacéuticas también pueden presentarse en otras formas diversas. Entre ellas se incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones y liposomas. La forma preferida puede depender del modo de administración previsto y de la aplicación terapéutica. Las composiciones para los agentes aquí descritos suelen presentarse en forma de soluciones inyectables o infusibles, o son para administración tópica u ocular (véase más adelante).
Las composiciones farmacéuticas suelen ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Una composición farmacéutica también puede someterse a pruebas para garantizar que cumple las normas reglamentarias e industriales de administración. La composición puede formularse en forma de solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración elevada del fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando un agente descrito en el presente documento en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un agente descrito en el presente documento a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que producen un polvo de un agente descrito en el presente documento más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estérilmente del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante la inclusión de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Por ejemplo, un agente de unión al receptor puede asociarse con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. En algunas realizaciones, el polímero se une covalentemente al agente de unión al receptor, por ejemplo, directa o indirectamente. Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Pueden utilizarse polímeros con pesos medios de número molecular comprendidos entre 200 y 35.000 Daltons (o entre 1.000 y 15.000, y entre 2.000 y 12.500). Por ejemplo, un agente de unión al receptor puede conjugarse con un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero polivinílico hidrófilo, por ejemplo, polivinilalcohol o polivinilpirrolidona. Una lista no limitativa de tales polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros en bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros en bloque. Otros polímeros útiles son los polioxialquilenos, tales como el polioxietileno, el polioxipropileno y los copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); los polimetacrilatos; los carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que incluyan los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (p. ej., ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico).g. o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico, incluidos los homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como la lactosa, la amilopectina, el almidón, el hidroxietilalmidón, la amilosa, el sulfato de dextrano, el dextrano, las dextrinas, el glucógeno o la subunidad polisacárida de los mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, el ácido hialurónico.por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar tales como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparán.
En ciertas realizaciones, el agente de unión al receptor puede prepararse con un portador que proteja el compuesto contra la liberación rápida. Puede administrarse como una formulación de liberación controlada, mediante un implante o un sistema de administración microencapsulado. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, como el etilvinilacetato, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Administración
Un agente de unión a receptores puede administrarse a un individuo, por ejemplo, un individuo humano, por diversos procedimientos, tales como la administración intravenosa en bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intrasinovial, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, inyección epidural, inyección intraesternal e infusión. Otros modos de administración incluyen las vías tópica (por ejemplo, dérmica o mucosa) o inhalatoria (por ejemplo, intranasal o intrapulmonar). Para muchas aplicaciones, la vía de administración es una de las siguientes: inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea o inyección intramuscular.
Un agente de unión a receptores puede administrarse como dosis fija o en dosis de mg/kg. Puede administrarse por vía intravenosa (IV) o subcutánea (SC). El agente de unión al receptor puede administrarse, por ejemplo, cada día, cada dos días, cada tercer, cuarto o quinto día, cada semana, cada tres a cinco semanas, por ejemplo, cada cuarta semana, o mensualmente.
Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" de la proteína aislada definida en las reivindicaciones adjuntas. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar en función de factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, la mejora de al menos un parámetro del trastorno, o la mejora de al menos un síntoma del trastorno (y opcionalmente el efecto de cualquier agente adicional que se administre). Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Un agente de unión a receptores suele administrarse en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante el uso de dispositivos médicos, por ejemplo, implantes, bombas de infusión, agujas hipodérmicas y dispositivos de inyección hipodérmica sin aguja. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, uno o más alojamientos para almacenar composiciones farmacéuticas, y puede estar configurado para administrar dosis unitarias del agente de unión a receptores, y opcionalmente un segundo agente. Las dosis pueden ser dosis fijas, es decir, unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de agente de unión a receptores calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un portador farmacéutico y opcionalmente en asociación con otro agente.
En algunas realizaciones, para tratar un trastorno como se define en las reivindicaciones adjuntas, puede administrarse un agente de unión a receptores al individuo que padece el trastorno en una cantidad y durante un tiempo suficientes para inducir una mejora sostenida en al menos un indicador que refleje la gravedad del trastorno. Se considera que una mejoría es "sostenida" si el individuo presenta la mejoría al menos en dos ocasiones separadas por un intervalo de una a cuatro semanas. El grado de mejora puede determinarse basándose en signos o síntomas, y también puede emplear cuestionarios que se administran al sujeto, como cuestionarios de calidad de vida.
A fin de determinar si la cantidad y la duración del tratamiento son suficientes, pueden evaluarse diversos indicadores que reflejen el alcance de la enfermedad. El valor basal del indicador o indicadores elegidos se establece mediante el examen del sujeto antes de la administración de la primera dosis del agente de unión a receptores. Preferiblemente, el examen basal se realiza en un plazo aproximado de 60 días tras la administración de la primera dosis.
La mejora puede inducirse administrando repetidamente una dosis del agente de unión a receptores hasta que el individuo manifieste una mejora con respecto a la línea de base para el indicador o indicadores elegidos. En el tratamiento de afecciones crónicas, el grado de mejora puede obtenerse mediante la administración repetida durante un período de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o más, o indefinidamente. En el tratamiento de una afección aguda, el agente puede administrarse durante un periodo de una a seis semanas o incluso en una sola dosis.
Aunque la extensión de la enfermedad tras el tratamiento pueda parecer mejorada de acuerdo con uno o más indicadores, el tratamiento puede continuarse indefinidamente al mismo nivel o a una dosis o frecuencia reducidas. El tratamiento también puede interrumpirse, por ejemplo, al mejorar o desaparecer los síntomas. Una vez reducido o interrumpido el tratamiento, puede reanudarse si reaparecen los síntomas.
Tratamientos
Los trastornos mediados por la IL-1 incluyen trastornos agudos y crónicos, entre ellos trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios. Los trastornos mediados por la IL-1 incluyen trastornos sistémicos y no sistémicos. Está bien establecido que la IL-1 a y la IL-1 p son potentes citoquinas proinflamatorias implicadas en respuestas infecciosas, así como en enfermedades inflamatorias, incluida la artritis reumatoide. Se ha observado un aumento de la producción de IL-1 en pacientes con varios trastornos autoinmunes, isquemia y diversos cánceres, lo que implica a la IL-1 en estas enfermedades y otras relacionadas.
Véase también, en general, Sims y Smith, The IL-1 family: regulators of immunity, Nature Reviews Immunology, doi:10.1038/nri2691 (2010).
El término "tratar" se refiere a la administración de un agente a un individuo, por ejemplo, un paciente, en una cantidad, manera y/o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento, o para prevenir la progresión de un trastorno, en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable para un experto en la técnica. El tratamiento puede estar destinado a curar, sanar, aliviar, aliviar, mitigar, remediar, mejorar, paliar, optimizar o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición al trastorno. Una cantidad, manera o modo eficaz puede variar en función del sujeto y puede adaptarse a él. Algunos ejemplos son los seres humanos, los primates y otros mamíferos no humanos. Un agente también puede administrarse profilácticamente para reducir el riesgo de aparición de un trastorno o síntoma del mismo.
La invención proporciona una composición farmacéutica para su uso como medicamento, y para su uso en el tratamiento del cáncer, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas
Un trastorno mediado por IL-1 puede ser un trastorno autoinmune, pero no se reivindica. Entre los ejemplos de trastornos autoinmunes mediados por la IL-1 se incluyen: artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Behcet, enfermedades inflamatorias intestinales (incluidas la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), asma, psoriasis, diabetes de tipo I y otros trastornos identificados en el presente documento. Un trastorno mediado por IL-1 ppuede ser un trastorno inflamatorio, pero éstos no se reivindican..
Algunos ejemplos de trastornos mediados por la IL-1 son:
Artritis reumatoide y artritis afines. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar a un sujeto que padezca o corra el riesgo de padecer artritis reumatoide, pero esto no se reivindica. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que afecta a la membrana sinovial de las articulaciones y que daña el cartílago articular. La patogenia de la AR depende de los linfocitos T y puede incluir la producción de autoanticuerpos conocidos como factores reumatoides. Pueden formarse complejos de factor reumatoide y antígeno que se acumulan en el líquido articular y en la sangre, induciendo la infiltración de linfocitos, neutrófilos y monocitos en la membrana sinovial. Las articulaciones suelen verse afectadas con un patrón simétrico, pero también puede producirse enfermedad extraarticular, por ejemplo, causando fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas, o el síndrome de Felty, que se manifiesta con neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Los pacientes también pueden presentar nódulos reumatoides en la zona de las articulaciones afectadas, pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria y neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar. Una forma de IL-1Ra está indicada para la Ar de moderada a gravemente activa. Véase, por ejemplo, Cohen, S. et al. Arthritis & Rheumatism 46, 614-24 (2002); Fleischmann, R.M. et al. Arthritis & Rheumatism 48, 927-34 (2003); Nuki, G., et al. Arthritis & Rheumatism 46, 2838-46 (2002); Schiff, M.H. et al. Arthritis & Rheumatism 50, 1752-60 (2004).
Los síntomas de la AR activa incluyen fatiga, falta de apetito, fiebre baja, dolores musculares y articulares y rigidez. La rigidez muscular y articular suele ser más notable por la mañana y tras periodos de inactividad. Durante los brotes, las articulaciones suelen enrojecerse, hincharse, doler y sensibilizarse, generalmente como consecuencia de la sinovitis. Entre las escalas útiles para evaluar la AR y sus síntomas se incluyen la escala de gravedad de la artritis reumatoide (RASS; Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41 (1):38-45), el índice de salud específico de la artritis SF-36 (ASHI; Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Suppl):MS40-50), Arthritis Impact Measurement Scales o Arthritis Impact Measurement Scales 2 (AIMS o AIMS2; Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1):1 10); the Stanford Health Assessment Questionnaire (HAQ), HAQII, or modified HAQ (see, e.g., Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum.
26(11):1346-53).
Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede administrarse a un individuo que padezca o corra el riesgo de padecer AR para retrasar la aparición y/o mejorar uno o más de los signos y síntomas anteriores, pero esto no se reivindica. El sujeto puede tener AR activa de moderada a grave. El individuo puede no responder a la terapia con un inhibidor del TNF (por ejemplo, terapia con ENBREL® (etanercept), HUMIRA® (adalimumab) o REMICADE® (infliximab)); el individuo puede haber recibido previamente un inhibidor del TNF; o el individuo también puede seguir recibiendo un inhibidor del TNF (y responder o no responder).
También se puede administrar metotrexato al individuo. Al sujeto se le pueden administrar uno o más DMARDS (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad), un corticosteroide y/o un antiinflamatorio no esteroideo. Otros fármacos que pueden coadministrarse con un agente de unión a receptores incluyen los inhibidores de CD28 (por ejemplo, CTLA4-lg), los inhibidores de RANKL, IFNy, IL-6, IL-8 e IL-17. Los inhibidores incluyen anticuerpos contra dichos mediadores, receptores solubles específicos para dichos mediadores y/o anticuerpos contra receptores para dichos mediadores.
Artritis crónica juvenil. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar la artritis crónica juvenil, por ejemplo, en un individuo menor de 21,18,15 o 14 años de edad, pero no se reivindica. La artritis crónica juvenil se parece a la AR en varios aspectos. Los sujetos pueden ser positivos al factor reumatoide. Los sujetos pueden tener formas pauciarticulares, poliarticulares o sistémicas de la enfermedad. La artritis puede provocar anquilosis articular y retraso del crecimiento, así como uveítis anterior crónica y amiloidosis sistémica. Se puede utilizar un agente de unión a receptores para retrasar la aparición o mejorar uno o más de estos síntomas, pero esto no se reivindica. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar la artritis idiopática juvenil, incluida la artritis idiopática juvenil de aparición sistémica (SO-JIA) , pero esto no se reivindica. Los sujetos pueden haber fracasado a un tratamiento previo con corticosteroides o haber necesitado un tratamiento con corticosteroides a una dosis diaria igual o superior a 0,3 mg/kg. Véase, por ejemplo, Quartier et al. (2011) Ann Rheum Dis. 70(5):747-54.
Otros trastornos reumáticos. Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento también puede utilizarse para tratar otros trastornos reumáticos, que incluyen esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, gota, osteoartritis, polimialgia reumática, artritis psoriásica y artritis de Lyme crónica, inflamación del músculo voluntario y otros músculos, incluida la dermatomiositis, la miositis por cuerpos de inclusión, la polimiositis y la linfangioleimioomatosis, el síndrome de artritis pirogénica, el síndrome de artritis granulomatosa pediátrica (AGP)ZBIau y otros trastornos reumáticos descritos en el presente documento, pero que no se reivindican.
Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar trastornos reumáticos metabólicos, por ejemplo, trastornos asociados a hiperuricemia, por ejemplo, gota, incluida la gota aguda crónica, y otras artropatías mediadas por cristales, pero no se reivindica. El agente puede utilizarse para tratar los brotes inducidos por fármacos asociados a la gota, incluidos, por ejemplo, los brotes inducidos por inhibidores de la xantina oxidasa, urato oxidasa o agentes uricosúricos, pero esto no se reivindica. En la gota, los cristales de ácido úrico pueden activar el inflamasoma y desencadenar la liberación de IL-1p.
Espondiloartropatías. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar espondiloartropatías, que incluyen trastornos como la espondilitis anquilosante, el síndrome de Reiter, la artritis asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, la espondilitis asociada a psoriasis, la espondiloartropatía de inicio juvenil y la espondiloartropatía indiferenciada, pero no se reivindica. Las espondiloartropatías se asocian con frecuencia al gen HLA-B27. Los sujetos pueden carecer de factor reumatoide y presentar sacroileítis con o sin espondilitis y artritis asimétrica inflamatoria. Los sujetos también pueden presentar inflamación ocular (véase más adelante).
Esclerodermia. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar la esclerodermia o la esclerosis sistémica, pero eso no se reivindica. La esclerodermia se caracteriza por una induración de la piel que puede ser localizada o sistémica. También puede haber lesiones vasculares y lesiones de las células endoteliales en la microvasculatura. Los sujetos pueden presentar infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y tener anticuerpos antinucleares. Otros órganos que muestran patogénesis pueden ser: el tracto gastrointestinal, que puede presentar atrofia del músculo liso y fibrosis que dan lugar a un peristaltismo/motilidad anormales; el riñón, que puede presentar proliferación intimal subendotelial concéntrica que afecta a las pequeñas arterias arqueadas e interlobulares, con la consiguiente reducción del flujo sanguíneo cortical renal, y que puede causar proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético que puede implicar atrofia, fibrosis intersticial, inflamación, pulmón, neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón que puede presentar, e.g., necrosis en banda de contracción y cicatrización/fibrosis. Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede administrarse a un sujeto con esclerodermia o con riesgo de padecerla para mejorar uno o más de los signos y síntomas anteriores, pero no se reivindica.
Síndrome de Sjogren. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar el síndrome de Sjogren, pero eso no se reivindica. El síndrome de Sjogren se caracteriza por una inflamación inmunomediada y la posterior destrucción funcional de las glándulas lagrimales y salivales. La enfermedad puede ir asociada o acompañada de enfermedades inflamatorias del tejido conjuntivo. La enfermedad está asociada a la producción de autoanticuerpos contra los antígenos Ro y La, ambos pequeños complejos ARN-proteína. Las lesiones pueden dar lugar a queratoconjuntivitis seca, xerostomía, con otras manifestaciones o asociaciones que incluyen cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial y púrpura palpable. El tratamiento de los trastornos oculares asociados a la enfermedad de Sjogren también se trata más adelante, pero no se reivindica.
Trastornos tiroideos. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar un trastorno tiroideo, pero eso no se reivindica. Los trastornos tiroideos ejemplares incluyen la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocítica juvenil y la tiroiditis atrófica, y son el resultado de una respuesta autoinmune contra antígenos tiroideos con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes en la glándula tiroides y a menudo específicas de ella. Se dispone de modelos experimentales que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos) y modelos inducibles creados por inmunización de animales con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea).
Trastornos diabéticos y metabólicos. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar un trastorno diabético tal como la diabetes de aparición juvenil (incluida la diabetes mellitus autoinmune y los tipos de diabetes insulinodependientes) y la diabetes de aparición madura (incluida la diabetes no insulinodependiente y la diabetes mediada por la obesidad), la diabetes de tipo I y la diabetes de tipo II, pero eso no se reivindica. Por ejemplo, la diabetes mellitus de tipo I o diabetes insulinodependiente se asocia a la destrucción autoinmune de las células de los islotes pancreáticos causada por autoanticuerpos y células T autorreactivas. Además, la reducción de la actividad de la IL-1p puede mejorar el control de la glucosa y la función de las células beta, y puede utilizarse para tratar la diabetes de tipo II. Véase, por ejemplo, Owyang et al. Endocrinology. 2010;151 (6):2515- 27. Por ejemplo, un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede administrarse a un individuo al que no se le está administrando insulina, por ejemplo, el individuo no es insulinodependiente, pero que no se reivindica. Por ejemplo, el sujeto puede ser prediabético. El sujeto puede tener alteración de la tolerancia a la glucosa o alteración de la glucosa en ayunas. El sujeto puede ser obeso o tener un índice de masa corporal superior a 23, 25, 30, 35 o 40 kg/m2. El sujeto puede ser resistente a la insulina, y/o caracterizarse por hiperglucemia o hiperinsulinemia. El sujeto puede correr el riesgo de progresar a diabetes de tipo II. Véase también Larsen, et al. (2007) NEJM 356:1517-26 y Larsen, et al. (2009). Diabetes Care 32:1663-8. Por ejemplo, el individuo tiene una glucosa plasmática en ayunas superior a 6,1,6,5, 7 u 8 mmol/L. Por ejemplo, el sujeto tiene un nivel de A1C superior a 5,5, 5,7, 6, 6,4, 7, 7,5 u 8%.
Por ejemplo, al individuo también se le administra un secretagogo de insulina, p. ej., tal como una sulfonilurea (p. ej., clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, tolbutamida, gliburida, glimepirida, glipizida) y/o meglitinidas (p. ej., repaglinida, nateglinida) que estimulan la secreción de insulina. También se puede administrar al sujeto una biguanida (por ejemplo, metformina). El agente de unión al receptor puede administrarse para reducir la pérdida y/o el daño de las células beta pancreáticas.
Por ejemplo, el individuo es heterocigoto u homocigoto para el alelo C del rs4251961, situado cerca del 5' del gen IL1RN.
El tratamiento con un agente de unión a receptores incluye la mejora o prevención del deterioro de afecciones secundarias asociadas a la diabetes, tales como la retinopatía diabética, el rechazo del trasplante renal en pacientes diabéticos, la resistencia a la insulina mediada por la obesidad y la insuficiencia renal, que a su vez puede estar asociada a proteinuria e hipertensión, pero esto no se reivindica.
Trastornos gastrointestinales. Los agentes de unión a receptores descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar un trastorno gastrointestinal inflamatorio, incluidas, por ejemplo, la enfermedad celíaca, la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerosa, la gastroparesia idiopática, la pancreatitis, incluidas la pancreatitis crónica, la pancreatitis aguda, la enfermedad inflamatoria intestinal y las úlceras, incluidas las úlceras gástricas y duodenales, pero esto no se reivindica.
Trastornos pulmonares. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar una enfermedad pulmonar mediada por IL-1, pero eso no se reivindica. Las enfermedades pulmonares ejemplares incluyen la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (p. ej. enfisema y bronquitis crónica), proteinosis alveolar pulmonar, neumopatía y fibrosis inducidas por bleomicina, fibrosis pulmonar, incluida la fibrosis pulmonar idiopática y la fibrosis pulmonar inducida por radiación, sarcoidosis pulmonar, fibrosis quística, acumulación de colágeno en los pulmones, SDRA, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedades pulmonares obstructivas crónicas y enfermedad pulmonar fibrótica crónica de los recién nacidos prematuros. Además, los agentes de unión a receptores descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar enfermedades pulmonares ocupacionales, incluidas la asbestosis, la neumoconiosis de los trabajadores del carbón, la silicosis o afecciones similares asociadas a la exposición a largo plazo a partículas finas, pero no se reivindica. Las enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas, como la neumonía eosinofílica, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad, pueden implicar una respuesta inmune-inflamatoria mal regulada que puede tratarse con un agente de unión a receptores.
La sarcoidosis es una enfermedad de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido del organismo; la afectación del pulmón es la más frecuente. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos y células linfoides activados en los lugares de la enfermedad, con las consiguientes secuelas crónicas resultantes de la liberación de productos activos a nivel local y sistémico liberados por estos tipos celulares.
Trastornos cardiovasculares. Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede utilizarse para tratar un trastorno o lesión cardiovascular, como aneurismas aórticos, síndrome coronario agudo, arteritis, oclusión vascular, incluida la oclusión de la arteria cerebral, complicaciones de la cirugía de bypass coronario, lesión por isquemia/reperfusión, cardiopatía, incluida la cardiopatía aterosclerótica, miocarditis, incluida la miocarditis autoinmunitaria crónica y la miocarditis vírica, insuficiencia cardíaca, incluida la insuficiencia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, reestenosis y/o aterosclerosis tras cirugía cardíaca o tras procedimientos angioplásticos con balón en la arteria carótida, isquemia miocárdica silente, disfunción de la bomba ventricular izquierda, complicaciones postimplantación de dispositivos de asistencia ventricular izquierda, Fenómeno de Raynaud, tromboflebitis, vasculitis, incluida la vasculitis de Kawasaki, enfermedad venooclusiva, arteritis de células gigantes, granulomatosis de Wegener y púrpura de Schoenlein-Henoch, pero no se reivindica. El agente de unión a receptores también puede proporcionarse profilácticamente, por ejemplo, para reducir el riesgo de dicho trastorno cardiovascular, pero eso no se reivindica. Por ejemplo, el agente de unión a receptores se administra a un paciente para tratar la aterosclerosis o reducir el riesgo de la misma, pero eso no se reivindica.
La señalización mediada por la IL-1 se activa con el infarto agudo de miocardio y puede iniciar la muerte celular apoptótica en las células miocárdicas periinfarto, ampliando el tamaño de la zona infartada. Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede administrarse para reducir el daño causado por el infarto de miocardio, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, el agente de unión a receptores puede administrarse a un individuo que esté en riesgo de sufrir un infarto de miocardio, o a un individuo que haya sufrido un infarto de miocardio, en particular un infarto agudo de miocardio, por ejemplo, en las últimas 2, 4, 6, 12, 24 o48 horas, pero esto no se reivindica. El agente puede administrarse en combinación con otros agentes, incluyendo, por ejemplo, heparina y aspirina.
Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para tratar el ictus, la hemorragia subaracnoidea, el traumatismo craneal o la lesión cerebral, y/o la inflamación asociada a un trastorno cardiovascular, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, los niveles elevados de IL-1 p se han relacionado con la neuroinflamación asociada al ictus y las lesiones cerebrales (Rothwell, N. J., et al., TINS 23(12): 618-625, 2000). El agente de unión a receptores puede administrarse para reducir dicha inflamación y otras inflamaciones asociadas a isquemia y/o hipoxia, pero no se reivindica. Además, el agente de unión a receptores también puede proporcionarse profilácticamente, por ejemplo, para reducir el riesgo de tales trastornos y/o la inflamación asociada a tales trastornos, pero eso no se reivindica. Por ejemplo, el agente de unión a receptores puede administrarse a un sujeto que esté en riesgo de sufrir un ictus, un acontecimiento isquémico, otro acontecimiento cardiovascular o un acontecimiento hemorrágico (tal como una hemorragia subaracnoidea), o a un sujeto que haya sufrido un ictus, un acontecimiento isquémico, otro acontecimiento cardiovascular o un acontecimiento hemorrágico (tal como una hemorragia subaracnoidea), por ejemplo, en las últimas 2, 4, 6, 12, 24 o 48 horas, pero esto no se reivindica.
Trastornos genitourinarios y renales. Los trastornos del sistema genitourinario también pueden tratarse con un agente de unión a receptores descrito en el presente documento, pero esto no se reivindica. Estos trastornos incluyen la glomerulonefritis, incluida la glomerulonefritis autoinmune, la glomerulonefritis debida a la exposición a toxinas o la glomerulonefritis secundaria a infecciones por estreptococos hemolíticos u otros agentes infecciosos. Las enfermedades renales inmunomediadas, incluidas la glomerulonefritis y la nefritis tubulointersticial, son el resultado de una lesión del tejido renal mediada por anticuerpos o linfocitos T, ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autoreactivos o células T contra antígenos renales o indirectamente como resultado del depósito de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñón que son reactivos contra otros antígenos no renales. Así pues, otras enfermedades inmunomediadas que dan lugar a la formación de inmunocomplejos también pueden inducir una enfermedad renal inmunomediada como secuela indirecta. Tanto los mecanismos inmunitarios directos como los indirectos dan lugar a una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales con el consiguiente deterioro de la función del órgano y, en algunos casos, la progresión a insuficiencia renal. En la patogénesis de las lesiones pueden intervenir mecanismos inmunitarios tanto humorales como celulares.
Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para tratar el síndrome urémico y sus complicaciones clínicas (por ejemplo, insuficiencia renal, anemia y cardiomiopatía hipertrófica), incluido el síndrome urémico asociado a la exposición a toxinas ambientales, fármacos u otras causas, pero no se reivindica. También pueden tratarse las complicaciones derivadas de la inflamación de la pared de la vesícula biliar que provoque una alteración de la función de absorción, pero eso no se reivindica. Entre estas complicaciones se incluyen la colelitiasis (cálculos biliares) y la coledocolitiasis (cálculos en los conductos biliares), así como la recurrencia de la colelitiasis y la coledocolitiasis. Otras afecciones que pueden tratarse son las complicaciones de la hemodiálisis; las afecciones de próstata, incluida la hipertrofia prostática benigna, la prostatitis no bacteriana y la prostatitis crónica; y las complicaciones de la hemodiálisis, pero eso no se reivindica. Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para tratar afecciones de dolor crónico, como el dolor pélvico crónico, incluido el síndrome de prostatitis crónica/dolor pélvico, y el dolor post-herpético, pero esto no se reivindica.
Trastornos hematológicos y oncológicos. Como se define en las reivindicaciones adjuntas, la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, que incluye diversas formas de cáncer, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, Carcinoma nasofaríngeo positivo para el virus de Epstein-Barr, glioma, cáncer de colon, estómago, próstata, células renales, cuello uterino y ovario, cáncer de pulmón (SCLC y NSCLC), incluyendo caquexia asociada al cáncer, fatiga, astenia, síndrome paraneoplásico de caquexia e hipercalcemia. Véase, por ejemplo, Voronov et al. (2003) PNAS 100:2645-2650. También son tratables los tumores sólidos, como el sarcoma, el osteosarcoma y los carcinomas, como el adenocarcinoma (por ejemplo, el cáncer de mama) y el carcinoma de células escamosas. En cuanto al papel de la IL-1p en determinados tumores, véase, por ejemplo, Krelin et al. (2007) Cancer Res. 67: 1062-1071. Otros cánceres son el cáncer de esófago, el cáncer gástrico, el carcinoma de vesícula biliar, la leucemia, incluida la leucemia mielógena aguda, la leucemia mielógena crónica, la leucemia mieloide, la leucemia linfoblástica crónica o aguda y la leucemia de células pilosas. Otras neoplasias malignas con potencial metastásico invasivo, incluido el mieloma múltiple, pueden tratarse con los agentes fijadores de receptores. Véase, por ejemplo, Lust et al. (2009) Mayo Clin Proc 84(2):114-122.
Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para tratar anemias y trastornos hematológicos, incluida la neutropenia idiopática crónica, la anemia de enfermedad crónica, la anemia aplásica, incluida la anemia aplásica de Fanconi; la púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); púrpura trombocitopénica trombótica, síndromes mielodisplásicos (incluida la anemia refractaria, la anemia refractaria con sideroblastos anillados, la anemia refractaria con exceso de blastos, la anemia refractaria con exceso de blastos en transformación); mielofibrosis/metaplasia mieloide; y crisis vasoclusiva falciforme, pero no se reivindica.
La anemia hemolítica autoinmune, la pancitopenia inmune y la hemoglobinuria paroxística nocturna pueden ser el resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados en la superficie de los glóbulos rojos (y en algunos casos con otras células sanguíneas, incluidas también las plaquetas) y es consecuencia de la eliminación de esas células recubiertas de anticuerpos a través de la lisis mediada por el complemento y/o de mecanismos mediados por el receptor ADCC/Fc. En la trombocitopenia autoinmune, incluida la púrpura trombocitopénica, y en la trombocitopenia inmunomediada en otros contextos clínicos, la destrucción/eliminación de plaquetas se produce como resultado de la unión de anticuerpos o complemento a las plaquetas y su posterior eliminación por lisis del complemento, mecanismos mediados por receptores de ADCC o FC.
Como se define en las reivindicaciones adjuntas, la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer, y también se puede administrar a individuos que tienen o están en riesgo de varios trastornos linfoproliferativos, incluidos el síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), leucemia linfoblástica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfática crónica, linfoma periférico de células T, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células T positivo para el virus de Epstein-Barr, linfoma histiocítico, enfermedad de Hodgkin, linfoma difuso agresivo, leucemias linfáticas agudas, enfermedad linfoproliferativa T gamma, linterna cutáneo de células B, linterna cutáneo de células T (es decir.e., micosis fungoide) y el síndrome de Sezary.
Trastornos hepáticos. Los agentes de unión a receptores divulgados en la presente memoria también son útiles para tratar afecciones del hígado, tales como la hepatitis, incluida la hepatitis alcohólica aguda, la hepatitis aguda inducida por fármacos o viral, la hepatitis A, B y C, la colangitis esclerosante, el epitelio sinusoide hepático y la inflamación del hígado superior por causas desconocidas, pero esto no se reivindica.
Trastornos auditivos. Los agentes de unión a receptores también pueden utilizarse para tratar trastornos que implican pérdida de audición y que están asociados con una expresión anormal de IL-1, pero eso no se reivindica. Estos trastornos incluyen la pérdida de audición asociada al nervio coclear que se cree que es el resultado de un proceso autoinmune, por ejemplo, la pérdida de audición autoinmune, el síndrome de Meniere y el colesteatoma, un trastorno del αdo medio asociado a menudo a la pérdida de audición.
Trastornos óseos. Trastornos no artríticos de los huesos y las articulaciones y también tratables con los agentes de unión a receptores descritos en el presente documento, pero que no se reivindican. Esto abarca los trastornos inflamatorios del hueso o la articulación, los trastornos osteoclásticos que conducen a la pérdida ósea, como la osteoporosis, incluida la osteoporosis posmenopáusica, la osteoartritis, la periodontitis que provoca el aflojamiento o la pérdida de dientes, y el aflojamiento de prótesis tras el reemplazo articular (generalmente asociado a una respuesta inflamatoria a los restos de desgaste), por ejemplo, la osteólisis de implantes ortopédicos.
Trastornos amiloides. Además, los agentes de unión a receptores descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar la amiloidosis primaria y la amiloidosis secundaria que es característica de diversas afecciones, incluida la enfermedad de Alzheimer, la amiloidosis reactiva secundaria, el síndrome de Down y la amiloidosis asociada a diálisis, pero que no se reivindica. Además, los agentes de unión a receptores pueden utilizarse para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson, pero eso no se reivindica. Estas enfermedades también pueden implicar la formación de agregados y amiloides que pueden desencadenar respuestas inflamatorias.
Trastornos neurológicos. Los agentes de unión a receptores también pueden utilizarse para tratar la neuroinflamación y las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluida la esclerosis múltiple; la polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barre; y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, pero eso no se reivindica. Se cree que estos trastornos tienen una base autoinmune y provocan la desmielinización de los nervios como resultado de los daños causados a los oligodendrocitos o a la mielina directamente. En la inducción de la enfermedad de la esclerosis múltiple e implican a los linfocitos T La esclerosis múltiple tiene un curso remitente-recurrente o un curso crónico progresivo. Las lesiones contienen infiltrados mediados predominantemente por linfocitos T, células microgliales y macrófagos infiltrantes; los linfocitos T CD4+ son el tipo celular predominante en las lesiones. Se desconoce el mecanismo de la muerte de las células oligodendrocitarias y la desmielinización subsiguiente, pero es probable que se deba a los linfocitos T.
Miopatías. Los agentes de unión a receptores pueden utilizarse para tratar miopatías asociadas a la inflamación y la autoinmunidad, pero eso no se reivindica. Las miopatías inflamatorias idiopáticas, como la dermatomiositis, la polimiositis y otras, son trastornos de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que provocan debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular suele ser simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados a la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis se dirigen contra componentes, proteínas y ARN, implicados en la síntesis de proteínas e inhiben su función.
Trastornos de vasculitis. Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede utilizarse para tratar un trastorno de vasculitis, por ejemplo, una vasculitis sistémica, pero esto no se reivindica. La vasculitis sistémica incluye enfermedades en las que la lesión primaria es la inflamación y posterior lesión de los vasos sanguíneos, lo que provoca isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos irrigados por los vasos afectados y, en algunos casos, disfunción del órgano final. Las vasculitis también pueden producirse como lesión secundaria o secuela de otras enfermedades mediadas por el sistema inmune-inflamatorio, como la artritis reumatoide, la esclerosis sistémica, etc., especialmente en enfermedades también asociadas a la formación de complejos inmunes. Las enfermedades del grupo de las vasculitis sistémicas primarias incluyen: vasculitis necrotizante sistémica: poliarteritis nodosa, angiitis alérgica y granulomatosis, poliangeítis; granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide; y arteritis de células gigantes. Las vasculitis diversas incluyen: el síndrome mucocutáneo de los ganglios linfáticos (MLNS o enfermedad de Kawasaki), la vasculitis aislada del SNC, la enfermedad de Behcet, la tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger) y la venulitis necrotizante cutánea. Se cree que el mecanismo patogénico de estos trastornos vasculíticos se debe principalmente al depósito de complejos de inmunoglobulinas en la pared vascular y a la subsiguiente inducción de una respuesta inflamatoria a través de la ADCC, la activación del complemento o ambas.
CAPS. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar un trastorno CAPS, es decir, Síndromes Periódicos Asociados a CIAS1, pero eso no se reivindica. El CAPS incluye tres síndromes genéticos: Trastorno inflamatorio multisistémico de aparición neonatal (NOMID), síndrome de Muckle-Wells (MWS) y síndrome autoinflamatorio familiar por frío (FCAS). (Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348). Los CAPS se heredan de forma autosómica dominante con un patrón esporádico o familiar. CIAS1 codifica NALP3, una proteína componente del "inflamasoma", un complejo enzimático subcelular que regula la actividad de la caspasa 1. Las mutaciones en CIAS1 conducen a una mayor producción de IL-1 y a numerosas consecuencias patológicas (Aksentijevich et al. 2002 supra). La IL-1 induce fuertemente la producción de reactantes de fase aguda en el hígado, como la proteína C reactiva (PCR) y el amiloide sérico A (aAs ).
Los trastornos CAPS comparten características clínicas comunes y se presentan como un espectro de gravedad clínica. El NOMID es el más gravemente discapacitante, el MWS algo menos y el FCAS es el menos grave. Los trastornos CAPS tienen varias características que se solapan y los individuos pueden presentar constelaciones únicas de signos y síntomas. Las características comunes a todas estas afecciones incluyen fiebre, erupción cutánea similar a la urticaria, artritis o artralgia, mialgia, malestar general y conjuntivitis.
En la NOMID, la meningitis aséptica crónica puede provocar retraso mental y estos pacientes también pueden sufrir un sobrecrecimiento óseo desfigurante e incapacitante en las epífisis y las rótulas. Estos pacientes también pueden sufrir ceguera debido a la atrofia del nervio óptico que resulta del aumento de la presión intracraneal. El mWs y el NOMID se asocian comúnmente a una inflamación grave que puede incluir el sistema auditivo, las meninges y las articulaciones. Estos pacientes pueden sufrir a diario fiebre alta en picos y una erupción crónica que cambia frecuentemente de distribución e intensidad. Los pacientes pueden sufrir pérdida de audición o sordera. Se observan con frecuencia conjuntivitis y papiledema. La amiloidosis puede desarrollarse y provocar insuficiencia renal debido a la inflamación crónica y a la sobreproducción de reactantes de fase aguda (en particular SM). Un agente de unión a receptores puede administrarse a un sujeto que tenga NOMID, MWS o FCAS o al que se le haya diagnosticado un genotipo asociado a NOMID, MWS o FCAS, pero que no se reivindique. Además, puede administrarse un agente de unión al receptor a un sujeto que padezca TRAPS (síndrome periódico asociado al receptor de TNF), pero no se reivindica.
Trastornos dermatológicos. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar un trastorno dermatológico, como un trastorno dermatológico inflamatorio o una enfermedad cutánea autoinmune o inmunomediada, pero eso no se reivindica. Un trastorno ejemplar es la psoriasis. Otras enfermedades cutáneas autoinmunes o inmunomediadas, incluidas las enfermedades bullosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis de contacto, están mediadas por autoanticuerpos, cuya génesis depende de los linfocitos T, pero eso no se reivindica. La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por los linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células de procesamiento de antígenos, y algunos neutrófilos.
Otros trastornos de la piel o de las mucosas que pueden tratarse son las enfermedades acantolíticas, incluida la enfermedad de Darier, la queratosis folicular y el pénfigo vulgar, pero no se reivindican. Otros trastornos adicionales incluyen: acné, acné rosácea, alopecia areata, estomatitis aftosa, penfigoide bulloso, quemaduras, eczema, eritema, incluidos eritema multiforme y eritema multiforme bulloso (síndrome de Stevens-Johnson), enfermedad inflamatoria de la piel, liquen plano, enfermedad bullosa IgA lineal (dermatosis bullosa crónica de la infancia), pérdida de elasticidad de la piel, úlceras de la superficie mucosa, incluidas las úlceras gástricas, dermatitis neutrofílica (síndrome de Sweet), dermatomiositis, pitiriasis rubra pilaris, psoriasis, pioderma gangrenoso, reticulohistiocitosis multicéntrica y necrólisis epidérmica tóxica. Otras afecciones relacionadas con la piel que pueden tratarse con agentes fijadores de receptores son la dermatitis herpetiforme (enfermedad de Duhring), la dermatitis atópica, la dermatitis de contacto y la urticaria (incluida la urticaria idiopática crónica), pero esto no se reivindica.
Trastornos alérgicos. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar un trastorno alérgico, como el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad alimentaria, la conjuntivitis alérgica (véase también más adelante) y la urticaria, pero esto no se reivindica. Estas enfermedades suelen estar mediadas por la inflamación inducida por linfocitos T, la inflamación mediada por IgE o ambas.
El asma es una enfermedad crónica del aparato respiratorio en la que las vías respiratorias se estrechan, se inflaman y se recubren de una cantidad excesiva de mucosidad, a menudo en respuesta a uno o varios desencadenantes. Los episodios pueden desencadenarse por factores como la exposición a un estimulante ambiental (o alérgeno) como el aire frío, el aire caliente, el aire húmedo, el ejercicio o el esfuerzo, el estrés emocional y las enfermedades víricas. El estrechamiento de las vías respiratorias provoca síntomas como sibilancias, dificultad para respirar, opresión torácica y tos. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar el asma y puede formularse para administración tópica o pulmonar para dicho tratamiento o puede administrarse por vía parenteral, pero eso no se reivindica.
Trasplante. Un agente de unión a receptores puede administrarse a un sujeto que esté a punto de someterse, se esté sometiendo o se esté recuperando de un trasplante, pero que no se reivindique. Las enfermedades asociadas a los trasplantes, entre ellas el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), dependen de los linfocitos T; la inhibición de la función de los linfocitos T es mejoradora. El trasplante de córnea puede asociarse a neovascularización, que puede mejorarse mediante el tratamiento con un agente de unión de receptores, pero no se reivindica. Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para tratar complicaciones derivadas de trasplantes de órganos sólidos, como corazón, hígado, piel, riñón, pulmón (obliteración de las vías respiratorias por trasplante de pulmón) u otros trasplantes, incluidos los de médula ósea, pero esto no se reivindica.
Enfermedades infecciosas. Los agentes de unión a receptores aquí descritos son útiles para tratar enfermedades protozoarias, incluida la malaria y la esquistosomiasis, y para tratar el eritema nodoso leproso; la meningitis bacteriana o vírica; la tuberculosis, incluida la tuberculosis pulmonar; y la neumonitis secundaria a una infección bacteriana o vírica, incluida la infección gripal y la mononucleosis infecciosa, pero esto no se reivindica.
También son tratables con un agente de unión a receptores los síndromes hereditarios de fiebre periódica, incluida la fiebre mediterránea familiar, el síndrome de hiperinmunoglobulina D y fiebre periódica y los síndromes periódicos asociados a receptores TNF (TRAPS), y la enfermedad de Still de inicio en la edad adulta, el síndrome de Schnitzler y la alveolitis fibrosante, pero esto no se reivindica.
Puede administrarse a un individuo un agente de unión a receptores para reducir la actividad o la expresión de IL-6 en el individuo, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, el sujeto puede tener un trastorno asociado o mediado, al menos en parte, por la IL-6.
Trastornos oculares y administración ocular
Los agentes de unión a receptores descritos en el presente documento pueden utilizarse para tratar trastornos oculares, incluidos trastornos oculares que afectan a la superficie del ojo, trastornos oculares inflamatorios y trastornos oculares mediados al menos en parte por una reacción autoinmune, pero esto no se reivindica.
Por ejemplo, el trastorno ocular es un trastorno de ojo seco que afecta a la superficie del ojo. El trastorno incluye afecciones también denominadas queratoconjuntivitis sicca, queratitis sicca, síndrome sicca, xeroftalmia, trastorno de la película lagrimal, disminución de la producción de lágrimas, deficiencia de lágrima acuosa y disfunción de las glándulas de Meibomio. El ojo seco puede incluir formas que están asociadas al síndrome de Sjogren (SS), por ejemplo, la queratoconjuntivitis sicca asociada al síndrome de Sjogren, pero también formas que no están tan asociadas, por ejemplo, la queratoconjuntivitis sicca no asociada al síndrome de Sjogren. El paciente puede tener o no otras manifestaciones de un trastorno autoinmune sistémico. La IL-1 se ha implicado en la patogénesis de los trastornos del ojo seco. Véase, por ejemplo, Enríquez de Salamanca et al. (2010), Mol. Vis. 16:862-873.
Los individuos que padecen un síndrome de ojo seco pueden presentar inflamación del ojo seco, y pueden experimentar sensaciones de rascado, escozor, picor, quemazón o presión, irritación, dolor y enrojecimiento. El ojo seco puede asociarse tanto a un lagrimeo excesivo como a una producción insuficiente de lágrimas. Puede administrarse a dichos sujetos un agente de unión a receptores para mejorar o prevenir la aparición o el empeoramiento de uno o más de dichos síntomas, pero esto no se reivindica. Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para mitigar el dolor, por ejemplo, el dolor ocular, como el debido a la neuroinflamación, en un sujeto que experimenta dicho dolor, pero esto no se reivindica.
Por ejemplo, el trastorno ocular es un trastorno ocular asociado con un trastorno autoinmune sistémico (tal como el síndrome de Sjogren y la artritis reumatoide) o con un trastorno asociado con la IL-1 u otro miembro de la familia de citoquinas IL-1. El paciente puede tener o no un trastorno autoinmune sistémico u otras manifestaciones de un trastorno autoinmune sistémico.
Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para tratar otros trastornos que afectan a la superficie del ojo, tal como la córnea, pero esto no se reivindica. Dichos trastornos incluyen afecciones inflamatorias de la superficie ocular de la córnea, neovascularización corneal, queratitis, incluidas la queratitis ulcerosa periférica y la queratitis microbiana. El agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar a un individuo sometido a cicatrización de una herida corneal (por ejemplo, un individuo que tenga una herida corneal), pero no se reivindica. Un agente de unión a receptores puede administrarse a un individuo que esté a punto de recibir, se someta o se esté recuperando de un procedimiento que afecte al ojo, por ejemplo, trasplante de córnea/queratoplastia, cirugía de queratoprótesis, trasplante lamelar, trasplante endotelial selectivo, pero que no se reivindique. Véase, por ejemplo, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43; Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9; y Dana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7. Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar trastornos que afectan a la conjuntiva, incluidos los trastornos de cicatrización conjuntival y la conjuntivitis, pero esto no se reivindica. El agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar otros trastornos como el síndrome penfigoide y el síndrome de Stevens-Johnson, pero no se reivindica. Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede administrarse a un sujeto para modular la neovascularización en el ojo o a su alrededor, pero esto no se reivindica. Véase, por ejemplo, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43.
Un agente de unión a receptores puede administrarse a un individuo que tenga una reacción alérgica que afecte al ojo, por ejemplo, un individuo que experimente una enfermedad ocular alérgica (atópica) grave como la conjuntivitis alérgica, pero no se reivindica. Por ejemplo, el agente de unión a receptores puede administrarse por vía tópica, pero esto no se reivindica. Véase también, por ejemplo, Keane-Myers AM et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12): 3041-6.
Puede administrarse un agente de unión a receptores a un individuo que padezca un trastorno autoinmune que afecte al ojo, pero esto no se reivindica. Entre los trastornos oculares autoinmunes cabe citar la oftalmía simpática, el síndrome de Vogt-Koyanagi Harada (VKH), la retinocoriodopatía en perdigonada, el penfigoide cicatricial ocular, la iridociclitis heterocrónica de Fuchs y diversas formas de uveítis.
Puede administrarse un agente de unión a receptores a un individuo que padezca retinopatía diabética o que corra el riesgo de padecerla, pero esto no se reivindica. Véase, por ejemplo, Demircan et al. (2006) Eye 20:1366-1369 y Doganay et al. (2006) Eye, 16:163-170
La uveítis incluye formas agudas y crónicas e incluye la inflamación de uno o más del iris, el cuerpo ciliar y la coroides. Las formas crónicas pueden estar asociadas a enfermedades autoinmunes sistémicas, por ejemplo, el síndrome de Behcet, la espondilitis anquilosante, la artritis reumatoide juvenil, el síndrome de Reiter y la enfermedad inflamatoria intestinal. En la uveítis anterior, la inflamación se produce principalmente en el iris (también iritis). La uveítis anterior puede afectar a sujetos que padecen una enfermedad autoinmune sistémica, pero también a sujetos que no padecen una enfermedad autoinmune sistémica. La uveítis intermedia implica la inflamación del vítreo anterior, la retina periférica y el cuerpo ciliar, a menudo con poca inflamación anterior o coriorretiniana. La panplanitis es el resultado de la inflamación de la pars plana entre el iris y la coroides. La uveítis posterior afecta al tracto uveal y principalmente a la coroides, y también se denomina coroiditis. La uveítis posterior puede estar asociada a una infección sistémica o a una enfermedad autoinmune. Puede persistir durante meses e incluso años. Puede administrarse a un sujeto un agente de unión a receptores para tratar cualquiera de las formas de uveítis anteriores, pero no se reivindica. Véase también, por ejemplo, Tsai et al. (2009) Mol Vis 15:1542-1552 y Trittibach P et al. (2008) Gene Ther. 15(22): 1478-88.
Un agente de unión a receptores puede utilizarse para tratar a un individuo que padezca o corra el riesgo de padecer degeneración macular asociada a la edad (DMAE) , pero esto no se reivindica. El agente de unión al receptor puede aplicarse tópicamente en el ojo, inyectarse (por ejemplo, por vía intravítrea) o suministrarse sistémicamente, pero esto no se reivindica. Véase, por ejemplo, Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3): 195-200.
Un agente de unión a receptores descrito en el presente documento puede administrarse por cualquier modo para tratar una enfermedad ocular, pero eso no se reivindica. El agente puede administrarse por vía parenteral. Alternativa o adicionalmente, el agente puede administrarse directamente en el ojo o en sus proximidades. Por ejemplo, la proteína puede administrarse por vía tópica o intraocular, como se describe a continuación.
Formulaciones y procedimientos de administración ocular
Las formulaciones oftálmicas definidas en las reivindicaciones pueden administrarse por vía tópica, por ejemplo, en forma de gota líquida o pomada, o implantarse, por ejemplo, en la cámara anterior del ojo o en el saco conjuntival. Las gotas líquidas pueden administrarse con un gotero. Cuando se formula para administración ocular, el agente de unión a receptores como se define en las reivindicaciones puede estar presente a una concentración de 0,0001-0,1%, 0,001-5%, por ejemplo, 0,005-0,5%, 0,05 - 0,5%, 0,01-5%, 0,1- 2% o 1%-5%. Con frecuencia, la formulación oftálmica se aplica directamente en el ojo, incluida la aplicación tópica en los párpados o la instilación en el espacio (cul-de-sac) entre el globo ocular y los párpados. La formulación oftálmica puede diseñarse para que se mezcle fácilmente con los fluidos lagrimales y se extienda por las superficies de la córnea y la conjuntiva. Con la técnica habitual de administración, la mayor parte del fármaco se deposita en el fórnix inferior. La capilaridad, las fuerzas difusionales y el reflejo de parpadeo impulsan la incorporación del fármaco en la película precorneal desde la que penetra en la córnea y la atraviesa.
Las formulaciones oftálmicas también pueden incluir uno o más agentes, por ejemplo, un esteroide antiinflamatorio tal como rimexolona, loteprednol, medrisona e hidrocortisona, o un antiinflamatorio no esteroideo. Por ejemplo, el esteroide puede estar presente en una concentración del 0,001 al 1 %. En algunas realizaciones, no hay esteroides presentes. Por ejemplo, el agente de unión a receptores definido en las reivindicaciones es el único agente activo de la formulación.
La formulación también puede incluir uno o más de los siguientes componentes: tensioactivos, agentes de tonicidad, tampones, conservantes, cosolventes y agentes formadores de viscosidad. Pueden utilizarse agentes tonificantes para ajustar la tonicidad de la composición, por ejemplo, a la de las lágrimas naturales. Por ejemplo, puede añadirse cloruro potásico, cloruro sódico, cloruro magnésico, cloruro cálcico, dextrosa y/o manitol para conseguir una tonicidad adecuada, por ejemplo, tonicidad fisiológica. Los agentes de tonicidad pueden añadirse en una cantidad suficiente para proporcionar una osmolalidad de aproximadamente 150-450 mOsm o 250-350 mOsm.
La formulación también puede incluir un tampón adecuado para la administración oftálmica. El tampón puede incluir uno o más componentes amortiguadores (por ejemplo, fosfato sódico, acetato sódico, citrato sódico, borato sódico o ácido bórico) de los cambios de pH, especialmente en condiciones de almacenamiento. Por ejemplo, el tampón puede seleccionarse para proporcionar un pH objetivo dentro del intervalo de pH 6,0-7,5, por ejemplo, 6,5-7,5.
La formulación puede incluir un portador acuoso o fosfolípido. Especialmente para el tratamiento de los trastornos del ojo seco, la formulación puede incluir agentes para proporcionar alivio a corto plazo, por ejemplo, compuestos que lubrican el ojo y ayudan a la formación de lágrimas. Por ejemplo, los portadores fosfolípidos (que incluyen uno o más fosfolípidos) pueden utilizarse para proporcionar alivio a corto plazo. Ejemplos o composiciones de lágrimas artificiales útiles tales como portadores de lágrimas artificiales incluyen productos comerciales como Tears Naturale™ (Alcon Labs, Inc., TX USA). Por ejemplo, por ml, la formulación puede incluir: 1 mg de dextrano, 70 y 3 mg de hidroxipropilmetilcelulosa, y opcionalmente un conservante tal como POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0,001% (m/v). Ejemplos de formulaciones portadoras de fosfolípidos incluyen las divulgadas en US 4,804,539, US 4,883,658, US 5,075,104, US 5,278,151, y US 5,578,586.
La formulación también puede incluir otros compuestos que actúen como lubricante o agente humectante. Entre ellos se incluyen agentes de viscosidad tales como: polioles monoméricos, tal como glicerol, propilenglicol, etilenglicol; polioles poliméricos, tales como polietilenglicol, diversos polímeros de la familia de la celulosa: hidroxipropilmetilcelulosa ("HPMC"), carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilcelulosa ("HPC"), dextranos, tales como dextrano 70; proteínas solubles en agua, tales como gelatina; y polímeros vinílicos, tales como alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, povidona y carbómeros, tales como carbómero 934P, carbómero 941; carbómero 940, carbómero 974P Otros ejemplos son los polisacáridos, como el ácido hialurónico y sus sales, el sulfato de condroitina y sus sales, y los polímeros de ácido acrílico. En ciertas realizaciones, la formulación tiene una viscosidad entre 1 y 400 cP
La formulación puede envasarse para uso monodosis o multidosis, por ejemplo, en un frasco con un cuentagotas asociado o como un conjunto de cuentagotas de un solo uso. La formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, para prevenir la contaminación microbiana y fúngica durante su uso. Algunos conservantes ejemplares son: cloruro de benzalconio, clorobutanol, bromuro de benzododecinio, metilparabeno, propilparabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico y policuaternio-1, y pueden incluirse en una concentración de 0,001 a 1,0% p/v. También es posible proporcionar una formulación que contenga un agente de unión a receptores que sea estéril pero sin conservantes. La formulación puede prepararse para su aplicación en un solo uso.
Los envases oftálmicos pueden utilizarse para proporcionar un contacto prolongado de una formulación oftálmica con el ojo. Se empapa una gasa de algodón con la formulación y se introduce en el fórnix superior o inferior. También puede administrarse un agente de unión a receptores mediante iontoforesis, pero esto no se reivindica. Este procedimiento mantiene la solución en contacto con la córnea en un ocular que lleva un electrodo. La difusión del fármaco se efectúa por diferencia de potencial eléctrico.
Un agente de unión a receptores también puede administrarse por medio de inyección, por ejemplo, inyección subconjuntival, pero esto no se reivindica. La formulación puede inyectarse bajo la conjuntiva facilitando el paso a través de la esclerótica y hacia el interior del ojo por simple difusión. La formulación también puede inyectarse por debajo de la conjuntiva y la cápsula de Tenon subyacente en la parte más posterior del ojo para administrar el agente al cuerpo ciliar, la coroides y la retina. La formulación también puede administrarse mediante inyección retrobulbar, pero esto no se reivindica.
Con respecto al ojo seco y otros trastornos de la superficie, los individuos pueden ser evaluados mediante el uso de uno o más de los siguientes enfoques: el Índice de Enfermedad de la Superficie Ocular (OSDI), la tinción corneal y conjuntival, y la prueba de Schirmer.
El Índice de Enfermedades de la Superficie Ocular (OSDI) es un cuestionario de 12 preguntas que proporciona una evaluación rápida de los síntomas de irritación ocular compatibles con los trastornos inflamatorios de la superficie ocular, incluido el DES, y su impacto en el funcionamiento relacionado con la visión. Véase, por ejemplo, Ocul Immunol Inflamm. 2007 Sep-Oct;15(5):389-93. Los 12 ítems del cuestionario OSDI se califican en una escala de 0 a 4. Las puntuaciones se obtienen a partir de las respuestas para proporcionar una puntuación OSDI en una escala de 0 a 100, en la que las puntuaciones más altas representan una mayor discapacidad. Un cambio negativo con respecto al valor inicial indica una mejora de la función relacionada con la visión y los trastornos inflamatorios oculares.
Tinción corneal y conjuntival: La tinción corneal es una medida de la enfermedad epitelial, o rotura de la barrera epitelial de la superficie ocular, que suele observarse en los trastornos inflamatorios de la superficie ocular, como el ojo seco. Puede existir tinción corneal incluso sin ojo seco clínicamente evidente, si hay una enfermedad significativa del párpado, como blefaritis posterior. La tinción corneal está altamente correlacionada con las molestias oculares en muchos pacientes, aunque no en todos; en general, la tinción corneal se asocia con puntuaciones altas en el OSDI, como se ha descrito anteriormente. Para la tinción corneal con fluoresceína, se utilizan tiras de fluoresceína humedecidas en solución salina o solución de fluoresceína sódica al 1% para teñir la película lagrimal. A continuación, se examina toda la córnea mediante evaluación con lámpara de hendidura con un filtro de barrera amarillo (Wratten n° 12) e iluminación azul cobalto. La tinción se clasifica según el esquema de Oxford. La tinción conjuntival es igualmente una medida de la enfermedad epitelial o de la ruptura de la barrera epitelial de la superficie ocular. La tinción conjuntival se realiza bajo la lámpara de hendidura con verde de lisamina. Se utiliza una tira humedecida en solución salina o una solución verde de lisamina al 1% para teñir la película lagrimal, y la tinción conjuntival interpalpebral se evalúa más de 30 segundos pero menos de 2 minutos después. Utilizando luz blanca de intensidad moderada, se clasifica únicamente la región interpalpebral de la tinción conjuntival nasal y temporal utilizando el esquema de Oxford.
Test de Schirmer: La prueba de Schirmer se lleva a cabo en presencia y en ausencia de anestesia colocando una tira estrecha de papel de filtro (tira de 5x35 mm de papel de filtro Whatman n° 41) en el fondo de saco inferior. Esta prueba se realiza en una habitación poco iluminada. El paciente cierra suavemente los ojos hasta que transcurren cinco minutos y se retiran las tiras. Dado que el frente lagrimal seguirá avanzando unos milímetros después de haber sido retirado de los ojos, el frente lagrimal se marca con un bolígrafo exactamente a los cinco minutos. La producción de lágrima acuosa se mide por la longitud en milímetros que moja la tira durante 5 minutos. Los resultados de 10 mm o menos en la prueba de Schirmer sin anestesia y de 5 mm o menos en la prueba de Schirmer con anestesia se consideran anormales. Un cambio positivo con respecto al valor basal indica una mejoría de uno o más síntomas de un trastorno inflamatorio ocular descrito en el presente documento.
Formulaciones y procedimientos de administración pulmonar
Un agente de unión a receptores como se define en las reivindicaciones puede formularse para administración pulmonar inhalatoria o de otro modo, por ejemplo, para administrar el agente a un tejido del tracto respiratorio, por ejemplo, el tracto respiratorio superior e inferior. Los tres sistemas habituales que pueden utilizarse para administrar agentes localmente en las vías respiratorias pulmonares son los inhaladores de polvo seco (IPS), los inhaladores dosificadores (IDM) y los nebulizadores. Los IDM pueden utilizarse para administrar agentes de unión a receptores en forma solubilizada o como dispersión. Por lo general, los IDM contienen freón u otro propulsor con una presión de vapor relativamente alta que impulsa la medicación en aerosol hacia las vías respiratorias al activar el dispositivo. Por el contrario, los IPS se basan generalmente en los esfuerzos inspiratorios del paciente para introducir un medicamento en forma de polvo seco en los pulmones. Los nebulizadores forman un aerosol medicamentoso que se inhala impartiendo energía a una solución líquida. El agente puede almacenarse en forma liofilizada (por ejemplo, a temperatura ambiente) y reconstituirse en solución antes de la inhalación.
La administración pulmonar directa de fármacos durante la ventilación líquida o el lavado pulmonar utilizando un medio fluoroquímico también son posibles modos de administración. Estos y otros procedimientos pueden utilizarse para administrar el agente de unión al receptor, pero no se reivindica. Por ejemplo, el agente se administra en una forma de unidad de dosificación de al menos aproximadamente 0,02, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 10, 20, 40 o 50 mg/puff o más.
El agente de unión al receptor puede administrarse convenientemente en forma de una presentación en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dielilorotetrafluoroctiliane, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo del agente aglutinante del receptor y una base en polvo adecuada, como lactosa o almidón, si la partícula es una partícula formulada. Además del agente de unión a receptores formulado o no formulado, pueden mezclarse otros materiales, como DPPC al 100% u otros tensioactivos, para favorecer el suministro y la dispersión del agente de unión a receptores formulado o no formulado. El tamaño de las partículas también puede variarse para controlar si se administran a las vías respiratorias inferiores o superiores. Por ejemplo, pueden utilizarse partículas de un tamaño comprendido entre 1 y 5 micrones o entre 10 y 50 micrones para las vías respiratorias inferiores y superiores, respectivamente.
A fin de mejorar aún más la administración pulmonar, pueden utilizarse potenciadores de la administración, tales como los tensioactivos. Un tensioactivo suele ser un compuesto con una fracción hidrófila y otra lipófila, que favorece la absorción de un fármaco al interactuar con una interfase entre dos fases inmiscibles. Los tensioactivos son útiles en las partículas secas por varias razones, por ejemplo, la reducción de la aglomeración de partículas y la reducción de la fagocitosis de macrófagos. Los tensioactivos son bien conocidos en la técnica e incluyen fosfoglicéridos, p. ej, fosfatidilcolinas, L-alfa-fosfatidilcolina dipalmitoil (DPPC) y difosfatidilglicerol (DPPG); hexadecanol; ácidos grasos; polietilenglicol (PEG); polioxietileno-9-; auril éter; ácido palmítico; ácido oleico; trioleato de sorbitán (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxómero; éster de ácido graso de sorbitán; trioleato de sorbitán; tiloxapol; y fosfolípidos.
También se presentan en la presente memoria, pero no se reivindican, anticuerpos que reconocen específicamente un dominio de citoquina quimérico descrito en la presente memoria. Por ejemplo, dichos anticuerpos se unen preferentemente a un dominio quimérico en relación con cualquier dominio de citoquina parental. Por ejemplo, un anticuerpo específico puede unirse a un epítopo que incluye una unión entre un segmento de una primera citoquina parental y una segunda citoquina parental.
Administración de ácidos nucleicos
Se puede proporcionar un agente de unión a receptores a un individuo por medio de la administración de un ácido nucleico que codifica y puede expresar el agente de unión a receptores, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de unión al receptor puede colocarse bajo el control de secuencias de control de la transcripción y situarse en un vector de ácido nucleico para la administración de genes, por ejemplo, un vector viral, pero esto no se reivindica. Entre los vectores virales ejemplares se incluyen los adenovirales, retrovirales o adenoasociados. Los vectores pueden tener forma de plásmido o de molécula lineal, por ejemplo, un ADN lineal de doble cadena. El ácido nucleico administrado puede diseñarse para incorporarse al genoma de la célula diana, por ejemplo, para integrarse en el genoma de la célula diana. Alternativamente, el ácido nucleico administrado puede diseñarse de forma que, tras la administración, exista de forma autónoma en la célula. Las secuencias de control transcripcional pueden diseñarse para proporcionar una expresión transitoria o constitutiva. El control transitorio puede incluir el control regulado por un agente exógeno, por ejemplo, mediante el uso de elementos de respuesta transcripcional para factores de transcripción que responden a agentes exógenos (por ejemplo, una hormona esteroidea o FK506) o señales ambientales.
La expresión de los genes proporcionados en el ácido nucleico suministrado puede evaluarse, por ejemplo, por medio de la detección de la proteína codificada por el gen (por ejemplo, utilizando anticuerpos) o por medio de la detección del ARNm, por ejemplo, mediante el uso de PCR o hibridación Northern. El ácido nucleico suministrado se diseña generalmente de modo que el ADN regulador transcripcional y traslacional se sitúe adecuadamente en relación con la secuencia codificante para el agente de unión al receptor, de modo que se inicie la transcripción y se traduzca la proteína a partir del mensaje resultante. El ácido nucleico puede incluir secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcionales y traslacionales de células de mamíferos, en particular humanos. Dichas secuencias incluyen, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada translacional y secuencias potenciadoras o activadoras.
Además, el vector de expresión puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, para integrar vectores de expresión, el vector de expresión puede contener al menos una o dos secuencias homólogas al genoma de la célula huésped, por ejemplo, flanqueando la construcción de expresión. El vector integrador puede dirigirse a un locus específico de la célula huésped seleccionando la secuencia homóloga adecuada para su inclusión en el vector. Las construcciones para integrar vectores son bien conocidas en la técnica.
Los vectores adenovirales ejemplares incluyen versiones modificadas de adenovirus humanos tales como Ad2 o Ad5, en los que se han eliminado los elementos genéticos necesarios para que el virus se replique in vivo. Por ejemplo, se puede eliminar la región E1 y modificar el genoma para que acepte un casete de expresión que codifique el agente de unión a receptores.
Los vectores retrovirales ejemplares incluyen LNL6, LXSN, LNCX y vectores lentivirales. Pawliuk et al. describen vectores lentivirales específicos. (2001) Science 294:2368 e Imren et al. (2002) PNAS 99:14380 e incluyen, entre otros, el virus de la inmunodeficiencia humana (por ejemplo, VIH-1, VIH-2), el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), el virus de la inmunodeficiencia simia (VIS), el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) y el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE). Estos vectores pueden construirse y diseñarse para que sean seguros, por ejemplo, separando los genes esenciales (p. ej., gag y pol ) en vectores separados y haciendo que la replicación del retrovirus sea defectuosa. El retrovirus de replicación defectuosa se empaqueta entonces en viriones mediante el uso de un virus ayudante o una línea celular de empaquetamiento, mediante técnicas estándar. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes e infectar células in vitro o in vivo con dichos virus pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. El vector retroviral puede incluir, además de secuencias para expresar un agente de unión a receptores, una LTR retroviral izquierda (5'); un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de respuesta inversa (RRE); un promotor, y una región de control de locus (LCR) u otra secuencia aislante transcripcional y una LTR retroviral derecha (3'). Los vectores retrovirales pueden contener además un tracto central polipurínico (cPPT) o un colgajo de ADN para aumentar los títulos virales y la eficacia de la transducción.
El ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica un agente de unión a receptores puede administrarse a cualquier célula diana adecuada, por ejemplo, ex vivo o in vivo, pero esto no se reivindica. Células diana ejemplares incluyen células sinoviales, hematopoyéticas, dérmicas, etc. El ácido nucleico puede administrarse a células diana asociadas al ojo, por ejemplo, células epiteliales de la córnea. La administración puede incluir el desbridamiento o raspado del epitelio corneal para exponer una capa basal de epitelio. A continuación, se añade el ácido nucleico a administrar. Por ejemplo, el ácido nucleico se administra a células endoteliales de la córnea, células de la malla trabecular situada bajo la periferia de la córnea, células de la capa coroidea del ojo, células de la retina, la esclerótica o el cuerpo ciliar, células de la vasculatura retiniana u ocular, o células del cuerpo vítreo o células del cristalino, por ejemplo el epitelio del cristalino.
Los procedimientos de administración que se describen en el presente documento pero que no se reivindican incluyen, por ejemplo, la infección retrovírica, la infección adenovírica, la transformación con plásmidos, la transformación con liposomas que contienen ácido nucleico exógeno, la administración biolística de ácido nucleico (por ejemplo, cargar el ácido nucleico en partículas de oro o de otro metal y disparar o inyectar en las células), la infección por virus adenoasociado y la infección por el virus de Epstein-Barr. La administración puede realizarse en células o tejidos por cualquier procedimiento, tal como inyección con aguja, hipoaspersión, electroporación o pistola génica.
Pueden encontrarse otros procedimientos de administración de genes en, por ejemplo, Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (2000) Curr.
Opinen. Lipidol. 11:179-86; Thule, P M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y Acad. Sci.
716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; y Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.
Segundos agentes ejemplares
La invención proporciona una composición farmacéutica como se define en las reivindicaciones adjuntas para su uso en el tratamiento del cáncer. En ese uso, el agente de unión a receptores definido en las reivindicaciones puede administrarse con un segundo agente. Los dos agentes pueden administrarse conjuntamente o por separado, por ejemplo, utilizando regímenes diferentes. Los segundos agentes ejemplares incluyen un agente antiinflamatorio. En una realización, el segundo agente es un antagonista de IL-17 (que abarca antagonistas de todos los miembros de la familia IL-17, por ejemplo, antagonistas de IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E). Los antagonistas ejemplares de la IL-17 incluyen: agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-17 (incluyendo IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E) y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-17, tales como IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene IL-17 y al menos una subunidad receptora, por ej.g., IL-17 y II-17RA, o IL-17, IL-17RA, e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; y agentes tales como receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-17RA e IL- IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17.
En otra realización, el segundo agente es un antagonista de IL-12. Los antagonistas ejemplares de la IL-12 incluyen: agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-12 (incluyendo p35 y p40) y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores para IL-12, tales como IL- 12Rp1 o IL-12Rp2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene p35, p40 y al menos una subunidad receptora, e.g., IL-12Rp1 o IL-12Rp2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; y agentes como receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-12Rp1 o IL-12Rp2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12.
En otra realización, el segundo agente es un antagonista de la IL-23. Algunos ejemplos de antagonistas de la IL-23 son: agentes (tal como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a la IL-23 (incluyendo p19 y p40) y que antagonizan la señalización mediada por la IL-23; agentes (tal como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de la IL-23, como IL-12Rp1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por la IL-23; agentes (tal como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene p19, p40 y al menos una subunidad receptora, por ej.g., IL-12Rp1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; y agentes como receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-12Rp1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23.
Se han descrito anticuerpos ejemplares contra la IL-23. Véase, por ejemplo, Beyer et al., J. Mol. Biol. (2008), doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001.
Modelos animales
Un agente de unión a receptores puede evaluarse en un modelo animal para una enfermedad humana, por ejemplo, una enfermedad autoinmune humana y/o una enfermedad inflamatoria humana, pero esto no se reivindica. El agente puede tener especificidad para la proteína diana correspondiente en el animal.
Modelos de artritis reumatoide. Un agente de unión a receptores puede evaluarse en un modelo animal de artritis reumatoide, por ejemplo, el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), pero esto no se reivindica. Véase, por ejemplo, Mclndoe etal., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214; Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569; y Current Protocols in Immunology, Unit15.5, Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. El modelo se produce por medio de la inmunización de cepas susceptibles de rata/ratón con colágeno nativo de tipo II. El colágeno se emulsiona en adyuvante completo de Freund (CFA) y se inyecta por vía intradérmica (100 |jg de colágeno:100 jg de CFNratón) en la base de la cola. Los ratones de control se inyectan intradérmicamente con 0,05 ml de emulsión de agua destilada/CFA. Se administra una inyección de refuerzo de colágeno en adyuvante incompleto 21 días después de la inmunización inicial. La enfermedad se debe a una respuesta autoinmune inducida tras la inmunización con colágeno.
Las articulaciones pueden puntuarse para detectar artritis, inflamación, pannus, daños en el cartílago y reabsorción ósea mediante el uso de una escala definida. Por ejemplo, la gravedad de la artritis puede puntuarse del siguiente modo: 0=sin efectos visibles de la artritis; 1=edema y eritema de un dedo o articulación; 2=edema y eritema de dos articulaciones; 3=edema y eritema de más de dos articulaciones; 4=artritis grave de toda la pata y los dedos, acompañada de anquilosis del tobillo y deformidad de la extremidad. La puntuación de cada extremidad se suma y se registra como el índice artrítico (Al) de cada animal. También pueden utilizarse otros sistemas de puntuación para estos y otros criterios.
Esclerosis múltiple. La encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es un modelo murino útil para la esclerosis múltiple. Se puede evaluar un agente de unión a receptores en el modelo de EAE, pero eso no se reivindica. La EAE es un trastorno autoinmune mediado por células T que se caracteriza por la inflamación de células T y mononucleares y la posterior desmielinización de los axones del sistema nervioso central. (Véase, por ejemplo, Bolton, C., 1995, Multiple Sclerosis, 143.) Pueden encontrarse protocolos ejemplares en Current Protocols in Immunology, Unit 15.1 y 15.2; Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. También se dispone de modelos para la enfermedad de la mielina en los que se injertan oligodendrocitos o células de Schwann en el sistema nervioso central, por ejemplo, como se describe en Duncan et al., 1997, Molec. Med. Hoy, 554-561.
Aloinjerto. Un agente de unión a receptores puede evaluarse en un modelo animal de rechazo de aloinjertos cutáneos, por ejemplo, mediante el uso de injertos de piel de cola murinos, pero eso no se reivindica. El rechazo de aloinjertos cutáneos está mediado por células T, células T auxiliares y células T asesinas-efectoras. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Unidad 4.4; Coligan et al. (eds.), 1995, John Wiley & Sons, Inc. También pueden utilizarse otros modelos de rechazo de trasplantes. Véase, por ejemplo, Tinubu et al., 1994, J. Immunol., 4330-4338.
Modelos de IBD y colitis. Un modelo ejemplar para la enfermedad inflamatoria intestinal es el uso de células CD4+ CD45Rb-altas transferidas a ratones SCID, pero esto no se reivindica. Véase, por ejemplo, Hirano et al., J Pharmacol Sci. 2009 Jun;110(2):169-81 y el uso de ratones transgénicos deficientes en IL-10. Véase, por ejemplo, Inaba et al., Inflamm Bowel Dis., DOI: 10.1002/ibd.21253 (2010). Otro modelo ejemplar de colitis emplea dextrano sulfato sódico (DSS) para inducir colitis aguda, pero no se reivindica. Por ejemplo, se puede inducir colitis en ratones mediante la administración de DSS al 5% (peso/vol) (masa molecular 30-40 kDa; ICN Biomedicals, Aurora, OH) en agua de bebida ad libitum. Los síntomas resultantes de este tratamiento son diarrea sanguinolenta, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por la infiltración de células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño focal de las criptas y ulceración epitelial. Se cree que estos cambios se desarrollan debido a un efecto tóxico del DSS sobre el epitelio y por la fagocitosis de las células de la lámina propia y la producción de TNF-alfa e IFN-gamma. Véase, por ejemplo, Hassan et al. PLoS One. 2010 Ene 25;5(1):e8868.
Modelos de enfermedad del ojo seco. Un agente de unión a receptores puede evaluarse en un modelo de ratón para la enfermedad del ojo seco, pero eso no se reivindica. El ojo seco puede inducirse en ratones mediante la inyección subcutánea de escopolamina y la posterior colocación de los ratones en cámaras de ambiente controlado. A modo de ejemplo concreto, se puede inducir la sequedad ocular en ratones C57BL/6 hembra de 6 a 10 semanas de edad, sanos y normales, mediante la exposición continua a un ambiente seco en una cámara ambiental controlada. La cámara tiene una humedad relativa baja, inferior al 30% (generalmente en torno al 19%), un caudal de aire elevado (15 litros/minuto) y una temperatura constante (en torno a 22°C). Los ratones colocados en la cámara también son tratados con escopolamina para inhibir la secreción lagrimal. Los parches transdérmicos de liberación sostenida de escopolamina pueden obtenerse de Novartis (Summit, N.J.). Se aplica una cuarta parte de un parche en la cola media depilada de los ratones cada 48 horas. La combinación de la cámara de ambiente controlado y la escopolamina produce sequedad ocular grave en un periodo de tiempo relativamente corto (aproximadamente 2-4 días). La cámara ambiental controlada puede prepararse como se describe en Barbino et al., Invest. Oftal. Vis. Sci., 46: 2766-2711 (2005), y permite controlar el flujo de aire, la humedad y la temperatura.
Los ratones pueden ser monitorizados para detectar signos de ojo seco, por ejemplo, realizando: a) la prueba del hilo de algodón para medir la producción de lágrima acuosa, que suele estar disminuida en pacientes con ojo seco; b) la tinción corneal con fluoresceína, que es un marcador de daño en la superficie corneal; y un examen oftalmológico general.
Prueba del hilo de algodón: La producción de lágrimas puede medirse con una prueba de hilo de algodón impregnado de rojo fenol (Zone-Quick, Lacrimedics, Eastsound, Wash.). Bajo una lámpara fluorescente de aumento, se sujeta el hilo con unas pinzas de joyero y se coloca en el cantus lateral del fórnix conjuntival del ojo derecho durante 30 o 60 segundos. La distancia lagrimal en mm se lee al microscopio utilizando la escala de un hemocitómetro.
Tinción corneal con fluoresceína: La tinción corneal con fluoresceína puede evaluarse aplicando 1,0 p.l de fluoresceína al 5% por medio de una micropipeta en el saco conjuntival inferior del ojo. La córnea se examina con un biomicroscopio de lámpara de hendidura utilizando luz azul de cobalto 3 minutos después de la instilación de fluoresceína. La tinción punteada se registra de forma enmascarada utilizando un sistema de graduación estandarizado del Instituto Nacional del Ojo (NEI) de 0-3 para cada una de las cinco zonas en las que se ha dividido la superficie corneal.
Diagnóstico y otros usos
Un agente de unión a receptor descrito en el presente documento puede utilizarse para detectar IL-1 IL-1R1 en una muestra, o células que expresen dicho receptor, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, el agente tal como se define en las reivindicaciones anexas puede marcarse directa o indirectamente con una fracción que sea una etiqueta o produzca una señal, por ejemplo, una enzima, una radiomarcación, un epítopo o una proteína fluorescente (tal como la proteína verde fluorescente). El agente puede ponerse en contacto con una muestra o con células para determinar si el receptor está presente en la muestra o en las células, por ejemplo, mediante inmunotransferencia estándar, inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), transferencia de energía de fluorescencia, transferencia Western y otras técnicas de diagnóstico y detección.
El agente de unión al receptor también puede marcarse para su detección in vivo y administrarse a un individuo, pero esto no se reivindica. Se pueden obtener imágenes del sujeto, por ejemplo, mediante RMN u otros medios tomográficos. Por ejemplo, el agente de unión puede marcarse con un radiomarcador tal como 131I, 111In, 1231,99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C, and 188Rh, marcadores fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina, marcadores activos de resonancia magnética nuclear, isótopos emisores de positrones detectables por medio de un escáner de tomografía por emisión de positrones ("PET"), quimioluminiscentes tales como luciferina y marcadores enzimáticos tales como peroxidasa o fosfatasa. El agente puede ser marcado con un agente de contraste como los agentes paramagnéticos y ferromagnéticos o superparamagnéticos (que alteran principalmente la respuesta T2) Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para purificar células que expresen el receptor al que se une, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, el agente de unión al receptor definido en las reivindicaciones anexas puede acoplarse a un soporte inmovilizado (por ejemplo, perlas magnéticas o una matriz de columna) y ponerse en contacto con células que pueden expresar el receptor. El soporte puede lavarse, por ejemplo, con un tampón fisiológico, y las células pueden recuperarse del soporte.
Un agente de unión a receptores también puede utilizarse para purificar formas solubles del receptor al que se une, pero esto no se reivindica. Por ejemplo, las muestras que contienen el receptor soluble pueden ponerse en contacto con el agente de unión al receptor inmovilizado y luego, por ejemplo, después del lavado, pueden recuperarse del agente inmovilizado.
Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran mejor las realizaciones de las invenciones descritras en la presente memoria.
Ejemplos
Ejemplo 1
Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas con las secuencias de aminoácidos enumeradas en la Tabla 4 (más abajo) se construyeron en un vector pET que contenía un promotor T7 y genes de resistencia a la ampicilina (serie pET31) o a la kanamicina (serie pET28) (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, EE.UU.), y se expresaron. En la Tabla 5 se ofrecen ejemplos de secuencias codificantes que pueden utilizarse para la expresión.
Tabla 4
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En la Tabla 5 se enumeran secuencias ejemplares de ácido nucleico que codifican las proteínas mencionadas. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye además un ATG anterior al primer nucleótido enumerado a continuación. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye además un codón de terminación (tal como TAA, TAG o TGA) después del último nucleótido enumerado a continuación.
Tabla 5
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Las proteínas pueden incluir una serie de residuos diferentes de IL-1p e IL-1 Ra, como se ilustra a continuación. Entre los ejemplos P01, P02, P03, P04 y P05, los dominios de citoquina pueden tener un 48-70% de residuos de IL-1p y un 55-78% de residuos de IL-1 Ra. (Dado que varios residuos de aminoácidos se conservan entre las dos proteínas, la suma del porcentaje de identidad con la IL-1 p y con la IL-1 Ra puede ser superior al 100%)
Tabla 6
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Ejemplo 2
Las proteínas que contienen una etiqueta de hexa-histidina se expresaron en células de E. coli cepa BL21(DES) por medio de inducción con 1 mM de IPTG a 37°C durante 3 horas en medio de caldo LB. Las células se lisaron en 20­ 50 mM Tris, 0,5 M NaCl, 2,5 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, pH 8,0. Los lisados se sometieron a cromatografía IMAC mediante el uso de una columna preempaquetada HiTrap® (GE Healthcare, Piscataway NJ, EE.UU.). La proteína se cargó en un tampón de 20 mM de fosfato sódico, 0,5 M NaCl 10 mM de imidazol, pH 7,4. Se eluyó con un tampón de 200 mM de imidazol, 20 mM de fosfato sódico, 0,5 M de NaCl pH 7,4. La proteína eluida se dializó extensamente contra PBS, 0,1% Polisorbato 80, pH 7,4, se concentró mediante el uso de un filtro Amicon Ultra® (10K) y se almacenó a 4° u-80°C.
Las proteínas que carecían de la etiqueta hexa-histidina se purificaron por medio de cromatografía de intercambio iónico. La proteína P05 se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico. El lisado de las células expresantes se aplicó a una columna GigaCapS™ (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA, EE.UU.) a pH bajo (aproximadamente pH 5,5) en ausencia de sal (conductividad de aproximadamente 1 mS/cm). A continuación, la columna se eluyó mediante un gradiente de pH (tampón A = 10 mM de ácido acético, pH 5,5; tampón B = 20 mM de Tris, pH 8). A continuación se diluyó una fracción de 5 ml que contenía la proteína eluida con 5 ml de H20 y 5 ml de Tris 20 mM pH 8) y luego se aplicó a la resina CaptoQ™ (GE Healthcare, Piscataway NJ, EE. UU.) y se eluyó con una concentración de 0 mM a 250 Gradiente de NaCl mM en Tris 20 mM pH 8,0. La proteína eluida se dializó extensamente contra 1,25 X PBS 0,1% TWEEN® 80 o 1,25X PBS sin TWEEN® y se almacenó. Véase la Fig. 6. Las proteínas P03 y P04 se purificaron utilizando procedimientos similares.
Las células que expresan P05 también se cultivaron en TEKNOVA™ Terrific Broth con soja libre de animales (# T7660) suplementado con 10 g/L de glucosa, 10 mM MgSO4, oligoelementos (1 mg/ml de TEKNOVA™ 1000X Trace Elements, #T1001) y antibiótico en un Sartorius 2L BIOSTAT™ A+ y se indujeron a OD 35-40 con IPTG 1 mM durante aproximadamente 6 horas. Las células se cultivan a 37°C con un 30% de oxígeno disuelto a pH 7,0, y agitación a 200-800 rpm con inyección de oxígeno a 2L/min. Las células se alimentan con 9 g de glucosa/L/hora cuando la glucosa se agota, lo que se detecta por un aumento del pH. La alimentación se reduce a 6 g de glucosa/L/hora cuando disminuye el pH (unas 2,5 h después de la inducción).
Se recogieron las células y se lisaron en tampón de lisis (20 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,1% Triton, pH 8,0; 20 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,1% Triton, pH 7,0; 50 mM MOPS, 10 mM EDTA, 0,1% Triton, pH 6,5; o 50 mM MOPS, 10 mM EDTA, 0. 1% Tritón, pH 6,0). El lisado se carga en un medio de intercambio iónico de cationes PorosXS® (Life Technologies Corp., Carlsbad CA EE.UU.) a pH 5,3 y 3 mS/cm (35 mg de producto por ml de resina de columna).
En un procedimiento ejemplar, la proteína P05 se eluye por medio de una etapa a pH 7,0 mediante el uso de un tampón que contiene 100 mM MOPS 25 mM NaCl pH 7,0. El primer pico de elución se descartó, y el segundo pico de elución se recogió en pools y contenía la proteína P05. Los primeros pools están enriquecidos en proteína P05 intacta en relación con una especie des-Ala. A continuación, este material eluido se hace fluir sobre la resina de intercambio aniónico CaptoQ™. Se recoge el flujo, que contiene la proteína P05 intacta.
En otro procedimiento ejemplar, el medio se lava con 100 mM MOPS 20 mM NaCl pH 6.0. La proteína P05 se eluye por medio de una etapa a pH 6,0 mediante el uso de un tampón que contiene 100 mM MOPS 50-58 mM NaCl pH 6,0. El primer pico de elución se separó de los picos siguientes y contenía la proteína P05 intacta. A continuación, este material eluido se hace fluir sobre la resina de intercambio aniónico CaptoQ™. Se recoge el flujo, que contiene la proteína P05 intacta.
Ejemplo 3
Las proteínas o los sobrenadantes que contenían las proteínas se evaluaron en un ensayo en base a células para la actividad de IL-1. Se utilizaron células HEK-Blue™ sensibles a la IL-1p para monitorizar la actividad de la IL-1p (disponibles en InvivoGen Inc., San Diego CA, EE.UU.). Estas células incluyen un gen reportero SEAP bajo el control del promotor mínimo IFN-p fusionado a cinco sitios de unión NF-kB y cinco AP-1. La activación de los receptores de IL-1 p en la superficie celular conduce a la activación de NF-kB y a la producción de SEAP. El informe SEAP puede detectarse, por ejemplo, mediante el uso de QUANTI-Blue™ (InvivoGen Inc., San Diego CA, EE.UU.) y análisis espectrofotométrico. Se preparó una suspensión de células HEK-Blue IL-1 p a partir de células cultivadas hasta un 70-80% de confluencia. Las células resuspendidas se ajustaron a ~330.000 células/ml en medio de crecimiento fresco (DMEM, 4,5 g/l de glucosa, 2 mM de L-Glutamina, 10% (v/v) de suero fetal bovino inactivado por calor (30 min a 56°C), 50 U/ml de penicilina, 50 |j.g/ml de estreptomicina, 100 |j.g/ml de NormocinT).
Los reactivos se añadieron a los pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano: 10 μl de IL-1 p a 20 ng/ml, 1^ μl del agente de interés y 30 μl de medio de cultivo celular hasta un volumen final de 50 μl. Las muestras de los controles positivo y negativo se prepararon en paralelo. A continuación, se añadieron 150 μl de suspensión de células HEK-Blue IL-1 p (~50.000 células) a cada pocillo y la placa se cultivó durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos con CO2 al 5 %. En general, la concentración final de IL-1p (en el volumen final de 200 μl) fue de 0,1 ng/ml. La actividad de la IL-1 p se evaluó al día siguiente (12-15 horas después). Antes de la cuantificación, se preparó el reactivo QUANTI-Blue™ siguiendo las instrucciones del fabricante. Se preparó una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo plano en la que se añadieron 150 p.l de solución QUANTI-Blue™ a cada pocillo. Se añadieron 50 μl de medio condicionado de los pocillos de la placa de cultivo tisular de 96 pocillos a cada pocillo de la placa de ensayo. La placa se incubó a 37°C durante aproximadamente 15-20 minutos. A continuación, se midieron los niveles de SEAP con un espectrofotómetro a 620-655 nm.
Resultados. Como se muestra en la FIG. 7A, en este ensayo, la proteína P06 se comportó como un agonista de IL-1RI RI, la proteína P07 se comportó como un agonista parcial, y la proteína P01 no agonizó. De hecho, la proteína P01 se comportó como un antagonista cuando se ensayó en presencia de IL-1 p. La Fig. 7B muestra el antagonismo de la actividad de IL-1 p por P01 en un intervalo de concentraciones de proteína IL-1p mediante el uso del ensayo de células HEκΒlue™ anterior. El antagonismo aumentó con cantidades crecientes de P01 (el eje x refleja los microlitros de sobrenadante que contienen P01).
Cada una de las proteínas P01, P02, P03, P04 y P05 antagonizó la actividad de la IL-1 p. Véanse las FIG. 8A y 8B, por ejemplo. El IC50 del P05 era inferior a aproximadamente 5 ng/ml. Se probó la capacidad de P05 para agonizar IL-1RI RI en este ensayo y no se observó que tuviera ninguna actividad agonística detectable incluso a las concentraciones más altas probadas, 1 mg/ml. P01, P02, P03, P04 y P05 también inhibieron la expresión de IL-6 inducida por IL-1 p en células MG-63, una línea celular de osteosarcoma humano que responde a IL- 1p. En un modelo murino de la enfermedad del ojo seco, se observó que el P05 marcado con hexa-histidina tenía actividad biológica. Véase también el Ejemplo 8 a continuación en relación con el P05 no etiquetado.
Ejemplo 4
Las propiedades de unión de las proteínas a la IL-1RI humana recombinante soluble (correspondiente al dominio extracelular de la IL-1RI) se evaluaron mediante el uso de resonancia de plasmón superficial con un sistema SPR Reichert SR7000DC Dual Channel. La unión se evaluó en solución salina tamponada con fosfato con 0,005% de Tween 20. Se observó que la IL-1 p tenía una Kd de entre 8-9 nM y una constante de disociación (Kd) de entre 2-3 * 10'3 s-1, y en otro experimento una Kd de aproximadamente 2 nM, una constante de asociación de 1,3-1,5 * 106 M 'V 1, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 2,9-3,0 * 10'3 s-1. Véase la Fig. 9A. La proteína P01 se unió con una cinética de asociación similar a la de IL-1 p, pero no se disoció durante la fase de disociación del experimento de unión (aproximadamente 180 segundos). De este modo, la proteína P01 se unió a la IL-1 RI con mayor afinidad que la IL-1p en condiciones similares.
Se observó que la unión de IL-1Ra tenía una Kd de aproximadamente 0,33 nM, una constante de asociación (Ka) de aproximadamente 2 * 105 M-1s-1 y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 6,6 * 10-5s-1 . Véase la Fig. 9B. Se observó que los dominios de citoquinas quiméricas P01, P02, P03, P04 y P05 tenían Kd que oscilaba entre aproximadamente 12 y 1700 μM, una constante de asociación (Ka) que oscilaba entre aproximadamente 3 * 104 M 'V 1 a 3 * 106 M-1s -1, y una constante de disociación (Kd) que oscila entre aproximadamente 2 * 10-5 a 1 * 10­ 3 s-1. Véanse por ejemplo las Fig. 9C y 9D y la Tabla 7 a continuación.
Tabla 7
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 5
Otras proteínas quiméricas ejemplares de la familia IL-1 son las siguientes:
P08 APVRSLAFRIW D VN QKTFYLRN N QLVAGYLQG PN VN LEEKFSM SFVQGEESN D SEQ ID NO: 32
K IPV A LG LK EK N LY LSC V LK D D K PTLQ LESV D PK N Y PK K K M EK RFV FN K IEIN NKLEFESAQFPNW FLCTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFYM QFVSS
P09 APVRSQAFRIW DVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSM SFVQGEESND SEQ ID NO: 33
K IPV A LG LK EK N LY LSC V LK D D K PTLQ LESV D PK N Y PK K K M EK RFV FN K IEIN NKLEFESAQFPNW FLCTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFYM QFVSS
P10 A PVRSLAFRIW D VN QKTFYLRN N QLVAGYLQG PN VN LEEKID VSFVQ GEESN D SEQ ID N O :34
K IPV A LG LK EK N LY LSC V LK D D K PTLQ LESV D PK N Y PK K K M EK RFV FN K IEIN NKLEFESAQFPNW FLCTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFYM QFVSS
P11 APVRSLN CRIW DVN Q KTFYLRN N QLVA GYLQGPN VN LEEKID VSFVQGEESN D SEQ ID NO: 35
K IPV A LG LK EK N LY LSC V LK D D K PTLQ LESV D PK N Y PK K K M EK RFV FN K IEIN NKLEFESAQFPNW FICTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFYM QFVSS
P12 APVRSLNCRIW DVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSM SFVQGEESND SEQ ID NO: 36
K IP V A LG L K E K N LY LSC V LK D D K PT1Q LESV D PK N Y PK K K M E K R FV FN K IEIN
NKLEFESAQFPNW FLCTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFTMQFVSS
P13 APVRSLAFRIW D VN QKTFYLRN N QLVAGYLQG PN VN LEEKFSM SFVQGEESN D SEQ ID NO: 37
K IPV A LG LK EK N LY LSC V LK D D K PTLQ LESV D PK N Y PK K K M EK RFV FN K IEIN NKLEFESAQFPNW FLCTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFYFQED
P14 APVRSLNCRIW DVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSM SFVQGEESND SEQ ID N O :38
K IPV A LG LK EK N LY LSC V LK D D K PTLQ LESV D PK N Y PK K K M EK RFV FN K IEIN NKLEFESAQFPNW FLCTAM EADQPVSLTNM PDEGVM VTKFYFQED
El polipéptido a continuación es un dominio quimérico que incluye al menos dos segmentos de IL-1a y al menos dos segmentos de IL-1Ra.
SA PFSFLSN V K YN FM RIIK YEFRIW D V N Q K TFYLRN N Q LV A G YLQ G PN VN LEEK F SEQ ID N O :39
D M G A Y K SSK D D A K IT V IL R ISK T Q L Y V T A Q D E D Q P V L L K E M P E IP K TIT G SE TN L LFFW ETHGTKNYFTSVAH PNLFLCTAM EADQ PVSLTNM PDEGVM VTKFYILENQ A
Ejemplo 6
Se puede construir un dominio quimérico de IL-1 permutado circularmente uniendo el N-terminal al C-terminal de la molécula mediante el uso de una secuencia enlazadora y seleccionando una nueva ubicación para cada uno de los terminales. Para las proteínas que tienen terminaciones derivadas de IL-1p, la longitud del enlazador puede estar entre cinco y diez, por ejemplo, aproximadamente siete aminoácidos. Las ubicaciones preferidas para los nuevos terminales se encuentran en los bucles que miran hacia fuera de los receptores, como el bucle p6-p7 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 71-80 de la SEQ ID NO:1) o el bucle p7-p8 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 84-99 de la SEQ ID NO:1).
Ejemplos de tales dominios quiméricos de IL-1 permutados circularmente incluyen:
DKPTLQLESVDPKN YPKKKM EKRFVFN KIEIN N KLEFESA QFPN W FLCTAM EADQ PVSLTN M PDEGVM VTK FYM Q FVSSGGSG GGSAPVRSLN CRIW D VN QKTFYLRN N Q LVAGYLQG PN VN LEEKFSM SFVQGEESN D KIP VA LG LKEKN LYLSCVLK D (S E Q ID N O :40 )
y
N YPK KKM EKRFVFN KIEIN N KLEFESAQFPN W FLCTAM EAD QPVSLTN M PDEGVM VTKFYM Q FVSSGGSGG GSA PVRSLN CRIW D VN Q KTFYLRN N Q LVA GYLQ GPN VN LEEK FSM SFVQ GEESN D KIPVA LGLKEK N LYLS CVLK D D KPTLQ LE5VD PK (SE Q ID N O : 41 )
Ejemplo 7
Las proteínas P03, P04, P05, mIL-1Ra (metionil IL-1Ra) e IL-1 p se prepararon en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4, a 0,5 mg/ml. Las proteínas se combinaron con el colorante naranja SYPRO (Invitrogen, CA) a una dilución 1:500 de la concentración madre y se sometieron a fluorimetría diferencial de barrido. Véase, por ejemplo, Hc et al. (2010) J. Pharm. Ciencias, 991707-1720. Las mediciones de fluorescencia se controlaron con una máquina QPCR Agilent Mx3005 a medida que se aumentaba la temperatura de 25 °C a 95 °C a razón de 1 °C por minuto. Los valores de la temperatura de fusión (Tm) se obtuvieron a partir del valor máximo de la primera derivada de la transición de fluorescencia. Se observó que las proteínas P03, P04 y P05 tenían un inicio de despliegue de más de 50 °C y tan alto como 59 °C, y Tm de más de 59, 60, 62 y 64 °C. Los resultados se muestran en la Tabla 8 a continuación y las FIG. 10A y 10B:
Tabla 8
Figure imgf000042_0001
P04 tiene una Tm que es aproximadamente 4 grados más alta que mIL-1Ra e IL-1 p y exhibe un inicio de despliegue aproximadamente 3 grados más alto que mlL-1Ra y aproximadamente 10 grados más alto que IL-1 p. P03 y P05 tienen una Tm que es unos 9 grados más alta que mlL-1Ra e IL-1 p y muestran un inicio de despliegue unos 11 grados más alto que mIL-1Ra y unos 18 grados más alto que IL-1 p.
Ejemplo 8
El P05 purificado (sin etiqueta de hexa-histidina) se preparó en 1,25x PBS y se probó en un modelo murino de enfermedad del ojo seco. En este modelo, ratones hembra C57BL/6 de 6 a 10 semanas de edad de los Laboratorios Jackson (aclimatados de 1 a 2 semanas en una sala de tenencia de animales con una humedad relativa superior al 30%, suplemento alimentario de hidrogel y enriquecimiento ambiental con secado ambiental) se sometieron previamente a tinción con fluoresceína el Día 0. Para la tinción con fluoresceína, se administró fluoresceína recién hecha diluida en WFI H2O a 10 mg/mL a 0,4 |jL en cada ojo. Aproximadamente 8-13 minutos después de la administración, se puntuaron los ojos utilizando un microscopio de disección fluorescente Olympus. La tinción punteada se registró utilizando el sistema de graduación estandarizado del Instituto Nacional del Ojo (NEI) de 0-3 para cada una de las cinco zonas en las que se ha dividido la superficie corneal (intervalo de puntuación 0-15/ojo). Utilizando un puente didáctico, dos evaluadores enmascarados evaluaron ratones al mismo tiempo para dar una única puntuación colectiva para cada ojo.
Los ratones con puntuaciones < 7 para cada ojo (de una puntuación máxima de 15) se colocaron en una cámara de ojo seco (20%± 2% de humedad y flujo de aire constante ~21 L/min/jaula) el día 1 y se mantuvieron en esta cámara durante el transcurso del experimento (excepto para el examen). El día 3, se volvió a puntuar a los ratones y se distribuyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento con 8 a 10 ratones/grupo. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente de forma que cada jaula de 4 a 5 ratones tuviera aproximadamente la misma puntuación media de la enfermedad. A partir del día 3 y después de la aleatorización, se administró tópicamente a los ratones P05 o vehículo (1,25X PBS) en un colirio a una frecuencia de 3 pL/ojo BID. Los ratones fueron examinados y puntuados en los días 7, 9 y 11 para la tinción corneal con fluoresceína, tal como se ha descrito anteriormente. Durante el experimento, los calificadores no conocían los grupos de tratamiento.
La Fig. 11A es un gráfico de barras de la puntuación media de tinción corneal ± SEM en los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones de dos experimentos idénticos bajo los siguientes tratamientos bid: ningún tratamiento, vehículo (1,25X PBS) y 10 mg/ml (1%) P05. 10 mg/ml de P05 redujeron significativamente la tinción de la córnea en los días 7, 9 y 11 del experimento. La eficacia, evaluada por la reducción de la tinción corneal, también se observó con dosis tan bajas como 0,1 mg/ml de P05. La IL-1 Ra recombinante producida en E. coli también redujo moderadamente la tinción corneal en el modelo animal.
Como se muestra en la FIG. 11B, el efecto de 10 mg/ml de P05 fue específico en base a una comparación con 10 mg/ml de albúmina de suero murino en el mismo vehículo. No se observó ningún efecto con 10 mg/ml de albúmina de suero murino (MSA) en relación con el vehículo, y el efecto de 10 mg/ml de P05 fue estadísticamente significativo en relación con 10 mg/ml de albúmina de suero murino. Como se muestra en la FIG. 11C, también se comparó 10 mg/ml de P05 con 0,05% de ciclosporina en una emulsión oftálmica (Restasis®). Mientras que la P05 redujo la tinción de la córnea, no se observó ningún efecto en la emulsión oftálmica de ciclosporina al 0,05% tras aproximadamente 1 semana de dosificación bid.
Ejemplo 9
Se ha desarrollado una etapa de captura para la purificación de P05 producido por fermentación en células E. coli BLR(DE3). Las condiciones de elución se definieron mediante un enfoque de diseño estadístico de experimentos (DOE) en una columna de 1 mL. Las condiciones optimizadas se realizaron a escala intermedia (columna de 10 mL). El producto se extrae por microfluidización en un tampón de lisis consistente en 20 mM de Tris a pH 7,0 con 10 mM de EDTA añadido. El lisado clarificado se ajusta a un pH de 5,3 y una conductividad de 3 mS/cm. El lisado acondicionado se carga en una columna PorosXS (resina de intercambio catiónico fuerte) con un tiempo de residencia de 2 min hasta una capacidad de 25-30 mg P05/mL. La columna se lava con tampón de equilibrio para eliminar las especies no unidas. Se realiza un segundo lavado a pH 6,0 y 3 mS/cm para eliminar una población de impurezas. El producto se eluye a pH 6,0 y 6,6 mS/cm. Una especie relacionada con el producto se eluye a pH 6,0 y 12.4 mS/cm. La columna se limpia con un tampón de alta salinidad y NaOH.
La P05 es una proteína de 17 kDa con un μl de 6,58. El μl de la especie des-ALA es de 6,8 y se resuelve fácilmente mediante cromatografía analítica de intercambio catiónico débil. Es probable que esta especie sea un producto de la actividad de la aminopeptidasa P que se encuentra en E. coli. Las especies pueden identificarse mediante espectroscopia de masas, mapeo de péptidos y procedimientos HPLC.
Materiales cromatográficos. PorosXS se basa en una perla reticulada de poli(estireno- divinilbenceno) con un tamaño de partícula nominal de 50 |μm. La matriz cromatográfica tiene una superficie química sulfopropílica y fue diseñada para tolerar niveles elevados de sal durante la unión. El material PorosXS (CN 4404339, Life Technologies) se adquirió como lodo a granel y se empaquetó en una columna Tricorn de 5x50 mm (CN 28-4064-09, GE Healthcare) con un volumen final de columna de 1 mL (altura del lecho de 5 cm) o en una columna Tricorn de 10x150 mm (CN 28-4064-16, GE Healthcare) empaquetada hasta un volumen final de 10,5 mL (altura del lecho de 13.4 cm).
Tampones. Todos los tampones se prepararon volumétricamente con agua MilliQ. Para alcanzar el pH deseado, se añadió HCl 10 N o NaOH 1 M (a partir de una solución madre de NaOH 10 M) para valorar el tampón. Tras la preparación, todos los tampones se filtraron a través de filtros PES de 0,2 μm.m para botellas. Todas las mediciones de pH y conductividad se realizaron a temperatura ambiente (~ 20-25°C).
PorosXS Buffers: Tampón de equilibrio CEX - ácido acético 10 mM (HoAC) con 21 mM de NaCl hecho añadiendo 0,57 mL de ácido acético glacial y 2,44 g de NaCl por L de tampón. El pH final fue de 5,3 y la conductividad final de 3 mS/cm.
Tampón de lavado CEX - 100 mM de MOPS con 22 mM de NaCl hecho añadiendo 19,5 g de ácido libre de MOPS, 1,5 g de sal sódica de MOPS y 1,28 g de NaCl por L de tampón. El pH final fue de 5,7- 6,6 (según lo deseado) y la conductividad final fue de 3 mS/cm.
Tampón de elución CEX - 100 mM de MOPS con 118 mM de NaCl elaborado añadiendo 19,5 g de ácido libre de Mo Ps , 1,5 g de sal sódica de MOPS y 6,93 g de NaCl por L de tampón. El pH final fue de 5,7- 6,6 (según lo deseado) y la conductividad final fue de 12,4 mS/cm.
Tampón de tira CEX - ácido acético 10 mM con NaCl 3 M hecho añadiendo 0,57 mL de ácido acético glacial y 175 g de NaCl por L de tampón. El pH final fue de 5,3 y la conductividad final de 188 mS/cm.
Preparación del lisado. El pH del lisado se ajustó utilizando ácido acético 200 mM a pH 4,5 hecho mezclando 11,5 mL de ácido acético glacial por L de tampón. La solución se valoró hasta un pH final de 4,5 utilizando NaOH 1 M. Esta solución se utilizó para evitar la precipitación localizada debida al bajo pH de los ácidos concentrados o fuertes. El material de carga para estos experimentos fue un extracto de un biorreactor de 2 L alimentado por lotes. La extracción del producto del sedimento celular se realizó utilizando 20 mM Tris a pH 7,0 con 10 mM EDTA añadido. El extracto fresco se diluyó hasta una conductividad de 3 mS/cm con agua MilliQ (normalmente dilución 1:1-1,5). El extracto diluido se congeló a -20°C en alícuotas de 41 mL. Para preparar la carga, se descongeló una alícuota a temperatura ambiente y se valoró a pH 5,3 utilizando ácido acético 200 mM a pH 4,5. Se realizaron pequeños ajustes de la conductividad añadiendo agua MilliQ cuando fue necesario después de la valoración. Por último, la carga se diluyó 2,5 veces hasta una concentración de ~1,7 g/L mediante el uso de tampón de equilibrio CEX. La carga se filtró estérilmente a través de un filtro de 0,8/0,2 μm. La carga acondicionada se utilizó el mismo día en que se preparó.
Determinación de la proteína de la célula huésped. Los niveles de proteína de la célula huésped (HCP) se determinaron por medio de un kit de ensayo inmunoenzimático (ELISA) específico para un sistema de expresión de E. coli (CN F410, Cygnus Technologies). Se siguió exactamente el protocolo suministrado con el kit. Las muestras que se iban a analizar para determinar los niveles de HCP se diluyeron mediante el uso de diluyente de muestras (CN I028, Cygnus Technologies) con una dilución mínima de 10x. Por lo general, las muestras se analizaron con dos diluciones y se sembraron por duplicado para cada dilución. El nivel de HCP se representa en términos de partes por millón (ppm) o ng-HCP/mg-producto.
Análisis SDS-PAGE. Para el análisis de pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), se utilizan geles NuPAGE 4-12% BisTris de 1 mm x 10 pocillos o de 1 mm x 15 pocillos (CN NP0322Box y NP0323Box, respectivamente, Invitrogen). El tampón de corrida es tampón de corrida 1x MES SDS preparado a partir de una concentración 20x (CN NP0002, Invitrogen). Como indicadores de peso molecular se utilizan patrones proteínicos Novex sharp prestained (CN 57318, Invitrogen). Las muestras para el análisis se prepararon por dilución con agua MilliQ hasta un volumen final de 30 μL y se añadieron 10 μL de dodecilsulfato de litio (LDS) 4X (CN NP0008, Invitrogen) hasta una concentración final de 1X. Las muestras se mezclaron mediante vórtex durante 5 s. En base a la concentración de proteínas calculada a partir de la medición A280/A320, se cargó un objetivo de 3 μg por pocillo.
wCEX. P05 se evaluó mediante cromatografía de intercambio catiónico débil (wCEX) mediante el uso de una columna Dionex ProPac® WCX-104x250 mm (número de producto 054993), con un caudal de 1,2 ml/min mediante el uso de soluciones de fase móvil de acetato de sodio 10 mM pH 5,5 (tampón A) y acetato de sodio 10 mM pH 5,5, NaCl 250 mM (tampón B). Se realiza un gradiente de 10%B a 25%B durante 20 minutos. El P05 intacto eluye aproximadamente entre 1,5 y 2,5 minutos antes que la especie des-Ala en la última parte del gradiente.
Cromatografía de Captura por Intercambio Catiónico. La cromatografía se realizó en un sistema cromatográfico AKTA Explorer 100. Se empaquetó una columna PorosXS de 10 mL. El material se cargó a 40 mg de P05/ml, o puede cargarse a 25-30 mg de P05/ml. El procedimiento cromatográfico se resume en la Tabla 9. El tiempo de permanencia se mantuvo constante durante los pasos de carga y elución en 2 minutos. Se hicieron grupos de elución de prueba y se analizó la recuperación de producto, el nivel de HCP y el % de proteína intacta. Se completaron un total de 2 pasadas en la columna de 10 mL con %B al 30% y 35% a pH 6,0.
Tabla 9
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
El lavado n° 2 da como resultado un pico compuesto principalmente por impurezas. Las eluciones n° 1 con 30% y 35% de B dan como resultado un producto >95% puro mediante análisis SDS-PAGE. La concentración de sal del lavado n° 2 puede aumentarse ligeramente para eliminar el hombro del pico de elución.
Ejemplo 10
Se purificó la P04 y se cultivaron cristales con calidad de difracción en 25% PEG1500, 0,1 M PCB (pH 4,0) a 20°C. La proteína cristalizó en el grupo espacial P2, con dimensiones típicas de celda unitaria de a = 44,5, b = 46,4, c = 64,8. Los cristales difractaron con alta resolución, y se recogió un conjunto de datos de hasta 1,47 A en la Advanced Photon Source, línea de luz LS-CAT 21ID-F (Chicago IL, EE.UU.). La estructura de rayos X de P04 se resolvió mediante sustitución molecular mediante el uso de un modelo que incorporaba las partes relevantes de las estructuras conocidas de IL-1p e IL-1Ra de las estructuras PDB 11t B y 1IRA (Vigers et al., (1997) Nature 386: 190­ 194 y Schreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200). El modelo final se refinó a un Rwork/Rfree de 17,6%/20,4% y contiene una molécula de P04 (140 residuos) y 98 moléculas de agua (Tabla 10). Los residuos P041-2, 48-49 y 85­ 93 no eran visibles en la densidad electrónica y faltan en el modelo final.
Tabla 10
Figure imgf000045_0002
Los números entre paréntesis corresponden a la cáscara de mayor resolución
Emerge = 1 hkl [ 1 i 1 Ii - <|> 1 / £ i|i]
Emerge = I hkl [ I i | Ii - <I> | / I ili] en la que Fobs y Fcalc son los factores de estructura observados y calculados Rfree se calculó a partir de un subconjunto de reflexiones (5%) no utilizadas para el refinamiento.__________ La estructura cristalina de la P04 presenta un pliegue similar al predicho por el modelado. En la Fig. 1 se muestra una vista de esta estructura. En la Fig. 12A se muestra una superposición de las dos estructuras. La RMSD para los carbonos del esqueleto fue de 1,41 A y de 1,09 A para los segmentos IL-1p e IL-1Ra frente a los mismos residuos en las respectivas moléculas originales. P04 tiene al menos un puente salino único y dos enlaces de hidrógeno únicos que involucran una interacción entre un residuo derivado de IL-1p y una contraparte derivada de IL-1Ra: (i) Glu39-Lys64 (Glu39 de IL-1RA; Lys64 de IL-1 p) como se muestra en la FIG. 12B, (ii) Arg9-Gln149 (Arg9 de IL-1RA; Gln149 de IL-1 p) como se muestra en la FIG. 12C y (iii) Ser152-Lys40 (Ser152 de IL-1RA; Lys50 de IL-1p) como se muestra en la FIG. 12C. Estas interacciones únicas pueden explicar la mayor estabilidad térmica de P04 ya que estas interacciones están ausentes en las estructuras IL-1 p e IL-1Ra. Los residuos implicados en estas interacciones también están presentes en P03 y P05, proteínas que también presentan una mayor estabilidad térmica.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína aislada que comprende un dominio quimérico de citoquinas de la familia de la interleucina-1 (IL-1) de 148-160 aminoácidos de longitud,
en la que el dominio de citoquina quimérico comprende 5, 6 o 7 segmentos que tienen al menos un 80 % de identidad de aminoácidos con los segmentos correspondientes de un dominio de citoquina de la familia IL-1 parental seleccionado de IL-1Ra humana (SEQ ID NO: 3) e IL-1 p humana (SEQ ID NO: 1), y en la que los segmentos adyacentes son de diferentes dominios parentales de citoquinas de la familia IL-1, en la que (i) al menos los residuos 11-41 y 120-147 (de acuerdo con IL-1 p (SEQ ID NO: 1) numeración) son colectivamente al menos 90% idénticos a los residuos correspondientes de IL-1Ra (SEQ ID NO:3); y a. al menos los residuos 1-6, 45-61 y 148-153 (de acuerdo con IL-1p (SEQ ID NO: 1) numeración) son colectivamente al menos 90% idénticos a los residuos correspondientes de IL-1 p (SEQ ID NO: 1); o b. al menos los residuos 1-8, 42-120 y 148-153 (de acuerdo con IL-1 p (SEQ ID NO: 1) numeración) son colectivamente al menos 90% idénticos a los residuos correspondientes de IL-1p (SEQ ID NO: 1); en la que la proteína aislada se une al receptor I de IL-1 (IL-1 RI) y antagoniza la actividad de señalización del receptor de IL-1 RI, y
en la que los segmentos correspondientes y residuos correspondientes son como se indica en la alineación proporcionada en la Figura 4.
2. La proteína de la reivindicación 1, en la que el dominio citoquina tiene una longitud de 150-156 aminoácidos.
3. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el dominio de citoquina no es de origen natural, opcionalmente en la que el dominio de citoquina es menos de 98, 95, 90, 85 u 80% idéntico a IL-1 p humana (SEQ ID NO: 1), y/o IL-1 Ra humana (SEQ ID NO: 3).
4. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que
a) el dominio de citoquina se une al receptor I de IL-1 (IL-1RI) con una Kd de menos de 100, 50, 20, 10, 5 o 1 nM y/o
b) la proteína inhibe la señalización por IL-1 p a una concentración de 0,1 ng/ml en un ensayo celular con una IC50 de menos de 100, 50, 20, 10 o 5 nM, en la que opcionalmente la proteína inhibe la señalización con una IC50 que es menor que la de IL-1Ra.
5. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el dominio de citoquina es al menos un 80% idéntico a P05 (SEQ ID NO: 21), P01 (SEQ ID NO: 17), P02 (SEQ ID NO: 18), P03 (SEQ ID NO: 19) o P04 (SEQ ID NO: 20).
6. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que al menos el 95, 97, 98, 99 o el 100 % de las posiciones dentro del dominio de citoquinas tienen la propiedad de que, en cada posición, el aminoácido presente es idéntico a una primera citoquina de la familia IL-1, donde la primera citoquina de la familia IL-1 es IL-1p, o a una segunda citoquina de la familia IL-1, donde la segunda citoquina de la familia IL-1 es IL-1 Ra, o ambas si la primera y la segunda citoquina de la familia IL-1 son idénticas en la posición particular.
7. La proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el dominio de citoquina tiene mayor termoestabilidad que la IL-1p humana y la IL-1Ra humana en un tampón fisiológico, y opcionalmente en la que el dominio de citoquina tiene una Tm al menos 2°C mayor, para ejemplo, entre 5-12°C mayor que la Tm de la IL-1 p humana y la IL-1Ra humana a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
8. La proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el dominio de citoquina quimérico comprende:
i. al menos dos, tres o cuatro segmentos discontinuos, cada uno con una longitud de al menos 5, 6, 7, 10, 15 o 20 aminoácidos y que tengan al menos 90, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de aminoácidos con los segmentos correspondientes de la 1p humana; y
ii. aminoácidos en las posiciones restantes que no están en los segmentos discontinuos que son al menos 90, 95 o 100% idénticos a los residuos correspondientes en la IL-1 Ra humana, opcionalmente en la que el dominio de citoquina es idéntico a la IL-1 Ra humana en las posiciones restantes que no están en los segmentos discontinuos.
9. La proteína de la reivindicación 1, en la que el dominio de citoquina es entre 45- 72% idéntico a la IL-1 p humana (SEQ ID NO: 1) y 53-80% idéntico a la IL-1Ra humana (SEQ ID NO: 3).
10. Una composición farmacéutica que comprende una proteína según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, opcionalmente en la que la composición farmacéutica es
a) una composición farmacéutica tópica; o
b) una composición farmacéutica oftálmica o
c) formulada para administración subcutánea, intravenosa o intramuscular.
11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso como medicamento.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para su uso en el tratamiento del cáncer.
13. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
14. Un vector de ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13, en el que la secuencia está operablemente unida a una secuencia de control de transcripción.
15. Una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, opcionalmente en la que la célula huésped es una célula huésped de E. coli.
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