CN111686241B - Il-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种IL‑38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的新用途，并且更具体地，涉及在治疗干眼病、新生血管形成和/或其他与炎症有关的眼科疾病中的用途。本发明公开了以IL‑38蛋白和/或IL‑38蛋白融合IgG Fc片段形式、融合人血清白蛋白形式等为活性成分的药物对眼科疾病的治疗作用。体内外实验的结果表明，使用以IL‑38蛋白为活性成分的药物对眼科类疾病进行治疗，治疗效果好，治疗简便，为眼科疾病的治疗提供了新的选择。

Description

IL-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，尤其涉及到IL-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的应用。
背景技术
白介素(IL)-38(又称为IL-1F10和IL-1HY2)是2001年发现的IL-1超家族的第10个成员，是IL-1超家族中的抑制炎症因子之一。其基因位于2号染色体2q13-14.1，邻近编码IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)和IL-36受体拮抗剂(IL-36Ra)的基因，含有5个外显子，跨越7.8kb的基因组DNA。人IL-38蛋白由152个氨基酸残基组成，分子量约为17～18KDa，缺少信号肽、N和O糖基化位点以及caspase-1切割位点，与IL-1Ra和IL-36Ra的同源性大约为41％和43％。
IL-38蛋白在皮肤中的上皮细胞、扁桃体中增殖B细胞和凋亡细胞等中均有表达，可与炎症因子IL-36受体IL-36R(又称为IL1R6，IL1Rrp2)、炎症因子IL-1受体IL-1RI以及IL-1受体相关蛋白样1前体蛋白(IL-1RAPL1，IL-1R8)结合。IL-38与IL-1R和IL-36R结合，抑制IL-1和IL-36介导的NF-kB和AP-1信号通路，起到抗炎症作用；与IL-RAPL1结合，通过选择性的抑制JNK信号通路的激活，起到抑制免疫的作用。IL-38蛋白主要生物功能有可抑制活化的PBMC细胞表达IL-8、IL-17和IL-22，抑制活化的巨噬细胞表达IL-6、IL-8和IL-23，抑制细菌脂多糖LPS激活的DC细胞分泌IL-6，促进THP-1细胞分泌IL-6、IL-23和TNFα，促进T细胞分泌IL-10，抑制T细胞向Th17细胞的转化和抑制视网膜内皮细胞的增殖等。
干眼病是常见的眼科疾病，根据2017年TFOS DEWS II对干眼病的定义是：眼表的一种多因子疾病，特征是泪膜稳态的丧失并伴有眼表症状，其病因包括泪膜不稳定、泪液高渗性、眼表炎症与损伤和神经感觉异常。干眼发病初期有包括眼睛刺激和红肿、视力模糊及眼睛有砂砾或异物感的症状，如果不予以治疗，则可能会引起角膜疼痛、溃疡与伤痕、视功能障碍，甚至失明。但对干眼病的治疗尚无有效药物的出现。目前普遍认为炎症是造成干眼病的机制之一，国际干眼新共识中指出IL-1受体拮抗剂可抗炎治疗干眼病。
有文献报导通过敲除小鼠IL-1RI基因或者阻断IL-1和IL-1R1的结合，可以降低疾病信号和角膜的损伤等干眼病症状。还有文献报导，炎症因子IL-36a和IL-38在原发性干燥综合征症组织和分泌腺中均表达上调，与未患有原发性干燥综合征症者存在显著地差异，推测出IL-36α和IL-38可能与原发性干燥综合征有关。此外有文献研究了HLA-B27阳性的急性前葡萄膜炎(AAU)患者与对照组相比，前房水中炎症因子IL-1β、IL-Ra、IL-18和IL-36Ra显著性升高，推测出IL-1和IL-36均与眼科中炎症有关。IL-38可阻断IL-1和IL-36与其受体结合，抑制炎症反应，因此为治疗干眼病和其他炎症相关的眼科疾病提供了可能。
大量灾难性视力减退的眼科疾病均与眼部新血管的形成有关。根据发病部位不同，眼部新生血管主要分为角膜新生血管、虹膜新生血管、脉络膜新生血管及视网膜新生血管，其发病机理与新生血管的过度形成相关。此外，其他炎症导致的眼科疾病与血管新生是两个相互联系，共同发展的病理过程。新生血管的形成是引起这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤，因此抑制内皮细胞增殖、迁移、成管性和新生血管的生成，可以有效治疗新生血管相关性眼科疾病。IL-38可以抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管性，为新生血管形成有关的疾病提供了理论依据。
目前，针对此三类原因导致的眼科疾病的治疗多为超适应症用药，风险较大，出现了诸多不良反应，且市场上尚无药物可有效治疗此三类原因导致的眼科疾病。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种IL-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的新用途，解决了国内干眼病症状和体征的治疗药物的空白，以及治疗新生血管相关眼科药物严重不足的问题。此外本药物可用原核细胞表达生产，结合了生物制品的安全性和化学药品的低成本的特点，为该类疾病的治疗提供了安全、有效、低价、使用方便和起效快的药物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案施行：
本发明提供了一种IL-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的应用；
进一步地，所述IL-38蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；编码SEQID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；
进一步地，所述IL-38蛋白是重组人IL-38蛋白(rhIL-38蛋白)或rhIL-38蛋白突变体形式；
进一步地，所述rhIL-38蛋白突变体形式包括rhIL-38蛋白融合IgG Fc片段的形式、rhIL-38蛋白融合单域抗体的形式、rhIL-38蛋白融合人血清白蛋白的形式、rhIL-38蛋白融合聚乙二醇的形式或rhIL-38蛋白融合人转铁蛋白的形式；
进一步地，所述rhIL-38蛋白突变体形式包括rhIL-38蛋白未去除二硫键的形式、rhIL-38蛋白去除全部或部分二硫键的形式、rhIL-38蛋白经修饰的形式、rhIL-38蛋白截短的形式或rhIL-38蛋白经翻译后的修饰形式；
进一步地，所述IL-38蛋白的制备方法包括以下步骤：
1)设计得到IL-38蛋白的核苷酸序列；
2)构建核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转入宿主细胞；
3)培养宿主细胞，使其表达IL-38蛋白；
4)分离纯化IL-38蛋白；
进一步地，所述步骤2)中的表达系统选自原核表达系统或真核表达系统；
进一步地，所述原核表达系统为大肠杆菌表达系统，所述真核表达系统为酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫表达系统；
进一步地，所述步骤4)中纯化的方法为采用镍柱和HiTrapTM 1mL HP苯基柱2步亲和纯化获得IL-38蛋白；
进一步地，所述步骤4)中也可以采用常规的纯化方法对目的蛋白进行纯化；
进一步地，以上所述药物的剂型可以为滴眼剂、注射剂、凝胶剂或软膏剂；
进一步地，以上所述药物可以包含惰性、无毒、药理学合适的赋形剂；
进一步地，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色剂或香料；
进一步地，以上所述药物的剂型优选为滴眼剂、注射剂、凝胶剂和软膏剂；优选地，采用滴眼剂用于眼表疾病和采用注射剂用于眼部深层疾病；进一步地，所述滴眼剂处方也在本发明的范围之内，制剂处方中缓冲剂优选为pH在5.5～8.5范围内合适的缓冲剂，如硼酸、硼酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris和多种混合磷酸盐缓冲剂(包括Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4的组合)及其混合物；进一步优选地，pH在6.5～8.0范围内硼酸盐缓冲液；制剂处方中张力增强剂优选为渗透压225至400mOsm/kg的离子张力增强剂如碱金属或碱土金属卤化物，例如CaCl2、KBr、KCl、LiCl、NaI、NaBr或NaCl，Na2SO4或硼酸，而渗透压为225至400mOsm/kg非离子张力增强剂如尿素、甘油、山梨醇、甘露糖醇、丙二醇或右旋糖；优选地，0.9％±0.1％的氯化钠溶液或2.5％±0.3％的甘油溶液；在一些实施方案中，制剂处方是含有1％吐温80和2％甘油的pH 7.2的磷酸盐缓冲液、含有2.5％甘油的pH 7.4的硼酸盐、有5％w/v山梨糖醇和0.1％w/v泊洛沙姆；
进一步地，所述眼科疾病包括干眼病，所述干眼病的症状包括干涩感、异物感、烧灼感、痒感、畏光、眼红、视物模糊或视力波动；
进一步地，所述干眼病的描述包括干燥综合征、干眼、干眼症、水液缺乏型干眼、蒸发型干眼、干燥型角结膜炎、干燥性结膜炎、结膜干燥症、干眼紊乱、干燥性角膜炎、睑板腺功能障碍、泪腺紊乱、水性泪液缺乏或与移植物抗宿主相关干眼和眼干燥；
进一步地，所述眼科疾病包括内皮细胞增殖和/或新生血管形成相关的眼科疾病，所述内皮细胞增殖和/或新生血管相关的眼科疾病包括脉络膜新生血管生成、息肉样脉络膜血管病变、老年性黄斑病变、糖尿病性黄斑水肿、氧气诱导视网膜病变、丝状角膜病变、视网膜静脉阻塞继发的黄斑水肿、病理性近视继发脉络膜新生血管、新生血管性青光眼、老年性玻璃膜疣、虹膜新生血管性疾病、早熟性视网膜病或视网膜母细胞瘤；
进一步地，所述眼科疾病还包括其他炎症引起的眼科疾病，所述其他炎症引起的眼科疾病包括翼状胬肉、角膜炎、结膜炎、泪囊炎、泪腺炎、睑缘炎、视网膜血管炎、巩膜炎、眼眶骨膜炎、眼色素层炎或葡萄膜炎；
进一步地，所述药物的给药途径，包括眼表给药、结膜囊给药、眼睑给药、结膜下给药、眼前房内给药、玻璃体内给药、眼球下给药、视网膜下给药、脉络膜下给药、脉络膜上给药或者通过设计成递送眼科药物的药物传递装置施用；优选为结膜囊给药和玻璃体注射给药；
进一步地，滴眼剂给药方式优选为0.01～50000μg/mL剂量，每只眼睛3～100μL，给药频率是1～8次/日，给药周期7～28天；优选地，0.01～50000μg/mL剂量，每只眼睛50～100μL，给药频率是1～8次/日，给药周期7～28天；1～5000μg/mL剂量，每只眼睛50～100μL，给药频率是2或者4次/日，给药周期14～28天；进一步优选地，10～1000μg/mL剂量，每只眼睛50～100μL，给药频率是2～4次/日，给药周期21天；在一些实施方案中，给药途径是眼结膜囊给药，给药剂量是200μg/mL，给药频率是4次/日，给药周期21天。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种IL-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的新用途，不仅解决了现有技术中尚无有效药物或现有药物不能满足眼科疾病临床治疗需求的问题，而且为眼科疾病的安全、有效、低成本、易给药和起效快治疗方案提供了新的选择。
附图说明
图1为实施例1中rhIL-38蛋白的SDS-PAGE表达结果图，a、b分别为rhIL-38蛋白和HSA-rhIL-38融合蛋白的实验结果图，a图中“1”为蛋白分子量标记，“2”为纯化前的样品，“3”为纯化后的样品；b图中“1”为HSA-rhIL-38培养上清，“2”为HSA-rhIL-38未与镍柱结合的蛋白，“3”为HSA-rhIL-38与镍柱结合的还原后蛋白，“4”为HSA-rhIL-38未与镍柱结合的非还原蛋白，“5”为rhIL-38-HSA未与镍柱结合的蛋白，“6”为rhIL-38-HSA与镍柱结合的还原后蛋白，“7”为rhIL-38-HSA未与镍柱结合的非还原蛋白，“M”为蛋白分子量标记。
图2为实施例2中不同形式IL-38蛋白与IL-36R蛋白结合的实验结果图，a、b、c为不同浓度的rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白、rhIL-38-IgG Fc融合蛋白分别与IL-36R结合的实验结果图。
图3为实施例3中不同形式IL-38蛋白与IL-1RI蛋白结合的实验结果图，a、b、c为不同浓度的rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白、rhIL-38-IgG Fc融合蛋白分别与IL-1RI结合的实验结果图。
图4为实施例4中rhIL-38蛋白对IL-36R蛋白与IL-36a蛋白结合的抑制作用的实验结果图，其中a为OD450nm的结果，b为抑制百分数的结果。阴性对照是未添加IL-36R-Fc样品，空白对照是仅含有PBS的样品。
图5为实施例4中rhIL-38蛋白对IL-36R蛋白与IL-36Ra蛋白结合的抑制作用的实验结果图，其中图a是描述随着IL-36Ra浓度的改变，与IL-36R捕获rhIL-38的曲线，b是选取4个浓度的IL-36Ra，抑制rhIL-38和IL-36R结合的抑制百分率。
图6为实施例5中rhIL-38蛋白对HUVEC细胞增殖的抑制作用的实验结果图，其中a图为不同浓度rhIL-38蛋白分别抑制HUVEC细胞的实验结果图，b图为抑制百分比。
图7为实施例6中rhIL-38-IgG Fc融合蛋白治疗干眼病动物的试验结果图，a、b、c分别是在抑制血管增生、促进泪液分泌和抑制结膜炎症的效果。其中“RB0022”是rhIL-38-IgG Fc融合蛋白给药组、“Control Group”是没有干眼病的空白对照组、“Module Group”是仅给于溶媒的干眼病模型组、“CsA Group”是环孢素对照组。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本领域的技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技术常识，本申请公开的核苷酸序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的核苷酸序列构建到任何合适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步地说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
实施例1不同形式的IL-38蛋白的制备
本实施例代表性地列举了rhIL-38蛋白及其融合人血清白蛋白形式的制备，而且还列举了大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母表达系统表达目的蛋白的方法以及纯化方法。利用相同或者相似的方法和步骤可以对其他rhIL-38蛋白融合蛋白，例如rhIL-38蛋白融合IgG Fc片段的形式(rhIL-38-IgG Fc融合蛋白)、融合单域抗体的形式、人转铁蛋白(transferrin)或者其他可延长半衰期成分-rhIL-38蛋白融合蛋白进行制备。利用相同或者相似的方法和步骤可以对其他的表达系统进行表达目的蛋白，例如哺乳细胞表达系统、昆虫表达系统等。
(1)rhIL-38蛋白的制备
原核表达载体的构建：由外包公司合成需要的含rhIL-38蛋白基因片段(编码IL-38蛋白的核苷酸序列，其中IL-38蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ NO ID：1所示，编码SEQNO ID：1所示氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中SEQ NO ID：2所示)，将合成的rhIL-38重组蛋白基因片段连入pET-24a表达载体，将该重组质粒转化BL-21感受态菌株(Bio-Rad)。
目的蛋白的表达和纯化：将转化后的BL-21阳性克隆菌株进行培养，并用0.5mMIPTG诱导表达，将离心收集的菌体，进行匀浆破壁后，收集离心上清，并采用镍柱和HiTrapTM1mL HP苯基柱2步亲和纯化获得rhIL-38蛋白。镍柱纯化过程具体为：1)样品处理，用0.22μm滤膜过滤菌液上清；2)15～30mL的PBS缓冲液平衡镍柱(实验室填装)，流速2mL/min；3)蛋白样品上样处理，总体积为100mL，流速为2mL/min；4)PBS+5％洗脱缓冲液(300mM咪唑)洗柱，体积15～30mL；5)洗脱缓冲液洗脱，并收集洗脱峰。HiTrapTM 1mL HP苯基柱纯化过程具体为：1)样品处理，将咪唑洗脱的蛋白样品按1∶9体积与平衡缓冲液(PBS+1.7M(NH4)2SO4)混匀，0.22μm滤膜过滤；2)15～30mL平衡缓冲液平衡HiTrapTM 1mL HP苯基柱；3)蛋白样品上样处理，体积20mL，流速1mL/min；4)0～100％的PBS线性洗脱HiTrapTM 1mL HP苯基柱，流速1mL/min，体积20mL，收集洗脱峰；5)20％乙醇保存HiTrapTM 1mL HP苯基柱。
实验结果：取纯化蛋白，紫外法测定蛋白浓度，并采用SDS-PAGE和SEC-HPLC方法进行鉴定和纯度检测。紫外分光法测定rhIL-38蛋白的浓度为2.30mg/mL。纯化前后的样品的SDS-PAGE检测结果如图1a所示，其中“1”为蛋白分子量标记，“2”为纯化前的样品，“3”为纯化后的样品。SDS-PAGE结果显示rhIL-38蛋白的分子量约20KDa，与理论值一致。SEC-HPLC检测结果显示rhIL-38蛋白的纯度在90％以上，纯度较高。
(2)rhIL-38-人血清白蛋白融合蛋白的制备
真核表达载体的构建：由外包公司合成连接了人血清白蛋白的rhIL-38蛋白(N端连接HSA的融合蛋白(HSA-rhIL-38)和C端连接HSA的融合蛋白(rhIL-38-HSA)基因片段(编码融合蛋白的核苷酸序列)，合成编码融合蛋白的基因片段并连入pRIC9K表达载体，将该重组质粒电转到毕赤酵母SMD1168感受态。
目的蛋白的诱导表达：将转化后阳性克隆酵母菌株，选用YPD培养基并以甘油为碳源，在pH 5.0、30℃和大于20％溶氧的条件下扩种培养，扩大培养后接种于含有TPM1的BSM发酵培养基中发酵，待OD600达到100时，添加BMMY和1％甲醇进行诱导表达目的融合蛋白。诱导表达72h后，离心后去培养上清，采用镍柱和HiTrapTM 1mL HP苯基柱2步亲和纯化获得目的融合蛋白。镍柱纯化过程具体为：1)样品处理，用0.22μm滤膜过滤菌液上清；2)15～30mL的PBS缓冲液平衡镍柱(实验室填装)，流速2mL/min；3)蛋白样品上样处理，总体积为100mL，流速为2mL/min；4)PBS+5％洗脱缓冲液(300mM咪唑)洗柱，体积15～30mL；5)洗脱缓冲液洗脱，并收集洗脱峰。HiTrapTM 1mL HP苯基柱纯化过程具体为：1)样品处理，将咪唑洗脱的蛋白样品按1∶9体积与平衡缓冲液(PBS+1.7M(NH4)2SO4)混匀，0.22μm滤膜过滤；2)15～30mL平衡缓冲液平衡HiTrapTM 1mL HP苯基柱；3)蛋白样品上样处理，体积20mL，流速1mL/min；4)0～100％的PBS线性洗脱HiTrapTM 1mL HP苯基柱，流速1mL/min，体积20mL，收集洗脱峰；5)20％乙醇保存HiTrapTM 1mL HP苯基柱。
实验结果：取纯化蛋白，紫外法测定蛋白浓度，并采用SDS-PAGE和SEC-HPLC方法检测融合蛋白的纯度。紫外分光法测定HSA-rhIL-38和rhIL-38-HSA融合蛋白的浓度分别为0.88和0.47mg/mL。纯化前后的SDS-PAGE检测结果如图1b所示，其中“1”为HSA-rhIL-38培养上清，“2”为HSA-rhIL-38未与镍柱结合的蛋白，“3”为HSA-rhIL-38与镍柱结合的还原后蛋白，“4”为HSA-rhIL-38未与镍柱结合的非还原蛋白，“5”为rhIL-38-HSA未与镍柱结合的蛋白，“6”为rhIL-38-HSA与镍柱结合的还原后蛋白，“7”为rhIL-38-HSA未与镍柱结合的非还原蛋白，“M”为蛋白分子量标记。SDS-PAGE结果显示HSA-rhIL-38和rhIL-38-HSA融合蛋白的分子量约85KDa，与理论值一致。SEC-HPLC检测结果显示HSA-rhIL-38和rhIL-38-HSA的纯度分别为45％和41％。
本实施例还采用同样的方法制备了rhIL-38-IgG Fc融合蛋白，具体制备步骤同rhIL-38-HSA融合蛋白，本领域技术人员可以在上述制备方法的教导下制备得到rhIL-38-IgG Fc融合蛋白，这里就不再赘述。
实施例2：ELISA法检测不同形式的IL-38蛋白与IL-36R的结合
本实施例将检测rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白和rhIL-38-IgG Fc融合蛋白与IL-36R蛋白的结合能力，并检测EC50。
实验步骤
1)将100μL含有0.5μg/mL的IL-36R蛋白的碳酸盐包被液加到微孔板中，4℃包被过夜；
2)拍掉孔内液体，每孔加300μL的洗液(0.1％PBST)洗板3次，每次洗板浸泡2min并轻摇板子，甩掉板内液体，吸水纸上拍3次，最后一次洗板结束，吸水纸上拍干；
3)每孔加300μL封闭液(含1％BSA的PBS)进行封板。封板膜封板，37℃封闭1h；
4)重复步骤2)；
5)标准曲线溶液加入封闭过的微孔板中，100μL/孔，封板膜封板，37℃封板1h。其中rhIL-38蛋白和rhIL-38-HSA融合蛋白的标准曲线的浓度点是50000、16667、5556、1852、617、206和69ng/mL；rhIL-38-IgG Fc融合蛋白的标准曲线的浓度点是200000、66667、22222、7407、2469、823、274、91、30、10和3ng/mL；
6)重复步骤2)；
7)加8000倍稀释的IL-38多克隆抗体，每孔加100μL的检测抗体溶液。封板膜封板，37℃封闭1h；
8)重复步骤2)；
9)加入10000倍稀释的羊抗兔HRP，每孔加100μL的检测抗体溶液。封板膜封板，37℃封闭1h；
10)重复步骤2)；
11)加入TMB底物溶液100μL/孔。室温避光孵育大约10min；
12)加入终止液100μL/孔，终止反应，30min内在酶标仪上测定450nm处的OD值。
实验结果
试验结果如图2所示，a、b、c为不同浓度rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白、rhIL-38-IgG Fc融合蛋白分别与IL-36R结合的实验结果图，实验结果显示：rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白、rhIL-38-IgG Fc融合蛋白都能与IL-36R蛋白结合，不同形式的IL-38蛋白与IL-36R蛋白的EC50如表1所示。
表1不同形式IL-38蛋白与IL-36R蛋白结合的EC50
实施例3：ELISA法检测不同形式的IL-38蛋白与IL-1RI的结合
本实施例将rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白和rhIL-38-IgG Fc融合蛋白与IL-1RI蛋白进行结合实验，并检测其EC50。
实验步骤
1)将100μL含有10μg/mL的IL-1RI蛋白的碳酸盐包被液加到微孔板中，4℃包被过夜；
2)拍掉孔内液体，每孔加300μL的洗液(0.1％PBST)洗板3次，每次洗板浸泡2min并轻摇板子，甩掉板内液体，吸水纸上拍3次，最后一次洗板结束，吸水纸上拍干；
3)每孔加300μL封闭液(含1％BSA的PBS)进行封板。封板膜封板，37℃封闭1h；
4)重复步骤2)。
5)标准曲线溶液加入封闭过的微孔板中，100μL/孔，封板膜封板，37℃封板1h。其中rhIL-38蛋白的标准曲线的浓度点为是50000、30000、20000、10000、5000、2500、1250、625、313、156、78、39、20、10和5ng/mL；HSA-rhIL-38融合蛋白和rhIL-38-IgG Fc融合蛋白的标准曲线的浓度点是200000、66667、22222、7407、2469、823、274、91、30、10和3ng/mL。
6)重复步骤2)。
7)每孔加100μL 8000倍稀释的IL-38多克隆抗体溶液。封板膜封板，37℃封闭1h；
8)重复步骤2)；
9)每孔加100μL 10000倍稀释的羊抗兔HRP溶液。封板膜封板，37℃封闭1h；
10)重复步骤2)；
11)加入TMB底物溶液100μL/孔。室温避光孵育大约10min；
12)加入终止液100μL/孔，终止反应，30min内在酶标仪上测定450nm处的OD值。
实验结果
试验结果如图3所示，a、b、c为rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白和rhIL-38-IgGFc融合蛋白分别与IL-1RI蛋白结合的实验结果图，实验结果显示：rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白和rhIL-38-IgG Fc融合蛋白都能与IL-1RI蛋白结合，并且与IL-1RI蛋白结合的EC50如表2所示。
表2不同形式IL-38蛋白与IL-1RI蛋白结合的EC50
实施例4：ELISA法检测rhIL-38蛋白对IL-36R蛋白与IL-36a或IL-36Ra结合的抑制作用
(1)抑制IL-36a与IL-36R的结合
1)将100μL含有0.2μg/mL的IL-36a蛋白的碳酸盐包被液加到微孔板中，4℃包被过夜；
2)洗掉孔内液体，每孔加300μL的洗液(0.1％PBST)洗板3次，每次洗板浸泡2min并轻摇板子，甩掉板内液体，吸水纸上拍3次，最后一次洗板结束，吸水纸上拍干；
3)每孔加300μL封闭液(含5％BSA的PBS)进行封板。封板膜封板，37℃封闭1h；
4)重复步骤2)。
5)系列稀释的rhIL-38蛋白与10μg/mL浓度的IL-36R-Fc的混合溶液加入封闭过的微孔板中，50μL/孔，封板膜封板，37℃封板1.5h。其中rhIL-38蛋白的浓度点是100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0μg/mL。
6)重复步骤2)。
7)加入2000倍稀释的羊抗兔HRP，每孔加100μL的检测抗体溶液。封板膜封板，37℃封闭1.5h；
10)重复步骤2)；
11)加入TMB底物溶液100μL/孔。室温避光孵育大约10min
12)加入终止液100μL/孔，终止反应，30min内在酶标仪上测定450nm处的OD值。
实验结果如图4a、4b所示，a为OD450nm的结果，b为抑制百分数的结果，其中阴性对照是未添加IL-36R-Fc样品，空白对照是仅含有PBS的样品。试验结果显示：rhIL-38蛋白可抑制IL-36a与IL-36R的结合。
(2)抑制IL-36Ra与IL-36R的结合
实验步骤
1)将100μL含有0.5μg/mL的IL-1RI蛋白的碳酸盐包被液加到微孔板中，4℃包被过夜；
2)洗掉孔内液体，每孔加300μL的洗液(0.1％PBST)洗板3次，每次洗板浸泡2min并轻摇板子，甩掉板内液体，吸水纸上拍3次，最后一次洗板结束，吸水纸上拍干；
3)每孔加300μL封闭液(含1％BSA的PBS)进行封板。封板膜封板，37℃封闭1h；
4)重复步骤2)。
5)将5μg/mL rhIL-38蛋白与系列稀释的IL-36Ra蛋白的混合溶液加入封闭过的微孔板中，100μL/孔，封板膜封板，37℃封板1h。其中IL-36Ra蛋白的标准浓度点是50000、16667、5556、1852、617、206、69、23和0ng/mL。
6)重复步骤2)。
7)加入8000倍稀释的IL-38兔多抗，每孔加100μL的检测抗体溶液。封板膜封板，37℃封闭1h；
10)重复步骤2)；
11)加入10000倍稀释的羊抗兔HRP，每孔加100μL的检测抗体溶液。封板膜封板，37℃封闭1h；
12)重复步骤2)；
13)加入TMB底物溶液100μL/孔。室温避光孵育大约10min；
14)加入终止液100μL/孔，终止反应，30min内在酶标仪上测定450nm处的OD值。
实验结果
试验结果如图5a、5b所示，其中a是描述随着IL-36Ra浓度的改变，与IL-36R捕获rhIL-38的曲线，b是选取4个浓度的IL-36Ra，抑制rhIL-38和IL-36R结合的抑制百分率。试验结果显示IL-36Ra可抑制rhIL-38与IL-36R的结合，进而推测出rhIL-38可抑制IL-36Ra与IL-36R的结合。
实施例5：rhIL-38蛋白抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC的增殖实验
实验方法
采用细胞生长刺激剂VEGF刺激HUVEC细胞的方法检测rhIL-38蛋白对内皮细胞增殖的抑制作用。详细的试验步骤是：培养HUVEC细胞，每天观察，3天传次代；2.5％胰酶消化细胞，新鲜培养基重悬细胞成单细胞悬液，计数。按2000cell/well铺96孔板，37℃，5％CO2，培养箱培养。分别用新鲜培养基配制60ng/mL VEGF165的溶液，以及浓度为2μM、200nM、20nM、2nM、200pM、20pM和2pM的rhIL-38蛋白溶液作为测试蛋白，等体积混合后，室温孵育过夜；换液后，继续培养72h，加入Cell Titer-GloTM(CTG)试剂(培养基∶CTG＝2∶1)，37℃反应15min后测光度值。
实验结果如图6所示，其中a图为不同浓度rhIL-38蛋白分别抑制HUVEC细胞的实验结果图，b图为抑制百分比。结果表明rhIL-38蛋白能有效抑制HUVEC细胞的增殖，且IC50为0.19nM。
本实施例还采用类似的方法检测了HSA-rhIL-38融合蛋白、rhIL-38-IgG Fc融合蛋白等其他形式的IL-38蛋白抑制人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖的情况，结果表明HSA-rhIL-38融合蛋白、rhIL-38-IgG Fc融合蛋白及其他形式的IL-38蛋白均能有效抑制HUVEC细胞的增殖。
实施例6：rhIL-38-IgG Fc蛋白治疗碱烧伤新西兰兔造模干眼病
本实施例将以干眼病市场主流药物环孢素(CsA)作为对照，在抑制角膜内皮细胞增值、泪液分泌和炎症方面评估rhIL-38的突变体形式rhIL-38-IgG Fc融合蛋白对干眼病的治疗作用。
实验材料：新西兰大白兔，3-5个月，雌性22只；动物分为4个组：空白对照组、溶媒模型组、环孢素对照组和给药组(药物制剂是67.5μg/mL rhIL-38-IgG Fc，1％吐温80，2％甘油的磷酸盐缓冲剂)；
实验步骤
造模：NaOH诱导，对照组使用生理盐水(3只)；造模后当天随机分组，每组3只；造模后第二天开始给药，双眼结膜囊滴眼给药，50μL/eye，每日4次，给药间隔不小于2h，连续21天；给药前、给药后每周2次观察小鼠的体重变化情况。
检测：谢尔默泪液试验(试纸)检测泪液分泌情况，其采样为造模后第1、7、天；结膜评分评估结膜炎症情况，其采样为造模后第1、3、7、11、14、21天；角膜内血管增生情况，其采样点为造模后第1、3、7、11、14天。
实验结果
如图7所示，rhIL-38-IgG Fc融合蛋白对新西兰兔干眼病模型有缓解和治疗作用，a、b、c分别为rhIL-38-IgG Fc融合蛋白抑制角膜内皮细胞血管增值、促进泪液分泌和结膜炎症评分的结果，分数越低代表效果越好；其中“RB0022”是rhIL-38-IgG Fc融合蛋白给药组、“Control Group”是没有干眼病的空白对照组、“Module Group”是仅给于溶媒的干眼病模型组、“CsA Group”是环孢素对照组。
环孢素是目前常用来治疗眼科疾病的药物，本实验通过对比发现，rhIL-38-IgGFc融合蛋白蛋白在抑制角膜内皮细胞血管增殖和抑制结膜炎症方面明显优于环孢素，在促进泪液分泌方面rhIL-38-IgG Fc融合蛋白也显示出一定的作用。
本实施例还采用类似的方法检测了rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白及其他形式IL-38蛋白对碱烧伤新西兰兔造模干眼病的治疗作用，实验结果表明，rhIL-38蛋白、HSA-rhIL-38融合蛋白和rhIL-38-IgG Fc融合蛋白及其他形式IL-38蛋白均能有效缓解碱烧伤新西兰兔造模干眼病，且优于现有药物环孢素。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，在本发明权利要求所述范围类的技术效果与本发明实施例所述技术效果等效，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 瑞阳（苏州）生物科技有限公司
<120> IL-38蛋白在制备治疗眼科疾病的药物中的应用
<130> 20190227
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 154
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Cys Ser Leu Pro Met Ala Arg Tyr Tyr Ile Ile Lys Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Gln Lys Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Gln Leu Leu Val Gly Asp Pro
20 25 30
Val Ala Asp Asn Cys Cys Ala Glu Lys Ile Cys Thr Leu Pro Asn Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Arg Thr Lys Val Pro Ile Phe Leu Gly Ile Gln Gly Gly
50 55 60
Ser Arg Cys Leu Ala Cys Val Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ser Leu Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asp Val Asn Ile Glu Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Glu Glu Ala
85 90 95
Thr Arg Phe Thr Phe Phe Gln Ser Ser Ser Gly Ser Ala Phe Arg Leu
100 105 110
Glu Ala Ala Ala Trp Pro Gly Trp Phe Leu Cys Gly Pro Ala Glu Pro
115 120 125
Gln Gln Pro Val Gln Leu Thr Lys Glu Ser Glu Pro Ser Ala Arg Thr
130 135 140
Lys Phe Tyr Phe Glu Gln Ser Trp Leu Glu
145 150
<210> 2
<211> 486
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
catatgtgca gcctgccgat ggcccgctac tacatcatta agtacgccga ccagaaagcc 60
ctgtataccc gcgatggtca gctgctggtg ggcgatccgg ttgccgataa ctgctgcgcc 120
gaaaaaatct gcaccctgcc gaatcgtggt ctggatcgca ccaaagtgcc gatctttctg 180
ggcatccagg gtggtagccg ttgtctggca tgcgtggaaa ccgaagaagg tcctagcctg 240
cagctggaag atgtgaacat cgaggagctg tataaaggcg gcgaagaagc cacccgcttt 300
accttctttc agagcagcag cggtagcgcc tttcgcctgg aagcagcagc ctggccgggt 360
tggtttctgt gtggtccggc agaaccgcag cagccggttc agctgaccaa agaaagcgaa 420
ccgagcgccc gcaccaaatt ttatttcgag cagagctggc tcgagcacca ccaccaccac 480
cactga 486

Claims (3)

1.IL-38 蛋白的融合蛋白在制备治疗干眼病药物中的应用，其特征在于，所述融合蛋白为 IL-38 蛋白融合 IgG Fc 片段的形式，所述 IL-38 蛋白的氨基酸序列为 SEQ IDNO：1 所示。
2.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为滴眼剂、注射剂、凝胶剂或软膏剂。
3.根据权利要求 2 所述的应用，其特征在于，所述药物包含惰性、无毒、药理学合适的赋形剂。
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Jing Zhang等.The Effect of Interleukin 38 on Angiogenesis in a Model of Oxygen-induced Retinopathy.《Scientific Reports》.2017,第1-9页. *
The Effect of Interleukin 38 on Angiogenesis in a Model of Oxygen-induced Retinopathy;Jing Zhang等;《Scientific Reports》;20170605;摘要、第1页最后1段-第2页第1段、第4页"讨论"部分 *

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