MX2013001107A - Agonistas y antagonistas del receptor tipo i de il-1 quimerico. - Google Patents

Agonistas y antagonistas del receptor tipo i de il-1 quimerico.

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Abstract

Se presentan aquí dominios de citosinas no naturales que se pueden utilizar, entre otros, para modular la señalización celular que responde al receptor tipo I de interleucina- I (IL-1RI), para tratar trastornos y para detectar o unir a receptores celulares, así como otros agentes. Los dominios de citosinas ejemplares pueden contener residuos de aminoácidos de al menos dos dominio0s de citosinas madre, por ejemplo, características, cadenas B y bucles de al menos dos dominios de citosinas madre.

Description

AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR TIPO I DE IL-1 QUIMÉRICO REFERENCIA CRUZADA Y REIVINDICACIÓN DE PRIORIDAD La presente solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes de patentes provisionales estadounidenses N.° de serie 61/368.799, presentada el 29 de julio de 2010, N.° de serie 61/436.178, presentada el 25 de enero de 2011, N.° de serie 61/436.184 , presentada el 25 de enero de 2011, N.° de serie 61/493.966, presentada el 6 de junio de 2011 y N.° de serie 61/493.967, presentada el 6 de junio de 2011 y con respecto a las solicitudes estadounidenses incorpora el contenido de la N.° de serie 61/368.799, presentada el 29 de julio de 2010, N.° de serie 61/436.184 , presentada el 25 de enero de 2011 y N.° de serie 61/493.967, presentada el 6 de junio de 2011, por referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interleucina-1 alfa (IL-?a) y beta (IL-?ß) son miembros prototipicos de una familia de citocinas inmunorreguladoras y cumplen varias funciones importantes en la regulación del sistema inmunológico . IL-?a e IL-?ß se unen al receptor tipo I de interleucina-1 (IL-1RI), lo que produce la activación del receptor secundario, la proteina accesoria del receptor de interleucina-1 (IL-IRAcP) . La señalización agonizada por IL-?a e IL-?ß produce respuestas de células T amplificadas, incluso la proliferación y la supervivencia de células T vírgenes y el desarrollo de células TH17.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se presentan' aquí dominios de citocinas no naturales que se pueden utilizar, entre otros, para modular la señalización celular que responde al receptor tipo I de interleucina-1 (IL-1RI), para tratar trastornos y para detectar o unir a receptores celulares, así como otros agentes.
En un aspecto, la presente divulgación presenta una proteína aislada que incluye un dominio de citocina que contiene residuos de aminoácidos de al menos dos dominios de citocinas madre, por ejemplo, características de unión al receptor, características superficiales, cadenas ß y bucles de al menos dos dominios de citocinas madre.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina se une a IL-1RI e incluye características de unión al receptor de diferentes dominios de citocinas madre, p. e . , de un agonista del receptor y de un antagonista del receptor (por ejemplo, IL-?ß e IL-IRa o IL-?a e IL-IRa) , de IL-?ß e IL-?a o de los tres IL-IRa, IL-?a e IL-IRa. Las características de unión al receptor pueden corresponder a residuos, segmentos o regiones en los Sitios A y B. Con respecto a dichos residuos, segmentos y regiones correspondientes a los Sitios A y B, en el contexto de IL-1 (IL-?ß, IL-? e IL-IRa), véanse las definiciones más adelante.
Con respecto al Sitio A, el dominio de citocina puede tener: (a) (i) residuos del Sitio A que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en un primer dominio de citocina madre; (a) (ii) residuos del Sitio A extendido que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en un primer dominio de citocina madre; (a) (iii) segmentos Al y A2 del Sitio A que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con las regiones correspondientes de un primer dominio de citocina madre; o (a) (iv) una región del Sitio A que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con las regiones correspondientes de un primer dominio de citocina madre.
Con respecto al Sitio B, el dominio de citocina puede tener: (b) (i) residuos del Sitio B que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en un segundo dominio de citocina madre; (b) (ii) residuos del Sitio Bs extendido que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en un segundo dominio de citocina madre; (b) (iii) segmentos Bl, B2 y B3 del Sitio B que tienen al menos el 80, 85, 88, '90, 92, 95 o 100% de identidad con las regiones correspondientes de un segundo dominio de citocina madre; o (b) (iv) una región del Sitio B que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con las regiones correspondientes de un segundo dominio de citocina madre.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye las características: (a) (i) y b(i), (a) (ii) y b(ii), (a) (iii) y (b) (iii), o (a) (iv) y (b) (iv) , p. e . , en donde cada característica se define adicionalmente por el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad. Por ejemplo, el primer dominio de citocina madre puede ser IL-?ß y el segundo dominio de citocina madre puede ser IL-lRa. Por ejemplo, el primer dominio de citocina madre puede ser IL-?a y el segundo dominio de citocina madre puede ser IL-lRa.
El dominio de citocina también puede incluir aminoácidos de un segundo dominio de citocina madre en una o más posiciones en el dominio que deterioran la interacción con un receptor secundario de citocinas (p. ej . , IL-IRAcP) . Por ejemplo, el segundo dominio de citocina madre es IL-lRa. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye uno o más segmentos del Sitio C o D (p. ej . , Cl, DI, D2 , D3, D4 o D5) de IL-IRa o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con dichos segmentos. Por ejemplo, el dominio de citocina incluye (i) residuos del Sitio C que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa, (ii) residuos del Sitio D que tienen al- menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa, (iii) un segmento Cl que tiene al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa; o (iv) un segmento D2 que tiene identidad en al menos 3, 4 o 5 residuos con los residuos correspondientes en IL-IRa. El dominio de citocina puede incluir las características (i) y (ii) o (ii) y (iii), p. e . , en donde cada característica se define adicionalmente por el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad o (iii) y (iv) .
El dominio puede incluir regiones de al menos dos dominios de citocinas de la familia IL-1 humana diferentes, en donde las regiones se seleccionan del grupo que consiste en la región A (que tiene los segmentos Al y A2 ) , la región B (que tiene los segmentos Bl, B2 y B3) , la región C y la región D (que tiene los segmentos DI, D2, D3, D4 y D5) .
El dominio de citocina puede incluir una región del Sitio A y una región del Sitio B de diferentes dominios de citocinas. La región del Sitio A puede ser de un agonista o antagonista natural del receptor; la región del Sitio B puede ser de un agonista natural del receptor. Puede incluir una región del Sitio C de un antagonista natural del receptor o una región del Sitio D de un antagonista natural del receptor .
Por ejemplo, el dominio puede ser un dominio quimérico que tiene segmentos de al menos 5, 6, 10, 15,' 20 o 25 aminoácidos de longitud y que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los segmentos correspondientes de al menos dos dominios de citocinas madre diferentes, por ejemplo, un primer y un segundo dominio de citocina madre. Los dominios de citocinas madre pueden ser citocinas de unión a IL-1RI, por ejemplo, IL-?ß, IL-?a e IL-lRa. En algunas realizaciones, los aminoácidos que no se encuentran en los segmentos del primer dominio de citocina madre están hechos a partir de otros dos o más dominios de citocinas madre.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos dos segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los segmentos correspondientes de un primer dominio de citocina madre y los aminoácidos que no se encuentran en dichos segmentos son mayoritariamente idénticos (p. ej . , al menos el 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100%) a los residuos correspondientes en el segundo dominio de citocina madre.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye (i) al menos dos segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los segmentos correspondientes de un primer dominio de citocina madre y (ii) al menos uno, dos o tres segmentos, p. e . , de al menos 5, 6, 7, 8, 10 o 15 aminoácidos de longitud, que son idénticos a un segundo dominio de citocina madre.
Por ejemplo, el dominio de citocina puede incluir un primer segmento de 20-50, 25-50, 30-45 o 30-40 aminoácidos (p. ej., 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40) y un segundo segmento de 20-4.5, 20-40, 25-40 o 25-35 aminoácidos (p. ej . , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35), cada uno idéntico (o que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, o 98% de identidad) a un primer dominio de citocina madre (p. e j . , IL-IRa) y un tercer segmento que es idéntico (o que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 98% de identidad) a un segundo dominio de citocina madre (p. e j . , IL-?ß o IL-la) . Por ejemplo, el tercer segmento puede ser de entre 55 y 90, 60 y 90, 60 y 85 o 70 y 85 aminoácidos de longitud, p. ej . , 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 u 85 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones: el primer segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO: 9, también denominado segmento Al en el presente y correspondiente a los residuos 16-40 de SEQ ID NO: 3 y a los residuos 11-36 de acuerdo con la numeración de IL-?ß) . El segundo segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos 120-140 o 120-141 de SEQ ID NO:3 (IL-IRa), correspondiente a los residuos 121-139 o 121-140 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) . El tercer segmento puede tener al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos 45-100 o 42-120 de IL-?ß (SEQ ID NO:l) .
En algunos casos, el primer segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos 14-45 de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los residuos 9-41 de acuerdo con la numeración de IL-?ß) . El segundo segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos 120-145 de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los residuos 121-145 de acuerdo con la numeración de IL-?ß) o los residuos 120-147 de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los residuos 121-147 de acuerdo con la numeración de IL-?ß) . En algunas realizaciones, al menos los residuos 11-41 y 120-147 (de acuerdo con la numeración de IL-1ß) en forma colectiva tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa.
En algunas realizaciones, un extremo terminal de uno de los segmentos del primer dominio de citocina de la familia IL-1 está ubicado dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 41 de SEQ ID NO:l y un extremo terminal de uno de los segmentos del primer dominio de citocina de la familia IL-1 está ubicado dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 121 de SEQ ID N0:1.
En algunas realizaciones, el dominio incluye un segmento que tiene un extremo amino terminal en una posición dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 42 de SEQ ID N0:1 y un extremo carboxilo terminal dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 120 de SEQ ID N0:1 o un segmento que tiene un extremo amino terminal en una posición dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 121 de SEQ ID N0:1 y un extremo carboxilo terminal dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 145 de SEQ ID NO:l.
En algunas realizaciones, los residuos en el dominio en las posiciones correspondientes a 11-41 y 120-147- (de acuerdo con la numeración IL-?ß) en forma colectiva tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa. El. dominio también puede estar basado en las secuencias de los miembros de la familia de citocinas IL-1, p. e . , en posiciones análogas a las anteriores .
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV ( SEQ ID NO:9); NLEEK (SEQ ID NO:10); RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK ( SEQ ID NO : 11 ) ; AMEADQP (SEQ ID NO: 12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY (SEQ ID NO: 13); o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con las anteriores. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: VQGEESNDKI (SEQ ID NO: 14); KKKMEKRF (SEQ ID NO: 15) y FSMSFVQGEESNDKI PVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKN YPKKKMEKRFVF KI EINNKLEFES (SEQ ID NO: 16); o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con las anteriores.
En algunas realizaciones, uno o más o todos los bucles ß1ß2, ß2ß3, ß8ß9 y ß??ß?? tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los bucles correspondientes de un antagonista de IL-1, p. ej . , IL-IRa. En algunas realizaciones, uno o más o todos los bucles ß4ß5, ß5ß6, ßßß7 y ß7ß8 tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los bucles correspondientes de un dominio de citocina de la familia IL-1 diferente de la citocina madre humana que es muy similar a los bucles ß1ß2, ß2ß3, ß8ß9 y ß??ß??. Por ejemplo, uno o más o todos los bucles ß4ß5, ß5ßd, ß6ß7 y ß7ß8 tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los bucles de un agonista de IL-1, por ejemplo IL-?ß. En algunas realizaciones, el bucle ß11ß12 tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con el bucle correspondiente de un antagonista de IL-1, p. ej., IL-IRa.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con una, dos, tres o todas las cadenas beta ß2, ß3, ß?? y ß?? de IL-IRa. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con una, dos, tres o todas las ß4 , ßd, ß7 y ß8 de IL-?ß, o con ß4 , ß5, ß6, ß7, y ß8 de IL-?ß.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100% de identidad con los aminoácidos I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110 o I46-G118 de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el dominio de citocina no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100% de identidad con los aminoácidos N7-V41, R11-M36, N102-D145, o Y121-D145 de SEQ ID NO:l.
Generalmente, el dominio de citocina no es natural. Difiere de los dominios de citocinas de la familia IL-1 humana. Por ejemplo, tiene menos del 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60 o 55% de identidad con IL-IRa (SEQ ID N0:3), IL-?ß ( SEQ ID NO:l) o IL-?a (SEQ ID NO:2). El dominio de citocina también puede tener al menos el 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% de identidad con dicha citocina. Por ejemplo, el dominio quimérico puede tener entre el 30 y el 95%, el 40 y el 90% o el 45 y el 85% de identidad con IL-IRa, IL-?ß e IL-?a. Por ejemplo, el dominio quimérico puede tener entre el 40 y el 90% de identidad con IL-?ß y entre el 35 y el 85% de identidad con IL-IRa; entre el 40 y el 80% de identidad con IL-?ß y entre el 45 y el 80% de identidad con IL-IRa; entre el 45 y el 72 de identidad con IL-?ß y entre el 45 y el 80% de identidad con IL-IRa; entre el 45 y el 72% de identidad con IL-?ß y entre el 53 y el 80% de identidad con IL-IRa; entre el 50 y el 72% de identidad con IL-?ß y entre el 53 y el 70% de identidad con IL-IRa; entre el 60 y el 72% de identidad con IL-?ß y entre el 53 y el 68% de identidad con IL-IRa; entre el 65 y el 72% de identidad con IL-?ß y entre el 54 y el 60% de identidad con IL-IRa o entre el 68 y el 72% de identidad con IL-?ß y entre el 54 y el 57% de identidad con IL-IRa. Por ejemplo, el dominio quimérico puede tener entre el 40 y el 90% de identidad con IL-? y entre el 35 y el 85% de identidad con IL-IRa; entre el 40 y el 80% de identidad con IL-?a y entre el 45 y el 80% de identidad con IL-IRa; entre el 45 y el 72% de identidad con IL-?a y entre el 45 y el 80% de identidad con IL-IRa; entre el 45 y el 72% de identidad con IL-?a y entre el 53 y el 80% de identidad con IL-IRa; entre el 50 y el 72% de identidad con IL-?a y entre el 53 y el 70% de identidad con IL-IRa; entre el 60 y el 72% de identidad con IL-loc y entre el 53 y el 68% de identidad con IL-IRa; entre el 65 y el 72% de identidad con IL-?a y entre el 54 y el 60% de identidad con IL-IRa o entre el 68 y el 72% de identidad con IL-?a y entre el 54 y el 57% de identidad con IL-IRa.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina difiere de IL-IRa y se une al receptor mientras que incluye un Sitio C o un Sitio D característico de un antagonista del receptor natural (por ejemplo IL-IRa). Por ejemplo, el dominio tiene menos del 98, 95, 92, 90, 85 y 80% de identidad con IL-?ß humana e IL-IRa. Por ejemplo, el dominio tiene entre el 40 y el 95%, el 40 y el 90% o el 45 y el 85% de identidad con IL-IRa. El dominio también puede tener entre el 40 y el 95%, el 40 y el 90% o el 45 y el 85% de identidad con un antagonista de citocinas de la familia IL-1, por ejemplo IL-?a o IL-?ß. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye: al menos el 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85% de aminoácidos de un primer dominio de citocina madre que es un agonista de señalización de citocinas.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina tiene una mayor identidad de aminoácidos (p. ej . , al menos el 5, 10, 15 o 20% o más) con un agonista del receptor (por ejemplo IL-?ß o IL-?a) que con un antagonista del receptor (IL-IRa), pero funciona como un antagonista de IL-IRI.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina es completamente quimérico, p. ej . , cada aminoácido en el dominio es de uno de los dominios de citocinas madre, p. ej . , uno de dos dominios de citocinas madre o uno de tres o más dominios de citocinas madre. Por ejemplo, los dominios de citocinas madre son dominios de citocinas humanos o dominios de citocinas primates no humanos. En algunas realizaciones, el dominio de citocina es parcialmente quimérico, p. ej., no todos los aminoácidos en el dominio son de uno de los dominios de citocinas madre.
Por ejemplo, la proteina aislada se une a IL-1RI y modula la señalización a^ través del receptor, p. ej . , agoniza o antagoniza la actividad de señalización del receptor de IL-1RI . En algunas realizaciones, la proteina no induce sustancialmente la producción de ' IL-6 cuando se pone en contacto con las células humanas que responden a IL-?ß o no induce sustancialmente la producción de un gen indicador que responde a IL-?ß, p. ej . , en concentraciones de 10 pg/ml, 100 pg/ml o 1 mg/ml . Generalmente, la proteina inhibe la señalización de IL-?ß (p. e . , en una concentración de 0.1 ng/ml por ejemplo, en un ensayo celular descrito en el presente) con una IC50 inferior a 100, 50, 20, 10 o 5 nM. La proteina puede inhibir la señalización de IL-?ß con una IC50 menor que la de IL-IRa, p. ej . , al menos el 10, el 20 o el 50% inferior.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina se une por ejemplo con la misma afinidad o con una afinidad mejor que uno de los dominios de citocinas madre. En algunas realizaciones, el dominio de citocina se une a IL-1RI con una KD inferior a 100, 50, 20, 10, 5 o 1 nM o inferior a 500, 400, 100 o 50 pM. Por ejemplo, la constante de asociación puede ser mayor que 1x104, 3><104, 1x105 o 1x106 M-ls-1 y la disociación puede ser menor que 1x10-3, 1x10-4, 6x10-4 o 6x10-5 s-1.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina se une a IL-1RI con una mejor afinidad (p. e . , menor KD) o una velocidad de disociación más lenta que IL-?ß o IL-IRa. Por ejemplo, el dominio de citocina se puede unir a IL-1RI con una constante de disociación menor o igual a la de IL-IRa o con una constante de asociación mayor o igual a la de IL-?ß.
El dominio de citocina puede ser de entre aproximadamente 120 y 180, 140 y 170, 148 y 160 o 150 y 156 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio es de 152 o 153 aminoácidos de longitud. Típicamente, el dominio incluye al menos 10, 11 o 12 cadenas ß y se pliega de forma estable. En algunas realizaciones, el dominio de citocina tiene una Tm de al menos 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64 °C, según se describe en el presente. Puede tener una Tm de entre 51 y 61, 51 y 66, 56 y 61 o 56 y 66 °C. En algunas realizaciones, el dominio de citocina no comienza a desplegarse antes de al menos 48, 50, 51, 55, 57, 58 o 59 °C. Por ejemplo, tiene una Tm que se encuentra al menos dentro de 10 °C o 5 °C de la Tm de IL-IRa o IL-?ß en un tampón fisiológico. En algunas realizaciones, es más termoestable que IL-IRa o IL-?ß en un tampón fisiológico. Por ejemplo, el dominio puede tener una Tm que es al menos 2, 4, 6, 7 u 8 °C mayor que la Tm de IL-IRa o IL- 1ß en un tampón fisiológico, p. e . , entre aproximadamente 5 y 12, 5 y 10 o 7 y 10 °C mayor que la Tm de IL-IRa o IL-?ß en una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml.
La proteina puede incluir otras características descritas en el presente.
En otro aspecto, la divulgación presenta una proteína aislada que incluye un dominio de citocina de la familia IL-1 quimérico. Ejemplos de miembros de la familia de citocinas IL-1 incluyen IL-?a, IL-lp, IL-IRa, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 e IL-33. El dominio de citocina puede incluir una región de unión al receptor de una de las citocinas anteriores o una secuencia de proteínas que incluye elementos de una o más de dichas citocinas. Por ejemplo, el dominio de citocina puede incluir una quimera de dos o más miembros de la familia de citocinas IL-1.
En una realización, el dominio quimérico incluye al menos un segmento de una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 aminoácidos y que tiene identidad de aminoácidos (o al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94 , 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad) con una primera citocina de la familia IL-1 y otro segmento de una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos y que tiene identidad de aminoácidos (o al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94 , 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad) con una segunda citocina de la familia IL-1. El dominio quimérico puede tener menos del 90, 85, 80 o 75% de identidad con una o ambas de la primera y la segunda citocina de la familia IL-1.
En una realización, la primera citocina y la segunda citocina de la familia IL-1 se seleccionan del grupo que consiste en IL-?ß, IL-loc e IL-IRa. En otra realización, la primera citocina y la segunda citocina de la familia IL-1 se seleccionan del grupo que consiste en IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7 e IL-1F8. En otra realización, la primera citocina de la familia IL-1 se selecciona del grupo de agonistas y la segunda se selecciona del grupo de antagonistas. En algunas realizaciones, el dominio quimérico incluye menos de 120, 110, 100, 90 u 80 aminoácidos contiguos del mismo dominio de citocina madre.
En una realización, el dominio quimérico tiene identidad con la primera citocina de la familia IL-1 en al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 posiciones y tiene identidad con la segunda citocina de la familia IL-1 en al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 posiciones (incluido posiciones que pueden ser idénticas individualmente a ambas citocinas ) .
En una realización, el dominio quimérico incluye al menos dos, tres o cuatro segmentos discontinuos, cada uno de una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15 o 20 aminoácidos y que tienen identidad de aminoácidos (o al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de identidad) con los segmentos correspondientes de una primera citocina de la familia IL-1 y que incluyen aminoácidos mayoritariamente de una segunda citocina de la familia IL-1 en las posiciones restantes. En una realización, el dominio quimérico incluye 4, 5, 6 o 7 segmentos, en donde los segmentos adyacentes son de dominios de citocinas madre de la familia IL-1 diferentes. Por ejemplo, cada aminoácido en el dominio está ubicado en un péptido de al menos 5 o 6 aminoácidos de longitud de un dominio de citocina de la familia IL-1 humana natural. En una realización, el dominio quimérico incluye al menos uno, dos o tres de: (i) un segmento de al menos 50, 60, 65, 70 o 75 aminoácidos de longitud de IL-?ß, (ii) un segmento de al menos 15, 20, 25 aminoácidos de longitud de IL-IRa; y (iii) otro segmento de al menos 15, 20, 25 aminoácidos de longitud de IL-IRa.
En una realización, los segmentos discontinuos incluyen los residuos (i) 1-6 y 45-61, (ii) 1-6 y 86-95, (iii) 45-61 y 86-95, (iv) 1-6 y 148-153, (v) 45-61 y 148-153 o (vi) 86-95 y 148-153, de acuerdo con la numeración de dichas posiciones en IL-?ß. Los tres segmentos discontinuos de la primera citocina de la familia IL-1 pueden incluir, p. e . , los residuos 1-8, 42-120 y 141-153, los residuos 1-10, 37-125 y 131-153 o los residuos 1-6, 45-61, 86-95 y 148-153, de acuerdo con la numeración de dichas posiciones en IL-?ß. El dominio quimérico puede tener al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad con la segunda citocina de la familia IL-1 en las posiciones restantes. En una realización, uno o más de los bordes de los segmentos discontinuos están ubicados en posiciones en donde la primera citocina y la segunda citocina de la familia IL-1 son idénticas o están conservadas. La proteina puede tener otras características descritas en el presente.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta un inhibidor de IL-1 aislado que incluye un dominio de "citocina de la familia IL-1 que se une a IL-1RI. Por ejemplo, el inhibidor de IL-1 incluye una o más características mencionadas anteriormente o en otras partes del presente. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye: (a) aminoácidos que tiene identidad con IL-IRa en las siguientes posiciones: ARG11 , SER13 , GLN14, GLN15, GLU25, LYS27 , LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34 , ASP35, MET36, GLN38 , GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 y GLN141 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) y (b) aminoácidos que tienen identidad con IL-?ß en las siguientes posiciones: ALAI, PR02 , VAL3 , ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PR057, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152. En algunas realizaciones, los segmentos Al y A2 del Sitio A tienen al menos el 80% de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-IRa. En algunas realizaciones, los segmentos Bl, B2 y B3 del Sitio B tienen al menos el 80% de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-?ß. Por ejemplo, los segmentos Al y A2 del Sitio A tienen al menos el 90% de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-IRa; y los segmentos Bl, B2 y B3 del Sitio B tienen al menos el 90% de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-?ß. Por ejemplo, los segmentos Al y A2 del Sitio A tienen identidad con los segmentos correspondientes de IL-IRa; y los segmentos Bl, B2 y B3 del Sitio B tienen identidad con los segmentos correspondientes de IL-?ß.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye secuencias que tienen al menos el 80% de identidad (en forma colectiva] con las cadenas beta ß2, ß3, ß?? y ß?? de IL-IRa y secuencias que tienen al menos el 80% de identidad (en forma colectiva] con las cadenas beta ß4 , ß6, ß7 y ß8 de IL-?ß. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye secuencias que son idénticas a las cadenas beta ß2 , ß3 , ß?? y ß11 de IL-IRa y secuencias que son idénticas a las cadenas beta ß4 , ßß, ß7 y ß8 de IL-?ß. En algunas realizaciones, los segmentos y las características identificados anteriormente de IL-?ß se derivan de IL-loc o una combinación de IL-?ß o IL-la.
En algunas realizaciones, el inhibidor de IL-1 incluye una o más (p. e . , al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) de las siguientes propiedades: (i) residuos del Sitio A o Sitio B (o los residuos del Sitio A extendido y Sitio B extendido] que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß, IL-lcx o IL-IRa; (ii) segmentos Al y A2 que tienen en forma colectiva al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-lRa; (iii) segmentos Bl, B2 y B3 que tienen en forma colectiva al menos el 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß o IL-? ; (iv)' una región del Sitio A que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa; (v) una región del Sitio B que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß o IL-lcx; (vi) residuos del Sitio C o Sitio D que tienen al menos el 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa o IL 36Ra, (vii) un segmento Cl que tiene al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa; (viii) un segmento D2 que tiene identidad de al menos 3, 4 o 5 residuos con los residuos correspondientes en IL-IRa. El dominio de citocina difiere de IL-IRa, por ejemplo, el dominio de citocina tiene menos del 99, 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60% de identidad con IL-IRa o al menos el 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% de identidad con IL-IRa, p. e j . , entre el 40 y el 95%, el 40 y el 90% o el 45 y el 85% de identidad con IL-IRa. En algunas realizaciones, el dominio de citocina no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100% de identidad con los aminoácidos I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110 o I46-G118 de SEQ ID N0:3. En algunas realizaciones, el dominio de citocina no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100% de identidad con los aminoácidos N7-V41, Rll-M37, N102-D144 o Y121-D144 de SEQ ID NO : 1.
En algunas realizaciones, el inhibidor se une a IL-1RI con una D inferior a 100, 50, 20, 10, 5 o 1 nM. En algunas realizaciones, el inhibidor se une a IL-1RI con una mejor afinidad (p. e . , menor KD) o una velocidad de disociación más lenta que IL-?ß o IL-IRa.
En algunas realizaciones, el inhibidor no induce sustancialmente la expresión de IL-6 cuando se pone en contacto con las células humanas que responden a IL-?ß.
Generalmente, el inhibidor inhibe la señalización de IL-?ß, p. e . , con una IC50 inferior a 100, 50, 20, 10 o 5 nM.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID N0:9); NLEEK (SEQ ID NO:10); RIWDVNQKT FYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK (SEQ ID NO : 11 ) ; AMEADQP (SEQ ID NO: 12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY (SEQ ID NO: 13); o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con las anteriores. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: VQGEESND I ( SEQ ID NO: 14); KKKMEKRF (SEQ ID NO: 15) y FSMSFVQGEESND I PVALGLKEKNLYLSCVLKDD PTLQLESVDPKN YPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO: 16); o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100% de identidad con las anteriores. El inhibidor puede incluir otras características descritas en el presente.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una proteína aislada que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o 100% de identidad con una secuencia divulgada en el presente, p. e . , una secuencia enumerada en la tabla 4 o en el ejemplo 1, p. ej . , la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, P05, P06 o P07, o una secuencia del ejemplo 1, 5, 6 o en otras partes del presente. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos incluye al menos una sustitución, inserción o eliminación. La secuencia de aminoácidos puede incluir menos de 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones no conservadoras o menos de 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones totales. La secuencia de aminoácidos puede incluir al menos 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones, p. e j . , sustituciones conservadoras.
También se proporcionan proteínas aisladas que incluyen una metionina N-terminal para la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, P05, P06, o P07 o una secuencia del ejemplo 1, 5, 6 o en otras partes del presente, y proteínas aisladas que incluyen la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, P05, P06 o P07 o una secuencia del ejemplo 1, 5, 6 o en otras partes del presente en las cuales la alanina en el extremo amino terminal está ausente. Las secuencias anteriores pueden incluir otras características divulgadas en el presente. Por ejemplo, la secuencia además puede incluir una etiqueta, por ejemplo una secuencia de hexahis tidina , p. ej., un terminal N o C relativo a la secuencia de unión a IL-1RI. La secuencia además puede incluir un grupo que modifica la estabilidad o la farmacocinética de la secuencia de unión a IL-1RI . La secuencia además puede incluir una albúmina sérica o un dominio Fe, o uno o más dominios de estos, p. e j . , uno o más dominios constantes de inmunoglobulina o uno o más dominios de albúmina. La proteína puede tener otras características descritas en el presente. En' algunas realizaciones, la proteína aislada consiste, o consiste esencialmente, en una secuencia o dominio quimérico divulgado en el presente.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una proteína aislada que incluye un dominio que tiene una forma circularmente permutada de un dominio de citocina descrito en el presente, p. ej . , un dominio de citocina enumerado en la tabla 4 o un dominio que incluye SEQ ID NO: 3. La proteina además puede incluir una secuencia heterologa (por ejemplo un dominio Fe o albúmina) en el extremo amino o carboxilo terminal de la forma permutada, opcionalmente separada por un ligador. La proteína puede tener otras características descritas en el presente.
La divulgación . también presenta composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más agentes de unión al receptor descritos en el presente (por ejemplo una proteína que incluye un dominio de citocina quimérico) . Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas oftálmicas, composiciones tópicas o composiciones para administración parenteral.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para modular una respuesta inmune o inflamatoria en un sujeto. El método puede incluir la administración de una composición que incluye un agente de unión al receptor descrito en el presente a un sujeto en una cantidad eficaz para modular la respuesta inmune o inflamatoria en el sujeto.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para tratar un trastorno mediado por IL-1 en un sujeto. El método incluye la administración de una composición que incluye una proteína que se puede unir a IL-1RI, p. ej . , un agente de unión al receptor descrito en el presente, al sujeto. Por ejemplo, el trastorno puede ser un trastorno autoinmune, p. e j . , artritis reumatoide o artritis crónica juvenil, esclerodermia , síndrome de Sjogren, espondilitis anquilosante, síndrome de Behcet, una enfermedad inflamatoria intestinal, asma, vasculitis o psoriasis. El trastorno puede ser un- trastorno asociado con formación de agregados, p. e j . , hiperuricemia , gota, diabetes (incluso diabetes no insulinodependiente ) , mal de Alzheimer, amiloidosis secundaria reactiva, esclerosis lateral amiotróf ica (ELA) , enfermedad de Huntington o enfermedad de Parkinson. El trastorno también puede ser un trastorno tipo CAPS (síndromes periódicos asociados a la CIAS1) u otro trastorno descrito en el presente .
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para tratar un trastorno ocular mediado por IL-1 en un sujeto. El método puede incluir la administración de una composición que incluye una proteína que se puede unir a IL-1RI, p. ej., un agente de unión al receptor descrito en el presente, al sujeto. Por ejemplo, la composición es una composición oftálmica que se administra tópicamente a un ojo del sujeto o a la región que lo rodea. En una realización, el trastorno es un trastorno del ojo seco. En algunas realizaciones, el sujeto no presenta manifestaciones de enfermedad autoinmune sistémica. En algunas realizaciones, el sujeto tiene el síndrome de Sjogren. En algunas realizaciones, el sujeto tiene la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) . En otras realizaciones, el trastorno es la uveítis.
En otro aspecto, la divulgación presenta un método para inhibir la actividad de IL-1. El método incluye poner en contacto, un agente de unión al receptor que se puede unir a IL-1RI con las células que responden a IL-1 o con un sujeto. Generalmente, la proteína se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir la actividad de IL-1 asociada con las células o en el sujeto. La proteína se puede poner en contacto con las células de un sujeto ex vivo.
En otro aspecto, la presente divulgación presenta un ácido nucleico aislado que incluye una o más secuencias que codifican las proteínas descritas en el presente o un ácido nucleico divulgado en el presente (p. e j . , en la tabla 5), una secuencia que se hibridiza con dicho ácido nucleico o que tiene el 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o 100% de identidad con dicho ácido nucleico. Las secuencias de hibridación ejemplares pueden ser de al menos 200, 300, 400, 420 o 450 nucleótidos de longitud, p. e j . , de entre 420 y 480 nucleótidos de longitud. El ácido nucleico también puede incluir otras características divulgadas en el presente.
También se presenta una célula hospedera recombinante que incluye un ácido nucleico que incluye una o más secuencias que codifican las proteínas descritas en el presente y una cadena de polipéptidos de estas. Un agente de unión al receptor se puede producir a través de un método que incluye mantener la célula hospedera bajo condiciones que permiten la expresión del agente de unión al receptor y, opcionalmente , recuperar el agente de unión al receptor, p. ej . , de las células o del medio asociado con la célula hospedera. Por ejemplo, se puede purificar el agente de unión al receptor a partir del lisado de las células. El agente de unión al receptor purificado se puede formular, p. ej . , con uno o más de un excipiente, un estabilizador y un tampón.
También se presenta un método para proporcionar un dominio de proteínas quimérico. El método incluye identificar al menos dos proteínas madre que tienen un pliegue común (p. ej . , una primera proteína madre y una segunda proteína madre), ubicar al menos dos segmentos dentro de la primera proteína madre y construir un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos quimérica que incluye los dos segmentos de la primera proteína madre y los residuos que son principalmente de la segunda proteína madre en las posiciones restantes. El dominio puede ser un dominio que está mayoritariamente compuesto por láminas ß, un dominio que está mayoritariamente compuesto por hélices a o un dominio que tiene una combinación de dichos elementos. Por ejemplo, el dominio puede tener el pliegue de una citocina. La primera proteina madre y la segunda proteina madre pueden estar relacionadas por homología, p. e . , entre el 10 y el 40% de identidad de aminoácidos. En algunas realizaciones, los segmentos de la primera proteína están ubicados dentro de un único dominio de proteínas plegado y la secuencia de aminoácidos quimérica incluye una forma del dominio de proteínas plegado que no tiene identidad con el dominio correspondiente en la primera y en la segunda proteína madre. En algunas realizaciones, las dos proteínas madre tienen propiedades funcionales diferentes y el dominio quimérico puede tener propiedades de una o ambas proteínas madre. En algunas realizaciones, el dominio quimérico tiene una interfaz de unión de la primera proteína madre y otra interfaz de unión de la segunda proteína madre.
En el presente, se hace referencia a varias regiones, segmentos y residuos en las citocinas de la familia IL-1 con relación a los Sitios A, B, C y D. La ubicación de dichos residuos, segmentos y regiones en la secuencia de IL-lp humana ( SEQ ID N0:1) y las posiciones correspondientes se proporcionan a continuación en la figura 1: Sitio A. Los residuos del Sitio A en IL-?ß incluyen: ARG11, SER13, GLN14 , GLN15, SER21, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31 , GLN32, GLY33, GLN34 , ASP35, ???36, GLU128, ASN129 y MET130 y los residuos correspondiente de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en el presente "residuos del Sitio A") . En determinados contextos, especialmente con relación a IL-?ß, se hace referencia a los "residuos del Sitio A extendido" que incluye los residuos del Sitio A asi como GLN149 y PHE150, y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1. Además, es posible definir una "región' del Sitio A" como se muestra en la figura 4, incluido por ejemplo un segmento Al (correspondiente en IL-?ß a 11-36 de SEQ ID N0:1) y un segmento A2 (correspondiente en IL-?ß a 125-131 de SEQ ID N0:1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Sitio B. Los residuos del Sitio B en IL-?ß incluyen: ALAI, PR02, ARG4 , GLN48, GLU51, ASN53, ILE56, LYS92 , LYS93, LYS94, LYS103, GLU105 y ASN108, y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en el presente "residuos del Sitio B") . En determinados contextos, especialmente con relación a IL-?ß, se hace referencia a los "residuos del Sitio B extendido" que incluye los residuos del Sitio B asi como PHE46 y SER152 que están fuera de la región del Sitio B en la figura 4. Además, es posible definir una "región del Sitio B" como se muestra en la figura 4, incluido por ejemplo un segmento Bl (correspondiente en IL-?ß a 1-5 de SEQ ID N0:1), un segmento B2 (correspondiente en IL-?ß a 48-56 de SEQ ID N0:1) y un segmento B3 (correspondiente en IL-?ß a 92-98 de SEQ ID N0:1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Sitio C. Los residuos del Sitio C en IL-?ß incluyen: ILE104, ILE106, ASN107, LYS109, GLU111, THR137, LYS138, GLY139, GLY140, GLN141, THR144 y ASP145 y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en el presente "residuos del Sitio C") . Además, es posible definir una "región del Sitio C" como se muestra en la figura 4, incluido por ejemplo un segmento Cl (correspondiente en IL-?ß a 136-145 de SEQ ID N0:1) y los segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas I Ll .
Sitio D. Los residuos del Sitio D en IL-?ß incluyen: LEU6, THR9, LYS63, GLU64, LYS65 y ASN66 y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en el presente "residuos del Sitio D"). Además, es posible definir una "región del Sitio D" como se muestra en la figura 4, incluido por ejemplo un segmento DI (correspondiente en IL-?ß a 6-9 de SEQ ID N0:1), un segmento D2 (correspondiente en IL-?ß a 37-41 de SEQ ID N.:l), un segmento D3 (correspondiente en IL-?ß a 63-66 de SEQ ID N0:1), un segmento D4 (correspondiente en IL-?ß a 86-91 de SEQ ID N0:1), un segmento D5 (correspondiente en IL-?ß a 150-153 de SEQ ID NO:l) y los segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Se puede obtener una mayor identificación de la ubicación de los residuos y las regiones para los Sitios A, B, C y D mediante la alineación de la citocina en cuestión con las secuencias que se muestran en la 4.
La secuencia de aminoácidos de IL-?ß (humana) mencionada en el presente es: APVRSLNCTLRDSQQ SLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQWFSMSFVQGEESNDKIPVALG L E NLYLSCVL DD PTLQLESVDPKNYPK ME REVFN IEINNKLEFESAQFPNWYI STSQAENMPVFLGGT GGQDITDFTMQFVSS (SEQ ID N0:1) .
La secuencia de aminoácidos de IL-?a (humana) mencionada en el presente es: SAPFSFLSNVKYNFMRI IKYEFILNDALNQS I I RANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKS SKDDA ITVILRIS TQLYVTAQDEDQPVLL EMPEI P TITGSETNLLFF ETHGTKNYF TSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA ( SEQ ID NO: 2) .
La secuencia de aminoácidos de IL-IRa (humana) mencionada en el presente es: RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQ TFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEE IDWPIEPHALFLGIH GGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENR QDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPG FLC TAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED (SEQ ID N0:3). Los términos IL-1ß, IL-?a e IL-IRa, según se emplean aquí, se refieren a las proteínas maduras respectivas.
Las láminas ß mencionadas en el presente, que se muestran en la figura 4, se refieren a las siguientes secuencias : Tabla 1 Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se utilizan indistintamente en el presente) se realizan de la siguiente manera. Se alinean las secuencias de acuerdo con las alineaciones proporcionadas en el presente, o en caso de no haber una alineación adecuada, se implementa la alineación óptima determinada mediante el mejor puntaje utilizando el algoritmo Needleman-Wunsch en el algoritmo Needle de los paquetes EMBOSS empleando una matriz de puntuación Blosum 62 con una penalizacion por huecos de 10 y una penalizacion por extensión de huecos de 1. Véase Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453; Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed. ) , Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pp . 1-44 Addison Wesley, y las herramientas disponibles en el European Bioinformatics Institute (Cambridge, RU ) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P. y col., A., Trends in Genetics 16, (6) pp . 276--277 y disponible en linea en http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/ align/index . html y http://emboss.open-bio . org/wiki/Appdoc : Needle . Después se comparan los residuos de aminoácidos o los nucleotidos en las posiciones de los aminoácidos o de los nucleotidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (según se emplea aquí, la "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a la "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias depende de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Para determinar la identidad colectiva de una secuencia de interés con un ' grupo de secuencias de referencia, se considera que una posición es idéntica si es idéntica a al menos un aminoácido en una posición correspondiente en una o más de las secuencias del grupo de referencia. Con respecto a las listas de segmentos, características o regiones, la identidad se puede calcular en forma colectiva para todos los miembros de dicha lista para obtener un porcentaje de identidad general.
En el presente, se proporcionan secuencias que tienen al menos el 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, • 97, 98 o 99% de identidad con las secuencias divulgadas en el presente.
Según se emplea aquí, el término "correspondiente a" se utiliza para designar la posición de un residuo de aminoácidos en un polipéptido de interés con respecto a un polipéptido de referencia. En general, la posición es la indicada por una alineación proporcionada en el presente (p. e j . , la figura 4 ) .
Según se emplea aquí, el término "hibridiza en condiciones de rigor alto" describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Se puede encontrar orientación para realizar las reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora por referencia. En esa referencia, se describen métodos acuosos y no acuosos, y se puede utilizar cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación de rigor alto incluyen hibridación en 6X de SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0.2X de SSC, 0.1% de SDS a 65 °C o condiciones sustancialmente similares. En el presente, se proporcionan ácidos nucleicos aislados que contienen secuencias que se hibridizan en condiciones de rigor alto con los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos divulgadas aquí y con los ácidos nucleicos divulgados aqui, p. ej . , en el ejemplo 1.
Las proteínas naturales a las que se hace referencia en el presente incluyen específicamente la forma humana de dicha proteína y también formas de otras especies de mamíferos.
Todas las patentes, solicitudes de patente publicadas y referencias publicadas citadas aquí se incorporan por referencia, a todos los efectos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un gráfico de la estructura de P04 determinada a partir de los datos de cristalografía de rayos X. La estructura principal de los residuos de IL-IRa se muestra en negro y la estructura principal de los residuos de IL-?ß se muestra en gris.
La figura 2 presenta tres vistas de un modelo de la proteina P05 unida al dominio extracelular de IL-1RI humana. En P05, los residuos de IL-IRa se presentan en negro y los residuos de IL-?ß se presentan en blanco.
La figura 3 presenta modelos de proteínas quiméricas en donde los residuos de IL-IRa se ilustran en negro y los residuos de IL-?ß se ilustran en blanco. El modelo presenta las proteínas: P01 (figura 3A) , P03 (figura 3B), P04 (figura 3 C ) , P05 (figura 3D), P07 (figura 3E) y P06 (figura 3F) .
La figura 4 proporciona una alineación de varias citocinas de la familia IL-1 humana: IL-?ß (SEQ ID NO:l), IL-la ( SEQ ID NO:2), IL-IRa (SEQ ID N0:3), IL-33 (SEQ ID NO:4), IL-36Ra (SEQ ID NO : 5 ) , IL-36a (SEQ ID N0 : 6 ) , - I L - 36p ( SEQ ID NO: 7) e IL-36y (SEQ ID NO: 8) . Los segmentos mencionados aquí están identificados debajo de la alineación. Además, se identifican las láminas ß y los bucles entre dichas láminas.
La figura 5A es una lista de la secuencia de aminoácidos de P01 (SEQ ID NO:17) . La figura 5B es una lista de la secuencia de aminoácidos de P02 (SEQ ID NO:18) . La figura 5C es una lista de la secuencia de aminoácidos de P03 (SEQ ID NO: 19) . La figura 5D es una lista de la secuencia de aminoácidos de P04 (SEQ ID NO: 20) . La figura 5E es una lista de la secuencia de aminoácidos de P05 (SEQ I D NO:21). Los segmentos de IL- ? ß se muestran en negrita y cursiva. Véase también el ejemplo 1 a continuación.
La figura 6 es una imagen de un gel SDS-PAGE en donde se observan muestras ejemplares de proteina purificada de células de ?. coli que expresan agentes de unión al receptor. Los marcadores de 15 y 20 kDa de peso molecular se indican a la izquierda. Las líneas son de la siguiente manera: marcador de peso molecular (líneas 1 y 6), extracto (líneas 2 y 7), material purificado por cromatografía de intercambio catiónico (líneas 3 y 8), material adicionalmente purificado por cromatografía de intercambio aniónico (líneas 4 y 9) y muestras reducidas de dicho material (líneas 5 y 10). Las líneas de 2 a 5 son de purificación de P05 y las líneas de 6 a 10 son de purificación de P04. Véase también el ejemplo 2.
La figura 7A es una tabla acompañada por una gráfica de barras que muestra la capacidad de las proteínas P06, P07 y P01 de agonizar la señalización relativa a IL- ?ß y a una proteína ß-glucuronidasa (GUS) de control negativo. La figura 7B es una gráfica que presenta el antagonismo de I L- ? ß en diversas concentraciones de IL- ? ß por P01.
La figura 8A es una gráfica que presenta el antagonismo de IL- ? ß por P03 (marcada con hexahistidina ) , P04 (marcada con hexahistidina ) , P05 (marcada con hexahistidina ) e IL-IRa en presencia de IL-?ß (humana) 0.1 ng/ml. La figura 8B es una gráfica que presenta el antagonismo de IL-?ß por los Usados que contienen las formas no marcadas de P01, P02, P03, P04 y P05 e IL-IRa en presencia de IL-?ß (humana) 0.1 ng/ml y que utiliza estimaciones de la concentración de proteina en los Usados respectivos.
La figura 9 contiene gráficas de datos de SPR que muestran la cinética de unión a IL-1RI soluble inmovilizada para las siguientes proteínas: IL-?ß (figura 9A) , IL-IRa (figura 9B) , P04 (figura 9C) y P05 (figura 9D) .
La figura 10A es una gráfica que presenta la desnaturalización térmica de IL-IRa, IL-?ß, P03, P04 y P05 como se describe en el ejemplo 7. La figura 10B presenta la primera derivada negativa de la gráfica en la figura 10A.
La figura 11A es una gráfica de barras que muestra el puntaje medio de tinción corneal ± SEM según lo evaluado por tinción con fluoresceína de la córnea por ojo de dos estudios independientes, en los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron ningún tratamiento (n = 18), P05 10 mg/ml (n=19) o PBS 1.25*, el vehículo (n = 20). Los asteriscos indican la significancia estadística de P05 con relación al vehículo de la siguiente manera: * (P < 0.05) y ** (P < 0.005) .
La figura 11B es una gráfica de barras que representa los datos de un experimento separado que muestra el puntaje medio de tinción corneal ± SEM de la córnea por ojo, en los dias 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron ningún tratamiento (n = 8), vehículo PBS 1.25* (n =8), albúmina sérica murina (MSA) 10 mg/ml (n = 8) o P05 10 mg/ml (n=9) . Los asteriscos indican la significancia estadística de P05 con relación a la albúmina sérica murina de la siguiente manera: * (P < 0.05) y *** ( P < 0.0005) .
La figura 11C es una gráfica de barras que incluye datos sobre ratones que fueron tratados con Restasis® (emulsión de ciclosporina al 0.05%) (n = 8) en el mismo experimento que en la figura 11B. Los asteriscos indican la significancia estadística de P05 con relación al Restasis® de la siguiente manera: * * (P < 0.005) y (P < 0.0005) .
La figura 12A presenta la estructura de la estructura de cristalografía de rayos X (negro) de P04 superpuesta sobre un modelo calculado (gris) de su estructura. La figura 12B ilustra las interacciones entre K64 y E39 de P04; la figura 12C ilustra las interacciones entre los residuos Q149 y S152 del terminal C con 0 y R9 de P0 .
DESCRIPCIÓN DETALLADA La familia IL-1 de citocinas incluye varios miembros, todos tienen un pliegue ß-trébol que comprende seis cadenas ß que forman un barril ß cubierto por otras seis cadenas ß. Las estructuras principales de las formas humanas y de otros mamíferos de estas citocinas son conocidas. Una alineación estructural ejemplar de varios miembros de la familia IL-1 humana se muestra en la figura 1.
Hemos descubierto, entre otras cosas, que el pliegue IL-1 es altamente plástico. En particular, se pueden combinar elementos de miembros diferentes para proporcionar proteínas que agonizan o antagonizan la señalización de citocinas. Los ejemplos de estas proteínas incluyen dominios de citocinas quiméricos que incluyen, por ejemplo, dos o más segmentos o residuos de la superficie de una citocina en el contexto de otra citocina o una secuencia de consenso de citocinas, creando así combinaciones de origen no natural de sitios de interacción del receptor de citocinas de la familia IL-1 diferentes .
Las citocinas de la familia IL-1 pueden incluir al menos dos sitios de interacción del receptor principal, denominados Sitio A y Sitio B. Los Sitios A y B participan en los contactos con el receptor de citocinas principal (p. e j . , IL-1RI) . En el caso de IL-IRa e IL-?ß, por ejemplo, las dos proteínas difieren sustancialmente con respecto a los sitios A y B de modo que IL-lRa tiene menos contactos con el receptor en el Sitio B que en el Sitio A.
Hemos descubierto que es posible construir dominios de citocinas quiméricos funcionales que incluyen un Sitio A derivado de una citocina y un Sitio B derivado de otra citocina. La plasticidad del pliegue IL-1 permite la construcción de diversos dominios de citocinas quiméricos para antagonizar la señalización de IL-1.
Además, las citocinas de la familia IL-1 pueden incluir dos sitios de interacción del receptor secundarios, denominados Sitio C y Sitio D, que participan en el agonismo o antagonismo y pueden ser determinantes de la capacidad de una citocina de interactuar con su receptor de citocinas secundario (p. ej . , IL-IRAcP). La inclusión de los residuos del Sitio C o Sitio D de los antagonistas del receptor naturales (por ejemplo, IL-lRa) puede conferir propiedades antagonistas. Se pueden construir dominios de citocinas quiméricos que incluyen uno o ambos de los Sitios A y B de uno o más agonistas de IL-1 (por ejemplo IL-?ß e IL-lot) o un antagonista del receptor de IL-1 (por ejemplo IL-lRa) y uno o ambos de los Sitios C y D de un antagonista del receptor de IL-1 (por ejemplo IL-lRa). Por lo tanto, es posible producir un dominio de citocina quimérico que antagoniza la señalización y que incluye los residuos del Sitio B de un agonista de IL-1.
También se proporcionan combinaciones ejemplares en la tabla 2 a continuación: Tabla 2 Las secuencias de origen pueden ser idénticas a las secuencias humanas para los dominios de citocinas identificados o pueden contener mutaciones relativas a las secuencias humanas, p. e . , de modo que tienen al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con las secuencias humanas en cada región respectiva, p. ej . , pueden incluir uno o más segmentos de cada región.
Se pueden seleccionar orígenes para los residuos del Sitio A y los residuos del Sitio B para aumentar la afinidad por el receptor principal. Por ejemplo, para unirse a IL-1RI, los residuos del Sitio A se pueden derivar de IL-IRa y los residuos del Sitio B se pueden derivar de IL-?ß.
Un dominio de citocina quimérico puede tener la capacidad de unirse a un receptor de la familia IL-1, p. e . , IL-1RI humana con una D inferior a 10-8, 10-9 o 10-10, p. ej., una KD de entre 10 y 100 veces la KD de un ligando del receptor natural (p. e . , IL-?ß, IL-? o IL-IRa) en las mismas condiciones o menos que la KD de un ligando natural (p. ej . , IL-?ß, IL-?a o IL-IRa) en las mismas condiciones. Por otra parte, en determinadas realizaciones, el dominio de citocina quimérico se une con una KD menor, una Kon más rápida o una Koff más lenta que al menos uno de sus dominios de citocinas madre.
Los dominios de citocinas quiméricos que se unen al receptor de la familia IL-1 y que antagonizan la señalización del receptor se pueden utilizar como agentes de unión al receptor, p. ej., para tratar trastornos mediados por la señalización de citocinas de la familia IL-1 como se describe a continuación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el dominio de citocina quimérico se une a IL-1RI y antagoniza la señalización de IL-1. Por ejemplo, tiene una IC50 inferior a 100, 10, 1, 0.6 o 0.3 nM.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina puede tener al menos el 40, 45 o 50% de identidad, pero menos que identidad completa, p. ej . , menos del 95, 90, 85 u 80% de identidad con un primer dominio de citocina de la familia IL-1. Al mismo tiempo, el dominio de citocina también puede tener al menos el 40, 45 o 50% de identidad, pero menos que identidad completa, p. ej . , menos del 95, 90, 85 u 80% de identidad con un segundo dominio de citocina de la familia IL-1. El primer y el segundo dominio de citocina de la familia IL-1 pueden tener menos del 50% de identidad entre si. Por ejemplo, el primer dominio de citocina de la familia IL-1 puede ser un agonista (p. ej . , IL-?ß o IL-la) , mientras que el segundo dominio de citocina de la familia IL-1 puede ser un antagonista del receptor (p. e . , IL-IRa) .
En algunas realizaciones, al menos el 80, 85, 90, 92, 94, 95, 97, 98, 99 o 100% de las posiciones dentro del dominio de citocina tienen la característica de que, en cada posición, el aminoácido presente tienen identidad con el primer dominio de citocina de la familia IL-1 o con el segundo dominio de citocina de la familia IL-1 (o ambos, si el primer y el segundo dominio de citocina de la familia IL-1 tienen identidad en la posición específica) . Cuando el 100% de las posiciones de los aminoácidos en el dominio de citocina tienen esta característica, el dominio es una quimera completa de dos citocinas. Los dominios de citocinas quiméricos también pueden estar hechos de más de dos citocinas y también pueden tener mutaciones con respecto a sus citocinas madre (p. e . , una o más posiciones específicas en donde el aminoácido presente difiere del aminoácido correspondiente en cada una de sus citocinas madre) .
Los dominios de citocinas pueden tener residuos del Sitio A, B, C y D de dominios de citocinas de IL-1 diferentes y asimismo pueden tener regiones del Sitio A, B, C y D de dominios de citocinas de IL-1 diferentes.
SITIO A. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos de un antagonista (p. ej., IL-IRa) o un agonista del receptor en al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17 o 18 de los residuos del Sitio A identificados anteriormente, o en al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 de los residuos del Sitio A extendido identificado anteriormente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100% de dichos residuos. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye residuos que tienen al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los segmentos Al, A2 o A1+A2 en un antagonista (p. ej . , IL-IRa) o un agonista del receptor (p. ej . , IL-?ß o IL-la) .
En determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos que tienen identidad con un agonista de IL-1 (p. e j . , residuos de IL-?ß) en al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17 o 18 de los residuos del Sitio A identificados en el presente, o al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17, o 18 de los residuos del Sitio A extendido identificados anteriormente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100% de dichos residuos.
SITIO B. En determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos que tienen identidad con un agonista de IL-1 (p. e j . , residuos de IL-?ß o IL-?a) en al menos 2, 3, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de los residuos del Sitio B identificados en el presente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100% de dichos residuos. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye residuos que tienen al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100% de identidad con los segmentos Bl, B2, B3, B1+B2, B1+B3, B2+B3 o B1+B2+B3 en un agonista de citocinas de IL-1 (p. ej . , IL-?ß o IL-lcc) .
SITIO C. En determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos que tienen identidad con un antagonista del receptor (p. ej . , residuos de IL-IRa) en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de los residuos del Sitio C identificados en el presente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90 o 100% de dichos residuos. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye residuos que tienen al menos el 50, 65, 75, 80, 90 o 100% de identidad con el segmento Cl en un antagonista del receptor (p. ej . , IL-IRa).
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina puede incluir, por ejemplo, uno o más de: un aminoácido hidrofóbico (p. ej . , Met o lie) en la posición correspondiente a THR137 de SEQ ID NO:l, o un hidrofóbico, p. ej., un aminoácido alifático (p. e . , Val o lie), en la posición correspondiente a GLN141 de SEQ ID NO:l y un aminoácido no ácido, por ejemplo un aminoácido básico (p. ej., Lys o Arg) en la posición correspondiente a ASP145 de SEQ ID NO:l, y los residuos en las posiciones correspondientes a estos en otras citocinas de IL-1. Las pruebas indican que Aspl45 es importante para el reclutamiento de IL-IRAcP y, por lo tanto, la mutación a un residuo no ácido desestabiliza la actividad agonista y se puede utilizar para lograr propiedades antagonistas. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, un aminoácido no ácido, por ejemplo un aminoácido básico (p. ej . , Lys o Arg) o un aminoácido hidrofóbico, está ubicado en la posición correspondiente a ASP145 de SEQ ID N0:1.
SITIO D. En determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos que tienen identidad con un antagonista del receptor (p. e . , residuos de IL-IRa) en al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de los residuos del Sitio D identificados en el presente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100% de dichos residuos. En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye residuos que tienen al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100% de identidad con los segmentos DI, D2 , D3, D4 , D5, D1+D2, D1+D2+D3 y sus combinaciones en un antagonista del receptor (p. ej . , IL-lRa) .
Diversos residuos en IL-?ß se ponen en contacto o están cercanos a IL-1RI, por ejemplo: ALAI, PR02, VAL3 , ARG , LEU6 , ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27 , LEU 29 , HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN3 , ASP35, MET36, GLN38, GLN39, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PR057, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, ALA127, GLU128, ASN129, MET130, GLN141, GLN149, PHE150 y SER152. Además de la designación en los sitios como se describió anteriormente, estos residuos se pueden clasificar en dos grupos: Grupo 1 y Grupo 2.
Residuos del Grupo 1 ejemplares en IL-?ß incluyen: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU 29 , HIS30, LEU31 , GLN32, GLY33 , GLN34 , ASP35, ET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 y GLN141 y los residuos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL-1. Los residuos del Grupo 1 extendido incluyen los residuos de interacción del Grupo 1 y los residuos dentro de 4 angstrom de los anteriores en la estructura 1ITB. Residuos del Grupo 2 ejemplares en IL-?ß incluyen: ALAI, PR02, VAL3 , ARG4 , LEU 6 , PHE46, GLN48 , GLU51 , SER52 , ASN53, LYS55, ILE56, PR057, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152 y los residuos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL-1. Los residuos del Grupo 2 extendido incluyen los residuos de interacción del Grupo 2 y los residuos dentro de 4 angstrom de los anteriores en la estructura 1ITB. En determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos de IL-?ß en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Grupo 1 identificados anteriormente. En determinadas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos de IL-?ß en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 de los residuos del Grupo 2 identificados anteriormente. En algunas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos de IL-?ß en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Grupo 1 extendido. En algunas realizaciones, un dominio de citocina incluye residuos de IL-?ß en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Grupo 2 extendido.
Otras variantes que se pueden utilizar como un agente de unión al receptor incluyen las proteínas que tienen secuencias derivadas de dos o más miembros de la familia de citocinas IL-1. Ejemplos de dichas variantes incluyen dominios quiméricos basados en IL-?ß e IL-IRa. Por ejemplo, las variantes pueden incluir uno o más residuos de aminoácidos del Grupo 1 de IL-IRa (p. ej . , todos los residuos del Grupo 1 de IL-IRa) y uno o más residuos de aminoácidos del Grupo 2 de IL-?ß (p. e . , todos los residuos del Grupo 2 de IL-?ß) .
Las proteínas quiméricas ejemplares son mayoritariamente idénticas (p. e . , al menos el 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 o 100%) a IL-?ß en las siguientes posiciones de aminoácidos (es decir, en base a la correspondencia con estas posiciones en IL-?ß) : residuos 1-8, 42-120 y 141-153 de SEQ ID NO : 1 ; residuos 1-6, 45-61, 86-95 y 148-153 de SEQ ID NO:l y residuos 1-10, 37-125 y 131-153 de SEQ ID NO:l.
Los residuos restantes pueden ser mayoritariamente idénticos (p. e . , al menos el 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 o 100%) a IL-IRa. Por ejemplo, las siguientes posiciones de aminoácidos pueden ser mayoritariamente idénticas a IL-IRa: residuos 9-41 y 121-140 de SEQ ID NO:l; residuos 7-44, 62-85 y 96-147 de SEQ ID NO:l y residuos 11-36 y 126-130 de SEQ ID NO: 1.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina tienen identidad con IL-?ß en al menos 2, 4, 5, 10 o 20 posiciones además de las posiciones de los aminoácidos Gln48 - Asn53 de IL-?ß, y, p. e j . , el dominio de citocina es mayoritariamente idéntico, p. ej . , al menos el 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 o 100% a una citocina diferente de IL-?ß.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 1-8 de SEQ ID NO:l. Por ejemplo, incluye residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 3, 4 o a los 5 de: ALAI, PR02, VAL3, ARG4 y LEU6.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 45-61 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de: PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56 y PR057.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 86-95 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a uno, dos o los tres de LYS92, LYS93 y LYS94.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos 3, 4, 5 o 6 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 148-153 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a uno, dos o los tres de GLN149, PHE150 y SER152.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina no incluye una treonina en la posición correspondiente a THR147 en IL-?ß. Por ejemplo, esta posición puede ser un aromático, por ejemplo una tirosina. El aromático en la posición correspondiente a THR147 en IL-?ß se puede comprimir contra otro aromático (p. ej . , triptófano) presente en diversas realizaciones en la posición 11 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) .
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina no incluye un aromático en la posición correspondiente a CYS8 en IL-?ß. Por ejemplo, esta posición puede ser un aminoácido diferente de fenilalanina u otro que no sea un aromático. Por ejemplo, puede ser cisteina, valina, serina, treonina o alanina. Esta posición está ubicada cerca de otros residuos voluminosos, especialmente MET44 ? MET148 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) . Preferentemente, no todas las posiciones 8, 43 y 148 son residuos voluminosos.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos cinco, seis o siete residuos que tienen identidad con IL-IRa en las posiciones correspondientes a 30-36 de SEQ ID N0:1, p. e . , al menos cinco, seis o siete residuos que tienen identidad con YLQGPNV (SEQ ID NO:43) . Por ejemplo, el dominio de citocina incluye al menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25 o 26 residuos que tienen identidad con IL-IRa en las posiciones correspondientes a 11-36 de SEQ ID NO:l. El dominio de citocina también puede incluir un residuo básico en la posición correspondiente a 145 de SEQ ID NO: 1.
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye: (a) un ácido glutámico en la posición correspondiente a Val40 de IL-?ß y lisina en la posición correspondiente a Lys65 de IL-?ß; (b) arginina en la posición correspondiente a Thr9 de IL-?ß y glutamina en la posición correspondiente a Glnl49 de IL-?ß; o (c) lisina en la posición correspondiente a V41 de IL-?ß y serina en la posición correspondiente a Serl52 de IL-?ß.
El dominio de citocina también puede incluir al menos cuatro, cinco, seis o siete residuos que tienen identidad con IL-IRa en las posiciones correspondientes a 126-132, p. ej . , al menos cuatro, cinco, seis o siete residuos que tienen identidad con MEADQPVS (SEQ ID NO : 44 ) .
En determinadas realizaciones, el dominio de citocina incluye al menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 62-85 de SEQ ID NO:l.
En algunas realizaciones, el dominio de citocina incluye una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos (p. ej., las cuatro de): RSLAFR ( SEQ ID NO:45), IDVSFV (SEQ ID NO: 46), KKMD R ( SEQ ID NO: 47) y FYMQF ( SEQ ID NO: 8); una o más de las siguientes (p. e . , las cuatro de) RSLAFR (SEQ ID NO:45), IDVSFV (SEQ ID NO:46), NKLSFE ( SEQ ID NO:49) y KFYMQF (SEQ ID NO:48); una o más de las siguientes (p. ej., las cuatro de) RSLAFR (SEQ ID NO:45), EEKFSM (SEQ ID NO:50), RFVFIR (SEQ ID NO: 51) y VTKFTM (SEQ ID NO: 52); una o más de las siguientes (p. ej . , las cuatro de) RSLAFR (SEQ ID NO:45), EEKFSM (SEQ ID NO:50), FESAAC (SEQ ID NO:53) y VTKFTM (SEQ ID NO: 54); o una o más de las siguientes (p. e j . , las cuatro de) LNCRI (SEQ ID NO: 55), EEKFSM (SEQ ID NO:50), PNWFLC (SEQ ID NO: 56) y KFYMQF (SEQ ID NO: 8).
Las proteínas quiméricas se pueden utilizar para diversos fines. Por ejemplo, se pueden utilizar para aumentar o disminuir la actividad de señalización del receptor, para detectar células que expresan receptores o para purificar células o proteínas a las cuales se unen.
Ejemplos específicos de dominios de citocinas quiméricos que se basan en IL-?ß e IL-Ra se proporcionan en el ejemplo 1 a continuación e incluyen los siguientes dominios de citocinas ejemplares que antagonizan la señalización de IL-1: P01. El dominio de P01 incluye tres segmentos de IL-IRa correspondiente a los aminoácidos Alal2-Val48, Ile60-Val83 y Asp95-Tyrl47 de SEQ ID NO: 3 y los cuatro segmentos restantes de IL-?ß. En general, el dominio de P01 tiene 74 de 153 aminoácidos de IL-?ß (aproximadamente el 48% de identidad) y 119 aminoácidos de IL-IRa (aproximadamente el 77% de identidad) . Estos porcentajes suman más del 100% porque varios aminoácidos en P01 y otras proteínas ejemplares divulgadas en el presente son aminoácidos que se conservan entre IL-?ß e IL-IRa y, por lo tanto, contribuyen al porcentaje de identidad para IL-?ß e IL-IRa.
P02. El dominio de P02 incluye tres segmentos de IL-IRa correspondiente a los aminoácidos Alal2-Val48, Ile60-Val83 y Serll0-Tyrl47 de SEQ ID NO: 3 y los cuatro segmentos restantes de IL-?ß. En general, el dominio de P02 tiene 85 de 153 aminoácidos de IL-?ß (aproximadamente el 55% de identidad) y 108 aminoácidos de IL-IRa (aproximadamente el 70% de identidad) .
P03. El dominio de P03 incluye dos segmentos de IL-IRa correspondiente a los aminoácidos Alal2-Lys45 y Phel 00-Lys 145 de SEQ ID NO : 3 y los tres segmentos restantes de IL-?ß. En general, el dominio de P03 tiene 94 de 153 aminoácidos de IL-?ß (aproximadamente el 61% de identidad) y 91 aminoácidos de IL-IRa (aproximadamente el 64% de identidad).
P04. El dominio de P04 incluye dos segmentos de IL-IRa correspondiente a los aminoácidos Alal2-Lys45 y Alai 14 -Lysl45 de SEQ ID NO : 3 y los tres segmentos restantes de IL-?ß. En general, el dominio de P04 tiene 104 de 153 aminoácidos de IL-?ß (aproximadamente el 68% de identidad) y 89 aminoácidos de IL-IRa (aproximadamente el 58% de identidad) .
P05. El dominio de P05 incluye dos segmentos de IL-IRa correspondiente a los aminoácidos Argl4-Lys45 y Phel20-Tyrl47 de SEQ ID NO : 3 y los tres segmentos restantes de IL-?ß. En general, el dominio de P05 tiene 108 de 153 aminoácidos de IL-?ß (aproximadamente el 70% de identidad) y 85 aminoácidos de IL-IRa (aproximadamente el 55% de identidad) .
Se pueden construir otras proteínas quiméricas de manera similar. Por ejemplo, las proteínas quiméricas se pueden hacer entre IL-?a e IL-IRa, p. e j . , específicamente dominios que incluyen los segmentos identificados de IL-IRa en combinación con los residuos correspondientes de IL-?a en lugar de IL-?ß para cada uno de los ejemplos anteriores.
Sustituciones y modificaciones de proteínas Las secuencias de proteínas, por ejemplo las descritas en el presente, se pueden variar, p. e j . , realizando una o más sustituciones conservadoras. Se pueden hacer sustituciones conservadoras para retener la función o para realizar cambios moderados en la función. En la siguiente tabla, se describen sustituciones conservadoras ejemplares: Tabla 3 Las sustituciones se pueden elegir en base a su efecto potencial sobre (a) la estructura fundamental cercana a la sustitución, por ejemplo, una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen y la ramificación de la cadena lateral. Los residuos de aminoácidos se pueden clasificar en base a las propiedades de la cadena lateral: (1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofilicos neutrales: cys, ser, thr; asn; gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que afectan la conformación de la estructura: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe .
Las sustituciones no conservadoras pueden incluir la sustitución de un miembro de una de estas clases por un miembro de una clase diferente. Las sustituciones conservadoras pueden incluir la sustitución de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase.
La significancia de un residuo determinado también se puede evaluar en el contexto del índice hidropático para el aminoácido. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9) y arginina (-4.5) . Para conocer un planteamiento sobre el Indice hidropático de los aminoácidos y su significancia véase, por ejemplo, Kyte y col., 1982, J. Mol. Biol . 157:105-131.
La secuencia de una proteina se puede variar a través de cualquier método, incluso mutagénesis (de sitio dirigido) mediada por ol igonucleótidos , (Cárter y col., Nucí. Acids Res..13:4331, 1986; Zoller y col., Nucí. Acids Res., 10:6487, 1987), mutagénesis por inserción de un cásete (Wells y col., Gene, 34:315, 1985), mutagénesis por selección de restricción (Wells y col., Philos. Trans. R. Soc. London, 317:415, 1986) y mutagénesis dirigida por PCR. Véase también "In Vitro Mutagénesis Protocols": tercera edición, Braman (ed.), Humana Press, (2010) ISBN: 1607616513 y "PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering" , Chen y Janes (ed.), Humana Press, (2002) ISBN: 0896039730.
Se puede emplear análisis de barrido de aminoácidos para evaluar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. El método puede comprender mutar todos o casi todos los aminoácidos en una región a un aminoácido especifico, p. e . , a un aminoácido neutral relativamente pequeño, por ejemplo alanina, serina o valina. Típicamente, se escoge alanina porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989) . Además, es el aminoácido más común y frecuentemente se encuentra en posiciones enterradas y expuestas (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1, 1976) . El proceso de barrido también se puede adaptar para realizar cambios más marcados, p. e . , los residuos cargados se pueden cambiar por residuos de la carga opuesta, los residuos con cadenas laterales cortas se pueden reemplazar por residuos con cadenas laterales voluminosas. Por ejemplo, el barrido de arginina es un enfoque que se puede utilizar en lugar del barrido de alanina o además de este último. El barrido se puede aplicar a cada residuo en una región o a residuos de una característica específica, p. ej . , residuos en la superficie, o cerca de esta, de una proteína o que sea probable que estén en la superficie, o cerca de esta, de la proteína .
La estructura de una proteína, uno de sus dominios o un complejo que involucra la proteína se pueden modelar, p. e j . , realizando modelado basado en homología, minimización de la energía u otro tipo de modelado utilizando las estructuras resueltas conocidas. Dichos métodos incluyen: Accelrys Software Inc., Díscovery Studio®, Reléase 3.0 , San Diego: Accelrys Software Inc., 2010, AMBER™ modeling software (Case y col. (2005) J. Computat. Chem. 26, 1668-1688 y Case y col. (2010), AMBER 11, University of California, San Francisco, CA EUA) y CHARMM™ modeling software (Molecular Simulations Inc.) . Véase también en general Baker y Sali, Science 294 (5540) :93-6, 2001) . La estructura también se puede determinar directamente, p. e j . , utilizando cristalografía de rayos X o espectroscopia de NMR.
Estructuras de PDB ejemplares que describen la estructura de las citocinas de la familia IL-1 incluyen: 1I1B, HLR, 1IRA, 1ITB, 2I1B, 2ILA, 2KLL, 4I1B, 5I1B, 6I1B, 7I1B, 8I1B, 9ILB y 1MD6 (disponible en http de www.pdb.org de RCSB-Rutgers, Piscataway NJ, EUA y en la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EUA) ) . Por ejemplo, se han resuelto las estructuras de IL-?ß sola y en complejo con el receptor IL-1RI. Véase p. ej . , Finzel y col. (1989) J. Mol. Biol. 209: 779-791, PDB 1ITB y Vigers y col. (1997) Nature 386: 190-194. La estructura de IL-IRa con IL-1RI también se ha resuelto. Véase, p. ej . , PDB 1IRA y Schreuder y col., (1997) Nature 386: 194-200.
El modelado por homología puede ser asistido por la alineación de secuencias, p. ej . , utilizando un software informático, por ejemplo "Basic Local Alignment Search Tool" (BLAST), PSI-BLAST, PHI-BLAST, WU-BLAST-2 o MEGABLAST . Véase Altschul y col., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul y col., 1996, Methods in Enzymology 266, 460-480 y Karlin y col., 1993, PNAS EUA 90, 5873-5787. Los algoritmos adicionales para la alineación de macromoléculas (secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos) incluyen FASTA (Pearson, 1995, Protein Science 4, 1145-1160), Clustal (Higgin y col., 1996, Methods Enzymol. 266, 383-402), DbClustal (Thompson y col., 2000, Nucí. Acids Res. 28, 2910-2926) y Molecular Operating Environment (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec Canadá H3A 2R7) . Además, se puede utilizar el algoritmo de Myers y Miller (Myers y Miller, CABIOS 4, 11-17, 1988) que se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) del paquete de software de alineación de secuencias GCG.
Se puede obtener una secuencia de consenso para IL-?ß e IL-IRa comparando las dos secuencias e identificando los residuos que tienen identidad o que están altamente conservados. Un dominio de citocina quimérico descrito en el presente puede tener al menos el 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de identidad con dichos residuos o residuos altamente conservados. Una secuencia de consenso ejemplar es: DXXQKX{8-9 } L-AXXLQGX { 18-28 } LGX { 7 } LSCVXXXDXXXLQLEXVX { 8- 9 } XXKRFXFX { 10 } FESAXXPXWXXXTXXXXXXPVXLX { 5-6 } GXXXTXFXXQ ( SEQ ID NO: 57), en donde X es independientemente cualquier aminoácido y el número de subíndice o intervalo es el número de ocurrencias. Un dominio de citocina quimérico descrito en el presente puede tener al menos el 60, 70, 80, 90, 95 o 100% de identidad con la secuencia de consenso (en donde los residuos X no se cuentan para la identidad) . Otras secuencias de consenso se pueden identificar del mismo modo.
Se pueden realizar otras variantes de un miembro de la familia de citocinas IL-1 y evaluar utilizando un sistema basado en visuali zación u otra selección basada en genotecas. Por ejemplo, se pueden visualizar o expresar y evaluar las variantes de la proteina para conocer la capacidad de unirse a un receptor para el miembro de la familia de citocinas IL- 1. Por ejemplo, se pueden evaluar las variantes de IL-?ß, IL-lRa o un dominio de citocina descrito en el presente para conocer la capacidad de unirse al dominio extracelular soluble de IL-1RI. Una 'descripción general de los sistemas basados en visuali zación incluyen los siguientes: para la visualización de células, Chao y col. Nat Protoc . 2006; 1 (2) :755-68; Colby y col. Methods Enzymol. 2004 ; 388 : 348-58; Boder y col., Methods Enzymol. 2000;328:430-44), para la visualización de fagos (p. e . , Viti y col., Methods Enzymol. 2000;326:480-505 y Smith (1985) Science 228:1315-1317) y para la visualización de ribosomas (p. e . , Mattheakis y col. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:9022 y Hanes y col. (2000) Nat Biotechnol . 18:1287-92; Hanes y col. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; y Schaffitzel y col. (1999) J Immunol Methods. 231 ( 1-2 ) : 119-3.
Aunque muchas de las realizaciones en el presente se ejemplifican utilizando secuencias de citocinas de IL-1 humana como dominios madre, se pueden utilizar otras secuencias. Muchas otras citocinas de IL-1, p. e . , de otras especies, se conocen y están disponibles y se pueden encontrar en bases de datos públicas, por ejemplo Entrez (Biblioteca Nacional de Medicina, Bethesda MD) y EBI-EMBL (Hinxton, Cambridge, RU). Ejemplos de dichas secuencias de la base de datos UNIPROT (disponible en UniProt.org y véase The UniProt Consortium, Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)), incluyen los siguientes: Los dominios de citocinas descritos en el presente también pueden incluir sustituciones presentes en los dominios de citocinas variantes que son capaces de unirse a IL-1RI. Por ejemplo, la posición 15 de SEQ ID N0:1 (correspondiente a la posición 20 de SEQ ID NO: 3) puede ser Met o Asn. La posición 30 de SEQ ID N0:1 (correspondiente a la posición 34 de SEQ ID N0:3) puede ser Gly, His, Trp o Met.
Variantes ejemplares adicionales de IL-?ß e IL-IRa incluyen las descritas en Boraschi y col. (1996) Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library 1, d270-308, Evans y col., J. Biol. Chem., 270:11477 (1995) y Greenfeder y col., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995) . Por ejemplo, las variantes de IL-?ß incluyen R11G, R11A, Q15H, E105G y T147G. Véase, p. e j . , Evans y col. Las variantes de IL-lRa incluyen W16Y, Q20M, Q20N, Y34G, Y34H, Y34W, Y34M, Y147G, Y147H, Y147M, K145D, H54P, V18S, T108K, C116F, C122S, C122A, Y147G, H54P, H54I y otras en Evans y col. y Greenfeder y col., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995) . Un dominio de citocina puede incluir un residuo que tiene identidad con IL-lRa en una de las posiciones anteriores. Un dominio de citocina también puede incluir un residuo diferente de una de las mutaciones anteriores en una posición correspondiente.
Además, las citpcinas de la familia IL-1 pueden incluir uno o más residuos de cisteina desparejados. Se pueden mutar uno o más, p. e j . , dos, tres o todos los residuos de cisteina desparejados a otro aminoácido, p. e j . , un aminoácido sin carga, por ejemplo alanina o serina. Por ejemplo, P01 incluye cisteinas en las posiciones 67, 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: 17. Se pueden sustituir una, dos, tres o las cuatro cisteinas por otro aminoácido, p. ej . , un aminoácido sin carga, por ejemplo alanina o serina. P02 incluye cisteinas en las posiciones 67, 70, 116 y 122 de SEQ ID NO:18. Se pueden sustituir una, dos, tres o las cuatro cisteinas por otro aminoácido, p. ej . , un aminoácido sin carga, por ejemplo alanina o serina. P03 incluye cistelnas en las posiciones 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: 19. Se pueden sustituir una, dos o las tres cisteinas por otro aminoácido, p. e . , un aminoácido sin carga, por ejemplo alanina o serina. P04 incluye cisteinas en las posiciones 70, 116 y 122 de SEQ ID N0:20. Se pueden sustituir una, dos o las tres cisteinas por otro aminoácido, p. e j . , un aminoácido sin carga, por ejemplo alanina o serina. P05 incluye cisteinas en las posiciones 8, 70 y 122 de SEQ ID NO: 21. Se pueden sustituir una, dos o las tres cisteinas por otro aminoácido, p. ej . , un aminoácido sin carga, por ejemplo alanina o serina.
Un dominio de citocina de la familia IL-1, incluso los dominios de citocinas quiméricos descritos en el presente, también se puede permutar cíclicamente. Por ejemplo, se puede reposicionar un segmento C-terminal del dominio de modo que sea N-terminal para el extremo amino terminal original y un segmento N-terminal (que generalmente comprende el resto de la proteina original después de la escisión del segmento C-terminal) . Se pueden separar los dos segmentos reposicionados mediante un ligador (p. ej . , de entre aproximadamente tres y diez aminoácidos) . Generalmente, se retienen todos los aminoácidos en el dominio antes de la permutación, excepto por el cambio en el orden. En algunas realizaciones, el punto de corte para la permutación puede estar en una región flexible, p. e . , un bucle flexible como el ßß-ß7 (p. ej . , los aminoácidos correspondientes a 71-80 de SEQ ID NO: 3) o el bucle p7-p8 (p. ej . , los aminoácidos correspondientes a 84-99 de SEQ ID NO: 3) .
En algunas realizaciones, un agente de unión al receptor descrito en el presente, p. ej.. , un agente de unión al receptor que incluye un dominio de citocina de la familia IL-1 tiene un peso molecular inferior a 30, 25, 22, 20, 19, 18 o aproximadamente 17 kDa. En algunas realizaciones, el agente de unión al receptor tiene un peso molecular superior a 18, 19, 20, 22, 25, 30, 40, 45 o 50 kDa. Por ejemplo, el agente de unión al receptor puede incluir otros componentes polipeptidicos, poliméricos o no poliméricos, por ejemplo, componentes que modifican la farmacocinética, la estabilidad, la inmunogenicidad o el peso molecular de los agentes. La proteina puede incluir otras modificaciones, p. ej . , modificaciones postraduccionales o sintéticas. En determinadas realizaciones, el agente de unión al receptor no es glicosilado. En otras realizaciones, el agente de unión al receptor incluye al menos una glicosilación .
Por ejemplo, los agentes de unión al receptor descritos en el presente pueden incluir dominios y características adicionales. Por ejemplo, un agente de unión al receptor se puede fusionar, directa o indirectamente, con un dominio de una proteína anticuerpo, p. ej . , con un dominio Fe o con uno o más dominios constantes (p. e j . , CH1, CH2 o CH3). Por ejemplo, los dominios pueden ser dominios humanos o variantes de dominios humanos. El dominio Fe o uno o más de los dominios constantes pueden estar ubicados en el terminal N o el terminal C para el agente de unión al receptor.
Los dominios Fe se pueden obtener de cualquier inmunoglobulina adecuada, p. e . , de un anticuerpo humano, p. ej., un anticuerpo de los subtipos IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 , IgA, IgE, IgD o IgM. En un ejemplo, el dominio Fe incluye una secuencia de un residuo de aminoácidos en aproximadamente la posición Cys226 o de aproximadamente la posición Pro230, para el extremo carboxilo terminal del dominio Fe. Un dominio Fe generalmente incluye dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y, opcionalmente , incluye un dominio CH4. También se describen los anticuerpos con sustituciones en una región Fe de estos y vidas medias séricas elevadas en WO00/42072, O 02/060919; Shields y col., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004) . La numeración de los residuos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU como en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed . Public Health Service, NH1, MD (1991) con referencia a la numeración del anticuerpo EU de IgGl humana.
E.n una realización, un agente de unión al receptor incluye un epitopo de unión al receptor de rescate que aumenta la vida media sérica ín vivo, como se describe, p. e . , en la patente de Estados Unidos 5739.277 y en Ghetie y col., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000) . En algunas realizaciones, el epitopo se incluye en una región Fe que se fusiona con el agente de unión al receptor.
En una realización, un agente de unión al receptor incluye una secuencia de albúmina sérica o una parte de dicha secuencia que se une al receptor de FcRn, o una secuencia que se un a la albúmina sérica, p. e . , la albúmina sérica humana. Por ejemplo, se pueden asociar determinados péptidos unidos a la albúmina sérica con el agente de unión al receptor, p. e . , la secuencia DICLPRWGCL (SEQ ID NO:22) . Véase también, Dennis y col. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) .
Ss pueden modificar los agentes de unión al receptor para incluir una secuencia que aumenta el tamaño y la estabiLidad del agente, p. ej . , una secuencia descrita en WO2008 155134 o O2009/023270. Generalmente, dichas secuencias pueden ser biológicamente inactivas, p. e . , no modulan la señalización mediada por los miembros de la familia de citocinas IL-1. Se pueden utilizar diversas secuencias de polipéptidos estabilizadoras, p. ej . , secuencias ricas en glicina o serina, asi como otros aminoácidos, por ejemplo glutamato, aspartato, alanina o prolina. Por ejemplo, se pueden diseñar las secuencias de modo que tengan al menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de residuos de glicina o serina. En algunas realizaciones, la longitud combinada de las secuencias de polipéptidos estabilizadoras que están unidas a una proteina puede ser de al menos 20, 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más de 1000 o 2000 aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias estabilizadoras se pueden fusionar con un polipéptido biológicamente activo, por ejemplo con el extremo amino o carboxilo terminal del agente de unión al receptor. La fusión de las secuencias estabilizadoras puede dar lugar a un aumento significativo en el radio hidrodinámico de la proteina de fusión con respecto a la proteina no modificada, que se puede detectar, por ejemplo mediante ultra centri fugación , cromatografía de exclusión por tamaño o dispersión de luz. En algunas realizaciones, las secuencias estabilizadoras contienen pocos o ninguno de los siguientes aminoácidos: cisteína (para evitar la formación de disulfuro y la oxidación), metionina (para evitar la oxidación), asparagina y glutamina (para evitar desamidación ) y aspartato. Se pueden diseñar las secuencias estabilizadoras de modo que contengan residuos de prolina que tienden a reducir la sensibilidad a la degradación proteoli tica .
Ensayos de unión La interacción de un agente de unión al receptor y sus dianas se puede analizar utilizando cualquier enfoque adecuado, incluido por ejemplo radioinmunoensayos , ensayos de unión celular y resonancia del plasmón superficial (SPR) . Un ensayo de unión celular ejemplar que utiliza competencia de proteínas radioyodadas se describe en Boraschi, J. Immunol., 155 (10) :4719-25 (1995) .
La SPR o el análisis de interacción biomolecular (BIA) pueden detectar las interacciones bioespecí ficas en tiempo real, sin marcar a ninguno de los elementos de interacción. Los cambios de masa en la superficie de unión (que indican una instancia de unión) del chip de BIA provocan modificaciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR)) . Los cambios en la refractividad generan una señal detectable y estas se miden como una indicación de reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas. Los métodos para utilizar SPR se describen, por ejemplo, en Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo y col., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y los recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia) . Se puede utilizar un sistema BIAcore® o un Reichert SR7000DC SPR de doble canal para comparar y clasificar las interacciones en tiempo real, en términos de cinética, afinidad o especificidad sin el uso de marcadores. Se pueden medir las afinidades de unión de un agente de unión al receptor para un dominio extracelular del receptor de citocinas (p. ej . , el dominio extracelular de IL-1RI) utilizando SPR en condiciones aproximadamente fisiológicas, p. ej., HEPES 10 mM a pH 7.4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0.005% de Tween-20. Además, se pueden utilizar otros métodos que no se basan en SPR, p. e j . , para medir la unión y la afinidad.
Se puede utilizar la información de los ensayos de unión para proporcionar una medida adecuada y cuantitativa de la constante de equilibrio de disociación ( D) y los parámetros cinéticos (p. e j . , Kon y off) para la unión de un agente de unión al receptor a una diana. Estos datos se pueden utilizar para comparar diferentes proteínas, dianas y condiciones. Esta información también se puede utilizar para desarrollar relaciones estructura-actividad (SAR) . Por ejemplo, los parámetros cinéticos y de unión de equilibrio de las proteínas variantes se pueden comparar con los parámetros de una referencia o proteína madre. Se pueden identificar aminoácidos variantes en determinadas posiciones que se correlacionan con parámetros de unión específicos, p. e . , alta afinidad y baja Koff. Se puede combinar esta información con el modelado estructural (p. e . , utilizando modelado por homología, minimización de la energía o determinación de la estructura por cristalografía de rayos X o NMR) .
Se pueden producir las proteínas utilizadas para evaluar las afinidades en forma recombinante y pueden incluir etiquetas adecuadas para la purificación o inmovilización, p. e . , una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta hemaglutinina , una etiqueta His o una fusión del dominio Fe. Se pueden producir los dominios extracelulares de las proteínas del receptor (por ejemplo IL-1RI e IL-IRAcP) en forma recombinante por expresión, p. e . , en células bacterianas o de insectos, por ejemplo, utilizando expresión del baculovirus en células Sf9. Se pueden inmovilizar las proteínas del receptor solubles en el sistema BIAcore, p. ej . , utilizando chips que inluyen reactivos que se unen a sus etiquetas, por ejemplo, un chip recubierto con IgG específica para el dominio Fe u otra etiqueta.
Ensayos de actividad celular Se puede evaluar la capacidad de los agentes de unión al receptor de funcionar como antagonistas del receptor, p. e j . , en un ensayo basado en células. Por ejemplo, es posible evaluar la inhibición de IL-1RI por un agente de unión al receptor. Diversos ensayos ejemplares para la actividad de IL-1 se describen en Boraschi y col. e incluyen ensayos de proliferación de células T, ensayos de producción de IL-6 e IL-8 e inhibición de la afluencia de calcio.
En un ensayo ejemplar, se evalúa la capacidad de un agente de unión al receptor de inhibir la liberación estimulada por IL-?ß de IL-6 de fibroblastos humanos. La inhibición de la liberación de citocinas estimulada por IL-?ß en células MRC5 se correlaciona con la capacidad del agente de inhibir la actividad mediada por IL-1 in vivo. Los detalles del ensayo se describen en Dinarello y col., Current Protocols in Immunology, Ch . 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., 2000. En resumen, los fibroblastos humanos de MRC5 humana (N.° de ATCC CCL-171, Manassas VA, EUA) crecen hasta la confluencia en placas de pocilios múltiples. Se tratan las células con dosis tituladas del agente de unión al receptor y controles. Posteriormente, las células se ponen en contacto con IL-?ß 100 pg/ml en presencia del agente titulado o los controles. Las células de control negativo no se estimulan con IL-?ß. Se mide la cantidad de IL-6 liberada en cada grupo de células tratadas utilizando un kit ELISA IL-6 (p. e j . , BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, EUA) . Los controles que se pueden utilizar incluyen tampón solo, IL-IRa y anticuerpos para IL-?ß.
La eficacia de un agente de unión al receptor también se puede evaluar in vivo. Un ensayo ejemplar se describe en Economides y col., Nature Med. , 9:47-52 (2003). En resumen, se inyecta a los ratones por via intraperitoneal con dosis tituladas del agente de unión al receptor y controles. Veinticuatro horas después de la inyección, se inyecta a los ratones por via subcutánea con IL-?ß recombinante humana en una dosis de 1 pg/kg. Dos horas después de la inyección de la IL-?ß (tiempo de respuesta pico de IL-6), se sacrifican los ratones, se recolecta la sangre y se procesa para obtener el suero. Los niveles séricos de IL-6 se analizan por ELISA. Se puede calcular el porcentaje de inhibición basándose en la proporción de IL-6 detectada en el suero animal experimental a la IL-6 detectada en los controles.
Otros ensayos ejemplares para conocer la actividad de IL-1 in vivo se describen en Boraschi y col. e incluyen un ensayo de anorexia, hipoglucemia y neutrofilia.
Producción Los agentes de unión al receptor se pueden producir por expresión en células huésped recombinantes , pero también a través de otros métodos, por ejemplo transcripción y traducción in vitro y síntesis química.
Para la expresión celular, se pueden insertar uno o más ácidos nucleicos (p. e . , ADNc o ADN genómico) que codifican un agente de unión al receptor en un vector replicable para la clonación o para la expresión. Diversos vectores se encuentran disponibles al público. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido, un cósmido, un genoma viral, un fagémido, un genoma del fago u otra secuencia de replicación autónoma. Se puede introducir la secuencia de ácido nucleico codificante adecuada en el vector mediante varios procedimientos. Por ejemplo, se pueden diseñar sitios de endonucleasa de restricción adecuados (p. ej., utilizando PCR) . Después, se pueden utilizar la digestión de restricción y la ligadura para insertar la secuencia de ácido nucleico codificante en una ubicación adecuada. Los componentes del vector generalmente incluyen uno o más de un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción .
El agente de unión al receptor se puede producir por recombinación en forma aislada o por fusión con uno o más componentes, por ejemplo una secuencia señal, un epítopo o un grupo de purificación y un marcador. El agente de unión al receptor puede incluir el prodominio de un miembro de la familia interleucina-1 , p. ej . , que posteriormente se puede extraer por procesamiento proteolitico .
Para la expresión bacteriana, el agente de unión al receptor se puede producir con o sin una secuencia señal. Por ejemplo, se puede producir dentro de las células de modo que se acumula en los cuerpos de inclusión o en la fracción soluble. También se puede secretar, p. ej . , mediante el añadido de una secuencia señal procariota, p. ej . , una secuencia guia adecuada, por ejemplo de fosfatasa alcalina, penicilinasa o enterotoxina II termoestable . Las células huésped bacterianas ejemplares para la expresión incluyen cualquier cepa transformable de E. coli K-12 (por ejemplo E. coli BL21, C600, ATCC 23724 ; E. coli HB101 NRRLB-11371, ATCC-33694; E. coli MM294 ATCC-33625; E. coli W3110 ATCC-27325) , las cepas de B. subtilís, Pseudomonas y otro bacilli. Las proteínas producidas en sistemas bacterianos típicamente carecerán de glicosilación . Por lo tanto, en algunas realizaciones, los agentes de unión al receptor descritos aquí carecen sustancialmente de glicosilación, p. ej . , carecen de modificaciones de glicosilación de un mamífero u otra célula eucariota .
El agente de unión al receptor se puede expresar en una célula hospedera de levadura, p. ej . , Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe , Hanseula o Pichia pastoris . Para la expresión de levaduras, el agente de unión al receptor también se puede producir intracelularmente o por secreción, p. ej . , utilizando el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor alfa (incluso las formas Saccharomyces y Kluyveromyces) , el líder de la fosfatasa ácida o el líder de líder de la glucoamílasa de C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990) . En la expresión de células mamíferas, se pueden utilizar secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, por ejemplo secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una relacionada, así como líderes secretores virales. Alternativamente, el agente de unión al receptor se puede producir con un prodominio de un miembro de la familia interleucina- 1 , p. ej . , un prodominio de IL-?a o de IL-lp.
Los vectores de expresión y de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se reproduzca en una o más células huésped seleccionadas. Estas secuencias son conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas; el origen del plásmido de 2µ es adecuado para levaduras; y diversos orígenes de replicación (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación típicamente contienen un gen o marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas, que (a) dotan de resistencia a los antibióticos u otras toxinas, p. ej . , ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , (b) complementan las deficiencias auxotróficas (por ejemplo el marcador URA3 en Saccharomyces) o (c) suministran nutrientes fundamentales que no están disponibles en medios complejos, p. ej . , el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli. También hay diversos marcadores disponibles para células mamíferas, p. ej . , DHFR o timidina cinasa . DHFR se puede utilizar junto con una línea celular (por ejemplo una línea celular CHO) deficiente en la actividad de DHFR, preparada y propagada según lo descrito por Urlaub y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 77:4216 (1980).
Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor unido funcionalmente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de unión al receptor para dirigir la síntesis del ARNm. Promotores ejemplares adecuados para el uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la ß-lactamasa y de la lactosa (Chang y col., Nature, 275:615 (1978); Goeddel y col., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36.776) y promotores híbridos, por ejemplo el promotor tac (deBoer y col., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 80:21-25 (1983)) . Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también pueden contener una secuencia . Shine-Dalgarno adecuadamente ubicada. El sistema de la polimerasa T7 también se puede utilizar para conducir la expresión de una secuencia de ácido nucleico codificante colocada bajo el control del promotor T7. Véase, p. ej., los vectores pET (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, EUA) y las células huésped, p. ej . , como se describe en Novagen User Protocol TB053 disponible en EMD Chemicals y en 5.693.489 de EUA. Por ejemplo, dichos vectores se pueden utilizar en combinación con células BL21(DE3) y células BL21(DE3) pLysS para producir proteína, p. e j . , al menos 0.05, 0.1 o 0.3 mg por mi de cultivo celular. Oras líneas celulares que se pueden utilizar incluyen lisógenos DE3 de B834, BLR, HMS174, NovaBlue, incluso células que contienen un plásmido pLysS.
Promotores ejemplares para el uso con células de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman y col., J. Biol . Chem., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978) ), por ejemplo enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa , fosfofructocinasa , glucosa-6-fosfato isomerasa y piruvato cinasa. Otros promotores de levadura ejemplares son inducibles y tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de crecimiento. Ejemplos de promotores inducibles incluyen las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, metalotioneína y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.
La expresión de ARNm que codifica un agente de unión al receptor de vectores en células huésped mamiferas se puede controlar, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus como virus del polioma, adenovirus (por ejemplo Adenovirus 2), virus ' del papiloma bovino, virus del sarcoma aviario, citomegalovirus , un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, p. ej . , el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y de promotores de choque térmico. También se pueden utilizar sistemas de promotores heterólogos, p. ej . , promotores que responden a tetraciclina . Véase Urlinger, S. y col. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97 ( 1 ): 7963-7968. La transcripción también puede ser impulsada por una secuencia potenciadora, ubicada en cis o trans. Las secuencias potenciadoras de mamíferos ejemplares incluyen las secuencias potenciadoras para globina, elastasa, albúmina, a-proteina e insulina. Ejemplos adicionales incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante para el agente de unión al receptor, pero preferentemente se ubica en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levadura, hongo, insecto, planta, animal, humano células nucleadas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias se encuentran disponibles comúnmente a partir de las regiones 51 y, ocasionalmente 3', no traducidas de ADN o ADNc eucariota o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el agente de unión al receptor. El vector de expresión también puede incluir una o más secuencias intrónicas.
El agente de unión al receptor también se puede expresar en células de insectos, p. e . , células Sf9 o SF21, p. ej . , utilizando el sistema pFAST-BAC™. Vectores de expresión del baculovirus adicionales ejemplares son comerecializados por Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad CA, EUA. El agente de unión al receptor también se puede expresar en células mamiferas. Por ejemplo, las lineas celulares de origen mamífero también se pueden emplear. Ejemplos de lineas de células huésped de mamíferos incluyen la línea COS-7 de células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman y col., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células ováricas de hámster chino (CHO) , células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de las líneas de células CV1 de riñon de mono verde africano (ATCC CCL 70) como se describe en McMahan y col. (EMBO J. 10: 2821, 1991) . Los métodos establecidos para introducir ADN en células mamiferas se han descrito (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 1569) .
Otros métodos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis del agente de unión al receptor en células recombinantes se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Sambrook y col. (eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773).
Una vez expresados en células, los agentes de unión al receptor se pueden recuperar del medio de cultivo, cuerpos de inclusión o Usados de células. Las células se pueden alterar mediante varios medios físicos o químicos, por ejemplo ciclos de congelamiento y descongelamiento, sonicación, rotura mecánica o agentes de lisado celular (p. e . , detergentes) .
Los agentes de unión al receptor se pueden purificar a partir de otras proteínas -de células o polipéptidos que se pueden encontrar en lisados de células o en el medio celular. Se pueden emplear diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); y Scopes, Protein Puri fication : Principies and Practice, Springer-Verlag , Nueva York (2010) (ISBN: 1441928332) . Ejemplos de procedimientos de purificación incluyen: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico como DEAE; croma toenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75; columnas de sefarosa de proteína A para eliminar contaminantes como IgG; y columnas de afinidad (p. e . , columnas de quelante de metales para unir formas marcadas con epítopo de la proteína y columnas con diversos ligandos para unir cualquier grupo de purificación que esté asociado con el agente de unión al receptor) . Un método de purificación puede incluir una combinación de dos etapas de cromatografía de intercambio iónico diferentes, p. e . , cromatografía de intercambio catiónico seguido de una cromatografía de intercambio aniónico o viceversa. Los agentes de unión al receptor se pueden eluir de una resina de intercambio iónico a través de diversos métodos que incluyen gradientes de pH o sal o etapas. En algunas realizaciones, el agente de unión al receptor incluye un grupo de purificación (por ejemplo etiquetas de epítopos y asas de afinidad) . Dichos grupos se pueden utilizar para la cromatografía de afinidad y se pueden quitar opcionalmente por escisión proteolítica .
La cromatografía de intercambio iónico también se puede utilizar como una técnica de separación de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico separa moléculas en base a las diferencias entre la carga general de las moléculas y se puede utilizar para separar la forma intacta de los agentes de unión al receptor de otras formas de dichas proteínas.
Los sustituyentes aniónicos o catiónicos pueden estar unidos a natrices para formar soportes aniónicos o catiónicos para la cromatografía. Los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos dietilaminoetil (DEAE) , aminoetilo cuaternario (QAE) y amina cuaternaria (Q) . Los sustituyentes catiónicos incluyen carboximetil (CM) , sulfoetilo (SE), sulfopropil (SP), fosfato (P) y sulfonato (S) . Las resinas de intercambio iónico de la celulosa como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 y CM-52 son comercializadas por Whatman Ltd. (Maidstone, Kent, RU) . SEPHADEX™ y otros intercambiadores de iones reticulados también son conocidos. Por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM- y SP-SEPHADEX™ y DEAE-, Q-, CM- y S-SEPHAROSE™ y SEPHAROSE™ Fast Flow son comercializados por Pharmacia AB . El copolimero de metacrilato-etilenglicol derivado de DEAE y CM, por ejemplo TOYOPEARL DEAE-650S o M y TOYOPEARL CM-650S o M son comercializados por Toso Haas Co. (Filadelfia, PA, EUA) .
Una superficie de intercambio catiónico es una superficie de intercambio iónico con ligandos con carga negativa unidos por enlace covalente y que, por lo tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución en contacto con la superficie. Las superficies ejemplares incluyen resinas de intercambio catiónico, por ejemplo en las que los grupos unidos por enlace covalente son carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles en el mercado incluyen celulosa CMC, SP-Sephadex™ y Fast S-Sepharose™ (Pharmacia) .
Una superficie de intercambio aniónico es una superficie de intercambio iónico con grupos con carga positiva unidos por un enlace, por ejemplo grupos amino cuaternarios. Una superficie de intercambio aniónico ejemplar es una resina de intercambio aniónico, por ejemplo celulosa DEAE, TMAE, QAE Sephadex™ y Fast Q Sepharose™ (Pharmacia) .
Un esquema de purificación ejemplar para un agente de unión al receptor incluye el lisado de células E. coli en tampón de lisis seguido de filtración profunda. Después, el material se somete a cromatografía de intercambio catiónico (CEX) . Después, se deja fluir el eluato de CEX sobre un medio de intercambio aniónico en una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) . El AEX FT puede estar sujeto a una etapa de pulido. Después, se puede procesar el material por ultrafiltración/diafiltración, p. ej . , para concentrar o desalinizar el material. Las membranas de ultrafiltración/diafiltración se pueden seleccionar basándose en el corte de peso molecular nominal ("NMWCO") para retener la proteína en el retenido, permitiendo que los materiales de peso molecular bajo como la sal pasen hacia el filtrado. Se puede utilizar cualquier solución tampón o agua estéril durante la etapa de intercambio de tampón final, p. ej . , dependiendo del pH final deseado y la conductividad del producto .
Un agente de unión al receptor se puede almacenar en diversas soluciones, incluso agua, PBS y soluciones tamponadas. Soluciones tamponadas ejemplares incluyen acetato de sodio pH 4.5, acetato de sodio pH 4.7, acetato de sodio pH 4.9, acetato de sodio pH 5.1, acetato de sodio pH 5.3, acetato de sodio pH 5.5, succinato pH 5.2, succinato pH 5.4, succinato pH 5.6, succinato' pH 5.8, histidina pH 5.7, histidina pH 6.0, histidina pH 6.3, histidina 6.6, fosfato de sodio pH 6.5, fosfato de sodio pH 6.7, fosfato de sodio 7.0, fosfato de sodio pH 7.3, fosfato de sodio pH 7.7, imidazol pH 6.5, imidazol pH 6.8, imidazol pH 7.2, Tris pH 7.0, Tris pH 7.5, Tris pH 7.7. Los agentes tamponantes pueden estar presentes, p. e . , en una concentración de aproximadamente 1-100 mM, 5-50 mM, 10-50 mM o 5-25 mM. Las solución puede incluir además una sal, por ejemplo NaCl (p. ej . , 50 mM, 150 mM o 250 mM e intervalos intermedios), arginina (p. e . , aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7.5% e intervalos intermedios), sacarosa (p. ej . , aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7.5%, 8.5%, 10%, 15% e intervalos intermedios) o glicerol (p. e . , aproximadamente el 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 7.5%, 8.5%, 10%, 15% e intervalos intermedios) .
El agente de unión al receptor puede estar presente en la composición en una cantidad de al menos 50 mg, 100 mg, 500 mg, 1 g, 5 g, 10 g o más.
Métodos analíticos Proteínas de células huésped (HCP) se refiere a las proteínas en una preparación que difiere de un agente de unión al receptor y, por ejemplo, son proteínas endógenas de la célula hospedera a partir de la cual se preparó el agente de unión al receptor, típicamente proteínas de E. coli. Preferentemente, las proteínas de células huésped están presentes en menos de 10000, 1000, 900, 800 o 700 ppm (partes por millón) . Las HCP se pueden detectar, por ejemplo, por ELISA u otros métodos de detección. Por ejemplo, ELISA puede utilizar anticuerpos policlonales para HCP. Un kit ejemplar es comercializado por Cygnus Technologies (CN# F410; Southport NC, EUA) . Otro kit ejemplar utiliza AlphaScreen technology (AlphaLisa® E. coli HCP Kit, Número de producto AL261 C/F, Perkin Elmer, Waltham MA, EUA) .
El material que contiene o que potencialmente contiene un agente de unión al receptor se puede evaluar, p. e . , utilizando cromatografía líquida de alta presión. Técnicas analíticas ejemplares incluyen cromatografía líquida de intercambio catiónico débil de alto rendimiento (wCEX-HPLC) , cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento (SE-HPLC), cromatografía líquida en fase inversa, ESI-MS, espectrometría de masas por ionización turbospray, espectrometría de masas por ionización nanospray, espectrometría de masas por ionización thermospray, espectrometría de masas por ionización sonic spray, SELDI-MS y MALDI-MS.
En diversas realizaciones, la región terminal N de un agente de unión al receptor incluye secuencias idénticas a los péptidos de la región terminal N de IL-?ß, por ejemplo, el péptido APVRS (SEQ ID NO:58) . Las células re combinantes (especialmente las células E. coli) que expresan' dichas proteínas pueden producir la proteína intacta así como otras isoformas, incluso la isoforma des-Ala y una isoforma con una metionina adicional (p. ej . , terminal N para Alai) . Los agentes de unión al receptor que incluyen una prolina en la posición 2 del aminoácido (en donde el residuo del terminal N está en la posición 1) pueden ser susceptibles a la escisión por proteasas de E. colí, por ejemplo aminopeptidasa P que tiene especificidad de escisión para X-PRO. Esta escisión puede quitar el aminoácido del terminal N. Por ejemplo, P03, P04 y ?0? tienen una prolina en la posición 2. Las formas intactas de P03, P04 y P05 son de 153 aminoácidos de longitud y comienzan con alanina, mientras que las especias con des-Ala son de 152 aminoácidos de longitud y comienzan con prolina .
Las técnicas analíticas como las anteriores se pueden utilizar para distinguir entre las formas intactas y las otras formas, p. e . , una especie con des-Ala. Una técnica analítica ejemplar es wCEX-HPLC. Por ejemplo, se puede evaluar P05 utilizando una columna de 4x250 mm de Dionex ProPac® WCX-10 (Número de producto 054993) como se describe en el ejemplo 9 a continuación. Los picos de WCX-HPLC se pueden evaluar por (RP)-HPLC de fase inversa de C4 en línea con espectrometría de masas. P05 intacta tiene la masa teórica: 17700.4 Da y es detectable como 17700.4 Da. La especie con des-Ala es detectable como 17629.4 Da, que es 71 Da menor que la masa de P05 intacta. La reducción de 71 Da en la masa corresponde a la eliminación de un solo residuo de a lanina .
Composiciones farmacéuticas Un agente de unión al receptor se puede formular como una composición farmacéutica. Típicamente, la composición es estéril e incluye uno o más de un tampón, una sal farmacéuticamente aceptable y un excipiente o estabilizador. Por ejemplo, la composición puede ser una composición acuosa. Un agente de unión al receptor descrito aquí se puede formular de acuerdo con los métodos estándar para un producto biológico. Véase p. ej . , Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Dd . , Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a Ed.., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); ibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X) ; Protein formulation and delivery, McNally and Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007) .
Un agente de unión al receptor para una composición farmacéutica es típicamente al menos el 10, 20, 50, 70, 80, 90, 95, 98, 99 o 99.99% puro y típicamente libre de proteínas humanas. Puede ser la única proteína en la composición o la única proteína activa en la composición. También se puede combinar con una o más proteínas activas, p. ej . , una o más proteínas activas purificadas, p. ej . , una proteína relacionada o no relacionada. En algunas realizaciones, la composición puede contener el agente de unión al receptor en una concentración de entre aproximadamente el 0.001 y el 10%, p. ej., el 0.001 y el 0.1%, el 0.01 y el 1% o el 0.1% y el 10% .
Por lo tanto, aquí también se presentan formas purificadas y aisladas de los agentes descritos en el presente. El término "aislado" se refiere a un material que se quita de su ambiente original (p. e . , las células o los materiales a partir de los cuales se produce el agente de unión al receptor) . Las composiciones farmacéuticas pueden estar sustancialmente libres de materiales pirogénicos, sustancialmente libres de ácidos nucleicos o sustancialmente libres de componentes y enzimas celulares, por ejemplo polimerasas, proteínas ribosomales y proteínas chaperonas.
Una composición farmacéutica puede incluir un portador farmacéuticamente aceptable. Según se emplea aquí, un "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y otros similares que son fisiológicamente compatibles. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto base y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado (véase p. e . , Berge, S.M. y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19), p. e j . , sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
En una realización, . el agente de unión al receptor se formula con uno o más excipientes, por ejemplo cloruro de sodio, un tampón de fosfato (p. e j . , fosfato de sodio dibásico heptahidratado, fosfato de sodio monobásico) y polisorbato. Se puede proporcionar, por ejemplo, en una solución tamponada, p. e . , en una concentración de aproximadamente 5-100, 5-30, 30-50 o 50-100 mg/ml y se puede almacenar a 2-8 °C. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en muchas otras formas. Estas comprenden, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (p. e . , soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones y liposomas. La forma preferida puede depender de la vía de administración y de la aplicación terapéutica pretendidas. Las composiciones para los agentes descritos aquí están típicamente en forma de soluciones inyectables o infundibles, o son para administración tópica u ocular (véase a continuación) .
Las composiciones farmacéuticas típicamente son estériles y estables en condiciones de fabricación y almacenamiento. También se puede evaluar una composición farmacéutica para garantizar que cumpla con los estándares reguladores y de la industria para la administración. La composición se puede formular como una solución, una microemulsión , una dispersión, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para altas concentraciones del fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación de un agente descrito aquí en la cantidad necesaria en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes mencionados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de un agente descrito aquí en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los mencionados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacio y el liofilizado que proporcionan un polvo de un agente descrito aquí más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de este filtrada previamente en condiciones estériles. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, manteniendo el tamaño de las partículas necesario en caso de una dispersión y mediante el uso de surfactantes . La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede diseñar mediante la inclusión de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Por ejemplo, un agente de unión al receptor puede estar asociado con un polímero, p. ej . , un polímero sustancialmente no antigénico, por ejemplo un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. En algunas realizaciones, el polímero está unido por enlace covalente al- agente de unión al receptor, p. ej . , directa o indirectamente. Los polímeros adecuados varían sustancialmente según el peso. Se pueden utilizar polímeros que tienen pesos moleculares medios numéricos que oscilan entre aproximadamente 200 y aproximadamente 35.000 Daltones (o entre aproximadamente 1.000 y 15.000 y entre 2.000 y aproximadamente 12.500). Por ejemplo, un agente de unión al receptor se puede conjugar a un polímero soluble en agua, p. ej . , un polímero de polivinilo hidrofílico, p. ej . alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona . Una lista no exhaustiva de dichos polímeros incluye los homopolímeros de óxido de polialquileno, por ejemplo polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, sus compolímeros y sus copolímeros de bloque, siempre y cuando la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque se mantenga. Otros polímeros útiles incluyen polioxialquilenos , por ejemplo polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno ( Plurónicos ) ; polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificado o sin ramificar que incluyen los monómeros de sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónio (p. ej . ácido polimanurónico o ácido algínico) , D-glucosamina , D-galactosamina , D- glucosa y ácido neuramínico incluso homopolisacáridos y heteropolisacáridos , por ejemplo lactosa, amilopectina , almidón, almidón de hidroxietilo, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, p. ej . el ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar, por ejemplo polisorbitol y polimanitol ; heparina o heparan.
En determinas realizaciones, el agente de unión al receptor se puede preparar con un portador que protegerá al compuesto de la liberación rápida. Se puede administrar como una formulación de liberación controlada, administrada por un implante o un sistema de administración microencapsulado . Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles , como el acetato de etilenvinilo, los polianhidridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Véase en general p. ej . , Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Administración Un gente de unión al receptor se puede administrar a un sujeto, p. ej . , un sujeto humano, a través de diversos métodos, por ejemplo administración intravenosa como un bolo o por infusión continua durante un periodo, por inyección intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular , intraorbital, intracardiaca, intradérmica , intraperitoneal , intrasinovial , transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular , subcapsular, subaracnoidea, intrarraquidea , epidural e inyección e infusión intraesternal . Otros modos de administración incluyen las vías tópicas (p. ej . , dérmica o mucosa) o de inhalación (p. ej . , intranasal o intrapulmonar).
Para muchas aplicaciones, la vía de administración se selecciona de: inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea o inyección intramuscular.
Un agente de unión al receptor se puede administrar como una dosis fija o en una dosis de mg/kg. Se puede administrar intravenosamente (IV) o por vía subcutánea (SC) . El agente de unión al receptor se puede administrar, por ejemplo, todos los días, día por medio, cada tres, cuatro o cinco días, todas las semanas, cada tres a cinco semanas, p. ej . , cada cuatro semanas o mensualmente .
Un composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente descrito aquí. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad del compuesto de provocar una respuesta deseada en el individuo, p. ej . , mejora de al menos un parámetro del trastorno o mejora de al menos un síntoma del trastorno (y, opcionalmente , el efecto de cualquier agente adicional que se administra). Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad con la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Un agente de unión al receptor típicamente se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar utilizando dispositivos médicos, p. e . , implantes, bombas de infusión, agujas hipodérmicas y dispositivos de inyección hipodérmica sin aguja. El dispositivo puede incluir, p. e . , una o más cubiertas para el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas y puede estar configurado para administrar dosis unitarias del agente de unión al receptor y, opciona Imente , un segundo agente. Las dosis pueden ser dosis fijas, es decir, unidades separadas físicamente dispuestas como dosis unitarias para los sujetos que se tratarán; cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de agente de unión al receptor calculada para producir el efecto terapéutico deseado en combinación con un portador farmacéutico y, opcionalmente , en combinación con otro agente.
En algunas realizaciones, para tratar un trastorno descrito aquí, se puede administrar un agente de unión -al receptor al sujeto que sufre el trastorno en una cantidad y durante un período suficiente para inducir una mejoría sostenida en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno. Se considera que una mejoría es "sostenida" si se manifiesta en el sujeto en al menos dos ocasiones separadas por un período de una a cuatro semanas. El grado de mejoría se puede determinar en función de los signos o de los síntomas y también se pueden utilizar cuestionarios que se administran al sujeto, por ejemplo, cuestionarios de calidad de vida .
Se pueden evaluar varios indicadores que reflejan el grado de la enfermedad para determinar si las cantidades utilizadas y el período del tratamiento son suficientes. El valor de referencia para el indicador o los indicadores elegidos se establece mediante el examen del sujeto antes de la administración de la primera dosis del agente de unión al •receptor. Preferentemente, el examen de referencia se realiza en un plazo de aproximadamente 60 días antes de la administración de la primera dosis.
La mejoría puede ser inducida mediante la administración repetida de una dosis del agente de unión al receptor hasta que el sujeto manifiesta una mejoría con respecto al valor de referencia para el indicador o los indicadores elegidos. En el tratamiento de afecciones crónicas, el grado de mejoría se puede obtener mediante la administración repetida en un período de al menos un mes o más, p. ej . , durante uno, dos o tres meses o más, o por tiempo indefinido. En el tratamiento de una enfermedad aguda, el agente se puede administrar durante un período de una a seis semanas o incluso en una dosis única.
Aunque la medida de la enfermedad después del tratamiento pueda parecer mejorada de acuerdo con uno o más indicadores, se puede continuar el tratamiento por tiempo indefinido en el mismo nivel o en una dosis o frecuencia menores. También se puede interrumpir el tratamiento, p. e . , tras la mejoría o desaparición de los síntomas. Una vez que se ha reducido o interrumpido el tratamiento, se puede retomar si los síntomas reaparecieran.
Tratamientos Se puede utilizar un agente de unión al receptor, por ejemplo un agente que se une a IL-1RI y que antagoniza la señalización de IL-1, para tratar un "trastorno mediado por IL-1" que incluye cualquier enfermedad o afección médica que (i) es provocada al menos en parte por un agonismo de IL-1, (ii) está asociada con niveles elevados o actividad de un componente de la señalización de IL-1 (por ejemplo, IL-loc, IL-?ß o IL-1RI) o señalización de IL-1 elevada o (iii) mejora mediante la disminución de la actividad de IL-1. Los trastornos mediados por IL-1 incluyen trastornos agudos y crónicos, incluso trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios. Los trastornos mediados por IL-1 incluyen trastornos sistémicos y no sistémicos. Se sabe que IL-lor e IL-?ß son citocinas proinflama torias potentes asociadas con las respuestas infecciosas, asi como con la enfermedad inflamatoria, incluso la artritis reuma toide. Se ha observado un aumento en la producción de IL-1 en pacientes con diversos trastornos autoinmunes, isquemia y varios cánceres, por lo tanto, IL-1 tiene incidencia en estas enfermedades y en otras enfermedades relacionadas.
Véase también en general Sims y Smith, The IL-1 family: regulators of immunity, Nature Reviews Immunology, doi : 10.1038/nri2691 (2010).
El término "tratar" se refiere a la administración de un agente descrito aquí a un sujeto, p. ej, un paciente, en una cantidad, manera o modo eficaces para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno, p. ej . , un trastorno descrito aqui, o para prevenir el avance de un trastorno, ya sea en un grado estadísticamente significativo o en- un grado detectable para un entendido en la técnica. El tratamiento puede ser para curar, sanar, aliviar, mitigar, modificar, recuperar, mejorar, paliar o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición a sufrir el trastorno. Una cantidad, manera o modo eficaz puede variar dependiendo del sujeto y se puede ajusfar al sujeto. Los sujetos ejemplares incluyen los seres humanos, los primates y otros mamíferos no humanos. Un agente de unión al receptor también se puede administrar profilácticamente para reducir el riesgo de aparición de un trastorno o síntoma de este.
El trastorno mediado por IL-1 puede ser un trastorno autoinmune. Ejemplos de trastornos autoinmunes mediados por IL-1 incluyen: artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Behcet, enfermedades intestinales inflamatorias (incluso enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), asma, psoriasis, diabetes tipo I y otros trastornos identificados aquí. Un agente de unión al receptor descrito aquí se puede administrar a un sujeto que sufre o en riesgo de sufrir dichos trastornos autoinmunes mediados por IL-1. El trastorno mediado por IL-1 puede ser un trastorno inflamatorio como se describe a continuación. Un agente de unión al receptor descrito aquí se puede administrar a un sujeto que sufre o en riesgo de sufrir dichos trastornos inflamatorios mediados por IL-1.
Los trastornos mediados por IL-1 ejemplares incluyen: Artritis reumatoide y artritis relacionada. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar a un sujeto que sufre o en riesgo de sufrir artritis reumatoide. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que afecta la membrana sinovial en las articulaciones y que daña el cartílago articular. La patogénesis de AR es dependiente del linfocito T y puede incluir la producción de autoanticuerpos conocidos como factores reuma toides. Los complejos de factor reumatoide y antigeno se pueden formar y acumular en el liquido articular y en la sangre, induciendo la infiltración de linfocitos, neutrófilos y monocitos en la sinovial. Las articulaciones son afectadas típicamente en un patrón simétrico, pero también se puede presentar una enfermedad extraarticular , p. e . , que provoca fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas o síndrome de Felty que se manifiesta como neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia . Los pacientes también pueden presentar nodulos reumatoides en el área de las articulaciones afectadas, pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria y neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar. Una forma de IL-IRa está indicada para AR moderada a grave. Véase, p. ej . , Cohén, S. y col. Arthritis & Rheumatism 46, 614-24 (2002); Fleischmann, R.M. y col. Arthritis & Rheumatism 48, 927-34 (2003); Nuki, G. y col. Arthritis & Rheumatism 46, 2838-46 (2002); Schiff, M.H. y col. Arthritis & Rheumatism 50, 1752-60 (2004) .
Los síntomas de la AR activa incluyen fatiga, falta de apetito, fiebre baja, dolor muscular y en las articulaciones y rigidez. La rigidez muscular y de las articulaciones suelen ser más notables en la mañana y después de períodos de inactividad. Durante las erupciones, las articulaciones frecuentemente se enrojecen, se inflaman, presentan dolor y sensibilidad, generalmente como consecuencia de la sinovitis. Las escalas útiles para determinar la AR y los síntomas de la AR incluyen: Rheumatoid Arthritis Severity Scale (RASS; Bardwell y col., (2002) Rheumatology 41 ( 1 ) : 38-45 ) , SF-36 Arthritis Specífic Health Index (ASHI; Ware y col., (1999) Med. Care. 37(5 Suppl ) : MS40-50 ) , Arthritis Impact Measurement Scales o Arthritis Impact Measurement Scales 2 (AIMS o AIMS2; Meenan y col. (1992) Arthritis Rheum. 35 ( 1 ) : 1-10) ; Stanford Health Assessment Questionnaíre (HAQ), HAQII o HAQ modificado (véase, p. ej . , Pincus y col. (1983) Arthritis Rheum. 26(11) :1346-53) .
Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito aquí a un sujeto que sufre o en riesgo de sufrir AR para retardar el inicio o mejorar uno o más de los signos y síntomas anteriores. El sujeto puede sufrir AR activa moderada a grave. El sujeto puede no responder a la terapia con inhibidores del TNF (p. e j . , terapia con ENBREL® (etanercept) , HUMIRA® (adalimumab) o REMICADE® ( in f1 iximab ) ) ; se le puede haber administrado previamente un inhibidor del TNF al sujeto; o el sujeto también puede continuar recibiendo un inhibidor del TNF (y responder o no responder) .
También se le puede administrar metotrexato al sujeto. Se le puede administrar al sujeto uno o más DMARDS (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad) , un corticosteroide o un antiinflamatorio no esteroideo. Otros fármacos que se pueden coadministrar con un agente de unión al receptor incluyen los inhibidores de CD28 (p. e . , CTLA4- Ig) , inhibidores de RAN L, IFNy, IL-6, IL-8 e IL-17. Los inhibidores incluyen anticuerpos para dichos mediadores, receptores solubles específicos para dichos mediadores o anticuerpos de receptores para dichos mediadores.
Artritis crónica juvenil. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar la artritis crónica juvenil, p. ej., en un sujeto que tiene menos de 21, 18, 17, 16, 15 o 14 años. La artritis crónica juvenil se asemeja a la AR en varios aspectos. Los sujetos pueden ser factor reuma toide positivos. Los sujetos pueden tener las formas pauciarticular, poliarticular o sistémica de la enfermedad. La artritis puede provocar anquilosis de las articulaciones y retraso en el crecimiento, y también puede producir uveítis anterior crónica y amiloidosis sistémica. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para retardar el inicio o mejorar uno o más de dichos síntomas.
Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar la artritis idiopática juvenil, incluso la artritis idiopática juvenil de inicio sistémico (SO-JIA) . Es posible que los sujetos no hayan recibido un tratamiento anterior con corticosteroides o el tratamiento con corticosteroides requerido en una dosis diaria igual o superior a 0.3 mg/kg. Véase p. ej . , Quartier y col. (2011) Ann Rheum Dis . 70(5) :747-54.
Otros trastornos reumáticos. Un agente de unión al receptor descrito aquí también se puede utilizar para tratar otros trastornos reumáticos que incluyen la esclerodermia , lupus eritematoso sistémico, gota, osteoartritis, polimialgia reumática, artritis psoriásica y artritis de Lyme crónica, inflamación del músculo voluntario y de otros músculos, incluso dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, polimiositis y linfangioleiomiomatosis , síndrome de artritis pirogénica, Artritis granulomatosa pediátrica (PGA)/ síndrome de Blau y otros trastornos reumáticos planteados en el presente .
Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar trastornos reumáticos metabólicos, p. e . , trastornos asociados con la hiperuricemia , p. ej . , la gota que incluye la gota aguda crónica y otras artropatías mediadas por cristales. Se puede utilizar el agente para tratar erupciones inducidas por fármacos asociados con la gota, incluido por ejemplo erupciones inducidas por inhibidores de xantina oxidasa, urato oxidasa o agentes uricosúricos . En la gota, los cristales de ácido úrico pueden activar el inflamasoma y disparar la liberación de IL-?ß.
Espondiloartropatías . Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar espondiloartropatías, que incluyen trastornos como la espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis asociada con la enfermedad inflamatoria intestinal, espondilitis asociada con la psoriasis, espondiloartropatía de inicio juvenil y espondiloartropatía indiferenciada . Las espondiloartropatías suelen estar asociadas con el gen HLA-B27. Los sujetos pueden carecer de factor reumatoide y pueden presentar sacroileitis con o sin espondilitis y artritis inflamatoria asimétrica. Los sujetos también pueden tener inflamación ocular (véase a continuación) .
Esclerodermia . Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar la esclerodermia o la esclerosis sistémica. La esclerodermia se caracteriza por la induración de la piel que puede ser localizada o sistémica. También puede haber lesiones vasculares y lesión celular endotelial en la microvasculatura . Los sujetos pueden presentar infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y tener anticuerpos antinucleares. Otros órganos que muestran patogénesis pueden incluir: el tracto gastrointestinal que puede tener atrofia del músculo liso y fibrosis que provocan peristalsis/motilidad anormal; el riñon que puede tener proliferación subendotelial intima! concéntrica que afecta las arterias interlobulares arqueadas pequeñas con reducción del flujo sanguíneo renal cortical resultante y que puede provocar proteinuria, azotemia e hipertensión; el músculo esquelético que puede comprender atrofia, fibrosis intersticial, inflamación; pulmón, neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón que puede presentar, p. ej . , necrosis de las bandas de contracción y cicatrices/ fibrosis . Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito aquí a un sujeto que sufre o en riesgo de sufrir escleroderma para mejorar uno o más de los signos y síntomas anteriores.
Síndrome de Sjógren. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar el síndrome de Sjógren. El síndrome de Sjógren se caracteriza ' por la inflamación inmunomediada y la posterior destrucción funcional de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales. La enfermedad puede estar asociada o acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de autoanticuerpos contra antígenos de Ro y La, los cuales son complejos de proteínas ARN pequeños. Las lesiones pueden provocar queratoconj untivitis sicca, xerostomía, con otras manifestaciones o asociaciones que incluyen cirrosis biliar, neuropatía sensorial y periférica y púrpura palpable. También se plantea a continuación el tratamiento de los trastornos oculares asociados con el síndrome de Sjógren.
Trastornos de tiroides. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar los trastornos de tiroides. Los trastornos de tiroides ejemplares incluyen la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocítica juvenil y la tiroiditis atrófica, y son el resultado de una respuesta autoinmune contra los antígenos tiroideos con producción de anticuerpos que reaccionan con las proteínas presentes y a menudo específicas de la glándula tiroides. Hay modelos experimentales disponibles que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos) y modelos inducibles creados mediante la inmunización de animales con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea) .
Trastornos diabéticos y metabólicos . Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno diabético, por ejemplo diabetes de inicio juvenil (incluso la diabetes mellitus autoimmune y los tipos de diabetes insulinodependientes) y diabetes de inicio en la madurez (incluso la diabetes no insulinodependiente y la diabetes mediada por obesidad), diabetes tipo I y diabetes tipo II. Por ejemplo, la diabetes mellitus tipo I o diabetes insulinodependiente está asociada con la destrucción autoimmune de las células de los islotes pancreáticos provocada por las células T autoanticuerpos y autorreactivas. Además, reducir la actividad de IL-?ß puede mejorar el control de la glucosa y la función de las células beta, y se puede utilizar para tratar la diabetes tipo II. Véase, p. ej., Owyang y col. Endocrinology . 2010 ; 151 ( 6 ) : 2515-27. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se puede administrar un agente de unión al receptor descrito aquí a un sujeto al que no se le está administrando insulina, p. ej . , el sujeto no es insulinodependiente . Por ejemplo, el sujeto puede ser prediabético. El sujeto puede tener tolerancia alterada a la glucosa o deterioro de la glucosa de ayuno. El sujeto puede ser obeso o tener un índice de masa corporal que es superior a 23, 25, 30, 35 o 40 kg/m2. El sujeto puede ser resistente a la insulina o se puede caracterizar por hiperglucemia o hiperinsulinemia . El sujeto puede tener riesgo de avance de la diabetes tipo II. Véase también Larsen y col. (2007) NEJM 356:1517-26 y Larsen y col. (2009) . Diabetes Care 32:1663-8. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una glucosa en plasma en ayunas superior a 6.1, 6.5, 7 u 8 mmol/L. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un nivel de A1C mayor que el 5.5, 5.7, 6, 6.4, 7, 7.5 u 8%.
En algunas realizaciones, al sujeto también se le administra un secretagogos de insulina, p. e j . , una sulfonilurea (p. e j . , clorpropamida , tolazamida, acetohexamide , tolbutamida, gliburida, glimepirida, glipizida) o meglitinidas (p. ej . , repaglinida, nateglinida) que estimulan la secreción de insulina. Al sujeto también se le puede administrar una biguanida (p. e . , metformina). Se puede administrar el agente de unión al receptor para reducir la pérdida o el daño a las células beta pancreáticas.
En algunas realizaciones, el sujeto es heterocigoto u homocigoto para el alelo C de rs4251961, ubicado cerca del 5' del gen IL1RN.
El tratamiento con un agente de unión al receptor incluye la mejora o la prevención del deterioro de afecciones secundarias asociadas con la diabetes, por ejemplo la retinopatía diabética, rechazo al trasplante renal en pacientes diabéticos, resistencia a la insulina mediada por la obesidad e insuficiencia renal, que a su vez puede estar asociada con la proteinuria y la hipertensión.
Trastornos gastrointestinales. Se pueden utilizar los agentes de unión al receptor descritos aquí para tratar un trastorno gastrointestinal inflamatorio, incluido por ejemplo enfermedad celiaca, la enfermedad de Crohn; la colitis ulcerativa; la gastroparecia idiopática; la pancreatitis, incluso la pancreatitis crónica, la pancreatitis aguda, enfermedades inflamatorias intestinales y úlceras, incluso úlceras gástricas y duodenales.
Trastornos pulmonares. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar una enfermedad pulmonar mediada por IL-1. Enfermedades pulmonares ejemplares que se pueden tratar incluyen la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (p. e j . enfisema y bronquitis crónica), proteinosis alveolar pulmonar, neumopatia inducida por bleomicina y fibrosis, fibrosis pulmonar, incluso fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis pulmonar inducida por radiación, sarcoidosis pulmonar, fibrosis quistica, acumulación de colágeno en los pulmones, SDRA, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedades pulmonares obstructivas crónicas y enfermedad pulmonar crónica fibrótica de los bebés prematuros. Además, se puede utilizar el agente de unión al receptor descrito aqui para tratar la enfermedad ocupacional de los pulmones, incluso asbestosis, neumoconiosis del minero, silicosis o afecciones similares asociadas con la exposición a largo plazo a partículas finas. La enfermedad pulmonar fibrótica e inflamatoria, incluso la neumonía eosinofi lica , fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, puede comprender una respuesta inmunoinflamatoria mal regulada que se puede tratar utilizando un agente de unión al receptor.
La sarcoidosis es una afección de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido del cuerpo; lo más común es que afecte a los pulmones. La patogénesis comprende la persistencia de células linfoides y macrófagos activados en los sitios de la enfermedad con posterior secuela crónica resultante de la liberación de productos local y sistemáticamente activos liberados por estos tipos de células .
Trastornos cardiovasculares. Se puede utilizar un agente de unión al receptor descrito aqui para tratar una lesión o trastorno cardiovascular, por ejemplo aneurisma aórtico, síndrome coronario agudo, arteritis, oclusión vascular, incluso oclusión de la arteria cerebral, complicaciones de la cirugía de derivación coronaria, lesión por reperfusión/isquemia, enfermedad cardíaca, incluso enfermedad cardíaca aterosclerótica , miocarditis, incluso miocarditis autoinmune crónica y miocarditis viral, insuficiencia cardíaca, incluso insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, restenosis o ateroesclerosis después de cirugía cardíaca o después de procedimientos de angioplastia con balón de la arteria caródica, isquemia miocárdica silente, disfunción de la bomba ventricular izquierda, posteriores complicaciones de implanten de dispositivos de asistencia ventricular izquierda, fenómeno de Raynaud, tromboflebitis, vasculitis, incluso vasculitis de Kawasaki, enfermedad veno oclusiva, arteritis de células gigantes, granulomatosis de Wegener y púrpura de Schoenlein-Henoch . El agente de unión al receptor también se puede proporcionar profilácticamente, p. ej . , para reducir el riesgo de dicho trastorno cardiovascular. En algunas realizaciones, el agente de unión al receptor se administra a un paciente para tratar la ateroesclerosis o para reducir el riesgo de esta.
La señalización mediada por IL-1 se activa por el infarto de miocardio agudo y puede iniciar la muerte celular apoptótica en las células miocárdicas preinfarto, extendiendo el tamaño de la zona del infarto. Se puede administrar el agente de unión al receptor descrito aquí para reducir el daño provocado por el infarto de miocardio. Por ejemplo, se puede administrar el agente de unión al receptor a un sujeto que corre riesgo de un infarto de miocardio o a un sujeto que ha sufrido un infarto de miocardio, especialmente un infarto de miocardio agudo, p. ej . , en las últimas 2, 4, 6, 12, 24 o 48 horas. Se puede administrar el agente en combinación con otros agentes, incluso, p. ej . , heparina y aspirina.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un accidente cerebrovascular, hemorragia subaracnoidea , traumatismo de cráneo o lesión cerebral, o inflamación asociada con un trastorno cardiovascular. Por ejemplo, los niveles elevados de IL-?ß tienen incidencia en la neuroinflamación asociada con accidentes cerebrovasculares y lesiones cerebrales (Rothwell, N. J. y col., TINS 23(12) : 618-625, 2000) . Se puede administrar el agente de unión al receptor para reducir dicha inflamación y otra inflamación asociada con isquemia o hipoxia. Además, el agente de unión al receptor también se puede proporcionar profilácticamente, p. e . , para reducir el riesgo de dichos trastornos o la inflamación asociada con dichos trastornos. Por ejemplo, el agente de unión al receptor se puede administrar a un sujeto que corre riesgo de un accidente cerebrovascular, un evento isquémico, otro evento cardiovascular o un evento hemorrágico (por ejemplo una hemorragia subaracnoidea ) o a un sujeto que ha tenido un accidente cerebrovascular, un evento isquémico, otro evento cardiovascular o un evento hemorrágico (por ejemplo una hemorragia subaracnoidea), p. e j . , en las últimas 2, 4, 6, 12, 24 o 48 horas.
Trastornos genitourinarios y renales. Los trastornos del sistema genitourinario también se pueden tratar con un agente de unión al receptor descrito aqui. Dichos trastornos incluyen la glomerulonefritis, incluso glomerulonefritis autoinmune, glomerulonefritis debido a la exposición a toxinas o glomerulonefritis secundaria, de infecciones con estreptococos hemoliticos u otros agentes infecciosos. Las enfermedades renales inmunomediada s , incluso la glomerulonefritis y la nefritis tubulointersticial , son el resultado de la lesión mediada por anticuerpos o linfocitos T al tejido renal, ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autorreactivos o células T contra antigenos renales o indirectamente como resultado de la deposición de anticuerpos o complejos inmunes en el riñon que son reactivos contra otros antigenos no renales. Por lo tanto, otras enfermedades inmunomediadas que provocan la formación de complejos inmunes también pueden inducir una enfermedad renal inmunomediada como una secuela indirecta. Los mecanismos inmunes directo e indirecto producen respuesta inflamatoria que provoca/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales con el resultante deterioro de la función de los órganos y, en algunos casos, el avance de la insuficiencia renal. Los mecanismos inmunes humoral y celular pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar el síndrome urémico y sus complicaciones clínicas (por ejemplo, insuficiencia renal, anemia y cardiomiopatía hipertrófica), incluso el síndrome urémico asociado con la exposición a las toxinas ambientales, fármacos u otras causas. También se pueden tratar las complicaciones que surgen de la inflamación de la pared vesicular que produce la alteración de la función absortiva . En dichas complicaciones se incluyen la colelitiasis (cálculos biliares) y la coliedocolitiasis (piedras del conducto biliar) y la recurrencia de la colelitiasis y la coliedocolitiasis. Otras afecciones que se pueden tratar son las complicaciones de la hemodiálisis; afecciones de la próstata, incluso hipertrofia prostética benigna, prostatitis no bacteriana y prostatitis crónica; y las complicaciones de la hemodiálisis. También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar afecciones de dolor crónico, por ejemplo dolor pélvico crónico, incluso prostatitis crónica/sindrome del dolor pélvico y dolor post herpético.
Trastorno hematológicos y oncológicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor descrito aquí para tratar diversas formas de cáncer, incluso leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, carcinoma nasofaríngeo positivo para el virus de Epstein-Barr, cánceres de glioma, colon, estómago, próstata, células renales, cáncer cervical y de ovarios, cáncer de pulmón ( SCLC y NSCLC) , incluso caquexia asociada al cáncer, fatiga, astenia, síndrome paraneoplásico de caquexia e hipercalcemia . Véase, p. ej . , Voronov y col. (2003) PNAS 100:2645-2650. También se pueden tratar tumores sólidos, incluso el sarcoma, osteosarcoma y carcinoma, por ejemplo el adenocarcinoma (por ejemplo, cáncer de mama) y carcinoma de células escamosas. Con referencia a la función de IL-?ß en determinados tumores, véase, p. e . , relin y col. (2007) Cáncer Res. 67:1062-1071. Otros cánceres incluyen el cáncer de esófago, cáncer gástrico, carcinoma de vejiga biliar, leucemia, incluso leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena, leucemia linfoblástica crónica o aguda y leucemia de células pilosas. Otras neoplasias con potencial metastático invasivo, incluso el mieloma múltiple, se pueden tratar con los agentes de unión al receptor. Véase, p. e . , Lust y col. (2009) Mayo Clin Proc 84(2) : 114-122.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar anemias y trastornos hematológicos , incluso neutropenia idiopática crónica, anemia de las enfermedades crónicas, anemia aplásica, incluso anemia aplásica de Fanconi; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); púrpura trombocitopénica trombótica, síndromes mielodisplásicos (incluso anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en la transformación) ; mielofibrosis/metaplasia mieloide; y crisis de células falciformes ' vasooclusiva .
La anemia hemolítica autoinmune, la pancitopenia inmune y la hemoglobinuria paroxística nocturna pueden resultar de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados en la superficie de los glóbulos rojos (y en algunos casos también otros glóbulos incluido las plaquetas) y son una consecuencia de la eliminación de las células recubiertas con anticuerpos mediante lisis mediada por complemento o mecanismos mediados por el receptor de Fc/ADCC. En la trombocitopenia autoinmune, incluso la púrpura trombocitopénica, y la trombocitopenia inmunomediada en otros entornos clínicos, la eliminación/destrucción de las plaquetas se produce como resultado, de la unión del anticuerpo o complemento a las plaquetas y la posterior eliminación por lisis por complemento, mecanismos mediados por el receptor de FC o ADCC.
También se puede administrar el agente de unión al receptor a sujetos que sufren o que corren riesgo de diversos trastornos linfoproliferativos , incluso síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA) , leucemia linfoblástica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfática crónica, linfoma de células T periféricas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células T positiva para el virus de Epstein-Barr, linfoma histiocítico, enfermedad de Hodgkin, linfoma difuso agresivo, leucemias linfáticas agudas, enfermedad linfoproli ferativa T-gamma, linfoma cutáneo de células B, linfoma cutáneo de células T (es decir, micosis fungoide) y síndrome de Sezary.
Trastornos hepáticos. El agente de unión al receptor divulgado aquí también es útil para tratar afecciones del hígado, por ejemplo hepatitis, incluso hepatitis alcohólica aguda, hepatitis viral o aguda inducida por fármacos, hepatitis A, B y C, colangitis esclerosante, epitelio sinusoide hepático e inflamación del hígado debido a causas desconocidas .
Trastornos de la audición. También se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar trastornos que comprenden la pérdida de la audición y que están asociados con la expresión anormal de IL-1. Dichos trastornos incluyen la pérdida de la audición asociada con el nervio coclear que se cree que resulta de un proceso autoinmune, p. e . , pérdida de la audición autoinmune, síndrome de Méniérey y colesteatoma, un trastorno del oído medio que. se suele asociar con la pérdida de la audición.
Trastornos óseos. Los trastornos no artríticos de los huesos y las' articulaciones también se pueden tratar con los agentes de unión al receptor descritos aquí. Esto abarca los trastornos inflamatorios del hueso o la articulación, trastornos de los osteoclastos que provocan la pérdida ósea, por ejemplo, entre otros, osteoporosis , incluso osteoporosis posmenopáusica, osteoartritis, periodontitis que provoca la pérdida _ o el aflojamiento de dientes, y el aflo amiento de prótesis después del reemplazo de la articulación (generalmente asociado con una respuesta inflamatoria a las partículas de desgaste), p. e . , osteolisis de implante ortopédico.
Trastornos amiloides . Además, se pueden utilizar los agentes de unión al receptor descritos aquí para tratar la amiloidosis primaria y la amiloidosis secundaria que es característica de diversas afecciones, incluso el mal de Alzheimer, la amiloidosis secundaria reactiva; el síndrome de Down; y la amiloidosis asociada a la diálisis. Además, se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson. Estas enfermedades también pueden comprender la formación de agregados y amiloides que pueden activar las respuestas inflamatorias.
Trastornos neurológicos . También se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar la neuroinflamación y las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluso la esclerosis múltiple; la polineuropatía desmielinizante idiopática o el síndrome de Guillain-Barre; y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica. Se cree que estos trastornos tienen una base autoinmune y provocan desmielini zación del nervio como resultado del daño causado a los oligodendrocitos o a la mielina directamente. En la inducción de la enfermedad de esclerosis múltiple y los linfocitos T involucrados. La esclerosis múltiple tiene un curso recurrente-remitente o un curso progresivo crónico. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales mediadas principalmente por linfocitos T y macrófagos de infiltración; los linfocitos T CD4+ son el tipo de células predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte celular de los oligodendrocitos y la posterior desmiel inización no se conoce, pero es probable que sea activado por los linfocitos T.
Miopatias. Se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar las miopatias ' asociadas con la inflamación y la autoinmunidad . Las miopatias inflamatorias idiopáticas, incluso la dermatomiositis , la polimiositis y otros son trastornos de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que provocan debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular suele ser simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis se dirigen e inhiben la función de los componentes, las proteínas y el ARN, implicados en la síntesis de proteínas.
Trastornos vasculares. Se puede utilizar un agente de unión al receptor descrito aquí para tratar un trastorno vascular, p. e . , una vasculitis sistémica. La vasculitis sistémica incluye enfermedades en las cuales la principal lesión es la inflamación y posterior daño a los vasos sanguíneos que provocan isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos alimentados por los vasos afectados y la eventual disfunción de los órganos diana en algunos casos. Las vasculitis también se pueden presentar como una lesión o secuela secundaria de otras enfermedades mediadas inmunoinflamatorias , por ejemplo la artritis reumatoide, la esclerosis sistémica, etc., especialmente en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes.
Las enfermedades en el principal grupo de vasculitis sistémica incluyen: vasculitis necrotizante sistémica: poliarteritis nodosa, angiitis alérgica y granulomatosis , poliangeítis; granulomatosis de egener; granulomatosis linfomatoide y arteritis de células gigantes. Diversas vasculitis incluyen: el síndrome de nodo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de awasaki), vasculitis del SNC aislada, enfermedad de Behcet, tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger) y venulitis necrotizante cutánea. Se cree que el mecanismo patogénico de estas enfermedades de vasculitis se debe principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared de los vasos y la posterior inducción de una respuesta inflamatoria ya sea mediante ADCC, activación del complemento o ambas.
CAPS. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno CAPS, es decir, síndromes periódicos asociados a la CIAS1. Los CAPS incluyen tres síndromes genéticos: la enfermedad inflamatoria sistémica de inicio neonatal (NOMID) , el síndrome de Muckle-Wells ( WS) y el síndrome autoinflama torio familiar inducido por el frío (FCAS) . (Hoffman y col. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann y col. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentij evich y col. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348) . Los CAPS se heredan de forma autosómica dominante con un patrón esporádico o familiar. CIAS1 codifica NALP3, un componente de proteínas del "inflamasoma", un complejo enzimático subcelular que regula la actividad de la caspasa 1. Las mutaciones en CIAS1 provocan un aumento en la producción de IL-1 y muchas consecuencias patológicas (Aksenti evich y col. 2002, mencionado anteriormente) . IL-1 induce fuertemente la producción de reactivos de fase aguda en el hígado, por ejemplo la proteína C reactiva (PCR) y el amiloide A sérico (AAS) .
Los trastornos CAPS comparten características clínicas comunes y se presentan como un espectro de gravedad clínica. NOMID es la enfermedad más grave, MWS es menos grave y FCAS es la menos grave. Los trastornos CAPS tienen diversas características superpuestas y los individuos pueden tener constelaciones únicas de signos y síntomas. Las características comunes a todas estas afecciones incluyen: fiebre, erupción tipo urticaria, artritis o artralgia, mialgia, malestar y conjuntivitis.
En NOMID, la meningitis aséptica crónica puede provocar retraso mental y estos pacientes también pueden sufrir sobrecrecimiento óseo desfigurante e incapacitante en el epífisis y en las rótulas. Estos pacientes también pueden sufrir ceguera debido a la atrofia del nervio óptico que resulta del aumento de la presión intracraneal. MWS y NOMID se asocian comúnmente con inflamación grave que puede comprender el sistema auditivo, las meninges y las articulaciones. Estos pacientes pueden sufrir picos de fiebre altos diarios y una erupción crónica que cambia con frecuencia en cuanto a la distribución y la intensidad. Los pacientes pueden sufrir pérdida de la audición o sordera. Frecuentemente, se observan la conjuntivitis y el papiledema. La amiloidosis puede desarrollar y producir una insuficiencia renal debido a la inflamación crónica y el exceso de producción de reactivos de fase aguda (especialmente SM) . Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre NOMID, MWS o FCAS o que padece un genotipo asociado con NOMID, MWS o FCAS. Además, se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre TRAPS (síndrome periódico asociado a TNF) .
Trastornos dermatológicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno dermatológico, por ejemplo un trastorno dermatológico inflamatorio o una enfermedad de la piel autoinmune o inmunomediada . Un trastorno ejemplar es la psoriasis. Otras enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas, incluso las enfermedades ampollosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis de contacto son mediadas por autoanticuerpos , cuyo origen es dependiente del linfocito T. La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por el linfocito T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, células procesadoras de antígenos y macrófagos, y algunos neutrófilos.
Otros trastornos de la piel o de las membranas mucosas que se pueden tratar incluyen las enfermedades acantolíticas , incluso la enfermedad de Darier, la queratosis folicular y el pénfigo vulgar. Otros trastornos incluyen: acné, acné rosácea, alopecia areata, estomatitis aftosa, penfigoide ampolloso, quemaduras, eccema, eritema, incluso eritema multiforme y eritema multiforme ampollar (síndrome de Stevens-Johnson ) , enfermedad de la piel inflamatoria, liquen plano, enfermedad ampollosa de IgA lineal (dermatosis ampollar crónica de la infancia), pérdida de elasticidad de la piel, úlceras mucosas superficiales, incluso úlceras gástricas, dermatitis neutrofilica (síndrome de Sweet) , dermatomiositis , pitiriasis rubra pilaris, psoriasis, pioderma gangrenoso, reticulohistiocitosis multicéntrico y necrólisis epidérmica tóxica. Otras afecciones relacionadas con la piel que se pueden tratar con los agentes de unión al receptor incluyen la dermatitis herpetiforme (enfermedad de Duhring), la dermatitis atópica, la dermatitis de contacto y la urticaria (incluso urticaria crónica idiopática) .
Trastornos alérgicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno alérgico, por ejemplo el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad a los alimentos, la conjuntivitis alérgica [véase también a continuación) y la urticaria. Estas enfermedades frecuentemente son mediadas por inflamación inducida por linfocitos T, inflamación mediada por IgE o ambas .
El asma es una afección crónica que involucra al sistema respiratorio en el cual las vias respiratorias ocasionalmente se contraen, se inflaman y se alinean con una cantidad excesiva de mucosidad, a menudo en respuesta a uno o más disparadores. Los episodios se pueden desencadenar por factores tales como la exposición a un estimulante ambiental (o alérgeno), por ejemplo aire frió, aire cálido, aire húmedo, ejercicio o esfuerzo, estrés emocional y enfermedad viral. El estrechamiento de las vias respiratorias provoca síntomas como sibilancias, falta de aire, presión en el pecho y tos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar el asma y se puede formular para la administración tópica o pulmonar para dicho tratamiento o se puede administrar por vía parenteral.
Transplante. Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que se va a someter, se está sometiendo o se está recuperando de un transplante. Las enfermedades asociadas con el transplante, incluso el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) , son dependientes de los linfocitos T; la inhibición de la función de los linfocitos T produce una mejora. El trasplante de córnea puede estar asociado con neovasculari zación que se puede aliviar mediante tratamiento con un agente de unión al receptor. También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar complicaciones provocadas por el trasplante de órganos sólidos, por ejemplo de corazón, hígado, piel, riñon, pulmón (destrucción de las vías respiratorias después del trasplante de pulmón) u otros transplantes, incluso trasplantes de médula ósea.
Enfermedades infecciosas. Los agentes de unión al receptor descritos aquí son útiles para tratar enfermedades causadas por protozoos, incluso malaria y esquistosomiasis y para tratar eritema nodoso leproso; meningitis bacteriana o viral; tuberculosis, incluso tuberculosis pulmonar; y neumonitis secundaria a una infección bacteriana o viral, incluso infección de gripe y mononucleosis infecciosa.
También se pueden tratar con un agente de unión al receptor: síndromes hereditarios de fiebre periódica, incluso fiebre mediterránea familiar, hiperinmunoglobulinemia D, síndrome de fiebre periódica, síndrome periódico asociado a TNF (TRAPS), enfermedad de Still de inicio adulto, síndrome de Schnitaler y alveolitis fibrosante.
En algunas realizaciones, se administra un agente de unión al receptor a un sujeto para reducir la actividad o expresión de IL-6 en el sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede tener un trastorno que está asociado o mediado al menos en parte por IL-6.
Trastornos oculares y administración ocular Se puede utilizar el agente de unión al receptor descrito aquí para tratar trastornos oculares, incluso trastornos oculares que afectan la superficie del ojo, trastornos oculares inflamatorios y trastornos oculares mediados al menos en parte por una reacción autoinmune.
En algunas realizaciones, el trastorno ocular es un trastorno del ojo seco que afecta la superficie del ojo. El trastorno incluye afecciones también conocidas como queratocon untivitis sicca, queratitis sicca, síndrome seco, xeroftalmia, trastorno de la película lagrimal, disminución de la producción lagrimal, deficiencia de lágrima acuosa y disfunción de las glándulas de Meibomio. El ojo seco puede incluir formas que están asociadas con el síndrome de Sjógren (SS), p. ej . , quera toconj untivitis sicca asociada con el síndrome de Sjógren, pero también formas que no están asociadas con este, p. e j . , queratocon untivitis sicca no asociada con el síndrome de Sjógren. El paciente puede presentar o no otras manifestaciones de un trastorno sistémico autoinmune. IL-1 tiene incidencia en la patogénesis de los trastornos del ojo seco. Véase, p. ej . , Enriquez de Salamanca y col. (2010), Mol. Vis. 16:862-873.
Los sujetos que sufren un síndrome del ojo seco pueden presentar inflamación en el ojo seco y pueden experimentar sensaciones de comezón, de puntadas, picazón, ardor o presión, irritación, dolor y enrojecimiento. El ojo seco puede estar asociado con lagrimeo excesivo y, contrariamente, con producción lagrimal insuficiente. Se puede administrar un agente de unión al receptor a dichos sujetos para aliviar o evitar el inicio o el agravamiento de uno o más de dichos síntomas. También se puede utilizar un agente de unión al receptor para mitigar el dolor, p. e j . , el dolor ocular, por ejemplo, debido a la neuroinflamación, en un sujeto que está experimentando dicho dolor.
En algunas realizaciones, el trastorno ocular es un trastorno ocular asociado con un trastorno sistémico autoinmune (por ejemplo el síndrome de Sjogren y la artritis reumatoide) o con un trastorno asociado con IL-1 u otro miembro de la familia de citocinas IL-1. El paciente puede tener o no un trastorno sistémico autoinmune u otras manifestaciones de un trastorno sistémico autoinmune.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar otros trastornos que afectan la superficie del ojo, por ejemplo la córnea. Dichos trastornos incluyen las afecciones inflamatorias de la superficie ocular corneal, neovascularización corneal, queratitis, incluso queratitis ulcerativa periférica y queratitis microbiana. También se puede utilizar el agente de unión al receptor para tratar un sujeto que está experimentando cicatrización de la herida corneal (p. ej . , un sujeto que sufre un herida corneal) . Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que va a recibir, que está experimentando o que se está recuperando de un procedimiento que involucra al ojo, p. ej . , trasplante de córnea/queratoplastia, cirugía de quera toprótesis, trasplante lamelar, trasplante endotelial selectivo. Véase, p. ej . , Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43; Dekaris y col. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9; y Dana y col. (1997) Transplantation 63:1501-7. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar trastornos que afectan la conjuntiva, incluso trastornos de cicatrización conjuntival y conjuntivitis. Se puede utilizar el agente de unión al receptor para tratar otros trastornos, por ejemplo el síndrome penfigoide y el síndrome de Stevens-Johnson. Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito aquí a un sujeto para modular la neovascularización en el ojo o alrededor de este. Véase, p. ej . , Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43.
Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre una reacción alérgica que afecta el ojo, p. e . , un sujeto que está experimentando una enfermedad ocular alérgica grave (atópica), por ejemplo conjuntivitis alérgica. Por ejemplo, el agente de unión al receptor se puede administrar tópicamente. Véase también, p. ej . , eane-Myers AM y col. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12) : 3041-6.
Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre un trastorno autoinmune que afecta el ojo. Los trastornos oculares autoinmunes ejemplares incluyen la oftalmía simpática, el síndrome de Vogt- oyanagi Harada (V H) , la re tinocoriodopatía de perdigonada, el penfigoide cicatricial ocular, la iridoclitis he terocrómica de Fuchs y diversas formas de uveitis. Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto para tratar cualquiera de los trastornos anteriores.
Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre o corre riesgo de retinopatía diabética. Véase, p. ej . , Demircan y col. (2006) Eye 20:1366-1369 y Doganay y col. (2006) Eye, 16:163-170.
La uveitis incluye las formas agudas y crónicas e incluye inflamación de uno o más del iris, el cuerpo ciliar y la coroides. Las formas crónicas pueden estar asociadas con una enfermedad sistémica autoinmune, p. ej., síndrome de Behcet, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, síndrome de Reiter y enfermedades inflamatorias intestinales. En la uveitis anterior, la inflamación está principalmente en el iris (también iritis) . La uveitis anterior puede afectar a sujetos que sufren enfermedad sistémica autoinmune, pero también a sujetos que no sufren enfermedad sistémica autoinmune. La uveitis intermedia comprende inflamación del. vitreo anterior, la retina periférica y el cuerpo ciliar, a menudo con poca inflamación anterior o coriorretiniana . La pars planitis resulta de la inflamación de la pars plana entre el iris y la coroides. La uveitis posterior comprende el tracto uveal y principalmente la coroides y también se denomina coroiditis. La uveitis posterior puede estar asociada con una infección sistémica o una enfermedad autoinmune. Puede continuar durante meses e incluso años. Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto para tratar cualquiera de las formas de uveitis anteriores. Véase también p. e . , Tsai y col. (2009) Mol Vis 15:1542-1552 y Trittibach P y col. (2008) Gene Ther. 15(22) : 1478-88.
En algunas realizaciones, se utiliza un agente de unión al receptor para tratar a un sujeto que sufre o corre riesgo de degeneración macular relacionada con la edad (AMD) . El agente de unión al receptor se puede aplicar tópicamente en el ojo, inyectar (p. ej., intravítrea) o proporcionar sistemáticamente. Véase, p. ej . , Olson y col. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17 ( 3) : 195-200.
Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito aquí de cualquier modo para tratar una enfermedad ocular. El agente se puede administrar por vía parenteral. Alternativamente o además, el agente se puede administrar directamente en el ojo o cerca del ojo. Por ejemplo, la proteína se puede administrar tópicamente o intraocularmente , p. ej . , como se describe a continuación.
Formulaciones y métodos para la administración ocular Las formulaciones oftálmicas que contienen un agente de unión al receptor se pueden realizar para la administración tópica, p. ej . , para la administración como una gota liquida o un ungüento, o para el implante, p. ej . , en una cámara anterior del ojo o el saco conjuntival. Las gotas liquidas se pueden administrar utilizando un gotero. Cuando se formula para la administración ocular, el agente de unión al receptor puede estar presente en una concentración de entre el 0.0001 y el 0.1%, el 0.001 y el 5%, p. ej., el 0.005 y el 0.5%, el 0.05 y el 0.5%, el 0.01 y el 5%, el 0.1 y el 2% o el 1 y el 5%. Frecuentemente, la formulación oftálmica se aplica directamente en el ojo, incluso en la aplicación tópica en los párpados o la instilación en el espacio (cul-de-sac) entre el globo ocular y los párpados. La formulación oftálmica se puede diseñar para mezclarse fácilmente con los fluidos lacrimales y para dispersarse sobre las superficies de la córnea y la conjuntiva. Con la técnica de administración habitual, la mayor parte del fármaco se deposita en el fondo de saco inferior. La capilaridad, las fuerzas difusionales y el reflejo de parpadeo conducen a la incorporación del fármaco en la película precorneal desde la cual penetra en la córnea y a través de esta.
Las ormulaciones oftálmicas también pueden incluir uno o más de otros agentes, p. e j . , un esferoide antiinflamatorio, por ejemplo rimexolona, loteprednol, medrisona e hidrocortisona , o un antiinflamatorio no esteroideo. Por ejemplo, el esteroide puede estar presente en una concentración del 0.001 al 1%. En algunas realizaciones, no hay ningún esteroide. Por ejemplo, el agente de unión al receptor es el único agente activo en la formulación.
La formulación también puede incluir uno o más de los siguientes componentes: . surfactantes , agentes de tonicidad, tampones, conservantes, codisolventes y agentes de viscosidad. Los agentes de tonicidad se pueden utilizar para ajustar la tonicidad de la composición, p. ej., a la tonicidad de las lágrimas naturales. Por ejemplo, se pueden añadir cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, dextrosa o manitol para lograr una tonicidad adecuada, p. ej . , la tonicidad fisiológica. Los agentes de tonicidad se pueden añadir en una cantidad suficiente para proporcionar una osmolalidad de aproximadamente 150-450 mOsm o 250-350 mOsm.
La formulación también puede incluir tamponamiento adecuado para la administración oftálmica. El tampón puede incluir uno o más componentes de tamponamiento (p. e . , fosfato de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio o ácido bórico) para los cambios en el pH especialmente en condiciones de almacenamiento. Por ejemplo, se puede seleccionar el tampón para proporcionar un pH diana dentro del intervalo de pH 6.0-7.5, p. ej . , 6.5-7.5.
La formulación puede incluir un portador acuoso o de fosfolipidos . Especialmente para tratar trastornos del ojo seco, la formulación puede incluir agentes para proporcionar alivio a corto plazo, p. ej., compuestos que lubrican el ojo y ayudan a la formación de lágrimas. Por ejemplo, los portadores de fosfolipidos (que incluyen uno o más fosfolipidos ) se pueden utilizar para proporcionar alivio a corto plazo. Ejemplos o composiciones de lágrimas artificiales útiles como portadores de lágrimas artificiales incluyen los productos comerciales, por ejemplo Tears Naturale™ (Alcon Labs, Inc., TX EUA) . Por ejemplo, por mi, la formulación puede incluir: 1 mg de dextrano, 70 y 3 mg de hidroxipropilmetilcelulosa y, opcionalmente, un conservante como POLYQUAD® (policuaternio-1 ) al 0.001% (m/v) . Ejemplos de formulaciones de portadores de fosfolipidos incluyen las divulgadas en 4.804.539 de EUA, 4.883.658 de EUA, 5.075.104 de EUA, 5.278.151 de EUA y 5.578.586 de EUA.
La formulación también puede incluir otros compuestos que actúan como lubricantes o agentes humectantes. Estos incluyen los agentes de viscosidad, por ejemplo: polioles monoméricos, por ejemplo, glicerol, propilenglicol , etilenglicol; polioles poliméricos, por ejemplo polietilenglicol, varios polímeros de la familia de celulosa: hidroxipropilmetilcelulosa ("HPMC"), carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilcelulosa ("HPC"), dextranos, por ejemplo dextrano 70; proteínas solubles en agua, por ejemplo gelatina; y polímeros de vinilo, por ejemplo alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, povidona y carbómeros, por ejemplo carbómero 934P, carbómero 941; carbómero 940, carbómero 974P. Otros ejemplos adicionales incluyen los polisacáridos , por ejemplo el ácido hialurónico y sus sales y sulfato de condroitina y sus sales, y polímeros de ácido acrílico. En determinadas realizaciones, la formulación tiene üna viscosidad de entre 1 y 400 cP.
La formulación se puede empaquetar para el uso de dosis única o múltiple, p. ej . , en un frasco con un gotero asociado o como un conjunto de goteros para un solo uso. La formulación puede incluir uno o más conservantes, p. e j . , para evitar la contaminación microbiana y micótica durante el uso. Los conservantes ejemplares incluyen: cloruro de benzalconio, clorobutanol , bromuro de benzododecinio , metilparabeno, propilparabeno, feniletil alcohol, edetato disódico, ácido sórbico y policuaternio-1 , y se pueden incluir en una concentración del 0.001 al 1.0% p/v. También es posible proporcionar una formulación que contiene un agente de unión al receptor que es estéril, pero sin conservantes. La formulación se puede preparar para una aplicación de uso único.
Se pueden utilizar paquetes oftálmicos para proporcionar un contacto prolongado de una formulación oftálmica con el ojo. Se satura un trozo de algodón con la formulación y luego se inserta en el fondo de saco superior o inferior. También se puede administrar un agente de unión al receptor mediante iontoforesis . Este procedimiento mantiene la solución en contacto con la córnea en una copa ocular que contiene un electrodo. La difusión del fármaco se produce por la diferencia de potencial eléctrico.
Un agente de unión al receptor también se puede administrar por inyección, p. e . , inyección subconjuntival . La formulación se puede inyectar debajo de la conjuntiva facilitando el paso a través de la esclerótica y dentro del ojo por difusión simple. La formulación también se puede inyectar debajo de la conjuntiva y la cápsula de Tenon subyacente en la parte más posterior del ojo para administrar el agente al cuerpo ciliar, la coroides y la retina. La formulación también se puede administrar por inyección retrobulbar .
Con respecto al ojo seco y a otros trastornos supe ficiales, se puede evaluar a los sujetos utilizando uno o más de los siguientes enfoques: el índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI), tinción corneal y conjuntival y la prueba de Schirmer.
El índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI) es un cuestionario de 12 ítems que proporciona una rápida evaluación de los síntomas de la irritación ocular congruente con los trastornos inflamatorios de la superficie ocular, incluso DES y su impacto en el funcionamiento relacionado con la visión. Véase, p. ej. Ocul Immunol Inflamm. 2007 Sep-Oct; 15 (5) :389-93. Los 12 ítems del cuestionario OSDI se califican en una escala de 0 a 4. Los puntajes se derivan según las respuestas para proporcionar un puntaje de OSDI en una escala de 0 a 100, los puntajes mayores representan mayor discapacidad. Un cambio negativo con respecto a la referencia indica una mejoría en la función relacionada con la visión y los trastornos oculares inflamatorios.
Tinción corneal y conjuntival: la tinción corneal es una medida de enfermedad epitelial o ruptura de la barrera epitelial de la superficie ocular, típicamente se observa en los trastornos inflamatorios de la superficie ocular, por ejemplo el o o seco. La tinción corneal puede existir incluso sin la manifestación clínica del ojo seco, si hay una enfermedad de los párpados significativa, por ejemplo blefaritis posterior. La tinción corneal está altamente correlacionada con el malestar ocular en muchos pacientes, aunque no en todos; en general, la tinción corneal está asociada con puntajes altos en OSDI, como se describe a continuación. Para la tinción con fluoresceina de la córnea, se utilizan tiras de fluoresceina humectadas con solución salina o solución de fluoresceina de sodio al 1% para teñir la película lagrimal. Después, se evalúa toda la córnea utilizando evaluación con lámpara de hendidura con un filtro de barrera amarillo N.° 12 Wratten) e iluminación azul cobalto. La tinción se califica de acuerdo con el esquema de Oxford. La tinción conjuntival también es una medida de enfermedad epitelial o ruptura en la barrera epitelial de la superficie ocular. La tinción conjuntival se realiza bajo la lámpara de hendidura utilizando verde lisamina. Se utiliza una tira Humectada con solución salina o solución con verde lisamina al 1% para teñir la película lagrimal y se evalúa la tinción conjuntival interpalpebral más de 30 segundos, pero menos de 2 minutos después. Utilizando luz blanca de intensidad moderada, se califica solamente la región interpalpebral de la tinción conjuntival nasal y temporal utilizando el esquema de Oxford.
Prueba de Schirmer: la prueba (o "test") de Schirmer.se realiza con y sin anestesia, colocando un tira de papel de filtro estrecha (tira de 5 x 35 mm de papel de filtro Whatman N.°41) en el "cul-de-sac" inferior. Esta prueba se realiza en una habitación con poca luz. El paciente cierra suavemente los ojos, se dejan transcurrir cinco minutos y se retiran las tiras. Como la parte delantera de la lágrima continuará avanzando unos pocos milímetros después de que se hayan retirado de los ojos, se marca la parte delantera de la lágrima con un bolígrafo precisamente a los cinco minutos. Se mide la producción lagrimal acuosa mediante la longitud que se moja la tira en milímetros, durante 5 minutos. Los resultados de 10 mm o menos en la prueba de Schirmer sin anestesia y de 5 mm o menos en la prueba de Schirmer con anestesia se consideran anormales. Un cambio positivo con respecto a la referencia indica una mejoría de uno o más síntomas de un trastorno ocular inflamatorio descrito en el presente .
Formulaciones y métodos para la administración pulmonar Se puede formular un agente de unión al receptor para la administración inhalatoria u otra vía de administración pulmonar, p. e . , para administrar el agente a un tejido de las vías respiratorias, p. ej . , las vías respiratorias superiores e inferiores. Los tres sistemas comunes que se pueden utilizar para administrar agentes localmente a los conductos de aire pulmonares incluyen inhaladores de polvo seco (DPI), inhaladores de dosis controladas (MDI) y nebulizadores . Los MDI se pueden utilizar para administrar agentes de unión al receptor de una forma solubilizada o como una dispersión. Típicamente, los MDI incluyen un freón u otro propelente de presión de vapor relativamente alta que transporta el medicamento aerosolizado a las vias respiratorias tras la activación del dispositivo. En cambio, los DPI generalmente se basan en el esfuerzo inspiratorio del paciente para introducir un medicamento en forma de polvo seco a los pulmones. Los nebulizadores forman un aerosol del medicamento para ser inhalado proporcionando energía a una solución liquida. El agente se puede almacenar en forma liofilizada (p. e . , a temperatura ambiente) y reconstituir una solución antes de la inhalación. La administración pulmonar directa de fármacos durante la ventilación líquida o el lavado' pulmonar utilizando un medio fluoroquímico también son posibles modos de administración. Se pueden utilizar estos y otros métodos para administrar un agente de unión al receptor. Por ejemplo, el agente se administra en forma de dosificación unitaria de al menos aproximadamente 0.02, 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 5, 10, 20, 40 o 50 mg/disparo o más.
El agente de unión al receptor se puede administrar de forma conveniente en una presentación de aerosol en spray de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, p. ej . , diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dielilorotetrafluoroctliano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular de forma que contengan una mezcla del agente de unión al receptor y una base de polvo adecuada, como lactosa o almidón, si la partícula es una partícula formulada. Además del agente de unión al receptor formulado o no formulado, se pueden mezclar otros materiales, por ejemplo DPPC al 100% u otros surfactantes para promover la administración y la dispersión del agente de unión al receptor formulado o no formulado. El tamaño de partícula también se puede variar para controlar si la administración es en las vías respiratorias superiores o inferiores. Por ejemplo, las partículas en el intervalo de tamaño de 1 y 5 micrones o de 10 y 50 micrones se pueden utilizar para las vías respiratorias superiores e inferiores, respectivamente .
Se pueden utilizar potenciadores de administración tales como surfactantes para mejorar aún más la administración pulmonar. Un surfactante generalmente es un compuesto que tiene una parte hidrofílica y una lipofílica, que promueve la absorción de un fármaco interactuando con una interfase entre dos fases inmiscibles. Los surfactantes son útiles en las partículas secas por varios motivos, p. ej . , la reducción de la aglomeración de partículas y la reducción de la fagocitosis de macrófagos. Los surfactantes se conocen en la técnica e incluyen los fosfoglicéridos , p. e . , fosfatidilcolinas , L-alfa-dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y fosfatidilglicerol (DPPG) ; hexadecanol ; ácidos grasos; polietilenglicol (PEG); polioxietileno-9- ; lauril éter; ácido palmítico; ácido oleico; trioleato de sorbitán (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxómero; éster de ácido graso de sorbitán; trioleato de sorbitán; tiloxapol y fosfolipidos.
También se presentan aqui anticuerpos que reconocen específicamente un dominio de citocina quimérico descrito en el presente. Por ejemplo, dichos anticuerpos se unen preferentemente a un dominio quimérico relativo a cualquier dominio de citocina madre. Por ejemplo, un anticuerpo específico se puede unir a un epítopo que incluye una unión entre un segmento de una primera citocina madre y una segunda citocina madre.
Administración de ácido nucleico Un agente de unión al receptor se puede proporcionar a un sujeto administrando un ácido nucleico que codifica y que puede expresar el agente de unión al receptor. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica al agente de unión al receptor se puede colocar bajo el control de las secuencias de control de transcripción y posicionar en un vector de ácido nucleico para la administración del gen, p. e . , un vector viral. Vectores virales ejemplares incluyen los vectores adenovirales , retrovirales o virales asociados a adeno. Los vectores pueden estar en forma de un plásmido o molécula lineal, p. ej . , un ADN de doble cadena lineal. El ácido nucleico administrado se puede diseñar para ser incorporado en el genoma de la célula diana, p. ej . , para integrarse en el genoma de la célula diana. Alternativamente, el ácido nucleico administrado se puede diseñar de modo que después de la administración esté presente de forma autónoma en la célula.
Las secuencias de control transcripcional se pueden diseñar para proporcionar expresión transitoria o constitutiva. El control transitorio puede incluir control regulado por un agente exógeno, p. e . , utilizando elementos de respuesta transcripcional para los factores de transcripción que responden a los agentes exógenos (p. ej . , una hormona esteroide o FK506) o señales ambientales.
Se puede evaluar la expresión de genes proporcionada en el ácido nucleico administrado, p. e . , detectando la proteina codificada por el gen (p. ej . , utilizando anticuerpos) o detectando el ARNm, p. ej . , utilizando PCR o hibridación Northern. El ácido nucleico administrado generalmente se diseña de modo que el ADN regulador transcripcional y traslacional se posicionen adecuadamente con respecto a la secuencia codificante para el agente de unión al receptor, de modo que se inicie la transcripción y se traduzca la proteina a partir del mensaje resultante. El ácido nucleico puede incluir secuencias de ácido nucleico reguladoras transcripcional y traslacional de células mamiferas, especialmente humanas. Dichas secuencias incluyen, p. ej . , secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, secuencias de arranque y de detención transcripcional, secuencias de arranque y de detención traslacional y secuencias potenciadoras o activadoras.
Además, el vector de expresión puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, para los vectores de expresión de integración, el vector de expresión puede contener al menos una o más secuencias homologas al genoma de la célula hospedera, p. e . , que flanquea la construcción de expresión. El vector de integración se puede dirigir a un locus especifico en la célula hospedera mediante la selección de la secuencia homologa adecuada para la inclusión en el vector. Las construcciones para los vectores de integración se conocen en la técnica.
Vectores adenovirales ejemplares incluyen versiones modificadas de adenovirus humanos, por ejemplo Ad2 o Ad5, en los cuales se han eliminado los elementos genéticos necesarios para que el virus se reproduzca in vivo. Por ejemplo, se puede eliminar la región El y se puede modificar adicionalmente el genoma para aceptar un cásete de expresión que codifica el agente de unión al receptor.
Vectores retrovirales ejemplares incluyen los vectores LNL6, LXSN, LNCX y lentivirales . Vectores lentivirales específicos han sido descritos por Pawliuk y col. (2001) Science 294:2368 e Imren y col. (2002) PNAS 99:14380 y se limitan a: virus de la inmunodeficiencia humana (p. ej . , VIH-1, VIH-2), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) , virus de la inmunode ficiencia de los simios (VIS), virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) y virus de la anemia infecciosa equina (VAIE) . Estos vectores se pueden construir y diseñar de modo que sean seguros, p. ej . , separando los genes esenciales (p. je., gag y pol) en vectores separados y proporcionando replicación de retrovirus defectuoso. La replicación de retrovirus defectuoso luego se empaqueta en viriones a través del uso de un virus auxiliar o una línea celular de empaquetamiento mediante las técnicas convencionales. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vítro o in vivo con dichos virus se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M . y col. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. El vector retroviral puede incluir, además de las secuencias para expresar un agente de unión al receptor, un LTR retroviral izquierdo (5'); un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de respuesta inverso (RRE); un promotor y una región de control del locus (LCR) u otra secuencia aislante transcripcional y un LTR retroviral derecho (3'). Los vectores retrovirales pueden contener además un tracto de polipurina central (cPPT) o un fragmento de ADN para aumentar los títulos virales y la eficacia de transducción .
El ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica un agente de unión al receptor se puede administrar a cualquier célula diana adecuada, p. e . , ex vivo o in vivo. Las células diana ejemplares incluyen células sinoviales, células hematopoyéticas, células dérmicas y similares. El ácido nucleico se puede administrar a las células diana asociadas con el ojo, p. e . , las células epiteliales de la córnea. La administración puede incluir desbridamiento o raspado del epitelio de la córnea para exponer una capa basal de epitelio. Después, se añade el ácido nucleico para la administración. En otra realización, se administra el ácido nucleico a las células endoteliales de la córnea, las células de la malla trabecular debajo de la periferia de la córnea, las células de la capa coroide del ojo, las células de la retina, la esclerótica o el cuerpo ciliar, las células de la vasculatura retinal u ocular o las células del cuerpo vitreo o las células del cristalino, por ejemplo, el epitelio del cristalino .
Los métodos de administración incluyen, p. e . , infección retroviral, infección adenoviral, transformación con plásmidos, transformación con liposomas que contienen ácido nucleico exógeno, administración biolistica del ácido nucleico (p. e . , cargando el ácido nucleico en partículas de oro u otro metal y disparándolas o inyectándolas en las células), infección con virus asociado a adeno e infección con virus de Epstein-Barr . La administración puede ser a las células o al tejido a través de cualquier método incluso, inyección de aguja, hipospray, electroporación o una pistola de genes.
Otros métodos para la administración de genes se pueden encontrar, p. ej . , en Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp. ) : 138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. y col. (1999) Liver 19:265-74; Oka, . y col. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol . 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann . N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep . 3:43-49; y Lee, H. C. y col. (2000) Nature 408:483-8.
Agentes secundarios ejemplares Un agente de unión al receptor descrito aqui se puede administrar con un agente secundario. Los agentes se pueden coadministrar o administrar por separado, p. e . , utilizando regímenes diferentes. Agentes secundarios ejemplares incluyen un agente antiinflamatorio. En una realización, el agente secundario es un antagonista de IL-17 (abarca los antagonistas de todos los miembros de la familia IL-17, p. ej., antagonistas de IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E) . Antagonistas de IL-17 ejemplares incluyen: agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-17 (incluido IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E) y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-17, como IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene IL-17 y al menos una subunidad del receptor, p. e . , IL-17 e I1-17RA, o IL-17, IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; y agentes como los receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17.
En otra realización, el agente secundario es un antagonista de IL-12. Antagonistas de IL-12 ejemplares incluyen: agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-12 (incluido p35 y p40) y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-12, como IL-12Rpi o IL-12í^2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene p35, p40 y al menos una subunidad del receptor, p. ej . , IL-12R l o ^-12? 2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; y agentes como los receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios. extracelulares solubles de IL-12R i o IL-12Rß2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12.
En otra realización, el agente secundario es un antagonista de IL-23. Antagonistas de IL-23 ejemplares incluyen: agentes (como anticuerpos y otras proteínas' de unión) que se unen a IL-23 (incluido pl9 y p40) y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-23, como IL-12Rpl o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; agentes (como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene pl9, p40 y al menos una subunidad del receptor, p. e . , IL-12Rpl o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; y agentes como los receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extra celulares solubles de IL-12RP1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23.
Se han descrito anticuerpos ejemplares para IL-23. Véase, p. ej . , Beyer y col., J. Mol. Biol . (2008), doi : 10.1016/j . mb .2008.08.001.
Modelos animales Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo animal para una enfermedad humana, p. e . , una enfermedad humana autoinmune o una enfermedad humana inflamatoria. El agente puede tener especificidad para la proteína diana correspondiente en el animal.
Modelos de artritis reumatoide. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo animal de artritis reumatoide, p. ej . , el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) . Véase, por ejemplo, Mclndoe y col., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 96:2210-2214; Issekutz, A. C. y col., Immunology (1996) 88:569; y Current Protocols in Immunology, Unit 15.5, Coligan y col. (eds.), John iley & Sons, Inc. El modelo se produce mediante la inmunización de cepas susceptibles de ratas/ ratones con colágeno nativo tipo II. Se emulsifica el colágeno en adyuvante completo de Freund (CFA) y se inyecta por via intradérmica (100 µ? de colágeno: 100 µg de CFA/ratón) en la base de la cola. Los ratones de control son inyectados por via intradérmica con 0.05 mi de emulsión de agua destilada/CFA. Se administra una inyección de refuerzo de colágeno en adyuvante incompleto 21 días después de la inmunización inicial. La enfermedad es causada por una respuesta autoinmune inducida tras la inmunización con colágeno.
Las articulaciones se pueden evaluar en cuanto a la artritis, inflamación, pannus, daño al cartílago y resorción ósea utilizando una escala definida. Por ejemplo, la gravedad de la artritis se puede evaluar del siguiente modo: 0= sin efectos visibles de artritis; 1= edema y eritema de un dedo o articulación; 2= edema y eritema de dos articulaciones; 3= edema y eritema de más de dos articulaciones; 4= artritis grave de roda la pata y los dedos, acompañada por anquilosis del tobillo y deformidad de la pata. Se suma el puntaje de cada pata y se registra como el índice artrítico (AI) para cada animal individual. También se pueden utilizar otros esquemas de puntuación para estos y otros criterios.
Esclerosis múltiple. La encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es un modelo murino útil para la esclerosis múltiple. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en el modelo de EAE. EAE es un trastorno autoinmune mediado por células T, caracterizado por la inflamación de las células T y de las células mononucleares y la posterior desmielinizacion de los axones en el sistema nervioso central. (Véase, por ejemplo, Bolton, C, 1995, Múltiple Sclerosis, 143.) Se pueden encontrar protocolos ejemplares en Current Protocols in Immunology, unidad 15.1 y 15.2; Coligan y col. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. También hay modelos disponibles para la enfermedad de la mielina en la cual se injertan oligodendrocitos o células de Schwann en el sistema nervioso central, por ejemplo, como se describe en Duncan y col., 1997, Molec. Med. Today, 554-561.
Aloinjerto. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo animal para el rechazo de aloinjertos de piel, p. e j . , utilizando injertos murinos de piel de cola. El rechazo de aloinjertos de piel es mediado por las células T, las células T auxiliares y las células T destructoras-efectoras. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, unidad 4.4; Coligan y col. (eds.), 1995, John Wiley & Sons, Inc. También se pueden utilizar otros modelos de rechazo de transplantes. Véase, p. e . , Tinubu y col.', 1994, J. Immunol., 4330-4338.
Modelos de IBD y colitis. Un modelo ejemplar para la enfermedad inflamatoria intestinal es el uso de células CD4+ con CD45Rb alto transferidas a ratones SCID. Véase, p. e . , Hirano y col., J Pharmacol Sci. 2009 Jun; 110 ( 2 ) : 169-81 y el uso de ratones transgénicos con deficiencia de IL-10. Véase, p. e . , Inaba y col., Inflamm Bowel Dis., DOI : 10.1002/ibd.21253 (2010) . Otro modelo de colitis ejemplar emplea dextrano sulfato de sodio (DSS) para inducir la colitis aguda. Por ejemplo, se puede inducir la colitis en ratones mediante la administración de DSS 5% (p/v) (masa molecular 30-40 kDa; ICN Biomedicals, Aurora, OH) en agua potable a voluntad. Los síntomas resultantes de este tratamiento incluyen diarrea con sangre, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por infiltración de las células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño focal de las criptas y ulceración- del epitelio. Se cree que estos cambios se desarrollan debido a un efecto tóxico del DSS sobre el epitelio y por la fagocitosis de las células de la lámina propia y la producción de TNF-alfa e IFN-gamma. Véase, p. e . , Hassan y col. PLoS One. 2010 Jan 25; 5(1) :e8868.
Modelos de enfermedad del ojo seco. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo de ratón para la enfermedad del ojo seco. Se puede inducir el ojo seco en ratones mediante inyección subcutánea de escopolamina y colocación de los ratones en cámaras de ambiente controlado. Como ejemplo especifico, se pueden inducir ratones C57BL/6 hembra de 6 a 10 semanas de edad sanos y normales para que sufran ojo seco mediante exposición continua a un ambiente seco en una cámara de ambiente controlado. La cámara tiene humedad relativa baja inferior al 30% (generalmente aproximadamente el 19%), flujo de aire alto (15 litros/minuto) y temperatura constante (aproximadamente 22°C) . Los ratones colocados en la cámara también reciben tratamiento con escopolamina para inhibir la secreción de lágrimas. Se pueden obtener parches transdé rmicos de escopolamina de liberación progresiva de Novartis (Summit, N.J.) . Se aplica cuarto parche en la mitad de la cola depilada de los ratones cada 48 horas. La combinación de la cámara de ambiente controlado y la escopolamina produce ojo seco grave en un periodo relativamente breve (aproximadamente' 2 a 4 dias) . Se puede preparar la cámara de ambiente controlado como se describe en Barbino y col., Invest. Ophthal. Vis. Sci., 46: 2766-2711 (2005) y permite el control del flujo de aire, la humedad y la temperatura.
Se puede moni tori za r a los ratones para detectar signos de ojo seco, p. ej., mediante la realización de: a) prueba del hilo de algodón para medir la producción lagrimal acuosa, que generalmente disminuye en los pacientes con ojo seco; b) tinción de la córnea con fluoresceina que es un marcador del daño a la superficie de la córnea; y examen oftálmico general .
Prueba del hilo de algodón: se puede medir la producción lagrimal con la prueba del hilo de algodón, impregnado con rojo de fenol ( Zone-Quick , Lacrimedics, Eastsound, Wash.) . Bajo una lámpara fluorescente con lupa, se sostiene el hilo con pinzas de joyería y se coloca en el canto lateral del fondo de saco conjuntival del ojo derecho durante 30 o 60 segundos. Se lee la distancia lagrimal en mm bajo un microscopio utilizando la escala de un hemacitómetro .
Tinción de la córnea con fluoresceina: Se puede evaluar la tinción de la córnea con fluoresceina mediante la aplicación de 1.0 µ? de fluoresceina al 5% utilizando una micropipeta en el saco conjuntival inferior del ojo. Se examina la córnea con un biomicroscopio con lámpara de hendidura utilizando luz azul cobalto 3 minutos después de la instilación de fluoresceina. La tinción evaluada se registra de forma enmascarada utilizando un sistema de calificación estandarizado del Instituto Nacional del Ojo (National Eye Institute, NEI) de 0-3 para cada una de las cinco áreas en las cuales se ha dividido la superficie de la córnea.
Diagnóstico y otros usos Un agente de unión al receptor descrito aqui se puede utilizar para detectar IL-1R1 en una muestra o en células que expresan dicho receptor. Por ejemplo, el agente se puede marcar directa o indirectamente con un grupo que es un marcador o que produce una señal, p. e . , una enzima, un radiomarcador , un epitopo o una proteina fluorescente (por ejemplo, una proteína verde fluorescente) . El agente se puede poner en contacto con una muestra o con células para determinar si el receptor está presente en la muestra o en las células, p. e . , utilizando inmunotransferencia estándar, inmunofluorescencia , inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), transferencia de ' energía de fluorescencia, transferencia Western y otras técnicas de diagnóstico y detección.
Además, se puede marcar el agente de unión al receptor para detección in vivo y administrar a un sujeto. Se pueden obtener imágenes del sujeto, p. e j . , por NMR u otras técnicas de tomografía. Por ejemplo, se puede marcar el agente de unión con un radiomarcador como 1311, lllln, 1231, 99mTc, 32P, 1251, 3H, 14C y 188Rh, con marcadores fluorescentes como la fluoresceína y la rodamina, con marcadores activos de resonancia magnética nuclear, isótopos emisores de positrones detectables utilizando un escáner de tomografía por emisión de positrones ("PET"), quimioluminiscentes como la luciferina y marcadores enzimáticos como la peroxidasa o la fosfatasa. Se puede marcar el agente con un agente de contraste como los agentes paramagnéticos y ferromagnéticos o superparamagnéticos (que modifican principalmente la respuesta de T2 ) .
Un agente de unión al receptor también se puede utilizar para purificar las células que expresan el receptor al cual se une. Por ejemplo, el agente de unión al receptor se puede acoplar con un soporte inmovilizado (p. ej., esferas magnéticas o una matriz de columna) y poner en contacto con células que pueden expresar el receptor. Se puede lavar el soporte, p. e . , con un tampón fisiológico y se pueden recuperar las células del soporte.
Un agente de unión al receptor también se puede utilizar para purificar las formas solubles del receptor al cual se une. Por ejemplo, se pueden poner en contacto muestras que contienen el receptor soluble con el agente de unión al receptor inmovilizado y luego, p. e j . , después del lavado, se pueden recuperar del agente inmovilizado.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran más las realizaciones de las invenciones descritas aqui .
E emplos Ejemplo 1 Se construyeron ácidos nucleicos que codifican las proteínas con las secuencias de aminoácidos enumeradas en la tabla 4 (a continuación) en un vector pET que contiene un promotor T7 y genes con resistencia a la ampicilina (serie pET31) o a la kanamicina (serie pET28) (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, EUA) y se expresaron. En la tabla 5, se proporcionan ejemplos de las secuencias codificantes que se pueden utilizar para la expresión.
Tabla 4 tabla 5, se enumeran secuencias de ácidos nucleicos ejemplares que codifican las proteínas anteriores. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye además un ATG antes del primer nucleótido enumerado a continuación. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye además un codón de parada (como TAA, TAG o TGA) después del último nucleótido enumerado a continuación.
Tabla 5 Las proteínas pueden incluir diversos residuos de IL-?ß e IL-IRa como se lustra a continuación. Entre los ejemplos P01, P02, P03, P04 y P05, los dominios de citocinas pueden tener entre el 48 y el 70% de residuos de IL-?ß y entre el 55 y el 78% de residuos de IL-IRa. (Como algunos residuos de aminoácidos se conservan entre las dos proteínas, la suma del porcentaje de identidad con IL-?ß y con IL-IRa puede ser superior al 100%.) Tabla 6 Ejemplo 2 Se expresaron proteínas que contienen una etiqueta de hexahistidina en células E. coli de la cepa BL21(DES) mediante inducción con IPTG 1 mM a 37°°C durante 3 horas en medio de caldo LB. Se Usaron las células en Tris 20-50 mM, NaCl 0.5 M, EDTA 2.5 mM, Tritón X-100 al 0.1%, pH 8.0. Se sometieron los Usados a cromatografía IMAC utilizando una columna preempaquetada HiTrap® (GE Healthcare, Piscataway NJ, EUA) . Se cargó la proteína en tampón de fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0.5 M, imidazol 10 mM, pH 7.4. Se eluyó con tampón de imidazol 200 mM, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0.5 M, pH 7.4. Se dializó la proteína eluída ampliamente contra PBS, polisorbato 80 al 0.1%, pH 7.4, se concentró utilizando un filtro Amicon Ultra® (10 ) y se almacenó a 4o o -80OoC.
Se purificaron las proteínas que no tenían una etiqueta de hexahistidina mediante cromatografía de intercambio iónico. Se purificó la proteína P05 mediante cromatografía de intercambio iónico. Se aplicó el Usado de las células de expresión a una columna GigaCapS™ (Tosoh Bioscience LLC, ing of Prussia, PA, EUA) a pH bajo (aproximadamente pH 5.5) en ausencia de sal (conductividad de aproximadamente 1 mS/cm) . Se eluyó la columna mediante un gradiente de pH (tampón A = ácido acético 10 mM, pH 5.5; tampón B = Tris 20 mM, pH 8) . Se diluyó una fracción de 5 mi que contenia la proteina eluida con 5 mi de H20 y 5 mi de Tris 20 mM, pH 8 y se aplicó a una resina CaptoQ™ (GE Healthcare, Piscataway NJ, EUA) y se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 mM a 250 mM en Tris 20 mM, pH 8.0. Se dializó la proteina eluida ampliamente contra 1.25 X PBS TWEEN® 80 al 0.1% o 1.25X PBS sin T EEN® y se almacenó. Véase la figura 6. Se purificaron las proteínas P03 y P04 utilizando métodos similares.
También se cultivaron células que expresan P05 en TEKNOVA™ Terrific Broth con Soytone no animal (N.° T7660) complementado con 10 g/L de glucosa, MgS04 10 mM, elementos traza (1 mg/ml 1000X Trace Elements TEKNOVA™, N.° T1001) y antibiótico en un Sartorius BIOSTAT™ A+ de 2L y se indujeron a OD de 35-40 con IPTG 1 mM durante aproximadamente 6 horas. Se cultivaron las células a 37 °C con oxígeno disuelto al 30% a pH 7.0, y agitación a 200-800 rpm con purga de oxígeno a 2L/min. Se alimentaron las células con 9 g de glucosa/L/h cuando se agotó la glucosa según se detecta por un aumento del pH. Se redujo la alimentación a 6 g de glucosa/L/h cuando disminuyó el pH (aproximadamente 2.5 horas después de la inducción ) .
Se recolectaron y se lisaron las células en tampón de lisis (Tris 20 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0.1%, pH 8.0; Tris 20 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0.1%, pH 7.0; MOPS 50 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0.1%, pH 6.5; o MOPS 50 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0.1%, pH 6.0) . Se cargó el lisado en un medio de intercambio iónico de cationes Poros XS® (Life Technologies Corp., Carlsbad CA EUA) a pH 5.3 y 3 mS/cm (35 mg de producto por mi de resina de la columna) .
En un procedimiento ejemplar, se eluyó la proteína P05 en una etapa a pH 7.0 utilizando tampón que contiene MOPS 100 mM, NaCl 25 mM, pH 7.0. Se desechó el primer pico de elución y se recolectó el segundo pico de elución en mezclas y contenían la proteína P05. Las primeras mezclas son enriquecidas en la proteína P05 intacta con respecto a la especie con des-Ala. El material eluído después se deja fluir sobre una resina de intercambio aniónico CaptoQ™. Se recolecta el flujo continuo que contiene la proteína P05 intacta .
En otro procedimiento ejemplar, se lavó el medio con MOPS 100 mM, NaCl 20 mM, pH 6.0. Se eluyó la proteína P05 en una etapa a pH 6.0 utilizando tampón que contiene MOPS 100 mM, NaCl 50-58 mM, pH 6.0. Se separó el primer pico de elución de los picos posteriores y contenía la proteína P05 intacta. El material eluído después se deja fluir sobre una resina de intercambio aniónico CaptoQ™. Se recolecta el flujo continuo que contiene la proteína P05 intacta .
Ejemplo 3 Se evaluaron las proteínas b los sobrenadantes que contenían las proteínas en un ensayo basado en células para detectar la actividad de IL-1. Se utilizaron células que responden a IL-?ß HEK-Blue™ para monitorizar la actividad de IL-?ß (comercializadas por InvivoGen Inc., San Diego CA, EUA) . Estas células incluyen un gen indicador de SEAP bajo el control del promotor mínimo de IFN-ß fusionado a cinco sitios de unión a NF-?? y a cinco sitios de unión a AP-1. La activación por IL-?ß de los receptores de IL-1 sobre la superficie celular produce la activación de NF-?? y la producción de SEAP. El informe de SEAP se puede detectar, p. ej., utilizando QUANTI-Blue™ (InvivoGen Inc., San Diego CA, EUA) y análisis espectrofotométrico . Se preparó una suspensión de células IL-?ß HEK-Blue a partir de células cultivadas hasta el 70-80% de confluencia. Se ajustaron las células resuspendidas a -330.000 células/ml en medio de cultivo nuevo (DMEM, 4.5 g/1 de glucosa, L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal inactivado por calor al 10% (v/v) (30 min a 56 °C) , 50 U/ml de penicilina, 50 µq/ml de estreptomicina, 100 µg/tal de NormocinT) .
Se añadieron los reactivos a los pocilios de una placa de cultivo celular de 96 pocilios de fondo plano: 10 µ? de IL-?ß a 20 ng/ml, 1 µ? del agente de interés y 30 µ? del medio de cultivo celular hasta un volumen final de 50 µ? . Se prepararon muestras ¦ de control positivo y negativo en paralelo. Se añadieron 150 µ? de la suspensión de células IL-1ß HEK-Blue (-50.000 células) a cada pocilio y se cultivó la placa durante la noche a 37°°C en una incubadora de cultivo de tejidos con C02 al 5%. En general, la concentración de IL-1ß final (en el volumen final de 200 µ?) fue 0.1 ng/ml. Se evaluó la actividad de IL-?ß el día siguiente (12-15 horas más tarde) . Antes de la cuanti ficación, se preparó el reactivo QUANTI-Blue™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una placa de ensayo de 96 pocilios de fondo plano en la cual se añadieron 150 µ? de solución QUANTI-Blue™ a cada pocilio. Se añadieron 50 µ? de medio acondicionado de los pocilios de la placa de cultivo de tejidos de 96 pocilios a cada pocilio de la placa de ensayo. Se incubó la placa a 37°°C durante aproximadamente 15 a 20 minutos. Se midieron los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620-655 nm.
Resultados. Como se muestra en la figura 7A, en este ensayo, la proteína P06 se comportó como un agonista de IL-1RI, la proteína P07 se comportó como un agonista parcial y la proteína P01 no produjo agonización. De hecho, la proteina P01 se comportó como un antagonista cuando se evaluó en presencia de IL-?ß. La figura 7B muestra el antagonismo de la actividad de IL-?ß por P01 en un intervalo de concentraciones de la proteina de IL-?ß utilizando el ensayo de células HE Blue™ anterior. El antagonismo aumentó con el aumento de la cantidad de P01 (el eje X refleja los microlitros de sobrenadante que contenía P01) .
Las proteínas P01, P02, P03, P04 y P05 antagoniza ron la actividad de IL-?ß. Véase, por ejemplo, la figura 8A y 8B. La IC50 de P05 fue inferior a aproximadamente 5 ng/ml . Se evaluó la capacidad de P05 de agonizar IL-1RI en este ensayo y se observó que no presentaba actividad agonista detectable, incluso a las mayores concentraciones evaluadas, 1 mg/ml. P01, P02, P03, P04 y P05 también inhibieron la expresión de IL-6 inducida por IL-?ß en células MG-63, una línea celular de osteosarcoma humano que responde a IL-?ß. En un modelo murino de enfermedad del ojo seco, se observó que P05 marcada con hexahistidina presentaba actividad biológica. Véase también el ejemplo 8 a continuación sobre la P05 no marcada.
Ejemplo 4 Se evaluaron las propiedades de unión de las proteínas para IL-1RI humana recombinante soluble (correspondiente al dominio extracelular de IL-1RI) utilizando resonancia de plasmón superficial con un sistema SPR de doble canal Reichert SR7000DC. Se evaluó la unión en solución salina con tampón de fosfato con Tween 20 al 0.005%. Se observó que IL-1ß tenía una KD de entre 8 y 9 nM y una constante de disociación (Kd) de entre 2 y 3 ? 10-3 s-1, y en otro experimento una KD de aproximadamente 2 nM, una constante de asociación de 1.3-1.5 ? 106 M-ls-1, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 2.9-3.0 ? 10-3 s-1. Véase la figura 9A. La proteina P01 se unión con cinética de asociación similar a IL-?ß, pero no se disoció durante la fase de disociación del experimento de unión (aproximadamente 180 segundos) . Por lo tanto, la proteína P01 se unió a IL-1RI con una mayor afinidad que IL-?ß en condiciones similares.
Se observó que la unión de IL-IRa tenía una KD de aproximadamente 0.33 nM, una constante de asociación (Ka) de aproximadamente 2 ? 105 M-ls-1 y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 6.6 10-5 s-1. Véase la figura 9B . Se observó que los dominios de citocinas quiméricos P01, P02, P03, P04 y P05 tenían una KD en el intervalo de entre aproximadamente 12 y 1700 pM, una constante de asociación (Ka) en el intervalo de entre aproximadamente 3 ? 104 M-ls-1 y 3 x 106 M-ls-1 y una constante de disociación (Kd) en el intervalo de entre aproximadamente 2 10-5 y 1 10-3 s-1.
Véase, por ejemplo, las figuras 9C y 9D y la tabla 7 a continuación .
Tabla 7 Ejemplo 5 Otras proteínas ejemplares de la familia IL-1 quiméricas también incluyen las siguientes: apvrslAFriwdvnqktfylrnnql agylqgpnvnleekfsmsfvqg SEQ 08 eesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmek N.°:32 rf fnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvt kfymqfvss apvrsQAFriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsmsfvqg SEQ 09 eesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmek N.°:33 rf fnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvt kfymqfvss apvrslAFriwdvnqktfylrnnql vagylqgpnvnleeklDVsfvqg SEQ 10 eesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypkkkmek N.°:34 rfvf kieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmvt kfymqfvss apvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleeklDV SEQ 11 sfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypk N.°:35 kkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwfletameadqpvsitnmpde gvmvtkfymqfvss apvrsincriwdvnqktfyIrnnqlvagylqgpnvnleekfsm SEQ 12 sfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypk N.°:36 kkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwfletameadqpvsitnmpde gvmvtkfTmqfvss apvrslAFriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsm SEQ 13 sfvqgeesndkipvalglkeknlyl scvlkddkptlqlesvdpknypk N.°:37 kkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwfletameadqpvsitnmpde gvmvtkfyFQED apvr slNCriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsm SEQ 14 sfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpknypk N.°:38 kkmekrfvfnkieinnklefesaqfpnwfletameadqpvsitnmpde gvmvtkfyFQED El polipéptido a continuación es un dominio quimérico que incluye al menos dos segmentos de IL-loc y al menos dos segmentos de IL-IRa.
SAPFSFLSNVKYNFMRII YEFRI DV Q TFYLRNNQLVAGYL SEQ QGPNVNLEE FDMGAYKSSKDDAKI TVILRI SKTQLYVTAQDEDQPVLLK N.°: 39 EMPEI PKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFLC AMEADQPVS LTNMPDEGVMVT FYILENQA Ejemplo 6 Se puede construir un dominio quimérico de IL-1 circularmente permutado mediante la unión del extremo amino terminal con el extremo carboxilo terminal de la molécula utilizando una secuencia ligadora y seleccionando una nueva ubicación para cada uno de los extremos terminales. Para las proteínas que tienen extremos terminales derivados de IL-?ß, la longitud del ligador puede ser de entre cinco y diez, p. e . , aproximadamente siete aminoácidos. Las ubicaciones preferidas para los nuevos extremos terminales son en los bucles orientados en dirección opuesta a los receptores, como el bucle ß6-ß7 (p. ej . , los aminoácidos correspondientes a 71-80 de SEQ ID NO:l) o el bucle ß7-ß8 (p. e . , los aminoácidos correspondientes a 84-99 de SEQ ID N0:1) .
Ejemplos de dichos dominios quiméricos de IL-1 circularmente permutados: dkptlqlesvdpknypkkkmekrfvfnkieinnkle fesaqfpnwfletameadqp vsltnmpdegvmvtkf mqfvssggSgggSapvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylq gpnvnleekfsmsfvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkd (SEQ ID NO: 40) y nypkkkmekr f fnkieinnklefesaqfpnwflctameadqpvsltnmpdegvmv tkfymqfvssggsgggsapvrslncriwdvnqktfylrnnqlvagylqgpnvnleekfsms fvqgeesndkipvalglkeknlylscvlkddkptlqlesvdpk (SEQ ID NO: 41) Ejemplo 7 Se prepararon las proteínas P03, P04, P05, mlL-IRa (metionil IL-IRa) e IL-?ß en solución salina con tampón de fosfato (PBS), pH 7.4 a 0.5 mg/ral . Se combinaron las proteínas con tinta naranja SYPRO (Invitrogen, CA) y una dilución 1:500 de la concentración madre y se sometieron a fluorimetría de exploración diferencial. Véase, p. ej . , He y col. (2010) J. Pharm. Sciences, 99 1707-1720. Se monitorizaron las mediciones de fluorescencia utilizando una máquina de QPCR Agilent Mx3005 a medida que se aumentó la temperatura de 25 °C a 95 °C a una tasa de 1 °C por minuto. Se derivaron los valores de la temperatura de fusión (Tm) del valor del máximo de la primera derivada de la transición de fluorescencia. Se observó que las proteínas P03, P04 y P05 tenían un comienzo de despliegue de más de 50 °C y de hasta 59 °C, y una Tm de más de 59, 60, 62 y 64 °C . Los resultados se muestran en la tabla 8 a continuación y en las figuras 10A y 10B: Tabla 8 Proteína Tm (°C) Comienzo de despliegue (°C) mlL-IRa 56 48 IL-?ß 56 41 P03 65 59 P04 · 60 51 P05 65 59 P04 tiene una Tm que es aproximadamente 4 grados superior a la de mlL-IRa e IL-?ß, y presenta un comienzo de despliegue aproximadamente 3 grados superior al de mlL-IRa y aproximadamente 10 grados superior al de IL-?ß. P03 y P05 tienen una Tm que es aproximadamente 9 grados superior a la de mlL-IRa e IL-?ß, y presentan un comienzo de despliegue aproximadamente 11 grados superior al de mlL-IRa y aproximadamente 18 grados superior al de IL-?ß.
Ejemplo 8 Se preparó P05 (sin una etiqueta de hexahistidina ) en 1.25x PBS y se evaluó en un modelo murino de enfermedad del ojo seco. En este modelo, se preseleccionaron ratones C57BL/6 hembra de 6 a 10 semanas de edad de Jackson Laboratories (aclimatados durante 1 o 2 semanas en una sala de alojamiento de animales con =30% de humedad relativa, complemento alimenticio hidrogel y enriquecimiento ambiental envirodry) para tinción con fluoresceina el dia 0. Para la tinción con fluoresceína, se administró fluoresceina diluida en WFI H20 a 10 mg/mL recién preparada en una cantidad de 0.4 pL en cada ojo. Aproximadamente 8-13 minutos después de la administración, se evaluaron los ojos utilizando un microscopio de disección fluorescente Olympus. Se registró la tinción evaluada utilizando el sistema de calificación estandarizado del Instituto Nacional del Ojo (NEI) de 0-3 para cada una de las cinco áreas en las cuales se ha dividido la superficie de la córnea (intervalo de puntuación 0-15/ojo) . Utilizando un puente, de enseñanza, dos evaluadores enmascarados evaluaron a los ratones al mismo tiempo para dar un único puntaje colectivo para cada ojo.
Se colocaron los ratones con puntajes = 7 para cada ojo (de un puntaje máximo de 15) en una cámara de ojo seco (20%± 2% de humedad y flujo de aire constante -21 L/min/jaula) el dia 1 y se mantuvieron en esta cámara durante el transcurso del experimento (excepto para el examen) . El día 3, se evaluó nuevamente a los ratones y se los dividió aleatoriamente en grupos de tratamiento con 8 a 10 ratones/grupo. Se agruparon aleatoriamente los ratones de modo que cada jaula de 4 o 5 ratones tuviera aproximadamente el mismo puntaje de enfermedad promedio. A partir del dia 3 y después de la asignación aleatoria, a los ratones se les administró por vía tópica P05 o vehículo (1.25X PBS ) en una gota para el ojo de 3 pL/ojo con una frecuencia BID. Los ratones fueron examinados y valorados los días 7, 9 y 11 en cuanto a la tinción de la córnea con fluoresceína como se describió anteriormente. Los evaluadores se mantuvieron ciegos sobre los grupos de tratamiento durante el transcurso del experimento .
La figura 11A es una gráfica de barras del puntaje medio de tinción corneal ± SEM los dias 0, 3, 7, 9 y 11 para los ratones de dos experimentos idénticos con los siguientes tratamientos bid: ningún tratamiento, vehículo (1.25X PBS) y P05 10 mg/ml (1%) . P05 10 mg/ml redujo significativamente la tinción corneal los días 7, 9 y 11 del experimento. La eficacia evaluada mediante una reducción en la tinción corneal también se observó con dosis de P05 de hasta 0.1 mg/ml. IL-IRa recombinante producido en E. coli también redujo moderadamente la tinción corneal en el modelo animal.
Como se muestra en la figura 11B, el efecto de P05 10 mg/ml fue específico basándose en una comparación con albúmina sérica murina 10 mg/ml en el mismo vehículo. No se observó ningún efecto con albúmina sérica murina (MSA) 10 mg/ml con relación al vehículo, y el efecto de P05 10 mg/ml fue estadísticamente significativo con relación a la albúmina sérica murina 10 mg/ml. Como se muestra en la figura 11C, P05 10 mg/ml también se comparó con ciclosporina al 0.05% en una emulsión oftálmica (Restasis®) . Aunque P05 redujo la tinción corneal, no se observó ningún efecto para la emulsión oftálmica de ciclosporina al 0.05% después de -1 semana de dosificación bid.
Ejemplo 9 Se' desarrolló una etapa de captura para la purificación de P05 producida por fermentación en células de E. coli BLR(DE3) . Se definieron las condiciones de elución a través de un enfoque estadístico de diseño experimental (DOE) en una columna de 1 ral. Se realizaron las condiciones optimizadas en una escala intermedia (columna de 10 mL) .
Se extrajo el producto mediante microfluidización en un tampón de lisis que consiste en Tris 20 mM a pH 7.0 con adición de EDTA 10 mM. Se ajustó el lisado aclarado a un pH de 5.3 y a una conductividad de 3 mS/cm. Se cargó el lisado acondicionado ' en un PorosXS (resina de intercambio catiónico fuerte) con un tiempo de permanencia de 2 min para una capacidad de 25-30 mg P05/mL de columna. Se lavó la columna con tampón de equilibrio para extraer las especies no unidas. Se implemento un segundo lavado a pH 6.0 y 3 mS/cm para extraer una población de impurezas. Se eluyó el producto a pH 6.0 y 6.6 mS/cm. Se" eluyó una especie relacionada con el producto a pH 6.0 y 12.4 mS/cm. Se lavó la columna con un tampón de alta salinidad y NaOH.
P05 es una proteína de 17 kDa con un pl de 6.58. El pl de la especie des-ALA es 6.8 y se resuelve fácilmente a través de cromatografía de intercambio catiónico analítica débil. Es probable que esta especie sea un producto de la actividad de la aminopeptidasa P que se encuentra en E . coli. Se puede identificar la especie a través de los métodos de espectroscopia de masas, mapeo peptidico y HPLC.
Materiales cromatográficos . PorosXS se basa en una esfera de poli ( estireno-divinilbenceno) reticulada con un tamaño de partícula nominal de 50 µta. La matriz cromatográfica tiene una química superficial de sulfopropil y fue diseñada para tolerar niveles elevados de sal durante la unión. Se obtuvo el material PorosXS (CN 4404339, Life Technologies) como una suspensión a granel y se colocó en una columna Tricorn de 5x50 mm (CN 28-4064-09, GE Healthcare) con un volumen de columna final de 1 mL (altura del lecho 5 cm) o en una columna de 10x150 mm Tricorn (CN 28-4064-16, GE Healthcare) hasta un volumen final de 10.5 mL (altura del lecho 13.4 cm) .
Tampones . Se prepararon todos los tampones con agua MilliQ en forma volumétrica. Para alcanzar el pH deseado, se añadió HCl 10 N o NaOH 1 M (hecho a partir de una solución madre de NaOH 10 M) para titular el tampón . Después de la preparación, se filtraron todos los tampones a través de filtros de cuello de botella de PES de 0.2 µp?. Se realizaron todas las mediciones de pH y de conductividad a temperatura ambiente (~ 20-25 °C) .
Tampones PorosXS: Tampón de equilibrio de CEX - ácido acético 10 mM (HoAC) con NaCl 21 mM preparado mediante el añadido de 0.57 mL de ácido acético glacial y 2.44 g de NaCl por L de tampón . El pH final era 5.3 y la conductividad final era 3 mS/cm.
Tampón de lavado de CEX - MOPS 100 mM con NaCl 22 mM preparado mediante el añadido de 19.5 g de ácido libre MOPS, 1.5 g de sal sódica MOPS y 1.28 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5.7-6.6 (según lo deseado) y la conductividad final era 3 mS/cm.
Tampón de elución de CEX - MOPS 100 mM con NaCl 118 mM preparado mediante el añadido de 19.5 g de ácido libre MOPS, 1.5 g de sal sódica MOPS y 6.93 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5.7-6.6 (según lo deseado) y la conductividad final era 12.4 mS/cm.
Tampón de tiras de CEX - ácido acético 10 mM con NaCl 3 M preparado mediante el añadido de 0.57 mL de ácido acético glacial y 175 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5.3 y la conductividad final era 188 mS/cm.
Preparación del lisado. Se ajustó el pH del Usado utilizando 200 mM de ácido acético a pH 4.5 preparado mezclando 11.5 mL de ácido acético glacial por L de tampón. Se tituló la solución para un pH final de 4.5 utilizando NaOH 1 M. Esta solución se utilizó para evitar la precipitación localizada debido al pH bajo de ácido fuertes o concentrados.
El material cargado para estos experimentos fue un extracto de una corrida de biorreactor lote alimentado de 2 L. La extracción del producto del sedimento se realizó utilizando Tris 20 mM a pH 7.0 con adición de EDTA 10 mM. El extracto nuevo se diluyó hasta una conductividad de 3 mS/cm con agua MilliQ (típicamente dilución 1:1-1.5). Se congeló el extracto diluido en -20° C en alícuotas de 41 mL . Para preparar la carga, se descongeló una alícuota a temperatura ambiente y se tituló a pH.5.3 utilizando ácido acético 200 mM a pH 4.5. Se realizaron pequeños ajustes en la conductividad mediante la adición de agua MilliQ cuando fue necesario después de la valoración. Finalmente, se diluyó la carga 2.5* hasta una concentración de ~1.7 g/L utilizando tampón de equilibrio de CEX. La carga se filtró en condiciones estériles a través de un filtro de 0.8/0.2 fim. La carga acondicionada se utilizó el mismo día que se preparó.
Determinación de las proteínas de células huésped. Los niveles de proteínas de células huésped (HCP) se determinaron mediante un kit de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) específico para un sistema de expresión de E. coli (CN F410, Cygnus Technologies) . Se siguió exactamente el protocolo proporcionado con el kit. Las muestras que se iban a evaluar para conocer los niveles de HCP se diluyeron utilizando un diluyente de muestra (CN 1028, Cygnus Technologies) con una dilución mínima de 10*. Las muestras se realizaron típicamente en dos diluciones y se colocaron en placas en duplicado para cada dilución. El nivel de HCP se representó en términos de partes por millón (ppm) o ng-HCP/mg-producto .
Análisis SDS-PAGE. Para el análisis de pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), se utilizaron geles BisTris NuPAGE 4-12% ya sea en 10 pocilios de 1 mm o en 15 pocilios de 1 mm (CN NP0322Box y NP0323Box, respectivamente, Invitrogen) . El tampón del proceso era 1* de tampón de proceso MES de SDS preparado a partir de una concentración de 20? (CN NP0002, Invitrogen) . Se utilizaron Sharp Prestained Protein Standards Novex (CN 57318, Invitrogen) como indicadores del peso. Se prepararon las muestras para el análisis mediante dilución con agua MilliQ hasta un volumen final de 30 µ?, y se añadió 10 µ? de 4* Dodecil sulfato de litio (LDS) ( CN NP0008, Invitrogen) hasta una concentración final de 1*. Se mezclaron las muestras por vórtex durante 5 s. Según la concentración de proteina calculada a partir de la medida A280/A320, se cargó una diana de 3 µg por pocilio. wCEX. Se evaluó P05 mediante cromatografía de intercambio catiónico débil (wCEX) utilizando una columna de 4x250 mm de Dionex ProPac® WCX-10 (Número de producto 054993), con una velocidad de flujo de 1.2 mL/min utilizando soluciones de fase móvil de acetato de sodio 10 mM pH 5.5 ( tampón A) y acetato de sodio 10 mM pH 5.5, NaCl 250 mM ( tampón B) . Se realizó un gradiente de 10%B a 25%B durante 20 minutos. La P05 intacta se eluyó aproximadamente de 1.5 a 2.5 minutos antes que la especie con des-Ala en la parte posterior del gradiente.
Cromatografía de captura de intercambio catiónico . Se realizó la cromatografía en un sistema de cromatografía AKTA Explorer 100. Se empaquetó una columna de 10 mL PorosXS . Se cargó el material a 40 mg de P05/ml, o se puede cargar a 25-30 mg de P05/ml. En la tabla 9 se resume el método de cromatografía. El tiempo de permanencia se mantuvo constante durante las etapas de carga y elución en 2 min . Se realizaron mezclas de elución de imitación y se evaluaron en cuanto a la recuperación del producto, para conocer el nivel de HCP y el% de proteína intacta. Se realizaron un total de 2 corridas en la columna de 10 mL con%B de 30% y 35% a pH 6.0.
Tabla 9 El lavado N.° 2 provoca un pico compuesto principalmente de impurezas. Las eluciones N.° 1 con el 30% y el 35% de B provocan el >95% de producto puro mediante análisis SDS-PAGE. La concentración de sal del lavado N.° 2 se puede aumentar en una pequeña cantidad para eliminar el saliente del pico de elución .
Ejemplo 10 Se purificó P04 y se cultivaron cristales de calidad de difracción en PEG1500 al 25%, PCB 0.1 M (pH 4.0) a 20 °C . Se cristalizó la proteina en el grupo del espacio P212121 con dimensiones de la celda unidad típicas de a = 44.5, b = 46.4, c = 64.8. Los cristales difractaron a alta resolución y se recolectó un conjunto de datos que se extiende a 1.47 Á en el Advanced Photon Source, beamline LS-CAT 21ID-F (Chicago IL, EUA) . Se resolvió la estructura de rayos X de P04 por reemplazo molecular utilizando un modelo que incorpora las partes relevantes de las estructuras de IL-?ß e IL-IRa conocidas de 1ITB y 1IRA de las estructuras de PDB (Vigers y col., (1997) Nature 386: 190-194 y Schreuder y col., (1997) Nature 386: 194-200) . El modelo final se refino a un Rwork/Rfree del 17.6%/20.4% y contiene una molécula de P04 (140 residuos) y 98 moléculas de agua (tabla 10) . Los residuos de P04 1-2, 48-49 y 85-93 no fueron visibles en la densidad de los electrones y no están presentes en el modelo final .
Tabla 10 Los números entre paréntesis corresponden al intervalo de resolución más alta ftnerge = ?hkl [?i|li - <I>|/?iIi] Fwork = ?hkl ? Fobs | - | Fcalc D/?hkl|Fobs| en donde Fobs y Fcalc son los factores estructurales calculados y observados Rfree se calculó a partir de un subconjunto de reflexiones (5%) no utilizadas para refinamiento.
La estructura cristalina de P04 tiene un pliegue similar al previsto por el modelado. En la figura 1, se muestra una vista de esta estructura. En la figura 12a, se muestra una superposición de las estructuras. La RMSD para los carbonos de la estructura fue 1.41 Á y 1.09 Á para los segmentos de IL-?ß e IL-IRa contra los mismos residuos en las moléculas madre respectivas. P04 tiene al menos un puente de sal único y dos enlaces de hidrógenos únicos que comprenden una interacción entre un residuo derivado de IL-?ß y un opuesto derivado de IL-IRa: (i) Glu39-Lys64 (Glu39 de IL-IRA; Lys64 de IL-?ß) como se muestra en la figura 12B, (ii) Arg9-Glnl49 (Arg9 de IL-IRA; Glnl49 de IL-?ß) como se muestra en la figura 12C y (iii) Serl52-Lys40 (Serl52 de IL-IRA; Lys50 de IL-?ß) como se muestra en la figura 12C. Estas interacciones únicas pueden explicar el aumento de la estabilidad térmica de P04 porque estas interacciones están ausentes en las estructuras de IL-?ß e IL-IRa. Los residuos implicados en estas interacciones también están presentes en P03 y P05, proteínas que también tienen un aumento de la estabilidad térmica .
Otras realizaciones se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (70)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención como antecede, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una proteína aislada, caracterizada porque comprende un dominio quimérico de citocina de la familia interleucina- 1 (IL-1) en donde al menos el primer segmento del dominio es de 20 aminoácidos de longitud y tiene al menos el 80% de identidad de aminoácidos con un segmento correspondiente de una primera citocina de la familia IL-1, y al menos un segundo segmento del dominio es de al menos 20 aminoácidos de longitud y tienen al menos el 80% de identidad de aminoácidos con un segmento correspondiente de una segunda citocina de la familia IL-1.
2. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la primera y la segunda citocina de la familia IL-1 se seleccionan del grupo que consiste en IL-?ß, IL-la e IL-IRa.
3. La proteína de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la primera citocina de la familia IL-1 es IL-?ß y la segunda citocina de la familia IL-1 es IL-IRa.
4. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteina se une al receptor I de IL1 e inhibe la actividad del receptor I de IL-1.
5. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el primer segmento del dominio de citocina tiene una longitud de al menos 20 o 30 aminoácidos y es idéntico a un segmento correspondiente de IL-?ß.
6. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio de citocina comprende residuos del Sitio A que tienen al menos el 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa y residuos del Sitio B que tienen al menos el 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-lp.
7. La proteina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el dominio de citocina incluye (a) aminoácidos que tiene identidad con IL-IRa en las siguientes posiciones ARG11, SER13, GLN14 , GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33 , GLN3 , ASP35 , MET36, GLN38 , GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 y GLN141 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) y (b) aminoácidos que tiene identidad con IL-?ß en las siguientes posiciones: ALAI, PR02, VAL3 , ARG4 , LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52 , ASN53, LYS55, ILE56, PR057 , LYS92, LYS93, LYS94 , LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) .
8. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio de citocina comprende secuencias que son idénticas a las cadenas beta ß2 , ß3, ß?? y ß?? de IL-IRa y secuencias que son idénticas a las cadenas beta ß4, ß6, ß7 y ß8 de IL-?ß.
9. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque uno o más de los bucles ß1ß2, ß2ß3, ß8ß9, ß??ß?? y ß11ß12 tienen al menos el 90% de identidad con los bucles correspondientes de IL-IRa.
10. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio de citocina comprende al menos dos segmentos discontinuos de una longitud de al menos 20 aminoácidos que tienen al menos el 90% de identidad con los segmentos correspondientes respectivos de IL-?ß.
11. La proteina de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque los dos segmentos discontinuos son idénticos a los segmentos correspondientes respectivos de IL-lp.
12. La proteína de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque los dos segmentos discontinuos son de entre 25 y 40 aminoácidos de longitud.
13. La proteina de conformidad con las reivindicaciones 10, 11 ó 12, caracterizada porque los aminoácidos que no se encuentran en los dos segmentos discontinuos tienen al menos 90% de identidad con IL-IRa.
14. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteina consiste en una única cadena de polipéptidos que es de 150-160 aminoácidos de longitud.
15. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio de citocina tiene identidad con la primera citocina de la familia IL-1 en al menos 50 posiciones y tiene identidad con la segunda citocina de la familia IL-1 en al menos 50 posiciones.
16. La proteina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque al menos los residuos 11-41 y 120-147 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) tienen en forma colectiva al menos el 90% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa.
17. La proteina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos los residuos 1-6, 45-61 y 148-153 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) tienen en forma colectiva al menos 90% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß.
18. La proteina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque al menos los residuos 1-8, 42-120 y 148-153 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) tienen en forma colectiva al menos 90% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß.
19. La proteina de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el dominio de citocina tiene al menos 80% de identidad con P01, P02, P03, P04 o P05.
20. La proteina de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el dominio de citocina tiene al menos 90% de identidad con P01, P02, P03, P04 o P05.
21. La proteina de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el dominio de citocina tiene al menos 95% de identidad con P01, P02, P03, P04 o P05.
22. La proteina de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el dominio de citocina es idéntico a P01, P02 o P03.
23. La proteina de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el dominio de citocina es idéntico a P04.
24. La proteina de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el dominio de citocina es idéntico a P05.
25. La proteína de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio de citocina tiene mayor termoestabilidad que IL-?ß e IL-IRa.
26. La proteína de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio de citocina tiene una Tm al menos 2 grados mayor que IL-?ß e IL-IRa.
27. La proteína de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína tiene una IC50 inferior a 10 ng/ml para la inhibición de IL-?ß (en 0.1 ng/ml) en un ensayo de señalización celular.
28. La proteína de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína se une a IL-1RI con una mayor KD de afinidad, una velocidad de disociación más lenta y/o una velocidad de asociación más rápida que la IL-IRa humana .
29. La proteína de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el dominio de citocina comprende uno o más de los siguientes: (a) Sitio A: i. residuos del Sitio A que tienen al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en un primer dominio de citocina madre; ii. residuos del Sitio A extendido que tienen al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en un primer dominio de citocina madre; iii. segmentos Al y A2 del Sitio A que tienen al menos 80% de identidad con los segmentos correspondientes de un primer dominio de citocina madre; o iv. una región del Sitio A que tiene al menos 80% de identidad con las regiones correspondientes de un primer dominio de citocina madre; (b) Sitio B: i. residuos del Sitio B que tienen al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en un segundo dominio de citocina madre; ii. residuos del Sitio B extendido que tienen al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en un segundo dominio de citocina madre; iii. segmentos Bl, B2 y B3 del Sitio B que tienen al menos 80% de identidad con los segmentos correspondientes de un segundo dominio de citocina madre; o iv. una región del Sitio B que tiene al menos 80% de identidad con las regiones correspondientes de un segundo dominio de citocina madre.
30. Un inhibidor de IL-1 aislado, caracterizado porque comprende un dominio de citocina de la familia IL-1 que se une a IL-IRI y comprende (i) un segmento Cl que tiene al menos 70% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa, y (ii) residuos del Sitio A o Sitio B que tienen al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß, IL-?a o IL-IRa, y en donde el dominio tiene entre el 40% y el 90% de identidad con IL-IRa.
' 31. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el segmento Cl tiene al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa.
32. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el segmento Cl es idéntico a los residuos correspondientes en IL-IRa.
33. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el segmento D2 tiene al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa.
34. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación '30, caracterizado porque los segmentos Al y A2 tienen en forma colectiva al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-IRa.
35. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque los segmentos Bl , B2 y B3 tienen al menos 80% de identidad con los residuos correspondientes en IL-?ß.
36. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque inhibe la señalización por IL-lp.
37. El inhibidor de IL-1 de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque se une a IL-1RI con una afinidad inferior a 1 nM.
38. Una proteina aislada de unión al receptor, caracterizada porque comprende: (a) aminoácidos que tiene identidad con IL-IRa en las siguientes posiciones ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GL 39 , ALA127, GLU128, ASN129, MET130 y GLN141 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) y (b) aminoácidos que tiene identidad con IL-?ß en las siguientes posiciones: ALAI, PR02, VAL3 , ARG , LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PR057, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152 (de acuerdo con la numeración de IL-?ß) .
39. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una quimera de IL-?ß e IL-IRa.
40. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende Gln48-Asn53 de IL-?ß.
1. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque tiene al menos 50% de identidad con una citocina diferente de IL-?ß.
42. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a Alai, Pro2, Val3, Arg4 y Leu6.
43. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende al menos 15 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 45-61 de IL-?ß (SEQ ID NO:l) .
44. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende al menos 8 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 86-95 de IL-?ß (SEQ ID NO:l) .
45. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende al menos 5 residuos que tienen identidad con IL-?ß en las posiciones correspondientes a 148-153 de IL-?ß (SEQ ID NO : 1 ) .
46. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque las posiciones de los aminoácidos correspondientes a los residuos 11-36 y 126-130 (de acuerdo con SEQ ID N0:1) son mayoritariamente idénticas a IL-IRa.
47. La proteina de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque las posiciones de los aminoácidos correspondientes a los residuos 9-41 y 121-140 (de acuerdo con SEQ ID N0:1) son mayoritariamente idénticas a IL-IRa.
48. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 47.
49. Una composición farmacéutica tópica, caracterizada porque comprende una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 47.
50. Una composición farmacéutica oftálmica, caracterizada porque comprende una proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 47.
51. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque es acuosa y comprende la proteína en una concentración de entre el 0.001 y el 5%.
52. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 48 en un sujeto para modular una respuesta inmune o inflamatoria en un sujeto.
53. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 48 en el tratamiento de un sujeto que sufre o corre riesgo de trastorno sistémico autoinmune.
54. ?1 uso de una composición de conformidad con la reivindicación 48 en el tratamiento de un sujeto que sufre o corre riesgo de artritis reumatoide.
55. El uso de una composición de conformidad con la reivindicación 48 en el tratamiento de un sujeto que sufre o corre riesgo de enfermedad del ojo seco o conjuntivitis alérgica .
56. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica la proteina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 47.
57. Un vector de ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia que codifica la proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 47, en donde la secuencia está unida funcionalmente a una secuencia de control de transcripción.
58. Una célula hospedera recombinante, caracterizada porque comprende un ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 47.
59. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque es una célula hospedera E. coli.
60. Un método para preparar una proteína recombinante , el método caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 58 en condiciones que permiten la expresión de la proteína recombinante; purificar la proteína recombinante de un lisado de células o medio celular; y formular la proteína recombinante para la administración a un sujeto.
61. Una proteína aislada, caracterizada porque comprende un dominio quimérico de citocina de la familia IL-1 que comprende al menos dos segmentos discontinuos de una longitud de al menos seis aminoácidos y que tiene al menos 80% de identidad con los segmentos correspondientes de una primera citocina de la familia IL-1 y que comprende aminoácidos mayoritariamente de una segunda citocina de la familia IL-1 en las posiciones restantes.
62. La proteína de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque los segmentos discontinuos, comprenden los residuos 1-6 y 45-61, 1-6 y 86-95, 45-61 y 86-95, 1-6 y 148-153, 45-61 y 148-153 u 86-95 y 148-153, de acuerdo con la numeración de dichas posiciones en IL-?ß.
63. La proteína de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteina comprende tres segmentos discontinuos que tienen aminoácidos idénticos a los de los segmentos correspondientes en la primera citocina de la familia IL-1 y esos segmentos incluyen los residuos 1-8, 42-120 y 141-153.
64. La proteina de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteina comprende cuatro segmentos discontinuos que tienen aminoácidos idénticos a los de los segmentos correspondientes en la primera citocina de la familia IL-1 y esos segmentos incluyen los residuos 1-6, 45-61, 86-95 y 148-153.
65. La proteina de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteina comprende tres segmentos discontinuos que tienen aminoácidos idénticos a los de los segmentos correspondientes en la primera citocina de la familia IL-1 y esos segmentos incluyen los residuos 1-10, 37-125 y 131-153.
66. La proteina de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteina tiene identidad con la segunda citocina de la familia IL-1 en las posiciones restantes .
67. La proteina de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque uno o más de los bordes de los segmentos discontinuos están ubicados en posiciones en donde la primera citocina y la segunda citocina de la familia IL-1 tienen los mismos aminoácidos.
68. La proteina de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteína tiene identidad con la primera citocina de la familia IL-1 en al menos 50 posiciones y tienen identidad con la segunda citocina de la familia IL-1 en al menos 50 posiciones.
69. La proteína de conformidad con la reivindicación .61 , caracterizada porque la primera y la segunda citocina de la familia IL-1 se seleccionan del grupo que consiste en IL-?ß, IL-?a e IL-IRa.
70. La proteína de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque la primera citocina de la familia IL-1 es IL-?ß y la segunda citocina de la familia IL-1 es IL-IRa.
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