CN103221422A - 嵌合il-1受体i型激动剂和拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征在于非天然存在的细胞因子结构域，其尤其可用于调节响应白介素-1受体I(IL-1RI)的细胞信号转导，用于治疗疾病，以及用于检测细胞受体和/或与细胞受体结合，以及其他药剂。示例性细胞因子结构域可包含来自至少两个亲本细胞因子结构域的氨基酸残基，例如来自至少两个亲本细胞因子结构域的受体结合特征、表面特征、β链和环。

Description

嵌合IL-1受体I型激动剂和拮抗剂
交叉引用和优先权申明
本申请要求以下美国临时专利申请的优先权：2010年7月29日提交的序列号61/368,799、2011年1月25日提交的序列号61/436,178、2011年1月25日提交的序列号61/436,184、2011年6月6日提交的序列号61/493,966以及2011年6月6日提交的序列号61/493,967，并且对于美国专利申请以引用的方式并入2010年7月29日提交的序列号61/368,799、2011年1月25日提交的序列号61/436,184以及2011年6月6日提交的序列号61/493,967的内容。
发明背景
白介素-1α(IL-1α)和β(IL-1β)是免疫调节细胞因子家族的原型成员，并在免疫系统调节中具有多种重要的作用。IL-1α和IL-1β与白介素-1受体I(IL-1RI)结合，从而导致第二受体即白介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)的接合。由IL-1α和IL-1β激动的信号转导导致放大的T细胞应答，包括初始T细胞的增殖和存活以及TH17细胞的发育。
发明概述
本文的特征在于非天然存在的细胞因子结构域，其尤其可用于调节响应白介素-1受体I(IL-1RI)的细胞信号转导，用于治疗疾病，以及用于检测细胞受体和/或与细胞受体结合，以及其他药剂。
在一个方面，本公开的特征在于包含细胞因子结构域的分离的蛋白质，该细胞因子结构域含有来自至少两个亲本细胞因子结构域的氨基酸残基，例如，来自至少两个亲本细胞因子结构域的受体结合特征、表面特征、β链和环。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域与IL-1RI结合并包含来自不同亲本细胞因子结构域的受体结合特征，例如，来自受体激动剂和受体拮抗剂（诸如IL-1β和IL-1Ra，或IL-1α和IL-1Ra）、来自IL-1β和IL-1α或来自IL-1Ra、IL-1α和IL-1Ra所有三者。这些受体结合特征可对应于位点A和B中的残基、片段或区域。至于在IL-1（IL-1β、IL-1α和IL-1Ra）的情况下对应于位点A和B的此类残基、片段和区域，详见下文的定义。
至于位点A，该细胞因子结构域可具有：(a)(i)与第一亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点A残基；(a)(ii)与第一亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的扩展位点A残基；(a)(iii)与第一亲本细胞因子结构域的对应区域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位点A片段A1和A2；和/或(a)(iv)与第一亲本细胞因子结构域的对应区域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位点A区域。
至于位点B，该细胞因子结构域可具有：(b)(i)与第二亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点B残基；(b)(ii)与第二亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的扩展位点B残基；(b)(iii)与第二亲本细胞因子结构域的对应区域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位点B片段B1、B2和B3；和/或(b)(iv)与第二亲本细胞因子结构域的对应区域具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的位点B区域。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含以下特征：(a)(i)和b(i)、(a)(ii)和b(ii)、(a)(iii)和(b)(iii)或(a)(iv)和(b)(iv)，例如，其中各特征进一步通过80、85、88、90、92、95或100%的同一性所限定。例如，第一亲本细胞因子结构域可以为IL-1β，以及第二亲本细胞因子结构域可以为IL-1Ra。例如，第一亲本细胞因子结构域可以为IL-1α，以及第二亲本细胞因子结构域可以为IL-1Ra。
细胞因子结构域还可以在该结构域的一个或多个位置包含来自第二亲本细胞因子结构域的氨基酸，它们减弱与细胞因子第二受体（例如，IL-1RAcP）的相互作用。例如，第二亲本细胞因子结构域为IL-1Ra。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含来自IL-1Ra的一个或多个位点C和/或D片段（例如，C1、D1、D2、D3、D4和/或D5），或与此类片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的序列。例如，该细胞因子结构域包含(i)与IL-1Ra中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点C残基，(ii)与IL-1Ra中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点D残基，(iii)与IL-1Ra中的对应残基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的C1片段，或(iv)在至少3、4或5个残基与IL-1Ra中的对应残基相同的D2片段。该细胞因子结构域可包含特征(i)和(ii)或(ii)和(iii)，例如，其中各特征进一步通过80、85、88、90、92、95或100%的同一性而限定，或(iii)和(iv)。
该结构域可包含来自至少两个不同的人IL-1家族细胞因子结构域的区域，其中所述区域选自A区域（具有A1和A2片段）、B区域（具有B1、B2和B3片段）、C区域以及D区域（具有D1、D2、D3、D4和D5片段）。
该细胞因子结构域可包含来自不同细胞因子结构域的位点A区域和位点B区域。位点A区域可来自天然存在的受体激动剂或拮抗剂；位点B可来自天然存在的受体激动剂。它可包含来自天然存在的受体拮抗剂的位点C区域和/或来自天然存在的受体拮抗剂的位点D区域。
例如，该结构域可以是具有以下片段的嵌合结构域，所述片段长度为至少5、6、10、15、20或25个氨基酸并与来自至少两个不同亲本细胞因子结构域诸如第一和第二亲本细胞因子结构域的对应片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。亲本细胞因子结构域可以为IL-1RI结合细胞因子，诸如IL-1β、IL-1α和IL-1Ra。在一些实施方案中，不在来自第一亲本细胞因子结构域的片段中的氨基酸来自两个或更多个其他亲本细胞因子结构域。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含长度为至少5、6、10、15、20或25个氨基酸的与第一亲本细胞因子结构域的对应片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的至少两个片段，并且不在此类片段中的氨基酸大部分（例如，至少50、60、70、80、85、88、90、92、95或100%）与第二亲本细胞因子结构域中的对应残基相同。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含(i)长度为至少5、6、10、15、20或25个氨基酸的与第一亲本细胞因子结构域的对应片段具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的至少两个片段，以及(ii)例如长度为至少5、6、7、8、10或15个氨基酸的与第二亲本细胞因子结构域相同的至少一个、两个或三个片段。
例如，该细胞因子结构域可包含20-50、25-50、30-45或30-40个（例如，29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个）氨基酸的第一片段，和20-45、20-40、25-40或25-35个（例如，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个）氨基酸的第二片段，每一个均与第一亲本细胞因子结构域（例如，IL-1Ra）相同（或具有至少80、85、88、90、92、95或98%同一性），以及与第二亲本细胞因子结构域（例如，IL-1β或IL-1α）相同（或具有至少80、85、88、90、92、95或98%同一性）的第三片段。例如，第三片段长度可以为55-90、60-90、60-85或70-85个氨基酸，例如，75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85个氨基酸。
在一些实施方案中：第一片段可以为与WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV（SEQ ID NO:9，本文也称为A1片段，并对应于SEQ ID NO:3的第16-40位残基以及根据IL-1β编号的第11-36位残基）具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的片段。第二片段可以为与SEQ ID NO:3(IL-1Ra)的第120-140或120-141位残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性，对应于第121-139或121-140位残基（根据IL-1β编号）的片段。第三片段可以与来自IL-1β(SEQ ID NO:1)的第45-100或42-120位残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性。
在一些情况下，第一片段可以为与SEQ ID NO:3的第14-45位残基（对应于根据IL-1β编号的第9-41位残基）具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的片段。第二片段可以为与SEQ ID NO:3的第120-145位残基（对应于根据IL-1β编号的第121-145位残基）或SEQ ID NO:3的第120-147位残基（对应于根据IL-1β编号的第121-147位残基）具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的片段。在一些实施方案中，至少第11-41和120-147位残基（根据IL-1β编号）共同地与IL-1Ra中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性。
在一些实施方案中，第一IL-1家族细胞因子结构域的片段之一的末端位于SEQ ID NO:1的第41位氨基酸的五个、四个、三个、两个或一个氨基酸内，以及第一IL-1家族细胞因子结构域的片段之一的末端位于SEQ IDNO:1的第121位氨基酸的五个、四个、三个、两个或一个氨基酸内。
在一些实施方案中，该结构域包含：具有SEQ ID NO:1第42位氨基酸的五个、四个、三个、两个或一个氨基酸内某一位置处的N端以及SEQ IDNO:1第120位氨基酸的五个、四个、三个、两个或一个氨基酸内的C端的片段，和/或具有SEQ ID NO:1第121位氨基酸的五个、四个、三个、两个或一个氨基酸内某一位置处的N端以及SEQ ID NO:1的第145位氨基酸的五个、四个、三个、两个或一个氨基酸内的C端的片段。
在一些实施方案中，该结构域中在对应于11-41和120-147（根据IL-1β编号）的位置处的残基共同地与IL-1Ra中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性。该结构域还可基于来自IL-1细胞因子家族成员的序列，例如，在与前述位置相似的位置。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含以下序列中的一者、两者、三者或更多者：WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO:9)；
NLEEK(SEQ ID NO:10)；
RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11)；
AMEADQP(SEQ ID NO:12)；
FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO:13)；和/或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含以下序列中的一者、两者、三者或更多者：VQGEESNDKI(SEQ ID NO:14)；KKKMEKRF(SEQ ID NO:15)和FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO:16)；和/或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。
在一些实施方案中，β1β2、β2β3、β8β9和β10β11环的一者或多者或全部与IL-1拮抗剂（如，IL-1Ra）的对应环具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。在一些实施方案中，β4β5、β5β6、β6β7和β7β8环的一者或多者或全部与来自不同于与β1β2、β2β3、β8β9和β10β11环最相似的人亲本细胞因子的IL-1家族细胞因子结构域的相应环具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。例如，β4β5、β5β6、β6β7和β7β8环的一者或多者或全部与来自IL-1激动剂诸如IL-1β的此类环具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。在一些实施方案中，β11β12环与来自IL-1拮抗剂例如IL-1Ra的对应环具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11中的一者、两者、三者或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的序列。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与IL-1β的β4、β6、β7和β8或与IL-1β的β4、β5、β6、β7和β8的一者、两者、三者或全部具有至少80、85、88、90、92、95或100%同一性的序列。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域不含与SEQ ID NO:3的氨基酸I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110或I46-G118具有大于80、85、90、95或100%同一性的片段。在一些实施方案中，该细胞因子结构域不含与SEQ ID NO:1的氨基酸N7-V41、R11-M36、N102-D145或Y121-D145具有大于80、85、90、95或100%同一性的片段。
一般来讲，该细胞因子结构域不是天然存在的。它不同于人IL-1家族细胞因子结构域。例如，它与IL-1Ra(SEQ ID NO:3)、IL-1β(SEQ ID NO:1)和/或IL-1α(SEQ ID NO:2)具有小于98、95、90、85、80、75、70、65、60或55%的同一性。该细胞因子结构域也可以与此类细胞因子具有至少30、40、45、50、55、60、65、70%同一性。例如，该嵌合结构域可以与IL-1Ra、IL-1β和IL-1α具有30-95%、40-90%或45-85%同一性。例如，该嵌合结构域可以与IL-1β具有40-90%同一性以及与IL-1Ra具有35-85%同一性；与IL-1β具有40-80%同一性以及与IL-1Ra具有45-80%同一性；与IL-1β具有45-72%同一性以及与IL-1Ra具有45-80%同一性；与IL-1β具有45-72%同一性以及与IL-1Ra具有53-80%同一性；与IL-1β具有50-72%同一性以及与IL-1Ra具有53-70%同一性；与IL-1β具有60-72%同一性以及与IL-1Ra具有53-68%同一性；与IL-1β具有65-72%同一性以及与IL-1Ra具有54-60%同一性；或与IL-1β具有68-72%同一性以及与IL-1Ra具有54-57%同一性。例如，该嵌合结构域可以与IL-1α具有40-90%同一性以及与IL-1Ra具有35-85%同一性；与IL-1α具有40-80%同一性以及与IL-1Ra具有45-80%同一性；与IL-1α具有45-72%同一性以及与IL-1Ra具有45-80%同一性；与IL-1α具有45-72%同一性以及与IL-1Ra具有53-80%同一性；与IL-1α具有50-72%同一性以及与IL-1Ra具有53-70%同一性；与IL-1α具有60-72%同一性以及与IL-1Ra具有53-68%同一性；与IL-1α具有65-72%同一性以及与IL-1Ra具有54-60%同一性；或与IL-1α具有68-72%同一性以及与IL-1Ra具有54-57%同一性。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域不同于IL-1Ra，并与受体结合，同时包含天然存在的受体拮抗剂（诸如IL-1Ra）特有的位点C和/或位点D。例如，该结构域与人IL-1β和/IL-1Ra具有小于98、95、92、90、85和80%的同一性。例如，该结构域与IL-1Ra具有40-95%、40-90%或45-85%同一性。该结构域也可以与IL-1家族细胞因子激动剂诸如IL-1α或IL-1β具有40-95%、40-90%或45-85%同一性。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含：来自作为细胞因子信号转导激动剂的第一亲本细胞因子结构域的至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85%的氨基酸。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域与受体激动剂（诸如IL-1β或IL-1α）具有比与受体拮抗剂(IL-1Ra)更高的氨基酸同一性（例如，至少高5、10、15或20%），但作为IL-1RI的拮抗剂发挥作用。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域为完全嵌合的，例如，该结构域中的每个氨基酸来自亲本细胞因子结构域之一，例如，两个亲本细胞因子结构域之一或者三个或更多个亲本细胞因子结构域之一。例如，该亲本细胞因子结构域为人细胞因子结构域或非人灵长类细胞因子结构域。在一些实施方案中，该细胞因子结构域为部分嵌合的，例如，该结构域中并非所有氨基酸都来自亲本细胞因子结构域之一。
例如，该分离的蛋白质与IL-1RI结合并调节受体的信号转导，例如，激动或拮抗IL-1RI受体信号转导活性。在一些实施方案中，该蛋白质在接触IL-1β反应性人细胞时不实质上诱导IL-6的产生，和/或不实质上诱导IL-1β反应性报告基因的产生，例如，以10μg/ml、100μg/ml或1mg/ml的浓度。一般来讲，该蛋白质以小于100、50、20、10或5nM的IC50抑制IL-1β（例如，诸如在本文所述的细胞测定中以0.1ng/ml的浓度）的信号转导。该蛋白质可以小于IL-1Ra的IC50值的IC50（例如，小至少10、20或50%）抑制IL-1β的信号转导。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域例如以相比于亲本细胞因子结构域之一相同的或更高的亲和力结合。在一些实施方案中，该细胞因子结构域以小于100、50、20、10、5或1nM或小于500、400、100或50pM的KD与IL-1RI结合。例如，缔合常数可大于1×104、3×104、1×105或1×106M-1s-1，而解离常数可小于1×10-3、1×10-4、6×10-4或6×10-5s-1。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域以相比于IL-1β或IL-1Ra更高的亲和力（例如，更低的KD）和/或更慢的解离速率与IL-1RI结合。例如，该细胞因子结构域可以小于或等于IL-1Ra的解离常数的解离常数和/或以大于或等于IL-1β的缔合常数的缔合常数与IL-1RI结合。
该细胞因子结构域的长度可介于约120-180、140-170或148-160或150-156个氨基酸之间。在一些实施方案中，该结构域的长度为152或153个氨基酸。通常，该结构域包含至少10、11或12条β链，并稳定折叠。在一些实施方案中，该细胞因子结构域具有至少38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62或64℃的Tm，如本文所述。它可具有介于51-61、51-66、56-61或56-66℃之间的Tm。在一些实施方案中，该细胞因子结构域直到至少48、50、51、55、57、58或59℃才开始解折叠。例如，在生理缓冲液中，它具有至少在IL-1Ra和/或IL-1β的Tm的10℃或5℃内的Tm。在一些实施方案中，它在生理缓冲液中比IL-1Ra和/或IL-1β更加热稳定。例如，该结构域在生理缓冲液中可具有比IL-1Ra和/或IL-1β的Tm高至少2、4、6、7或8℃的Tm，例如，在约0.5mg/ml的浓度下比IL-1Ra和/或IL-1β的Tm高约5-12、5-10或7-10℃。
该蛋白质可包含本文所述的其他特征。
在另一方面，本公开的特征在于包含嵌合IL-1家族细胞因子结构域的分离的蛋白质。IL-1细胞因子家族成员的实例包括IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、IL-18、IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1F10和IL-33。该细胞因子结构域可包含前述细胞因子之一的受体结合区或包含一种或多种此类细胞因子的元件的蛋白质序列。例如，该细胞因子结构域可包含两种或更多种IL-1细胞因子家族成员的嵌合体。
在一个实施方案中，该嵌合结构域包含：长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70个氨基酸并与第一IL-1家族细胞因子具有氨基酸同一性（或至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性）的至少一个片段，以及长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸并与第二IL-1家族细胞因子具有氨基酸同一性（或至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性）的另一片段。该嵌合结构域与第一和第二IL-1家族细胞因子之一或两者具有可小于90、85、80或75%的同一性。
在一个实施方案中，第一和第二IL-1家族细胞因子选自IL-1β、IL-1α和IL-1Ra。在另一个实施方案中，第一和第二IL-1家族细胞因子选自IL-1F5、IL-1F6、IL-1F7和IL-1F8。在另一个实施方案中，第一IL-1家族细胞因子选自激动剂，而第二IL-1家族细胞因子选自拮抗剂。在一些实施方案中，该嵌合结构域包含少于120、110、100、90或80个来自相同亲本细胞因子结构域的邻接氨基酸。
在一个实施方案中，该嵌合结构域在至少50、60、70、80、90、100、110或120个位置与第一IL-1家族细胞因子相同，以及在至少50、60、70、80、90、100、110或120个位置与第二IL-1家族细胞因子相同（包括可以单独地与这两种细胞因子均相同的位置）。
在一个实施方案中，该嵌合结构域包含至少两个、三个或四个不连续片段，每一个的长度为至少5、6、7、8、9、10、15或20个氨基酸并与第一IL-1家族细胞因子的对应片段具有氨基酸同一性（或至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98或99%的同一性）以及在其余的位置包含大部分来自第二IL-1家族细胞因子的氨基酸。在一个实施方案中，该嵌合结构域包含4、5、6或7个片段，其中相邻的片段来自不同的亲本IL-1家族细胞因子结构域。例如，该结构域中的每个氨基酸位于来自天然存在的人IL-1家族细胞因子结构域的长度为至少5或6个氨基酸的肽内。在一个实施方案中，该嵌合结构域包含以下至少一者、两者或三者：(i)来自IL-1β的长度为至少50、60、65、70或75个氨基酸的片段；(ii)来自IL-1Ra的长度为至少15、20、25个氨基酸的片段；以及(iii)来自IL-1Ra的长度为至少15、20、25个氨基酸的另一片段。
在一个实施方案中，根据IL-1β中此类位置的编号，该不连续片段包含(i)第1-6和45-61位，(ii)第1-6和86-95位，(iii)第45-61和86-95位，(iv)第1-6和148-153位，(v)第45-61和148-153位或(vi)第86-95和148-153位残基。根据IL-1β中此类位置的编号，来自第一IL-1家族细胞因子的该三个不连续片段可包含（例如）第1-8、42-120和141-153位残基，第1-10、37-125和131-153位残基或第1-6、45-61、86-95和148-153位残基。该嵌合结构域在其余的位置可以与第二IL-1家族细胞因子具有至少80、82、85、87、90、92、94、95、96、97、98、99或100%同一性。在一个实施方案中，该不连续片段的边界的一个或多个位于其中第一和第二IL-1家族细胞因子为相同的或保守的位置处。该蛋白质可具有本文所述的其他特征。
在另一方面，本公开的特征在于包含与IL-1RI结合的IL-1家族细胞因子结构域的分离的IL-1抑制剂。例如，该IL-1抑制剂包含上文或本文其他地方所述的一种或多种特征。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含：(a)在以下位置与IL-1Ra相同的氨基酸：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130和GLN141（根据IL-1β的编号）；以及(b)在以下位置与IL-1β相同的氨基酸：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152。在一些实施方案中，位点A片段A1和A2与IL-1Ra的对应片段具有至少80%同一性（共同地）。在一些实施方案中，位点B片段B1、B2和B3与IL-1β的对应片段具有至少80%同一性（共同地）。例如，位点A片段A1和A2与IL-1Ra的对应片段具有至少90%同一性（共同地）；而位点B片段B1、B2和B3与IL-1β的对应片段具有至少90%同一性（共同地）。例如，位点A片段A1和A2与IL-1Ra的对应片段相同；而位点B片段B1、B2和B3与IL-1β的对应片段相同。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11具有至少80%同一性（共同地）的序列以及与IL-1β的β链β4、β6、β7和β8具有至少80%同一性（共同地）的序列。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11相同的序列以及与IL-1β的β链β4、β6、β7和β8相同的序列。在一些实施方案中，得自IL-1β的上文确定的片段和特征衍生自IL-1α，或IL-1β或IL-1α的组合。
在一些实施方案中，该IL-1抑制剂包含以下性质的一种或多种（例如，至少2、3、4、5、6或7种）：(i)与IL-1β、IL-1α或IL-1Ra中的对应残基具有至少60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点A或位点B残基（和/或扩展位点A和扩展位点B残基）；(ii)与IL-1Ra中的对应残基共同地具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的A1和A2片段；(iii)与IL-1β或IL-1α中的对应残基共同地具有至少80%同一性的B1、B2和B3片段；(iv)与IL-1Ra中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点A区域；(v)与IL-1β或IL-1α中的对应残基具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点B区域；(vi)与IL-1Ra或IL36Ra中的对应残基具有至少50、60、70、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的位点C和/或位点D残基；(vii)与IL-1Ra中的对应残基具有至少70、75、80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的C1片段；(viii)在至少3、4或5个残基与IL-1Ra中的对应残基相同的D2片段。该细胞因子结构域不同于IL-1Ra，例如，该细胞因子结构域与IL-1Ra具有小于99、98、95、90、85、80、75、70、65、60%的同一性，和/或与IL-1Ra具有至少30、40、45、50、55、60、65、70%同一性，例如，与IL-1Ra具有40-95%、40-90%或45-85%同一性。在一些实施方案中，该细胞因子结构域不含与SEQ ID NO:3的氨基酸I46-G59、A55-G59、A55-V83、I60-V83、N84-D95、I46-S110、V49-S110或I46-G118具有大于80、85、90、95或100%的同一性的片段。在一些实施方案中，该细胞因子结构域不含与SEQ IDNO:1的氨基酸N7-V41、R11-M37、N102-D144或Y121-D144具有大于80、85、90、95或100%的同一性的片段。
在一些实施方案中，该抑制剂以小于100、50、20、10、5或1nM的KD与IL-1RI结合。在一些实施方案中，该抑制剂以相比于IL-1β或IL-1Ra更高的亲和力（例如，更低的KD）和/或更慢的解离速率与IL-1RI结合。
在一些实施方案中，该抑制剂在接触IL-1β反应性人细胞时不实质上诱导IL-6表达。一般来讲，该抑制剂以小于100、50、20、10或5nM的IC50抑制IL-1β的信号转导。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含以下序列中的一者、两者、三者或更多者：WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV(SEQ ID NO:9)；
NLEEK(SEQ ID NO:10)；
RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK(SEQ ID NO:11)；
AMEADQP(SEQ ID NO:12)；
FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY(SEQ ID NO:13)；和/或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含以下序列中的一者、两者、三者或更多者：VQGEESNDKI(SEQ ID NO:14)；KKKMEKRF(SEQ ID NO:15)和FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES(SEQ ID NO:16)；和/或与前述序列具有至少80、85、88、90、92、95、98或100%同一性的序列。该抑制剂可包含本文所述的其他特征。
在另一方面，本公开提供分离的蛋白质，其包含与本文所公开的序列具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或100%同一性的氨基酸序列，例如，表4和实施例1中所列的序列，例如，P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列，或实施例1、5、6或本文其他地方的序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列包含至少一个取代、插入或缺失。该氨基酸序列可包含少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个非保守取代或少于15、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个总取代。该氨基酸序列可包含至少1、2、3、4或5个取代，例如保守取代。
本发明还提供包含N端甲硫氨酸到P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列或实施例1、5、6或本文其他地方的序列的分离蛋白质，以及包含P01、P02、P03、P04、P05、P06或P07的氨基酸序列或实施例1、5、6或本文其他地方的序列（其中不存在N端丙氨酸）的分离蛋白质。前述序列可包含本文所公开的其他特征。例如，该序列可进一步包含标记，诸如六组氨酸序列，例如，在相对于IL-1RI结合序列的N或C端。该序列可进一步包含改变IL-1RI结合序列的稳定性或药动学的部分。对于该序列而言，可进一步包含血清白蛋白和/或Fc结构域，或其一个或多个结构域，例如，一个或多个免疫球蛋白恒定结构域或一个或多个白蛋白结构域。该蛋白质可具有本文所述的其他特征。在一些实施方案中，该分离的蛋白质由本文所公开的序列或嵌合结构域组成或基本上由其组成。
在另一方面，本公开提供分离的蛋白质，其包含的结构域具有本文所述的细胞因子结构域的循环排列形式，例如，表4中所列的细胞因子结构域和/或包含SEQ ID NO:3的结构域。该蛋白质可进一步在该排列形式的N或C端包含异源序列（诸如Fc结构域或白蛋白），其任选地通过接头隔开。该蛋白质可具有本文所述的其他特征。
本公开的特征还在于包含本文所述的一种或多种受体结合剂（诸如包含嵌合细胞因子结构域的蛋白质）的药物组合物。该组合物可以为眼科药物组合物、局部用组合物或用于肠胃外施用的组合物。
在另一方面，本公开的特征在于调节受试者免疫或炎性反应的方法。该方法可包括以有效调节受试者免疫或炎性反应的量向该受试者施用包含本文所述的受体结合剂的组合物。
在另一方面，本公开的特征在于治疗受试者的IL-1介导的疾病的方法。该方法包括向受试者施用包含可与IL-1RI结合的蛋白质（例如本文所述的受体结合剂）的组合物。例如，该疾病可以是自身免疫疾病，如类风湿性关节炎或幼年型慢性关节炎、硬皮病、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、强直性脊柱炎、白塞氏综合征(Behcet’s syndrome)、炎性肠病、哮喘、血管炎或牛皮癣。该疾病可以是与聚集体形成相关的疾病，例如高尿酸血症、痛风、糖尿病（包括非胰岛素依赖型糖尿病）、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、继发型反应性淀粉样变性、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨丁顿舞蹈症或帕金森病。该疾病还可以是CAPS（CIAS1相关周期综合征）疾病或本文所述的其他疾病。
在另一方面，本公开的特征在于治疗受试者的IL-1介导的眼部疾病的方法。该方法可包括向受试者施用包含可与IL-1RI结合的蛋白质（例如本文所述的受体结合剂）的组合物。例如，该组合物是局部施用到受试者眼睛或周围区域的眼科组合物。在一个实施方案中，该疾病是干眼病。在一些实施方案中，该受试者无全身性自身免疫疾病的表现。在一些实施方案中，该受试者患有舍格伦综合征。在一些实施方案中，该受试者患有移植物抗宿主病(GVHD)。在其他实施方案中，该疾病为葡萄膜炎。
在另一方面，本公开的特征在于抑制IL-1活性的方法。该方法包括使可与IL-1RI结合的受体结合剂接触对IL-1有反应的细胞或接触受试者。一般而言，该蛋白质以有效抑制与细胞相关的或受试者中的IL-1活性的量提供。可使该蛋白质在体外接触来自受试者的细胞。
在另一方面，本公开的特征在于分离的核酸，其包含编码本文所述的蛋白质的一个或多个序列或本文所公开的核酸（例如，见表5），与此类核酸杂交或与此类核酸具有80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或100%同一性的序列。示例性杂交序列的长度可为至少200、300、400、420或450个核苷酸，例如，长度为420-480个核苷酸。该核酸还可以包含本文所公开的其他特征。
本发明的特征还在于重组宿主细胞，其包含的核酸包含编码本文所述的蛋白质及其多肽链的一个或多个序列。可以通过以下方法产生受体结合剂，该方法包括：将宿主细胞维持在允许受体结合剂表达的条件下，以及任选地（例如）从细胞或与宿主细胞相关的培养基中回收受体结合剂。例如，受体结合剂可从细胞裂解物中纯化。纯化的受体结合剂可（例如）与赋形剂、稳定剂和缓冲剂的一者或多者一起配制。
本发明的特征还在于提供嵌合蛋白结构域的方法。该方法包括：鉴定具有共同折叠的至少两种亲本蛋白（例如，第一亲本蛋白和第二亲本蛋白），定位第一亲本蛋白内的至少两个片段，以及构建核酸，该核酸具有编码嵌合氨基酸序列的序列，该嵌合氨基酸序列包含来自第一亲本蛋白的两个片段以及在其余位置大部分来自第二亲本蛋白的残基。该结构域可以为主要由β折叠组成的结构域，或主要由α螺旋组成的结构域，或具有此类元件的组合的结构域。例如，该结构域可具有细胞因子的折叠。该第一和第二亲本蛋白可通过同源性而相关，例如10-40%的氨基酸同一性。在一些实施方案中，来自第一蛋白的所述片段位于单个折叠蛋白结构域内，并且所述嵌合氨基酸序列包含与第一和第二亲本蛋白中的对应结构域不同的折叠蛋白结构域的一种形式。在一些实施方案中，所述两种亲本蛋白具有不同的功能特性，并且所述嵌合结构域可具有所述亲本蛋白的一者或两者的特性。在一些实施方案中，所述嵌合结构域具有一个来自第一亲本蛋白的结合界面以及另一个来自第二亲本蛋白的结合界面。
本文提及了IL-1家族细胞因子中关于位点A、B、C和D的各种区域、片段和残基。此类残基、片段和区域在人IL-1β(SEQ ID NO:1)序列中的定位以及对应位置在下文和图1中提供：
位点A.IL-1β中的位点A残基包括：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、SER21、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLU128、ASN129和MET130以及其他IL1细胞因子家族成员的对应残基（本文称为“位点A残基”）。在某些情况下，尤其是与IL-1β有关，提及了包括位点A残基以及GLN149与PHE150和其他IL1细胞因子家族成员的对应残基的“扩展位点A残基”。此外，可以定义如图4所示的“位点A区域”，包括（例如）A1片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第11-36位）和A2片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第125-131位）以及其他IL1细胞因子家族成员中的对应片段。
位点B.IL-1β中的位点B残基包括：ALA1、PRO2、ARG4、GLN48、GLU51、ASN53、ILE56、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105和ASN108，以及其他IL1细胞因子家族成员的对应残基（本文称为“位点B残基”）。在某些情况下，尤其是与IL-1β有关，提及了包括位点B残基以及在图4位点B区域之外的PHE46和SER152的“扩展位点B残基”。此外，可以定义如图4所示的“位点B区域”，包括（例如）B1片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第1-5位）、B2片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第48-56位）和B3片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第92-98位）以及其他IL1细胞因子家族成员中的对应片段。
位点C.IL-1β中的位点C残基包括：ILE104、ILE106、ASN107、LYS109、GLU111、THR137、LYS138、GLY139、GLY140、GLN141、THR144和ASP145以及其他IL1细胞因子家族成员的对应残基（本文称为“位点C残基”）。此外，可以定义如图4所示的“位点C区域”，包括（例如）C1片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第136-145位）以及其他IL1细胞因子家族成员中的对应片段。
位点D.IL-1β中的位点D残基包括：LEU6、THR9、LYS63、GLU64、LYS65和ASN66及其他IL1细胞因子家族成员的对应残基（本文称为“位点D残基”）。此外，可以定义如图4所示的“位点D区域”，包括（例如）D1片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第6-9位）、D2片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第37-41位）和D3片段（在IL-1β中对应于SEQ IDNO:1的第63-66位）、D4片段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第86-91位）和D5段（在IL-1β中对应于SEQ ID NO:1的第150-153位）以及其他IL1细胞因子家族成员中对应片段。
可通过将所考虑的细胞因子与图4所示的序列进行比对来获得对位点A、B、C与D的残基和区域的定位的进一步鉴定。
如本文所提及的IL-1β（人）的氨基酸序列为：APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAEMMFVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS(SEQIDNO：1)。
如本文所提及的IL-1α（人）的氨基酸序列为：SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA(SEQ ID NO:2)。
如本文所提及的IL-1Ra（人）的氨基酸序列为：RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED(SEQ ID NO：3)。如本文所用的术语IL-1β、IL-1α和IL-1Ra是指各自的成熟蛋白质。
本文提及的以及如图4所示的β折叠是指以下序列：
表1
Figure BDA00002991618700161
两序列之间的“同源性”或“序列同一性”（这些术语在本文可互换使用）的计算按如下方式进行。序列根据本文提供的比对法加以比对，或者在没有适当的比对法的情况下，将最佳比对确定为使用Needleman和Wunsch算法所得的最高分，如以空位罚分10和空位延伸罚分1使用Blosum62评分矩阵在EMBOSS软件包的Needle算法中执行。参见Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453；Kruskal,J.B.(1983)An overview ofsequence comparison In D.Sankoff and J.B.Kruskal,(编著),Time warps,stringedits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,1-44页Addison Wesleytools；以及可得自European Bioinformatics Institute(Cambridge UK)的工具EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite(2000)(Rice,P.等,A.,Trends in Genetics16,(6)276—277页)并可通过http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html andhttp://emboss.open-bio.org/wiki/Appdoc:Needle在线获得。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的某一位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置相同（如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”）。两序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置数的函数。要确定所关注的一个序列与参考序列组的集体同一性，如果某一位置与所述参考序列组任何一个或多个序列中对应位置处的至少一个氨基酸相同，则将该位置视为相同的。至于片段、特征或区域的列表，可以共同地计算此列表所有成员的同一性，以得到总体百分比同一性。
本文提供与本文所公开的序列具有至少80、82、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列。
如本文所用，术语“对应于”用于表示氨基酸残基在所关注的多肽中相对于参考多肽的位置。一般来讲，该位置为通过本文所提供的比对法（例如，图4）指示的位置。
如本文所用，术语“在高严格条件下杂交”描述用于杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6，该文献以引用方式并入。含水和不含水的方法在该参考文献中有所描述，并且任一者均可使用。高严格杂交条件包括于约45℃下在6X SSC中杂交，然后于65℃下在0.2X SSC，0.1%SDS中进行一次或多次洗涤，或基本上类似的条件。本文提供分离的核酸，它们包含的序列在高严格条件下与编码本文所公开的氨基酸序列的核酸杂交以及与本文所公开的核酸杂交，例如，实施例1中。
本文提及的天然存在的蛋白质特别包括此类蛋白质的人源形式，也包括来源于其他哺乳动物物种的形式。
本文所引用的所有专利、已公布的专利申请和发表的参考文献以引用方式并入用于所有目的。
附图简述
图1是通过X射线晶体学数据确定的P04的结构图。来自IL-1Ra的残基的主链以黑色显示，而来自IL-1β的残基的主链以灰色显示。
图2示出了与人IL-1RI胞外结构域结合的P05蛋白的模型的三个视图。在P05中，IL-1Ra残基以黑色示出，而IL-1β残基以白色示出。
图3示出了嵌合蛋白的模型，其中IL-1Ra残基以黑色示出，而IL-1β残基以白色示出。该模型示出了以下蛋白质：P01（图3A）、P03（图3B）、P04（图3C）、P05（图3D）、P07（图3E）和P06（图3F）。
图4提供以下多个人IL-1家族细胞因子的比对：IL-1β(SEQ ID NO:1)、IL-1α(SEQ ID NO:2)、IL-1Ra(SEQ ID NO:3)、IL-33(SEQ ID NO:4)、IL-36Ra(SEQ ID NO:5)、IL-36α(SEQ ID NO:6)、IL-36β(SEQ ID NO:7)和IL-36γ(SEQID NO:8)。在本文的上下文中提及的片段在比对下鉴定。此外，鉴定了β折叠和此类折叠之间的环。
图5A是P01的氨基酸序列的列表(SEQ ID NO:17)。图5B是P02的氨基酸序列的列表(SEQ ID NO:18)。图5C是P03的氨基酸序列的列表(SEQ IDNO:19)。图5D是P04的氨基酸序列的列表(SEQ ID NO:20)。图5E是P05的氨基酸序列的列表(SEQ ID NO:21)。来自IL-1β的片段以粗斜体显示。另见下文的实施例1。
图6是SDS-PAGE凝胶的图像，显示了从表达受体结合剂的大肠杆菌(E.coli)细胞纯化的蛋白质的示例性实例。在左侧指明了15和20kDa分子量标准。泳道如下：分子量标准（泳道1和6）、提取物（泳道2和7）、由阳离子交换层析纯化的材料（泳道3和8）、由阴离子交换层析另外纯化的材料（泳道4和9）以及此类材料的还原样本（泳道5和10）。泳道2-5为P05纯化，以及泳道6-10为P04纯化。另见实施例2。
图7A为表格及随附的条形图，显示了P06、P07和P01蛋白相对于IL-1β和阴性对照β-葡糖醛酸酶(GUS)蛋白激动信号转导的能力。图7B为曲线图，显示了在多种IL-1β浓度下P01对IL-1β的拮抗作用。
图8A为曲线图，显示了在存在0.1ng/ml IL-1β（人）的情况下P03（六组氨酸标记的）、P04（六组氨酸标记的）、P05（六组氨酸标记的）和IL-1Ra对IL-1β的拮抗作用。图8B是曲线图，显示了在存在0.1ng/ml IL-1β（人）的情况下含有未标记形式的P01、P02、P03、P04和P05以及IL-1Ra的裂解物对IL-1β的拮抗作用，并使用相应裂解物中蛋白质浓度的估计值。
图9包含SPR数据的曲线图，显示了以下蛋白质对固定化可溶IL-1RI的结合动力学：IL-1β（图9A）、IL-1Ra（图9B）、P04（图9C）和P05（图9D）。
图10A为曲线图，显示了如实施例7中所述的IL-1Ra、IL-1β、P03、P04和P05的热变性。图10B显示了图10A中的曲线图的负一阶导数。
图11A为条形图，显示了平均角膜染色评分±SEM，测试方法为在小鼠干眼模型中在第0、3、7、9和11天时通过两项独立研究对每只眼的角膜进行荧光素染色。小鼠不接受处理(n=18)，接受10mg/ml P05(n=19)或接受1.25×PBS即媒介物(n=20)。星号表示P05相对于媒介物的统计显著性，具体如下：*(P<0.05)和**(P<0.005)。
图11B为条形图，代表了来自独立实验的数据，显示了在小鼠干眼模型中在第0、3、7、9和11天时每只眼角膜的平均角膜染色评分±SEM。小鼠不接受处理(n=8)，接受1.25×PBS媒介物(n=8)，接受10mg/ml鼠血清白蛋白(MSA)(n=8)或10mg/ml P05(n=9)。星号表示P05相对于小鼠血清白蛋白的统计显著性，具体如下：*(P<0.05)和***(P<0.0005)。
图11C为条形图，包括在与图11B相同的实验中用
Figure BDA00002991618700191
（0.05%环孢霉素乳液）(n=8)处理的小鼠的数据。星号表示P05相对于
Figure BDA00002991618700192
的统计显著性，具体如下：**(P<0.005)和***(P<0.0005)。
图12A显示了P04的X射线晶体学结构（黑色）重叠在其结构的计算模型（灰色）上的结构。图12B示出了P04的K64与E39之间的相互作用；图12C示出了P04的C端残基Q149和S152与K40和R9之间的相互作用。
发明详述
细胞因子的IL-1家族包括多个成员，它们都具有共同的由六条β链构成的β三叶草折叠，这六条链形成β桶状结构，再由另外六条β链封端。这些细胞因子的人和其他哺乳动物形式的一级结构是已知的。多种人IL-1家族成员的示例性结构比对在图1中示出。
我们已特别发现IL-1折叠为高塑性的。具体地讲，来自不同成员的元件可加以结合以提供激动或拮抗细胞因子信号转导的蛋白质。这些蛋白质的实例包括嵌合细胞因子结构域，它们包含（例如）在另一细胞因子或细胞因子共有序列的情况下来自一种细胞因子的两个或更多个片段或表面残基，从而形成来自不同IL-1家族细胞因子的受体相互作用位点的非天然存在的组合。
IL-1家族细胞因子可包含至少两个主要受体相互作用位点，称为位点A和位点B。位点A和B参与与主要细胞因子受体（例如，IL-1RI）的接触。就IL-1Ra和IL-1β而言，例如，这两种蛋白质在位点A和B方面实质上不同，使得IL-1Ra在位点B比位点A的受体接触更少。
我们已经发现，可能构建包含衍生自一种细胞因子的位点A以及衍生自另一种细胞因子的位点B的功能性嵌合细胞因子结构域。IL-1折叠的塑性允许构建多种嵌合细胞因子结构域以拮抗IL-1信号转导。
此外，IL-1家族细胞因子可包含两个第二受体相互作用位点，称为位点C和位点D，它们参与激动和/或拮抗作用，并可决定细胞因子与其第二细胞因子受体（例如，IL-1RAcP）之间相互作用的能力。包含来自天然受体拮抗剂（诸如IL-1Ra）的位点C和/或位点D残基可赋予拮抗特性。可以构建包含以下部分的嵌合细胞因子结构域：来自一种或多种IL-1激动剂（诸如IL-1β和IL-1α）和/或一种IL-1受体拮抗剂（诸如IL-1Ra）的位点A和B之一或两者，以及来自一种IL-1受体拮抗剂（诸如IL-1Ra）的位点C和D之一或两者。因此，可能产生拮抗信号转导并包含来自IL-1激动剂的位点B残基的嵌合细胞因子结构域。
示例性组合还在下表2中提供：
表2
A B C D
1. IL-1β或1α IL-1β或1α IL-1Ra IL-1β或1α
2. IL-1β或1α IL-1β或1α IL-1β或1α IL-1Ra
3. IL-1β或1α IL-1β或1α IL-1Ra IL-1Ra
4. IL-1Ra IL-1β或1α IL-1Ra IL-1β或1α
5. IL-1Ra IL-1β或1α IL-1β或1α IL-1Ra
6. IL-1Ra IL-1β或1α IL-1Ra IL-1Ra
源序列可与已鉴定的细胞因子结构域的人序列相同或可包含相对于人序列的突变，例如，使得它们在各相应区域中与人序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高程度同一性，例如，它们可包含来自每个区域的一个或多个片段。
可选择位点A残基和位点B残基的来源以最大化对主要受体的亲和力。例如，为了结合IL-1RI，位点A残基可衍生自IL-1Ra，并且位点B残基可衍生自IL-1β。
嵌合细胞因子结构域可具有以小于10-8、10-9或10-10的KD值，例如在相同条件下在天然受体配体（例如，IL-1β、IL-1α或IL-1Ra）的10倍或100倍内的或在相同条件小于天然配体（例如，IL-1β、IL-1α或IL-1Ra）的KD值，结合IL-1家族受体（例如，人IL-1RI）的能力。此外，在某些实施方案中，该嵌合细胞因子结构域以小于其亲本细胞因子结构域的至少一者的KD值、快于其亲本细胞因子结构域的至少一者的Kon值或慢于其亲本细胞因子结构域的至少一者的Koff值结合。
与IL-1家族受体结合并拮抗受体信号转导的嵌合细胞因子结构域可用作受体结合剂，例如，以治疗如下所述由IL-1家族细胞因子信号转导介导的疾病。例如，在一些实施方案中，该嵌合细胞因子结构域与IL-1RI结合并拮抗IL-1信号转导。例如，它具有小于100、10、1、0.6或0.3nM的IC50。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域可以与第一IL-1家族细胞因子结构域具有至少40、45或50%同一性，但不完全相同，例如，具有小于95、90、85或80%同一性。同时，该细胞因子结构域也可以与第二IL-1家族细胞因子结构域具有至少40、45或50%同一性，但不完全相同，例如，小于95、90、85或80%同一性。第一和第二IL-1家族细胞因子结构域可彼此具有小于50%的同一性。例如，第一IL-1家族细胞因子结构域可以为激动剂（例如，IL-1β或IL-1α），而第二IL-1家族细胞因子结构域可以为受体拮抗剂（例如，IL-1Ra）。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域内至少80、85、90、92、94、95、97、98、99或100%的位置具有以下特性，在每个这样的位置处，存在的氨基酸与第一IL-1家族细胞因子结构域或与第二IL-1家族细胞因子结构域相同（或者如果第一和第二IL-1家族细胞因子在该特定位置处相同，则与它们都相同）。如果细胞因子结构域中100%的氨基酸位置均具有该特性，则则该结构域为两种细胞因子的完整嵌合体。嵌合细胞因子结构域也可由不止两种细胞因子制成，并且还可具有相对于其亲本细胞因子的突变（例如，其中存在的氨基酸不同于其亲本细胞因子每一个中的对应氨基酸的一个或多个特定位置）。
细胞因子结构域可具有来自不同IL-1细胞因子结构域的位点A、B、C和D残基，并且同样地可具有来自不同IL-1细胞因子结构域的位点A、B、C和D区域。
位点A.例如，在某些实施方案中，细胞因子结构域包含：在上文鉴定的位点A残基的至少5、10、12、15、16、17或18个处，或上文鉴定的扩展位点A残基的至少5、10、12、15、16、17、18、19或20个处来自受体拮抗剂（例如，IL-1Ra）或激动剂的残基，或此类残基的保守取代，或此类残基的至少50、65、75、80、90、95或100%。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与受体拮抗剂（例如，IL-1Ra）或激动剂（例如，IL-1β或IL-1α）中的片段A1、A2或A1+A2具有至少70、75、80、85、88、90、92、95或100%同一性的残基。
在某些实施方案中，细胞因子结构域包含：在本文鉴定的位点A残基的至少5、10、12、15、16、17或18个处，或上文鉴定的扩展位点A残基的至少5、10、12、15、16、17或18个处与IL-1激动剂（例如，IL-1β残基）相同的残基，或此类残基的保守取代，或此类残基的至少50、65、75、80、90、95或100%。
位点B.在某些实施方案中，细胞因子结构域包含：在本文鉴定的位点B残基的至少2、3、5、8、9、10、11、12、13、14或15个处与IL-1激动剂（例如，IL-1β或IL-1α残基）相同的残基，或此类残基的保守取代，或此类残基的至少50、65、75、80、90、95或100%。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与IL-1细胞因子激动剂（例如，IL-1β或IL-1α）中的片段B1、B2、B3、B1+B2、B1+B3、B2+B3或B1+B2+B3具有至少70、75、80、85、88、90、92、95或100%同一性的残基。
位点C.在某些实施方案中，细胞因子结构域包含：在本文鉴定的位点C残基的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个处与受体拮抗剂（例如，IL-1Ra残基）相同的残基，或此类残基的保守取代，或此类残基的至少50、65、75、80、90或100%。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与受体拮抗剂（例如，IL-1Ra）中的片段C1具有至少50、65、75、80、90或100%同一性的残基。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域可包含（例如）以下一者或多者：在对应于SEQ ID NO:1的THR137的位置处的疏水氨基酸（例如，Met或Ile）；在对应于SEQ ID NO:1的GLN141的位置处的疏水如脂族氨基酸（例如，Val或Ile）；和在对应于SEQ ID NO:1的ASP145的位置处的非酸性氨基酸诸如碱性氨基酸（例如，Lys或Arg），以及在其他IL-1细胞因子中对应位置处的此类残基。有证据表明，Asp145对于IL-1RAcP的募集具有重要意义，并且应此，非酸性残基的突变破坏激动剂活性并可用于赋予拮抗特性。因此，在某些实施方案中，非酸性氨基酸诸如碱性氨基酸（例如，Lys或Arg）或疏水氨基酸位于对应于SEQ ID NO:1的ASP145的位置处。
位点D.在某些实施方案中，细胞因子结构域包含：在本文鉴定的位点D残基的至少1、2、3、4、5或6个处与受体拮抗剂（例如，IL-1Ra残基）相同的残基，或此类残基的保守取代，或此类残基的至少50、65、75、80、90、95或100%。在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含与受体拮抗剂（例如，IL-1Ra）中的片段D1、D2、D3、D4、D5、D1+D2、D1+D2+D3以及它们的组合具有至少50、65、75、80、90、95或100%同一性的残基。
IL-1β中的多个残基与IL-1RI接触或靠近，例如：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、ALA127、GLU128、ASN129、MET130、GLN141、GLN149、PHE150和SER152。除了如上所述在位点中的命名外，还可以将这些残基归为两组：第1组和第2组。
IL-1β中的示例性第1组残基包括：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130和GLN141以及其他IL-1细胞因子家族成员中的对应残基。扩展第1组残基包括：相互作用第1组残基，以及1ITB结构中前述残基4埃内的残基。IL-1β中的示例性第2组残基包括：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152以及其他IL-1细胞因子家族成员中的对应残基。扩展第2组残基包括：相互作用第2组残基，以及1ITB结构中前述残基4埃内的残基。在某些实施方案中，细胞因子结构域在上文鉴定的第1组残基的至少15、16、17、18、19、20或21个处包含IL-1β残基。在某些实施方案中，细胞因子结构域在上文鉴定的第2组残基的至少15、16、17、18、19、20、21或22个处包含IL-1β残基。在一些实施方案中，细胞因子结构域在扩展第1组残基的至少15、16、17、18、19、20或21个处包含IL-1β残基。在一些实施方案中，细胞因子结构域在扩展第2组残基的至少15、16、17、18、19、20或21个处包含IL-1β残基。
可用作受体结合剂的其他变体包括具有衍生自两种或更多种IL-1细胞因子家族成员的序列的蛋白质。此类变体的实例包括基于IL-1β和IL-1Ra的嵌合结构域。例如，这些变体可包含来自IL-1Ra的第1组的一个或多个氨基酸残基（例如，来自IL-1Ra的所有第1组残基）以及来自IL-1β的第2组的一个或多个氨基酸残基（例如，来自IL-1β的所有第2组残基）。
示例性嵌合蛋白在以下氨基酸位置大部分（例如，至少50、60、70、75、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97、98、99或100%）与IL-1β相同（即，基于与IL-1β中的这些位置的对应性）：SEQ ID NO:1的第1-8、42-120和141-153位残基；SEQ ID NO:1的第1-6、45-61、86-95和148-153位残基；以及SEQ ID NO:1的第1-10、37-125和131-153位残基。
其余的残基可大部分（例如，至少50、60、70、75、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97、98、99或100%）与IL-1Ra相同。例如，以下氨基酸位置可大部分与IL-1Ra相同：SEQ ID NO:1的第9-41和121-140位残基；SEQ ID NO:1的第7-44、62-85和96-147位残基；以及SEQ ID NO:1的第11-36和126-130位残基。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域除了IL-1β的氨基酸位置Gln48–Asn53外还在至少2、4、5、10或20个位置处与IL-1β相同，并且（例如）该细胞因子结构域大部分（例如，至少50、60、70、75、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、97、98、99或100%）与非IL-1β的细胞因子相同。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第1-8位的位置处包含与IL-1β相同的至少3、4、5、6、7或8个残基。例如，它在对应于以下3、4或所有5者的位置处包含与IL-1β相同的残基：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4和LEU6。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第45-61位的位置处包含与IL-1β相同的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个残基。例如，它在对应于以下3、4、5、6、7或8者的位置处包含与IL-1β相同的残基：PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56和PRO57。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第86-95位的位置处包含与IL-1β相同的至少5、6、7、8、9或10个残基。例如，它在对应于以下1、2或所有3者的位置处包含与IL-1β相同的残基：LYS92、LYS93和LYS94。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第148-153位的位置处包含与IL-1β相同的至少3、4、5或6个残基。例如，它在对应于以下1、2或所有3者的位置处包含与IL-1β相同的残基：GLN149、PHE150和SER152。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于IL-1β中THR147的位置处不含苏氨酸。例如，该位置可以为芳族氨基酸，诸如酪氨酸。在对应于IL-1β中THR147的位置处的芳族氨基酸可以靠着在多个实施方案中在第11位处（根据IL-1β编号）存在的另一芳族氨基酸（例如，色氨酸）而堆积。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于IL-1β中CYS8的位置处不含芳族氨基酸。例如，该位置可以为非苯丙氨酸或非芳族氨基酸的氨基酸。例如，它可以为半胱氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸。该位置位于其他大残基尤其是MET44和MET148（根据IL-1β编号）附近。优选地，第8、43和148位三个位置不全是大残基。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第30-36位的位置处包含与IL-1Ra相同的至少5、6或7个残基，例如，与YLQGPNV(SEQ ID NO:43)相同的至少5、6或7个残基。例如，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第11-36位的位置处包含与IL-1Ra相同的至少10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25或26个残基。该细胞因子结构域还可以在对应于SEQ ID NO:1的第145位的位置处包含碱性残基。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域包含：(a)在对应于IL-1β的Val40的位置处的谷氨酸以及在对应于IL-1β的Lys65的位置处的赖氨酸；(b)在对应于IL-1β的Thr9的位置处的精氨酸以及在对应于IL-1β的Gln149的位置处的谷氨酰胺；和/或(c)在对应于IL-1β的V41的位置处的赖氨酸以及在对应于IL-1β的Ser152的位置处的丝氨酸。
该细胞因子结构域还可以包含在对应于第126-132位的位置处与IL-1Ra相同的至少4、5、6或7个残基，例如，与MEADQPVS(SEQ ID NO:44)相同的至少4、5、6或7个残基。
在某些实施方案中，该细胞因子结构域在对应于SEQ ID NO:1的第62-85位的位置处包含与IL-1β相同的至少10、12、14、16、18、19、20、21、22、23或24个残基。
在一些实施方案中，该细胞因子结构域包含以下氨基酸序列的一者或多者（例如，所有四者）：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、IDVSFV(SEQ ID NO:46)、KKMDKR(SEQ ID NO:47)和KFYMQF(SEQ ID NO:48)；以下氨基酸序列的一者或多者（例如，所有四者）：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、IDVSFV(SEQ IDNO:46)、NKLSFE(SEQ ID NO:49)和KFYMQF(SEQ ID NO:48)；以下氨基酸序列的一者或多者（例如，所有四者）：RSLAFR(SEQ ID NO:45)、EEKFSM(SEQ ID NO:50)、RFVFIR(SEQ ID NO:51)和VTKFTM(SEQ ID NO:52)；以下氨基酸序列的一者或多者（例如，所有四者）：RSLAFR(SEQ ID NO:45)，EEKFSM(SEQ ID NO:50)，FESAAC(SEQ ID NO:53)和VTKFTM(SEQ IDNO:54)；或以下氨基酸序列的一者或多者（例如，所有四者）：LNCRIW(SEQID NO:55)，EEKFSM(SEQ ID NO:50)，PNWFLC(SEQ ID NO:56)和KFYMQF(SEQ ID NO:48)。
嵌合蛋白可用于多种目的。例如，它们可用于提高或降低受体信号转导活性，以检测表达受体的细胞，或纯化它们与之结合的细胞或蛋白质。
基于IL-1β和IL-Ra的嵌合细胞因子结构域的具体实例在下文的实施例1中提供，并包括拮抗IL-1信号转导的以下示例性细胞因子结构域：
P01.P01结构域包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Val48、Ile60-Val83和Asp95-Tyr147的来自IL-1Ra的三个片段，以及来自IL-1β的其余四个片段。总体而言，P01结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的74个（约48%的同一性）以及来自IL-1Ra的119个氨基酸（约77%的同一性）。这些百分比加起来大于100%，这是因为P01以及本文所公开的其他示例性蛋白质中的大量氨基酸为在IL-1β与IL-1Ra之间保守的氨基酸，并且并因此有助于IL-1β和IL-1Ra两者的百分比同一性。
P02.P02结构域包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Val48、Ile60-Val83和Ser110-Tyr147的来自IL-1Ra的三个片段，以及来自IL-1β的其余四个片段。总体而言，P02结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的85个（约55%的同一性）以及来自IL-1Ra的108个氨基酸（约70%的同一性）。
P03.P03结构域包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Lys45和Phe100-Lys145的来自IL-1Ra的两个片段，以及来自IL-1β的其余三个片段。总体而言，P03结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的94个（约61%的同一性）以及来自IL-1Ra的91个氨基酸（约64%的同一性）。
P04.P04结构域包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Ala12-Lys45和Ala114-Lys145的来自IL-1Ra的两个片段，以及来自IL-1β的其余三个片段。总体而言，P04结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的104个（约68%的同一性）以及来自IL-1Ra的89个氨基酸（约58%的同一性）。
P05.P05结构域包含对应于SEQ ID NO:3的氨基酸Arg14-Lys45和Phe120-Tyr147的来自IL-1Ra的两个片段，以及来自IL-1β的其余三个片段。总体而言，P05结构域具有来自IL-1β的153个氨基酸中的108个（约70%的同一性）以及来自IL-1Ra的85个氨基酸（约55%的同一性）。
可以类似地构建其他嵌合蛋白。例如，可以在IL-1α与IL-1Ra之间构建嵌合蛋白，例如，具体地讲，对于上文的各实例，包含与来自IL-1α而非IL-1β的对应残基相结合的IL-1Ra指定片段的结构域。
蛋白质修饰和取代
蛋白质序列（诸如本文所述的那些）可（例如）通过产生一个或多个保守取代而变化。可产生保守取代以保持功能或使功能发生适度的变化。示例性保守取代描述于下表：
表3
Figure BDA00002991618700271
可基于它们对以下方面的潜在影响选择取代：(a)邻近该取代的主链结构，例如折叠或螺旋构象，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积和支化。氨基酸残基可基于侧链性质而分类：(1)疏水：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；asn；gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响主链构象的残基：gly、pro；以及(6)芳族残基：trp、tyr、phe。
非保守取代可包括用这些分类中的一者的成员来取代不同分类中的成员。保守取代可包括用这些分类中的一者的成员来取代同一分类的另一成员。
特定残基的重要性也可在该氨基酸亲水性指数的情况下加以评估。已为各氨基酸基于其疏水性和电荷特性而指定了亲水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。有关亲水氨基酸指数及其重要性的讨论，参见（例如）：Kyte等,1982,J.Mol.Biol.157:105-131。
蛋白质序列可通过任何方法而改变，包括寡核苷酸介导的（定点）诱变（Carter等,Nucl.Acids Res.,13:4331,1986；Zoller等,Nucl.Acids Res.,10:6487,1987）、盒诱变(Wells等,Gene,34:315,1985)、限制性选择诱变(Wells等,Philos.Trans.R.Soc.London,317:415,1986)和PCR诱变。另见In VitroMutagenesis Protocols:第三版,Braman(编著),Humana Press,(2010)ISBN:1607616513以及PCR Cloning Protocols:From Molecular Cloning to GeneticEngineering,Chen和Janes(编著),Humana Press,(2002)ISBN:0896039730。
扫描氨基酸分析可用于沿着连续序列评价一个或多个氨基酸。该方法可涉及使某一区域中的每个或几乎每个氨基酸突变为特定氨基酸，例如，突变为相对小的中性氨基酸，诸如丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸。通常选择丙氨酸，这是因为它消除β碳之外的侧链，并且不太可能改变变体的主链构象(Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085,1989)。它还是最常见的氨基酸，并常常存在于包埋和暴露的位置(Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.,150:1,1976)。该扫描方法也可适合于产生更明显的变化，例如，可使带电荷的残基变为带相反电荷的残基，可将具有短侧链的残基用具有大侧链的残基替换。例如，精氨酸扫描是一种除了丙氨酸扫描之外或代替丙氨酸扫描而可使用的方法。扫描可应用于某一区域内的每个残基或应用于具有特定性质的残基，例如，在蛋白质表面处或附近的残基，或可能在蛋白质表面处或附近的残基。
可对蛋白质的结构、其结构域中的一者或涉及该蛋白质的复合体建模，例如通过进行基于同源性的建模、能量最小化和/或其他利用已知的已解出结构的建模。此类方法包括：Accelrys Software Inc.,Discovery 
Figure BDA00002991618700291
,Release3.0,San Diego:Accelrys Software Inc.,2010；AMBERTM建模软件（Case等(2005)J.Computat.Chem.26,1668-1688和Case等(2010),AMBER11,University of California,San Francisco,CA USA）以及CHARMMTM建模软件(Molecular Simulations Inc.)。另外一般可参见Baker和Sali,Science294(5540):93-6,2001)。结构也可直接测定，例如，使用X射线晶体学和/或NMR光谱学。
描述IL-1家族细胞因子的结构的示例性PDB结构包括：1I1B、1ILR、1IRA、1ITB、2I1B、2ILA、2KLL、4I1B、5I1B、6I1B、7I1B、8I1B、9ILB和1MD6（通过RCSB-Rutgers,Piscataway NJ,USA的网站www.pdb.org获得，以及通过National Library of Medicine(Bethesda,MD,USA)获得）。例如，已经解出了仅有IL-1β时以及与受体IL-1RI复合时的结构。参见（例如）Finzel等(1989)J.Mol.Biol.209:779-791,PDB1ITB和Vigers等(1997)Nature386:190-194。IL-1Ra与IL-1RI一起的结构也已解出。参见（例如）PDB1IRA和chreuder等，(1997)Nature386:194-200。
同源性建模可通过序列的比对来协助，例如使用计算机软件，诸如BasicLocal Alignment Search Tool(BLAST)、PSI-BLAST、PHI-BLAST、WU-BLAST-2和/或MEGABLAST。参见Altschul等，1990,J.Mol.Biol.215,403-410；Altschul等，1996,Methods in Enzymology266,460-480；和Karlin等，1993,PNAS USA90,5873-5787。另外的用于大分子（氨基酸序列和核酸序列）比对的算法包括FASTA(Pearson,1995,Protein Science4,1145-1160),ClustalW(Higgin等，1996,Methods Enzymol.266,383-402)、DbClustal(Thompson等，2000,Nucl.Acids Res.28,2910-2926)和Molecular OperatingEnvironment(Chemical Computing Group,Montreal,Quebec Canada H3A2R7)。此外，可以使用并入到GCG序列比对软件包的ALIGN程序（2.0版）中的Myers和Miller算法(Myers&Miller,CABIOS4,11-17,1988)。
IL-1β和IL-1Ra的共有序列可通过将这两个序列进行比较并鉴定相同的或高度保守的残基而获得。本文所述的嵌合细胞因子结构域可具有此类相同残基或高度保守残基的至少60、70、80、90、95或100%。示例性共有序列为：
DXXQKX{8-9}L-AXXLQGX{18-28}LGX{7}LSCVXXXDXXXLQLEXVX{8-9}KXXKRFXFX{10}FESAXXPXWXXXTXXXXXXPVXLX{5-6}GXXXTXFXXQ(SEQID NO:57)，其中X独立地为任何氨基酸而下标数字或范围为出现次数。本文所述的嵌合细胞因子结构域可具有与该共有序列至少60、70、80、90、95或100%的同一性（其中X残基不计入同一性）。其他共有序列可同样地确定。
可制备IL-1细胞因子家族成员另外的变体，并使用基于展示的系统或其他基于文库的筛选进行评价。例如，可使这些蛋白质变体展示或表达，并评估与IL-1细胞因子家族成员受体结合的能力。例如，可评价本文所述的IL-1β、IL-1Ra或细胞因子结构域的变体与IL-1RI的可溶性胞外域结合的能力。基于展示的系统的一般性描述包括以下：对于细胞展示，Chao等NatProtoc.2006;1(2):755-68；Colby等Methods Enzymol.2004;388:348-58；Boder等，Methods Enzymol.2000;328:430-44)；对于噬菌体展示（例如，Viti等，Methods Enzymol.2000;326:480-505和Smith(1985)Science228:1315-1317）以及对于核糖体展示（例如，Mattheakis等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:9022和Hanes等(2000)Nat Biotechnol.18:1287-92；Hanes等(2000)Methods Enzymol.328:404-30；以及Schaffitzel等(1999)J Immunol Methods.231(1-2):119-3）。
虽然本文的许多实施方案使用人IL-1细胞因子序列作为亲本结构域而示例性示出，但可以使用其他序列。许多其他IL-1细胞因子（例如，来自其他物种）是已知的且可获得的，并可见于公共数据库，诸如Entrez(theNational Library of Medicine,Bethesda MD)和EBI-EMBL(Hinxton,CambridgeUK)。得自UNIPROT数据库（可得自UniProt.org并参见The UniProtConsortium,Nucleic Acids Res.D142-D148(2010)）的此类序列的实例包括以下：
Figure BDA00002991618700311
本文所述的细胞因子结构域还可以包含能够与IL-1RI结合的变体细胞因子结构域中所存在的取代。例如，SEQ ID NO:1的第15位（对应于SEQ IDNO:3的第20位）可以为Met或Asn。SEQ ID NO:1的第30位（对应于SEQID NO:3的第34位）可以为Gly、His、Trp或Met。
IL-1β和IL-1Ra另外的示例性变体包括在以下文献中所述的那些：Boraschi等(1996)Frontiers in Bioscience:A Journal and Virtual Library1,d270-308,Evans等，J.Biol.Chem.,270:11477(1995)和Greenfeder等,J.Biol.Chem.,270:22460(1995)。例如，IL-1β的变体包括R11G、R11A、Q15H、E105G和T147G。参见例如Evans等。IL-1Ra的变体包括W16Y、Q20M、Q20N、Y34G、Y34H、Y34W、Y34M、Y147G、Y147H、Y147M、K145D、H54P、V18S、T108K、C116F、C122S、C122A、Y147G、H54P、H54I以及Evans等和Greenfeder等,J.Biol.Chem.,270:22460(1995)。细胞因子结构域可包含在前述位置之一处与IL-1Ra相同的残基。细胞因子结构域还可以包含在对应位置与前述突变之一不同的残基。
此外，IL-1家族细胞因子可以包含一个或多个未配对的半胱氨酸残基。一个或多个（例如两个、三个或所有）此类未配对的半胱氨酸残基可突变为另一氨基酸，例如，不带电的氨基酸，诸如丙氨酸或丝氨酸。例如，P01在SEQ ID NO:17的第67、70、116和122位包含半胱氨酸。一个、两个、三个或所有四个此类半胱氨酸可被另一氨基酸取代，例如不带电的氨基酸，诸如丙氨酸或丝氨酸。P02在SEQ ID NO:18的第67、70、116和122位包含半胱氨酸。一个、两个、三个或所有四个此类半胱氨酸可被另一氨基酸取代，例如，不带电的氨基酸，诸如丙氨酸或丝氨酸。P03在SEQ ID NO:19的第70、116和122位包含半胱氨酸。一个、两个或所有三个此类半胱氨酸可被另一氨基酸取代，例如，不带电的氨基酸，诸如丙氨酸或丝氨酸。P04在SEQID NO:20的第70、116和122位包含半胱氨酸。一个、两个或所有三个此类半胱氨酸可被另一氨基酸取代，例如，不带电的氨基酸，诸如丙氨酸或丝氨酸。P05在SEQ ID NO:21的第8、70和122位包含半胱氨酸。一个、两个或所有三个此类半胱氨酸可被另一氨基酸取代，例如，不带电的氨基酸，诸如丙氨酸或丝氨酸。
IL-1家族细胞因子结构域（包括本文所述的嵌合细胞因子结构域）也可以循环排列。例如，来自该结构域的C端片段可重新定位使得其为原始N端和N端片段（通常包含切除C端片段后原始蛋白质的剩余部分）的N端。这两个重新定位的片段可通过接头（例如，具有约3至10个氨基酸）分开。一般来讲，在排列前的该结构域中的所有氨基酸除了顺序变化外都保留了下来。在一些实施方案中，该排列的分割点可以在柔性区域中，例如，柔性环，诸如β6-β7（例如，对应于SEQ ID NO:3的第71-80位的氨基酸）或β7-β8环（例如，对应于SEQ ID NO:3的第84-99位的氨基酸）。
在一些实施方案中，本文所述的受体结合剂（例如，包含IL-1家族细胞因子结构域的受体结合剂）具有小于30、25、22、20、19、18或约17kDa的分子量。在一些实施方案中，该受体结合剂具有大于18、19、20、22、25、30、40、45或50kDa的分子量。例如，该受体结合剂可包含其他多肽、聚合或非聚合组分，例如，改变该药剂药物动力学、稳定性、免疫原性和/或分子量的组分。该蛋白质可以包含其他修饰，例如，转录后修饰或合成修饰。在某些实施方案中，该受体结合剂不糖基化。在其他实施方案中，该受体结合剂包含至少一个糖基化。
例如，本文所述的受体结合剂可包含另外的结构域和特征。例如，受体结合剂可直接或间接与抗体蛋白的结构域融合，例如，与Fc结构域融合或与一个或多个恒定结构域（例如，CH1、CH2或CH3）融合。例如，这些结构域可以为人结构域或人结构域的变体。所述Fc结构域或一个或多个恒定结构域可位于受体结合剂的N段或C端。
Fc结构域可获自任何合适的免疫球蛋白获得，例如，获自人抗体，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，IgA、IgE、IgD或IgM的抗体。在一个实例中，该Fc结构域包含从约Cys226位或从约Pro230位的氨基酸残基到Fc结构域的羧基末端的序列。Fc结构域通常包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域以及任选地包含CH4结构域。具有其Fc结构域中的取代以及延长的血清半衰期的抗体还在以下文献中有所描述：WO00/42072、WO02/060919；Shields等,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Hinton,J.Biol.Chem.279:6213-6216(2004)。IgG重链中残基的编号为EU索引的编号，如在Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，PublicHealth Service,NH1,MD(1991)中，参考其中人IgG1EU抗体的编号。
在一个实施方案中，受体结合剂包含延长体内血清半衰期的补救受体结合表位，如（例如）在美国专利5,739,277和Ghetie等，Ann.Rev.Immunol.18:739-766(2000)中所述。在一些实施方案中，该表位包含在与该受体结合剂融合的Fc区域中。
在一个实施方案中，受体结合剂包含与FcRn受体结合的血清白蛋白序列，或这种序列的一部分，或与血清白蛋白（例如，人血清白蛋白）结合的序列。例如，某些与血清白蛋白结合的表位可与受体结合剂相关，例如，序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:22)。另见Dennis等J.Biol.Chem.277:35035-35043(2002)。
受体结合剂可进行修饰以包含增加该药剂的大小和稳定性的序列，例如，在WO2008/155134或WO2009/023270中所述的序列。此类序列通常可不具有生物活性，例如，它不调节由IL-1细胞因子家族成员介导的信号转导。可以使用多种稳定化多肽序列，例如，富含甘氨酸和/或丝氨酸以及其他氨基酸诸如谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸或脯氨酸的序列。例如，序列可设计为具有至少30、40、50、60、70、80、90或100%的甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一些实施方案中，连接到某蛋白质的稳定化多肽序列的组合长度可为至少20、25、35、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900个或多于1000或2000个氨基酸。稳定化序列可以（例如）与生物活性多肽融合，例如与所述受体结合剂的N或C端融合。稳定化序列的融合可导致融合蛋白的流体力学半径相对于未修饰的蛋白质而明显增大，这可通过例如超速离心、尺寸排阻色谱或光散射而检测。在一些实施方案中，稳定化序列包含少量的以下氨基酸或不含以下氨基酸：半胱氨酸（以避免二硫键形成和氧化）、甲硫氨酸（以避免氧化）、天冬酰胺和谷氨酰胺（以避免脱酰胺）以及天冬氨酸。稳定化序列可设计为包含倾向于降低蛋白水解降解敏感性的脯氨酸残基。
结合测定
受体结合剂与其靶标的相互作用可使用任何合适的方法进行分析，包括（例如）放射免疫测定、细胞结合测定和表面等离子体共振(SPR)。示例性的使用放射性碘标记的蛋白质竞争进行的细胞结合测定在Boraschi,J.Immunol.,155(10):4719-25(1995)中有所描述。
SPR或生物分子相互作用分析(BIA)可实时检测生物特异性相互作用，而不用标记任何相互作用物。BIA芯片结合表面处的质量变化（表示发生结合事件）导致靠近该表面的光的折射率改变（表面等离子体共振(SPR)的光学现象）。折射性的变化生成可检测的信号，对其进行测量作为生物分子之间实时反应的指示。使用SPR的方法（例如）在Raether,1988,SurfacePlasmons Springer Verlag；Sjolander和Urbaniczky,1991,Anal.Chem.63:2338-2345；Szabo等，1995,Curr.Opin.Struct.Biol.5:699-705以及BIAcoreInternational AB(Uppsala,Sweden)提供的在线资源中有所描述。
Figure BDA00002991618700341
系统或Reichert SR7000DC双通道SPR可用于在动力学、亲和力或特异性方面对相互作用进行实时比较和排序，而不用使用标记物。受体结合剂对细胞因子受体胞外域（例如，IL-1RI的胞外域）的结合亲和力可在接近生理的条件下（例如，10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%Tween-20）使用SPR进行测量。也可使用不依靠SPR的其他方法，例如用于测量结合力和亲和力。
由结合测定得到的信息可用于提供受体结合剂与靶标结合的平衡解离常数(KD)和动力学参数（例如，Kon和Koff）准确且定量的测定。此类数据可用于比较不同的蛋白质、靶标和条件。该信息也可用于开发构效关系(SAR)。例如，可将变体蛋白的动力学和平衡结合参数与参考或亲本蛋白的相应参数进行比较。可鉴定与特定结合参数（例如，高亲和力和慢Koff）相关联的给定位置的变体氨基酸。该信息可与结构建模（例如，使用同源性建模、能量最小化或通过X射线晶体学或NMR进行的结构测定）相结合。
用于评价亲和力的蛋白质可以重组形式产生，并可包含适用于纯化或固定化的标记，如FLAG标记、myc标记、血凝素标记、His标记或Fc结构域融合。受体蛋白（诸如IL-1RI和IL-1RAcP）的胞外域可通过例如使用Sf9中的杆状病毒表达，例如在细菌或昆虫细胞中表达而以重组形式产生。可溶性受体蛋白可在BIAcore系统中被固定，例如，使用包含与所述蛋白标记结合的试剂的芯片，例如用对Fc结构域或其他标记特异的IgG包被的芯片。
细胞活性测定
受体结合剂作为受体拮抗剂的能力可（例如）在基于细胞的测定中进行评估。例如，可能评价受体结合剂对IL-1RI的抑制。IL-1活性的多种示例性的测定在Boraschi等的文献中有所描述，并包括T细胞增殖测定、IL-6和IL-8生成测定以及钙内流的抑制。
在一种示例性的测定中，评价受体结合剂抑制IL-1β刺激的IL-6从人成纤维细胞释放的能力。对MRC5细胞中IL-1β刺激的细胞因子释放的抑制与所述药剂体内抑制IL-1介导活性的能力相关联。该测定的详细信息在Dinarello等，Current Protocols in Immunology,Ch.6.2.1-6.2.7,John Wiley andSons Inc.,2000中有所描述。简而言之，使人MRC5成纤维细胞(ATCC#CCL-171,Manassas VA,USA)在多孔板中生长至汇合。将细胞用滴定剂量的受体结合剂和对照进行处理。随后将细胞与100pg/ml的IL-1β在存在滴定剂和/或对照的情况下接触。阴性对照细胞不用IL-1β刺激。在各组处理细胞中释放的IL-6的量用IL-6ELISA试剂盒（例如，BD Pharmingen,Franklin Lakes,NJ,USA）测量。可以使用的对照包括仅缓冲液、IL-1Ra，以及IL-1β的抗体。
还可在体内评价受体结合剂的功效。示例性测定在Economides等，Nature Med.,9:47-52(2003)中有所描述。简而言之，将小鼠经腹膜内注射滴定剂量的受体结合剂和对照。注射后24小时，将小鼠经皮下注射剂量为1μg/kg的重组人IL-1β。注射IL-1β后2小时（IL-6峰值反应时间），将小鼠处死，并采集和处理血液以获得血清。通过ELISA测定血清IL-6水平。可基于在实验动物血清中检测到的IL-6与对照中检测到IL-6的比率计算抑制百分比。
体内IL-1活性的其他示例性测定在Boraschi等的文献中有所描述，并包括厌食、低血糖和中性白细胞增多测定。
制备
受体结合剂可通过在重组宿主细胞中表达而制备，但也可通过其他方法诸如体外转录和翻译以及化学合成而制备。
对于细胞表达，可将编码受体结合剂的一种或多种核酸（例如，cDNA或基因组DNA）插入用于克隆或表达的可复制载体中。多种载体可通过公众渠道获得。载体可以（例如）为质粒、粘粒、病毒基因组、噬粒、噬菌体基因组或其他自主复制序列。合适的编码核酸序列可通过多种程序插入载体。例如，可对合适的限制性内切酶位点进行工程化（例如，使用PCR）。然后，可将限制性消化和连接用于将所述编码核酸序列插到合适的位置。载体组分通常包含以下一者或多者：一个复制起点、一个或多个标记基因、一个增强子元件、一个启动子以及一个转录终止序列。
该受体结合剂可以分离方式但也可通过与一种或多种其他组分诸如信号序列、表位或纯化部分以及标记融合而重组地制得。该受体结合剂可包含白介素-1家族成员的前结构域，例如，其随后可通过蛋白分解处理而移除。
对于细菌表达，该受体结合剂可制成为具有或不具有信号序列。例如，其可在细胞内产生，以使得其聚集在包涵体中或可溶性部分中。它也可（例如）通过加入原核信号序列（例如，合适的前导序列，诸如来自碱性磷酸酶、青霉素酶、热稳定性肠毒素II）而分泌。用于表达的示例性细菌宿主细胞包括任何可转化的大肠杆菌K-12菌株（诸如大肠杆菌BL21、C600、ATCC23724；大肠杆菌HB101NRRLB-11371、ATCC-33694；大肠杆菌MM294ATCC-33625；大肠杆菌W3110ATCC-27325）以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、假单胞菌(Pseudomonas)和其他杆菌菌株。在细菌系统中产生的蛋白通常将缺乏糖基化。因此，在一些实施方案中，本文所述的受体结合剂基本上不含糖基化，例如不含哺乳动物或其他真核细胞的糖基化修饰。
该受体结合剂可在酵母宿主细胞中表达，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、汉逊酵母(Hanseula)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。对于酵母表达，该受体结合剂也可在细胞内产生或通过分泌产生，例如，使用酵母转化酶前导序列或α因子前导序列（包括酿酒酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)形式）、或酸性磷酸酶前导序列、或白色念珠菌(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列（1990年4月4日公布的EP362,179）。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列可用于蛋白质的直接分泌，诸如来自相同或相近物种的分泌多肽的信号序列以及病毒分泌性前导序列。作为另外一种选择，该受体结合剂可制备为具有白介素-1家族成员的前结构域，例如，IL-1α或IL-1β前结构域。
表达和克隆载体两者都含有使该载体能够在一种或多种所选的宿主细胞中复制的核酸序列。此类序列对于多种细菌、酵母和病毒是熟知的。来自质粒pBR322的复制起点适用于大部分革兰氏阴性细菌；2μ质粒起点适用于酵母；以及多种病毒起点（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV）可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
表达和克隆载体通常包含选择基因或标记。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补充营养缺陷株（诸如酿酒酵母中的URA3标记）；或(c)供应从复合培养基中无法获得的关键营养素，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。多种标记也可供哺乳动物细胞使用，例如，DHFR或胸苷激酶。DHFR可与缺乏DHFR活性的细胞系（诸如CHO细胞系）结合使用，其制备和繁殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)所述。
表达和克隆载体通常包含启动子，其可操作地连接到编码受体结合剂的核酸序列以指导mRNA合成。示例性的适于与原核宿主一起使用的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统（Chang等，Nature,275:615(1978)；Goeddel等，Nature,281:544(1979)）、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统（Goeddel,Nucleic Acids Res.,8:4057(1980)；EP36,776）和杂合启动子诸如tac启动子(deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983))。用于细菌系统的启动子也可包含适当定位的Shine-Dalgarno序列。T7聚合酶系统也可用来驱动置于该T7启动子控制下的核酸编码序列的表达。参见（例如）pET载体(EMD Chemicals,Gibbstown NJ,USA)和宿主细胞，例如，如可得自EMDChemicals的Novagen User Protocol TB053以及US5,693,489中所述。例如，此类载体可与BL21(DE3)细胞和BL21(DE3)pLysS细胞结合使用以产生蛋白，例如，每毫升细胞培养物至少0.05、0.1或0.3mg。可以使用的其他细胞系包括B834、BLR、HMS174、NovaBlue的DE3溶原菌，包括具有pLysS质粒的细胞。
与酵母细胞一起使用的示例性启动子包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.,255:2073(1980))或其他糖解酶（Hess等，J.Adv.EnzymeReg.,7:149(1968)；Holland,Biochemistry,17:4900(1978)），诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖6-磷酸异构酶和丙酮酸激酶。其他示例性酵母启动子为诱导型启动子，并具有转录受生长条件控制的额外优势。诱导型启动子的实例包括用于醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。
在哺乳动物宿主细胞中由载体表达编码受体结合剂的mRNA可加以控制，例如通过得自病毒基因组的启动子，诸如多瘤病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)，来自异源哺乳动物启动子，例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及来自热休克启动子。也可使用异源启动子系统，例如，对四环素有反应的启动子。参见Urlinger,S.,等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(14):7963–7968。转录也可通过处于顺式或反式的增强子序列来驱动。示例性哺乳动物增强子序列包括球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白和胰岛素的那些。另外的实例包括在复制起点近侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点近侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可在受体结合剂的编码序列的5'或3'位拼接到载体中，但优选地位于启动子的5'位点。
用于真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞）的表达载体也可包含终止转录以及稳定mRNA所必需的序列。此类序列一般可得自真核或病毒DNA或cDNA的5'端并且偶尔为3'端未翻译区。这些区域包含在编码受体结合剂的mRNA的未翻译部分中转录为多聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。表达载体还可以包含一个或多个内含子序列。
受体结合剂还可以例如使用pFAST-BACTM系统在昆虫细胞中表达，例如，Sf9或SF21细胞。另外的示例性杆状病毒表达载体可得自Invitrogen,LifeTechnologies,Carlsbad CA,USA。受体结合剂还可以在哺乳动物细胞中表达。例如，还可以采用哺乳动物源细胞系。哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞COS-7细胞系(ATCC CRL1651)(Gluzman等，Cell23:175,1981)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL163)、中国仓鼠卵(CHO)细胞、HeLa细胞和BHK(ATCC CRL10)细胞系，以及衍生自非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCC CCL70)，如McMahan等(EMBO J.10:2821,1991)所述。用于将DNA引入哺乳动物细胞的确立方法已有描述(Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990,第1569页)。
适于在重组细胞中合成受体结合剂的其他方法、载体和宿主细胞在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，Sambrook等(编著),ColdSpring Harbor Press,(2001)(ISBN:0879695773)中有所描述。
在细胞中表达后，可从培养基、内涵体或细胞裂解物中回收受体结合剂。细胞可通过多种物理或化学手段破坏，诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂（如，洗涤剂）。
受体结合剂可从可存在于细胞裂解物或细胞培养基中的其他细胞蛋白或多肽中纯化。可以采用用于蛋白质纯化的多种方法，并且此类方法在本领域中是已知的，并例如在Deutscher,Methods in Enzymology,182(1990);和Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag,New York(2010)(ISBN:1441928332)中有所描述。示例性纯化程序包括：通过离子交换柱分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；硅胶或阳离子交换树脂诸如DEAE层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤；蛋白A-琼脂糖柱除去诸如IgG的污染物；以及亲和柱（例如，金属螯合柱以结合蛋白质的表位标记形式，以及具有各种配体的柱以结合与受体结合相关的任何纯化部分）。纯化方法可包括两个不同的离子交换层析步骤的组合，例如阳离子交换层析然后是阴离子交换层析，反之亦然。受体结合剂可通过包括盐和/或pH梯度或步骤的多种方法从离子交换树脂中洗脱出来。在一些实施方案中，该受体结合剂包含纯化部分（诸如表位标记和亲和柄）。此类部分可用于亲和层析，并可任选地通过蛋白水解裂解而移除。
离子交换层析也可作为离子交换分离技术而使用。离子交换层析基于分子总体电荷之间的差异而对分子进行分离，并可用于将受体结合剂的完整形式与此类蛋白质的其他形式相分离。
阴离子或阳离子取代基可连接到基质上，以便形成用于层析的阴离子或阳离子载体。阴离子交换取代基包括二乙氨乙基(DEAE)、季铵乙基(QAE)和季铵(Q)基团。阳离子取代基包括羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸根(P)和磺酸根(S)。纤维素离子交换树脂诸如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可得自Whatman Ltd.(Maidstone,Kent,U.K)。SEPHADEXTM和其他交联离子交换树脂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEXTM以及DEAE-、Q-、CM-和S-SEPHAROSETM及SEPHAROSETMFast Flow可得自Pharmacia AB。DEAE和CM衍生化乙二醇-甲基丙烯酸酯共聚物诸如TOYOPEARL DEAE-650S或M以及TOYOPEARL CM-650S或M可得自Toso Haas Co.(Philadelphia,PA,USA)。
阳离子交换表面是具有共价结合的带负电配体的离子交换表面，其因此具有自由阳离子以与接触该表面的溶液中的阳离子交换。示例性的表面包括阳离子交换树脂，诸如其中共价结合基团为羧酸根或磺酸根的那些树脂。市售阳离子交换树脂包括CMC-纤维素、SP-SephadexTM和Fast S-SepharoseTM(Pharmacia)。
阴离子交换表面是具有共价结合的带正电基团诸如季铵基团的离子交换表面。示例性阴离子交换表面为阴离子交换树脂，诸如DEAE纤维素、TMAE、QAE SephadexTM和Fast Q SepharoseTM(Pharmacia)。
受体结合剂的示例性纯化方案包括在裂解缓冲液中裂解大肠杆菌细胞，然后进行深层过滤。然后将材料进行阳离子交换层析(CEX)。CEX洗脱液然后在阴离子交换层析(AEX)步骤中流经阴离子交换介质。AEX FT可经历精制步骤。然后，可将材料通过超滤/渗滤处理，例如以浓缩材料或对材料脱盐。超滤/渗滤膜可基于名义分子量分割("NMWCO")加以选择，以便在渗余物中保留蛋白质，而允许低分子量材料诸如盐进入滤液。例如，取决于产品的所需最终pH和导电率，在最终缓冲液交换步骤中可以使用任何缓冲溶液或无菌水。
受体结合剂可保存在多种溶液中，包括水、PBS和缓冲溶液。示例性缓冲溶液包括乙酸钠pH4.5、乙酸钠pH4.7、乙酸钠pH4.9、乙酸钠pH5.1、乙酸钠pH5.3、乙酸钠pH5.5、琥珀酸盐pH5.2、琥珀酸盐pH5.4、琥珀酸盐pH5.6、琥珀酸盐pH5.8、组氨酸pH5.7、组氨酸pH6.0、组氨酸pH6.3、组氨酸6.6、磷酸钠pH6.5、磷酸钠pH6.7、磷酸钠7.0、磷酸钠pH7.3、磷酸钠pH7.7、咪唑pH6.5、咪唑pH6.8、咪唑pH7.2、Tris pH7.0、Tris pH7.5、Tris pH7.7。缓冲剂可例如以约1-100mM、5-50mM、10-50mM或5-25mM的浓度存在。溶液可进一步包含诸如NaCl的盐（例如，50mM、150mM或250mM和它们之间的范围）、精氨酸（例如，以约1%、2%、3%、4%、5%、7.5%和它们之间的范围）、蔗糖（例如，以约1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、8.5%、10%、15%和它们之间的范围）和/或甘油（例如，以约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、7.5%、8.5%、10%、15%和它们之间的范围）。
受体结合剂可以至少50mg、100mg、500mg、1g、5g、10g或更多的量存在于组合物中。
分析方法
宿主细胞蛋白质(HCP)是指制剂中不同于受体结合剂的蛋白质，并且例如为用来制备受体结合剂的宿主细胞内源蛋白质，通常为大肠杆菌蛋白质。优选地，宿主细胞蛋白质以低于10000、1000、900、800或700ppm（份每一百万份）的量存在。HCP可例如通过ELISA或其他检测方法进行检测。例如，ELISA可使用HCP的多克隆抗体。示例性试剂盒可得自CygnusTechnologies(CN#F410;Southport NC USA)。另一种示例性试剂盒使用AlphaScreen技术（大肠杆菌HCP试剂盒，产品编号AL261C/F，Perkin Elmer,Waltham MA USA）。
含有或可能含有受体结合剂的材料可例如使用高压液相色谱进行评价。示例性分析技术包括：弱阳离子交换-高效液相色谱(wCEX-HPLC)、尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)、反相液相色谱、ESI-MS、电喷雾(turbospray)电离质谱、纳喷雾(nanospray)电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、SELDI-MS和MALDI-MS。
在多个实施方案中，受体结合剂的N端区域包含与来自IL-1βN端区域的肽相同的序列，例如肽APVRS(SEQ ID NO:58)。表达此类蛋白质的重组细胞（尤其是大肠杆菌细胞）可产生完整蛋白质以及其他亚型，包括des-Ala亚型以及含有另外的甲硫氨酸（例如，在Ala1的N端）的亚型。在氨基酸第2位包含脯氨酸的受体结合剂（其中N端残基在第1位）可容易地被大肠杆菌蛋白酶裂解，诸如具有X-PRO裂解特异性的氨基肽酶P。该裂解可移除N端氨基酸。例如，P03、P04和P05在第2位具有脯氨酸。P03、P04和P05的完整形式为长度为153个氨基酸并以丙氨酸开始，而des-Ala形式为长度为152个氨基酸并以脯氨酸开始。
诸如上文那些分析技术可用于区分完整形式与其他形式，例如，des-Ala形式。示例性分析技术为wCEX-HPLC。例如，P05可使用Dionex 
Figure BDA00002991618700421
WCX-104x250mm柱（产品编号054993）进行评价，如下文的实施例9中所述。WCX-HPLC峰可通过C4反相(RP)-HPLC在线联用质谱进行评价。完整的P05具有17700.4Da的理论质量，并可检测为17700.4Da。des-Ala形式可检测为17629.4Da，其比完整P05的质量小71Da。71Da的质量降低对应于单个丙氨酸残基的移除。
药物组合物
受体结合剂可配制为药物组合物。通常，该组合物为无菌的，并包含缓冲剂、药学上可接受的盐以及赋形剂或稳定剂中的一者或多者。例如，该组合物可以为含水组合物。本文所述的受体结合剂可根据生物制剂的标准方法进行配制。参见例如Gennaro(编著),Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第20版，Lippincott,Williams&Wilkins(2000)(ISBN:0683306472)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN:0683305727)；Kibbe(编著),Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版.(2000)(ISBN:091733096X)；Protein formulation and delivery,McNally和Hastedt(编著),Informa Health Care(ISBN:0849379490)(2007)。
用于药物组合物的受体结合剂的纯度通常为至少10、20、50、70、80、90、95、98、99或99.99%，并且通常不含人蛋白质。它可以为组合物中的唯一蛋白质，或组合物中的唯一活性蛋白质。它也可以与一种或多种其他活性蛋白质组合，例如一种或多种其他纯化的活性蛋白质，例如，相关或不相关的蛋白质。在一些实施方案中，该组合物可包含浓度介于约0.001–10%之间例如0.001–0.1%、0.01–1%或0.1%-10%的受体结合剂。
因此，本文的特征还在于本文所述的药剂的纯化和分离形式。术语“分离的”是指从其原始环境（例如，从中产生受体结合剂的细胞或材料）中移除的材料。药物组合物可基本上不含热原物质，基本上不含核酸，和/或基本上不含细胞酶和组分，诸如聚合酶、核糖体蛋白和伴侣蛋白。
药物组合物可包含药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣料、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。“药学上可接受的盐”是指保持母体化合物的所需生物活性且不产生任何不利毒性作用的盐（参见例如Berge,S.M.,等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19），例如，酸加成盐和碱加成盐。
在一个实施方案中，将受体结合剂与一种或多种赋形剂一起配制，诸如氯化钠、磷酸盐缓冲剂（例如，磷酸氢二钠七水合物、磷酸二氢钠）和聚山梨醇酯。它可以例如约5-100、5-30、30-50或50-100mg/ml的浓度存在于例如缓冲溶液中，并可在2-8℃下保存。药物组合物也可以具有多种其他形式。这些形式包括（例如）液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液（例如，注射用和输注用溶液）、分散体或混悬剂以及脂质体。优选的形式可取决于预期的施用方式和治疗应用。本文所述的药剂的组合物通常为注射用或输注用溶液形式，或用于局部或眼部递送（参见下文）。
药物组合物通常为无菌的并在生产和储藏条件下稳定。药物组合物还可接受测试以确保符合施用的管理和工业标准。组合物可配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构。无菌注射用溶液可通过以下方法制备：将本文所述的药剂以所需的量与上文所列成分中的一种或组合根据需要掺入合适的溶剂中，然后进行过滤杀菌。一般来讲，分散体通过以下方法制备：将本文所述的药剂掺入无菌媒介物中，该媒介物包含基本分散介质和上文列举的那些中的所需其他成分。就用于制备无菌注射用溶液的无菌粉末而言，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其由之前通过无菌过滤的溶液产生本文所述的药剂与任何另外所需成分的粉末。合适的溶液流动性可例如通过使用包衣诸如卵磷脂、通过维持所需的粒度（就分散体而言）以及通过使用表面活性剂而维持。注射用组合物的延长吸收可通过包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和明胶而设计。
例如，受体结合剂可以与聚合物相结合，例如，基本上无抗原性的聚合物，诸如聚氧化烯或聚氧化乙烯。在一些实施方案中，该聚合物例如直接地或间接地共价连接到受体结合剂。合适的聚合物将在重量上有很大的变化。可以使用具有约200至约35,000道尔顿（或约1,000至约15,000以及2,000至约12,500）范围内的数均分子量的聚合物。例如，受体结合剂可连接到水溶性聚合物，例如，亲水性聚乙烯基聚合物，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。此类聚合物的非限制性列表包括：聚氧化烯均聚物诸如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇类，聚氧乙烯多元醇类，它们的共聚物以及它们的嵌段共聚物，前提是保持嵌段共聚物的水溶性。另外有用的聚合物包括：聚氧化烯类诸如聚氧乙烯、聚氧丙烯以及聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯类；卡波姆(carbomer)；含有糖类单体D-甘露糖、D-与L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸、唾液酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸（例如聚甘露糖醛酸或藻酸）、D-葡糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖和神经氨酸的支链或非支链多糖，包括同多糖和杂多糖，诸如乳糖、支链淀粉、淀粉、羟乙基淀粉、直链淀粉、硫酸葡聚糖、葡聚糖、糊精、糖原或酸性粘多糖的多糖亚基，如透明质酸；糖醇的聚合物，诸如聚山梨糖醇和聚甘露糖醇；肝素或类肝素。
在某些实施方案中，受体结合剂可与将防止该化合物快速释放的载体一起制备。它可以作为控释制剂递送，通过植入物或微囊化递送系统递送。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。一般可参见例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,编著,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978。
施用
受体结合剂可通过多种方法施用给受试者，例如，人类受试者，所述多种方法诸如静脉推注，或经过一段时间连续输注，通过肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、滑膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外注射、胸骨内注射和输注。还有其他施用方式包括局部（例如，表皮或粘膜）或吸入（例如，鼻内或肺内）途径。对于许多应用，施用途径为以下之一：静脉内注射或输注、皮下注射或肌内注射。
受体结合剂可按固定剂量或以mg/kg的剂量施用。它可以通过静脉内(IV)或皮下(SC)施用。受体结合剂可例如每天、每隔一天、每隔两天、每隔三天或四天、每周、每三至五周，例如，每隔三周或每月施用。
药物组合物可包含“治疗有效量”的本文所述的药剂。药剂的治疗有效量可根据以下因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及化合物在个体内引起所需反应的能力，例如改善至少一种疾病参数或改善至少一种疾病症状（以及任选地，所施用的任何其他药剂的影响）。治疗有效量也可以是其中组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益效果超过的量。受体结合剂通常以治疗有效量施用。
药物组合物可使用医疗装置施用，例如，植入物、输注泵、皮下注射针和无针皮下注射装置。该装置可以包括（例如）一个或多个用于储存药物组合物的壳体，并可被构造为递送单位剂量的受体结合剂以及任选地第二种药剂。剂量可以为固定剂量，即，适合作为单剂量用于待治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位可包含预定量的受体结合剂，该量计算为与药物载体相结合以及任选地与另一种药剂相结合产生所需的治疗效果。
在一些实施方案中，为了治疗本文所述的疾病，可将受体结合剂以一定的量施用给患有该疾病的受试者，并持续一段足以引起反映疾病严重性的至少一个指标的持续改善的时间。如果该受试者在相隔一至四周的至少两次中呈现改善，则将此改善视为“持续的”。改善程度可根据体征或症状确定，并且也可采用提供给受害者的问卷诸如生活质量文件。
可对反映疾病程度的多种指标进行评估，以确定治疗的量及时间是否足够。所选的一个或多个指标的基线值通过在施用受体结合剂的第一剂量前对受试者进行检查而确立。优选地，基线检查在施用第一剂量的约60天内完成。
改善可通过以下方式引起：重复施用一定剂量的受体结合剂，直到受试者显现出相对于所选一个或多个指标的基线的改善。在治疗慢性病症时，改善程度可通过在至少一个月或多个月的时间内（例如，一个月、两个月或三个月或更长时间或无限长时间内）重复施用而获得。在治疗急性病症时，药剂可施用一至六周的时间或甚至单剂量即可。
虽然在治疗后疾病的程度可能根据一个或多个指标出现改善，但是治疗可能需要以相同的水平或以降低的剂量或频率无限期继续。治疗也可以例如在症状改善或消失后停止。一旦减少或停止治疗，如果症状再次出现可以恢复治疗。
治疗
受体结合剂诸如与IL-1RI结合并拮抗IL-1信号转导的受体结合剂可用于治疗“IL-1介导的疾病”，其包括具有以下特点的任何疾病或医疗状况：(i)至少部分地由IL-1激动引起；(ii)与升高的IL-1信号转导组分（诸如IL-1α、IL-1β或IL-1RI）水平或活性或加强的IL-1信号转导相关；和/或(iii)通过降低IL-1活性而得以改善。IL-1介导的疾病包括急性和慢性疾病，包括自身免疫疾病和炎性疾病。IL-1介导的疾病包括全身性和非全身性疾病。已公认的是，IL-1α和IL-1β是感染性反应以及炎性疾病（包括类风湿性关节炎）中涉及到的强效促炎性细胞因子。在患有多种自身免疫疾病、缺血和多种癌症的患者中已观察到了IL-1的产生增多，从而表明IL-1存在于这些疾病及相关疾病中。
一般还可参见Sims和Smith,The IL-1family:regulators of immunity,Nature Reviews Immunology,doi:10.1038/nri2691(2010)。
术语“治疗”是指以有效改善与疾病（例如，本文所述的疾病）相关的病症、症状或参数或防止疾病进展以达到统计显著性程度或本领域技术人员可以发现的程度的量、方式和/或模式向受试者（例如，患者）施用本文所述的药剂。治疗可旨在治愈、愈合、减轻、缓和、改变、纠正、改良、减缓、改善或影响疾病、疾病症状或患病倾向。有效量、方式或模式可根据受试者而变化并可根据受试者定制。示例性受试者包括人、灵长类和其他非人哺乳动物。受体结合剂可预防性地给予，以减少疾病发生的风险或其症状。
IL-1介导的疾病可以为自身免疫疾病。IL-1介导的自身免疫疾病的实例包括：类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、白塞氏综合征(Behcet’s syndrome)、炎性肠病（包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）、哮喘、牛皮癣、I型糖尿病以及本文确定的其他疾病。本文所述的受体结合剂可施用给患有此类IL-1介导的自身免疫疾病或处于其风险中的受试者。IL-1介导的疾病可以为诸如下文所述的炎性疾病。本文所述的受体结合剂可施用给患有此类IL-1介导的炎性疾病或处于其风险中的受试者。
示例性IL-1介导的疾病包括：
类风湿性关节炎和相关关节炎。受体结合剂可用于治疗患有类风湿性关节炎或处于其风险中的受试者。类风湿性关节炎(RA)是影响关节滑膜并破坏关节软骨的慢性全身性自身免疫炎性疾病。RA的发病为T淋巴细胞依赖性的并可包括产生称为类风湿因子的自身抗体。类风湿因子和抗原的复合体可在关节液和血液中形成和聚集，从而引起淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞浸润到滑膜中。关节通常以对称形式受累，但关节外的疾病也可发生，例如，导致肺纤维化、血管炎和皮肤溃疡，或表现为中性粒细胞减少、血小板减少和脾肿大的费尔蒂综合征(Felty’s syndrome)。患者也可在受累关节、心包炎、胸膜炎、冠状动脉炎和伴有肺纤维化的间质性肺炎的区域中呈现出类风湿结节。一种形式的IL-1Ra的指示中度至重度活动性RA。参见例如Cohen,S.等Arthritis&Rheumatism46,614-24(2002)；Fleischmann,R.M.等Arthritis&Rheumatism48,927-34(2003)；Nuki,G.,等Arthritis&Rheumatism46,2838-46(2002)；Schiff,M.H.等Arthritis&Rheumatism50,1752-60(2004)。
活动性RA的症状包括疲乏、食欲不振、低烧、肌肉和关节痛以及僵直。肌肉和关节僵直通常在早晨和不活动期后最明显。在发作期间，关节常会变得发红、肿胀、疼痛和触痛，一般而言是因滑膜炎所致。可用于评估RA和RA症状的量表包括：类风湿性关节炎严重性量表（RASS；Bardwell等,(2002)Rheumatology41(1):38-45）；SF-36关节炎专用健康指数（ASHI；Ware等，(1999)Med.Care.37(增刊5):MS40-50）；关节炎影响量表或关节炎影响量表2（AIMS或AIMS2；Meenan等(1992)Arthritis Rheum.35(1):1-10）；斯坦福健康评估问卷(HAQ)、HAQII或改良HAQ（参见例如，Pincus等(1983)ArthritisRheum.26(11):1346-53）。
本文所述的受体结合剂可施用给患有RA或处于其风险之中的受试者，以延迟发作和/或改善前述体征和症状中的一种或多种。受试者可患有中度至重度活动性RA。受试者可以为对TNF抑制剂治疗（如，通过
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（依那西普）、
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（阿达木单抗）或
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（英夫利西单抗）治疗）无反应者；受试者可以之前已施用过TNF抑制剂；或者受试者也可继续接受TNF抑制剂（以及起反应或不起反应）。
也可向受试者施用甲氨蝶呤。可向受试者施用一种或多种其他DMARDS（改变病情抗风湿药）、皮质类固醇和/或非甾体抗炎药。可与受体结合剂共同施用的其他药物包括CD28抑制剂（例如，CTLA4-Ig）、RANKL抑制剂、IFNγ、IL-6、IL-8和IL-17。抑制剂包括此类介质的抗体、此类介质的特异性可溶受体和/或此类介质的受体的抗体。
幼年型慢性关节炎.受体结合剂可用于治疗幼年型慢性关节炎，例如，在年龄低于21、18、17、16、15或14岁的受试者中。幼年型慢性关节炎在多个方面与RA相似。受试者可以为类风湿因子阳性者。受试者可以具有疾病的少关节、多关节或全身性形式。关节炎可造成关节强直和生长停滞，并且还可导致慢性前葡萄膜炎和系统性淀粉样变性。受体结合剂可用于延迟一种或多种此类症状的发作或改善一种或多种此类症状。
受体结合剂可用于治疗幼年特发性关节炎，包括全身发作性幼年特发性关节炎(SO-JIA)。受试者可能已对先前的皮质类固醇治疗失败或需要以每天等于或超过0.3mg/kg的剂量的皮质类固醇治疗。参见例如Quartier等(2011)Ann Rheum Dis.70(5):747-54。
其他风湿性疾病.本文所述的受体结合剂也可用于治疗其他风湿性疾病，包括硬皮病、全身性红斑狼疮、痛风、骨关节炎、风湿性多肌痛、牛皮癣关节炎和慢性莱姆关节炎、随意肌和其他肌肉炎症（包括皮肌炎、包涵体肌炎、多肌炎）、淋巴管肌瘤病、化脓性关节炎综合征、小儿肉芽肿性关节炎(PGA)/Blau综合征以及本文讨论的其他风湿性疾病。
受体结合剂可用于治疗代谢性风湿疾病，例如，与高尿酸血症相关的疾病，例如，包括慢、急性痛风的痛风，以及其他结晶介导的关节病。该药剂可用于治疗药物引起的痛风相关发作，包括（例如）由黄嘌呤氧化酶抑制剂、尿酸氧化酶或排尿酸剂引起的发作。在痛风中，尿酸晶体可激活炎性体并触发IL-1β的释放。
脊柱关节病.受体结合剂可用于治疗脊柱关节病，这包括诸如强直性脊柱炎、赖特综合征(Reiter’s syndrome)、炎性肠病相关关节炎、牛皮癣相关脊柱炎、幼年型脊柱关节病和未分化脊柱关节病的疾病。脊柱关节病通常与HLA-B27基因相关。受试者可能缺乏类风湿因子，并可表现出伴有或没有脊柱炎和炎性非对称性关节炎的骶髂关节炎。受试者也可能患有眼部炎症（参见下文）。
硬皮病.受体结合剂可用于治疗硬皮病或系统性硬化。硬皮病的特征在于可为局部的或全身性的皮肤硬化。还可存在微脉管系统中的血管病变和内皮细胞损伤。受试者可表现出皮肤病变处的单核细胞浸润，并具有抗核抗体。表现出发病的其他器官可包括：可具有平滑肌萎缩和纤维化从而导致异常蠕动/活动的胃肠道；可具有同心内皮下内膜增生从而影响小弓形和小叶间动脉致使肾皮质血流降低并且可导致蛋白尿、氮血症和高血压的肾脏；可涉及萎缩、间质性纤维化、炎症、肺、间质性肺炎和间质性纤维化的骨骼肌；以及可表现出（例如）收缩带坏死和结疤/纤维化的心脏。本文所述的受体结合剂可施用给患有硬皮病或处于其风险之中的受试者，以改善前述体征和症状中的一种或多种。
舍格伦综合征.受体结合剂可用于治疗舍格伦综合征。舍格伦综合征的特征在于免疫介导的炎症以及随后泪腺和唾腺的功能性破坏。该疾病可与炎性结缔组织疾病相关或伴随炎性结缔组织疾病。该疾病与针对Ro和La抗原产生自身抗体有关，这两种抗原都是小RNA-蛋白复合体。病变可导致干燥性角结膜炎、口腔干燥，伴随其他包括胆汁性肝硬变、周围或感觉神经病变和可触性紫癜的表现或关联。与舍格伦综合征相关的眼部疾病的治疗也在下文进行了讨论。
甲状腺疾病.受体结合剂可用于治疗甲状腺疾病。示例性甲状腺疾病包括格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎和萎缩性甲状腺炎，并为针对甲状腺抗原的自体免疫反应的结果，其产生与存在于甲状腺中并通常为甲状腺特异性的蛋白发生反应的抗体。可用的实验模型包括自发性模型：大鼠（BUF和BB大鼠）和鸡（Obese鸡品系），以及通过甲状腺球蛋白或甲状腺微粒体抗原（甲状腺过氧化物酶）对动物免疫而建立的可诱导模型。
糖尿病和代谢疾病.受体结合剂可用于治疗糖尿病，诸如幼年型糖尿病（包括自身免疫糖尿病和胰岛素依赖型糖尿病）和成年型糖尿病（包括非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖相关性糖尿病）、I型糖尿病和II型糖尿病。例如，I型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病与由自身抗体和自身反应性T细胞所导致的胰岛细胞自身免疫性破坏有关。此外，降低IL-1β活性可改善血糖控制和β细胞功能，并可用于治疗II型糖尿病。参见例如Owyang等Endocrinology.2010;151(6):2515-27。例如，在一些实施方案中，本文所述的受体结合剂可施用给未在施用胰岛素的受试者，例如非胰岛素依赖型受试者。例如，该受试者可处于糖尿病前期。受试者可以为葡萄糖耐受性受损或空腹血糖耐受性受损。受试者可以为肥胖受试者或具有高于23、25、30、35或40kg/m2的身体质量指数。受试者可以为胰岛素抗性的，和/或特征在于高血糖或高胰岛素血症。受试者可以处于发展到II型糖尿病的风险中。另见Larsen,等(2007)NEJM356:1517-26和Larsen,等(2009).Diabetes Care32:1663-8。在一些实施方案中，受试者的空腹血糖高于6.1、6.5、7或8mmol/L。在一些实施方案中，受试者的A1C水平高于5.5、5.7、6、6.4、7、7.5或8%。
在一些实施方案中，受试者还在施用胰岛素促分泌素，例如，刺激胰岛素分泌的磺酰脲（例如，氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪）和/或氯茴苯酸类（例如，瑞格列奈、那格列奈）。受试者还可施用双胍（例如，二甲双胍）。可施用所述受体结合剂以减少胰腺β细胞的损失和/或对胰腺β细胞的损伤。
在一些实施方案中，该受试者对于位于基因IL1RN5’附近的rs4251961的C等位基因而言是杂合的或纯合的。
用受体结合剂治疗包括改善与糖尿病相关的继发性病症或防止其恶化，诸如糖尿病视网膜病变、糖尿病患者中的肾脏移植排斥、肥胖介导的胰岛素抗性和肾衰竭，其本身可与蛋白尿和高血压相关。
胃肠疾病.本文所述的受体结合剂可用于治疗炎性胃肠疾病，包括（例如）乳糜泻、克隆氏病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、包括慢性胰腺炎的特发性胃轻瘫胰腺炎、急性胰腺炎、炎性肠病以及包括胃和十二指肠溃疡的溃疡。
肺病.受体结合剂可用于治疗IL-1介导的肺病。可治疗的示例性肺病包括：慢性阻塞性肺病（例如肺气肿和慢性支气管炎）、肺泡蛋白沉积症、博来霉素诱导肺病和纤维化、肺纤维化（包括特发性肺纤维化和放射诱导的肺纤维化）、肺结节病、囊性纤维化、肺胶原聚集、ARDS、支气管肺发育不良(BPD)、早产儿慢性阻塞性肺病和慢性纤维化肺病。此外，本文所述的受体结合剂可用于治疗职业肺病，包括石棉肺、煤矿工人尘肺症、硅肺病或与长期暴露在细微粒下相关的相似病症。包括嗜酸性粒细胞肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎的炎性和纤维化肺病可涉及可用受体结合剂治疗的失调免疫炎性反应。
类肉瘤病是一种病因不明的病症，其特征在于在全身的几乎任何组织中都存在上皮样肉芽；牵涉肺部是最常见的。发病机制涉及在疾病位置持续存在活化的巨噬细胞和淋巴样细胞，随后由这些细胞类型所释放的活性产物的局部和全身性释放所造成的慢性后遗症。
心血管疾病.本文所述的受体结合剂可用于治疗心血管疾病或损伤，诸如主动脉瘤、急性冠状动脉综合征、动脉炎、血管阻塞（包括脑动脉梗塞）、冠状动脉旁路手术并发症、缺血/再灌注损伤、心脏病（包括动脉粥样硬化心脏病）、心肌炎（包括慢性自身免疫性心肌炎和病毒性心肌炎）、心力衰竭（包括慢性心力衰竭、充血性心力衰竭）、心肌梗塞、在心脏手术后或在颈动脉球囊血管成形术后的再狭窄和/或动脉粥样硬化、无症状性心肌缺血、左室泵血功能减退、左心室辅助装置植入后并发症、雷诺现象(Raynaud’sphenomena)、血栓性静脉炎、血管炎（包括川崎血管炎(Kawasaki’s vasculitis)）、静脉闭塞症、巨细胞动脉炎、韦格纳肉芽肿和亨-舍二氏紫癜。还可以预防性地提供受体结合剂，例如以降低此类心血管疾病的风险。在一些实施方案中，将受体结合剂施用给患者以治疗动脉粥样硬化或降低其风险。
IL-1介导的信号转导通过急性心肌梗塞而激活，并可引发梗死周围心肌细胞中的凋亡细胞死亡，从而扩大梗死区。可施用本文所述的受体结合剂以减少心肌梗塞所致的损害。例如，可将受体结合剂施用给处于心肌梗塞风险中的受试者，或施用给已经历心肌梗塞的受试者，尤其是急性心肌梗塞，例如，在最近2、4、6、12、24、或48小时内。该药剂可结合其他药剂施用，包括（例如）肝素和阿司匹林。
受体结合剂还可用于治疗中风、蛛网膜下出血、头部外伤或脑损伤和/或心血管疾病相关炎症。例如，升高的IL-1β水平与中风和脑损伤相关的神经炎症有牵连(Rothwell,N.J.,等,TINS23(12):618-625,2000)。可施用受体结合剂以减少此类炎症和与缺血和/或低氧相关的其他炎症。此外，还可预防性地提供受体结合剂，例如，以降低此类疾病的风险和/或与此类疾病相关的炎症。例如，可将受体结合剂施用给处于中风、缺血事件、其他心血管事件或出血事件（诸如蛛网膜下出血）风险中的受试者，或施用给已经历中风、缺血事件、其他心血管事件或出血事件（诸如蛛网膜下出血）的受试者，例如在最近2、4、6、12、24或48小时内。
泌尿生殖系统疾病和肾病.泌尿生殖系统的疾病也可用本文所述的受体结合剂治疗。此类疾病包括肾小球性肾炎，包括自身免疫肾小球性肾炎、由于暴露于毒素所引发的肾小球性肾炎或被溶血性链球菌或其他感染原感染后继发的肾小球性肾炎。免疫介导的肾病（包括肾小球性肾炎和肾小管间质性肾炎）是抗体或T淋巴细胞介导的对肾脏组织的损伤的结果，直接原因是对抗肾抗原的自身反应性抗体或T细胞的产生，或间接原因是对其他非肾抗原具有反应性的抗体和/或免疫复合体在肾脏中的沉积。因此，其他造成免疫复合体形成的免疫介导的疾病也可作为间接后遗症诱导免疫介导的肾病。直接和间接免疫机制两者都会导致炎性反应，其产生/诱导肾脏组织中的病变发展，致使器官功能损害以及在一些情况下进展为肾衰竭。体液和细胞免疫机制两者都涉及在病变的发病机制中。
受体结合剂也可用于治疗尿毒综合征及其临床并发症（例如，肾衰竭、贫血和肥厚性心肌病），包括与暴露于环境毒素、药物或其他原因有关的尿毒综合征。由于胆囊壁发炎所引起的造成吸收功能改变的并发症也可治疗。此类并发症包括胆石症（胆结石）和胆管结石症（胆管结石）以及胆石症和胆管结石症的复发。可治疗的其他病症为血液透析的并发症；前列腺病症，包括良性前列腺肥大、非细菌性前列腺炎和慢性前列腺炎；以及血液透析的并发症。受体结合剂也可用于治疗慢性疼痛病症，诸如慢性骨盆病，包括慢性前列腺炎/骨盆病综合征，以及疱疹后疼痛。
血液和肿瘤疾病.本文所述的受体结合剂可用于治疗多种形式的癌症，包括急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，EB(Epstein-Barr)病毒阳性鼻咽癌，胶质瘤，结肠、胃、前列腺、肾细胞、子宫颈和卵巢癌，肺癌（SCLC和NSCLC），包括与癌症相关的恶病质、疲乏、无力、恶病质副肿瘤综合征以及高钙血症。参见例如，Voronov等(2003)PNAS100:2645-2650。包括肉瘤、骨肉瘤和上皮细胞癌（诸如腺癌（例如，乳腺癌）和鳞状上皮细胞癌）的实体瘤也是可治疗的。关于IL-1β在某些肿瘤中的作用，参见例如，Krelin等(2007)Cancer Res.67:1062-1071。其他癌症包括食道癌、胃癌、胆囊癌、白血病，包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓性白血病、慢性或急性淋巴细胞性白血病和毛细胞白血病。其他具有侵入性转移可能的恶性肿瘤（包括多发性骨髓瘤）可用所述受体结合剂治疗。参见例如，Lust等(2009)Mayo Clin Proc84(2):114-122。
受体结合剂也可用于治疗贫血和血液疾病，包括慢性特发性中性粒细胞减少症、慢性疾病的贫血、再生障碍性贫血，包括范科尼再生障碍性贫血(Fanconi’s aplastic anemia)；特发性血小板减少性紫癜(ITP)；血栓性血小板减少性紫癜、骨髓增生异常综合征（包括难治性贫血、环形铁粒幼细胞性难治性贫血、原始细胞过多性难治性贫血(refractory anemia with excess blasts)、转化型难治性贫血伴原始细胞增多(refractory anemia with excess blasts intransformation)）；骨髓纤维化/髓样化生；以及镰状细胞血管阻塞危机。
自身免疫性溶血性贫血、免疫性全血细胞减少和阵发性夜间血红蛋白尿可因与在红细胞（并在一些情况下，也有其他血细胞，包括血小板）表面上表达的抗原发生反应的抗体的产生所致，并且是通过补体介导的裂解和/或ADCC/Fc受体介导的机制来移除那些受抗体包被的细胞的结果。在自身免疫性血小板减少（包括血小板减少性紫癜）以及在其他临床背景下的免疫介导的血小板减少中，血小板的破坏/移除因为抗体或补体贴附到血小板并随后通过补体裂解、ADCC或FC受体介导的机制移除而发生。
也可将受体结合剂施用给患有各种淋巴增生疾病或处于其风险之中的受试者，包括自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、慢性淋巴性白血病、外周T细胞淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、EB病毒阳性T细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤、何杰金氏病(Hodgkin’s disease)、弥漫侵袭性淋巴瘤、急性淋巴性白血病、T-γ淋巴组织增生性疾病、皮肤B细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤（即，蕈样肉芽肿）和西泽里综合征(Sezarysyndrome)。
肝病.本文所公开的受体结合剂也可用于治疗肝脏病症，诸如肝炎，包括急性酒精性肝炎、急性药物性或病毒性感性、甲肝、乙肝、丙肝、硬化性胆管炎、肝窦上皮以及由未知原因所致的肝脏炎症。
听力疾病.受体结合剂还可用于治疗涉及听力损失并与异常IL-1表达相关的疾病。此类疾病包括与耳蜗神经相关的被认为是因自身免疫过程所致的听力损失，例如，自身免疫听力损失、美尼尔氏综合征(Meniere’s syndrome)和胆脂瘤，一种通常与听力损失相关的中耳疾病。
骨病.骨骼和关节的非关节炎疾病也可用本文所述的受体结合剂治疗。这涵盖骨骼或关节的炎性疾病，导致骨质流失的破骨细胞疾病，诸如但不限于骨质疏松症（包括停经后骨质疏松症）、骨关节炎、造成牙齿松脱或掉齿的牙周炎，以及在关节置换术后的假体松动（通常与磨耗碎片的炎性反应有关），例如，骨科植入物骨质溶解。
淀粉样疾病.进一步地，本文所述的受体结合剂可用于治疗特征在于多种病症的原发性淀粉样变性和继发性淀粉样变性，包括阿尔茨海默病、继发型反应性淀粉样变性；唐氏综合征；以及透析相关淀粉样变性。此外，受体结合剂可用于治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨丁顿舞蹈症和帕金森病。这些疾病还可涉及可触发炎性反应的聚集体和淀粉样蛋白的形成。
神经疾病.受体结合剂也可用于治疗中枢和外周神经系统的神经炎症和脱髓鞘病，包括多发性硬化；特发性脱髓鞘性多神经病或格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)；以及慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。据信，这些疾病具有自身免疫基础，并因对少突细胞或直接对髓鞘引起的损害而导致神经脱髓鞘。在多发性硬化中，疾病的诱发涉及T淋巴细胞。多发性硬化具有复发缓解型病程或慢性进行性病程。病变含有主要为T淋巴细胞介导的小胶质细胞和浸润性巨噬细胞的浸润；CD4+T淋巴细胞是在病变处的主要细胞类型。少突细胞的细胞死亡以及随后的脱髓鞘作用的机制仍不清楚，但有可能是T淋巴细胞所驱动的。
肌肉疾病.受体结合剂可用于治疗与炎症和自身免疫相关的肌肉疾病。包括皮肌炎、多肌炎等的特发性炎性肌肉疾病是病因不明的造成肌肉无力的慢性肌肉炎性疾病。肌肉损伤/炎症通常为全身性的和进展性的。自身抗体与大多数形式相关。这些肌炎特异性抗体针对并抑制蛋白质以及蛋白质合成中涉及到RNA等组分的功能。
血管炎疾病.本文所述的受体结合剂可用于治疗血管炎疾病，例如，系统性血管炎。系统性血管炎包括这样的疾病，其中原发性病变为炎症以及后续对血管的损伤，其导致由受累血管供血的组织缺血/坏死/退化，并在一些情况下最终导致终末器官功能障碍。血管炎也可作为其他免疫炎性介导疾病诸如类风湿性关节炎、系统性硬化等的继发病变或后遗症而发生，尤其是在也和免疫复合体的形成相关的疾病中。
在原发性系统性血管炎群组中的疾病包括：系统性坏死性血管炎；结节性多动脉炎、变应性血管炎和肉芽肿、多血管炎；韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)；淋巴瘤样肉芽肿；以及巨细胞动脉炎。其他血管病变包括：黏膜皮肤淋巴结综合征（MLNS或川崎病）、孤立性CNS血管炎、白塞氏病(Behcet’s disease)、血栓闭塞性脉管炎（伯格氏病(Buerger’s disease)）和皮肤坏死性小静脉炎。据信，这些血管炎疾病的致病机制主要是因为免疫球蛋白复合体在血管壁中沉积，随后通过ADCC、补体活化或这两者而引起炎性反应。
CAPS.受体结合剂可用于治疗CAPS疾病，即CIAS1相关周期综合征。CAPS包括三种遗传性综合征：新生儿发病多系统炎症性疾病(NOMID)、穆-韦二氏综合征(MWS)和家族性寒冷性自身炎性综合征(FCAS)。（Hoffman等2001Naure29:301-305；Feldmann等2002Am J Hum Genet71:198-203；Aksentijevich等2002Arthritis Rheum46:3340-3348）。CAPS可以偶发性或家族性模式而以常染色体显性方式遗传。CIAS1编码“炎性体”的蛋白质组分NALP3，而炎性体则是一种调节半胱天冬酶1的活性的亚细胞酶复合体。CIAS1中的突变导致IL-1的产生增多以及许多病理性结果(Aksentijevich等2002同上)。IL-1强力诱导肝脏中急性期反应物的产生，诸如C反应性蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
CAPS疾病具有共同的临床特征并表现出一系列临床严重度。NOMID造成的失能最严重，MWS稍低，并且FCAS最轻。CAPS疾病具有多种重叠的特征，而个体可具有体征和症状的特有组合。所有这些病症的共同特征包括发热、荨麻疹样皮疹、关节炎或关节痛、肌痛、不适和结膜炎。
在NOMID中，慢性无菌性脑膜炎可导致智力迟钝，并且这些患者还可能造成毁容并在骺和髌骨处使骨骼不能过度生长。这些患者还可能因颅内压升高导致的视神经萎缩而造成失明。MWS和NOMID通常与可包括听觉系统、脑膜和关节的严重炎症有关。这些患者可能患有每日高热以及分布和强度经常变化的慢性皮疹。患者可能出现听力损失或失聪。经常会观察到结膜炎和视神经乳头水肿。淀粉样变性可能发展并由于慢性炎症以及急性期反应物（尤其是SM）的过度产生而导致肾衰竭。可将受体结合剂施用给患有NOMID、MWS或FCAS或诊断为具有与NOMID、MWS或FCAS相关的基因型的受试者。此外，可将受体结合剂施用给患有TRAPS的受试者（TNF受体相关性周期综合征）。
皮肤疾病.受体结合剂可用于治疗皮肤疾病，诸如炎性皮肤疾病或自身免疫或免疫介导的皮肤病。示例性疾病为牛皮癣。包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎的另外的自身免疫或免疫介导的皮肤病由自身抗体介导，其发生为T淋巴细胞依赖性的。牛皮癣是一种T淋巴细胞介导的炎性疾病。病变包含T淋巴细胞、巨噬细胞和抗原提呈细胞以及一些中性粒细胞的浸润。
可治疗的其他皮肤或黏膜疾病包括皮肤棘层松解性疾病，包括Darier病、毛囊角化病和寻常天疱疮。进一步的其他疾病包括：痤疮、红斑痤疮、斑秃症、口疮性口炎、大疱性类天疱疮、烧伤、湿疹、红斑（包括多形性红斑和水疱性多形红斑（史蒂文斯—约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)）)、皮肤炎症、扁平苔癣、线状IgA大疱病（儿童慢性大疱性皮肤病）、皮肤失去弹性、粘膜表面溃疡（包括胃溃疡）、嗜中性皮炎（Sweet综合征）、皮肌炎、毛发红糠疹、牛皮癣、坏疽性脓皮病、多中心网状组织细胞增生症和中毒性表皮坏死松解症。可通过受体结合剂治疗的其他皮肤相关病症包括疱疹样皮炎（杜林病(Duhring’s disease)）、特应性皮炎、接触性皮炎和荨麻疹（包括慢性特发性荨麻疹）。
过敏性疾病.受体结合剂可用于治疗过敏性疾病，诸如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、过敏性结膜炎（另见下文）和荨麻疹。这些疾病通常通过T淋巴细胞诱导的炎症、IgE介导的炎症或这两者而介导。
哮喘是一种涉及呼吸系统的慢性病症，其中气道偶尔会收缩、发炎，并且内衬有过量的黏液，通常是对一种或多种触发物的反应所致。发作可因暴露于环境刺激物（或过敏原）诸如冷空气、暖空气、湿空气、锻炼或运动、情绪压力和病毒性疾病等而触发。气道狭窄导致诸如喘鸣、呼吸短促、胸闷和咳嗽的症状。受体结合剂可用于治疗哮喘并可配制成局部或肺部递送以用于此类治疗或可不经肠道递送。
移植.可将受体结合剂施用给即将接受移植、正在接受移植或正从移植中恢复的受试者。移植相关疾病（包括移植物排斥和移植物抗宿主病(GVHD)）是T淋巴细胞依赖性的；抑制T淋巴细胞功能可起到改善效果。角膜移植可与血管新生相关，这可通过受体结合剂的治疗而改善。受体结合剂也可用于治疗由实体器官移植（诸如心脏、肝脏、皮肤、肾脏、肺（肺移植呼吸道闭塞））或其他移植（包括骨髓移植）所造成的并发症。
感染性疾病.本文所述的受体结合剂可用于治疗原虫病（包括疟疾和血吸虫病）以及治疗麻风结节性红斑；细菌性或病毒性脑膜炎；结核病，包括肺结核；以及在细菌或病毒感染（包括流行性感冒感染和传染性单核细胞增多症）后继发的肺炎。
也可用受体结合剂治疗的为遗传周期性发热综合征（包括家族性地中海热）、高免疫球蛋白D综合征、周期性发热综合征、TNF受体相关性周期综合征(TRAPS)、成人斯蒂尔病(Adult-onset Still’s disease)、施尼茨勒综合征(Schnitzler’s syndrome)和纤维性肺泡炎。
在一些实施方案中，将受体结合剂施用给受试者以降低受试者中IL-6的活性或表达。例如，该受试者可具有与IL-6有关或至少部分地由IL-6介导的疾病。
眼部疾病和眼部递送
本文所述的受体结合剂可用于治疗眼部疾病，包括影响眼睛表面的眼部疾病、炎性眼部疾病以及至少部分地由自身免疫反应介导的眼部疾病。
在一些实施方案中，眼部疾病是影响眼睛表面的干眼症。所述疾病包括也也称为干燥性角结膜炎、干燥性角膜炎、干燥综合征、干眼病、泪膜疾病、泪液产生减少、泪水不足以及睑腺功能障碍的病症。干眼症可包括与舍格伦综合征(SS)相关的形式，例如舍格伦综合征相关干燥性角结膜炎，但也可包括与舍格伦综合征(SS)无关的形式，例如非舍格伦综合征相关干燥性角结膜炎。患者可以具有或可以不具有系统性自身免疫疾病的其他表现。IL-1牵涉在干眼症的发病中。参见例如，Enriquez de Salamanca等(2010),Mol.Vis.16:862-873。
患有干眼综合征的受试者可呈现眼睛干燥性发炎，并可出现瘙痒(scratchy)、刺痛(stingy)、发痒、灼热或受压感、刺激性、疼痛和发红。干眼可与过量流泪和相反地泪液产生不足两者有关。可将受体结合剂施用给此类受试者以改善或防止一种或多种此类症状的发生或恶化。受体结合剂也可用于正在经历诸如因神经炎症所致的疼痛（如眼痛）的受试者，以缓解此类疼痛。
在一些实施方案中，眼部疾病为与系统性自身免疫疾病（诸如舍格伦综合征和类风湿性关节炎）相关或者与IL-1或另一种IL-1细胞因子家族成员相关性疾病相关的眼部疾病。患者可以具有或可以不具有系统性自身免疫疾病或系统性自身免疫疾病的其他表现。
受体结合剂也可用于治疗其他影响眼睛表面（诸如角膜）的疾病。此类疾病包括角膜性眼表面炎性病症、角膜血管新生、角膜炎，包括边缘溃疡性角膜炎和细菌性角膜炎。受体结合剂可用于治疗正在发生角膜伤口愈合的受试者（例如，具有角膜伤口的受试者）。可将受体结合剂施用给即将接受眼睛相关手术、正在接受眼睛相关手术或正从眼睛相关手术中恢复的受试者，例如，角膜移植/角膜成形术、人工角膜移植手术、角膜板层移植、选择性内皮细胞移植。参见例如，Dana(2007)Trans Am Ophthalmol Soc105:330-43；Dekaris等(1999)Curr Eye Res19(5):456-9；以及Dana等(1997)Transplantation63:1501-7。受体结合剂可用于治疗影响结膜的疾病，包括结膜瘢痕疾病和结膜炎。受体结合剂可用于治疗其他疾病，诸如类天疱疮综合征和史蒂文斯—约翰逊综合征。可将本文所述的受体结合剂施用给受试者以调节眼睛中或眼睛周围的血管新生。参见例如，Dana(2007)Trans AmOphthalmol Soc105:330-43。
可将受体结合剂施用给患有影响眼睛的过敏反应的受试者，例如，经历严重过敏（特应性）眼病诸如过敏性结膜炎的受试者。例如，受体结合剂可局部施用。另见例如，Keane-Myers AM等(1999)Invest Ophthalmol Vis Sci,40(12):3041-6。
可将受体结合剂施用给影响眼睛的自身免疫疾病的受试者。示例性自身免疫眼部疾病包括交感性眼炎、Vogt-小柳原田(Vogt-Koyanagi Harada)(VKH)综合征、鸟枪弹样视网膜脉络膜病变、眼瘢痕性类天疱疮、Fuchs异色虹膜睫状体炎和各种形式的葡萄膜炎。可将受体结合剂施用给受试者以治疗前述疾病中的任何一种。
可将受体结合剂施用给患有糖尿病性视网膜病或处于其风险之中的受试者。参见例如，Demircan等(2006)Eye20:1366-1369和Doganay等(2006)Eye,16:163-170。
葡萄膜炎包括急性和慢性形式，并包括虹膜、睫状体和脉络膜中一者或多种的炎症。慢性形式可与系统性自身免疫疾病相关，例如，白塞氏综合征、强直性脊柱炎、幼年型类风湿性关节炎、赖特综合征(Reiter’s syndrome)和炎性肠病。在前葡萄膜炎中，炎症主要在虹膜中（即虹膜炎）。前葡萄膜炎可影响患有系统性自身免疫疾病的受试者，也可影响无全身性自身免疫疾病的受试者。中间葡萄膜炎涉及前玻璃体、周边视网膜和睫状体的炎症，通常只有很少的前或脉络视网膜炎症。睫状体平坦部炎因虹膜与脉络膜之间的平坦部发炎所致。后葡萄膜炎涉及葡萄膜并且主要是脉络膜，并且也称为脉络膜炎。后葡萄膜炎可与全身性感染或自身免疫疾病相关。它可以持续数月甚至数年。可将受体结合剂施用给受试者以治疗葡萄膜炎的前述形式中的任何一种。另见例如，Tsai等(2009)Mol Vis15:1542-1552和Trittibach P等(2008)Gene Ther.15(22):1478-88。
在一些实施方案中，受体结合剂用于治疗患有老年性黄斑变性(AMD)或处于其风险之中的受试者。受体结合剂可局部施加给眼睛、注射（例如，玻璃体内）或全身性提供。参见例如，Olson等(2009)Ocul Immunol Inflamm17(3):195-200。
本文所述的受体结合剂可通过任何方式施用以治疗眼部疾病。该药剂可以非肠道方式递送。作为另外一种选择或除此之外，该药剂可直接递送到眼睛或眼睛附近。例如，蛋白质可局部或眼内施用，例如如下所述。
制剂和眼部递送方法
可递送包含受体结合剂的眼科制剂以局部施用，例如，作为液滴或软膏施用，或用于植入，例如植入眼睛前房或结膜囊。液滴可使用滴眼管递送。当配制成供眼部递送时，受体结合剂可以0.0001-0.1%、0.001-5%例如，0.005-0.5%、0.05-0.5%、0.01-5%、0.1-2%或1%-5%的浓度存在。很多情况下，将眼科制剂直接施加到眼睛，包括局部施加到眼睑或滴注到眼球与眼睑之间的空间（陷凹）中。眼科制剂可设计为与泪液容易地混合，并在角膜和结膜表面上散开。通过常见的施用技术，药物的大部分沉积到下穹隆中。毛细作用、扩散力和眨眼反射促使药物结合在角膜前膜中，自角膜前膜处药物进入并透过角膜。
眼科制剂还可以包含一种或多种其他药剂，例如，抗炎甾体诸如利美索龙、氯替泼诺、甲羟松和氢化可的松，或非甾体抗炎药。例如，甾体可以0.001至1%的浓度存在。在一些实施方案中，不存在甾体。例如，受体结合剂是制剂中的唯一活性药剂。
制剂还可以包含以下组分中的一种或多种：表面活性剂、张力剂、缓冲剂、防腐剂、共溶剂和粘度助剂。张力剂可用于调节组合物的张力，例如调节到天然泪液的张力。例如，可以添加氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钙、右旋糖和/或甘露糖醇以达到合适的张力，例如，生理张力。张力剂可按足以提供约150-450mOsm或250-350mOsm的渗透压度的量添加。
制剂还可以包含适合眼科递送的缓冲剂。缓冲剂可包含一种或多种缓冲组分（例如，磷酸钠、醋酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸）以特别是在储藏条件下缓冲pH的变化。例如，可选择缓冲剂以提供在pH6.0-7.5（例如，6.5-7.5）范围内的目标pH。
制剂可包含水性或磷脂载体。尤其是对于治疗干眼病，制剂可包含提供短期缓解的药剂，例如，润滑眼睛并有助于泪液形成的化合物。例如，磷脂载体（其可包含一种或多种磷脂）可用于提供短期缓解。可用作人造泪液载体的实例或人造泪液组合物包括商业产品诸如Tears NaturaleTM(Alcon Labs,Inc.,TX USA)。例如，每毫升制剂可包含：1mg葡聚糖70和3mg羟丙基甲基纤维素和任选的防腐剂诸如
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（聚季铵盐-1）0.001%(m/v)。磷脂载体制剂的实例包括在US4,804,539、US4,883,658、US5,075,104、US5,278,151和US5,578,586中公开的那些。
制剂还可以包含用作润滑剂或润湿剂的其他化合物。这些包括粘性剂，诸如：单体多元醇，诸如甘油、丙二醇、乙二醇；聚合多元醇，诸如聚乙二醇；纤维素家族的各种聚合物：羟丙基甲基纤维素(“HPMC”)、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素(“HPC”)；葡聚糖类，诸如葡聚糖70；水溶性蛋白质，诸如明胶；和乙烯基聚合物，诸如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮；以及卡波姆，诸如卡波姆934P、卡波姆941、卡波姆940、卡波姆974P。其他实例包括多糖，诸如透明质酸及其盐和硫酸软骨素及其盐，以及丙烯酸聚合物。在某些实施方案中，制剂具有1至400cP的粘度。
制剂可包装成作为单次或多次剂量使用，例如，包装在具有相连滴管的瓶子中或包装成一组单次使用的滴管。制剂可包含一种或多种防腐剂，例如，以在使用期间避免微生物和真菌污染。示例性防腐剂包括：苯扎氯铵、氯丁醇、苯扎溴铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸和聚季铵盐-1，并且可以0.001至1.0%w/v的浓度包含在内。还可能提供包含受体结合剂的无菌但不含防腐剂的制剂。制剂可制备成供单次使用应用。
眼科包可用于使眼科制剂与眼睛的接触时间延长。使棉拭子饱含制剂，然后将其插入上或下穹隆。受体结合剂也可通过离子电渗疗法施用。该手术在具有电极的洗眼杯中使溶液与角膜保持接触。药物的扩散通过电势差实现。
受体结合剂也可通过注射施用，例如结膜下注射。可将制剂注射在结膜之下，从而通过单纯扩散促使其穿过巩膜进入眼睛。也可将制剂注射在结膜下以及下面的眼睛更后部中的Tenon囊之下，以将药剂递送至睫状体、脉络膜和视网膜。制剂也可通过眼球后注射而施用。
关于干眼和其他表面疾病，可使用以下方法中的一种或多种来评估受试者：眼表疾病指数(OSDI)、角膜和结膜染色以及希尔默试验(Schirmer test)。
眼表疾病指数(OSDI)是包含12个项目的调查问卷，其提供与眼表炎性疾病（包括DES）一致的眼睛刺激症状以及它们对视力相关功能的影响的快速评价。参见例如Ocul Immunol Inflamm.2007年9月至10月；15(5):389-93。OSDI调查问卷的12个项目按0至4的量表评级。评分基于反应而得出，以提供0到100分级的OSDI评分，评分越高表示残疾度越大。相对于基线的负向变化表示视力相关功能和眼部炎性疾病的改善。
角膜和结膜染色：角膜染色是一种对上皮性疾病或眼表上皮屏障破裂（通常可见于诸如干眼症的眼表炎性疾病）的度量。如果存在严重的眼睑疾病（诸如后睑缘炎），即使没有临床上明显的干眼症，角膜染色也可存在。角膜染色在许多患者（尽管不是全部患者）中与眼部不适高度相关；如上所述，一般而言角膜染色与OSDI的高分相关。对于角膜荧光素染色，可使用盐水润湿的荧光素条或1%荧光素钠溶液来染色泪液膜。然后，使用裂隙灯评估以黄色阻挡滤光片(#12Wratten)和钴蓝照明对整个角膜进行检查。根据Oxford Schema对染色评级。结膜染色同样也是一种对上皮性疾病或眼表上皮屏障破裂的度量。结膜染色利用丽丝胺绿在裂隙灯下进行。将盐水润湿的条或1%丽丝胺绿溶液用于染色泪膜，并且随后在超过30秒但短于2分钟时对睑间结膜染色进行评价。使用中等强度的白光，通过Oxford Schema仅对鼻侧和颞侧结膜染色的睑间区域进行评级。
希尔默试验：希尔默试验在存在和不存在麻醉下通过在下陷凹中放置窄滤纸条（Whatman#41滤纸的5×35mm条）而进行。该试验在光线昏暗的房间中进行。患者轻轻闭上眼睛持续五分钟，然后移除纸条。由于将纸条从眼睛移除后泪液前沿将继续前进数毫米，因此在准确的第五分钟时用圆珠笔标记泪液前沿。通过在5分钟内纸条浸湿的毫米长度来测量泪水的产生。在没有麻醉的情况下希尔默试验的结果为10mm或更少以及在有麻醉的情况下希尔默试验的结果为5mm或更少被视为异常。相对于基线的正向变化表示本文所述的眼部炎性疾病中的一种或多种症状的改善。
制剂和肺部递送方法
可将受体结合剂配制成用于吸入性或其他模式的肺部递送，例如，以将该药剂施用至呼吸道（例如，上呼吸道和下呼吸道）的组织。三种可用于将药剂局部递送至肺部气道的常用系统包括干粉吸入器(DPI)、计量吸入器(MDI)和喷雾器。MDI可用于以溶解形式或作为分散体递送受体结合剂。通常，MDI装有氟利昂或其他相对高蒸气压的推进剂，其在启动装置时推动雾化药品进入呼吸道。相比之下，DPI通常依赖患者的吸气用力以将干粉形式的药物引入肺中。喷雾器通过将能量传给液态溶液而形成将被吸入的药物气溶胶。药剂可以冻干形式（例如，在室温下）储藏，并在吸入前在溶液中复溶。在液体通气或肺灌洗期间使用含氟化合物介质进行药物的直接肺部递送也是可能的递送模式。这些和其他方法可用于递送受体结合剂。例如，药剂以每次喷出至少约0.02、0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、20、40或50mg或更多的剂量单位形式递送。
受体结合剂可通过使用合适的推进剂（例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、dielilorotetrafluoroctliane、二氧化碳或其他合适的气体）便利地从加压包或喷雾器中以气溶胶喷雾的呈现形式递送。就加压气溶胶而言，剂量单位可通过提供阀门来递送计量的量而决定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒可制成包含受体结合剂和合适粉末基料（诸如乳糖或淀粉）的粉末混合物（如果颗粒是配方颗粒）。除了配方或非配方受体结合剂外，其他材料（诸如100%DPPC或其他表面活性剂）也可一起混合，以促进配方或非配方受体结合剂的递送和分散。粒度也可以变化以控制是递送到下呼吸道还是上呼吸道。例如，1-5微米或10-50微米大小范围内的粒度可分别用于下呼吸道和上呼吸道。
诸如表面活性剂的递送增强剂可用于进一步增强肺部递送。表面活性剂一般而言是具有亲水性和亲脂性部分的化合物，其通过与两不混溶相之间的界面发生相互作用而促进药物的吸收。表面活性剂可因多种原因用于干燥的颗粒，例如，减少颗粒聚集以及减弱巨噬细胞吞噬。表面活性剂在本领域中是熟知的并包括：磷酸甘油酯类，例如，磷脂酰胆碱类、L-α-二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二磷脂酰甘油(DPPG)；十六醇；脂肪酸类；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-；月桂醇醚；棕榈酸；油酸；脱水山梨糖醇三油酸酯(Span85)；甘氨胆酸盐；表面活性素；泊洛沙姆；脱水山梨糖醇脂肪酸酯；脱水山梨糖醇三油酸酯；泰洛沙泊；和磷脂类。
本文的特征还在于特异性识别本文所述的嵌合细胞因子结构域的抗体。例如，此类抗体相对于任何亲本细胞因子结构域优先地与嵌合结构域结合。例如，特异性抗体可与包含位于第一亲本细胞因子片段与第二亲本细胞因子之间的接合部的表位结合。
核酸递送
可通过递送编码受体结合剂并可表达该受体结合剂的核酸而向受试者提供受体结合剂。例如，可将编码受体结合剂的核酸序列置于转录控制序列的控制之下并设置在核酸载体中以进行基因递送，所述核酸载体例如病毒载体。示例性病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒或腺相关病毒载体。载体可以为质粒或线性分子的形式，例如，线性双链DNA。递送的核酸可设计为结合到靶细胞的基因组中，例如，整合到靶细胞的基因组中。作为另外一种选择，递送的核酸可设计为使得在递送后其自主存在于细胞中。
可对转录控制序列进行工程化处理以提供瞬时或组成型表达。瞬时控制可包括通过外源性物质调节的控制，例如，通过使用响应外源性物质（例如，甾体激素或FK506）或环境信号的转录因子的转录反应元件。
在所递送的核酸上提供的基因的表达可例如通过检测由该基因编码的蛋白质（例如，使用抗体）或通过检测mRNA（例如，使用PCR或Northern杂交）进行评价。通常对递送的核酸进行工程化处理，以使得转录和翻译调控DNA相对于受体结合剂的编码序列被适当定位，继而使得转录得以引发并且蛋白质通过所产生的消息进行翻译。核酸可包含来自哺乳动物细胞尤其是人的转录和翻译调控核酸序列。此类序列包括（例如）启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。
此外，表达载体可以包含另外的元件。例如，对于整合表达载体，该表达载体可包含与宿主细胞基因组同源的至少一个或两个序列，例如，位于表达构建体的侧翼。可通过选择包含在载体中的合适的同源序列，将整合载体导向宿主细胞中的特定基因座。整合载体的构建体在本领中是熟知的。
示例性腺病毒载体包括诸如Ad2或Ad5的人腺病毒的修饰形式，其中移除了病毒在体内复制所必需的遗传元件。例如，E1区域可以被移除，并且基因组可进一步被修饰以接受编码受体结合剂的表达盒。
示例性逆转录病毒载体包括LNL6、LXSN、LNCX和慢病毒载体。特定的慢病毒载体在Pawliuk等(2001)Science294:2368和Imren等(2002)PNAS99:14380中进行了描述，并包括限于人免疫缺陷病毒（例如，HIV-1、HIV-2）、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺损病毒(BIV)和马传染性贫血病毒(EIAV)。这些载体可以构建并工程化为安全的，例如，通过将必需基因（例如，gag和pol）分离到单独的载体上并使得成为逆转录病毒复制缺陷型的。然后采用标准技术通过使用辅助病毒或包装细胞系将复制缺陷型逆转录病毒包装成病毒粒子。用于产生重组逆转录病毒以及用于通过此类比病毒在体外或体内感染细胞的方案可见于Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel,F.M.等(编著)Greene Publishing Associates,(1989),Sections9.10-9.14以及其他标准实验室手册。逆转录病毒载体除了包含表达受体结合剂的序列外还可以包含：左侧(5')逆转录病毒LTR；逆转录病毒导出元件，任选地逆向反应元件(reverse response element,RRE)；启动子和基因座控制区(LCR)或其他转录绝缘子序列(transcriptional insulatorsequence)以及右侧(3')逆转录病毒LTR。逆转录病毒可进一步包含中心多嘌呤管道(cPPT)或DNA侧翼以提高病毒滴度和转导效率。
包含编码受体结合剂的序列的核酸可递送到任何合适的靶细胞，例如，在体外或体内。示例性靶细胞包括滑膜细胞、造血细胞、真皮细胞等。核酸可递送到与眼睛相关的靶细胞，例如，角膜上皮细胞。递送可包括清创或刮除角膜上皮以暴露上皮基底层。然后添加用于递送的核酸。在另一个实施方案中，将核酸递送到角膜内皮细胞、角膜周边之下的小梁网细胞、眼睛脉络膜层细胞、视网膜，巩膜或睫状体细胞、视网膜或眼部脉管细胞或玻璃体细胞或晶状体细胞，例如晶状体上皮细胞。
递送方法包括（例如）逆转录病毒感染、腺病毒感染、用质粒转化、用含外源核酸的脂质体转化、生物弹道核酸递送（例如，将核酸加载到金或其他金属粒子上，然后射击或注射进细胞）、腺相关病毒感染和EB病毒感染。递送可借助包括针注射、无痛皮下喷射、电穿孔或基因枪的任何方法进入细胞或组织。
用于基因递送的其他方法可见于例如：Kay,M.A.(1997)Chest111(增刊6):138S-142S；Ferry,N.和Heard,J.M.(1998)Hum.Gene Ther.9:1975-81；Shiratory,Y.等(1999)Liver19:265-74；Oka,K.等(2000)Curr.Opin.Lipidol.11:179-86；Thule,P.M.和Liu,J.M.(2000)Gene Ther.7:1744-52；Yang,N.S.(1992)Crit.Rev.Biotechnol.12:335-56；Alt,M.(1995)J.Hepatol.23:746-58；Brody,S.L.和Crystal,R.G.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.716:90-101；Strayer,D.S.(1999)Expert Opin.Investig.Drugs8:2159-2172；Smith-Arica,J.R.和Bartlett,J.S.(2001)Curr.Cardiol.Rep.3:43-49以及Lee,H.C.等(2000)Nature408:483-8。
示例性第二药剂
本文所述的受体结合剂可与第二药剂施用。两种药剂可（例如）使用不同的方案共施用或单独施用。示例性的第二药剂包括抗炎剂。在一个实施方案中，第二药剂为IL-17拮抗剂（涵盖所有IL-17家族成员的拮抗剂，例如，IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17E的拮抗剂）。示例性的IL-17拮抗剂包括：与IL-17（包括IL-17A、IL-17F、IL-17B、IL-17C、IL-17D和IL-17E）结合并拮抗IL-17介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；与一种或多种IL-17诸如IL-17RA和IL-17RC的受体结合并拮抗IL-17介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；与包含IL-17和至少一个受体亚单位的复合体例如IL-17和Il-17RA或IL-17、IL-17RA和IL-17RC结合并拮抗IL-17介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；以及诸如包含IL-17RA和IL-17RC的可溶性胞外域中的一个或多个并拮抗IL-17介导的信号转导的可溶性受体的药剂。
在另一个实施方案中，第二药剂为IL-12拮抗剂。示例性IL-12拮抗剂包括：与IL-12（包括p35和p40）结合并拮抗IL-12介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；与一种或多种IL-12诸如IL-12Rβ1或IL-12Rβ2的受体结合并拮抗IL-12介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；与包含p35、p40和至少一个受体亚单位例如IL-12Rβ1或IL-12Rβ2的复合体结合并拮抗IL-12介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；以及诸如包含L-12Rβ1或IL-12Rβ2的可溶性胞外域中的一个或多个并拮抗IL-12介导的信号转导的可溶性受体的药剂。
在另一个实施方案中，第二药剂为IL-23拮抗剂。示例性IL-23拮抗剂包括：与IL-23（包括p19和p40）结合并拮抗IL-23介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；与一种或多种IL-23诸如IL-12Rβ1或IL-23R的受体结合并拮抗IL-23介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；与包含p19、p40和至少一个受体亚单位例如IL-12Rβ1或IL-23R的复合体结合并拮抗IL-23介导的信号转导的药剂（诸如抗体和其他结合蛋白）；以及诸如包含IL-12Rβ1或IL-23R的可溶性胞外域中的一个或多个并拮抗IL-23介导的信号转导的药剂。
示例性IL-23抗体已有描述。参见例如Beyer等,J.Mol.Biol.(2008),doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001。
动物模型
受体结合剂可在人类疾病的动物模型中进行评价，例如，人自身免疫和/或人炎性疾病。药剂可具有针对动物中相应靶蛋白的特异性。
类风湿性关节炎模型.受体结合剂可在类风湿性关节炎动物模型，例如胶原诱导型关节炎(CIA)模型中进行评价。参见例如，McIndoe等,1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:2210-2214；Issekutz,A.C.等,Immunology(1996)88:569；以及Current Protocols in Immunology,15.5单元,Coligan等(编著),John Wiley&Sons,Inc。该模型通过用天然II型胶原对大鼠/小鼠的敏感品系进行免疫而建立。将胶原在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化并在尾巴根部进行皮内注射（100μg胶原:100μg CFA/小鼠）。向对照小鼠皮内注射0.05ml蒸馏水/CFA乳液。在初次免疫后21天，给予溶于不完全佐剂中的胶原的加强注射。疾病由通过胶原进行免疫而诱导的自身免疫反应所致。
使用限定的量表，对关节的关节炎、炎症、血管翳、软骨损伤和骨吸收进行评分。例如，关节炎的严重性可如下评分：0=没有可见的关节炎效应；1=一根足趾或关节出现浮肿和红斑；2=两个关节出现浮肿和红斑；3=多于两个关节出现浮肿和红斑；4=整只爪子和足趾发生严重关节炎，伴随足踝的关节僵硬和肢体的变形。可对各肢体的评分求和，并记录为各个动物的关节炎指数(AI)。其他评分方案也可用于这些及其他标准。
多发性硬化.实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的一种有用的鼠模型。受体结合剂可在EAE模型中进行评价。EAE为一种T细胞介导的自身免疫疾病，特征在于T细胞和单核细胞炎症以及随后在中枢神经系统中的轴突发生脱髓鞘。（参见例如，Bolton,C.,1995,Multiple Sclerosis,143）。示例性方案可见于Current Protocols in Immunology,15.1和15.2单元;Coligan等(编著),John Wiley&Sons,Inc.。髓鞘疾病也有相应的模型，在该模型中将少突细胞或许旺细胞(Schwann cell)移植到中枢神经系统中，例如，如Duncan等,1997,Molec.Med.Today,554-561中所述。
同种异体移植.受体结合剂可在皮肤同种异体移植排斥的动物模型中进行评估，例如使用鼠尾部皮肤移植。皮肤异体移植排斥由T细胞、辅助T细胞和杀伤效应T细胞介导。参见例如，Current Protocols in Immunology,4.4单元；Coligan等(编著),1995,John Wiley&Sons,Inc.。其他移植排斥模型也可使用。参见例如，Tinubu等,1994,J.Immunol.,4330-4338。
IBD和结肠炎模型.示例性炎性肠病模型为使用转移到SCID小鼠的CD4+CD45Rb高表达细胞。参见例如，Hirano等,J Pharmacol Sci.2009Jun;110(2):169-81以及使用转基因IL-10缺陷小鼠。参见例如，Inaba等,Inflamm Bowel Dis.,DOI:10.1002/ibd.21253(2010)。另一种示例性结肠炎模型采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导急性结肠炎。例如，可通过在自由摄取的饮用水中施用5%(重量/体积)的DSS（分子量30–40kDa；ICN Biomedicals,Aurora,OH）在小鼠中诱导结肠炎。在此种处理下所造成的症状为血性腹泻、体重减轻、结肠缩短和黏膜溃疡伴随嗜中性粒细胞浸润。DSS诱导的结肠炎在组织学上的特征在于炎性细胞侵入固有层，伴随着淋巴增生、局灶性隐窝损伤和上皮溃疡。这些变化被认为会发展，因为DSS对上皮的毒性效应以及固有层细胞的吞噬作用以及TNF-α和IFN-γ的产生。参见例如，Hassan等PLoS One.2010年1月25日；5(1):e8868。
干眼病模型.受体结合剂可在干眼病小鼠模型中进行评价。可通过以下方式诱导干眼病：皮下注射东莨菪碱，接着将小鼠放在环境受控的室内。作为特定实例，可通过持续暴露在环境受控室内的干燥环境而使正常健康的6至10周龄的雌性C57BL/6小鼠诱导成患有干眼症。室内具有低于30%（一般而言约19%）的低相对湿度、高气流量（15升/分钟）和恒温（约22℃）。放在室内的小鼠还用东莨菪碱进行处理以抑制泪液分泌。持续释放的透皮东莨菪碱贴片可得自Novartis(Summit,N.J.)。每48小时将一张贴片的四分之一施加到小鼠的脱毛尾部中段。环境受控室与东莨菪碱的组合在相对短的一段时间内（约2-4天）产生严重的干眼病。环境受控室可如Barbino等,Invest.Ophthal.Vis.Sci.,46:2766-2711(2005)所述来准备，并可控制气流量、湿度和温度。
可监测小鼠的干眼病体征，例如通过进行：a)棉线试验以测量泪水的产生，其在患有干眼病的患者中通常会减少；b)角膜荧光素染色，其是角膜表面损伤的一个标志；以及一般眼科检查。
棉线试验：可利用通过酚红(Zone-Quick,Lacrimedics,Eastsound,Wash.)浸渍的棉线来测量泪液的产生。在放大荧光灯下，将棉线用珠宝镊子夹持，并置于右眼结膜穹隆的外眦30或60秒。在显微镜下利用血球计标度读出泪液距离（以mm为单位）。
角膜荧光染色：角膜荧光染色可通过利用微量吸液管将1.0μl的5%荧光素施加至眼睛的下结膜囊而进行评价。在荧光素滴注后3分钟，将角膜通过裂隙灯生物显微镜利用钴蓝灯进行检查。利用0-3级的标准化美国国家眼科研究所(NEI)分级系统，针对被分成五个区域的角膜表面中的每个区域，以盲性方式记录点状染色。
诊断和其他用途
本文所述的受体结合剂可用于检测样本中的IL-1R1，或表达此受体的细胞。例如，可将药剂直接或间接地用作为标记或能产生信号的部分进行标记，该部分例如为酶、放射性标记、表位或荧光蛋白（诸如绿色荧光蛋白）。可使药剂与样本或细胞接触以确定所述受体是否存在于样本中或细胞上，例如，使用标准免疫印迹、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、荧光能量转移、Western印迹以及其他诊断和检测技术。
受体结合剂也可进行标记用于体内检测并施用给受试者。可对受试者成像，例如，通过NMR或其他断层成像装置。例如，结合剂可用放射性标记（诸如131I、111In、123I、99mTc、32P、125I、3H、14C和188Rh）、荧光标记（诸如荧光素和若丹明）、核磁共振活性标记、能通过正电子发射计算机断层("PET")扫描仪检测的正电子发射同位素、化学发光标记（诸如虫荧光素）和酶标记（诸如过氧化物酶或磷酸酶）进行标记。药剂可以用造影剂标记，诸如顺磁剂和铁磁性或超顺磁性（主要改变T2反应）物质。
受体结合剂也可用于纯化表达与其结合的受体的细胞。例如，可将受体结合剂与固定化载体（例如，磁珠或柱基质）连接并接触可能表达所述受体的细胞。载体可（例如）用生理缓冲液洗涤，并且可从载体回收细胞。
受体结合剂也可用于纯化与其结合的受体的可溶形式。例如，包含该可溶受体的样本可接触固定化的受体结合剂，然后，例如在洗涤后，可从固定化的受体结合剂中回收。
下列非限制性实例进一步说明本文所述的本发明的实施方案。
实施例
实施例1
在含有T7启动子和氨苄青霉素（pET31系列）或卡那霉素抗性基因（pET28系列）的pET载体(EMD Chemicals,Gibbstown NJ,USA)中，构建了编码具有表4（见下）所列氨基酸序列的蛋白质的核酸，并进行表达。可用于表达的编码序列的实例在表5中提供。
表4
Figure BDA00002991618700691
编码上述蛋白质的示例性核酸序列在表5中列出。在一些实施方案中，该核酸序列在下面所列的第一个核苷酸前进一步包含ATG。在一些实施方案中，该核酸序列在下面所列的最后一个核苷酸后进一步包含终止密码子（诸如TAA、TAG或TGA）。
表5
Figure BDA00002991618700701
Figure BDA00002991618700711
Figure BDA00002991618700712
蛋白质可包含如下所示的来自IL-1β和IL-1Ra的一系列不同残基。在实例P01、P02、P03、P04和P05之中，细胞因子结构域可具有48-70%来自IL-1β的残基以及55-78%来自IL-1Ra的残基。（由于大量氨基酸残基在这两种蛋白质之间是保守的，因此与IL-1β以及与IL-1Ra的百分比同一性的总和可大于100%。）
表6
Figure BDA00002991618700721
实施例2
通过在37℃下在LB肉汤培养基中用1mM IPTG诱导3小时，在大肠杆菌细胞BL21(DES)菌株中表达了含有六组氨酸标记的蛋白质。将细胞在20-50mM Tris、0.5M NaCl、2.5mM EDTA、0.1%Triton X-100(pH8.0)中裂解。使用
Figure BDA00002991618700722
预装填柱(GE Healthcare,Piscataway NJ,USA)将裂解液进行IMAC层析。将蛋白质上样到20mM磷酸钠、0.5M NaCl、10mM咪唑的pH7.4缓冲液中。将其用200mM咪唑、20mM磷酸钠、0.5M NaCl的pH7.4缓冲液洗脱。将洗脱出的蛋白质对PBS、0.1%聚山梨醇酯80(pH7.4)作广泛透析，使用
Figure BDA00002991618700723
(10K)过滤器浓缩，并在4℃或-80℃下保存。
不含六组氨酸标记的蛋白质通过离子交换层析纯化。P05蛋白质通过离子交换层析纯化。将得自表达细胞的裂解物在不存在盐的情况下（电导率约1mS/cm）在低pH（约pH5.5）下施加到GigaCapSTM柱(Tosoh Bioscience LLC,King of Prussia,PA,USA)上。然后通过pH梯度（缓冲液A=10mM乙酸，pH5.5；缓冲液B=20mM Tris pH8）对柱进行洗脱。然后将含有洗脱蛋白的5ml馏分用5ml H2O和5ml20mM Tris(pH8)洗脱，并然后施加到CaptoQTM树脂(GE Healthcare,Piscataway NJ,USA)上，并用20mM Tris(pH8.0)中的0mM至250mM NaCl梯度进行洗脱。将洗脱出的蛋白质对1.25X PBS0.1%
Figure BDA00002991618700724
80或不含
Figure BDA00002991618700725
的1.25X PBS作广泛透析，并保存。参见图6。将P03和P04蛋白质用相似的方法纯化。
使表达P05的细胞还在Sartorius2L BIOSTATTMA+中的补充了10g/L葡萄糖、10mM MgSO4、微量元素（1mg/ml TEKNOVATM1000X微量元素，#T1001）和抗生素的含非动物源大豆胨的TEKNOVATM极品肉汤(#T7660)中生长，并用1mM IPTG在OD35-40下诱导约6小时。细胞在以下条件下生长：37℃，含30%溶解氧，pH7.0，200-800rpm的搅拌，以及2L/min的氧气曝气。在通过pH升高所检测的葡萄糖耗尽时，向细胞进给9g葡萄糖/L/h。当pH降低时（诱导后约2.5小时），将进料降低到6g葡萄糖/L/h。
收集细胞，在裂解缓冲液（20mM Tris，10mM EDTA，0.1%Triton，pH8.0；20mM Tris，10mM EDTA，0.1%Triton，pH7.0；50mM MOPS，10mMEDTA，0.1%Triton，pH6.5或50mM MOPS，10mM EDTA，0.1%Triton，pH6.0）中裂解。在pH5.3和3mS/cm（35mg产物每毫升柱树脂）下将裂解液上样到Poros 
Figure BDA00002991618700731
阳离子交换介质(Life Technologies Corp.,Carlsbad CAUSA)。
在示例性程序中，使用pH7.0的含100mM MOPS25mM NaCl的缓冲液通过一个步骤将P05蛋白质洗脱到pH7.0。将第一个洗脱峰丢弃，并对第二个洗脱峰合并收集，并且其包含P05蛋白质。早期的合并液相对于des-Ala形式而言富含完整P05蛋白质。然后使该洗脱出的材料流经CaptoQTM阴离子交换树脂。收集包含完整P05蛋白质的穿柱液(flow through)。
在另一示例性程序中，将介质用100mM MOPS20mM NaCl(pH6.0)洗涤。使用pH6.0的含100mM MOPS50-58mM NaCl的缓冲液通过一个步骤将P05蛋白质洗脱到pH6.0。将第一洗脱峰与后续峰分离，并且其包含完整P05蛋白质。然后使该洗脱出的材料流经CaptoQTM阴离子交换树脂。收集包含完整P05蛋白质的穿柱液。
实施例3
可在基于细胞的测定中评价蛋白质或包含蛋白质的上清液的IL-1活性。HEK-BlueTMIL-1β反应性细胞用于监测IL-1β活性（可得自InvivoGen Inc.,San Diego CA,USA）。这些细胞包含处于与五个NF-κB和五个AP-1结合位点融合的IFN-β最小启动子控制之下的SEAP报告基因。IL-1β接合细胞表面上的IL-1受体导致NF-κB的活化以及SEAP产生。SEAP报告可例如使用QUANTI-BlueTM(InvivoGen Inc.,San Diego CA,USA)和分光光度分析进行检测。通过培养到70-80%汇合度的细胞制备HEK-Blue IL-1β细胞悬液。将重悬的细胞在新鲜生长培养基（DMEM，4.5g/l葡萄糖，2mM L-谷氨酰胺，10%(v/v)热灭活胎牛血清（在56℃下30min），50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素，100μg/ml NormocinT）中调整到约330,000个细胞/ml。
将以下试剂加到平底96孔细胞培养板的孔中：10μl20ng/ml的IL-1β、1μl所关注的药剂以及30μl细胞培养基，得到50μl的最终体积。平行地制备阳性和阴性对照样本。然后，将150μl HEK-Blue IL-1β细胞悬液（约50,000个细胞）加到各孔中，并将板在37℃下在5%CO2的组织培养箱中培养过夜。一般来讲，最终IL-1β浓度（以200μl最终体积）为0.1ng/ml。隔日（12-15小时后）评价IL-1β活性。在定量前，根据制造商说明制备QUANTI-BlueTM试剂。准备平底96孔测定板，其中向每个孔中加入150μl QUANTI-BlueTM溶液。将来自96孔组织培养板的孔中的50μl条件培养基加到测定板的每个孔中。将板在37℃下孵育约15-20分钟。然后使用分光光度计在620-655nm处测量SEAP水平。
结果.如图7A所示，在该测定中，P06蛋白质表现为IL-1RI激动剂，P07蛋白质表现为部分激动剂，而P01蛋白质则未能起到激动作用。事实上，在IL-1β存在下进行测定时P01蛋白质表现为拮抗剂。图7B显示使用以上的HEKBlueTM细胞测定，在一定范围的IL-1β蛋白浓度下P01拮抗IL-1β活性。随着P01的量增加，拮抗作用增强（x轴反映含有P01的上清液的微升数）。
蛋白质P01、P02、P03、P04和P05每一者都会拮抗IL-1β活性。例如，参见图8A和8B。P05的IC50小于约5ng/ml。在该测定中测试了P05激动IL-1RI的能力，并且甚至在所测试的最高浓度(1mg/ml)下也未观察到具有任何可检测的激动活性。P01、P02、P03、P04和P05还抑制了MG-63细胞（响应IL-1β的人骨肉瘤细胞系）中IL-1β诱导的IL-6表达。在干眼病鼠模型中，观察到了六组氨酸标记的P05具有生物活性。关于未标记的P05，另见下文实施例8。
实施例4
通过Reichert SR7000DC双通道SPR系统，采用表面等离子体共振评价蛋白质对可溶性重组人IL-1RI（对应于IL-1RI的胞外域）的结合性质。在含有0.005%Tween20的磷酸缓冲盐水中对结合进行评价。据观察，IL-1β具有8-9nM的KD和2-3×10-3s-1的解离常数(Kd)以及在另一实验中约2nM的KD、1.3-1.5×106M-1s-1的缔合常数和约2.9-3.0×10-3s-1的解离常数(Kd)。参见图9A。P01蛋白质以与IL-1β类似的缔合动力学结合，但在结合实验的解离阶段（约180秒）中不解离。因此，在相似的条件下，P01蛋白质以高于IL-1β的亲和力与IL-1RI结合。
据观察，IL-1Ra的结合具有约0.33nM的KD、约2×105M-1s-1的缔合常数(Ka)和约6.6×10-5s-1的解离常数(Kd)。参见图9B。据观察，嵌合细胞因子结构域P01、P02、P03、P04和P05具有约12-1700pM范围内的KD、约3×104M-1s-1至3×106M-1s-1范围内的缔合常数(Ka)以及约2×10-5至1×10-3s-1范围内的解离常数(Kd)。参见例如图9C和9D以及下文的表7。
表7
蛋白质 ka(M-1s-1) Kd(s-1) KD(pM)
IL-1β 1.47×106M-1s-1 2.95×10-3s-1 2010
IL-1Ra 2.01×105M-1s-1 6.58×10-5s-1 326
P01 4.93×104M-1s-1 2.32×10-5s-1 470
P02 3.39×104M-1s-1 2.16×10-5s-1 636
P03 4.1×106M-1s-1 1.2×10-3s-1 290
P04 3.00×104M-1s-1 5.14×10-4s-1 1714
P05 3.47×106M-1s-1 4.15×10-5s-1 12
P06 4.8×106M-1s-1 1.7×10-3s-1 410
P07 1.58×104M-1s-1 1.46×10-3s-1 92553
实施例5
另外的示例性嵌合IL-1家族蛋白质还包括以下这些：
P08APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQG  SEQ  IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK NO:32RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P09APVRSQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQG  SEQ IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK NO:33RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P10APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQG SEQ IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK  NO:34RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P11APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVSFVQG  SEQ IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK  NO:35RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSS
P12APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQG  SEQ IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK NO:36RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFTMQFVSS
P13APVRSLAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQG  SEQ IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK  NO:37RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED
P14APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQG  SEQ IDEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEK  NO:38RFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED
以下多肽是包含来自IL-1α的至少两个片段以及来自IL-1Ra的至少两个片段的嵌合结构域。
SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVN  SEQ IDLEEKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVVLLKEMPEIP  NO:39KTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYILENQA
实施例6
可通过利用接头序列并为各末端选择新的位置将分子的N端连接到C端，从而建构循环排列的IL-1嵌合结构域。对于具有衍生自IL-1β的末端的蛋白，接头长度可为五至十个氨基酸，例如，约七个氨基酸。新末端的优选位置位于背对受体的环中，诸如β6-β7环（例如，对应于SEQ ID NO:1的第71-80位的氨基酸）或β7-β8环（例如，对应于SEQ ID NO:1的第84-99位的氨基酸）。
此类循环排列的IL-1嵌合结构域的实例包括：
DKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNRIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKD(SEO ID NO:40)
和
NYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNOLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKMLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPK(SEQ IDNO：41)
实施例7
以0.5mg/ml的浓度，在pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备蛋白质P03、P04、P05、mIL-1Ra（甲硫氨酰基IL-1Ra）和IL-1β。将蛋白质与SYPRO橙色染料(Invitrogen,CA)以1:500稀释的储备浓度合并，并进行差示扫描荧光分析。参见例如，He等(2010)J.Pharm.Sciences,991707-1720。使用AgilentMx3005QPCR仪器随着温度以每分钟1℃的速率从25℃升至95℃监测荧光测量值。解链温度(Tm)值由荧光跃迁一阶导数的最大值得出。据观察，蛋白质P03、P04和P05在高于50℃以及高达59℃时开始解折叠，并具有高于59、60、62和64℃的Tm。结果在下表8以及图10A和10B中示出：
表8
蛋白质 Tm(℃) 开始解折叠(℃)
mIL-1Ra 56 48
IL-1β 56 41
P03 65 59
P04 60 51
P05 65 59
P04具有比mIL-1Ra和IL-1β高约4度的Tm，并表现出比mIL-1Ra高约3度以及比IL-1β高约10度的解折叠开始温度。P03和P05具有比mIL-1Ra和IL-1β高约9度的Tm，并表现出比mIL-1Ra高约11度以及比IL-1β高约18度的解折叠开始温度。
实施例8
将纯化的P05（不含六组氨酸标记）在1.25x PBS中制备并在干眼病鼠模型中进行测试。在该模型中，将6至10周龄的得自Jackson实验室的雌性C57BL/6小鼠（在具有≥30%相对湿度、水凝胶食品补充剂和envirodry环境丰富的动物房中驯养1至2周）在第0天进行荧光素染色预筛选。对于荧光素染色，将以10mg/mL稀释在WFI H2O中的现制荧光素以0.4μL施用给每只眼睛。施用后约8-13分钟，使用Olympus荧光解剖显微镜对眼睛评分。利用0-3级的标准化美国国家眼科研究所(NEI)分级系统，针对被分成五个区域的角膜表面中的每个区域，记录点状染色（评分范围0-15分/眼）。使用教学桥牌，两名盲性评分者同时对小鼠进行评价以给出各眼的单个总分数。
将各眼分数≤7的小鼠（在最大分15之外）在第1天置于干眼病室内（20%±2%湿度和约21L/min/笼的恒定气流量），并在实验过程中保持在该室内（检查时除外）。在第3天，对小鼠再次评分并随机分到每组具有8至10只小鼠的处理组中。将小鼠随机化分配，使得具有4至5只小鼠的各笼具有大约相同的平均疾病分数。从第3天开始并在随机化后，以3μL/眼向小鼠局部施用滴眼剂中的P05或媒介物(1.25X PBS)，频率为每日两次(BID)。在第7、9和11天时针对如上所述的角膜荧光素染色，对小鼠进行检查并进行评分。评分者在该实验的过程中对处理组是盲性的。
图11A是在接受下列每日两次(bid)处理的来自两个相同实验的小鼠在第0、3、7、9和11天时的平均角膜染色评分±SEM的条形图：无处理、媒介物(1.25X PBS)和10mg/ml(1%)P05。10mg/ml P05在实验的第7、9和11天明显减少了角膜染色。在低至0.1mg/ml P05的剂量下也观察到了由角膜染色减少所评价的功效。在大肠杆菌中产生的重组IL-1Ra也在该动物模型中适度减少了角膜染色。
如图11B所示，基于与相同媒介物中10mg/ml鼠血清白蛋白的比较，10mg/ml P05的效果为特异性的。10mg/ml鼠血清白蛋白(MSA)相对于媒介物并未观察到效果，而10mg/ml P05的效果相对于10mg/ml鼠血清白蛋白具有统计学显著性。如图11C所示，还将10mg/ml P05与眼用乳剂()中0.05%的环孢霉素进行了比较。P05减少了角膜染色，而0.05%环孢霉素眼用乳剂在约1周的每日两次(bid)给药后并未观察到效果。
实施例9
开发了捕获步骤用于纯化通过在BLR(DE3)大肠杆菌细胞中发酵而产生的P05。洗脱条件通过在1mL柱上的统计设计实验方法(DOE)而定义。优化的条件以中等规模（10mL柱）进行。
将产物在由20mM Tris(pH7.0)与添加的10mM EDTA组成的裂解缓冲液中通过微流化而提取。将澄清的裂解物调节到pH5.3以及3mS/cm的电导率。将调节后的裂解液上样到PorosXS（强阳离子交换树脂），停留时间为2min以达到25-30mg P05/mL柱的容量。将柱用平衡缓冲液洗涤以除去未结合的物质。进行pH6.0和3mS/cm下的第二次洗涤以除去多种杂质。将产物在pH6.0和6.6mS/cm下洗脱。产物相关物质在pH6.0和12.4mS/cm下洗脱。将柱用高盐缓冲液和NaOH清洗。
P05为17kDa蛋白质，pI为6.58。des-ALA形式的pI为6.8，并易于通过分析型弱阳离子交换层析而分离。该形式可能为存在于大肠杆菌中的氨基肽酶P活性的产物。它可通过质谱、肽图分析和HPLC方法进行鉴定。
层析材料.PorosXS基于名义粒度为50μm的交联聚(苯乙烯-二乙烯苯)珠。层析基质具有磺丙基表面化学并设计为耐受结合过程中的高盐水平。PorosXS(CN4404339,Life Technologies)材料获得为批量浆液并装填到5×50mm Tricorn柱(CN28-4064-09,GE Healthcare)中达到1mL的最终柱体积（5cm床高），或装填到10×150mm Tricorn柱(CN28-4064-16,GE Healthcare)中达到10.5mL的最终体积（13.4cm床高）。
缓冲液.所有缓冲液均通过MilliQ水定容制备。为了达到所需的pH，将10N HCl或1M NaOH（由10M NaOH储液制成）加入以滴定缓冲液。制备好后，将所有缓冲液通过0.2μm PES瓶顶过滤器过滤。所有pH和电导率测量均在室温(约20-25℃)下进行。
PorosXS缓冲液：CEX平衡缓冲液–10mM乙酸(HoAC)及21mM NaCl，通过每升缓冲液添加0.57mL冰醋酸和2.44g NaCl而制备。最终pH为5.3，并且最终电导率为3mS/cm。
CEX洗涤缓冲液–100mM MOPS及22mM NaCl，通过每升缓冲液添加19.5g MOPS游离酸、1.5g MOPS钠盐和1.28g NaCl而制备。最终pH为5.7-6.6（根据需要），并且最终电导率为3mS/cm。
CEX洗脱缓冲液–100mM MOPS及118mM NaCl，通过每升缓冲液添加19.5g MOPS游离酸、1.5g MOPS钠盐和6.93g NaCl而制备。最终pH为5.7-6.6（根据需要），并且最终电导率为12.4mS/cm。
CEX再生缓冲液(strip buffer)–10mM乙酸及3M NaCl，通过每升缓冲液添加0.57mL冰醋酸和175g NaCl而制备。最终pH为5.3，并且最终电导率为188mS/cm。
裂解物制备.使用通过每升缓冲液混合11.5mL冰醋酸而制备的pH4.5的200mM乙酸调节裂解物的pH。使用1M NaOH将溶液滴定到4.5的最终pH。使用该溶液以避免因为浓酸或强酸的低pH而导致的局部沉淀。
这些实验的上样材料为来自2L分批补料生物反应器运行的提取物。使用20mM Tris(pH7.0)及添加的10mM EDTA从细胞沉淀中提取产物。将新鲜提取物用MilliQ水稀释到3mS/cm的电导率（通常按1:1-1.5稀释）。将稀释提取物以41mL等分试样在-20℃下冷冻。为了制备上样液，将等分试样在室温下解冻，并用200mM乙酸(pH4.5)滴定到pH5.3。滴定后根据需要通过添加MilliQ水对电导率进行小幅调整。最后，使用CEX平衡缓冲液将上样液稀释2.5倍，达到约1.7g/L的浓度。将上样液通过0.8/0.2μm过滤器无菌过滤。调整后的上样液在制备当天使用。
宿主细胞蛋白质测定.通过对大肠杆菌表达系统(CN F410,CygnusTechnologies)特异的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定宿主细胞蛋白质(HCP)水平。严格遵照与试剂盒一起提供的方案。将待测定HCP水平的样本用样本稀释剂(CN I028,Cygnus Technologies)以10倍最低稀释度稀释。样本通常以两个稀释度运行，并且对于每个稀释度一式两份地进行平板接种。HCP的水平以份每一百万份(ppm)或ng-HCP/mg-产物表示。
SDS-PAGE分析.对于通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行的纯化分析，使用1mm×10孔或1mm×15孔NuPAGE4-12%BisTris凝胶（分别为CN NP0322Box和NP0323Box，Invitrogen）。运行缓冲液为由20×浓度(CN NP0002,Invitrogen)制备的1×MES SDS运行缓冲液。将Novex sharp预染蛋白质标准品(CN57318,Invitrogen)用作分子量标记。分析样本通过用MilliQ水稀释到30μL的最终体积而制备，并将10μL4×十二烷基硫酸锂(LDS)(CN NP0008,Invitrogen)加入以达到1×终浓度。将样本涡旋混合5s。基于通过A280/A320测量而计算出的蛋白浓度，每孔上样3μg目标物。
wCEX.采用以下层析条件通过弱阳离子交换层析(wCEX)对P05进行评价：
Figure BDA00002991618700801
WCX-104x250mm柱（产品编号054993），流速1.2mL/min，流动相溶液10mM乙酸钠(pH5.5)（缓冲液A）和10mM乙酸钠(pH5.5)、250mM NaCl（缓冲液B）。在20分钟的时间内从10%B至25%B运行梯度。完整P05在梯度的靠后部分在des-Ala形式前约1.5至2.5分钟时洗脱。
阳离子交换捕获层析.在AKTA Explorer100层析系统上进行层析。装填10mL PorosXS柱。将材料以40mg P05/ml的浓度上样，或可以25-30mgP05/ml的浓度上样。层析方法在表9中汇总。在上样和洗脱步骤中将停留时间保持恒定在2分钟。制备模拟洗脱混合样，并测定产物回收率、HCP水平和完整蛋白质百分比。在pH6.0下以30%和35%的%B在10mL柱上完成总共2次运行。
表9
Figure BDA00002991618700811
第2次洗涤得到主要由杂质组成的峰。通过30%和35%B进行的第1次洗脱得到由SDS-PAGE分析的纯度>95%的产物。第2次洗涤的盐浓度可少量增加以除去洗脱峰上的肩峰。
实施例10
将P04纯化，并在20℃下的25%PEG1500、0.1M PCB(pH4.0)中长成衍射质量的晶体。蛋白质在空间组P212121中结晶，其中典型的单位晶胞尺寸为a=44.5、b=46.4、c=64.8。晶体衍射至高分辨率，并在Advanced PhotonSource，光束线LS-CAT21ID-F(Chicago IL,USA)处采集扩展至
Figure BDA00002991618700812
的数据集。使用结合了来自PDB结构1ITB和1IRA的已知IL-1β和IL-1Ra结构的相关部分的模型，通过分子置换解析P04的X射线结构(Vigers等,(1997)Nature386:190-194和Schreuder等，(1997)Nature386:194-200)。最终模型精修(refine)到17.6%/20.4%的Rwork/Rfree，并包含一个P04分子（140个残基）和98个水分子（表10）。P04残基1-2、48-49和85-93在电子密度中不可见，并在最终模型中缺失。
表10
Figure BDA00002991618700821
括号中的数字对应于最高分辨率壳层(shell)
Rmerge=∑hkl[∑i│Ii-<I>│/∑iIi]
Rwork=∑hkl||Fobs│-│Fcalc||/∑hkl│Fobs│其中Fobs和Fcalc是测得的和计算的结构因子
Rfree由未用于精修的反射子集(5%)计算而得。
P04晶体结构具有与通过建模所预测的相似的折叠。该结构的视图在图1中示出。两种结构的叠加图在图12A中示出。对于与各自亲本分子上的相同残基相对的IL-1β和IL-1Ra片段，主链碳的RMSD为
Figure BDA00002991618700832
和。P04具有至少一个独特的盐桥和两个独特的氢键，它们参与衍生自IL-1β的残基与衍生自IL-1Ra的对应残基之间的相互作用：(i)如图12B中所示的Glu39-Lys64（来自IL-1RA的Glu39；来自IL-1β的Lys64），(ii)如图12C中所示的Arg9-Gln149（来自IL-1RA的Arg9；来自IL-1β的Gln149），以及(iii)如图12C中所示的Ser152-Lys40（来自IL-1RA的Ser152；来自IL-1β的Lys50）。这些独特的相互作用可以对P04增加的热稳定性作出解释，因为这些相互作用不存在于IL-1β和IL-1Ra结构中。这些相互作用中涉及到的残基也存在于P03和P05中，这些蛋白质同样具有增加的热稳定性。
其他实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims (70)

1.一种包含嵌合白介素-1(IL-1)家族细胞因子结构域的分离的蛋白质，其中所述结构域的至少第一片段的长度为至少20个氨基酸并与第一IL-1家族细胞因子的对应片段具有至少80%氨基酸同一性，以及
所述结构域的至少第二片段的长度为至少20个氨基酸并与第二IL-1家族细胞因子的对应片段具有至少80%的氨基酸同一性。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述第一和第二IL-1家族细胞因子选自IL-1β、IL-1α和IL-1Ra。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述第一IL-1家族细胞因子为IL-1β，以及所述第二IL-1家族细胞因子为IL-1Ra。
4.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述蛋白质与IL1受体I结合并抑制IL-1受体I活性。
5.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域的所述第一片段具有至少20或30个氨基酸的长度并与IL-1β的对应片段相同。
6.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域包含与IL-1Ra中的对应残基具有至少80%同一性的位点A残基以及与IL-1β中的对应残基具有至少80%同一性的位点B残基。
7.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域包含(a)在以下位置与IL-1Ra相同的氨基酸：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130和GLN141（根据IL-1β的编号），以及
(b)在以下位置与IL-1β相同的氨基酸：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152（根据IL-1β的编号）。
8.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域包含与IL-1Ra的β链β2、β3、β10和β11相同的序列以及与IL-1β的β链β4、β6、β7和β8相同的序列。
9.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述β1β2、β2β3、β8β9、β10β11和β11β12环的一者或多者与IL-1Ra的对应环具有至少90%同一性。
10.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域包含长度为至少20个氨基酸的至少两个不连续片段，它们与IL-1β的各自对应片段具有至少90%同一性。
11.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述两个不连续片段与IL-1β的各自对应片段相同。
12.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述两个不连续片段的长度为25至40个氨基酸。
13.根据权利要求10、11或12所述的蛋白质，其中不在所述两个不连续片段中的氨基酸与IL-1Ra具有至少90%同一性。
14.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述蛋白质由长度为150至160个氨基酸的单条多肽链组成。
15.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域在至少50个位置与所述第一IL-1家族细胞因子相同以及在至少50个位置与所述第二IL-1家族细胞因子相同。
16.根据权利要求2所述的蛋白质，其中至少第11-41位残基和第120-147位残基（根据IL-1β编号）总和起来与IL-1Ra中的对应残基具有至少90%同一性。
17.根据权利要求3所述的蛋白质，其中至少第1-6位、第45-61位和第148-153位残基（根据IL-1β编号）总和起来与IL-1β中的对应残基具有至少90%同一性。
18.根据权利要求3所述的蛋白质，其中至少第1-8位、第42-120位和第148-153位残基（根据IL-1β编号）总和起来与IL-1β中的对应残基具有至少90%同一性。
19.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域与P01、P02、P03、P04或P05具有至少80%同一性。
20.根据权利要求19所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域与P01、P02、P03、P04或P05具有至少90%同一性。
21.根据权利要求20所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域与P01、P02、P03、P04或P05具有至少95%同一性。
22.根据权利要求21所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域与P01、P02或P03相同。
23.根据权利要求21所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域与P04相同。
24.根据权利要求21所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域与P05相同。
25.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域比IL-1β和IL-1Ra具有更高的热稳定性。
26.根据权利要求2所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域具有比IL-1β和IL-1Ra高至少2度的Tm。
27.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述蛋白质在细胞信号转导测定中对于抑制IL-1β（以0.1ng/ml）具有低于10ng/ml的IC50。
28.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述蛋白质相比于人IL-1Ra以较高的亲和力KD、较慢的解离速率和/或较快的缔合速率与IL-1RI结合。
29.根据权利要求3所述的蛋白质，其中所述细胞因子结构域包含以下一者或多者：
(a)位点A：
i.与第一亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少80%同一性的位点A残基；
ii.与第一亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少80%同一性的扩展位点A残基；
iii.与第一亲本细胞因子结构域的对应片段具有至少80%同一性的位点A片段A1和A2；或
iv.与第一亲本细胞因子结构域的对应区域具有至少80%同一性的位点A区域；
(b)位点B：
i.与第二亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少80%同一性的位点B残基；
ii.与第二亲本细胞因子结构域中的对应残基具有至少80%同一性的扩展位点B残基；
iii.与第二亲本细胞因子结构域的对应片段具有至少80%同一性的位点B片段B1、B2和B3；或
iv.与第二亲本细胞因子结构域的对应区域具有至少80%同一性的位点B区域；
30.一种包含IL-1家族细胞因子结构域的分离的IL-1抑制剂，所述抑制剂与IL-1RI结合并包含
(i)与IL-1Ra中的对应残基具有至少70%同一性的C1片段；以及
(ii)与IL-1β、IL-1α或IL-1Ra中的对应残基具有至少80%同一性的位点A或位点B残基，并且
其中所述结构域与IL-1Ra具有40%-90%同一性。
31.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，其中所述C1片段与IL-1Ra中的对应残基具有至少80%同一性。
32.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，其中所述C1片段与IL-1Ra中的对应残基相同。
33.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，其中所述D2片段与IL-1Ra中的对应残基具有至少80%同一性。
34.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，其中所述A1和A2片段总和起来与IL-1Ra中的对应残基具有至少80%同一性。
35.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，其中所述B1、B2和B3片段与IL-1β中的对应残基具有至少80%同一性。
36.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，所述抑制剂抑制IL-1β的信号转导。
37.根据权利要求30所述的IL-1抑制剂，所述抑制剂以小于1nM的亲和力与IL-1RI结合。
38.一种分离的受体结合蛋白，其包含：
(a)在以下位置与IL-1Ra相同的氨基酸：ARG11、SER13、GLN14、GLN15、GLU25、LYS27、LEU29、HIS30、LEU31、GLN32、GLY33、GLN34、ASP35、MET36、GLN38、GLN39、ALA127、GLU128、ASN129、MET130和GLN141（根据IL-1β的编号）以及
(b)在以下位置与IL-1β相同的氨基酸：ALA1、PRO2、VAL3、ARG4、LEU6、PHE46、GLN48、GLU51、SER52、ASN53、LYS55、ILE56、PRO57、LYS92、LYS93、LYS94、LYS103、GLU105、ASN108、GLN149、PHE150和SER152（根据IL-1β的编号）。
39.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质为IL-1β和IL-1Ra的嵌合体。
40.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质包含IL-1β的Gln48-Asn53。
41.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质与非IL-1β的细胞因子具有至少50%同一性。
42.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质包含在对应于Ala1、Pro2、Val3、Arg4和Leu6的位置与IL-1β相同的残基。
43.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质包含在对应于IL-1β(SEQ ID NO:1)的45-61的位置与IL-1β相同的至少15个残基。
44.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质包含在对应于IL-1β(SEQ ID NO:1)的86-95的位置与IL-1β相同的至少8个残基。
45.根据权利要求38所述的蛋白质，所述蛋白质包含在对应于IL-1β(SEQ ID NO:1)的148-153的位置与IL-1β相同的至少5个残基。
46.根据权利要求38所述的蛋白质，其中对应于第11-36位和第126-130位（根据SEQ ID NO:1）的氨基酸位置大部分与IL-1Ra相同。
47.根据权利要求38所述的蛋白质，其中对应于第9-41位和第121-140位（根据SEQ ID NO:1）的氨基酸位置大部分与IL-1Ra相同。
48.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-47中任一项所述的蛋白质。
49.一种局部用药物组合物，其包含根据权利要求1-47中任一项所述的蛋白质。
50.一种眼科药物组合物，其包含根据权利要求1-47中任一项所述的蛋白质。
51.根据权利要求48所述的药物组合物，所述药物组合物为含水的并包含浓度为0.001–5%的所述蛋白质。
52.一种根据权利要求48所述的组合物用于受试者以调节受试者免疫或炎性反应的用途。
53.一种根据权利要求48所述的组合物用于治疗患有全身性自身免疫疾病或处于其风险之中的受试者的用途。
54.一种根据权利要求48所述的组合物用于治疗患有类风湿性关节炎或处于其风险之中的受试者的用途。
55.一种根据权利要求48所述的组合物用于治疗患有干眼病或过敏性结膜炎或处于其风险之中的受试者的用途。
56.一种分离的核酸，其包含编码根据权利要求1至47中任一项所述的蛋白质的序列。
57.一种分离的核酸载体，其包含编码根据权利要求1至47中任一项所述的蛋白质的序列，其中所述序列可操作地连接至转录控制序列。
58.一种重组宿主细胞，其包含编码根据权利要求1至47中任一项所述的蛋白质的重组核酸。
59.根据权利要求58所述的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞。
60.一种制备重组蛋白的方法，所述方法包括
在允许所述重组蛋白表达的条件下培养根据权利要求58所述的宿主细胞；
从细胞裂解物或细胞培养基中纯化所述重组蛋白；以及
配制所述重组蛋白以施用给受试者。
61.一种包含嵌合IL-1家族细胞因子结构域的分离的蛋白质，所述结构域包含至少两个长度为至少六个氨基酸并与第一IL-1家族细胞因子的对应片段具有至少80%同一性的不连续片段，并在其余的位置包含大部分来自第二IL-1家族细胞因子的氨基酸。
62.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述不连续片段根据IL-1β中此类位置的编号包含第1-6和45-61位、第1-6和86-95位、第45-61和86-95位、第1-6和148-153位、第45-61和148-153位或第86-95和148-153位残基。
63.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸与所述第一IL1家族细胞因子对应片段中的那些氨基酸相同的三个不连续片段，并且那些片段包含第1-8、42-120和141-153位残基。
64.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸与所述第一IL1家族细胞因子对应片段中的那些氨基酸相同的四个不连续片段，并且那些片段包含第1-6、45-61、86-95和148-153位残基。
65.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含氨基酸与所述第一IL1家族细胞因子对应片段中的那些氨基酸相同的三个不连续片段，并且那些片段包含第1-10、37-125和131-153位残基。
66.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述蛋白质在其余的位置与所述第二IL-1家族细胞因子相同。
67.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述不连续片段的边界的一个或多个位于其中所述第一和第二IL-1家族细胞因子具有相同氨基酸的位置。
68.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述蛋白质在至少50个位置与所述第一IL-1家族细胞因子相同以及在至少50个位置与所述第二IL-1家族细胞因子相同。
69.根据权利要求61所述的蛋白质，其中所述第一和第二IL-1家族细胞因子选自IL-1β、IL-1α和IL-1Ra。
70.根据权利要求69所述的蛋白质，其中所述第一IL-1家族细胞因子为IL-1β，以及所述第二IL-1家族细胞因子为IL-1Ra。
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