CN110314225A - 含有白细胞介素-38重组蛋白的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有IL‑38重组蛋白的药物组合物及其应用，该IL‑38重组蛋白包括序列表中的序列1表示的氨基酸序列或其突变体。该IL‑38重组蛋白可作为IL‑1或IL‑36细胞因子的受体拮抗剂，抑制IL‑1或IL‑36介导的免疫炎症反应，可治疗或者延缓一些代谢综合症相关类疾病，例如糖尿病、肥胖、脂肪肝、高血压，以及一些免疫性炎症疾病，如器官特异性自身免疫性疾病、系统性自身免疫性疾病等，包含其他的由炎症反应所导致的组织或者器官损伤性疾病如哮喘。

Description

含有白细胞介素-38重组蛋白的药物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种含有白细胞介素-38(IL-38)重组蛋白的药物组合物及其应用。
背景技术
代谢综合症是因糖尿病、肥胖、血脂异常、高血压等内分泌、心血管疾病导致的一系列代谢异常。该综合征的症状包括糖耐量减退、糖尿病、向心性肥胖、血脂异常、高血压等。代谢综合症相关类疾病如脂肪肝、肝硬化等，具体如下：
正常肝脏含脂肪不超过5％，肝内如有过量脂肪沉积称为脂肪肝，主要是输入肝脏的脂肪和脂肪酸过多，以及肝脏中脂蛋白合成障碍，或是某些药物和化学毒物的作用，影响肝内脂肪代谢和输出肝外，以致大量脂肪堆积，形成脂肪肝。因为长期大量的脂肪堆积于肝细胞内，使其血液供应、氧气供应及自身的代谢受到影响，造成肝细胞大量肿胀、炎症浸润及变性坏死，导致肝纤维化的发生。肝纤维化是肝脏受到各种急慢性刺激后引发的损伤修复反应。若损伤因素持续存在，导致细胞外基质不断聚集，肝纤维化逐步进展为肝硬化。一旦发展为肝硬化，其并发症多、预后差、死亡率高，严重危害身体健康。因此，肝硬化的发生机制受到越来越多的关注。
自身免疫性疾病则是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身相关组织损伤，所引起的相关疾病。该类疾病的临床表现主要包括器官特异性自身免疫性疾病、系统性自身免疫性疾病，具体如下：
器官特异性自身免疫性疾病是由于抗体或者致敏淋巴细胞所针对的某一器官而导致的该器官发生病理损伤和功能障碍，进而引起的疾病，如慢性淋巴性甲状腺炎、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎。系统性自身免疫性疾病是由于抗原抗体复合物广泛沉积于血管壁等原因导致局部或者全身多器官损伤，进而引起的一系列疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎。目前，很多研究表明代谢综合症和自身免疫性疾病的发生是与自身效应T细胞、调节性T细胞及其细胞因子(IL-17、IL-22、IL-23等等)息息相关的。大量研究显示白细胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)可以促进肺纤维化。在多种肝脏疾病中，外周血IL-17升高并且与肝损伤的严重程度呈正相关，如酒精性肝病、原发性胆汁性肝硬化、病毒性肝炎(尤其乙型病毒性肝炎)、非酒精性脂肪肝等。
IL-1家族(Interleukin-1family,IL-1F)成员(IL-1α、IL-1β、IL-36α、IL-36β和IL-36γ、IL-36Ra和IL-38)在人体免疫系统中各自可以介导不同的免疫反应。IL-1α和IL-1β可诱导CD4+细胞增殖分化产生IL-2，或共刺激CD8+/IL-1R+细胞介导免疫炎症反应，以及诱导成熟B细胞增殖和分泌表达免疫球蛋白。IL-1F6(IL-36α)、IL-1F8(IL-36β)和IL-1F9(IL-36γ)可通过结合CD4+T细胞(Th0)表面的IL-1Rrp2受体(IL-36R)，促进细胞增殖和IL-2表达分泌，其中IL-2不仅可促使T细胞活化也可与IL-12协同作用，导致Th0细胞分化为Th1细胞，进而促进CD4+T细胞表达IFN-γ。IFN-γ促进Th1细胞分化成熟，促进吞噬细胞吞噬和消化活性。
因此，IL-36可作为早期预警信号，活化天然和适应性免疫系统，使宿主产生免疫应答反应，产生大量的细胞因子、趋化因子、黏附分子和酶等炎症介质，如TNF-α、IL-6、IL-8、IL-23或NO。
IL-6促使初始T细胞分化成熟为Th17效应细胞或Th17调控细胞，发挥不同作用。Th17调控细胞表达的IL-10、IL-21可以降低IL-5、IL-4、IFN-γ细胞因子以及嗜酸性粒细胞活性，有利于抑制免疫性炎症反应；Th17效应细胞表达的IL-17、IL-22发挥促免疫炎症因子释放作用。IL-8促进趋化作用和吞噬作用。IL-23促使Th17细胞表达分泌IL-17、IL-22等。
IL-36可以间接促使Th17细胞分泌表达IL-17、IL-22，尤其是IL-17A。因此，可以看出这些细胞因子是互相作用的，协同诱导免疫反应。而IL-1家族成员中的IL-36α、IL-36β和IL-36γ与IL-36R的结合可能会导致机体发生过度的免疫炎症反应，需要IL-1家族成员中的受体拮抗剂IL-36Ra和IL-38与IL-36R结合，抑制IL-36介导的免疫信号通路，使免疫反应受到调控。
白细胞介素-22(IL-22)是IL-10细胞因子家族成员之一，两者具有22％的同源性。不同于传统意义上的“白介素”，IL-22是一种新型的免疫介质，它由激活的Th细胞(Th1细胞、Th17细胞)以及天然免疫细胞(NK细胞)分泌产生，但却并不作用于这些细胞。IL-22主要作用于少数组织器官(皮肤、肝脏、胰腺、小肠、肺脏等)的实质细胞，发挥促炎、天然免疫调节等功能。
一般情况下，为了对副作用的免疫应答反应进行一个有效抑制，最好的方法是提供一个广泛活性的免疫抑制剂。除此之外，为了维持抑制剂的抑制效应，该抑制剂药物需要具有一个较长血浆半衰期。但是，广泛活性抑制剂也有其自身缺陷性，其使用伴随很大的副作用，比如肿瘤、感染等。因此，免疫抑制治疗方法及待更新。然而，目前为止，依旧没有令人满意的治疗手段可以特异性针对代谢综合症相关类疾病。同时，因为部分患者刚受到病原体感染或者其免疫系统正处于发挥功能阶段，所以，需要考虑到免疫抑制剂尽可能避免抑制发挥正常功能的免疫系统。
发明内容
本发明的目的是针对上述缺陷，提供一种能够治疗或延缓IL-1或IL-36介导的免疫反应紊乱导致的代谢综合症或自身免疫性疾病或过敏性疾病。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
根据本发明的第一方面，提供一种IL-38重组蛋白，该IL-38重组蛋白包括序列表中的序列1表示的氨基酸序列或其突变体。
或者，该IL-38重组蛋白与序列表中的序列1表示的氨基酸序列具有至少80％的一致性。优选地，IL-38重组蛋白与序列表中的序列1表示的氨基酸序列具有至少90％的一致性。进一步优选地，IL-38重组蛋白与序列表中的序列1表示的氨基酸序列具有99％-100％的一致性。在一个具体实施方案中，IL-38重组蛋白的氨基酸序列与序列表中的序列1表示的氨基酸序列完全相同。
根据本发明的一个具体优选方面，所述白细胞介素-38重组蛋白通过采用BL21原核表达菌株进行表达，以pET-24作为表达载体，IPTG作为诱导表达剂制备得到。
根据本发明的第二方面，提供一种编码任一上述的IL-38重组蛋白的核酸分子。
根据本发明的第三方面，提供一种包含上述的核酸分子的表达载体。
优选地，该表达载体为pET-24表达载体。
根据本发明的第四方面，提供一种包含上述的表达载体的宿主细胞。
优选地，该宿主细胞是原核细胞。
具体地，该宿主细胞是BL21表达菌株。
根据本发明的第五方面，提供一种药物组合物，该药物组合物包含任一上述的IL-38重组蛋白。
优选地，该药物组合物用于治疗或缓解例如IL-1、IL-36介导的免疫反应紊乱导致的代谢综合症。
具体地，该代谢综合症是胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、脂肪肝、高胰岛素血症、糖尿病、葡萄糖耐量异常。
优选地，该药物组合物用于治疗或缓解例如IL-1、IL-36介导的免疫反应紊乱导致的自身免疫性疾病。
具体地，该自身免疫性疾病是慢性淋巴性甲状腺炎、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎。
优选地，该药物组合物用于治疗或缓解例如IL-1、IL-36介导的免疫反应紊乱导致的过敏性疾病。
具体地，该过敏性疾病是风湿性关节炎、哮喘、荨麻疹等。
优选地，该药物组合物包括一个或多个单位的单位制剂，每个单位制剂含有的活性成分的重量为活性成分的有效治疗剂量的n倍，其中，n为0.1～10之间的数。
更优选地，n为0.1～1之间的数。
更优选地，该活性成分的有效治疗剂量是0.1～600毫克/人/次。
进一步优选地，该活性成分的所述有效治疗剂量是100～400毫克/人/次。
根据本发明的第六方面，任一上述的IL-38重组蛋白在制备用于治疗或延缓例如IL-1、IL-36介导的免疫反应紊乱导致的代谢综合症的药物中的应用。
具体地，该代谢综合症是IL-1或IL-36介导的，包括但不限于，胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、脂肪肝、高胰岛素血症、糖尿病、葡萄糖耐量异常。
根据本发明的第七方面，任一上述的IL-38重组蛋白在制备用于治疗或延缓例如IL-1、IL-36介导的免疫反应紊乱导致的自身免疫性疾病的药物中的应用。
具体地，该自身免疫性疾病是慢性淋巴性甲状腺炎、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎。
根据本发明的第八方面，任一上述的IL-38重组蛋白在制备用于治疗或延缓例如IL-1、IL-36介导的免疫反应紊乱导致的过敏性疾病的药物中的应用。
具体地，该过敏性疾病是IL-1或IL-36介导的，包括但不限于，风湿性关节炎、哮喘、荨麻疹。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
IL-38重组蛋白可作为IL-1或IL-36细胞因子的受体拮抗剂，抑制IL-1或IL-36介导的免疫炎症反应，可治疗或者延缓一些代谢综合症相关类疾病，以及其他的由炎症反应所导致的组织或者器官损伤性疾病。
附图说明
图1示出了实施例1中在原核细胞BL-21阳性克隆菌株中表达的IL-38重组蛋白的镍柱纯化洗脱图谱；
图2示出了实施例1中在原核细胞BL-21阳性克隆菌株中表达的IL-38重组蛋白的经镍柱纯化后再经HiTrapTM 1ml HP苯基柱纯化洗脱图谱；
图3示出了实施例1中在原核细胞BL-21阳性克隆菌株中表达的IL-38重组蛋白的SDS-PAGE分析；
图4示出了ELISA法检测的不同浓度时IL-38重组蛋白和IL-36蛋白与IL-36R-Fc结合的亲和力；
图5示出了ELISA法检测的IL-38重组蛋白和IL-36蛋白竞争性结合IL-36R-Fc的亲和力。
图6示出了ELISA法检测的IL-38重组蛋白和IL-1R-Fc蛋白的结合的亲和力。
图7示出了IL-38重组蛋白对小鼠Asthma疾病模型的活性测定结果。
具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪器做出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
白细胞介素-38(IL-38)
IL-38是IL-1家族中的第十个成员，于2001年首次在硅片中发现。IL-38可在多种免疫组织中检测到有表达，如脾、扁桃体、胸腺等，其中在扁桃体和皮肤B淋巴细胞中表达尤为明显，而在心脏、胎盘等无免疫功能的组织中无明显表达。
IL-38可以竞争性结合IL-1R与IL-36R，作为促炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-36α、IL-36β、IL-36γ的受体拮抗剂，有效抑制IL-1(α、β)和IL-36(α、β或γ)与IL-1R和IL-36R的结合，进而间接调控细胞因子的表达，如抑制IL-8、IFN-γ、TNF-α的表达。另一方面，IL-38可以介导IL-6的表达，导致初始T细胞分化成熟为Th17调控细胞，使IL-17、IL-22、IL-23的表达下降，阻止这些炎症因子促使免疫炎症反应的发生进而导致肝脏损伤或坏死，同时，可上调IL-10、IL-21进而抑制IL-2、IFN-γ的表达，抑制Th0细胞分化成熟Th1细胞。因此，IL-38竞争性结合IL-36R，可影响Th17/Treg的动态平衡，治疗代谢综合症类相关疾病。
也就是，IL-38通过竞争性结合IL-1R或IL-36R，间接抑制T细胞与B细胞增值活化以及调控Th17/Treg的动态平衡，适用于由IL-36或者IL-23细胞因子所介导的代谢综合症或者免疫性炎症疾病。
基于以上因素考虑，IL-38重组蛋白可用作新型的免疫抑制剂，特别是作为生物活性大分子药物可以治疗代谢综合症类相关疾病或者免疫性炎症疾病。
在本发明中，IL-38重组蛋白采用BL21原核表达菌株进行表达，并且以pET-24作为表达载体，IPTG作为诱导表达剂。根据本发明制备的IL-38重组蛋白以可溶性形式存在。
实施例1：IL-38重组蛋白的表达
根据序列表中的序列1和序列2，合成IL-38重组蛋白基因片段并连入pET-24表达载体(苏州泓迅生物科技有限公司)，将该重组质粒转化BL-21感受态菌株(Bio-Rad)。其中，序列2为序列1所示的氨基酸序列对应的DNA序列。
将转化后的BL-21阳性克隆菌株接种到50mL的LB培养基，37℃、220rpm培养至OD600达到0.6左右后，按1％接种量接种到2瓶500ml的LB培养基，继续培养至OD600达到0.6左右，随后加入IPTG(终浓度0.5mM)于30℃、220rpm进行诱导表达过夜。
诱导表达过夜的总体积为1L的BL21菌液经过离心(8000×g，15min，4℃)处理，并收集菌体。随后，用100ml的PBS缓冲液重悬该菌体，并通过均质仪处理菌液，再次离心(25000×g，30min，4℃)收集上清，保存于4℃。
IL-38蛋白纯化步骤：
1.镍柱纯化
1)样品处理，用0.22μm滤膜过滤菌液上清；
2)15～30ml的PBS缓冲液平衡镍柱(实验室填装)，流速2ml/ml；
3)蛋白样品上样处理，总体积为100ml，流速为2ml/ml；
4)PBS+5％洗脱缓冲液(300mM咪唑)洗柱，体积15～30ml；
5)洗脱缓冲液洗脱，并收集洗脱峰；
该纯化步骤洗脱图谱如图1所示。
2.HiTrapTM 1ml HP苯基柱纯化
1)样品处理，将咪唑洗脱的IL-38样品按1:9体积与平衡缓冲液(PBS+1.7M(NH4)2SO4)混匀，0.22μm滤膜过滤；
2)15～30ml平衡缓冲液平衡HiTrapTM 1ml HP苯基柱；
3)IL-38上样处理，体积20ml，流速1ml/min；
4)0～100％的PBS线性洗脱HiTrapTM 1ml HP苯基柱，流速1min/min，体积20ml，收集洗脱峰；
5)20％乙醇保存HiTrapTM 1ml HP苯基柱。
HiTrapTM 1ml HP苯基柱洗脱图谱如图2所示。
在IPTG诱导表达前后的样品中加入上样缓冲液，于沸水浴处理5min，通过SDS-PAGE检测目的IL-38重组蛋白的表达。图3是IPTG诱导表达前后的样品的SDS-PAGE分析图，其中图3中“1”为蛋白分子量标记，“2”为IPTG诱导表达前的样品，“3”为IPTG诱导表达后的样品。
实施例2：酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测IL-38蛋白和IL-36蛋白与IL-36R-Fc 的亲和力
实验步骤：
(1)将浓度为2μg/mL的IL-38蛋白和IL-36蛋白按100μL体积包被ELISA板，4℃过夜；
(2)0.1％PBST洗板5次；
(3)用5％浓度的BSA溶液封闭ELISA板；
(4)0.1％PBST洗板5次；
(5)将起始浓度为50μg/mL的IL-36R-Fc溶液按1：3浓度梯度稀释至16.7μg/mL、5.56μg/mL、1.85μg/mL、0.62μg/mL、0.21μg/mL、0.07μg/mL，每个梯度浓度的IL-36R-Fc溶液分别加到ELISA板，终体积50μL，37℃孵育1.5小时；
(6)0.1％PBST洗板5次；
(7)将HRP标记的抗人Fc多抗按1:2000稀释后，按每孔100μL体积加入ELISA板，37℃孵育1.5小时；
(8)0.1％PBST洗板5次；
(9)TBS显色并在OD450nm处记录实验数据。
图4示出了不同浓度时IL-38重组蛋白和IL-36蛋白与IL-36R-Fc结合的亲和力。如图4所示，在各不同浓度梯段IL-38蛋白与IL-36R-Fc结合的亲和力相比于IL-36蛋白与IL-36R-Fc结合的亲和力十分相近。
实施例3：ELISA法检测IL-38蛋白和IL-36蛋白竞争性结合IL-36R-Fc
实验步骤：
(1)将浓度为2μg/mL的IL-36按100μL体积包被ELISA板，4℃过夜；
(2)0.1％PBST洗板5次；
(3)用5％浓度的BSA溶液封闭ELISA板；
(4)0.1％PBST洗板5次；
(5)将起始浓度为100μg/mL的IL-38蛋白溶液按1：10浓度梯度稀释至10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL，每个浓度梯度的IL-38溶液加入IL-36R-Fc，IL-36R-Fc的终浓度均为10μg/mL，加到ELISA板，终体积50μl，37℃孵育1.5小时；
(6)0.1％PBST洗板5次；
(7)将HRP标记的抗人Fc多抗按1:2000稀释后，按每孔100μL体积加入ELISA板，37℃孵育1.5小时。
(8)0.1％PBST洗板5次；
(9)TBS显色并在OD450nm处记录实验数据。
阳性对照为浓度为10μg/mL的IL-36R-Fc溶液，空白对照组为浓度为100μg/mL的IL-38溶液，阴性对照组为PBS溶液。
所得实验数据如图5和表1所示：
表1
实施例4：ELISA法检测IL-38蛋白和IL-1R-Fc的亲和力
(1)将浓度为4μg/mL的IL-38蛋白按100μL体积包被ELISA板，4℃过夜；
(2)0.1％PBST洗板5次；
(3)用5％浓度的BSA溶液封闭ELISA板；
(4)0.1％PBST洗板5次；
(5)将起始浓度为100μg/mL的IL-1R-Fc溶液按1：3浓度梯度稀释至33.3μg/mL、11.1μg/mL、3.70μg/mL、1.23μg/mL、0.41μg/mL、0.14μg/mL、0.05μg/mL，每个梯度浓度的IL-1R-Fc溶液分别加到ELISA板，终体积100μL，37℃孵育1.5小时；
(6)0.1％PBST洗板5次；
(7)将HRP标记的抗人Fc多抗按1:2000稀释后，按每孔100μL体积加入ELISA板，37℃孵育1.5小时；
(8)0.1％PBST洗板5次；
(9)TBS显色并在OD450nm处记录实验数据。
图6示出了不同浓度时IL-38重组蛋白和IL-1R-Fc结合的亲和力。
实施例5：IL-38重组蛋白对小鼠Asthma疾病模型的活性测定
哮喘是一种气道慢性炎症类疾病，表现为淋巴细胞，嗜酸性粒细胞(EOS)数量增加和气道炎症，其中以嗜酸性粒细胞浸润为主。患者哮喘发作时，其外周血及气道内嗜酸性粒细胞均明显增多，而病情缓解时嗜酸性粒细胞又明显减少。活化的嗜酸性粒细胞可以释放多种碱性蛋白质，包含主碱蛋白(MBP)、嗜酸性离子蛋白(ECP)，嗜酸细胞源神经毒素(EDN)及嗜酸性过氧化物酶(EPO)等，直接损伤气道上皮细胞，引起气道高反应性。而目前研究表明，可以通过阻断免疫反应信号通路阻止IL-5等免疫炎症因子的产生或者释放，可以有效抑制气道内的嗜酸性粒细胞的产生，已成为治疗哮喘的关键。
本实验用于测试受试物IL-38在OVA诱导的BALB/c小鼠(雌性，6～7周，17～20g)哮喘中的作用。实验中，根据体重将小鼠随机分配成3组：假致敏-溶媒组；致敏-溶媒组；IL-38组。实验共需要30只雌性BALB/c小鼠(详见分组及给药表)。OVA溶液：2mg OVA加入5mLPBS(PH＝7.2)，终浓度0.4mg/mL。OVA致敏溶液：加5mL OVA溶液于离心管中，再加入5mL的40mg/mL的氢氧化铝溶液，得到1:1混合液，最后置于37℃的水平摇床上摇动30min即可。攻击溶液：0.1g OVA溶于10mL PBS(PH＝7.2)即可，终浓度10mg/mL。
根据动物体重，通过BioBook随机分配功能将动物随机分配到各个处理组中，以达到近似的各组均重，减少组间偏差。
致敏：实验第1及第14天，第二组和第三组的动物通过每只腹腔注射0.1mL的致敏溶液进行致敏，第1组动物每只腹腔注射0.1mL的PBS(PH＝7.2)。
激发：实验第28，29和30天，攻击溶液先通过Mass dosing系统(Buxco)雾化，再攻击第二组和第三组的动物。第1组动物接受PBS(PH＝7.2)的攻击。
给药处理：
第一组(假致敏-溶媒组)，动物于第14(PBS注射前2小时)、18、26天和第30(PBS攻击前2小时)天每天一次尾静脉给予受试物溶媒PBS。
第二组(致敏-溶媒组)，动物于第14(致敏前2小时)、18、26天和第30(OVA攻击前2小时)天每天一次尾静脉给予受试物溶媒PBS。
第三组(IL-38组)，动物于第14(致敏前30分钟以内)天、第15-27天、第28天(OVA攻击前30分钟以内)、第29天(OVA攻击前30分钟以内)、第30(OVA攻击前30分钟以内)天和第31天每天一次腹腔注射给予IL-38(每只小鼠800ng在0.2mL PBS里)。
实验第32天，动物经腹腔注射7.5％水合氯醛(10mL/kg)深度麻醉放血安乐死。然后气管插管并用含1％FBS的0.5mL PBS(PH＝7.2)对肺组织进行首次灌洗，接着用新的含1％FBS的0.5mL PBS(PH＝7.2)重复上述灌洗两次。收集的第1次灌洗液和后面两次的灌洗液分开，置于冰上。第1次的灌洗液离心后，取上清置于-80℃保存。收集3次灌洗液离心得到的细胞，用1.5mL含1％FBS的PBS(PH＝7.2)重新悬浮，台盼蓝染色后滴于细胞计数器内进行总细胞计数。
悬起的支气管肺泡灌洗液(BALF)再经4℃,300×g离心5分钟，离下的细胞用0.3mL含1％FBS的PBS(PH＝7.2)重新悬浮。接着通过细胞涂片离心机离心和瑞氏-吉姆萨染色对细胞(淋巴细胞，嗜酸性粒细胞，巨噬细胞和中性粒细胞)进行分类计数。
统计分析结果见图7及表2和表3。
所有结果表示成均值±标准误(mean±S.E.M)。数据由Graphpad Prism或SPSS采用相应的统计方法分析。p<0.05视为具有统计学差异。所有统计分析在原始数据上完成。
表2
Mean 假致敏 致敏 IL-38
EOS 0.16 126.25 38.99
Mac 29.16 116.62 147.16
Neu 1.34 9.15 3.15
Lym 0.24 7.26 4.96
表3
SEM 假致敏 致敏 IL-38
EOS 0.02 15.29 5.36
Mac 4.41 6.86 7.87
Neu 0.56 3.14 0.90
Lym 0.07 1.65 1.19
IL-38重组蛋白可作为IL-1或者IL-36细胞因子的受体拮抗剂，抑制IL-1或者IL-36介导的免疫炎症反应，可治疗或者延缓一些代谢综合症相关类疾病，例如糖尿病、肥胖、脂肪肝、高血压，以及其他的由炎症反应所导致的组织或者器官损伤性疾病。本发明验证了IL-38的原核表达和理化性质，该重组蛋白不仅可与IL-1R或IL-36R结合，同时，在IL-1或IL-36存在条件下也可以有效的竞争性结合IL-1R或IL-36R。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 瑞阳(苏州)生物科技有限公司
<120> 含有白细胞介素-38重组蛋白的药物组合物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 161
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
His Met Cys Ser Leu Pro Met Ala Arg Tyr Tyr Ile Ile Lys Tyr Ala
1 5 10 15
Asp Gln Lys Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Gln Leu Leu Val Gly Asp
20 25 30
Pro Val Ala Asp Asn Cys Cys Ala Glu Lys Ile Cys Thr Leu Pro Asn
35 40 45
Arg Gly Leu Asp Arg Thr Lys Val Pro Ile Phe Leu Gly Ile Gln Gly
50 55 60
Gly Ser Arg Cys Leu Ala Cys Val Glu Thr Glu Glu Gly Pro Ser Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Asp Val Asn Ile Glu Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Glu Glu
85 90 95
Ala Thr Arg Phe Thr Phe Phe Gln Ser Ser Ser Gly Ser Ala Phe Arg
100 105 110
Leu Glu Ala Ala Ala Trp Pro Gly Trp Phe Leu Cys Gly Pro Ala Glu
115 120 125
Pro Gln Gln Pro Val Gln Leu Thr Lys Glu Ser Glu Pro Ser Ala Arg
130 135 140
Thr Lys Phe Tyr Phe Glu Gln Ser Trp Leu Glu His His His His His
145 150 155 160
His
<210> 2
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
catatgtgca gcctgccgat ggcccgctac tacatcatta agtacgccga ccagaaagcc 60
ctgtataccc gcgatggtca gctgctggtg ggcgatccgg ttgccgataa ctgctgcgcc 120
gaaaaaatct gcaccctgcc gaatcgtggt ctggatcgca ccaaagtgcc gatctttctg 180
ggcatccagg gtggtagccg ttgtctggca tgcgtggaaa ccgaagaagg tcctagcctg 240
cagctggaag atgtgaacat cgaggagctg tataaaggcg gcgaagaagc cacccgcttt 300
accttctttc agagcagcag cggtagcgcc tttcgcctgg aagcagcagc ctggccgggt 360
tggtttctgt gtggtccggc agaaccgcag cagccggttc agctgaccaa agaaagcgaa 420
ccgagcgccc gcaccaaatt ttatttcgag cagagctggc tcgagcacca ccaccaccac 480
cactga 486

Claims (10)

1.一种用于治疗或延缓免疫反应紊乱导致的代谢综合症或自身免疫性疾病或过敏性疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分包含白细胞介素-38重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述代谢综合症是由白细胞介素-36介导的，包括胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、脂肪肝、高胰岛素血症、糖尿病、葡萄糖耐量异常，和/或，所述自身免疫性疾病是由白细胞介素-1或白细胞介素-36介导的，包括慢性淋巴性甲状腺炎、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎，和/或，所述过敏性疾病是由白细胞介素-1或白细胞介素-36介导的，包括风湿性关节炎、哮喘、荨麻疹等。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述白细胞介素-38重组蛋白与序列表中序列1表示的氨基酸序列具有至少80％的一致性，优选至少90％的一致性，进一步优选99％-100％的一致性。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述白细胞介素-38重组蛋白通过采用BL21原核表达菌株进行表达，以pET-24作为表达载体，IPTG作为诱导表达剂制备得到。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括一个或多个单位的单位制剂，每个单位制剂含有的所述活性成分的重量为所述活性成分的有效治疗剂量的n倍，其中，n为0.1～10之间的数。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述n为0.1～1之间的数。
7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述活性成分的所述有效治疗剂量是0.1～600毫克/人/次。
8.白细胞介素-38重组蛋白在制备用于治疗或延缓免疫反应紊乱导致的代谢综合症或自身免疫性疾病或过敏性疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述代谢综合症是由白细胞介素-1或白细胞介素-36介导的，包括胰岛素抵抗、肥胖、高血糖、高血压、血脂异常、高血黏、高尿酸、脂肪肝、高胰岛素血症、糖尿病、葡萄糖耐量异常，和/或，所述自身免疫性疾病是由白细胞介素-1或白细胞介素-36介导的，包括慢性淋巴性甲状腺炎、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎，和/或，所述过敏性疾病是由白细胞介素-1或白细胞介素-36介导的,包括风湿性关节炎、哮喘、荨麻疹等。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述白细胞介素-38重组蛋白与序列表中序列1表示的氨基酸序列具有至少80％的一致性，优选至少90％的一致性，进一步优选99％-100％的一致性。
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