ES2952017T3 - Conjugado de anticuerpo-oligonucleótido mejorado - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a una fracción efectora de ligando provista de al menos una saponina y a una fracción efectora de anticuerpo provista de al menos una saponina. Un aspecto de la invención es una composición que comprende el resto ligando-efector provisto de al menos una saponina o el resto anticuerpo-efector provisto de al menos una saponina de la invención. La invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende saponina unida covalentemente y a un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido que comprende saponina unida covalentemente. Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el resto ligando-efector provisto de al menos una saponina o el resto anticuerpo-efector provisto de al menos una saponina de la invención, y opcionalmente que comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere al resto efector ligando provisto de al menos una saponina o al resto efector anticuerpo provisto de al menos una saponina, para uso como medicamento. La invención también se refiere al resto ligando-efector provisto de al menos una saponina o al resto anticuerpo-efector provisto de al menos una saponina de la invención para uso en el tratamiento o profilaxis de un cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugado de anticuerpo-oligonucleótido mejorado
CAMPO TÉCNICO
[0001] La invención se refiere a una porción ligando-efector provista de al menos una saponina y a una porción anticuerpo-efector provista de al menos una saponina, por ejemplo, un conjugado de anticuerpo-fármaco y un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido. Un aspecto de la invención es una composición que comprende la porción ligando-efector provista de al menos una saponina o la porción anticuerpo-efector provista de al menos una saponina de la invención. La invención también se refiere a un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende saponina unida covalentemente y a un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido que comprende saponina unida covalentemente. Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la porción ligando-efector provista de al menos una saponina o la porción anticuerpo-efector provista de al menos una saponina de la invención, y que opcionalmente comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención también se refiere a la porción ligando-efector provista de al menos una saponina o la porción anticuerpo-efector provista de al menos una saponina, para usar como medicamento. La invención también se refiere a la porción ligando-efector provista de al menos una saponina o a la porción anticuerpo-efector provista de al menos una saponina de la invención para usar en el tratamiento o la profilaxis de un cáncer.
ANTECEDENTES
[0002] Las moléculas con una actividad biológica terapéutica son en muchas ocasiones teóricamente adecuadas para su aplicación como un fármaco terapéutico eficaz para el tratamiento de una enfermedad tal como un cáncer en pacientes humanos que lo necesiten. Un ejemplo típico son las fracciones biológicamente activas de molécula pequeña. Sin embargo, muchas, si no todas, las moléculas y agentes terapéuticos similares a fármacos que se utilizan actualmente en la clínica sufren al menos una deficiencia o inconveniente entre una plétora de ellos. Cuando se administran a un cuerpo humano, las moléculas terapéuticamente activas pueden ejercer efectos fuera de la diana, además de la actividad biológica dirigida a un aspecto subyacente a una enfermedad o problema de salud a tratar. Dichos efectos fuera de la diana no son deseados y conllevan un riesgo de inducción de efectos secundarios de la molécula administrada que amenazan la salud o incluso la vida. Es la aparición de dichos eventos adversos lo que hace que muchos compuestos similares a fármacos y fracciones terapéuticas fracasen en los ensayos clínicos de fase III o incluso en los ensayos clínicos de fase IV (seguimiento posterior a la entrada en el mercado). Por lo tanto, existe un fuerte deseo de proporcionar moléculas de fármaco como, por ejemplo, terapias de molécula pequeña, en las que el efecto terapéutico de la molécula de fármaco debe, por ejemplo, (1) ser altamente específico para un factor biológico o proceso biológico que impulsa la enfermedad, (2) ser suficientemente seguro, (3) ser suficientemente eficaz, (4) estar suficientemente dirigido a la célula enferma con poca o ninguna actividad fuera de la diana en células no enfermas, (5) tener un modo de acción suficientemente oportuno (por ejemplo, la molécula de fármaco administrado debe alcanzar el sitio diana en el paciente humano en un cierto periodo de tiempo y debe permanecer en el sitio diana durante un cierto periodo de tiempo), y/o (6) tener una actividad terapéutica suficientemente duradera en el cuerpo del paciente, entre otros. Desafortunadamente, hasta la fecha, las terapias 'ideales' con muchas o incluso todas las características beneficiosas aquí descritas anteriormente, no están disponibles para los pacientes, a pesar de la investigación intensiva y de larga duración y a pesar del impresionante progreso realizado en varias áreas de las abordadas individualmente, encontraron dificultades e inconvenientes.
[0003] La quimioterapia es una de las opciones terapéuticas más importantes para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, a menudo se asocia con una ventana terapéutica baja porque no tiene especificidad hacia las células cancerosas sobre las células en división en el tejido sano. La invención de los anticuerpos monoclonales ofreció la posibilidad de explotar sus propiedades de unión específicas como mecanismo para el suministro dirigido de agentes citotóxicos a las células cancerosas, sin afectar a las células normales. Esto se puede lograr mediante la conjugación química de efectores citotóxicos (también conocidos como cargas útiles u ojivas) con anticuerpos, para crear conjugados de anticuerpo y fármaco (ADC). Por lo general, se utilizan cargas útiles muy potentes, como la emtansina (DM1), que tienen un índice terapéutico limitado (una relación que compara la dosis tóxica con la dosis eficaz) en sus formas no conjugadas. La conjugación de DM1 con trastuzumab (ado-trastuzumab emtansina), también conocido como Kadcycla, aumenta la dosis tolerable de DM1 al menos dos veces en monos. En las últimas décadas se han realizado enormes esfuerzos e inversiones para desarrollar ADC terapéuticos. Sin embargo, sigue siendo un desafío llevar los ADC a la clínica, a pesar de los datos preclínicos prometedores. El primer ADC aprobado para uso clínico fue gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg, dirigido a CD33, Pfizer/Wyeth) para la leucemia mielógena aguda (LMA) recidivante en 2000. Sin embargo, Mylotarg se retiró del mercado a petición de la Administración Federal de Medicamentos (FDA) debido a una serie de preocupaciones, incluyendo su perfil de seguridad. Los pacientes tratados con Mylotarg fallecieron con mayor frecuencia que los pacientes tratados con quimioterapia convencional. Mylotarg se admitió nuevamente en el mercado en 2017 con una dosis recomendada más baja, una planificación diferente en combinación con quimioterapia o solo, y una nueva población de pacientes. Hasta la fecha, solo se han aprobado cinco ADC para uso clínico y, mientras tanto, se ha detenido el desarrollo clínico de aproximadamente cincuenta y cinco ADC. Sin embargo, el interés sigue siendo alto y aproximadamente ochenta ADC todavía están en desarrollo clínico en casi seiscientos ensayos clínicos en la actualidad.
[0004] A pesar del potencial para usar cargas tóxicas que normalmente no son toleradas por los pacientes, un índice terapéutico bajo (una relación que compara la dosis tóxica con la dosis eficaz) es un problema importante que explica la interrupción de muchos ADC en el desarrollo clínico, que puede ser causado por varios mecanismos, como la toxicidad fuera de la diana en las células normales, el desarrollo de resistencia contra los agentes citotóxicos y la liberación prematura de fármacos en la circulación. Una revisión sistemática realizada por la FDA de los ADC encontró que los perfiles de toxicidad de la mayoría de los ADC podrían clasificarse según la carga útil utilizada, pero no según el anticuerpo utilizado, lo que sugiere que la toxicidad está determinada principalmente por la liberación prematura de la carga útil. De los aproximadamente cincuenta y cinco ADC que se suspendieron, se estima que al menos veintitrés se debieron a un bajo índice terapéutico. Por ejemplo, el desarrollo de un conjugado de trastuzumab tesirina (ADCT-502, dirigido a HER-2, ADC therapeutics) se interrumpió recientemente debido a un índice terapéutico estrecho, posiblemente debido a un efecto en el tejido pulmonar dentro de la diana pero fuera del tejido que expresa niveles considerables de HER2. Además, se suspendieron varios ADC en los ensayos de fase 3 debido a que faltaba el criterio principal de valoración. Por ejemplo, los ensayos de fase 3 de un conjugado de depatuxizumab mafodotina (ABT-414, dirigido a EGFR, AbbVie) probado en pacientes con glioblastoma recién diagnosticado, y un conjugado de mirvetuximab soravtansina (IMGN853, dirigido al receptor de folato alfa (Fra), ImmunoGen) probado en pacientes con cáncer de ovarios resistente al platino, se suspendieron recientemente, sin mostrar ningún beneficio de supervivencia. Es importante tener en cuenta que la dosis utilizada clínicamente de algunos ADC puede no ser suficiente para su actividad anticancerígena completa. Por ejemplo, la ado-trastuzumab emtansina tiene una DMT de 3.6 mg/kg en humanos. En modelos preclínicos de cáncer de mama, la ado-trastuzumab emtansina indujo la regresión del tumor a niveles de dosis de 3 mg/kg o superiores, pero se observó una eficacia más potente con 15 mg/kg. Esto sugiere que, a la dosis administrada clínicamente, es posible que la ado-trastuzumab emtansina no ejerza su efecto antitumoral potencial máximo.
[0005] Los ADC se componen principalmente de un anticuerpo, una porción citotóxica, por ejemplo, una carga útil, y una porción conectora. Se han propuesto y llevado a cabo varias estrategias novedosas en el diseño y desarrollo de nuevos ADC para superar los problemas existentes, tomando como diana cada uno de los componentes de los ADC. Por ejemplo, mediante la identificación y validación de dianas antigénicas adecuadas para el componente de anticuerpo, mediante la selección de antígenos que tienen altos niveles de expresión en el tumor y poca o ninguna expresión en tejidos normales, antígenos que están presentes en la superficie celular para que sean accesibles a los ADC circulantes y antígenos que permiten la internalización de ADC en la célula después de la unión; y mecanismos alternativos de actividad; diseñar y optimizar porciones conectaras que mejoren la solubilidad y la relación fármaco-anticuerpo (RFA) de los ADC y superen la resistencia inducida por proteínas que pueden transportar el agente quimioterapéutico fuera de las células; mejorar la relación RFA mediante la inclusión de más cargas útiles, seleccionar y optimizar los anticuerpos para mejorar la homogeneidad y la capacidad de desarrollo de los anticuerpos. Además del desarrollo tecnológico de los ADC, también se están implementando nuevas estrategias clínicas y traslacionales para maximizar el índice terapéutico, como cambiar los horarios de dosificación a través de dosificación fraccionada; realizar estudios de biodistribución; incluir biomarcadores para optimizar la selección de pacientes, capturar señales de respuesta tempranas y monitorizar la duración y profundidad de la respuesta, y notificar estudios de combinación.
[0006] Un ejemplo de ADC con potencial clínico son aquellos ADC como brentuximab vedotin, inotuzumab ozogamicina, moxetumomab pasudotox y polatuzumab vedotin, que se evalúan como una opción de tratamiento para las neoplasias malignas linfoides y el mieloma múltiple. Polatuzumab vedotina, que se une a CD79b en las células B (malignas), y pinatuzumab vedotin, que se une a CD22, se prueban en ensayos clínicos en los que cada ADC se combinó con rituximab coadministrado, un anticuerpo monoclonal que se une a CD20 y no se proporciona con una carga útil [B. Yu y D. Liu, Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoid malignancies and multiple myeloma; Journal of Hematology & 0ncology (2019) 12:94]. Las combinaciones de anticuerpos monoclonales como estos ejemplos son otro enfoque más y un intento de lograr la "bala mágica" que combina muchas o incluso todas las características deseadas de los ADC antes mencionados.
[0007] 0tros ejemplos conocidos de ADC incluyen conjugados de los anticuerpos monoclonales trastuzumab (Herceptin) y cetuximab (Erbitux) con la toxina de origen vegetal saporina. Gilabert-0riol et al. ""Modified Trastuzumab and Cetuximab Mediate Efficient Toxin Delivery While Retaining Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity in Target Cells", M0LECULAR PHARMACEUTICS, vol. 10, núm. 11, 7 de octubre de 2013 (07-10­ 2013), páginas 4347-4357]. Gilabert-0riol et al. han demostrado que estos anticuerpos terapéuticos específicos de tumores modificados pueden entregar su carga útil tóxica en las células diana, al tiempo que conservan su capacidad para desencadenar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por células. También mencionan que la actividad de eliminación de células podría verse aumentada por la presencia de saponinas triterpenoides.
[0008] Mientras tanto, en las últimas décadas, se están desarrollando terapias basadas en ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos terapéuticos pueden basarse en ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos antisentido (ASO, AON) y ARN interferente pequeño (ARNip), microARN y aptámeros de ADN y ARN, para enfoques como la terapia génica, y ARN de interferencia (ARNi). Muchos de ellos comparten la misma base fundamental de acción mediante la inhibición de la expresión del ADN o del ARN, evitando así la expresión de proteínas anormales relacionadas con la enfermedad. El mayor número de ensayos clínicos se está llevando a cabo en el campo de la terapia génica, con casi 2600 ensayos clínicos en curso o finalizados en todo el mundo, pero solo un 4 % entra en la fase 3. Le siguen los ensayos clínicos con AON. De manera similar a los ADC, a pesar de la gran cantidad de técnicas que se están explorando, los ácidos nucleicos terapéuticos comparten dos problemas principales durante el desarrollo clínico: la entrega en las células y los efectos fuera de la diana. Por ejemplo, los AON como el ácido péptidonucleico (APN), el oligómero de morfolino fosforamidato (PMO), el ácido nucleico bloqueado (LNA) y el ácido nucleico con puente (BNA) se están investigando como una estrategia atractiva para inhibir genes diana específicos y especialmente aquellos genes que son difíciles de atacar con inhibidores de moléculas pequeñas o anticuerpos neutralizantes. Actualmente, se está estudiando la eficacia de diferentes AON en muchas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esclerosis lateral amiotrófica y también en varias etapas del cáncer. La aplicación de AON como agentes terapéuticos potenciales requiere métodos seguros y efectivos para su entrega al citoplasma y/o núcleo de las células y tejidos diana. Aunque se ha demostrado la relevancia clínica de los AON, la absorción celular ineficiente, tanto in vitro como in vivo, limita la eficacia de los AON y ha sido una barrera para el desarrollo terapéutico. La captación celular puede ser ≤ 2 % de la dosis, lo que da como resultado una concentración de AOO demasiado baja en el sitio activo para un resultado efectivo y sostenido. En consecuencia, esto requiere un aumento de la dosis administrada que induce efectos fuera de la diana. Los efectos secundarios más comunes son la activación de la cascada del complemento, la inhibición de la cascada de la coagulación y la estimulación del sistema inmunitario mediada por receptores tipo toll.
[0009] Los quimioterapéuticos suelen ser moléculas pequeñas, sin embargo, su eficacia se ve obstaculizada por la toxicidad secundaria grave fuera de la diana, así como por su escasa solubilidad, eliminación rápida y exposición tumoral limitada. Los conjugados de fármaco de molécula pequeña-estructura de base, como los conjugados de fármaco-polímero (PDC), son constructos macromoleculares con actividad farmacológica, que comprenden una o más moléculas de un fármaco de molécula pequeña unido a una estructura de base portadora (por ejemplo, polietilenglicol (PEG)).
[0010] Dicho principio conjugado ha llamado mucho la atención y ha sido objeto de investigación durante varias décadas. La mayoría de los conjugados de fármacos de molécula pequeña en desarrollo preclínico o clínico son para indicaciones oncológicas. Sin embargo, hasta la fecha solo se ha aprobado un fármaco no relacionado con el cáncer (Movantik, un conjugado de oligómero de PEG del antagonista opioide naloxona, AstraZeneca) para el estreñimiento inducido por opioides en pacientes con dolor crónico en 2014, que es una indicación no oncológica. Traducir la aplicación de conjugados de fármaco-estructura de base en el tratamiento de sujetos humanos proporciona poco éxito clínico hasta el momento. Por ejemplo, el PK1 (copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA) doxorrubicina; desarrollado por Pharmacia, Pfizer) mostró una gran actividad anticancerígena tanto en tumores sólidos como en leucemia en modelos murinos, y estaba bajo investigación clínica para indicaciones oncológicas. A pesar de que demostró una reducción significativa de la toxicidad inespecífica y una farmacocinética mejorada en el hombre, las mejoras en la eficacia anticancerígena resultaron ser marginales en los pacientes y, como consecuencia, se interrumpió el desarrollo adicional de PK1.
[0011] El fracaso de los conjugados de fármaco de molécula pequeña-estructura de base se atribuye, al menos parcialmente, a su escasa acumulación en el sitio del tumor. Por ejemplo, mientras que en los modelos murinos PK1 mostró una acumulación en el tumor de 45 a 250 veces mayor que en los tejidos sanos (hígado, riñón, pulmón, bazo y corazón), la acumulación en el tumor solo se observó en un pequeño subconjunto de pacientes en el ensayo clínico.
[0012] Una posible solución a los problemas antes mencionados es la aplicación de sistemas de nanopartículas para la administración de fármacos, como los liposomas. Los liposomas son vesículas en forma de esfera que consisten en una o más bicapas de fosfolípidos, que se forman espontáneamente cuando los fosfolípidos se dispersan en agua. Las características de anfifilicidad de los fosfolípidos le proporcionan las propiedades de autoensamblaje, emulsionantes y humectantes, y estas propiedades pueden emplearse en el diseño de nuevos fármacos y nuevos sistemas de administración de fármacos. El fármaco encapsulado en un sistema de administración liposomal puede brindar varias ventajas sobre la administración directa del fármaco, como una mejora y control sobre la farmacocinética y la farmacodinámica, propiedad de direccionamiento al tejido, menor toxicidad y mayor actividad del fármaco. Un ejemplo de ese éxito es la forma encapsulada en liposomas de un agente de quimioterapia de molécula pequeña de doxurribicina (Doxil: una forma de doxorrubicina encapsulada en liposomas pegilados; Myocet: una doxorrubicina liposomal no pegilada), que ha sido aprobada para uso clínico.
[0013] Por lo tanto, aún es necesario encontrar una solución que permita terapias farmacológicas como las terapias antitumorales, aplicables para uso no sistémico cuando se desee, en las que el fármaco tenga, por ejemplo, un perfil de seguridad aceptable, poca actividad fuera de la diana, eficacia suficiente, tasa de eliminación suficientemente baja del cuerpo del paciente, etc.
RESUMEN
[0014] Para una forma de realización de la presente invención, un primer objetivo consiste en proporcionar un compuesto biológicamente activo mejorado o una composición que comprenda dicho compuesto biológicamente activo mejorado.
[0015] Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consiste en proporcionar una solución al problema de la falta de especificidad que se encuentra cuando se administran compuestos terapéuticamente activos de molécula pequeña a un paciente humano que los necesita. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consiste en proporcionar una solución al problema de los fármacos con especificidad no óptima para un factor biológico o proceso biológico que provoca una enfermedad. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consiste en proporcionar una solución al problema de las características de seguridad insuficientes de los fármacos actuales, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consisfte en proporcionar una solución al problema de los fármacos actuales que son menos eficaces de lo deseado, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consiste en proporcionar una solución al problema de los fármacos actuales que no se dirigen lo suficiente a la célula enferma con poca o ninguna actividad fuera de la diana en células no enfermas, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consiste en proporcionar una solución al problema de que los fármacos actuales no tienen un modo de acción lo suficientemente oportuno (por ejemplo, la molécula del fármaco administrado debe llegar al sitio diana en el paciente humano en un tiempo determinado y debe permanecer en el sitio diana durante un cierto periodo de tiempo) cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan. Uno de los varios objetivos de las formas de realización de la presente invención consiste en proporcionar una solución al problema de que los fármacos actuales no tienen una actividad terapéutica suficientemente duradera en el cuerpo del paciente, cuando se administran a pacientes humanos que los necesitan.
[0016] Al menos uno de los objetivos anteriores se logra proporcionando un conjugado tal como se define en las reivindicaciones.
[0017] La presente invención se describirá con respecto a formas de realización particulares, pero la invención no está limitada por ellas sino únicamente por las reivindicaciones. Las formas de realización de la invención descritas en este documento pueden operar en combinación y cooperación, a menos que se especifique lo contrario.
[0018] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado que comprende una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y al menos una porción efectora y que comprende además al menos una saponina unida covalentemente.
[0019] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina es una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende un grupo funcional ácido glucurónico en un carbohidrato sustituyente en el grupo C-3beta-OH de la saponina.
[0020] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos una saponina es una saponina específica única o es una mezcla de dos o más saponinas diferentes.
[0021] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos la saponina tiene una masa molecular de 3000 Dalton o menos, preferiblemente 2500 Dalton o menos, más preferiblemente 2300 Dalton o menos, lo más preferiblemente 2000 Dalton o menos, por ejemplo de 1500 Dalton a 1900 Dalton.
[0022] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina es una o varias de las saponinas de la tabla A1 o el esquema I, SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, Qs -21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl , QS1861, QS1862, quillaja saponina, Saponinum album, QS-18, Quil-A, Gyp1, gypsoside A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, o cualquiera de sus estereómeros y/o cualquier combinación de los mismos, preferiblemente la saponina es SO1861 y/o GE1741 y/o SA1641 y/o QS-21 y/o una saponina con un núcleo de aglicona de ácido quillaico, un sustituyente carbohidrato Gal-(1^-2)-[Xyl-(1^3)]-GlcA en el grupo C-3beta-OH y un sustituyente carbohidrato Glc-(1^3)-Xyl-(1^4)-Rha-(1^2)-[Xyl-(1^-3)-4-OAc-Qui-(1^4)]-Fuc en el grupo C-28-OH, y/o es ácido 3-O-beta-D-galactopiranosil-(1^2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^-3)]-beta-D-glucuronopiranosil quillaico 28-O-beta-D-glucopiranosil-(1^-3)-beta-D-xilopiranosil-(1^4)- alfa-L-ramnopiranosil-(1^2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^-3)-4-OAc-beta-D-quinovopiranosil-(1^4)]-beta-D-fucopiranósido, más preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS -21.
[0023] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina es una saponina bisdesmosídica que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehído en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral de carbohidratos ramificada en la posición C-3, donde dicha primera cadena lateral de carbohidratos ramificada contiene opcionalmente ácido glucurónico, donde la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral de carbohidratos ramificada en la posición C-28, donde dicha segunda cadena de carbohidratos ramificada comprende preferiblemente al menos cuatro unidades de carbohidratos, que opcionalmente contiene al menos un resto acetilo, por ejemplo, dos restos acetilo y/u opcionalmente comprende desoxi-carbohidratos y/u opcionalmente comprende quinovosa y/u opcionalmente comprende glucosa y/u opcionalmente comprende ácido 4-metoxicinámico y/u opcionalmente comprende ácido 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/u opcionalmente comprende ácido 5-O-[5-O-Rha-(1^-2)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico unido a un carbohidrato a través de un enlace éster, o donde la saponina es QS-21 o una o varias de las saponinas QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B -api, Qs -21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS-18, QS1861, QS1861 protonada (QS1862), Quil-A.
[0024] De acuerdo con la invención, la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprende o consiste en una inmunoglobulina, al menos un dominio de unión de una inmunoglobulina y/o al menos un fragmento de unión de una inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo, una IgG, una molécula que comprende o consiste en un dominio Vhh o un dominio Vh, un Fab, un scFv, un Fv, un dAb, un F(ab)2 , un fragmento Fcab, que puede unirse a la molécula de la superficie celular.
[0025] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular puede unirse a una molécula de la superficie de la célula tumoral, preferiblemente un receptor de células tumorales como, por ejemplo, un receptor específico de células tumorales, más preferiblemente un receptor seleccionado entre CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6 , HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente seleccionados entre CD71, HER2 y EGFR.
[0026] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el receptor de células tumorales es internalizado por la célula tumoral después de unirse a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención o donde el receptor de células tumorales es internalizado por la célula tumoral después de unirse al conjugado de la invención, y donde preferiblemente la unión de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y la unión del conjugado al receptor de la célula tumoral va seguida de una internalización mediada por el receptor de la célula tumoral, por ejemplo vía endocitosis, de un complejo del conjugado y el receptor de la célula tumoral.
[0027] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular es o comprende un anticuerpo monoclonal o al menos un fragmento de unión a la molécula de la superficie celular o un dominio del mismo, y preferiblemente comprende o consiste en cualquiera de los siguientes: cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal anti-CD38 OKT-10, un anticuerpo de la tabla A2 o la tabla A3 o la tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento o dominio de unión a la molécula de la superficie celular de los mismos.
[0028] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la porción efectora comprende o consiste en uno o varios elementos del grupo compuesto por un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado entre uno o varios elementos del grupo compuesto por un vector, un gen, un transgén que induce el suicidio celular, ácido desoxirribonucleico (a Dn ), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN minicircular, ácido péptidonucleico (APN), oligómero de morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treonucleico (ATN) o un derivado de los mismos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
[0029] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la porción efectora comprende o consiste en uno o varios elementos del grupo compuesto por un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado entre uno o varios elementos del grupo compuesto por un vector, un gen, un transgén que induce el suicidio celular, ácido desoxirribonucleico (a Dn ), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN minicircular, ácido péptidonucleico (APN), oligómero de morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treonucleico (ATN) o un derivado de los mismos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27, donde al menos una porción efectora son, por ejemplo, dos oligonucleótidos diferentes (antisentido) para silenciar dos genes diferentes.
[0030] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la porción efectora comprende o consiste en al menos una molécula proteica, preferiblemente seleccionada entre uno o varios elementos del grupo que consiste en un péptido, una proteína, una enzima tal como ureasa y recombinasa Cre, una proteína que inactiva los ribosomas, una toxina proteica seleccionada de la tabla A5 y más preferiblemente seleccionada entre una o varias toxinas, tales como una toxina vírica, por ejemplo, la apoptina; una toxina bacteriana como la toxina Shiga, la toxina similar a Shiga, la exotoxina (PE) de Pseudomonas aeruginosa o la exotoxina A de PE, la toxina diftérica (DT) completa o truncada, la toxina del cólera; una toxina fúngica como la alfa-sarcina; una toxina vegetal que incluye proteínas que inactivan los ribosomas y la cadena A de proteínas que inactivan los ribosomas de tipo 2, como la diantina, por ejemplo, la diantina-30 o diantina-32, la saporina, por ejemplo saporina-S3 o saporina-S6, la bouganina o el derivado desinmunizado debouganina de bouganina, la toxina A similar a shiga, la proteína antiviral de hierba carmín, la ricina, la cadena A de ricina, la modecina, la cadena A de modecina, la abrina, la cadena A de abrina, la volkensina, la cadena A de volkensina, la viscumina, la cadena A de viscumina; o una toxina animal o humana tal como la RNasa de rana, o la granzima B o angiogenina humana, o cualquier fragmento o derivado de las mismas; preferiblemente, la toxina proteica es diantina y/o saporina.
[0031] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos una porción efectora comprende o consiste en al menos una carga útil, preferiblemente seleccionada entre uno o varios elementos del grupo formado por una toxina dirigida a ribosomas, una toxina dirigida a factores de elongación, una toxina dirigida a tubulina, una toxina dirigida al ADN, una toxina dirigida al ARN, más preferiblemente uno o varios elementos del grupo formado por emtansina, pasudotox, derivado de maitansinoide DM1, derivado de maitansinoide DM4, monometil auristatina E (MMAE, vedotina), monometil auristatina F (MMAF, mafodotina), una calicheamicina, N-Acetil-Y-calicheamicina, un dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD), una benzodiazepina, un análogo de CC-1065, una duocarmicina, doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, ciclofosfamida, etopósido, docetaxel, 5-fluorouracilo (5-FU), mitoxantrona, una tubulisina, una indolinobenzodiazepina, AZ13599185, una criptoficina, rizoxina, metotrexato, una antraciclina, un análogo de la camptotecina, SN-38, DX-8951f, mesilato de exatecán, una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE38), un derivado de la duocarmicina, una amanitina, a-amanitina, una espliceostatina, una tailanstatina, ozogamicina, tesirina, ambarstatina269 y soravtansina, o un derivado de los mismos.
[0032] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos una porción efectora está unida covalentemente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, ya sea a través de al menos una porción conectora o unida directamente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular.
[0033] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos una porción efectora se une covalentemente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, formando así uno cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina y un conjugado de anticuerpofármaco de la tabla A2 y la tabla A3.
[0034] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la al menos una saponina se une covalentemente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular, preferiblemente un residuo de aminoácido de la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular, a través de un grupo funcional aldehído en la saponina, y /o a la porción efectora preferiblemente a través de un residuo de aminoácido en la porción efectora, a través de un grupo funcional aldehído en la saponina, preferiblemente un grupo funcional aldehído en la posición C-23 en una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano.
[0035] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que el grupo funcional aldehído en la saponina, preferiblemente el grupo funcional aldehído en la posición C-23 de la saponina, se une covalentemente a la porción conectora de hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, donde dicha porción conectora se une covalentemente a través de un enlace tio-éter a un grupo sulfhidrilo en la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o en la porción efectora, por ejemplo, un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
[0036] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-dehidrooleanano, con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende un grupo funcional ácido glucurónico en un carbohidrato sustituyente en el grupo C-3beta-OH de la saponina, donde la saponina se une covalentemente a un residuo de aminoácido de la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o a la porción efectora a través de dicho grupo funcional ácido glucurónico y preferiblemente a través de un residuo de aminoácido en la porción efectora.
[0037] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que el grupo funcional ácido glucurónico en el carbohidrato sustituyente en el grupo C-3beta-OH de la saponina se une covalentemente a la porción conectora 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, donde dicha porción conectora se une covalentemente a través de un enlace amida a un grupo amino en la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o en la porción efectora, por ejemplo, un grupo amino de una lisina o un N-terminal de la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o de la porción efectora.
[0038] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina se une covalentemente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o a la porción efectora, ya sea directamente o a través de al menos una porción conectora, como una porción conectora bifuncional, por ejemplo a base de hidrazida de ácido N-£-maleimidocaproico y/o a base de 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, o una porción conectora trifuncional, como la porción conectora trifuncional del esquema II y la estructura B.
[0039] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la porción conectora trifuncional comprende un segundo grupo químico con al menos una saponina unida covalentemente, un tercer grupo químico para la unión covalente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y un primer grupo químico para la unión covalente a la porción efectora, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional del esquema II y la estructura B.
[0040] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina se une covalentemente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y a la porción efectora a través de al menos una porción conectora que comprende una porción conectora trifuncional al que se unen tanto la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular como la porción efectora, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional del esquema II y la estructura B.
[0041] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde opcionalmente dicha porción conectora se somete a escisión en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por la luz, y preferiblemente la porción conectora escindible comprende un enlace escindible seleccionado de un enlace hidrazona o un enlace hidrazida sujeto a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo, proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras, como un puente disulfuro.
[0042] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde dicha porción conectora se somete a escisión in vivo en condiciones ácidas como las presentes en endosomas y/o en lisosomas de células de mamífero, preferiblemente de células humanas, preferiblemente a pH 4.0 - 6.5, y más preferiblemente a pH ≤ 5,5.
[0043] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina está unida covalentemente a una cadena lateral de lisina, formando un enlace amida, y/o a una cadena lateral de cisteína, formando un enlace tioéter o un puente disulfuro, donde la lisina y/o la cisteína están comprendidas por la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o están comprendidas por la porción efectora, y donde la saponina está unida directamente a la lisina y/o la cisteína, o se une a través de al menos una porción conectora que comprende opcionalmente una porción conectora escindible y/o una porción conectora trifuncional como el del esquema II y la estructura B.
[0044] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la porción conectora se basa en la hidrazida de ácido N-£-maleimidocaproico y/o se basa en el 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, una porción conectora trifuncional como el del esquema II y la estructura B, una porción conectora escindible, y/o involucra a uno o varios elementos del grupo formado por un puente disulfuro, un enlace tio-éter, un enlace amida y un enlace hidrazida.
[0045] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos una saponina se une covalentemente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o a la porción efectora a través de al menos una porción conectora, donde la porción conectora es o comprende una estructura de base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y que además comprende al menos un cuarto grupo químico para unir covalentemente la estructura de base a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y/o a la porción efectora.
[0046] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina se une covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base mediante un enlace escindible y/o mediante un enlace no escindible.
[0047] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que el enlace escindible está sujeto a escisión en cualquiera de las condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas y condiciones inducidas por la luz, y preferiblemente el enlace escindible comprende un enlace hidrazona o un enlace hidrazida sujeto a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo, proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras, como un puente disulfuro.
[0048] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que el enlace escindible está sujeto a escisión in vivo en condiciones ácidas como las presentes en endosomas y/o en lisosomas de células de mamífero, preferiblemente de células humanas, preferiblemente a pH 4.0 -6.5, y más preferiblemente a pH ≤ 5.5.
[0049] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de uno o varios enlaces del grupo compuesto por un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace hidrazida, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano, un puente disulfuro, un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace peptídico o un enlace éster, preferiblemente a través de al menos una porción conectora.
[0050] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de uno o varios enlaces imina, hidrazona y hidrazida, cuyo enlace es preferiblemente escindible de acuerdo con la invención, donde preferiblemente la saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de el grupo funcional aldehido en la posición C-23 de la saponina.
[0051] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que el grupo funcional aldehido en la posición C-23 de la saponina está unida covalentemente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, dicha porción conectora está unida covalentemente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo en la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, por ejemplo, un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
[0052] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de un enlace amida, donde preferiblemente la saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través del grupo funcional ácido glucurónico en el carbohidrato sustituyente en el grupo C-3beta-0H de la saponina, cuando está presente.
[0053] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que el grupo funcional ácido glucurónico en el carbohidrato sustituyente en el grupo C-3beta-OH de la saponina se une covalentemente a la porción conectora 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-lH-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, donde dicha porción conectora se une covalentemente a través de un enlace amida a un grupo amino en la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, como un grupo amino de una lisina o un N-terminal de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base.
[0054] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, involucrando en el enlace covalente a el grupo funcional aldehído en la posición C-23 de la saponina, cuando está presente, y/o involucrando en el enlace covalente a el grupo funcional ácido glucurónico en el carbohidrato sustituyente en el grupo C-3beta-0H de la saponina, cuando está presente.
[0055] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que al menos un cuarto grupo químico de la estructura de base, para unir covalentemente la estructura de base a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la porción efectora, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de entre uno o varios de los siguientes: una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, preferiblemente un grupo azida.
[0056] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base comprende un polímero, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol, o un conjunto de estas estructuras poliméricas u oligoméricas lineales, ramificadas y/o cíclicas, cuyo ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
[0057] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina es un número definido de saponinas o un rango definido de saponinas, preferiblemente 1-128 saponinas o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 128 saponinas, o cualquier número de saponinas entre ellos, por ejemplo, 7, 9, 12 saponinas.
[0058] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el conjugado comprende más de una saponina, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre ellos, por ejemplo, 7, 9, 12 saponinas, unidas de manera covalente directamente a un residuo de aminoácido de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la porción efectora y preferiblemente a través de un residuo de aminoácido en la porción efectora, preferiblemente a una cisteína y/o a una lisina, y/o unido covalentemente a través de al menos una porción conectora y/o a través de al menos una porción conectora escindible y/o a través de al menos una estructura de base polimérica u oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 28-40, preferiblemente 1-8 de dichas estructuras de base o 2-4 de dichas estructuras de base, donde 1-32 saponinas, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16 o 32 saponinas, o cualquier número de saponinas entre ellos, por ejemplo, 7, 9, 12 saponinas, están unidas covalentemente a la estructura de base.
[0059] Una forma de realización es el conjugado de la invención, en el que la saponina se une covalentemente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y a la porción efectora a través de una porción conectora trifuncional, el cual comprende un segundo grupo químico con al menos una saponina unida de manera covalente ya sea directamente o a través de una porción conectora, por ejemplo, una porción conectora escindible, y/o a través de la estructura de base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y un cuarto grupo químico según la invención para la unión covalente de la estructura de base a la porción conectora trifuncional, el cual comprende además un tercer grupo químico para la unión covalente a la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular y que comprende un primer grupo químico para la unión covalente a la porción efectora, donde la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular está unida al tercer grupo químico y/o la porción efectora está unida al primer grupo químico, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional del esquema II y la estructura B.
[0060] Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la invención y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable.
[0061] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado de la invención o se refiere a la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento.
[0062] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado de la invención o se refiere a la composición farmacéutica de la invención, para usar en el tratamiento o prevención de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
[0063] Un aspecto de la invención se relaciona con cualquiera de los siguientes ADC y AOC, y sus conjugados semiacabados, que comprenden la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención y que comprenden, o bien al menos una porción efectora de la invención, o bien al menos una saponina de la invención, o ambas:
Anticuerpo anti-EGFR - saponina;
Anticuerpo anti-EGFR - saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina;
Anticuerpo anti-EGFR - SO1861;
Anticuerpo anti-EGFR - GE1741;
Anticuerpo anti-EGFR - SA1641;
Anticuerpo anti-EGFR - Quil-A;
Anticuerpo anti-EGFR - QS-21;
Anticuerpo anti-EGFR - saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria; Cetuximab - saponina;
Cetuximab - saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina;
Cetuximab - SO1861;
Cetuximab - GE1741;
Cetuximab - SA1641;
Cetuximab - Quil-A;
Cetuximab - QS-21;
Cetuximab - saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria;
Anticuerpo anti-HER2 - saponina;
Anticuerpo anti-HER2 - saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina;
Anticuerpo anti-HER2 - SO1861;
Anticuerpo anti-HER2 - GE1741;
Anticuerpo anti-HER2 - SA1641;
Anticuerpo anti-HER2 - Quil-A;
Anticuerpo anti-HER2 - QS-21;
Anticuerpo anti-HER2 - saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria; Trastuzumab - saponina;
Trastuzumab - saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina;
Trastuzumab - SO1861;
Trastuzumab - GE1741;
Trastuzumab - SA1641;
Trastuzumab - Quil-A;
Trastuzumab - QS-21;
Trastuzumab - saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria;
Anticuerpo anti-CD71 - saponina;
Anticuerpo anti-CD71 - saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina;
Anticuerpo anti-CD71 - SO1861;
Anticuerpo anti-CD71 - GE1741;
Anticuerpo anti-CD71 - SA1641;
Anticuerpo anti-CD71 - Quil-A;
Anticuerpo anti-CD71 - QS-21;
Anticuerpo anti-CD71 - saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria;
OKT-9 - saponina;
OKT-9 - saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina;
OKT-9-SO1861;
OKT-9-GE1741;
OKT-9-SA1641;
OKT-9 - Quil-A;
OKT-9-QS-21;
OKT-9 - saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria;
Anticuerpo anti-EGFR - oligonucleótido;
Anticuerpo anti-EGFR - oligonucleótido antisentido;
Anticuerpo anti-EGFR - ARNip;
Anticuerpo anti-EGFR - BNA antisentido;
Anticuerpo anti-EGFR - BNA antisentido (HSP27);
Anticuerpo anti-EGFR - toxina proteica;
Anticuerpo anti-EGFR - proteína inactivadora de ribosomas;
Anticuerpo anti-EGFR - diantina;
Anticuerpo anti-EGFR - saporina;
Cetuximab - oligonucleótido;
Cetuximab - oligonucleótido antisentido;
Cetuximab - ARNip;
Cetuximab - BNA antisentido;
Cetuximab - BNA antisentido (HSP27);
Cetuximab - toxina proteica;
Cetuximab - proteína inactivadora de ribosomas;
Cetuximab - diantina;
Cetuximab - saporina;
Anticuerpo anti-HER2 - oligonucleótido;
Anticuerpo anti-HER2 - oligonucleótido antisentido;
Anticuerpo anti-HER2 - ARNip;
Anticuerpo anti-HER2 - BNA antisentido;
Anticuerpo anti-HER2 - BNA antisentido (HSP27);
Anticuerpo anti-HER2 - toxina proteica;
Anticuerpo anti-HER2 - proteína inactivadora de ribosomas;
Anticuerpo anti-HER2 - diantina;
Anticuerpo anti-HER2 - saporina;
Trastuzumab - oligonucleótido;
Trastuzumab - oligonucleótido antisentido;
Trastuzumab - ARNip;
Trastuzumab - BNA antisentido;
Trastuzumab - BNA antisentido (HSP27);
Trastuzumab - toxina proteica;
Trastuzumab - proteína inactivadora de ribosomas;
Trastuzumab - diantina;
Trastuzumab - saporina;
Anticuerpo anti-CD71 - oligonucleótido;
Anticuerpo anti-CD71 - oligonucleótido antisentido;
Anticuerpo anti-CD71 - ARNip;
Anticuerpo anti-CD71 - BNA antisentido;
Anticuerpo anti-CD71 - BNA antisentido (HSP27);
Anticuerpo anti-CD71 - toxina proteica;
Anticuerpo anti-CD71 - proteína inactivadora de ribosomas;
Anticuerpo anti-CD71 - diantina;
Anticuerpo anti-CD71 - saporina;
OKT-9 - oligonucleótido;
OKT-9 - oligonucleótido antisentido;
OKT-9 - ARNip;
OKT-9 - BNA antisentido;
OKT-9 - BNA antisentido (HSP27);
OKT-9 - toxina proteica;
OKT-9 - proteína inactivadora de ribosomas;
OKT-9 - diantina;
OKT-9 - saporina;
Anticuerpo anti-EGFR (-oligonucleótido)(-saponina), donde el oligonucleótido es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por oligonucleótido antisentido, ARNip, BNA antisentido y BNA antisentido (HSP27), y donde la saponina es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, donde el anticuerpo anti-EGFR es preferiblemente cetuximab;
Anticuerpo anti-EGFR (- toxina proteica)(- saponina), en el que la toxina proteica es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una proteína que inactiva los ribosomas, una diantina y una saporina, y donde la saponina es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SOO861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, donde el anticuerpo anti-EGFR es preferiblemente cetuximab;
Anticuerpo anti-HER2 (-oligonucleótido)(-saponina), donde el oligonucleótido es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por oligonucleótido antisentido, ARNip, BNA antisentido y BNA antisentido (HSP27), y donde la saponina es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, donde el anticuerpo anti-HER2 es preferiblemente trastuzumab;
Anticuerpo anti-HER2 (- toxina proteica)(- saponina), en el que la toxina proteica es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una proteína que inactiva los ribosomas, una diantina y una saporina, y donde la saponina es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, donde el anticuerpo anti-HER2 es preferiblemente trastuzumab;
Anticuerpo anti-CD71 (-oligonucleótido)(-saponina), donde el oligonucleótido es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por oligonucleótido antisentido, ARNip, BNA antisentido y BNA antisentido (HSP27), y donde la saponina es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de QuiMaja saponaria, donde el anticuerpo anti-CD71 es preferiblemente OKT-9; y
Anticuerpo anti-CD71 (- toxina proteica)(- saponina), en el que la toxina proteica es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una proteína que inactiva los ribosomas, una diantina y una saporina, y donde la saponina es uno o varios de los elementos del grupo compuesto por una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-deshidrooleanano con grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, donde el anticuerpo anti-CD71 es preferiblemente OKT-9.
[0064] Una forma de realización es el conjugado semiacabado de la invención o el conjugado de la invención, en el que la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular se selecciona entre cetuximab, trastuzumab, OKT-9 y/o en el que la porción efectora se selecciona entre diantina, saporina y BNA antisentido (HSP27), y/o en el que la saponina se selecciona entre SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y las saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria.
[0065] Una forma de realización es el conjugado según la invención, en el que la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular se selecciona entre cetuximab, trastuzumab, OKT-9 y/o en el que la porción efectora se selecciona entre diantina, saporina y BNA antisentido (HSP27), y/o en el que la saponina se selecciona entre SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y las saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria.
[0066] Un aspecto de la invención se refiere a un ADC o un AOC o un conjugado de ADC semiacabado o un conjugado de AOC semiacabado que comprenden la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención y que comprenden al menos una porción efectora de la invención y/o que comprenden al menos una saponina de la invención, de estructura C:
A (- S)b (- E)c Estructura C,
donde A es la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular;
S es la saponina;
E es la porción efectora;
b = 0 - 64, preferiblemente 0, 1,2, 3, 4, 8, 16, 32, 64 o cualquier número entero o porción entre ellos;
c = 0 - 8, preferiblemente 0, 1,2, 3, 4, 6, 8 o cualquier número entero o porción entre ellos,
donde S está unido a A y/o E, E está unido a A y/o S, preferiblemente S está unido a A y E está unido a A.
[0067] Una forma de realización es la estructura C de la invención, donde A es un anticuerpo anti-EGFR como cetuximab, un anticuerpo anti-HER2 como trastuzumab, un anticuerpo anti-CD71 como OKT-9, y/o donde S es uno o varios elementos del grupo compuesto por una saponina, una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende opcionalmenteun grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, SO1861, GE1741, SA1641, Quil-A, QS-21 y saponinas en la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, y/o donde E es uno o varios elementos del grupo que comprende un oligonucleótido, un oligonucleótido antisentido, un ARNip, un BNA antisentido y un b Na antisentido (HSP27), y/o uno o varios elementos del grupo compuesto por una toxina proteica, una proteína que inactiva ribosomas, una diantina y una saporina.
[0068] Una forma de realización es la estructura C de la invención, el conjugado de la invención o el conjugado semiacabado de la invención, en el que la saponina, si está presente, y/o la porción efectora, si está presente, se une covalentemente a través de al menos una porción conectora, por ejemplo, una porción conectora escindible, y/o a través de al menos una estructura de base polimérica u oligomérica, como una porción conectora basado en ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP), y 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato (HATU), y como una estructura de base basada en un dendrón, por ejemplo, un G4-Dendrón o una porción conectora trifuncional como la porción conectora trifuncional del esquema II, y/o donde al menos una cadena lateral de lisina y/o una cadena lateral de cisteína de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, preferiblemente un anticuerpo monoclonal o fragmentos o dominios del mismo, están involucradas en el enlace covalente con la saponina y/o la porción efectora y/o la porción conectora y/o la porción conectora escindible y/o la estructura de base, donde preferiblemente la saponina y/o la porción efectora están unidas covalentemente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, preferiblemente un anticuerpo, donde el enlace covalente comprende o consiste en un enlace amida, un enlace hidrazona, un puente disulfuro.
[0069] Un aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los conjugados mencionados anteriormente, ADC, AOC, ADC semiacabados, AOC semiacabados, para usar como medicamento.
[0070] Un aspecto de la invención se refiere a cualquiera de los conjugados, ADC, AOC, ADC semiacabados, AOC semiacabados mencionados anteriormente, para usar en el tratamiento o la profilaxis de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
DEFINICIONES
[0071] El término "porción conectora" tiene su significado científico habitual, y aquí se refiere a una porción química o un tramo lineal de residuos de aminoácidos complejados a través de enlaces peptídicos, que une una molécula o un átomo a otra molécula, por ejemplo a un ligando o a una molécula efectora o a una estructura de base. Normalmente, la porción conectora comprende una cadena de átomos unidos por enlaces químicos. Cualquier molécula conectora o tecnología conectora conocida en la técnica puede usarse en la presente divulgación. Cuando se indique, la porción conectora es una porción conectora para la unión covalente de moléculas a través de un grupo químico en dicha molécula adecuada para formar una unión o enlace covalente con la porción conectora. La porción conectora puede ser una porción conectora no escindible, por ejemplo, la porción conectora es estable en condiciones fisiológicas. La porción conectora puede ser una porción conectora escindible, por ejemplo una porción conectora que es escindible, en presencia de una enzima o en un rango o valor de pH particular, o en condiciones fisiológicas tales como las condiciones intracelulares en los endosomas, por ejemplo, los endosomas tardíos y los lisosomas de células de mamíferos como las células humanas. Los ejemplos de porciones conectoras que se pueden usar en el contexto de la presente divulgación incluyen, entre otros, hidrazida de ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH), 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo o éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) y 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato (HATU).
[0072] El término "porción conectora trifuncional" tiene su significado científico habitual, y aquí se refiere a una porción conectora que une tres moléculas a través de un grupo químico en cada una de las tres moléculas. El experto en la materia puede diseñar tales porciones conectoras trifuncionales, basándose en la presente divulgación y el conocimiento general común. Dicha porción conectora trifuncional puede presentar, por ejemplo, un grupo maleimido que puede usarse para la conjugación con ligandos dirigidos que exhiben grupos tiol para realizar una reacción de tiol-eno. Además, la porción conectora trifuncional podría presentar un grupo dibenzociclooctino (DBCO) para realizar la llamada cicloadición de alquino-azida promovida por tensión (SPAAC, química clic) con una saponina portadora de azido. Finalmente, la porción conectora trifuncional podría obtener un tercer grupo funcional como, por ejemplo, un grupo trans-cicloocteno (TCO) para realizar la llamada reacción de Diels-Alder de demanda inversa de electrones (lEDDA) con una molécula efectora portadora de tetrazina (Tz). El experto en la materia apreciará que los grupos químicos de la porción conectora trifuncional pueden ser los tres iguales o diferentes, o la porción conectora puede comprender dos de los mismos grupos químicos para unir una molécula a la porción conectora trifuncional. Los enlaces formados entre la porción conectora trifuncional pueden ser covalentes o no covalentes, y se prefieren los enlaces covalentes. Los enlaces formados entre la porción conectora trifuncional y una o dos o tres moléculas unidas a través de grupos químicos respectivos pueden ser enlaces escindibles (lábiles), por ejemplo, escindibles en condiciones ácidas dentro de células como los endosomas y los lisosomas de células de mamíferos como las células humanas, o pueden ser enlaces no escindibles. Por supuesto, la porción conectora trifuncional puede incluir uno o dos grupos químicos para formar enlaces covalentes, mientras que los otros dos grupos químicos o el otro grupo químico, respectivamente, son para formar un enlace no covalente. Por supuesto, la porción conectora trifuncional puede abarcar uno o dos grupos químicos para formar enlaces escindibles mientras que los otros dos grupos químicos o el otro grupo químico, respectivamente, son para formar un enlace escindible.
[0073] El término "escindible", tal como se usa en el término "porción conectora escindible" o "enlace escindible" tiene su significado científico habitual, y aquí se refiere a estar sujeto a escisión en condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas o condiciones inducidas por la luz. Por ejemplo, una porción conectora escindible puede estar sujeto a escisión en condiciones ácidas, preferiblemente dicha porción conectora se somete a escisión in vivo en condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o los lisosomas de células de mamífero, preferiblemente células humanas, preferiblemente a pH 4.0 - 6.5, y más preferiblemente a pH ≤ 5.5. Como otro ejemplo, una porción conectora escindible puede estar sujeto a escisión por una enzima, por ejemplo, por catepsina. Además, un ejemplo de un enlace covalente escindible en condiciones reductoras es un puente disulfuro.
[0074] Los términos "oligómero" y "polímero" en el contexto de una estructura de base polimérica u oligomérica tienen su significado científico habitual. Un polímero aquí se refiere a una sustancia que tiene una estructura molecular construida principal o completamente a partir de un gran número de unidades iguales o similares unidas entre sí; un oligómero aquí se refiere a un polímero cuyas moléculas consisten en relativamente pocas unidades repetitivas. Por ejemplo, una estructura que comprende de 5 a 10 unidades iguales o similares puede denominarse estructura oligomérica, mientras que una estructura que comprende de 10 a 50 unidades monoméricas o más puede denominarse estructura polimérica, una estructura de 10 unidades monoméricas puede denominarse tanto oligomérica como polimérica.
[0075] El término "sitio de unión" tiene su significado científico habitual y aquí se refiere a una región o un epítopo en una molécula, por ejemplo una proteína, ADN o ARN, a la que se puede unir otra molécula.
[0076] El término "estructura de base" tiene su significado científico normal, y aquí se refiere a una plantilla oligomérica o polimérica o un portador o una base (molécula base o estructura base), a la que se unen una o varias moléculas, por ejemplo la molécula de ligando, la saponina de la invención, el glucósido, la molécula efectora, pueden unirse covalentemente, ya sea directamente o a través de una porción conectora, por ejemplo, una porción conectora escindible. Una estructura de base puede tener una formación estructuralmente ordenada, como un polímero, un oligómero, un dendrímero, un polímero dendronizado o un oligómero dendronizado, o tener una estructura polimérica ensamblada, como un hidrogel, un microgel, un nanogel, una micela polimérica estabilizada o un liposoma, pero excluye las estructuras que están compuestas de conjuntos no covalentes de monómeros tales como mezclas de colesterol/fosfolípidos. Una estructura de base puede comprender una estructura polimérica u oligomérica, como poli- u oligo(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina); o estructuras tales como polietilenglicol, poli- u oligo(ésteres), tales como poli(láctidos), poli(lactamas), copolímeros de poliláctidos-co-glicólidos; o poli(dextrina), poli- u oligosacáridos, tales como ciclodextrina o polidextrosa; o estructuras tales como poli- u oligoaminoácidos naturales y/o artificiales tales como polilisina o un péptido o una proteína, oligo- o polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de APN (ácido péptidonucleico). Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles, donde biocompatible significa que la estructura polimérica u oligomérica no muestra una toxicidad aguda o crónica sustancial en los organismos y puede excretarse tal cual o degradarse por completo a compuestos excretables y/o fisiológicos por la acción del metabolismo corporal.
[0077] El término "ligando" tiene su significado científico habitual, y aquí se refiere a cualquier molécula o moléculas que puedan unirse selectivamente a una molécula de la superficie de la célula diana o a un receptor de la superficie de la célula diana expresado en las células diana, por ejemplo células cancerosas diana o células autoinmunes diana. El ligando puede unirse a un epítopo compuesto por receptores u otros antígenos en las células diana. Preferiblemente, los ligandos de unión a células son anticuerpos.
[0078] El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se usa en el sentido más amplio, lo cual puede referirse a una inmunoglobulina (Ig) definida como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de las mismas), o un fragmento de unión funcional o un dominio de unión de una inmunoglobulina. En el contexto de la presente invención, un "fragmento de unión" o un "dominio de unión" de una inmunoglobulina se define como un fragmento o dominio de unión a un antígeno u otro derivado de una inmunoglobulina original que esencialmente mantiene la actividad de unión a un antígeno de dicha inmunoglobulina original. Los fragmentos funcionales y los dominios funcionales son anticuerpos en el sentido de la presente invención incluso si su afinidad por el antígeno es menor que la de la inmunoglobulina original. Los "fragmentos y dominios funcionales" de acuerdo con la invención incluyen, entre otros, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fab, scFv, dsFv, anticuerpo de dominio único (sdAb), IgG monovalente, scFv-Fc, IgG reducida (rIgG), minicuerpo, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas de fusión Fc, nanocuerpos, dominios V variables como VHH, Vh y otros tipos de fragmentos y dominios de inmunoglobulina que reconocen antígenos. Los fragmentos y dominios pueden diseñarse para minimizar o eliminar completamente las interacciones intermoleculares de disulfuro que ocurren entre los dominios CH1 y CL. Los dominios y fragmentos funcionales ofrecen la ventaja de una mayor penetración en el tumor debido a su tamaño más pequeño. Además, el fragmento o dominio funcional puede distribuirse más uniformemente por toda la masa tumoral en comparación con la inmunoglobulina completa.
[0079] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la presente invención pueden ser bi o multifuncionales. Por ejemplo, un anticuerpo bifuncional tiene un brazo que tiene especificidad por un receptor o antígeno, mientras que el otro brazo reconoce un receptor o antígeno diferente. Alternativamente, cada brazo del anticuerpo bifuncional puede tener especificidad por un epítopo diferente del mismo receptor o antígeno de la célula diana.
[0080] Los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la presente invención pueden ser, entre otros, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos renovados, anticuerpos antiidiotípicos, anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos híbridos de rata/ratón, anticuerpos de llama, anticuerpos solo de cadena pesada de llama, anticuerpos solo de cadena pesada y anticuerpos veterinarios. Preferiblemente, el anticuerpo (inmunoglobulina) de la presente invención es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos totalmente humanos, humanizados, quiméricos y renovados también son más preferidos porque es menos probable que provoquen inmunogenicidad en humanos. Los anticuerpos del ADC de la presente invención preferiblemente se unen específicamente a un antígeno expresado en la superficie de una célula cancerosa, una célula autoinmune, una célula enferma, una célula aberrante, dejando esencialmente inalterada cualquier célula sana (por ejemplo, no uniéndose a dicha célula normal, o uniéndose en menor medida en número y/o afinidad a dicha célula sana).
[0081] Los anticuerpos específicos que se pueden usar para los ADC de la presente invención incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales anti-HER2 como trastuzumab y pertuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD20 como rituximab, ofatumumab, tositumomab e ibritumomab, anticuerpos monoclonales anti-CA125 como oregovomab, anticuerpos monoclonales anti-EpCAM (17-1A) como edrecolomab, anticuerpos monoclonales anti-EGFR como cetuximab, panitumumab y nimotuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD30 como brentuximab, anticuerpos monoclonales anti-CD33 como gemtuzumab y huMy9-6, anticuerpos monoclonales anti-integrina alfa-v beta-3 vascular como etaracizumab, anticuerpos monoclonales anti-CD52 como alemtuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD22 como epratuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CEA como labetuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD44v6 como bivatuzumab, anticuerpos monoclonales anti-FAP como sibrotuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD19 como huB4, anticuerpos monoclonales anti-CanAg como huC242, anticuerpos monoclonales anti-CD56 como huN901, anticuerpos monoclonales anti-CD38 como daratumumab, anticuerpos monoclonales anti-CA6 como DS6, anticuerpo monoclonales anti-IGF-IR como cixutumumab y 3B7, anticuerpos monoclonales anti-integrina como CNTO 95 y anticuerpos monoclonales antisindecano-1 como B-B4. Una forma de realización es el conjugado proteína-toxina de Stemline: ELZONRIS™ (tagraxofusp, SL-401) - ELZONRIS es una nueva terapia dirigida que toma como diana el receptor-a de la interleucina-3 (IL-3) (CD123), una diana presente en una amplia gama de tumores malignos.
[0082] Cualquier otra molécula además de los anticuerpos que se unen a un receptor celular o antígeno de una célula diana también se puede usar como ligando de unión celular para los conjugados ligando-fármaco de la presente invención y los ligandos provistos de saponina unida covalentemente según la invención. Estos ligandos incluyen, entre otros, proteínas, polipéptidos, péptidos y moléculas pequeñas. Ejemplos de estos ligandos que no son anticuerpos son los interferones (por ejemplo, IFN-a, IFN-p e IFN-y), transferrinas, lectinas, factores de crecimiento epidérmico (EGF) y dominios similares a EGF, péptidos liberadores de gastrina (GRP), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento transformantes (TGF), factor de crecimiento de vaccinia (VGF), insulina y factores de crecimiento similares a la insulina (IGF, por ejemplo, IGF-1 e IGF-2), otras hormonas adecuadas como las hormonas liberadoras de tirotropina (TRH), hormonas estimulantes de melanocitos (MSH), hormonas esteroides (por ejemplo, estrógeno y andrógeno), somatostatina, linfocinas (por ejemplo, IL-2, IL-3, IL-4 e IL-6), factores estimulantes de colonias (CSF, por ejemplo, G-CSF, M-CSF y g M-CSF), bombesina, gastrina, Arg-Gly-Asp o RGD, aptámeros (por ejemplo, AS-1411, GBI-10, aptámeros de ARN contra la glicoproteína del VlH), moléculas pequeñas (por ejemplo, folato , anisamida, ácido fenilborónico), vitaminas (por ejemplo, vitamina D), hidratos de carbono (por ejemplo, ácido hialurónico, galactosa).
[0083] Una "molécula efectora" o "porción efectora" o "carga útil" tienen su significado científico habitual y en el contexto de esta invención es cualquier sustancia que afecta el metabolismo de una célula por interacción con una molécula efectora intracelular diana, en donde esta molécula efectora diana es cualquier molécula o estructura dentro de las células excluyendo la luz de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje pero incluyendo las membranas de estos compartimentos y vesículas. De este modo, dichas estructuras en el interior de las células incluyen el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, otras vesículas de transporte, la parte interna de la membrana plasmática y el citosol.
[0084] La molécula o porción efectora es una sustancia farmacéuticamente activa, tal como una toxina, por ejemplo, una toxina proteica, un fármaco, un polipéptido o un polinucleótido. Una sustancia farmacéuticamente activa en esta invención es una molécula o porción efectora que se usa para lograr un resultado beneficioso en un organismo, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un mamífero, por ejemplo, un sujeto no humano o un ser/sujeto humano. Los beneficios incluyen diagnóstico, pronóstico, tratamiento, cura y prevención (profilaxis) de enfermedades y/o síntomas y/o problemas de salud. La sustancia farmacéuticamente activa también puede provocar efectos secundarios no deseados y, a veces, incluso dañinos (eventos adversos como los observados durante los ensayos clínicos). En este caso, se deben sopesar los pros y los contras para decidir si la sustancia farmacéuticamente activa es adecuada en el caso particular. Si el efecto de la sustancia farmacéuticamente activa dentro de una célula es predominantemente beneficioso para el organismo en su conjunto, la célula se denomina célula diana. Si el efecto dentro de una célula es predominantemente dañino para el organismo en su conjunto, la célula se denomina célula no diana. En sistemas artificiales como cultivos celulares y biorreactores, las células diana y las células no diana dependen del propósito y las define el usuario. Los ejemplos de moléculas y fracciones efectoras son un fármaco, una toxina, un polipéptido (como una enzima), un polinucleótido (incluidos polipéptidos y polinucleótidos que comprenden aminoácidos no naturales o ácidos nucleicos) y cualquier combinación de los mismos.
[0085] Una molécula o porción efectora que es un fármaco puede incluir, entre otros, agentes anticancerígenos, agentes antiinflamatorios y agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivirales). Preferiblemente, la molécula de fármaco de la presente invención es un agente anticancerígeno o un agente antiautoinmune. Los agentes anticancerígenos adecuados incluyen, entre otros, agentes alquilantes, antimetabolitos, alcaloides de antimitóticos de origen vegetal, antibióticos citotóxicos/antitumorales, inhibidores de topoisomerasa, fotosensibilizadores e inhibidores de quinasa. También se incluyen en la definición de "agente anticancerígeno": por ejemplo (i) agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de receptores de estrógenos; (ii) inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales; (iii) antiandrógenos; (iv) inhibidores de proteína quinasa; (v) inhibidores de la quinasa de lípidos; (vi) oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en vías de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante; (vii) ribozimas tales como inhibidores de la expresión de VEGF e inhibidores de la expresión de HER2; (viii) vacunas tales como vacunas de terapia génica; inhibidores de la topoisomerasa 1; (ix) agentes antiangiogénicos; y sales, ácidos, solvatos y derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
[0086] Una molécula o porción efectora que es una toxina puede incluir, entre otras, toxinas proteicas (por ejemplo, toxinas derivadas de bacterias y toxinas derivadas de plantas), toxinas que se dirigen a los filamentos de tubulina, toxinas que se dirigen al ADN y toxinas que se dirigen al ARN. Los ejemplos de toxinas proteicas son saporina, diantina, ricina, modecina, abrina, volkensina, viscumina, toxina shiga, toxina similar a shiga, exotoxina de pseudomonas (PE, también conocida como exotoxina A), toxina diftérica (DT) y toxina del cólera. Los ejemplos de toxinas dirigidas a los filamentos de tubulina son maitansinoides (por ejemplo, DM1 y DM4), auristatinas (por ejemplo, monometil auristatina E (MMAE) y monometil auristatina F (MMAF)), toxoides, tubulisinas, criptoficinas, rizoxina. Los ejemplos de toxinas dirigidas al ADN son las caliqueamicinas: N-acetil-Y-calicheamicina, análogos de CC-1065, duocarmicinas, doxorrubicina, metotrexato, benzodiazepinas, análogos de camptotecina y antraciclinas. Los ejemplos de toxinas dirigidas al ADN son las amanitinas, las espliceostatinas y las thailanstatinas. Una toxina, tal como se usa en esta invención, se define como una sustancia farmacéuticamente activa que es capaz de matar o inactivar una célula. Preferiblemente, una toxina dirigida es una toxina que es solo, o al menos predominantemente, tóxica para las células diana pero no para las células no diana. El efecto neto de la toxina dirigida es preferiblemente beneficioso para el organismo en su conjunto.
[0087] Una molécula o porción efectora que es un polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que recupera una función perdida, como por ejemplo reemplazo de enzimas, funciones de regulación de genes o una toxina. Los ejemplos de polipéptidos como moléculas efectoras son, por ejemplo, Cas9; toxinas (por ejemplo, saporina, diantina, gelonina, (de) bouganina, agrostina, ricina (cadena de la toxina A); proteína antiviral de hierba carmín, apoptina, toxina diftérica, exotoxina de pseudomonas) enzimas metabólicas (por ejemplo, argininosuccinato liasa, argininosuccinato sintetasa), enzimas de la cascada de coagulación, enzimas reparadoras; enzimas para señalización celular; factores de regulación del ciclo celular; factores reguladores de genes (factores de transcripción como NF-kB o represores de genes como el represor de metionina).
[0088] Una molécula o una porción efectora que es un polinucleótido puede ser, por ejemplo, un polinucleótido que comprende información de codificación, tal como un gen o un marco de lectura abierto que codifica una proteína. También puede incluir información de regulación, por ejemplo regiones de unión a elementos reguladores o promotores, o secuencias que codifican micro ARN. Dicho polinucleótido puede comprender ácidos nucleicos naturales y artificiales. Los ácidos nucleicos artificiales incluyen, por ejemplo ácido péptidonucleico (APN), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treonucleico (ATN). Cada uno de estos se distingue del ADN o ARN natural por cambios en el esqueleto de la molécula. Los ejemplos de nucleótidos como moléculas efectoras son, entre otros, por ejemplo, el ADN: ADN monocatenario (por ejemplo, ADN para adenina fosforribosiltransferasa); ADN lineal bicatenario (por ejemplo, gen del factor IX de coagulación); ADN circular de bicatenario (por ejemplo, plásmidos); el ARN: ARNm (por ejemplo, nucleasas de moléculas efectoras TAL), ARNt, ARNr, ARNip, miARN, ARN antisentido; oligonucleótidos antisentido (OA, por ejemplo, APN, PMO, LNA y BNA).
[0089] El término "proteico", usado en, por ejemplo, "molécula proteico" y "toxina proteico", se refiere a moléculas y toxinas que comprenden al menos una cadena de residuos de aminoácidos que pueden obtenerse como un producto de expresión a partir de un único ARNm. Dicha molécula o toxina puede comprender además cualquier modificación postraduccional, un carbohidrato tal como un carbohidrato unido a N o a 0, enlaces disulfuro, fosforilaciones, sulfataciones, etc., como resultado de cualquier modificación postraduccional, y/o puede comprender además cualquier otra modificación, como las que resultan de modificaciones químicas (por ejemplo, la unión de fracciones efectoras, saponina, estructuras de base, ligandos, etc., ya sea directamente a, por ejemplo, una cadena lateral de aminoácido, o a través de al menos una porción conectora (covalentemente) unido a la molécula para modificar químicamente la molécula proteica, y unido químicamente (covalentemente) a la molécula proteica). El término "proteico" también abarca e incluye conjuntos de dichas moléculas, por ejemplo homodímeros, heterotrímeros, heterohexámeros o conjuntos complejos como los ribosomas.
[0090] Los términos "específico" y "específicamente", en el contexto de, por ejemplo, "unión específica" y "receptor o diana molecular específicamente presente o expresado en la superficie de una célula tumoral" y similares, tienen su significado científico normal conocido en la técnica, y aquí se refieren a, por ejemplo, una interacción de unión de una primera molécula con una segunda molécula que se produce con una mayor afinidad en relación con cualquier unión putativa de la primera molécula con otra molécula diferente de la segunda molécula, o por ejemplo a la expresión o expresión en mayor medida cuando, por ejemplo se considera el número de receptores o dianas moleculares, de un receptor de superficie celular o diana molecular en la superficie de un primer tipo de célula como una célula tumoral, una célula autoinmune, una célula enferma, una célula aberrante, en relación con el grado de expresión de el mismo receptor o diana molecular en un segundo tipo de célula tal como una célula sana, etc., donde la expresión en el segundo tipo de célula puede estar completamente ausente o ser muy baja, en relación con cualquier grado de expresión en la célula tumoral, etc. Además, el término "específico", por ejemplo en "unión específica", tiene su significado científico normal conocido en la técnica, y aquí tiene el significado de indicar una molécula que puede tener una interacción con otra molécula con mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. De manera similar, el término "especificidad" se refiere a una interacción, por ejemplo, entre dos moléculas o entre una célula y una molécula, que tiene una mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. Las moléculas de unión, como las inmunoglobulinas, se unen a través de su sitio de unión, por ejemplo, las regiones variables de inmunoglobulina de la inmunoglobulina, a sitios de unión en las moléculas, como los epítopos, los receptores de superficie celular, etc., con una mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. En el contexto de la invención, las interacciones de fondo suelen ser interacciones con una afinidad inferior a una Kd de 10E-4 M. De manera similar, los "dominios de unión específicos" son dominios que se unen preferiblemente a sitios de unión en moléculas, tales como epítopos, receptores de superficie celular, etc., con una mayor afinidad de unión que las interacciones de fondo entre moléculas. En el contexto de la invención, las "interacciones de fondo" son típicamente interacciones con una afinidad inferior a una Kd de 10E-4 M. Preferiblemente, los dominios de unión específicos se unen con una afinidad superior a una Kd de unos 10E-5 M.
[0091] El término "unión" se define como interacciones entre moléculas que pueden distinguirse de las interacciones de fondo.
[0092] A lo largo de la especificación, el término "fragmento" se refiere a una secuencia de aminoácidos que forma parte de un dominio proteico o que forma un dominio proteico intacto. Los fragmentos de unión según la invención deben tener especificidad de unión para la diana correspondiente, como un receptor de superficie celular, por ejemplo en la superficie de una célula enferma tal como una célula tumoral.
[0093] El término "ADC" o "conjugado de anticuerpo-fármaco" tiene su significado científico habitual conocido por los expertos, y aquí se refiere a una clase de fármacos biofarmacéuticos diseñados como una terapia dirigida para tratar, por ejemplo, el cáncer. A diferencia de la quimioterapia, los ADC están destinados a atacar y destruir las células tumorales sin afectar las células sanas. Los ADC están compuestos por un anticuerpo vinculado a una carga útil o fármaco citotóxico (anticancerígeno) biológicamente activo. Los ADC combinan las capacidades de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales con la capacidad de eliminar el cáncer de los fármacos citotóxicos. Están diseñados con la intención de discriminar entre células sanas y tejidos enfermos, por ejemplo, las células tumorales en un tumor.
[0094] El término "Saponinum album" tiene su significado normal y aquí se refiere a una mezcla de saponinas producida por Merck KGaA (Darmstadt, Alemania) que contiene saponinas de Gypsophila paniculata y Gypsophila arostii, que contiene SA1657 y principalmente SA1641.
[0095] El término "Quillaja saponina" tiene su significado normal y aquí se refiere a la porción de saponina de Quillaja saponaria y, por lo tanto, a la fuente de todas las demás saponinas QS, que contienen principalmente QS-18 y QS-21.
[0096] "QS-21" o "QS21" tiene su significado científico normal y aquí se refiere a una mezcla de QS-21 A-apio (~63 %), QS-21 A-xylo (~32 %), QS-21 B- apio (~3.3 %) y QS-21 B-xylo (~1.7 %).
[0097] De manera similar, "QS-21A" tiene su significado científico habitual y aquí se refiere a una mezcla de QS-21 A-apio (~65 %) y QS-21 A-xylo (~35 %).
[0098] De manera similar, "QS-21B" tiene su significado científico habitual y aquí se refiere a una mezcla de QS-21 B-apio (~65 %) y QS-21 B-xylo (~35 %).
[0099] El término "Quil-A" se refiere a un extracto semipurificado comercialmente disponible de Quillaja saponaria y contiene cantidades variables de más de 50 saponinas distintas, muchas de las cuales incorporan la subestructura triterpeno-trisacárido Gal-(1^2)-[Xyl-(1^3)]-GlcA- en el grupo C-3beta-OH que se encuentra en QS-7, QS-17, QS18 y QS-21. Las saponinas encontradas en Quil-A se enumeran en van Setten (1995), Tabla 2 [Dirk C. van Setten, Gerrit van de Werken, Gijsbert Zomer y Gideon F. A. Kersten, Compositions and Structural Characteristics of the Potential Immuno-adjuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria Molina Extract Quil A, RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY, VOL. 9660-666 (1995J]. Quil-A y también Quillaja saponina son fracciones de saponinas de Quillaja saponaria y ambos contienen una gran variedad de saponinas diferentes con contenido en gran parte superpuesto. Las dos fracciones difieren en su composición específica ya que ambas se obtienen mediante diferentes procedimientos de purificación.
[0100] El término "QS1861" y el término "QS1862" se refieren a QS-7 y QS-7 api. QS1861 tiene una masa molecular de 1861 Dalton, QS1862 tiene una masa molecular de 1862 Dalton. QS1862 se describe en Fleck et al. (2019) en la tabla 1, fila n.° 28 [Juliane Deise Fleck, Andresa Heemann Betti, Francini Pereira da Silva, Eduardo Artur Troian, Cristina 0livaro, Fernando Ferreira y Simone Gasparin Verza, Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis: Particular Chemical Characteristics and Biological Activities, Molecules 2019, 24, 171; doi:10.3390/molecules24010171]. La estructura descrita es la variante api QS1862 de QS-7. La masa molecular es de 1862 Dalton ya que esta masa es la masa formal que incluye el protón en el ácido glucurónico. A pH neutro, la molécula se desprotona. Cuando se mide en espectrometría de masas en modo de iones negativos, la masa medida es de 1861 Dalton.
[0101] Los términos primero, segundo, tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones, se usan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Los términos son intercambiables bajo las circunstancias apropiadas. Las formas de realización de la invención pueden funcionar en otras secuencias que las descritas o ilustradas en este documento.
[0102] Además, las diversas formas de realización, aunque se denominen "preferidas" o vayan acompañadas de "p. ej." o "por ejemplo" o "en particular" deben interpretarse como formas ejemplares en las que la invención puede implementarse en lugar de limitar el alcance de la invención.
[0103] El término "que comprende", utilizado en las reivindicaciones, no debe interpretarse como restringido a los elementos o pasos enumerados a continuación; no excluye otros elementos o pasos. Debe interpretarse como una especificación de la presencia de las características, números enteros, pasos o componentes indicados a los que se hace referencia, pero no excluye la presencia o la adición de una o más características, números enteros, pasos o componentes, o grupos de los mismos. Por lo tanto, el alcance de la expresión "una composición farmacéutica que comprende A y B" no debe limitarse a una composición farmacéutica que consta únicamente de los componentes A y B, sino que, con respecto a la presente invención, los únicos componentes enumerados de la composición farmacéutica son A y B, y además, la reivindicación debe interpretarse como que incluye equivalentes de esos componentes. De manera similar, el alcance de la expresión "un método que comprende el paso A y el paso B" no debe limitarse a un método que consta solo de los pasos A y B, sino que, con respecto a la presente invención, los únicos pasos enumerados del método son A y B, y además, la reivindicación debe interpretarse como que incluye equivalentes de esos pasos.
[0104] Además, la referencia a una característica por el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que más de una de las características, como por ejemplo un componente, excipiente, saponina, etc., estén presentes, a menos que el contexto claramente requiere que haya una y solo una de las características. De este modo, los artículos indefinidos «un» o «una» significan generalmente «al menos uno».
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0105]
Figura 1. La administración de toxina proteica dirigida al tumor da como resultado la reducción del volumen del tumor y la inhibición del crecimiento del tumor en ratones portadores de tumores. A) El escalado de la dosis (intraperitoneal, i.p.) de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2 en ratones portadores de tumores A431 revela una reducción del volumen del tumor, en comparación con el control. B, C) El escalado de la dosis (intraperitoneal, i.p. (B) o intravenosa i.v. (C)) de cetuximab-(Cys-L-S01861)3,9(Lys-L-diantina)2 en ratones portadores de tumores A431 revela una reducción del crecimiento tumoral, en comparación con los controles.
Figura 2. Entrega de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigida al tumor y silenciamiento génico en ratones portadores de tumores. 30 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8 en ratones portadores de tumores A431 revela un silenciamiento génico eficiente inducido dirigido al tumor, en comparación con los controles.
Figura 3. Entrega de oligonucleótidos de BNA antisentido dirigida al tumor y silenciamiento génico en ratones portadores de tumores. 30 mg/kg cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 en ratones portadores de tumores A431 revela un silenciamiento génico eficiente inducido dirigido al tumor, en comparación con los controles.
Figura 4: HER2 o EGFR dirigidos a la administración de toxina proteica y destrucción de células en células cancerosas, según la invención. A, B) Trastuzumab-(Cys-L-SOO861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 o trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7tratamiento y controles en células SK-BR-3 (HER2++) y células MDA-MB-468 (HER2). C, D) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 o cetuximab-(Cys-L-SOO861)3,8(Lys-S-diantina)1,7 tratamiento y controles en células A431 (EGFR++) y células A2058 (EGFR-). Observación: Para conocer los datos de expresión del receptor diana de cada línea celular (determinados por análisis FACS), consulte la tabla 23.
Figura 5: EGFR dirigido a la administración de oligonucleótidos de BNA antisentido y al silenciamiento génico en células cancerosas, según la invención. A,B) Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)1,7tratamiento y controles en células A431 (EGFR++) y células A2058 (eGfR-). Observación: Para conocer los datos de expresión del receptor diana de cada línea celular (determinados por análisis FACS), consulte la tabla 23.
Figura 6: HER2 dirigido al suministro de oligonucleótidos BNA antisentido y al silenciamiento génico en células cancerosas, según la invención. Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3'8(Lys-L-HSP27BNA)3'5 tratamiento y controles en células SK-BR-3 (HER2++). ObOervación: Para conocer los datos de expresión del receptor diana de cada línea celular (determinados por análisis FACS), consulte la tabla 23.
Figura 7: EGFR dirigido a la administración de oligonucleótidos de BNA antisentido y al silenciamiento génico en células cancerosas, según la invención. A,B) Cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 tratamiento y controles en células A431 (Eg Fr++) y células A2058 (EGFR-). Observación: Para conocer los datos de expresión del receptor diana de cada línea celular (determinados por análisis FACS), consulte la tabla 23.
Figura 8 Tratamientos de control en todas las líneas celulares. A-D) Viabilidad celular cuando trastuzumab (A), cetuximab (B), T-DM1, (C) toxinas libres: saporina y diantina (D) o saporina unida a una IgG no celular (d ) se tratan con las líneas celulares indicadas SK-BR-3, JIMT-1, m Da -MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058, BT-474. Observación: Para conocer los datos de expresión del receptor diana de cada línea celular (determinados por análisis FACS), consulte la tabla 23.
Figura 9: Concepto (S)n-(L)(E): mAb-(SO1861)n(toxina proteica)n. Tanto SO1861 en los residuos de cisteína (Cys) como la toxina proteica (proteína inactivadora de ribosomas) en los residuos de lisina se conjugan con el mismo anticuerpo (mAb) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb-(Cys-L-SO1861)4(toxina proteica Lys)2 se une a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce endocitosis mediada por receptor, 3) a un pH endolisosomal bajo y una concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosomal, 4) se produce la liberación de toxina en el citoplasma y 5) la toxina induce la muerte celular
Figura 10: Concepto (S)n-(L)(E): mAb-(SO1861)n(oligonucleótido de BNA antisentido)n. Tanto SO1861 en los residuos de cisteína (Cys) como el oligonucleótido de BNA antisentido en los residuos de lisina, se conjugan con el mismo anticuerpo (mAb) para la administración e internalización en las células diana. 1) mAb-(Cys-SO1861)4(Lis-BNAoligo)2 se une a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce la endocitosis mediada por el receptor de ambos conjugados, 3) a un pH endolisosomal bajo y una concentración adecuada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosomal, 4) se produce la liberación del oligonucleótido de BNA en el citoplasma y 5) se induce el silenciamiento dirigido del gen.
Figura 11: Concepto (S)n-(L)(E): mAb-(SO1861-estructura de base-oligonucleótido de BNA antisentido)n. El (SO1861-porción conectora trifuncional-oligonucleótido de BNA)n se conjuga con un anticuerpo (mAb) para su administración e internalización en las células diana. 1) mAb-(SO1861-porción conectora trifuncionaloligonucleótido de BNA)4 se une a su receptor de superficie celular correspondiente, 2) se produce la endocitosis mediada por el receptor de ambos conjugados, 3) a un pH endolisosomal bajo y concentración apropiada, SO1861 se activa para permitir el escape endolisosomal, 4) se produce la liberación del oligonucleótido de BNA en el citoplasma y 5) se induce el silenciamiento dirigido de genes.
Figura 12. Procedimiento de conjugación del anticuerpo-SO1861. Se muestra la reacción de unión de la unión de cuatro fracciones de una saponina SO1861 de origen vegetal a las cuatro cisteínas en la cadena ligera de un anticuerpo. En primer lugar, los enlaces disulfuro de la IgG se rompen bajo la influencia de la exposición a TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina); en segundo lugar, la saponina SO1861 que comprende una porción conectora químico unido a ella, se añade junto con ácido trifluoroacético, y cuatro fracciones de saponina se unen a la IgG. Para producir saponinas escindibles "listas para conjugar", el grupo aldehído de SO1861 se hizo reaccionar con una porción conectora EMCH (hidrazida de ácido £-maleimidocaproico). El grupo hidrazida de EMCH forma un enlace de hidrazona escindible mediante ácido con el aldehído de SO1861. Al mismo tiempo, la porción conectora EMCH presenta un grupo maleimida que reacciona con el tiol (grupo sulfhidrilo) y, por lo tanto, puede conjugarse con tioles de la IgG, es decir, el resto del ligando. Con esto, se proporciona un conjugado de la invención que potencia el escape endosomal, y/o se proporciona una primera molécula de unión de la invención.
Figura 13. Síntesis de SO1861-EMCH
Figura 14 Síntesis de Dendrón-(-L-SO1861)4
Figura 15. Síntesis de Dendrón-(-L-SO1861)8
Figura 16. Síntesis de SO181-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA
Figura 17. Síntesis de HSP27BNA-dendron-(-L-SO1861)4
Figura 18. Síntesis de Dendrón (NEM)4
Figura 19: Precursor de estructura de base con cuatro grupos amino para enlace de saponina y un grupo azida para química clic.
Figura 20: Evidencia de la unión de saponinas a la estructura de base modelo. El recuadro muestra los picos y la distribución de intensidad teóricamente esperados para las saponinas unidas. Los datos experimentales obtenidos por LC-MS/ESI-MS muestran casi exactamente los mismos picos en m/z 758-760 Da demostrando el éxito en la unión de saponinas.
Figura 21: Ensayos de citotoxicidad utilizando la toxina dirigida diantina-factor de crecimiento epidérmico (diantina-EGF). Las células no tratadas se normalizaron a 1. La estructura polimérica (Pentrimer) no influye en la viabilidad celular ni en presencia ni en ausencia de diantina-EGF y saponina (SA1641), lo que indica que no hay citotoxicidad intrínseca de la estructura polimérica. La toxina seleccionada en la que se puede hacer reaccionar por química clic (Diantina-EGF-alquino) tiene una actividad marcadamente reducida, que es el resultado de la modificación de la toxina pero no tiene ninguna relación con la estructura de base. La estructura polimérica funcionalizada tiene la misma actividad que la toxina dirigida sin reacción de química clic, lo que indica que la funcionalización de la estructura de base no afecta la actividad de la molécula efectora. El efecto de las saponinas es idéntico en presencia y ausencia de la estructura polimérica, lo que demuestra que la estructura polimérica no perjudica la eficacia de las saponinas en el sistema de dos componentes.
Figura 22: Espectro H-RMN de (A) SO1861 y (B) SO1861-EMCH (EMCH = hidrazida del ácido N-emaleimidocaproico). (A) El pico a 9.43 ppm (Ha) corresponde al protón aldehido de SO1861. (B) El pico a 6.79 ppm (HC) corresponde a los protones de maleimida de SO1861-EMCH, mientras que el pico a 7.68 ppm (Hb) corresponde al protón de hidrazona. La ausencia de señal a 9.43 ppm indica una conversión cuantitativa del grupo aldehído.
Figura 23: (A) Espectro MALDI-TOF-MS de SO1861-EMCH y (B) SO1861-EMCH-mercaptoetanol. (A) Modo RP: miz 2124 Da ([M+K]+ , saponina-EMCH), m/z 2109 Da ([M+K]+ , SO1861-EMCH), m/z 2094 Da ([M+Na]+, SO1861-EMCH). (b ) Modo RP: miz 2193 Da ([M+K]+ , saponina-EMCH-mercaptoetanol), miz 2 l85 Da ([M+K]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol), miz 2170 Da ([M+Na]+ , SO1861-EMCH-mercaptoetanol).
Figura 24: Estructura de SO1861 con grupos químicos resaltados para la conjugación de saponinas que mejoran el escape endosomal con una estructura polimérica. Los grupos resaltados son aldehído (círculo negro), ácido carboxílico (círculo discontinuo), alqueno (pentágono discontinuo) y alcohol (recuadro discontinuo). El grupo aldehido (flecha) es el grupo más adecuado para reacciones de conjugación reversibles y quimioselectivas.
Figura 25: Estrategia para producir saponinas potenciadoras del escape endosomal (A) estables y (B) escindibles "listas para conjugar".
Figura 26: Hidrólisis del enlace hidrazona de SO1861-EMCH en condiciones ácidas.
Figura 27: Estructura de SO1861-EMCH. (A) Estructura molecular estándar y (B) modelo 3D. El grupo maleimida está marcado con un círculo.
Figura 28: (A) esquema de síntesis SO1861-EMCH. (B) espectros MALDI-TOF-MS de SO1861 (miz 1861 Da) y (C) SO1861-EMCH (miz 2068 Da) en modo reflector negativo. ATF: ácido trifluoroacético, t.a.: temperatura ambiente, h: horas y PM: peso molecular.
Figura 29: Espectros Ma Ld I-TOF-MS de SO1861-EMCH (A) antes y (B) después de la hidrólisis en solución de HCl a pH 3.
Figura 30: Esquema de reacción de la conjugación de SO1861-EMCH con cualquier estructura polimérica portadora de amina.
Figura 31: Espectros MALDI-TOF-MS de (A) BSA-SO1861 (miz 70.0 kDa, 72,1 kDa, 74.2 kDa) y (B) BSA (miz 66.6 kDa).
Figura 32: Esquema de reacción de la conjugación de (A) SOO861-EMCH y (B) SO1861-HATU (HATU = 1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato) con un dendrímero G5 de poliamidoamina marcado con colorante cianina 3 (PAMAM).
Figura 33: Espectros MALDI-TOF-MS de (A) Cy3-PAMAM, (B-D) Cy3-PAMAM-SO1861 con equivalentes de adición crecientes de SO1861-EMCH desde (B) hasta la parte inferior (D). (B) corresponde a Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 SO1861 unidos por PAMAM, (C) corresponde a Cy3-PAMAM-SO1861 con 13 SO1861 unidos por PAMAM y (D) corresponde a Cy3-PAMAM-SO1861 con 51 SO1861 unidos por PAMAM.
Figura 34: Espectros Ma LDI-To F-MS de (A) Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 equivalentes de adición de SO1861-EMCH y (B) Cy3-PAMAM-SO1861 con 30 equivalentes de adición de SO1861-EMCH.
Figura 35: Espectros MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (NC = enlace estable ("no escindible"). Figura 36: (A) Esquema de reacción y espectros MALDI-TOO-MS de (B) Cy3-PAMAM-NC-SO1861-Dibenzociclooctina (DBCO), (C) Cy3-PAMAM-(SO1861)5-DBCO y (D) Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO. Figura 37: Esquema de reacción de (A) diantina-EGF-Alexa488 y (B) diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3. Espectros Ma Ld I-TOF-MS de (C) diantina-EGF, (D) diantina-EGF-Alexa488 y (E) diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3 ; Alexa488: tinte Alexa Fluor 488.
Figura 38: Esquema de reacción de (A) diantina-Alexa488 y (B) diantina-Alexa488-SS-PEG-N3. Espectros MALDI-TOF-MS de (C) diantina, (D) diantina-Alexa488 y (E) diantina-Alexa488-SS-PEG-N3 ; Alexa488: tinte Alexa Fluor 488.
Figura 39: Imágenes de fluorescencia del gel SDS-PAGE realizadas en un sistema de imágenes VersaDoc. M = marcador, P = Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO, D = diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3 , C1 = Cy3-PAMAM-(SO1861)5-diantina-EGF-Alexa488, C2 = Cy3-PAMAM-NC-SO1861-diantina-EGF-Alexa488 y C3 = Cy3-PAMAM-(SO1861)27-diantina-EGF-Alexa488.
Figura 40: (A) Esquema de síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora. (B y C) Espectros MALDI-TOF-MS respectivos.
Figura 41: Esquema de reacción para la generación de poli(SO1861) utilizando SO1861-EMCH como monómero, el sistema APSiTMEDA como iniciador de polimerización y aminopropanotiol como neutralizador de radicales.
Figura 42: Espectros MALDI-TOF-MS de lotes de reacción de poli(SO1861). (A) SO1861-EMCH a 60 °C, (B) SO1861-EMCH 11-3 equivalentes de APS a 60 °C, (C) SO1861-EMCH 11‘ 3 equivalentes de APSiTMEDA a 60 °C.
Figura 43: enfoque del ADN. Uso del principio de origami de ADN para generar una estructura de base basada en el ADN que es capaz de conjugar y liberar moléculas de glucósido. Además, una de las cadenas de ADN obtiene una porción de química clic que se puede usar para la conjugación con una toxina específica para formar una estructura de base funcionalizada pb: par de bases.
Figura 44: Enfoque de poli(péptido-S01861). Uso de una secuencia peptídica que puede conjugarse y liberar moléculas de glucósido y que puede reaccionar consigo misma para formar un constructo de poli(péptido-S01861). Los extremos de la cadena poli(peptídica) se pueden modificar adicionalmente con fracciones de química clic (por ejemplo, la porción conectora BCN-NHS) que se pueden usar para la conjugación con una toxina.
Figura 45. Espectros MALDI-T0F-MS de (A) péptido nativo, (B) conjugado de péptido-S01861.
Figura 46. Estructura molecular de dendrón G4 con grupos amino protegidos.
Figura 47. Esquema de síntesis para la generación de estructuras de base basadas en dendrones y estructuras de base funcionales.
Figura 48. (A) Esquema de reacción para el marcaje parcial con tinte y desprotección del dendrón G4. (B) Espectro MALDI-T0F-MS de dendrón G4 desprotegido y parcialmente marcado con tinte.
Figura 49. Espectros MALDI-T0F-MS de estructuras de base dendrón G4-S01861 con (A) 22 equivalentes de alimentación de S01861-EMCH, (B) 10 equivalentes de adición de S01861-EMCH y (C) 3 equivalentes de adición de S01861-EMCH.
Figura 50. Curvas de viabilidad celular de células HeLa tratadas con (A) expresión de superficie celular de EGFR según lo determinado por análisis FACS de células HeLa (B, consulte la tabla 19), viabilidad celular de células HeLa tratadas con S01861 diantina-EGF (Dia-EGF), S01861 diantina-EGF 500 nM cloroquina, S01861 diantina-EGF 500 nM PAMAM, S01861 diantina-EGF 667 nM dendrón (C) viabilidad celular de células HeLa tratadas con S01861 diantina-EGF, S01861 diantina-EGF 500 nM cloroquina, S01861 diantina-EGF 500 nM PAMAM, S01861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(SH)16, S01861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(SH)65, S01861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(SH)108 (D) viabilidad celular de células HeLa tratadas con SO1861 diantina-EGF, SO1861 diantina-EGF 500 nM cloroquina, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM, SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(mPEG)3 , SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(mPEG)s , SO1861 diantina-EGF 500 nM PAMAM-(mPEG)18.
Figura 51. (A) Esquema de reacción de la tiolación de PAMAM utilizando el reactivo de tiolación 2-iminotiolano. Espectros MALDI-TOF-MS de (B) PAMAM nativa, (C) PAMAM-(SH)16 tiolada, (D) PAMAM-(SH)65 tiolada y (E) PAMAM-(SH)108 tiolada.
Figura 52. (A) Esquema de reacción de la PEGilación de PAMAM usando el reactivo de PEGilación mPEG2k-NHS. Espectros MALDI-TOO-MS de (B) PAMAM nativa, (C) PAMAM-(mPEG2k)3 PEGilada, (D) PAMAM-(mPEG2k)8 PEGilada y (E) PAMAM-(mPEG2k)18 PEGilada.
Figura 53: Estructura de base básica con función de química clic para enlazar cualquier molécula efectora deseada. El usuario determina la posición de la química clic en la molécula efectora y todas las demás propiedades de la molécula efectora, por ejemplo la elección y posición de un ligando opcional.
Figura 54: Estructura de base funcionalizada con molécula efectora preunida y función química clic para enlazar cualquier ligando deseado. Opcionalmente, se puede proporcionar un enlace sensible al pH para liberar la molécula efectora de la estructura de base después de alcanzar los endosomas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0106] Para que una molécula bioactiva funcione, la molécula debe poder interactuar con su diana, por ejemplo, en el suero sanguíneo, en el exterior de la superficie celular o en el interior de una célula o de un orgánulo. La porción activa de casi todas las toxinas dirigidas basadas en proteínas, por ejemplo, debe entrar en el citosol de la célula diana para mediar su efecto modulador de la diana. En muchas constelaciones, la toxina sigue siendo ineficaz, ya que (1) la porción direccionamiento se internaliza de manera deficiente y permanece adherida al exterior de las células, (2) se recicla de nuevo en la superficie celular después de la internalización o (3) se transporta a los endolisosomas, donde se degrada. Aunque estos problemas fundamentales se conocen desde hace décadas y se han investigado más de 500 toxinas específicas en las últimas décadas, los problemas aún no se han resuelto y solo se han admitido en el mercado un par de toxinas proteicas dirigidas a anticuerpos, aunque con etiquetas de advertencia por toxicidad grave. Moxetumomab pasudotox-tdfk (LUMOXITI® , AstraZeneca Pharmaceuticals LP), ha sido aprobado por la FDA hasta la fecha para la leucemia de células pilosas en recaída o refractaria. Otros ADC aprobados son Elzonris, Ontak.
[0107] Para superar estos problemas, se han descrito muchas estrategias que incluyen enfoques para redirigir las toxinas a complejos de transporte de membrana celular endógenos de la vía biosintética en el retículo endoplásmico y técnicas para alterar o debilitar la integridad de la membrana de los endosomas, es decir, los compartimentos de la vía endocítica de una célula, y facilitar así el escape endosomal. Esto comprende el uso de aminas lisosomotrópicas, ionóforos carboxílicos, antagonistas de los canales de calcio, varios péptidos de penetración celular de origen viral, bacteriano, vegetal, animal, humano y sintético, otras moléculas orgánicas y técnicas inducidas por la luz. Aunque la eficacia de las toxinas específicas se incrementó típicamente en cultivos celulares cien o mil veces, en casos excepcionales más de un millón de veces, el requisito de coadministrar potenciadores del escape endosomal con otras sustancias presenta nuevos problemas que incluyen efectos secundarios adicionales, pérdida de la especificidad por la diana, dificultades para determinar la ventana terapéutica y variaciones dependientes del tipo celular.
[0108] Todas las estrategias, incluidas las técnicas fisicoquímicas, requieren moléculas potenciadoras que interactúen de manera más o menos directa con las membranas y comprendan esencialmente moléculas químicas pequeñas, metabolitos secundarios, péptidos y proteínas. Una característica común de todas estas sustancias es que de por sí no tienen especificidad por la célula diana y se distribuyen con una cinética diferente a la de las toxinas dirigidas. Este es uno de los principales inconvenientes de los enfoques actuales.
[0109] La presente invención se describirá con respecto a formas de realización particulares, pero la invención no se limita a ellas sino únicamente a las reivindicaciones. Las formas de realización de la invención descritas en este documento pueden emplearse en combinación y cooperación, a menos que se especifique lo contrario.
[0110] Si bien la invención se ha descrito en términos de varias formas de realización, se contempla que las alternativas, modificaciones, permutaciones y equivalentes de la misma resultarán evidentes para un experto en la materia al leer la especificación y al estudiar los dibujos y gráficos. La invención no se limita de ningún modo a las formas de realización ilustradas. Se pueden realizar cambios sin apartarse del alcance definido por las reivindicaciones adjuntas.
[0111] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado que comprende una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y al menos una porción efectora y que comprende además al menos una saponina unida de manera covalente.
[0112] Los inventores han establecido que la ventana terapéutica de un conjugado, como un conjugado de anticuerpo y fármaco o un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido, aumenta cuando se administra a un mamífero que tiene tumores (ratón) al que se le administra el conjugado, donde dicho conjugado comprende al menos una saponina unida de manera covalente. El conjugado de la invención tiene al menos un glucósido tal como una saponina unido al mismo, preferiblemente de forma covalente, más preferiblemente a través de una porción conectora escindible. La saponina aumenta la eficacia terapéutica de la porción efectora unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, probablemente al mejorar el escape endosomal de la porción efectora al citosol donde se desea la actividad de la porción efectora. De esta manera, ya a una dosis más baja que la dosis convencional del ADC o del AOC, es decir, el conjugado de la invención, el efecto terapéutico se establece bajo la influencia de la presencia del conjugado que comprende la(s) saponina(s), llevando así la(s) saponina(s) cerca, a y/o dentro de la célula seleccionada. La célula diana es, por ejemplo, una célula enferma como una célula tumoral o una célula autoinmune o un linfocito B relacionado con una enfermedad de los linfocitos B, etc. La porción efectora es, por ejemplo, una toxina como parte de un ADC o un oligonucleótido como como un BNA antisentido como parte de un AOC según la invención.
[0113] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina es una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo aldehído en la posición C-23 y que comprende un grupoácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina.
[0114] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina es una saponina específica única o es una mezcla de dos o más saponinas diferentes.
[0115] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una saponina tiene una masa molecular de 3000 Dalton o menos, preferiblemente 2500 Dalton o menos, más preferiblemente 2300 Dalton o menos, de la manera más preferible 2000 Dalton o menos, tal como 1500 Dalton - 1900 Dalton.
[0116] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina es una o más de las saponinas de la Tabla A1 o el Esquema I, SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, Quillajasaponin, Saponinum album, QS-18, Quil-A, Gyp1, gypsoside A, AG1, AG2, SO1542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, o cualquiera de sus estereómeros y/o cualquier combinación de las mismas, preferiblemente la saponina es SO1861 y/o GE1741 y/o SA1641 y/o QS-21 y/o saponina con un núcleo de aglicona de ácido quillaico, un sustituyente carbohidrato Gal-(1^2)-[Xyl-(1^-3)]-GlcA en el grupo C-3beta-OH y un sustituyente carbohidrato Glc-(1^3)-Xyl-(1^4)-Rha-(1^2)-[Xyl-(1^3)-4-oAc-Qui-(1^4)]-Fuc en el grupo C-28-OH, y/o es ácido 3-O-beta-D-galactopiranosil-(1^2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^-3)]-beta-D-glucuronopiranosil quillaico 28-O-beta-D-glucopiranosil-(1^3)-beta-D-xilopiranosil-(1^4)- alfa-L-ramnopiranosil-(1^-2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^-3)-4-OAc-beta-D-quinovopiranosil-(1^4)]-beta-D-fucopiranósido, más preferiblemente la al menos una saponina es SO1861 y/o QS-21.
[0117] Los inventores describen en este documento que la unión covalente de saponinas tales como saponinas en la porción soluble en agua de Quillaja saponaria, QS-21, SA1641, SO1861, Tabla A1, Esquema I, a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular tal como una molécula proteica, tal como a través de una porción conectora trifuncional, por ejemplo, la porción conectora trifuncional del Esquema II, o a través de una estructura oligomérica o polimérica de una estructura de base que comprende saponinas unidas de manera covalente, da como resultado una toxicidad celular mejorada ejercida por la porción efectora tal como una toxina, comprendida por el conjugado, bajo la influencia de la saponina unida de manera covalente en el conjugado.
[0118] Una forma de realización es el conjugado de la invención que comprende una saponina que comprende una o varias o todas las características estructurales indicadas de la saponina de Estructura A del Esquema I, la saponina de estructura A denominada saponina con una estructura "ideal" cuando el escape endosomal potencia la actividad hacia una porción efectora presente en el endosoma de una célula en contacto con el conjugado de la invención, y/o una saponina seleccionada de cualquiera o más de las saponinas adicionales del Esquema I:
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ESQUEMA I (continuación)
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ESQUEMA I (continuación)
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ESQUEMA I (continuación)
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ESQUEMA I (continuación)
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[0119] Según la invención, un glucósido, tal como una saponina según la invención, unido a la molécula de direccionamiento hacia una molécula de la superficie celular comprendida por el conjugado de la invención, que tiene la estructura "ideal" con el fin de mejorar el escape endosomal de una molécula efectora que comprende el conjugado de la invención, es una saponina bisdesmosídica según la Estructura A del Esquema I, que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehido en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral carbohidrato ramificada en la posición C-3, donde dicha primera cadena lateral carbohidrato ramificada contiene opcionalmente ácido glucurónico, donde la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral carbohidrato ramificada en la posición C-28 donde dicha segunda cadena de carbohidratos ramificada comprende preferiblemente al menos cuatro unidades de carbohidrato, que contiene opcionalmente al menos un resto acetilo tal como dos restos acetilo y/o que comprende opcionalmente desoxicarbohidratos y/o que comprende opcionalmente quinovosa y/o que comprende opcionalmente glucosa y/o que comprende opcionalmente ácido 4-metoxicinámico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/u opcionalmente que comprende ácido 5-O-[5-O-Rha-(1^-2)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico unido a un carbohidrato a través de un enlace éster.
[0120] SO1861 difiere de la "estructura ideal” que se muestra en el Esquema I, Estructura A, solo en que tiene un único residuo de acetilo en la quinovosa y tiene una xilosa adicional. La "estructura ideal" de una saponina para mejorar el escape endosomal de una molécula efectora o una porción efectora es una saponina que tiene preferiblemente la Estructura A del Esquema I, y las saponinas que tienen la actividad potenciadora del escape endosomal tienen una o más de las características estructurales que se muestran en la Estructura A del Esquema I. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, los inventores creen que la Estructura A del esquema I representa una "saponina ideal" (y no una saponina que cumple el requisito mínimo) para la actividad potenciadora del escape endosomal, lo que significa que no todas las estructuras (grupos químicos) pueden o deben estar presentes en cada saponina con al menos suficiente actividad potenciadora del escape endosomal para potenciar la acumulación de la porción efectora en el citosol, y lo que significa que algunas saponinas pueden tener otros elementos estructurales, como cadenas de acilo, y/o para otras saponinas que muestran actividad potenciadora del escape endosomal, los azúcares pueden ser diferentes de los azúcares mostrados en el Esquema I. Por ejemplo, la saponina QS-21 y algunas de las saponinas de la porción soluble en agua de Quillaja saponaria (saponinas de Quillaja; Quil-A) difieren en la modificación de carbohidratos en C-28 cuando se tiene en cuenta la estructura ideal de la Estructura A en el Esquema I: por ejemplo, la presencia de una cadena de acilo en QS-21. En la porción soluble en agua de Quillaja saponaria, las saponinas como QS-7, QS1862 son similares a la Estructura A ideal y son similares a SO1861.
[0121] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una saponina es una saponina bisdesmosídica que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehído en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral carbohidrato ramificada en la posición C-3, donde dicha primera cadena lateral carbohidrato ramificada contiene opcionalmente ácido glucurónico, donde la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral carbohidrato ramificada en la posición C-28, donde dicha segunda cadena de carbohidratos ramificada comprende preferiblemente al menos cuatro unidades carbohidrato, que opcionalmente contiene al menos un resto acetilo tal como dos restos acetilo y/o opcionalmente comprende desoxi-carbohidratos y/o opcionalmente comprende quinovosa y/o opcionalmente comprende glucosa y/o opcionalmente comprende ácido 4-metoxicinámico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-0-[5-0-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/o que comprende opcionalmente ácido 5-0-[5-0-Rha-(1^-2)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico unido a un carbohidrato a través de un enlace éster, o donde al menos una saponina es QS-21 o cualquiera o más de QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS-18, QS1861, QS1861 protonada (QS1862), Quil-A.
[0122] En la Tabla A1 y el Esquema I y las formas de realización anteriores se resumen una serie de saponinas que se han identificado por su actividad potenciadora del escape endosomal cuando se ponen en contacto con células de mamífero, en particular células tumorales humanas, en forma libre junto con una segunda molécula (por ejemplo, una porción efectora o molécula efectora, como una toxina, un oligonucleótido). También se hace referencia a las saponinas con dicha actividad potenciadora del escape endosomal enumeradas en las Tablas 9 y 10 de Boettger (2013). [Stefan Bottger, Untersuchungen zur synergistischen Zytotoxizitat zwischen Saponinen und Ribosomen inaktivierenden Proteinen Typ I, Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.), eingereicht im Fachbereich Biologie, Chemie, Pharmazie der Freien Universitat Berlin, Tabla 9, Tabla 10, pp. 67-74]. De hecho, en bioensayos basados en células que utilizan células tumorales humanas se estableció para las saponinas recogidas en la Tabla A1 y las del Esquema I y en las diversas formas de realización de la invención descritas en el presente documento que, bajo la influencia de estas saponinas, cuando forman parte del conjugado de la invención, la porción efectora, como un ácido nucleico y/o una toxina, como una toxina proteica (por ejemplo, una o más de las toxinas proteicas enumeradas en la Tabla A5), compuesta por el conjugado, se administra en el citosol con mayor eficiencia y /o eficacia, presumiblemente a través de la liberación intracelular de los endosomas y lisosomas (tardíos). Es decir, el escape endosomal y/o lisosomal de dichas fracciones efectoras unidas por el conjugado de la invención, por ejemplo, ácidos nucleicos y/o toxinas, es menos eficaz en ausencia de la saponina.
[0123] Sorprendentemente, los inventores ahora demuestran que una porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria, que comprende QS-21 y los miembros de su familia QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, QS-18 y Quil-A, también posee la capacidad de potenciar un efecto biológico in vitro de, por ejemplo, un ácido nucleico unido a un anticuerpo monoclonal o una toxina proteica unida a un anticuerpo monoclonal (ejemplos de conjugados de la invención que comprenden un oligonucleótido unido de manera covalente o una carga útil tal como una toxina (proteica), cuando se administra a células tumorales de una especie de mamífero (humano) en forma de un conjugado covalente que comprende un anticuerpo monoclonal (molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención), junto con una porción efectora unida y el al menos un glucósido como QS-21 y las saponinas de su familia incluidas en dicha preparación de QS-21 (por ejemplo, porción soluble en agua de Quillaja saponaria), compuesta por un conjugado como un conjugado covalente, donde la molécula efectora y el glucósido, por ejemplo, la porción de saponina de Quillaja saponaria, QS-21, S01861, SA1641, GE1741, se unen de manera covalente, por ejemplo, a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular directamente o mediante una porción conectora o mediante una estructura de base polimérica u oligomérica, ya sea directamente o mediante al menos una porción conectora. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, la estimulación o potenciación observada de, por ejemplo, la reducción mediada por BNA antisentido de la expresión de HSP27 en células tumorales (silenciamiento del gen HSP27) en presencia de saponinas derivadas de Quillaja saponaria in vitro (también) puede relacionarse con la activación del inflamasoma en la célula tumoral por las saponinas, por ejemplo, dando como resultado la piroptosis de la célula tumoral. Los inventores establecieron que las moléculas dirigidas a una molécula de la superficie celular de la invención conjugadas, por ejemplo, con BNA antisentido o diantina o saporina, ejercieron actividad celular antitumoral in vitro o mejoraron la actividad celular antitumoral cuando se pusieron en contacto con células en bioensayos basados en células, cuando el conjugado comprende una saponina, de tal modo que la(s) saponina(s) está(n) dirigida(s) a las mismas células (tumorales), mientras que, en ausencia de la(s) saponina(s), es decir, con un formato de ADC convencional sin saponina(s) unida(s), no se observó tal actividad hacia la célula tumoral. La presencia de saponina unida de manera covalente en el conjugado de la invención demostró ser esencial para el ejercicio eficaz de la actividad de la porción efectora en el conjugado.
[0124] QS-21, y también la porción de saponinas solubles en agua que comprende QS-21 de Quillaja saponaria, ya se conoce desde hace mucho tiempo y antes se aplicaba por sus capacidades inmunopotenciadoras, por ejemplo, como adyuvante en, por ejemplo, vacunas de subunidades. Por ejemplo, QS-21 se aplica en dos ensayos clínicos de fase III con pacientes humanos, a los que se vacunó con una vacuna de subunidades mezclada con un adyuvante que comprende QS-21 (Glaxo-Smith-Kline, ensayo MAGRIT, estudio DERMA), donde la subunidad era la proteína MAGE-A3, que las células tumorales expresan y presentan específicamente. Las vacunas antitumorales, potenciadas con QS-21, tenían como objetivo la prolongación de la supervivencia sin enfermedad de los pacientes con cáncer (melanoma; cáncer de pulmón de células no pequeñas). Además, QS-21 ha sido probada como adyuvante en ensayos clínicos para el desarrollo de tratamientos de vacunas contra el cáncer, para vacunas contra la infección por VIH-1, en el desarrollo de una vacuna contra la hepatitis B y para el desarrollo de vacunas contra la malaria usando QS-21 que comprende los adyuvantes AS01 y AS02 de Glaxo-Smith-Kline. Estudios previos revelaron una respuesta inmune provocada contra los péptidos MAGE-A3 presentados en la superficie de la célula cancerosa, bajo la influencia del adyuvante que comprende saponina QS-21 (AS15; GSK). Para sorpresa de los inventores, la porción de saponina de Quillaja saponaria, y, por lo tanto, probablemente QS-21 (como parte de la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria) potencia la actividad celular antitumoral de, por ejemplo, una carga útil tal como una toxina proteica (diantina), unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular (por ejemplo, el ligando EGF) en el conjugado de la invención (por ejemplo, el ligando EGF).
[0125] Al actuar sobre una sola molécula de la superficie celular con el conjugado de la invención, se mejora la administración de la saponina y la porción efectora unidas a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular en el conjugado de la invención, a y dentro del citosol de la célula diana, exponiendo la molécula de la superficie celular en la superficie celular, y es más específica, en comparación con, por ejemplo, poner en contacto la célula con solo un ADC regular que carece de la saponina de la invención, por lo tanto, sin la presencia de la saponina dirigida a la célula (conjugado de la invención). Una célula aberrante seleccionada para dirigir hacia ella la molécula dirigida hacia una molécula de la superficie celular del conjugado idealmente lleva el epítopo en la molécula de la superficie celular a la que se puede unir la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, en un alto grado (es decir, una expresión relativamente mayor de la molécula de la superficie celular sobre la que se desea actuar de la célula diana como, por ejemplo, una célula tumoral o una célula autoinmune, que la expresión en una célula no diana como, por ejemplo, una célula sana) y/o presenta el epítopo en la molécula de la superficie celular sobre la que se desea actuar para la unión de la molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular, específicamente, cuando se tienen en cuenta las células sanas (adyacentes) de un paciente. Preferiblemente, la molécula de la superficie celular sobre la que actúa la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención se expresa de manera relativamente alta y/o específicamente en la célula diana (enferma, tumoral) en comparación con las células sanas. Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la molécula de la superficie celular sobre la que actúa la molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular, como un receptor de la célula tumoral, se expresa específicamente o en un grado relativamente mayor en comparación con la expresión de la molécula de la superficie celular en la superficie de una célula sana (adyacente). Por lo tanto, el epítopo de la molécula de la superficie celular sobre la que se desea actuar es idealmente único para las células enfermas sobre las que se desea actuar (diana), y al menos está específicamente presente y expuesto en la superficie de las células diana. La unión del conjugado de la invención al epítopo de la molécula de la superficie celular en una célula diana va seguida de endocitosis del complejo del conjugado y de la molécula de la superficie celular diana. Dado que el conjugado solo puede entrar en la célula diana a través de la interacción de unión con moléculas de la superficie celular expresadas específicamente en una medida suficiente o expresadas de manera única en la célula diana en comparación con las células sanas sobre las que no se debería actuar, la acumulación de una cantidad terapéuticamente activa de la porción efectora y la saponina comprendidas por el conjugado, dentro de las células diana, solo es posible y ocurre si los niveles de expresión de la molécula de la superficie celular diana están por encima de un cierto umbral mínimo de expresión. Al mismo tiempo, el hecho de que la porción efectora unida a molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular solo sea capaz de ejercer su actividad intracelular (por ejemplo, citotóxica o silenciamiento génico) en presencia del mismo conjugado que lleva la saponina unida de manera covalente también proporciona una protección contra los efectos secundarios negativos e indeseados de la porción efectora hacia, por ejemplo, las células sanas y el tejido que no están destinados a ser la diana y a verse afectados por la porción efectora, en comparación con la exposición de las células a un ADC sin la(s) saponina(s) unida(s) de manera covalente. Es decir, una expresión suficientemente baja o incluso la ausencia de una molécula expuesta en la superficie celular, a la que podría unirse un conjugado, idealmente no permite la entrada del conjugado en células sanas (no diana) en cantidades que puedan dar lugar a un escape endosomal de la porción efectora bajo la influencia de la saponina comprendida por el conjugado. Dado que el ADC con saponina unida o el AOC con saponina unida de manera covalente según la invención se pueden usar a dosis más bajas en comparación con la aplicación del ADC o AOC sin saponina unida en el régimen terapéutico, la entrada de ADC con saponina unida o la entrada de AOC con saponina unida en células sanas en baja medida ya conlleva un menor riesgo de aparición de efectos secundarios no deseados cuando, por ejemplo, se considera la selección y eliminación de células enfermas diana, como células tumorales y células autoinmunes.
[0126] Según la invención, la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprende o consiste en una inmunoglobulina, al menos un dominio de unión de una inmunoglobulina y/o al menos un fragmento de unión de una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, una IgG, una molécula que comprende o consiste en un dominio Vhh o un dominio Vh, un fragmento Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab que puede unirse a la molécula de la superficie celular.
[0127] Los inventores han establecido que dichas inmunoglobulinas, dominios de las mismas, etc., son particularmente adecuadas para su aplicación como la molécula dirigida a la molécula de la superficie celular del conjugado que comprende el sitio de unión para unirse a la molécula de la superficie celular diana. Por ejemplo, los anticuerpos y los dominios de unión de los anticuerpos son adecuados para dirigirse a un epítopo en una molécula de la superficie celular seleccionada expuesta en la superficie celular, lo que da como resultado que el conjugado y, por lo tanto, la porción efectora y la saponina se dirijan juntas a las células diana que expresan la molécula de la superficie celular sobre la que se desea que actúe la molécula del conjugado dirigida a la molécula de la superficie celular diana. De manera similar, los ligandos, tales como EGF, que se dirigen al EGFR de las células diana son adecuados para su aplicación como molécula del conjugado que se dirige a una molécula de la superficie celular. Se prefieren moléculas dirigidas a una molécula de la superficie celular para unirse a un epítopo en una molécula de la superficie celular diana, que son específicas para la unión del conjugado a la molécula de la superficie celular. Las moléculas dirigidas a una molécula de la superficie celular de la invención basadas en anticuerpos o dominios o fragmentos de unión de las mismas, por ejemplo, proporcionan la especificidad deseada para un epítopo seleccionado en una molécula seleccionada de la superficie celular de una célula seleccionada para actuar sobre ella, como una célula enferma, una célula tumoral, una célula autoinmune, etc. Por lo tanto, para los conjugados de la invención se prefieren moléculas dirigidas a una molécula de la superficie celular basadas en anticuerpos o moléculas de unión (fragmentos, dominios), tales como anticuerpos monoclonales (humanos, humanizados, quiméricos).
[0128] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular puede unirse a una molécula de la superficie de la célula tumoral, preferiblemente un receptor de la célula tumoral tal como un receptor específico de las células tumorales, más preferiblemente un receptor seleccionado de entre CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, eGf -IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6 , HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente seleccionado de entre CD71, HER2 y EGFR. Estos receptores son ejemplos preferidos de moléculas que portan epítopos a los que se puede unir la molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención, donde dichas moléculas son suficientemente específicas o incluso se expresan de forma única en la superficie de las células diana seleccionadas para la unión del conjugado, de manera que el conjugado se une de forma única y/o específica, o al menos de manera preferente y al menos en mayor medida a dichas células diana en comparación con la unión del conjugado a células que expresan y presentan el receptor en menor medida o que no presentan el receptor en la superficie celular. Las células diana son, por ejemplo, células aberrantes, células tumorales, células malignas, células enfermas, linfocitos B involucrados en el cáncer, células autoinmunes, etc.
[0129] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el receptor de la célula tumoral es internalizado por la célula tumoral después de unirse a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención o donde el receptor de la célula tumoral es internalizado por la célula tumoral después de unirse al conjugado de la invención, y donde preferiblemente la unión de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y la unión del conjugado al receptor de la célula tumoral va seguida de una internalización mediada por el receptor de la célula tumoral, por ejemplo, mediante endocitosis, de un complejo del conjugado y el receptor de la célula tumoral.
[0130] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el receptor de la célula tumoral es internalizado por la célula tumoral tras la unión y/o la internalización es inducida por la unión a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de la invención, o donde el receptor de la célula tumoral es internalizado por la célula tumoral después de unirse al conjugado de la invención, o internalizado con y/o debido a la unión del conjugado al receptor de la célula tumoral, y donde preferiblemente la unión de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y la unión del conjugado con el receptor de la célula tumoral induce y/o da como resultado la internalización mediada por el receptor de la célula tumoral, por ejemplo, vía endocitosis, de un complejo del conjugado y el receptor de la célula tumoral.
[0131] La sincronización es la pieza que falta entre una estrategia de administración exitosa para ratones y su aplicación en humanos. De hecho, los inventores establecieron en una serie de modelos de tumores de ratón in vivo que la administración por separado a los ratones de una dosis de saponina libre y una dosis de, por ejemplo, el ADC sin saponina unida no dio como resultado ninguna actividad antitumoral deseada, como retraso en el crecimiento del tumor, regresión del tumor, crecimiento tumoral disminuido y más lento, en comparación con los animales de control no tratados con el ADC en presencia de saponina libre. La saponina libre se administró usando varias vías de administración y usando varios puntos de tiempo de administración de la saponina libre en comparación con el momento de administración del ADC (administración de saponina libre antes, durante y después de administrar el ADC). El ADC probado en modelos tumorales in vivo fue cetuximab-diantina (con SO1861 libre) o trastuzumab-saporina (con SO1861 libre). La variación de la dosis de saponina libre no proporcionó una actividad antitumoral eficaz. Los ADC a los que se hace referencia se administraron a una dosis que por sí misma no tuvo ningún efecto antitumoral beneficioso en los animales con tumores. Sorprendentemente, los inventores ahora han establecido que puede lograrse una actividad antitumoral beneficiosa en varios bioensayos basados en células de mamíferos in vitro usando células tumorales humanas y/o en varios modelos de tumores animales in vivo tratando las células o animales con conjugados según la invención. Los conjugados comprenden opcionalmente una estructura de base según la invención (véase más abajo). La estructura de base, por ejemplo, es una porción conectora trifuncional con una saponina unida de manera covalente (por ejemplo, SO1861, QS-21) a través de un enlace escindible o no escindible, y/o con una porción efectora unida de manera covalente (por ejemplo, diantina, BNA antisentido silenciador de genes (HSP27) a través de un enlace no escindible o un enlace escindible, la estructura de base unida con un enlace covalente a la molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular, como un anticuerpo monoclonal como cetuximab, trastuzumab, OKT-9, o donde la estructura de base es un dendrón, como un dendrón, por ejemplo dendrón G4, al que, por ejemplo, se pueden unir cuatro porciones, como cuatro moléculas de saponina, o un dendrón para unir, por ejemplo, dos saponinas y dos moléculas efectoras, comprendiendo el dendrón un grupo químico para la unión (covalente) a la molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular, como un ligando o un anticuerpo o fragmento o dominio de esta. Se hace referencia a las formas de realización adicionales y a la sección de Ejemplos, donde se ejemplifican varias de estas estructuras de base según la invención, que muestran actividad celular antitumoral in vivo y/o in vitro cuando se tiene en cuenta la toxicidad celular ejercida por, por ejemplo, una toxina proteica o cuando se considera el silenciamiento génico en la célula tumoral.
[0132] Sin querer ceñirse a ninguna teoría, en vista de los fracasos observados cuando se considera el tratamiento de animales con tumores con un ADC junto con saponina libre, se prefiere sincronizar la presencia de ambos elementos, la al menos una saponina, y la porción efectora, preferiblemente una toxina o un oligonucleótido, en compartimentos o vesículas de la vía endocítica de la célula diana, por ejemplo, una célula tumoral o una célula autoinmune. Con ADC y saponina libre no se pudo obtener de forma beneficiosa una sincronización de la presencia de las moléculas en los endosomas tardíos para obtener los efectos sinérgicos in vivo según los intentos de los inventores. En un aspecto, la invención resuelve preferiblemente al menos el siguiente problema con respecto a la combinación de la porción efectora y la(s) saponina(s) en una sola molécula conjugada: sin desear ceñirse a ninguna teoría, el único grupo químico razonable dentro de, por ejemplo, las saponinas que se pueden usar para una unión (covalente), en particular, retenible simple y escindible, es necesario para la actividad de escape endosomal. Las restricciones conocidas son probablemente la razón por la que las saponinas no se han utilizado en combinación con sustancias farmacéuticamente activas en investigaciones clínicas distintas de la aplicación de saponinas en los regímenes de vacunación en los que estaba implícito el uso de una sustancia adyuvante inmunopotenciadora, aunque el sorprendente efecto potenciador del escape endosomal de, por ejemplo las saponinas enumeradas en la Tabla A1 y el Esquema I se conoce desde hace más de 10 años. Por ejemplo, proporcionar un conjugado de la invención con una saponina unida de manera covalente, por ejemplo, en el contexto de una estructura de base que lleva varias saponinas resuelve estas dificultades, al menos en parte. Sorprendentemente, las saponinas previamente aplicadas por su actividad inmunopotenciadora en el contexto de la vacunación que involucra saponinas como componente adyuvante ahora también son adecuadas para la unión (covalente) a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular que comprende el conjugado de la invención, para una actividad antitumoral in vitro e in vivo.
[0133] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular es o comprende un anticuerpo monoclonal o al menos un fragmento de unión a la molécula de la superficie celular o un dominio del mismo, y preferiblemente comprende o consiste en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, OKT-9 anticuerpo monoclonal anti-CD71 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, OKT-10 anticuerpo monoclonal anti-CD38 , un anticuerpo de la Tabla A2 o la Tabla A3 o la Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento o dominio de unión a la molécula de la superficie celular de estos.
[0134] Como se ha mencionado, al actuar sobre la molécula de la superficie celular con la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, se mejora y es más específica la administración de la saponina y la porción efectora a y dentro del citosol de la misma célula diana. Una célula aberrante seleccionada para dirigir hacia ella molécula del conjugado dirigida a una molécula de la superficie celular lleva idealmente la molécula de la superficie celular en gran medida y/o específicamente, cuando se consideran células sanas (adyacentes) de un paciente. Por lo tanto, el epítopo de la molécula de la superficie celular diana es idealmente único para las células enfermas diana, y está al menos específicamente presente y expuesto en la superficie de las células diana. A la unión del conjugado le sigue la endocitosis de los complejos del conjugado y la molécula de la superficie celular diana.
[0135] En las Tablas A2, A3 y A4 se enumeran ejemplos preferidos de la molécula de la superficie celular que comprende el epítopo para la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención. Cuando la molécula de la superficie celular se expresa específicamente en la célula diana, preferiblemente la unión del conjugado a la molécula de la superficie celular da como resultado el direccionamiento específico del conjugado a la célula diana deseada, como una célula tumoral que presenta la molécula de la superficie de la célula tumoral, mientras que otras células, como las células sanas, que no expresan la molécula de la superficie celular o expresan la molécula de la superficie celular en menor medida, en comparación con la expresión de la(s) molécula(s) de la superficie celular en la célula diana (aberrante), no reciben la acción del conjugado o solo lo hacen en menor medida.
[0136] Una sustancia farmacéuticamente activa en esta invención es una porción efectora que se usa para lograr un resultado beneficioso en un organismo, preferiblemente un vertebrado, más preferiblemente un ser humano, tal como un paciente con cáncer o un paciente autoinmune. El beneficio incluye el diagnóstico, pronóstico, tratamiento, cura y/o prevención de enfermedades y/o síntomas. La sustancia farmacéuticamente activa también puede provocar efectos secundarios nocivos no deseados. En este caso, se deben sopesar los pros y los contras para decidir si la sustancia farmacéuticamente activa es adecuada para cada caso particular. Si el efecto de la sustancia farmacéuticamente activa dentro de una célula es predominantemente beneficioso para todo el organismo, la célula se denomina célula diana. Si el efecto dentro de una célula es predominantemente dañino para todo el organismo, la célula se denomina célula no diana. En sistemas artificiales como cultivos celulares y biorreactores, las células diana y las células no diana dependen del propósito y las define el usuario.
[0137] Una porción efectora que es un polipéptido puede ser, por ejemplo, un polipéptido que recupera una función perdida, como por ejemplo reemplazo enzimático, funciones de regulación de genes o una toxina.
[0138] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una porción efectora comprende o consiste en uno o más de un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico, preferiblemente seleccionado de uno o más de un vector, un gen, un transgén que induce el suicidio celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótido antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de Ar N, ARNm, ADN minicircular, ácido peptidonucleico (APN), oligómero de morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido nucleico 2'-desoxi-2'-fluoroarabino (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente 2'-O,4'-aminoetileno, ácido nucleico 3'-fluorohexitol (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treosa-nucleico (ATN), o un derivado de estos, más preferiblemente un BNA, por ejemplo un BNA para silenciar la expresión de la proteína HSP27.
[0139] Los inventores muestran que un anticuerpo monoclonal dirigido a células tumorales provisto de BNA antisentido unido de manera covalente tal como BNA (HSP27) y provisto de la saponina unida de manera covalente de la invención, que se pone en contacto con células tumorales, tanto el BNA como la saponina unidos al anticuerpo (por ejemplo, cetuximab) a través de un enlace escindible, es capaz de silenciar HSP27 in vivo en tumores, en comparación con el control y en comparación con el AOC que contiene solo BNA y no saponina (S01861, Quil-A). La administración de un conjugado de ADC-saponina de la invención o un conjugado de anticuerpo-oligonucleótido-conjugado de saponina de la invención (A0C-saponina), tal como un conjugado de anticuerpo-BNA-saponina, dota así a la ADC-saponina o A0C-saponina de actividad anti células tumorales que no se observa solo con el ADC o solo con el a 0c , que no tienen las saponinas unidas de manera covalente al anticuerpo monoclonal, a la misma dosis. Cabe destacar que el A0C y el anticuerpo monoclonal separado con saponina unida de manera covalente como una combinación de dos conjugados separados aumentan la expresión de HSP27 en células tumorales, cuando se administran a ratones con tumores por separado en grupos separados de ratones, en comparación con un grupo de control (administrado con vehículo, solo). Solo la administración del conjugado A0C-saponina de la invención que comprende la porción efectora de la invención muestra una expresión reducida de HSP27 en comparación con los controles. El BNA antisentido (HSP27) era BNA con la secuencia de oligonucleótidos 5'-GGCacagccagtgGCG-3' según Zhang et al. (2011) [Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger e ID Horak, Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333]. Cabe mencionar que, hasta donde saben inventores, el BNA está diseñado para su aplicación como un ácido nucleico libre. Los inventores son ahora los primeros en demostrar que el BNA antisentido se puede unir de manera covalente a través de una porción conectora (no) escindible con un ligando o un anticuerpo, de manera que la actividad de silenciamiento génico se mantiene in vitro y, lo que es más importante, in vivo en las células tumorales de un animal con tumores. Este enfoque de proporcionar A0C basados en BNA abre camino a nuevas formas de administrar BNA dirigido a pacientes humanos (con cáncer) que lo necesiten.
[0140] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una porción efectora comprende o consiste en al menos una molécula proteica, preferiblemente seleccionada de entre uno o más de un péptido, una proteína, una enzima tal como ureasa y recombinasa Cre, una proteína que inactiva los ribosomas, una toxina proteica seleccionada de la Tabla A5 y más preferiblemente seleccionada de entre una o más de una toxina viral tal como apoptina; una toxina bacteriana tal como toxina Shiga, toxina similar a Shiga, exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE) o exotoxina A de PE, toxina diftérica (DT) completa o truncada, toxina del cólera; una toxina fúngica como la alfa-sarcina; una toxina vegetal que incluye proteínas que inactivan los ribosomas y la cadena A de proteínas que inactivan los ribosomas de tipo 2, como diantina, por ejemplo, diantina-30 o diantina-32, saporina, por ejemplo, saporina-S3 o saporina-S6, bouganina o derivado desinmunizado debouganina de bouganina, toxina A similar a shiga, proteína antiviral de hierba carmín, ricina, cadena A de ricina, modecina, cadena A de modecina, abrina, cadena A de abrina, volkensina, cadena A de volkensina, viscumina, cadena A de viscumina; o una toxina animal o humana tal como RNasa de rana, o granzima B o angiogenina humana, o cualquier fragmento o derivado; preferiblemente, la toxina proteica es diantina y/o saporina.
[0141] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una porción efectora comprende o consiste en al menos una carga útil, preferiblemente seleccionada de entre cualquiera o más de una toxina dirigida a ribosomas, una toxina dirigida a factores de elongación, una toxina dirigida a tubulina, una toxina dirigida a ADN y una toxina dirigida a ARN, más preferiblemente cualquiera o más de emtansina, pasudotox, derivado maitansinoide DM1, derivado maitansinoide DM4, monometil auristatina E (MMAE, vedotina), monometil auristatina F (MMAF, mafodotina), una caliqueamicina, N-Acetil-Y-caliqueamicina, un dímero de pirrolobenzodiazepina (PBD), una benzodiazepina, un análogo de CC-1065, una duocarmicina, doxorrubicina, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, ciclofosfamida, etopósido, docetaxel, 5-fluorouracilo (5-FU), mitoxantrona, una tubulisina, una indolinobenzodiazepina, AZ13599185, una criptoficina, rizoxina, metotrexato, una antraciclina, un análogo de la camptotecina, SN-38, DX-8951f, exatecán mesilato, forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa (PE38), un derivado de la duocarmicina, una amanitina, a-amanitina, una spliceostatina, una tailanstatina, ozogamicina, tesirina, Amberstatin269 y soravtansina, o un derivado estas.
[0142] Una porción efectora útil en la presente invención se basa preferiblemente en el escape endosomal tardío para ejercer su efecto. Algunos efectores, tales como, por ejemplo, una exotoxina de pseudomonas, se redireccionan a otros orgánulos antes de la “fase endosomal tardía" y, por tanto, normalmente no se beneficiarían de la unión a la segunda molécula proteica según la presente invención. Sin embargo, tal toxina puede adaptarse para su uso con la presente invención, por ejemplo, eliminando el péptido señal responsable del redireccionamiento. En particular, las toxinas que son altamente tóxicas y en las que solo haría falta que una molécula escapase de los endosomas para matar una célula pueden modificarse para que sean menos potentes. Se prefiere usar una toxina que mata una célula si al menos 2, más preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 20, más preferiblemente al menos 50, de la manera más preferible al menos 100 moléculas de la toxina escapan del endosoma. Se prefiere además que un conjugado de la invención comprenda una estructura de base funcionalizada conjugada covalentemente, es decir, una estructura de base como una estructura de base oligomérica o polimérica o una porción conectora trifuncional, que comprenda porción(es) efectora(s) unida(s) covalentemente para dirigir la estructura de base que comprende la(s) porción(es) efectora(s) unida(s) a una célula diana tal como una célula tumoral o una célula autoinmune. Además, con el fin de reducir la toxicidad fuera de la diana, las toxinas de moléculas pequeñas no permeables de la membrana celular son moléculas efectoras preferidas con respecto a las toxinas permeables de la membrana celular.
[0143] El término "ligando”, como se usa en esta invención, tiene su significado habitual y preferiblemente significa una molécula o estructura que es capaz de unirse a otra molécula o estructura de la superficie celular de una célula diana, donde dicha molécula o estructura de la superficie celular se puede incorporar al interior de la célula por endocitosis y preferiblemente está ausente o es menos prominente en las células que no son diana. Preferiblemente, dicha molécula o estructura de la superficie celular se puede incorporar al interior de la célula por endocitosis constitutiva. Más preferiblemente, un conjugado o, más en concreto, una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de esta invención induce la endocitosis de dicha molécula o estructura de la superficie celular de las células diana después de unirse a dicha molécula o estructura. Este es, por ejemplo, el caso del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), HER2 y CD71 presente en la superficie de una variedad de células cancerosas. Algunos ejemplos de moléculas o estructuras de la superficie celular de las células diana que se incorporan al interior por endocitosis son, por ejemplo, Claudina-1 o glucoproteínas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II. Una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un factor de crecimiento o una citocina. La combinación, en un conjugado de la invención, de una toxina con una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y con al menos una saponina de la invención es una posibilidad para crear una toxina dirigida. Una toxina que solo es tóxica en una célula diana porque interfiere con los procesos que ocurren solo en las células diana también puede verse como una toxina dirigida (ya que en las células no diana no puede ejercer su acción tóxica, como, por ejemplo, la apoptina). Preferiblemente, una toxina dirigida es una toxina que se combina con una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal para que ejerza su acción en las células diana y no en las células no diana (ya que solo se une y se incorpora por endocitosis a las células diana). En un conjugado de la invención que comprende una estructura de base funcionalizada que comprende, por ejemplo, la porción efectora y/o la(s) saponina(s), la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, como el anticuerpo monoclonal, guía la porción efectora y/o la(s) saponina(s) mediante la estructura de base hasta las células diana. Después de la internalización, el al menos un glucósido, preferiblemente una saponina comprendida por el conjugado de la invención, media en el escape endosomal de la porción efectora. La saponina es típicamente una saponina mencionada en la Tabla A1 y el Esquema I, y preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS-21, y/o SA1641 y/o GE1741.
[0144] Preferiblemente, la porción efectora comprendida por el conjugado de la invención, cuyo efecto es potenciado por las saponinas comprendidas por el conjugado, se separa del conjugado, por ejemplo, se separa de un anticuerpo presente en el conjugado como la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, cuando se somete a endocitosis. Esto se puede lograr mediante un enlace escindible que se rompe, por ejemplo, en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por la luz.
[0145] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una porción efectora está unida de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, ya sea a través de al menos una porción conectora o unida directamente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular.
[0146] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos una porción efectora se une de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, formando así cualquiera de los conjugados anticuerpo-fármaco Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina y un conjugado de anticuerpofármaco de la Tabla A2 y la Tabla A3.
[0147] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina se une de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, preferiblemente un residuo de aminoácido de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, a través de un grupo aldehído de la saponina, y/o a la al menos una porción efectora preferiblemente a través de un residuo aminoácido en la al menos una porción efectora, a través de un grupo aldehído de la saponina, preferiblemente un grupo aldehído en la posición C-23 de una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano.
[0148] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el grupo aldehído de la al menos una saponina, preferiblemente el grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina, se une de manera covalente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, porción conectora que se une de manera covalente a través de un enlace tio-éter a un grupo sulfhidrilo de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o de la al menos una porción efectora, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
[0149] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica perteneciente al tipo de un 12,13-dehidrooleanano, con grupo aldehído en la posición C-23 y que comprende un grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina, donde la saponina se une de manera covalente a un residuo de aminoácido de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la al menos a una porción efectora a través de dicho grupo ácido glucurónico y preferiblemente a través de un residuo de aminoácido de la al menos una porción efectora.
[0150] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el grupo ácido glucurónico del sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-0H de la al menos una saponina se une de manera covalente a la porción conectara 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, donde dicha porción conectora se une de manera covalente a través de un enlace amida a un grupo amino de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o de la al menos una porción efectora, tal como un grupo amino de una lisina o un extremo N de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o de la al menos una porción efectora.
[0151] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina se une de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la al menos una porción efectora, ya sea directamente o a través de al menos una porción conectora, como una porción conectora bifuncional, por ejemplo a base de hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico y/o a base de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, o una porción conectora trifuncional, tal como la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B.
[0152] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la porción conectora trifuncional comprende un segundo grupo químico con al menos una saponina unida de manera covalente, un tercer grupo químico para la unión covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y un primer grupo químico para la unión covalente a la al menos una porción efectora, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B.
[0153] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina se une de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y a la al menos una porción efectora a través de al menos una porción conectora que comprende una porción conectora trifuncional a la que se unen tanto la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular como la al menos una porción efectora, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B.
[0154] Una forma de realización es la porción conectora trifuncional de la invención, tal como la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B y/o la Figura 16 de la invención.
[0155] Una forma de realización es el uso de la porción conectora trifuncional según la invención, tal como la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B, para la fabricación de un conjugado, tal como un ADC o un AOC, preferiblemente un conjugado que comprende la al menos una saponina de la invención, el conjugado ADC-saponina y/o el conjugado AOC-saponina según la invención.
[0156] Una forma de realización es el producto semiacabado que comprende la porción conectora trifuncional de la invención, donde la al menos una saponina según la invención está unida de manera covalente a la porción conectora trifuncional y/o donde la al menos una porción efectora según la invención está unida de manera covalente a la porción conectora trifuncional, ya sea directamente o mediante al menos una porción conectora y/o mediante al menos una estructura de base oligomérica o polimérica de la invención, donde la porción conectora es preferiblemente una porción conectora escindible según la invención, donde la porción efectora de la invención es preferiblemente una toxina, tal como una toxina proteica seleccionada de entre diantina, saporina y/o la saponina de la invención, siendo preferiblemente una o más de Quil-A, QS-21, QS-7, QS1861, S01861, SA1641, GE1741 y la porción de saponina soluble en agua de Quillaja saponaria.
[0157] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde opcionalmente dicha porción conectora escindible se somete a escisión en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por la luz, y preferiblemente la porción conectora escindible comprende un enlace escindible seleccionado de entre un enlace hidrazona o un enlace hidrazida sometido a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo, proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras, como un puente disulfuro.
[0158] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde dicha porción conectora escindible se somete a escisión in vivo en condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o en los lisosomas de las células de los mamíferos, preferiblemente de células humanas, preferiblemente a pH 4,0 - 6,5, y más preferiblemente a pH ≤ 5,5.
[0159] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a una cadena lateral de lisina, formando un enlace amida, y/o a una cadena lateral de cisteína, formando un enlace tioéter o un puente disulfuro, donde la lisina y/o la cisteína están comprendidas por la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o están comprendidas por la al menos una porción efectora, y donde la al menos una saponina está unida directamente a la lisina y/o cisteína, o se une a través de al menos una porción conectora que comprende opcionalmente una porción conectora escindible y/o una porción conectora trifuncional tal como la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B.
[0160] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la porción conectora se basa en hidrazida de ácido N-£-maleimidocaproico y/o se basa en 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b] piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, una porción conectora trifuncional tal como la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B, una porción conectora escindible, y/o implica uno o más de un puente disulfuro, un enlace tio-éter, un enlace amida, un enlace hidrazida.
[0161] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina se une de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la al menos una porción efectora a través de al menos una porción conectora, donde la porción conectora es o comprende una estructura de base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y que además comprende al menos un cuarto grupo químico para unir de manera covalente la estructura de base a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la al menos una porción efectora.
[0162] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina se une de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base mediante un enlace escindible y/o mediante un enlace no escindible.
[0163] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el enlace escindible se somete a escisión en cualquiera de entre condiciones ácidas, condiciones reductoras, condiciones enzimáticas y condiciones inducidas por la luz, y preferiblemente el enlace escindible comprende un enlace hidrazona o un enlace hidrazida sometido a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo, proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras, como un puente disulfuro.
[0164] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el enlace escindible se somete a escisión in vivo en condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o en los lisosomas de las células de los mamíferos, preferiblemente de células humanas, preferiblemente a pH 4,0 -6,5, y más preferiblemente a pH ≤ 5,5.
[0165] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de uno o más de un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace hidrazida, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano, un puente disulfuro, un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace peptídico o un enlace éster, preferiblemente a través de al menos una porción conectora.
[0166] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de uno o más enlaces imina, hidrazona e hidrazida, donde dicho enlace es preferiblemente escindible según la invención, donde preferiblemente la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través del grupo aldehido en la posición C-23 de la al menos una saponina.
[0167] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el grupo aldehido en la posición C-23 de la al menos una saponina está unido de manera covalente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, dicha porción conectora está unida de manera covalente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo en la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
[0168] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de un enlace amida, donde preferiblemente la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través del grupo ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina, cuando está presente.
[0169] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el grupo ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina se une de manera covalente a la porción conectora 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, donde dicha porción conectora se une de manera covalente a través de un enlace amida a un grupo amino en la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, como un grupo amino de una lisina o un extremo N de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base.
[0170] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida de manera covalente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, involucrando en el enlace covalente el grupo aldehído de la posición C-23 de la al menos una saponina, cuando está presente, y/o involucrando en el enlace covalente el grupo ácido glucurónico del sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina, cuando está presente.
[0171] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde al menos un cuarto grupo químico de la estructura de base, para unir de manera covalente la estructura de base a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la al menos una porción efectora, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de entre cualquiera o más de una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, preferiblemente un grupo azida.
[0172] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol, o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde dicho ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
[0173] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina es un número definido de saponinas o un rango definido de saponinas, preferiblemente 1-128 saponinas o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 128 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas.
[0174] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el conjugado comprende más de una saponina, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, como 7, 9, 12 saponinas, unidas de manera covalente directamente a un residuo de aminoácido de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y/o a la al menos una porción efectora y preferiblemente a través de un residuo de aminoácido de la al menos una porción efectora, preferiblemente a una cisteína y/o a una lisina, y/o unidas de manera covalente a través de al menos una porción conectora y/o a través de al menos una porción conectora escindible y/o a través de al menos una estructura de base polimérica u oligomérica de cualquiera de los reivindicaciones 28-40, preferiblemente 1-8 de dichas estructuras de base o 2-4 de tales estructuras de base, donde 1-32 saponinas, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16 o 32 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas, están unidas de manera covalente a la al menos una estructura de base.
[0175] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina se une de manera covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y a la al menos una porción efectora a través de una porción conectora trifuncional, comprendiendo la porción conectora trifuncional un segundo grupo químico con al menos una saponina unida de manera covalente directamente o a través de una porción conectora tal como una porción conectora escindible y/o a través de la estructura de base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y un cuarto grupo químico según la invención para la unión covalente de la estructura de base a la porción conectora trifuncional, comprendiendo la porción conectora trifuncional además un tercer grupo químico para la unión covalente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y que comprende un primer grupo químico para la unión covalente a la al menos una porción efectora, donde la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular está unida al tercer grupo químico y/o al menos una porción efectora está unida al primer grupo químico, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional del Esquema II y la Estructura B.
[0176] Según la invención, típicamente la saponina es una saponina enumerada en la Tabla A1, Esquema I. Se ha demostrado que es beneficioso para la actividad de la saponina, por ejemplo, el escape endosomal mejora la actividad dentro de las células cuando se tiene en cuenta la entrada en la célula y la acumulación dentro del citosol de una porción efectora unida covalentemente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, cuando la saponina está unida covalentemente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular (de manera directa o indirecta mediante la unión primero a la porción efectora, donde la porción efectora está unida directamente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular) mediante un enlace hidrazona y/o un enlace hidrazida y/o un puente disulfuro. Dichos tipos de enlaces se escinden fácilmente en condiciones ácidas dentro de lisosomas y endosomas (tardíos) de células de mamíferos, por ejemplo, células humanas y/o en condiciones reductoras. Alternativamente, los inventores también demuestran que la unión covalente de saponina a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular mediante un enlace que no se puede escindir fácilmente en las condiciones fisiológicas del interior de las células, por ejemplo, lisosomas, endosomas (tardíos), citosol, también es beneficiosa para la actividad potenciadora de la saponina sobre el efecto biológico de, por ejemplo, una porción efectora como un ácido nucleico (por ejemplo, BNA que silencia HSP27) y una toxina proteica como la saporina. Un ejemplo de dicho enlace es un enlace amida, para unir una saponina a una cadena lateral de lisina, de manera directa o mediante una porción conectora (escindible) o mediante una estructura oligomérica o polimérica. En toda la solicitud, incluidas las reivindicaciones, el término "porción conectora escindible", "enlace escindible", etc., también se denomina "porción conectora lábil" ("L") y "enlace lábil", por ejemplo, en el contexto de la escisión de dicho enlace o porción conectora en el lisosoma y/o endosoma (tardío) o cuando un conjugado de la invención, por ejemplo, un conjugado que comprende opcionalmente una estructura de base con saponinas unidas a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular a través de una porción conectora y/o mediante la estructura de base mediante enlaces hidrazona o puentes disulfuro. Por ejemplo, las Figuras 2 y 3 muestran el silenciamiento del gen HSP27 in vivo en tumores humanos en ratones. Se trató a los ratones con tumores con un conjugado de la invención que consistía en un anticuerpo monoclonal con saponina unida a él mediante una porción conectora lábil (enlace hidrazona) y con BNA antisentido para silenciar el gen HSP27 en las células tumorales, unido covalentemente al anticuerpo monoclonal mediante un puente disulfuro, según la invención. Es decir, sin querer ceñirse a ninguna teoría, el enlace hidrazona y el puente disulfuro se escinden en los endosomas (tardíos) y/o lisosomas de las células tumorales diana que expresan el epítopo en la molécula de la superficie de la célula diana, en este caso el EGFR, en la superficie celular, una vez que el conjugado de la invención es internalizado, por ejemplo, por endocitosis. Es probable que la escisión de los enlaces contribuya al escape endosomal, mejorando la actividad de la saponina cuando se tiene en cuenta la entrada del BNA desde el endosoma y/o lisosoma al citosol, aunque dicha escisión no es necesaria para que haya un efecto de silenciamiento génico del conjugado cetuximab-SO1861-BNA de la invención.
[0177] El experto en la materia apreciará que una porción conectora trifuncional es una estructura de base de la invención adecuada para unir covalentemente uno, dos o tres restos de saponina. Para la porción conectora trifuncional, se prefiere la unión covalente de uno o dos restos de saponina. El segundo y/o tercer sitio de unión es adecuado, por ejemplo, para la unión covalente de un ligando proteico tal como la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular. Los ligandos proteicos típicos son EGF para dirigirse a células (tumorales) que expresan EGFR en la superficie celular, y citocinas para dirigirse a células tumorales o células autoinmunes. Además, el segundo o tercer sitio de unión de la porción conectora trifuncional es adecuado para la unión covalente de una inmunoglobulina tal como un anticuerpo monoclonal, es decir, una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular para la unión a una molécula de la superficie celular tal como una molécula de la superficie de una célula tumoral, preferiblemente una molécula específica de las células tumorales, más preferiblemente un receptor de células tumorales que se expresa específicamente (sobreexpresa) en la superficie de las células tumorales. De manera similar, la inmunoglobulina, o cualquier fragmento(s) y/o dominio(s) de la misma que abarque la especificidad de unión de la inmunoglobulina es adecuada para la unión a una molécula de la superficie celular, como un receptor, expresada en la superficie de una célula autoinmune. Por lo tanto, en una forma de realización, el conjugado de la invención comprende la porción conectora trifuncional, donde dicha porción conectora comprende o consiste en una saponina unida covalentemente, por ejemplo, QS-21, SO1861, y molécula dirigida a una molécula de la superficie celular unida covalentemente, como una porción de direccionamiento hacia células, como un ligando o un anticuerpo para la unión (específica) a una célula tumoral, una célula autoinmune, una célula enferma, una célula aberrante, una célula no sana, una enfermedad de los linfocitos B.
[0178] Una forma de realización es el conjugado de la invención, que comprende la porción conectora oligomérica trifuncional como estructura del núcleo de la estructura de base, de acuerdo con el Esquema II:
Figure imgf000039_0001
en el que la saponina y la poción efectora están unidas covalentemente a la estructura de base de la porción conectora trifuncional mediante porciones conectaras hidrazona lábiles y escindibles (sensibles a los ácidos) y/o mediante un enlace que comprende maleimida, mientras que la unión de la estructura de base a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, como un anticuerpo, se establece mediante porciones conectoras de hidrazona lábiles y escindibles (sensibles a los ácidos) y/o mediante un enlace que comprende maleimida con cisteínas en el sitio de unión, tal como 1, 2, 3 o 4 cisteínas, formando así la Estructura B:
Figure imgf000040_0001
Estructura B,
de modo que 1-4 estructuras de base están unidas covalentemente a una única molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, por ejemplo, como un anticuerpo monoclonal.
[0179] Una forma de realización es el conjugado de la invención en el que el enlace entre la saponina y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular se produce preferiblemente a través de un enlace lábil en medio ácido que es estable a pH 7,4 y, preferiblemente, libera la saponina por debajo de pH 6,5, más preferiblemente entre pH 6,5 y 5,0. Esto se realiza, por ejemplo, mediante una imina formada por un grupo amino de una porción conectora que une la saponina y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular y el grupo aldehido de la saponina. También se pueden usar otros enlaces químicos que cumplen la condición de pH para la unión de aldehídos, por ejemplo, hidrazonas o acetales particulares, que requieren hidrazidas y grupos hidroxilo como grupo funcional de la porción conectora, respectivamente. Si el enlace es un enlace escindible, una saponina se une preferiblemente a la estructura polimérica u oligomérica de una estructura de base mediante un grupo funcional aldehído o mediante uno de los grupos carboxilo de la saponina, más preferiblemente a través del grupo aldehído, preferiblemente un grupo aldehído en la posición 23. Alternativamente, una saponina se une preferiblemente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular a través de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base a través de una porción conectora que conecta la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, ya sea a través del grupo aldehído o mediante el grupo ácido carboxílico de la saponina.
[0180] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular mediante un enlace estable. En una forma de realización más preferida, el enlace estable entre la saponina y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular se produce preferiblemente a través de un enlace amida o formación de amina. Esto se realiza, por ejemplo, mediante la formación de un enlace amida mediado por carbodiimida mediante un grupo amino de una estructura de estructura de base polimérica u oligomérica que une la saponina y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular entre sí, y el grupo ácido glucurónico activado de la saponina. Los enlaces químicos que cumplen la definición de enlace estable también se pueden utilizar para la unión de aldehídos, por ejemplo, aminas particulares derivadas después de la aminación reductora, que requieren grupos amino primarios como grupo funcional de una estructura polimérica u oligomérica de una estructura de base o una porción conectora. Si el enlace es un enlace estable, la saponina se une preferiblemente a una porción conectora o una estructura de base a través de uno de los grupos carboxilo de la saponina, donde la porción conectora o estructura de base se une además a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular.
[0181] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina se une a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular mediante una estructura de base según la invención, donde el grupo químico para la unión covalente de la estructura de base al sitio de unión es un grupo de química clic.
[0182] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la saponina se une a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular a través de una estructura de base según la invención, donde el grupo de química clic es una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de cualquiera de estos grupos, preferiblemente una azida. Un grupo de química clic es un grupo químico funcional adecuado para la química clic, que se define como una reacción que es modular, de amplio alcance, que da rendimientos muy altos, que genera solo subproductos inofensivos, que ofrece alta selectividad y alta tolerancia para diferentes grupos funcionales y que es estereoespecífica. Las características requeridas del proceso incluyen condiciones de reacción simples, materiales de partida y reactivos de fácil obtención, sin uso de disolvente o con uso de un disolvente que sea benigno (como el agua) o que se elimine fácilmente, y el aislamiento simple del producto. El grupo de química clic para unir la saponina a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, opcionalmente a través de una estructura de base o una porción conectora, es preferiblemente una tetrazina, azida, alqueno o alquino, o derivados reactivos de estos, como metil-tetrazina o maleimida (alqueno), más preferiblemente un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, tal como ciclooctina (por ejemplo, aza-dibenzociclooctina, difluorociclooctina, biciclo[6.1.0]non-4-ina, dibenzociclooctina).
[0183] De este modo, un conjugado según la invención comprende al menos una saponina. Por "al menos una”, en este contexto, se entiende que el conjugado comprende una molécula de saponina pero también puede comprender un par (por ejemplo, dos, tres o cuatro) de saponinas o una multitud (por ejemplo, 10, 20 o 100) de saponinas. Dependiendo de la aplicación, el conjugado puede comprender una estructura de base unida covalentemente a saponinas unidas covalentemente, en donde la estructura de base puede diseñarse de manera que comprenda un número definido de saponinas. Preferiblemente, un conjugado según la invención comprende un número o rango definido de saponinas, en lugar de un número aleatorio. Esto es especialmente ventajoso para el desarrollo de fármacos por lo que respecta a la autorización de comercialización. Un número definido a este respecto significa que un conjugado comprende preferiblemente un número previamente definido de saponinas. Esto se logra, por ejemplo, diseñando una estructura de base que comprenda una estructura polimérica con un cierto número de posibles restos para que se unan las saponinas. En circunstancias ideales, todos estos restos se unen a una saponina y la estructura de base comprende el número definido anteriormente de saponinas. Se prevé ofrecer un conjunto estándar de estructuras de base, que comprenda, por ejemplo, dos, cuatro, ocho, dieciséis, treinta y dos, sesenta y cuatro, etc., saponinas, de modo que el usuario pueda probar fácilmente el número óptimo de acuerdo con sus necesidades. Una forma de realización es el conjugado de la invención que comprende la estructura de base de la invención, donde la saponina está presente en un rango definido, ya que, por ejemplo, en circunstancias no ideales, no todos los restos presentes en una estructura polimérica se unen a una saponina. Dichos rangos pueden ser, por ejemplo, de 2 a 4 moléculas de saponina por estructura de base, de 3 a 6 moléculas de saponina por estructura de base, de 4 a 8 moléculas de saponina por estructura de base, de 6 a 8 moléculas de saponina por estructura de base, de 6 a 12 moléculas de saponina por estructura de base y así sucesivamente. En tal caso, un conjugado que comprende una estructura de base según la invención comprende, por tanto, 2, 3 o 4 saponinas si el rango se define como 2-4.
[0184] La estructura de base es fundamentalmente independiente del tipo de saponina unida covalentemente a la estructura de base, y la estructura de base posteriormente (en orden secuencial) se une covalentemente al conjugado. Por tanto, el conjugado que comprende la estructura de base es el producto de base para una nueva tecnología de plataforma. Dado que la al menos una saponina unida covalentemente media en la administración intracelular de la porción efectora unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, la tecnología de estructura de base según la invención es el primer sistema conocido que media en la administración intracelular controlada de la porción efectora por las saponinas. La estructura de base proporciona una unidad optimizada y funcionalmente activa que se puede unir a la(s) saponina(s) y a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprendida por el conjugado de la invención, por ejemplo, un ligando, un anticuerpo, etc., en una posición única y definida.
[0185] Una forma de realización es el conjugado que comprende una estructura de base según la invención, donde el número de monómeros de la estructura polimérica u oligomérica es un número o rango exactamente definido. Preferiblemente, la estructura polimérica u oligomérica comprende estructuras como poli(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), o estructuras como polietilenglicol, poli(ésteres), como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido, poli(dextrina), o un péptido o una proteína, o estructuras tales como poliaminoácidos naturales y/o artificiales, por ejemplo, polilisina, polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de a Pn (ácido nucleico peptídico), que aparecen como un polímero lineal, ramificado o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado o conjuntos de estas estructuras, de carácter puro o mixto. Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles, en donde biocompatible significa que la estructura polimérica u oligomérica no muestra toxicidad aguda o crónica sustancial en los organismos y se puede excretar íntegramente o degradarse completamente en compuestos excretables y/o fisiológicos mediante el metabolismo del organismo. Los ensamblajes se pueden construir mediante reticulación covalente o enlaces y/o atracción no covalentes. Por lo tanto, también pueden formar nanogeles, microgeles o hidrogeles, o pueden unirse a vehículos como nanopartículas inorgánicas, coloides, liposomas, micelas o estructuras en forma de partículas que comprenden colesterol y/o fosfolípidos. Dichas estructuras poliméricas u oligoméricas llevan preferiblemente un número o rango exactamente definido de restos de unión para la unión de moléculas de glucósidos (y/o moléculas efectoras y/o moléculas portadoras tales como un ligando, anticuerpo monoclonal o un fragmento de los mismos). Preferiblemente al menos un 50 %, más preferiblemente al menos un 75 %, más preferiblemente al menos un 85 %, más preferiblemente al menos un 90 %, más preferiblemente al menos un 95 %, más preferiblemente al menos un 98 %, más preferiblemente al menos un 99 %, de la manera más preferible el 100 % del número o rango exactamente definido de restos de unión en la estructura polimérica u oligomérica está ocupado por una molécula de glucósido en una estructura de base según la invención.
[0186] Preferiblemente, un dendrón es un polímero ramificado y claramente definido con estructura similar a un árbol con un solo grupo químicamente direccionable en el origen del árbol, llamado punto focal. Un dendrímero es una conexión de dos o más dendrones en su punto focal. Un polímero dendronizado es una conexión del punto focal de uno o más dendrones a un polímero. En una forma de realización preferida, se proporciona una estructura de base según la invención, donde la estructura polimérica u oligomérica comprende un polímero lineal, ramificado o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado o conjuntos de estas estructuras, ya sean de carácter puro o mixto, donde los ensamblajes se pueden construir mediante reticulación covalente o atracción no covalente y pueden formar nanogeles, microgeles o hidrogeles, y donde, preferiblemente, el polímero es un derivado de una poli(amina), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), y estructuras como polietilenglicol, poli(ésteres), como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido y poli(dextrina), y estructuras como poliaminoácidos naturales y/o artificiales tales como polilisina, o un péptido o una proteína o polímeros de ADN, polímeros de ARN estabilizados o polímeros de APN (ácido nucleico peptídico). Preferiblemente, las estructuras poliméricas u oligoméricas son biocompatibles.
[0187] Una forma de realización es el conjugado de la invención para su uso según la invención, donde el conjugado comprende más de una saponina unida covalentemente, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16, 32, 64, 128 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre ellas, tales como 7, 9, 12 saponinas, o cualquier otro.
[0188] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base oligomérica o polimérica mediante al menos una porción conectora escindible según la invención.
[0189] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde el grupo químico de la estructura de base oligomérica o polimérica, para la unión covalente de la estructura de base oligomérica o polimérica al residuo de aminoácido de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, más preferiblemente dicho grupo químico es una azida.
[0190] Una forma de realización es el conjugado de la invención, donde la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base oligomérica o polimérica comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde el ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
[0191] Los inventores establecieron que la unión covalente, preferiblemente a través de enlaces o porciones conectoras escindibles, de la saponina a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, según cualquiera de las formas de realización anteriores, proporciona una potenciación eficaz y dirigida a la célula de la actividad de una porción efectora comprendida por dicho conjugado. La unión de la saponina a una cadena lateral de cisteína o una cadena lateral de lisina de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, como un anticuerpo monoclonal, directamente o mediante una porción conectora, demostró ser una forma beneficiosa de administración específica y eficiente de la actividad potenciadora de la porción efectora dentro de la célula diana, cuando también la porción efectora se administra en la misma célula diana usando la misma molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención a la que también está(n) unida(s) de manera covalente la(s) saponina(s).
[0192] Para explicar la invención con más detalle, se describe el proceso de absorción celular de sustancias (aunque los inventores no desean ceñirse a ninguna teoría) y la terminología utilizada en esta invención. La captación de sustancias extracelulares en una célula por gemación de vesículas se llama endocitosis. Dicha formación de vesículas se puede caracterizar por (1) captación de ligando dependiente del receptor mediada por la proteína citosólica clatrina, (2) captación de la balsa lipídica mediada por la proteína de unión al colesterol, la caveolina, (3) captación inespecífica de líquido (pinocitosis), o (4) captación inespecífica de partículas (fagocitosis). Todos los tipos de endocitosis llevan a los siguientes procesos celulares de transporte de vesículas y clasificación de sustancias llamados vías endocíticas. Las vías endocíticas son complejas y no se comprenden completamente. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se pueden formar orgánulos de novo y madurar en el siguiente orgánulo a lo largo de la vía endocítica. Sin embargo, ahora se plantea la hipótesis de que las vías endocíticas implican compartimentos estables que están conectados por tráfico vesicular. Un compartimento es un orgánulo de membrana complejo y multifuncional que está especializado para un conjunto particular de funciones esenciales de la célula. Las vesículas se consideran orgánulos transitorios, de composición más simple y se definen como compartimentos cerrados por membranas que se forman de novo al brotar de un compartimento preexistente. A diferencia de los compartimentos, las vesículas pueden experimentar una maduración, que es una serie fisiológicamente irreversible de cambios bioquímicos. Los endosomas tempranos y los endosomas tardíos representan compartimentos estables en la vía endocítica, mientras que las vesículas endocíticas primarias, fagosomas, cuerpos multivesiculares (también llamados vesículas portadoras de endosomas), gránulos secretores e incluso lisosomas representan vesículas. La vesícula endocítica, que surge en la membrana plasmática, principalmente a partir de estructuras recubiertas de clatrina, se fusiona primero con el endosoma temprano, que es un compartimento principal de clasificación de aproximadamente pH 6,5. Una gran parte de la carga y las membranas internalizadas se reciclan de nuevo a la membrana plasmática a través de vesículas de reciclaje (vía de reciclaje). Los componentes que deben degradarse se transportan al endosoma tardío ácido (pH inferior a 6) a través de cuerpos multivesiculares. Los lisosomas son vesículas que pueden almacenar enzimas lisosomales maduras y llevarlas a un compartimento endosomal tardío cuando sea necesario. El orgánulo resultante se llama orgánulo híbrido o endolisosoma. Los lisosomas brotan del orgánulo híbrido en un proceso denominado regeneración de lisosomas. Los endosomas tardíos, los lisosomas y los orgánulos híbridos son orgánulos extremadamente dinámicos y la distinción entre ellos suele ser difícil. La degradación de una molécula endocitosada ocurre dentro de un endolisosoma o lisosoma. El escape endosomal es la liberación activa o pasiva de una sustancia desde el lumen interno de cualquier tipo de compartimento o vesícula de la vía endocítica, preferiblemente de la endocitosis mediada por clatrina, o vía de reciclaje hacia el citosol. Por tanto, el escape endosomal incluye, pero no se limita a, la liberación de endosomas, endolisosomas o lisosomas, incluidos sus orgánulos intermedios e híbridos.
[0193] A menos que se indique específicamente lo contrario y, en particular, cuando se refiere al mecanismo de escape endosomal de la molécula de glucósido tal como la saponina de la invención, siempre que la palabra "endosoma" o "escape endosomal" se use en este documento, también incluye el endolisosoma y lisosoma, y el escape del endolisosoma y lisosoma, respectivamente. Después de entrar al citosol, dicha sustancia podría trasladarse a otras unidades celulares como el núcleo.
[0194] En términos formales, un glucósido es cualquier molécula donde un grupo azúcar está unido a través de su carbono anomérico a otro grupo a través de un enlace glucosídico. Las moléculas de glucósidos, tales como las saponinas, en el contexto de la invención son aquellas moléculas que además pueden mejorar el efecto de una porción efectora, sin desear ceñirse a ninguna teoría, en particular que facilitan el escape endosomal de la porción efectora. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, las moléculas de glucósidos (saponinas, como las que se enumeran en la Tabla A1) interactúan con las membranas de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje y las hacen permeables para dichas porciones efectoras, lo que da como resultado un aumento del escape endosomal. Con la expresión "la estructura de base puede aumentar el escape endosomal de la porción efectora" se entiende que la al menos una saponina (molécula de glucósido), que está unida mediante una porción conectora o directamente a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular o mediante la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, es capaz de mejorar el escape endosomal de una porción efectora cuando ambas moléculas están dentro de un endosoma, por ejemplo, un endosoma tardío, opcional y preferiblemente después de que el al menos un glucósido tal como una saponina se libere del conjugado, tal como de una porción conectora o estructura polimérica u oligomérica comprendida por dicho conjugado, por ejemplo, por escisión de un enlace escindible entre el al menos un glucósido (saponina) y el conjugado(por ejemplo, mediante una estructura polimérica u oligomérica de una estructura de base y/o mediante una porción conectora). Aunque un enlace entre el al menos un glucósido tal como una saponina según la invención y molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, opcionalmente a través de una porción conectora o una estructura de base, puede ser un "enlace estable", eso no significa que dicho enlace no pueda escindirse en los endosomas mediante, por ejemplo, enzimas. Por ejemplo, el glucósido o la saponina, opcionalmente junto con una porción conectora o una parte de la estructura oligomérica o polimérica de una estructura de base, pueden separarse del fragmento de porción conectora restante o de la estructura oligomérica o polimérica. Podría ser, por ejemplo, que una proteasa escinda una porción conectora (proteica) o una estructura polimérica proteica, por ejemplo, albúmina, liberando así el al menos un glucósido, la saponina. Sin embargo, se prefiere que la molécula de glucósido (preferiblemente saponina) se libere en una forma activa, preferiblemente en la forma original que tenía antes de ser (preparada para ser) unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención opcionalmente mediante una porción conectora y/o una estructura de base oligomérica o polimérica; por tanto, el glucósido (saponina) tiene su estructura natural después de tal escisión o el glucósido (saponina) tiene (parte de) un grupo químico o porción conectora unido al mismo, después de tal escisión, mientras que la actividad biológica del glucósido (actividad biológica de la saponina), por ejemplo, la actividad potenciadora del escape endosomal/lisosomal hacia una porción efectora presente en el mismo endosoma o lisosoma, se mantiene o se restaura tras dicha escisión del enlace entre el glucósido (saponina) y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, por ejemplo, un anticuerpo, que comprende opcionalmente una porción conectora y/o una estructura de base de la invención. Con respecto a la presente invención, el término "estable”, con respecto a los enlaces entre por ejemplo, saponinas y residuos de aminoácidos de molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado, una porción conectora, estructuras poliméricas u oligoméricas (de la estructura de base), ligandos, inmunoglobulinas (monoclonales) o dominios de unión o fragmentos de las mismas, y/o efectores (porciones efectoras, moléculas efectoras), significa que el enlace no se rompe fácilmente o al menos no está diseñado para romperse fácilmente a causa de, por ejemplo, diferencias de pH, concentraciones de sal o condiciones reductoras con luz ultravioleta. Con respecto a la presente invención, el término "escindible" con respecto a los enlaces entre, por ejemplo, saponinas y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular, porciones conectoras, residuos de aminoácidos, estructuras poliméricas u oligoméricas de la estructura de base, ligandos, anticuerpos y/o efectores, significa que el enlace está diseñado para romperse fácilmente por, por ejemplo, diferencias de pH, concentraciones de sal, condiciones reductoras, y similares. El experto en la materia conoce estos enlaces escindibles y cómo prepararlos.
[0195] Antes de la presente invención, uno de los principales obstáculos para la introducción de ADC y AOC en el mercado era la ventana terapéutica corta: una dosis terapéuticamente eficaz de un ADC o un AOC va acompañada de efectos secundarios (inaceptables) que dificultan el desarrollo y la implicación en el tratamiento de los pacientes con los ADC. Mediante la aplicación del conjugado de la invención, como un conjugado ADC-saponina y un conjugado AOC-saponina ahora es posible guiar una o múltiples moléculas de glucósidos (saponina(s)) a una célula (diana) junto con el ADC que lleva una carga útil o junto con un anticuerpo (monoclonal) conjugado con un oligonucleótido tal como un BNA según la invención. En particular, antes no era posible guiar específicamente una porción efectora de un ADC o un AOC o cualquier otro conjugado de una carga una molécula (proteica) dirigida a una molécula de la superficie celular, y un número o rango particular (predefinido, controlable) de moléculas de glucósidos (saponinas) por porción efectora al mismo tiempo al citosol de las células, por ejemplo, a través de la vía endocítica de una célula.
[0196] Una solución proporcionada por la invención comprende la unión covalente de al menos una saponina a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención. Una solución adicional proporcionada por la invención comprende (primero) polimerizar las moléculas de glucósidos (saponinas) usando una estructura de base oligomérica o polimérica, y proporcionar a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención un grupo de saponinas unidas covalentemente, lo que permite volver a monomerizar una o más saponinas en el sitio intracelular donde se desea el modo de acción de la saponina, por ejemplo, después de la endocitosis. "Polimerizar" en este contexto significa la conjugación múltiple reversible y/o irreversible de moléculas de saponina a la primera molécula proteica, ya sea mediante una porción conectora o directamente o mediante una estructura polimérica u oligomérica para formar una estructura de base o la conjugación múltiple reversible y/o irreversible de saponinas (modificadas), formando así una estructura polimérica u oligomérica para formar una estructura de base. "Remonomerización”, en este contexto, significa la escisión de las saponinas del conjugado de la porción conectora que une la(s) saponina(s) a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención o de la estructura de base, por ejemplo después de la endocitosis, y la recuperación del estado químico (nativo) de las saponinas no unidas, donde dichas saponinas no unidas pueden comprender o no grupos químicos adicionales tales como un grupo químico para unir la saponina a una porción conectora, un residuo de aminoácido del conjugado o a la estructura de base, y/o una porción conectora (química) unida a un grupo químico de la saponina tal como un grupo aldehído o un grupo ácido carboxílico. Debido a la química compleja de las saponinas, por ejemplo, la "polimerización" de las saponinas en una estructura de base u otra porción conectora de enlace y su "remonomerización" en una ubicación deseada, tal como intracelularmente, por ejemplo, después de la endocitosis, fue una tarea difícil. En particular, las reacciones químicas utilizadas para proporcionar las porciones conectoras y la estructura de base que comprenden glucósidos unidos covalentemente para la unión covalente al conjugado, por ejemplo, saponinas triterpenoides (polimerización de los glucósidos), normalmente se dan en disolventes orgánicos exentos de agua, pero las saponinas y, por ejemplo, los polímeros biocompatibles aplicados como una estructura de base para llevar unidas saponinas, son moléculas hidrosolubles. Las propiedades químicas de la saponina no modificada impidieron aún más la polimerización por sí misma y, se estimó que otra posible solución, consistente en unir múltiples saponinas (directamente) a la molécula efectora, no era muy prometedora, ya que una molécula efectora (fármaco, toxina, polipéptido o polinucleótido) normalmente no proporciona suficientes sitios de unión y debido a que el producto de unión se volvería bastante heterogéneo y/o la unión de moléculas biológicamente activas como una saponina y, por ejemplo, un péptido, una toxina, un ácido nucleico juntos conlleva el riesgo de influir y obstaculizar la actividad de una o incluso ambas moléculas unidas entre sí en tal conjugado que comprende saponina. Además, existía un riesgo considerable de que la porción efectora comprendida el conjugado de la invención perdiera su función cuando una saponina se une a por ejemplo, un ADC o un conjugado anticuerpo-oligonucleótido (AOC). Las formas de realización de la presente invención resuelven al menos uno de estos inconvenientes.
[0197] Una molécula efectora, o porción efectora, en el contexto de esta invención es cualquier sustancia que afecte al metabolismo de una célula por interacción con una diana molecular efectora intracelular, donde esta diana molecular efectora es cualquier molécula o estructura del interior de las células, excluyendo el lumen de los compartimentos y vesículas de la vía endocítica y de reciclaje pero incluyendo las membranas de estos compartimentos y vesículas. Dichas estructuras del interior de las células incluyen, por tanto, el núcleo, las mitocondrias, los cloroplastos, el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, otras vesículas de transporte, la parte interna de la membrana plasmática y el citosol. La administración citosólica de una porción efectora en el contexto de la invención significa preferiblemente que la porción efectora puede escapar del endosoma (y/o lisosoma), que, como se ha definido anteriormente, también incluye el escape del endolisosoma y del lisosoma, y preferiblemente puede alcanzar la diana efectora como se describe en el presente documento. La invención también abarca un nuevo tipo de molécula, a la que se hace referencia como estructura de base, que sirve para llevar tanto una porción efectora como al menos una molécula de glucósido, como una saponina de la invención, en un endosoma al mismo tiempo en una proporción predefinida, cuando la porción efectora está comprendida por el conjugado de la invención y la saponina está comprendida por el conjugado. Dentro del contexto de la presente invención, la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base es una formación ordenada estructuralmente, como un polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado, o es una estructura polimérica ensamblada como un hidrogel, microgel, nanogel, micela polimérica estabilizada o liposoma, pero excluye las estructuras que están compuestas por ensamblajes no covalentes de monómeros tales como mezclas de colesterol/fosfolípidos. Los términos "polímero, oligómero, dendrímero, polímero dendronizado u oligómero dendronizado" tienen su significado habitual. En particular, un polímero es una sustancia que tiene una estructura molecular construida principal o completamente a partir de un gran número de unidades iguales o similares unidas entre sí, y un oligómero es un polímero cuyas moléculas constan de relativamente pocas unidades repetidas. No hay consenso sobre un límite específico para "muchos" y "pocos" como se usa en la definición anterior de polímero y oligómero, respectivamente. Sin embargo, como la estructura de base puede comprender una estructura polimérica u oligomérica, o ambas, el rango completo de números de unidades similares unidas entre sí se aplica a dicha estructura, es decir, de 2 unidades monoméricas a 100 unidades monoméricas, 1000 unidades monoméricas y más. Una estructura que comprende 5 o menos, por ejemplo, puede llamarse estructura oligomérica, mientras que una estructura que comprende 50 unidades monoméricas puede llamarse estructura polimérica. Una estructura de 10 unidades monoméricas puede denominarse oligomérica o polimérica. Una estructura de base como se define en el presente documento comprende además al menos una molécula de glucósido, tal como una saponina de la invención. Una estructura de base incluye preferiblemente una estructura polimérica u oligomérica como poli u oligo(aminas), por ejemplo, polietilenimina y poli(amidoamina), y estructuras biocompatibles como polietilenglicol, poli (u oligo (ésteres)), como poli(lactidas), poli(lactamas), copolímeros de polilactida-co-glicólido y poli(dextrina), poli u oligosacáridos, como ciclodextrina o polidextrosa, y poli u oligoaminoácidos, como polilisina o un péptido o una proteína, u oligómeros o polímeros de ADN. Una estructura polimérica ensamblada como se define en el presente documento comprende al menos una estructura de base y, opcionalmente, otras estructuras poliméricas u oligoméricas individuales. Otras estructuras poliméricas u oligoméricas individuales de dicho ensamblaje pueden ser (a) estructuras de base (que comprenden así al menos una molécula de glucósido, como una saponina de la invención), (b) estructuras de base funcionalizadas (que comprenden así al menos una molécula de glucósido, como una saponina, y al menos una porción efectora, (c) estructuras poliméricas u oligoméricas sin una molécula de glucósido tal como una saponina de la invención (véase la Tabla A1 por ejemplo), pero con al menos una porción efectora. Una estructura polimérica ensamblada funcionalizada es una estructura polimérica ensamblada que contiene (a) al menos una estructura de base funcionalizada o (b) al menos una estructura de base y al menos una estructura polimérica que comprende al menos una porción efectora, etc, unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención. Las estructuras poliméricas u oligoméricas dentro de una estructura polimérica ensamblada que no comprenden ninguna de las moléculas mencionadas anteriormente (es decir, sin glucósidos tales como saponinas, sin porciones efectoras) se añaden en particular como componentes estructurales de las estructuras ensambladas, que ayudan a construir o estabilizar la estructura ensamblada (“de manera similar a un pegamento"). Sin querer ceñirse a ninguna teoría, el ambiente ácido parece ser un requisito previo para la acción sinérgica entre el glucósido (saponina) y la porción efectora.
[0198] Con un ensayo como se describe en el Ejemplo 12 y como se conoce en la técnica, se puede determinar fácilmente si un conjugado de la invención que comprende saponinas, que comprende o no además una o más porciones conectoras (escindibles) y/u opcionalmente una estructura de base, es capaz de alterar el ambiente ácido e inhibir la función de escape endosomal del al menos un glucósido (saponina). La inhibición se describe como "aumentos por múltiplos de la cantidad de glucósidos necesarios para inducir la muerte celular al 50 %". Se prefiere que la estructura de base no conduzca a un aumento que sea al menos el aumento de moléculas de glucósido (saponinas) necesario para obtener un 50 % de muerte celular observado cuando se usa cloroquina como control positivo. Alternativamente, y preferiblemente, el conjugado de la invención que comprende saponinas, comprenda o no además una o más porciones conectoras (escindibles) y/u opcionalmente una estructura de base, no conduce a un aumento de al menos el cuádruple de las moléculas de glucósido para inducir la muerte celular en un 50 %, más preferiblemente no conduce a un aumento de al menos el doble. El factor de aumento debe medirse en un ensayo, esencialmente como se describe en el Ejemplo 12, donde la cloroquina, como control positivo, induce un aumento del doble en la cantidad de glucósido, preferiblemente en la cantidad de saponina, en donde la saponina es una o más de las saponinas de la invención (véase Tabla A1, Esquema I, formas de realización previas), y donde se observa un 50 % de muerte celular.
[0199] Con el término "mejorar o potenciar un efecto de una porción efectora" se entiende que la molécula de glucósido, preferiblemente una saponina de la invención aumenta la eficacia funcional de esa porción efectora (por ejemplo, el índice terapéutico de una toxina o un fármaco o un oligonucleótido como un BNA; la eficacia metabólica de un modificador en procesos biotecnológicos; la eficacia de transfección de genes en experimentos de investigación de cultivos celulares), preferiblemente al habilitar o mejorar su interacción con la diana. Preferiblemente, no se incluyen la aceleración, prolongación o mejora de las respuestas inmunitarias específicas para antígenos. La eficacia terapéutica incluye, pero no se limita a, un efecto terapéutico más fuerte, preferiblemente con dosis más bajas y/o con menos efectos secundarios. "Mejorar un efecto de una porción efectora" también puede significar que una porción efectora, que no podría usarse debido a la falta de efecto (y, por ejemplo, que no se conocía como porción efectora), se vuelve eficaz cuando se usa en combinación con la presente invención. Cualquier otro efecto, que sea beneficioso o deseado y pueda atribuirse a la combinación de la porción efectora y la saponina, según lo proporcionado por la invención, se considera "un efecto mejorado". En una forma de realización, la estructura de base que comprende saponina o saponinas unidas y comprendidas por el conjugado de la invención mejora un efecto de la porción efectora comprendida dicho conjugado cuyo efecto se pretende y/o se desea. En el caso de un conjugado que comprende saponina unida a una estructura de base proteica, la estructura polimérica proteica de la estructura de base como tal puede tener, por ejemplo, un efecto sobre la presión osmótica coloide en el torrente sanguíneo. Si tal efecto no es el efecto pretendido o deseado de tal estructura de base funcionalizada comprendida por el conjugado, la estructura proteica de la estructura de base no es una porción efectora como se define en la invención. O, por ejemplo, en el caso de una estructura de base basada en ADN o ARN que lleva saponinas unidas y está compuesto por el conjugado, partes de ese ADN o ARN pueden tener una función (no intencionada), por ejemplo, interferir con la expresión. Si tal interferencia no es el efecto pretendido o deseado de la estructura de base funcionalizada final, la estructura polimérica de ADN o ARN de la estructura de base no es la porción efectora como se define en la invención.
[0200] Se pueden formular varias características preferidas para potenciadores del escape endosomal comprendidos por el conjugado de la invención, es decir, un glucósido o saponina, preferiblemente una saponina según la invención: (1) preferiblemente no son tóxicos y no invocan una respuesta inmune, ( 2) preferiblemente no median en la captación citosólica de la porción efectora en células no diana, (3) su presencia en el sitio de acción se sincroniza preferiblemente con la presencia de la porción efectora, (4) son preferiblemente biodegradables o excretables y (5) preferiblemente no interfieren sustancialmente con los procesos biológicos del organismo no relacionados con la actividad biológica de la molécula efectora con la que se combina el potenciador del escape endosomal, por ejemplo, no interactúan con las hormonas. Algunos ejemplos de moléculas de glucósidos como las saponinas de la invención que cumplen con los criterios mencionados, al menos hasta cierto punto, son los triterpenos bisdesmosídicos, preferiblemente las saponinas triterpénicas bisdesmosídicas, tales como SO1861, SA1641, QS-21, GE1741, y las saponinas de la Tabla A1, Esquema I.
[0201] Una forma de realización es el conjugado de la invención, como el conjugado anticuerpo-fármaco o conjugado anticuerpo-oligonucleótido o conjugado ligando-fármaco de la invención, en donde el anticuerpo puede unirse a cualquiera de CD71, CA125, EpCAM (17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP, EGF-IR, integrina , sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina , Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD38, FGFR3, CD7 , PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente CD71, HER2, EGFR, y/o es o comprende cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab, obinutuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-9 anti-CD71 del tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, anticuerpo monoclonal OKT-10 anti-CD38, un anticuerpo de la Tabla A2 o Tabla A3 o Tabla A4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión al receptor de la célula tumoral del mismo y/o al menos un dominio de unión al receptor de la célula tumoral del mismo, y/o en el que el conjugado anticuerpo-fármaco comprende cualquiera de Gemtuzumab ozogamicina, Brentuximab vedotina, Trastuzumab emtansina, Inotuzumab ozogamicina, Moxetumomab pasudotox y Polatuzumab vedotina y un conjugado anticuerpo-fármaco de la Tabla A2 y la Tabla A3, o donde el conjugado ligando-fármaco comprende al menos un ligando para la unión a una molécula de la superficie celular tal como EGF o una citocina.
[0202] Como se ha mencionado antes, la al menos una saponina que está comprendida por el conjugado según la invención aumenta la eficacia de al menos porciones efectoras actuales y nuevas como se define en esta invención. Los efectos secundarios potenciales disminuirán debido a la disminución de la dosis de la porción efectora comprendida por el conjugado, sin disminuir la eficacia. Por tanto, la invención proporciona un conjugado según la invención para su uso en medicina o para su uso como medicamento. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a un conjugado según la invención, el cual comprende al menos una saponina y al menos una porción efectora, para su uso como medicamento. También se prevé el uso de u conjugado según la invención para la fabricación de un medicamento. Especialmente los medicamentos contra el cáncer, y en particular los medicamentos de quimioterapia clásicos, son notorios por sus efectos secundarios. Debido al direccionamiento y la sincronización tanto en tiempo como en lugar de la sustancia farmacéuticamente activa comprendida por el conjugado y de la saponina comprendida por la misma molécula del conjugado, un conjugado terapéutico según la invención es especialmente valioso para su uso como medicamento, en particular para su uso en un método de tratamiento del cáncer. Por lo tanto, la invención proporciona un conjugado terapéutico según la invención para su uso en un método de tratamiento del cáncer. La invención también proporciona un conjugado terapéutico según la invención para su uso en un método de tratamiento de trastornos adquiridos o hereditarios, en particular trastornos de defecto monogénico. Por tanto, el conjugado terapéutico comprende la al menos una saponina y la al menos una porción efectora. Por tanto, un aspecto de la invención se refiere a un conjugado terapéutico según la invención, donde el conjugado comprende una porción efectora unida de manera covalente y comprende una saponina unida de manera covalente, para su uso en un método para el tratamiento de un cáncer o una enfermedad autoinmune.
[0203] Una aplicación adicional del conjugado de la invención en medicina es la sustitución de enzimas intracelulares en células diana que producen estas enzimas en cantidad insuficiente o con funcionalidad insuficiente. La enfermedad resultante puede ser hereditaria o adquirida. En la mayoría de los casos, solo es posible el tratamiento sintomático y, para una serie de enfermedades raras, la insuficiencia de opciones de tratamiento conduce a una menor esperanza de vida de los pacientes afectados. Un ejemplo de tal enfermedad es la fenilcetonuria, que es un error innato del metabolismo que da como resultado una disminución del metabolismo del aminoácido fenilalanina. La enfermedad se caracteriza por mutaciones en el gen de la enzima hepática fenilalanina hidroxilasa. La fenilcetonuria no tiene cura hasta la fecha. La incidencia es de aproximadamente 1:10000, con la incidencia más alta conocida en Turquía con 1:2600. Se puede usar una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprendida por el conjugado de la invención, preferiblemente un anticuerpo, con fenilalanina hidroxilasa unida o con un polinucleótido unido que codifica fenilalanina hidroxilasa para actuar en las células hepáticas mediante el uso de un anticuerpo específico adecuado y para sustituir la enzima defectuosa en los hepatocitos. Este es un ejemplo de uso del conjugado terapéutico de la invención que comprende una saponina unida a este y una enzima o el oligonucleótido unido a esta misma según la invención, para la sustitución o la terapia génica. En una forma de realización preferida, se proporciona un conjugado terapéutico según la invención para su uso en un método de terapia génica o terapia de sustitución.
[0204] Con el conjugado de la invención ahora es posible diseñar y fabricar una tecnología de administración de genes de un solo componente, no viral y aplicable clínicamente. Por ejemplo, el conjugado de la invención permite el desarrollo de tecnología de administración de genes no basada en virus, que mejora la eficacia terapéutica con dosis terapéuticas más bajas, mejorando así la salud de los pacientes. El conjugado de la invención, en particular cuando comprende una molécula unida de manera covalente dirigida a una molécula de la superficie celular tal como un anticuerpo monoclonal para unirse a una molécula específica de superficie celular (tumoral, autoinmune), y cuando se une a una porción efectora tal como un oligonucleótido, por ejemplo un BNA, permite superar un obstáculo importante y existente desde hace mucho tiempo en el campo de la administración de genes, a saber, la transferencia eficiente, segura y rentable de productos terapéuticos génicos a través de la membrana endosomal al citosol/nucleosol. De hecho, la terapia génica es una de las opciones de tratamiento más prometedoras para futuras terapias avanzadas en una amplia gama de enfermedades. La administración exitosa del gen requiere el reconocimiento de las células diana, así como la captación citosólica y nucleosólica del gen. Uno de los principales problemas en el campo de la terapia génica no viral es la administración ineficiente e insuficientemente segura de material genético para su uso terapéutico en pacientes.
[0205] Por lo tanto, al aplicar el conjugado de la invención, que comprende una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular de una célula como un ligando o preferiblemente un anticuerpo (fragmento, dominio del mismo) y que comprende un oligonucleótido como un BNA antisentido, los inventores han hecho posible superar un obstáculo importante y existente desde hace mucho tiempo en el campo de la entrega de genes: la transferencia segura de productos terapéuticos genéticos a través de la membrana endosomal al citosol/nucleosol. El conjugado de la invención representa una tecnología diseñada para permitir el direccionamiento hacia cualquier tipo de célula sobre la que se pueda actuar con todos los agentes genéticos conocidos, asegurando así una mejor terapia del paciente no limitada a los trastornos hereditarios, sino también para la terapia del cáncer y, por lo tanto, de importancia para grandes grupos de pacientes. La tecnología basada en el conjugado de la invención puede comprender una estructura de base polimérica u oligomérica que sirva como portador de potenciadores del escape endosomal (EEE), como las saponinas de la Tabla A1 y el Esquema I y cualquiera de las formas de realización según la invención, para la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular tal como un ligando o un anticuerpo (monoclonal) de acción específica (específico para células tumorales), y para la porción efectora, en este caso un gen efector tal como un lNa o BNA. El uso del conjugado de la invención, por ejemplo, que comprende un (fragmento de) anticuerpo dirigido a células y un oligonucleótido como un BNA, tiene potencial para llevar cualquier tipo de macromoléculas biológicas al citosol y al núcleo. Numerosos grupos de investigación y empresas de todo el mundo investigan continuamente el desarrollo de nuevos ligandos y anticuerpos monoclonales de acción específica (humanos, humanizados). Lo mismo para los oligonucleótidos que están destinados administrarse en el citosol de células enfermas, tales como células cancerosas. Por lo tanto, el conjugado de la invención también se presenta como una interfaz molecular en la que los ligandos y anticuerpos de acción específica presentes y futuros y los oligonucleótidos terapéuticos presentes y futuros (así como las cargas útiles tales como toxinas proteicas) están unidos o pueden unirse, por ejemplo, a una estructura de base oligomérica o polimérica de de la invención por química clic, lo que permite aplicaciones de fármacos personalizadas y futuros desarrollos en el campo de las técnicas de selección de células y tejidos. El conjugado de la invención puede comprender anticuerpos y ligandos como la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular El mercado mundial de terapias génicas está creciendo rápidamente y cubre tratamientos potenciales para una amplia gama de áreas de enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, el Parkinson, el Alzheimer, el VIH y muchas enfermedades raras (monogénicas). Las tecnologías terapéuticas génicas basadas en vectores virales actuales presentan problemas importantes, como la seguridad, la logística de fabricación y los altos costes asociados. El conjugado de la invención permite su uso en una plataforma tecnológica que representa una alternativa para una tecnología actual de administración de genes virales. Por lo tanto, el conjugado de la invención es adecuado para implementar en enfoques para desarrollar tratamientos génicos no virales para enfermedades tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, infección por VIH y muchas enfermedades raras (monogénicas). El conjugado de la invención es adecuado para desarrollar tratamientos novedosos para transformar el campo de los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) y las terapias basadas en oligonucleótidos mediante la elaboración de terapias génicas basadas en vectores no virales, como las basadas en BNA antisentido dirigido. La aplicación del conjugado de la invención, en particular en un conjugado covalente con un anticuerpo y un oligonucleótido tal como un BNA y al menos una saponina, es uno de los muchos enfoques beneficiosos que son posibles gracias a la presente invención. Por ejemplo, el uso del conjugado de la invención ahora permite la explotación de la vía endocítica de células de mamífero. La endocitosis se aprovecha para la administración de agentes terapéuticos, en los que el conjugado de la invención contribuye a mejorar la captación y el escape endosomal de, por ejemplo, ARNip que están comprendidos por el conjugado. El conjugado de la invención se usa adecuadamente junto con moléculas pequeñas que actúan como potenciadores de la administración, por ejemplo, cargas útiles, oligonucleótidos. Por lo tanto, el conjugado de la invención que lleva el oligonucleótido unido de manera covalente, como un BNA, y que lleva la porción de direccionamiento celular unida de manera covalente, como un ligando, y preferiblemente un anticuerpo (dominio o fragmento) y que lleva las saponinas de la invención proporciona una solución para el problema actual que se observa con los potenciadores del escape endosomal actuales y el producto terapéutico génico, en relación con su aplicación como dos componentes, lo que complica la aprobación terapéutica y la aplicabilidad clínica, ya que tal conjugado de la invención es una molécula terapéutica de un solo conjugado que abarca la saponina, el producto génico tal como un BNA y la porción dirigida a la célula (tumoral) tal como un anticuerpo (monoclonal). Por lo tanto, la invención proporciona una tecnología de administración de genes no virales en la que los potenciadores del escape endosomal (por ejemplo, los glucósidos de La Tabla A1, Esquema I, formas de realización de la invención), el producto terapéutico génico (oligonucleótidos según la invención, como un BNA) y el ligando o anticuerpo de acción específica (según, por ejemplo, la Tabla A2, A3, A4, formas de realización de la invención) están todos comprendidos por el conjugado de la invención. Tal conjugado de la invención proporciona así oportunidades terapéuticas para fármacos macromoleculares actuales y futuros para una amplia gama de enfermedades y grandes grupos de pacientes. Con la aplicación de dicho conjugado de la invención que comprende al menos una saponina, al menos un oligonucleótido y al menos una inmunoglobulina específica dirigida a células, se aborda el problema evidente de los métodos actuales de aplicación de potenciadores del escape endosomal y productos terapéuticos génicos por separado, los cuales no aseguran que ambos compuestos estén al mismo tiempo en el sitio de interacción. Este problema se supera ahora usando el conjugado de la invención. Es decir, dicho conjugado de la invención proporciona una tecnología de administración de genes no virales con una mayor sincronización (en cuanto al tiempo y lugar) de ambos compuestos, es decir, la saponina y el producto génico como un BNA.
[0206] Las terapias génicas podrían ayudar con enfermedades hereditarias previamente incurables, como la fibrosis quística, la corea, la enfermedad de Huntington o la hemofilia. Sin embargo, actualmente no se han superado algunos problemas: por ejemplo, los genes terapéuticos deben llegar con precisión a células diana específicas en el cuerpo. Por otro lado, los genes terapéuticos deberían ser absorbidos por las células diana, pero los genes terapéuticos no deberían destruirse. Los enfoques actuales de la terapia génica utilizan los virus como un transbordador para los genes. Sin embargo, estos procedimientos implican riesgos considerables y no pueden trasladarse a la introducción de otras biomoléculas. Una forma de realización es el conjugado de la invención que comprende glucósidos (derivados de plantas) para usar una tecnología de plataforma que permite no solo la administración de genes cuando está compuesto por el conjugado como molécula portadora, sino que también permite la administración de diferentes biomoléculas terapéuticas que se introducirán en las células diana. Por tanto, el conjugado de la invención se utiliza para desarrollar tratamientos a base de ácidos nucleicos para la fibrosis quística, la corea, la enfermedad de Huntington o la hemofilia. Según el presente documento, con el conjugado de la invención, está disponible una nueva estrategia de terapia génica para mejorar la salud de los pacientes con enfermedades genéticas, incluidos aquellos pacientes con fibrosis quística, enfermedad de Huntington y hemofilia. Como parte de la invención, se desarrolla una tecnología de administración de genes no virales que combina potenciadores del escape endosomal derivados de plantas (glucósidos), productos terapéuticos de genes y un ligando de acción específica que están todos comprendidos en un solo conjugado. La terapia génica no viral resultante basada en el conjugado de la invención muestra una eficiencia de administración aproximadamente 40 veces mayor a una dosis más baja que las estrategias actualmente disponibles. Por lo tanto, el conjugado de la invención es para uso en aplicaciones clínicas tales como la reparación o sustitución de genes defectuosos, como en pacientes con fibrosis quística, y para la administración dirigida de genes específicos, por ejemplo, para destruir células cancerosas. De hecho, el conjugado de la invención es adecuado para su aplicación en regímenes de tratamiento para cualquier enfermedad causada por un defecto genético, como la fibrosis quística, la enfermedad de Huntington y la hemofilia, y que actualmente son incurables. La terapia génica que hace uso del conjugado de la invención ayuda a superar dos problemas actuales: en primer lugar, con el conjugado de la invención es posible administrar genes terapéuticos a células diana específicas del cuerpo; en segundo lugar, los genes terapéuticos entran en el interior de estas células, pero no se destruyen, debido a la presencia de saponina(s), el producto de oligonucleótido y una porción de direccionamiento como un anticuerpo para unirse a una célula diana, todos unidos de manera covalente en el conjugado de la invención, por ejemplo usando una estructura de base oligomérica o polimérica de la invención.
[0207] La presente invención también proporciona un conjugado terapéutico según la invención para su uso en un método para tratar el cáncer, donde el método comprende administrar un medicamento que comprende el conjugado terapéutico a un paciente que lo necesite, preferiblemente administrar una dosis eficaz de dicho medicamento a un paciente que lo necesite, preferiblemente un paciente de cáncer humano.
[0208] Las consideraciones relativas a las formas adecuadas para la administración se conocen en la técnica e incluyen efectos tóxicos, solubilidad, vía de administración y mantenimiento de la actividad. Por ejemplo, las composiciones farmacológicas inyectadas en el torrente sanguíneo deben ser solubles.
[0209] Las formas galénicas adecuadas dependen en parte del uso o la vía de entrada, por ejemplo, transdérmica o por inyección. Tales formas galénicas deberían permitir que el compuesto alcance una célula diana si la célula diana está presente en un huésped multicelular. Se conocen otros factores en la técnica e incluyen consideraciones, tales como la toxicidad y la forma galénica, que retardan el efecto del compuesto o la composición.
[0210] Un aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende un recipiente que contiene un conjugado potenciador del escape endosomal según la invención, donde el kit también comprende instrucciones para usar el conjugado.
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TABLA A2- ADC que se investigaron previamente en el entorno clínico humano y posteriormente se retiraron de
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[0211] Forma parte de la invención que el conjugado terapéutico se combine además con un conjugado covalente (complejo) de una molécula o un resto de unión y una saponina, o se combine además con un compuesto farmacéutico, un anticuerpo, etc., proporcionando así una composición que comprende dos o incluso tres o más potenciadores, ingredientes farmacéuticamente activos, etc., por ejemplo, un conjugado de la invención combinado con un resto de unión complejado con una molécula efectora, opcionalmente combinado además con una inmunoglobulina, un dominio o un fragmento de la misma. Además, una forma de realización es el conjugado terapéutico de la invención, donde la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular está provista de dos o más porciones efectoras, tal como una toxina o inmunotoxina, donde las dos o más porciones efectoras son iguales o diferentes.
Formas de realización ejemplares
[0212] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, donde la saponina es preferiblemente una saponina que se puede aislar de la especie Gypsophila o Saponaria, más preferiblemente la saponina es la saponina SO1861 o cualquiera de sus diastereómeros.
[0213] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, donde la molécula de la superficie celular se selecciona de cualquiera de HER2, EGFR, CD20, CD22, Receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV, CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD33, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrinaA4, MUC1, Trop2, CEACAM5, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3, CD71.
[0214] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, donde una porción conectora se une a la saponina mediante un enlace escindible, donde preferiblemente dicho enlace escindible se escinde en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o condiciones inducidas por luz, y preferiblemente el enlace escindible es un enlace covalente, preferiblemente un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano o un enlace éster, donde preferiblemente el enlace escindible es un puente disulfuro o un enlace peptídico.
[0215] Una forma de realización es el conjugado potenciador del escape endosomal de la invención, donde el resto de saponina es una saponina terminal, preferiblemente la saponina SO1861, la porción conectora es una porción conectora química que une covalentemente la saponina a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular del conjugado de la invención, donde la porción conectora proporciona preferiblemente un enlace escindible entre el resto de saponina terminal y la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprendida por el conjugado.
[0216] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la saponina es un triterpeno bisdesmosídico.
[0217] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica.
[0218] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la saponina es una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un aldehído en la posición 23.
[0219] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la saponina es una saponina que puede aislarse de especies de Gypsophila o Saponaria.
[0220] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la saponina es una S01861 o cualquiera de sus diastereómeros.
[0221] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la al menos una saponina se une a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular (sitio de unión para el epítopo en la molécula de la superficie celular) a través de un enlace escindible, donde preferiblemente dicho enlace escindible se escinde en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por luz, y donde el enlace escindible preferiblemente es un puente disulfuro o un enlace peptídico.
[0222 Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde el enlace escindible es un enlace covalente, preferiblemente un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano o un enlace éster.
[0223] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde el conjugado potenciador del escape endosomal comprende un número definido de glucósidos o un rango definido.
[0224] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde el rango definido está entre 1-30 glucósido(s), preferiblemente entre 1-20, más preferiblemente entre 1-10, más preferiblemente entre 1-6, más preferiblemente entre 2-6, más preferiblemente entre 2-5, más preferiblemente entre 3-5, más preferiblemente entre 3-4 glucósidos.
[0225] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la porción efectora es una sustancia farmacéuticamente activa, tal como una toxina tal como una toxina proteica, un fármaco, un polipéptido o un polinucleótido.
[0226] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la célula diana es una célula enferma o una célula relacionada con una enfermedad, preferiblemente una célula tumoral o una célula asociada a un tumor (por ejemplo, una célula vascular tumoral), o una célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T regulador) o una célula autoinmune.
[0227] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la al menos una porción efectora está unida a la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprendida por el conjugado mediante un enlace escindible, donde preferiblemente dicho enlace escindible se escinde en condiciones ácidas, reductoras, condiciones enzimáticas o inducidas por luz, y/o en las que el enlace escindible es un puente disulfuro o un enlace peptídico.
[0228] Una forma de realización es el conjugado según la invención, donde la saponina es capaz de aumentar el escape endosomal de la molécula efectora.
[0229] Una forma de realización es el conjugado según la invención, para su uso como medicamento.
[0230] Una forma de realización es la composición farmacéutica que comprende un conjugado según la invención (formas de realización anteriores) y un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0231] Una forma de realización es la composición farmacéutica según la invención, que comprende además al menos otro ingrediente farmacéuticamente activo adicional, tal como una inmunoglobulina adicional.
[0232] Una forma de realización es el conjugado para su uso según la invención, o la composición farmacéutica según la invención, para su uso en un método de tratamiento del cáncer o de una enfermedad autoinmune.
[0233] Una forma de realización es un método para el tratamiento del cáncer, método que comprende administrar un conjugado según la invención a un paciente que lo necesite.
[0234] Una forma de realización es el método para el tratamiento del cáncer, método que comprende administrar una composición farmacéutica según la invención a un paciente que lo necesite.
[0235] Una forma de realización es un kit que comprende un recipiente que contiene un conjugado potenciador del escape endosomal según la invención, donde el kit comprende además instrucciones para usar las moléculas de unión.
[0236] La estructura de base que comprende al menos una saponina según la invención es adecuada para su uso como un producto semiacabado para la fabricación de un ADC funcionalizado o un A0C funcionalizado, donde el ADC funcionalizado o el 0AC funcionalizado comprende al menos una saponina unida covalentemente de la invención y al menos una porción efectora de la invención. Una forma de realización es la estructura de base de la invención, que comprende además una carga útil o porción efectora de la invención, tal como una toxina o un oligonucleótido unido covalentemente a la estructura de base de la invención, ya sea directamente o mediante una porción conectora de la invención, preferiblemente una porción conectora escindible de la invención. Tal estructura de base funcionalizada se puede utilizar para crear un conjugado ADC-saponina o un conjugado A0C-saponina que comprende dicha estructura de base con la estructura de base unida a él y con una porción efectora unida a esta. Por ejemplo, tal ADC u 0AC funcionalizado comprende 2-4 saponinas unidas covalentemente a, por ejemplo, una cadena lateral de cisteína el conjugado según la invención tal como una molécula dirigida a una molécula de la superficie celular unida de manera covalente, que es por ejemplo un ligando o un anticuerpo (fragmento), ya sea directamente o mediante una porción conectora (escindible), o dicho ADC u 0AC funcionalizado comprende, por ejemplo, un dendrón, tal como un dendrón G4, que comprende 1-16 saponinas unidas covalentemente al mismo, donde el dendrón está unido covalentemente a, por ejemplo, una cadena lateral de cisteína y/o una cadena lateral de lisina de la molécula dirigida a una molécula de la superficie celular comprendida por el conjugado según la invención.
[0237] Un aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el conjugado de la invención y, opcionalmente, un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico y/o un diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
[0238] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado de la invención o se refiere a la composición farmacéutica de la invención, para su uso como medicamento.
[0239] Un aspecto de la invención se refiere a un conjugado de la invención o se refiere a la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento o la prevención de un cáncer o de una enfermedad autoinmune.
[0240] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos
EJEMPLOS
EJEMPLO A - EL TRATAMIENTO DE UN MAMÍFERO CON TUMOR CON UN CONJUGADO DE LA INVENCIÓN EN COMBINACIÓN CON UN ADC RESULTA EN SUPERVIVENCIA Y REGRESIÓN TUMORAL
[0241] Se inyectó por vía subcutánea a ratones nude Balb/c hembra una suspensión de células tumorales A431 humanas. Debajo de la piel de los ratones, se desarrolló un carcinoma epidérmico humano en el modelo de tumor animal de xenoinjerto. Después de la inyección de las células tumorales, se permitió que el tumor del xenoinjerto se desarrollara hasta un tamaño de aproximadamente 170-180 mm3. Las células tumorales A431 tienen las siguientes características: expresión de EGFR alta, expresión CD71 media, expresión de HER2 baja. El modelo de tumor basado en células tumorales A431 es un modelo agresivo ya que, en comparación con otros tumores, es de crecimiento rápido.
[0242] En la Tabla A se presentan los resultados del tratamiento de ratones de control y ratones con tumores. Los ratones con tumores se trataron con los anticuerpos indicados dirigidos a Her2/neu humano, EGFR humano o CD71 humano, que son receptores de la superficie celular en el tumor xenoinjertado. Cetuximab se conjugó covalentemente con saponina SO1861. Primero se proporcionó a la SO1861 la porción conectora EMCH (hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico), ya que la EMCH es un reticulante de maleimida e hidrazida para la conjugación covalente de sulfhidrilos (cisteínas reducidas del anticuerpo) a carbonilos (aldehidos o cetonas; en este documento, el carbonilo del aldehído en la posición C-23 de la saponina). La saponina-EMCH se acopló covalentemente a cisteínas reducidas del Cetuximab, formando un enlace tio-éter covalente entre la EMCH y la cadena lateral de cisteína. Los ADC trastuzumab-saporina (conjugado covalente) y mAb anti-CD71 (OKT-9, IgG)-saporina (conjugado covalente) se evaluaron para determinar su eficacia de ataque tumoral en ratones, medida como volumen tumoral en el tiempo después del inicio del tratamiento con los ADC. La dosis de los ADC fue subóptima en el modelo de tumor. Es decir, a partir de experimentos previos, se estableció a qué dosis subóptima de los ADC no se observaría regresión tumoral o detención del crecimiento tumoral.
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[0243] Estos resultados demuestran que la terapia de combinación de un ADC a una dosis que es ineficaz cuando se tiene en cuenta el tratamiento de ratones con tumores con el ADC solo (crecimiento tumoral, no se evita la muerte de los ratones (eutanasia)), con un conjugado del invención que consiste en un anticuerpo dirigido a un receptor específico para las células tumorales unido covalentemente a una saponina, es decir, S01861, cuando el conjugado covalente se administra a ratones que padecen cáncer, en una dosis no eficaz cuando se administra solo (crecimientos tumorales, no se evita la muerte de los ratones (eutanasia)), proporciona un régimen de tratamiento eficiente y eficaz, expresado como tumores en regresión y supervivencia prolongada de los animales tratados (más allá de la duración del experimento). La dosis subóptima de ADC combinada con un conjugado de la invención que comprende saponina unido covalentemente que no tiene actividad antitumoral cuando se administra solo, proporciona así una opción de tratamiento eficaz para pacientes con cáncer, en donde una dosis relativamente baja de ADC es eficaz. Una dosis más baja de AdC conlleva la promesa de un menor riesgo de eventos adversos, o incluso ningún efecto secundario. Además, el efecto estimulante del conjugado que contiene saponina de la invención cuando se considera la eficacia del ADC, demuestra que los ADC que previamente han demostrado carecer de eficacia cuando se trata del tratamiento de pacientes con tumores, pueden ganar atención y un valor renovado, ya que la eficacia de los ADC mejora en el entorno de la terapia de combinación, como lo ha demostrado el ejemplo actual. Se hace referencia a la Tabla A2 y la Tabla A3, que resumen los ADC investigados previamente en el entorno clínico humano, pero que luego se retiraron de la investigación clínica adicional en el caso de algunos ADC. Especialmente los ADC para los que se interrumpió el desarrollo clínico debido a la falta de eficacia observada y/o debido a la aparición de un evento adverso inaceptable son los ADC que pueden ganar un valor renovado para los pacientes con cáncer cuando se combinan con un conjugado de la invención que comprende saponina unida covalentemente, como el conjugado cetuximab-saponina analizado.
EJEMPLO B - Mezcla de saponinas de Quillaja saponaria que comprende QS-21, con actividad potenciadora del escape endosomal/lisosomal
[0244] El esquema I muestra la estructura molecular común de una serie de saponinas QS-21 (parcialmente adaptado de: Conrado Pedebos, Laércio Pol-Fachin, Ramon Pons, Cilaine V. Teixeira Hugo Verli, Atomic Model and Micelle Dynamics of QS-21 Saponin, Molecules 2014, 19, 3744-3760). Una mezcla de saponinas hidrosolubles obtenidas de Quillaja saponaria (Sigma-Aldrich, producto No. S4521; Roth, Artículo No. 6857; InvivoGen, producto 'Quil-A') se puede aplicar en la composición del conjugado, composición o combinación potenciador/a del escape endosomal/lisosomal de la invención, basada en propiedades potenciadoras del escape endosomal/lisosomal de al menos una saponina individual presente en la mezcla, por ejemplo, QS-21, o basada en una combinación de dos o más de las saponinas que componen la mezcla, como QS-21 y QS-7.
[0245] Los inventores han demostrado que la mezcla de saponinas de Quillaja saponaria a una dosis de 2,5 microgramos/ml fue capaz de potenciar el escape endosomal de diantina, como se demostró con células tumorales de mamíferos en un bioensayo realizado en células. La porción efectora expuesta a las células fue diantina unida covalentemente al ligando EGF: EGF-diantina. Las células analizadas fueron líneas celulares tumorales HeLa para saponinas libres, y A431, MDA-MB-468, CaSki y A2058 para evaluar las saponinas unidas covalentemente a cetuximab.
Ejemplo 1
[0246] Se conjugó SO1861 (lábil) mediante residuos de cisteína (Cys) y se conjugó diantina (toxina proteica) (estable) mediante residuos de lisina (Lys) con cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), dando como resultado la producción de: Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2. El conjugado se analizó en un modelo de tumor xenógrafo de ratón A431 (EGFR++) para observar la muerte de células diana tumorales EGFR como se ilustra en la Figura 9. La administración comenzó el día 12, cuando los tumores alcanzaron ~150 mm3, y se determinó el volumen del tumor después de la administración de cada dosis. Se trató a ratones (n = 3) (vía intraperitoneal; i.p.; con dosis en aumento) a razón de: día 12: 0,5 mg/kg; día 15: 1 mg/kg y día 24: 1,5 mg/kg con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2 o cetuximab-(Lys-S-diantina)1,6. El día 26, en comparación con el grupo de control, se pudo observar una reducción del volumen del tumor en los ratones con tumores tratados con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2 (Figura 1A). Esto demuestra que la conjugación lábil de SO1861 a un conjugado anticuerpo-toxina proteica (estable) puede mejorar la eficacia terapéutica dirigida de la toxina proteica-anticuerpo dirigida al tumor, induciendo así una terapia dirigida al tumor más eficaz.
[0247] A continuación, se conjugó SO1861 (lábil) mediante residuos de cisteína (Cys) y diantina (toxina proteica) se conjugó (lábil) mediante residuos de lisina (Lys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFR humano), dando como resultado la producción de: Cetuximab-(Cys-L-S01861)3,9(Lys-L-diantina)2. El conjugado se analizó en un modelo de tumor xenógrafo de ratón A431 (EGFR++) para observar la muerte de células diana de tumor EGFR como se ilustra en la Figura 9. La administración de las dosis comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 y se determinó el volumen del tumor después de la administración de cada dosis. Se trataron ratones (n = 3) (intraperitoneal; i.p .; aumento de la dosis) el día 12: 0,5 mg/kg; día 15: 1 mg/kg, día 24: 1,5 mg/kg con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 o cetuximab-(Lys-L-diantina)1,6. Esto reveló que después de 35 días en comparación con el control, los ratones con tumores tratados con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 mostró inhibición del crecimiento tumoral (Figura 1B). Cuando los ratones (n = 3; fueron tratados (intravenoso, iv; aumento de la dosis) día 12 : 0,5 mg/kg; día 15: 1 mg/kg, día 18: 2 mg/kg, día 24: 2,5 mg/kg con cetuximab-( Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 de acuerdo con la invención también se pudo observar la inhibición del crecimiento tumoral en comparación con el control (los datos representan 1 ratón, ya que 2 ratones murieron durante los tratamientos). Esto demuestra que la conjugación lábil de SO1861 con un conjugado anticuerpo-toxina proteica (lábil) puede mejorar la eficacia terapéutica dirigida de la toxina proteica-anticuerpo dirigida al tumor, induciendo así una terapia dirigida al tumor más eficaz.
[0248] A continuación, S01861-EMCH se conjugó mediante residuos de cisteína (Cys) a cetuximab (anticuerpo monoclonal que reconoce y se une al EGFr humano), con un DAR 3,9 y el oligonudeótido antisentido HSP27BNA (dirigiendo e induciendo la degradación de la onco-diana hsp27 ARNm (silenciamiento génico) en células cancerosas) a través de una porción conectora lábil (L) a los residuos de lisina (Lys) del anticuerpo, con un DAR 1,8 que da como resultado la producción de cetuximab-(Cys-L-S01861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8. Cetuximab-(Cys-L-S01861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8 se analizó en un modelo de tumor de ratón 'nude' xenógrafo A431 para el silenciamiento del gen HSP27 dirigido a tumores mediado por EGFR, de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 10. La administración comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 de tamaño y se determinó la expresión en el ARNm de HSP27. Para ello, se recogieron muestras tumorales 72 h después de la primera administración y se analizaron los niveles de expresión del gen HSP27 en comparación con los niveles de expresión en el ARNm de control celular (genes de referencia). En ratones con tumores (n = 3) tratados (intraperitoneal; i.p.,) con 30 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-S01861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8 se observó, después de 1 dosis, una reducción del 40 % en la expresión en el ARNm de HSP27 en los tumores en comparación con una dosis única de cetuximab-(Cys-L-S01861)3,8 o cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)1,5 (Figura 2). En comparación con el tumor del control con vehículo, se observó una reducción del 25 % de la expresión del gen HSP27. Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 y HSP27BNA con el mismo anticuerpo de direccionamiento, según la invención, induce eficazmente la liberación citoplasmática mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en tumores sólidos de ratones con tumores, lo que induce el silenciamiento génico con tumor. En otro ejemplo, se diseñó y produjo una estructura de base de porción conectora trifuncional con 3 grupos finales químicos específicos para la conjugación con SO1861 en un brazo y el HSP27BNA en el otro brazo para producir SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA. A continuación, se conjugó SOO861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA con su tercer brazo a residuos de cisteína (Cys) del anticuerpo anti-EGFR, cetuximab (cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7) y se analizó en un modelo de tumor de ratón 'nude' xenógrafo A431 su actividad de silenciamiento génico dirigido a tumores mediada por EGFR, de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 11. La administración de las dosis comenzó el día 12 cuando los tumores alcanzaron ~ 150 mm3 de tamaño y se determinó la expresión en el ARNm de HSP27. Para ello, se recogieron muestras tumorales 72 h después de la primera administración y se analizaron los niveles de expresión del gen HSP27 en comparación con los niveles de expresión en el ARNm de control celular (genes de referencia). Esto reveló que 1 dosis de 30 mg/kg de cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 resultó en una reducción del 40 % en la expresión del gen HSP27 en los tumores en comparación con la administración única de monoterapias de 25 mg/kg de cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8 o 25 mg/kg de cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 (Figura 3). En comparación con los tumores de control con vehículo, se observó una reducción del 25 % de la expresión del gen HSP27 en ratones con tumores tratados con 1 dosis de cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7. Esto demuestra y asegura que cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 induce eficazmente la administración citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en un tumor sólido de ratones con tumores, induciendo el silenciamiento génico dirigido, in vivo.
Ejemplo 2
[0249] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SOO861 (lábil) y la toxina proteica, diantina (lábil o estable) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a HER2, trastuzumab. Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 o trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7, se produjeron y evaluaron para observar la mejora en la destrucción celular en SK-BR-3 (He R2++) y MDA-MB-468 (HER2-) como se ilustra en la Figura 9. Tanto trastuzumab-(Cys-L-SOO861)3,8(Lys-L-diantina)1,7 (CI50 = 0,8 nM) como trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina) 1,7 (CI50 = 0,8 nM) inducen eficazmente la muerte celular de las células SK-b R-3 (HER2++) (Figura 4A). Esto no se observó en células SK-BR-3 tratadas con trastuzumab, trastuzumab-(Lys-L-diantina)1,7, trastuzumab-(Lys-S-diantina) 1,7 o trastuzumab-(L-SO1861)3,8 solo (Figura 4A). En células MdA-MB-468 (HE R2-) no se puede observar actividad de destrucción celular para ninguno de los conjugados, de acuerdo con la invención (Figura 4B). Esto demuestra que la conjugación de SO1861 a un conjugado de toxina proteica-anticuerpo dirigido a HER induce de manera eficaz la liberación citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de la toxina proteica en la célula diana, dando como resultado la destrucción de la célula diana.
[0250] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y la toxina proteica, diantina (lábil o estable) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a EGFR, cetuximab. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 o cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-diantina)2, se evaluó para observar la mejora de la destrucción celular en células A431 (EGFR++) y células A2058 (EGFR-) como se ilustra en la Figura 9. Tanto cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-diantina)2 (CI50 = 0,3 nM) como cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-diantina)1,7(CI50 = 0,3 nM) mostraron una mayor destrucción celular en células A431 (EGFr++) en comparación con cetuximab-(Lys-L-diantina) 1,6 (CI50 = 2 oM), cetuximab-(Lys-S-diantina) 1,6 (CI50f = 2 pM) solo (Figura 4C). En células a 2058 (EGFR-), la combinación de acuerdo con la invención no mostró ninguna actividad destructora de células (CI50> 200 nM; Figura 4D). Esto demuestra que la conjugación de SO1861 a un conjugado de toxina proteicaanticuerpo dirigido a EGFR mejora con eficacia la liberación citoplasmática mediada por SO1861 de la toxina proteica en la célula diana, lo que da como resultado una destrucción mejorada de las células diana.
Ejemplo 3
[0251] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y el oligonucleótido HSP27BNA (lábil) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a EGFR, cetuximab. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8 se analizó para observar el silenciamiento mejorado del gen HSP27 en células A431 (eGFr++) y células A2058 (EGFR), de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 10. Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8 induce de manera eficaz el silenciamiento del gen HSP27 en células A431 (CI50 = 3 nM) en comparación con cetuximab, cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)3,9 o cetuximab-(Cys-L-SOO861)3,8 solo (Figura 5A). En las células A2058 (EGFR) no se puede observar actividad de silenciamiento génico con cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3'8 (CI50> 100 nM; Figura 5B). Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 y HSP27BNA con el mismo anticuerpo de direccionamiento, según la invención, induce de manera eficaz la liberación citoplasmática mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en las células diana, induciendo el silenciamiento génico dirigido.
[0252] En otro ejemplo de acuerdo con la invención, SO1861 (lábil) y el oligonucleótido HSP27BNA (lábil) se conjugaron con el anticuerpo dirigido a HER2, trastuzumab. Se analizó Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5 para observar el silenciamiento del gen HSP27 mejorado en células Sk -BR-3 (HER2++), de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 10. Trastuzumab-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5 induce de manera eficaz el silenciamiento del gen HSP27 en células SK-BR-3 (CI50 = 9 nM) en comparación con trastuzumab-(Lys-L-HSP27BNA)4,4 solo (Figura 6 ). Esto demuestra y asegura que la conjugación de SO1861 y HSP27BNA con un anticuerpo dirigido a HER2, según la invención, induce de manera eficaz la liberación citoplasmática mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en las células diana, induciendo el silenciamiento génico dirigido.
[0253] En otro ejemplo, cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 se analizó para observar el silenciamiento mejorado del gen HSP27 en células A431 (EGFR++) y A2058 (EGFR-) de acuerdo con la invención como se ilustra en la Figura 11. Cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 induce de manera eficaz el silenciamiento del gen HSP27 en células A431 (CI50 = 2 nM) en comparación con Cetuximab-(Lys-L-HSP27BNA)4 o Cetuximab-(Cys-L-SO1861)3,7 solo (Figura 7A). En células A2058 (EGFR), la actividad de silenciamiento génico solo se observó a concentraciones altas (> 80 nM) de Cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 (CI50 = 100 nM; Figura 7B). Esto demuestra y asegura que, en células con alta expresión de EGFR, cetuximab-Cys-(SO1861-L-porción conectora trifuncional-L-HSP27BNA)3,7 induce de manera eficaz la administración citoplásmica mejorada mediada por SO1861 de un oligonucleótido antisentido terapéutico en las células diana, induciendo el silenciamiento génico dirigido.
Ejemplo 4
[0254] La Figura 8A-D muestra la viabilidad celular relativa cuando trastuzumab (Figura 8A), cetuximab (Figura 8 B) o T-DM1 (Figura 8 C), toxinas proteicas no conjugadas, saporina, diantina y saporina conjugados a un anticuerpo IgG (que no se une a las células) (Figura 8 D) se administran a diversas líneas de células cancerosas SK-BR-3, JIMT-1, MDA-MB-468, A431, CaSki, HeLa, A2058.
[0255] Trastuzumab y cetuximab no influyen o apenas influyen en la viabilidad celular cuando se exponen a la mayoría de las líneas celulares, con algún efecto sobre la inhibición del crecimiento celular mediante el bloqueo del grupo funcionall receptor del factor de crecimiento HER2 cuando trastuzumab se expone a células SK-BR-3 en dosis relativamente altas y con algún efecto sobre la inhibición del crecimiento celular mediante el bloqueo del grupo funcionall receptor del factor de crecimiento EGFR cuando cetuximab se expone a células MDA-MB-468 en dosis relativamente altas.
[0256] TDM-1, o ado-trastuzumab emtansina, es una terapia dirigida aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para el tratamiento del cáncer de mama metastásico HER2 positivo que se ha tratado previamente con Herceptin (nombre químico: trastuzumab) y quimioterapia con taxanos; del cáncer de mama positivo para HER2 en estadio temprano después de la cirugía si se ha encontrado enfermedad residual después del tratamiento neoadyuvante (antes de la cirugía) con Herceptin y quimioterapia con taxanos. El TDM-1 es una combinación de Herceptin (Trastuzumab) y emtansina, un medicamento de quimioterapia. La Figura 8 C muestra que el TDM-1 da como resultado una menor viabilidad celular para todas las líneas celulares analizadas a concentraciones >1000 pM
[0257] Las toxinas libres saporina y diantina y la toxina saporina unidas a una IgG de control sin afinidad por ninguna de las moléculas de la superficie celular en las líneas celulares analizadas no tienen o apenas tienen influencia sobre la viabilidad celular en un amplio rango de concentraciones de toxina analizadas, hasta 100000 pM (Figura 8 D).
Ejemplo 5
Síntesis de dendrón(-L-SO1861)n (Figura 13, 14, 15)
Materiales y métodos
Abreviaturas
[0258]
DCM diclorometano
DIPEA N, N-diisopropiletilamina
DMF N,N-dimetilformamida
EDCI.HCl Cloruro de 3-((etilimino)metilenamino)-N, N-dimetilpropan-1-aminio
EMCH.TFA hidrazida del ácido N-(£-maleimidocaproico), sal del ácido trifluoroacético
min minutos
t.r. tiempo de retención
TCEP clorhidrato de tris (2-carboxietil)fosfina
Temp temperatura
TFA ácido trifluoroacético
THF tetrahidrofurano
Métodos analíticos
Método LC-MS 1,1
[0259] Aparato: Bomba binaria Agilent 1200: G1312A, desgasificador; inyector automático de muestras, ColCom, DAD (detector de matriz de diodos): Agilent G1316A, 210, 220 y 220-320 nM, PDA (detector de matriz de fotodiodos: 210-320 nM, MSD (detector selectivo de masas): Agilent LC/MSD G6130B ESI, pos/neg 100-1000; ELSD Alltech 3300 con flujo de gas 1,5 ml/min, temperatura del gas: 40 °C; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters, 30 x 2,1 mm, 3,5 μM, temperatura: 35 °C, flujo: 1 ml/min, gradiente: te = 5 % A, t1,6min = 98 % A, t3min = 98 % A, tiempo de espera: 1,3 min, Eluyente A: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo, Eluyente B: ácido fórmico al 0,1 % en agua.
Método LC-MS 2, 2
[0260] Aparato: Bomba binaria Agilent 1260: G7112B, Inyector de muestras múltiple, compensación de columna, DAD: Agilent G7115A, 210, 220 y 220-320 nM, PDA: 210-320 nM, MSD: Agilent LC/MSD G6130B ESI, rangos de masa según el peso molecular del producto:
Apos/neg 100-1000
Bpos/neg 100-1400
; ELSD Alltech 3300 flujo de gas 1,5 ml/min, temperatura del gas: 40 °C; columna: XSelect ™ C18 de Waters, 30 x 2,1 mm, 3,5 μM, temperatura: 40 °C, flujo: 1 ml/min, gradiente: t0 = 5 % A, t1,6min = 98 % A, t3min = 98 % A, tiempo de espera: 1,3 min, Eluyente A: ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo, Eluyente B: ácido fórmico al 0,1 % en agua.
Método de LC-MS 3, 3
[0261] Aparato: Waters IClass; Bomba binaria: UPIBSM, SM: UPISMFTN con SO; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, pos/neg 800-1500; ELSD: presión de gas 40 psi, temperatura del tubo de derivación: 50 °C; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters, 50 x 2,1 mm, 2,5 μM Temperatura: 25 °C, Flujo: 0,6 ml/min, Gradiente: a = 5 % A, t230min = 98 % A, t2.7min = 98 % A, tiempo de espera: 0,3 min, Eluyente A: acetonitrilo, Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua (pH = 9,5).
Método LC-MS 4, 4
[0262] Aparato: Waters IClass; Bomba binaria: UPIBSM, SM: UPISMFTN con SO; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, pos/neg 1500-2500; ELSD: presión de gas 40 psi, temperatura del tubo de derivación: 50 °C; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters, 50 x 2,1 mm, 2,5 μM Temp: 25 °C, Flujo: 0,6 ml/min, Gradiente: a = 15 % A, t2,0min = 60 % A, t2,7min = 98 % A, tiempo de espera: 0,3 min, Eluyente A: acetonitrilo, Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua (pH = 9,5).
Método de LC-MS 5, 5
[0263] Aparato: Waters IClass; Bomba binaria: UPIBSM, SM: UPISMFTN con SO; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, rangos de masa en función del peso molecular del producto:
Apos/neg 1500-2500
Bneg 2000-3000
; ELSD: presión de gas 40 psi, temperatura del tubo de derivación: 50 °C; columna: Acquity C18, 50 x 2.1 mm, 1,7|_im Temp: 60 °C, Flujo: 0,6 ml/min, Gradiente: to = 2 % A, t5,0min = 50 % A, t6,0min = 98 % A, tiempo de espera: 1,0 min, Eluyente A: acetonitrilo, Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua (pH = 9,5).
Métodos preparativos
Método preparativo de MP-LC 1, -[0264] Tipo de instrumento: MPLC preparativa Reveleris™; columna: XSelect ™ CSH C18 de Waters (145x25 mm, 10 |j); Flujo: 40 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: bicarbonato de amonio 10 mm en agua pH = 9,0); Eluyente B: acetonitrilo al 99 % bicarbonato de amonio 10 mm al 1 % en agua; Gradiente: t0min = 5 % B, t1min = 5 % B, t2min = 10 % B, t^min = 50 % B, t1Smin = 100 % B, t23min = 100 % B; Detección UV: 210, 225, 285 nM.
Método preparativo de MP-LC 2, -[0265] Tipo de instrumento: MPLC preparativa Reveleris™; Columna: LUNA C18(3) de Phenomenex (150 x 25 mm, 10 j); Flujo: 40 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en agua, Eluyente B: ácido fórmico al 0,1 % (v/v) en acetonitrilo; Gradiente: tümin = 5 % B, t^in = 5 % B, t2min = 10 % B, t17min = 50 % B, t^min = 100 % B, t23min = 100 % B; Detección UV: 210, 225, 285 nM.
Método preparativo de LC-MS 1,3
[0266] Tipo de instrumento de MS: G6130B Quadrupole de Agilent Technologies; Tipo de instrumento de HPLC: 1290 preparative LC de Agilent Technologies; Columna: XSelect™ CSH de Waters (C18, 100 x 30 mm, 10 j); Flujo: 25 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: acetonitrilo al 100 %; Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua pH = 9,0; gradiente lineal en función de la polaridad del producto: At0 = 20 % A, t2min = 20 % A, t8,5min = 60 % A, t-|0min = 100 % A, t-|3min = 100 % A
Bt0 = 5 % A, t2min = 5 % A, t8,5min = 40 % A, t-|0min = 100 % A, t-|3min = 100 % A
Ct0 = 10 % A, t2min = 10 % A, t8,5min = 50 % A, t10min = 100 % A, t-|3min = 100 % A
; Detección: DAD (220-320 nM); Detección: MSD (ESI pos/neg) rango de masa: 100-800; Recolección de fracciones en función de DAD.
Método preparativo de LC-MS 2, -[0267] Tipo de instrumento MS: G6130B Quadrupole de Agilent Technologies; Tipo de instrumento de HPLC: 1290 preparative LC de Agilent Technologies; columna: XBridge Shield de Waters(C18, 150 x 19 mm, 5 j); Flujo: 25 ml/min; Temperatura de la columna: temperatura ambiente; Eluyente A: acetonitrilo al 100 %; Eluyente B: bicarbonato de amonio 10 mM en agua pH = 9,0; gradiente lineal: t0 = 5 % A, t2,5min = 5 % A, tnmin = 40 % A, t13min = 100 % A, t17min = 100 % A; Detección: DAD (220-320 nM); Detección: MSD (ESI pos/neg) rango de masa: 100­ 800; Recolección de fracciones en función de DAD
Cromatografía flash
[0268] Grace Reveleris X2® C-815 Flash; Sistema de suministro de disolvente: bomba de 3 pistones con cebado automático, 4 canales independientes con hasta 4 disolventes en un solo cromatograma, líneas de conmutación automática cuando se agota el disolvente; caudal máximo de la bomba 250 ml/min; presión máxima 50 bar (725 psi); Detección: UV 200-400nm, combinación de hasta 4 señales UV y barrido de todo el rango UV, ELSD; Tamaños de columna: 4-330g en instrumento, tipo luer, 750g hasta 3000g con soporte opcional.
Síntesis de SO1861-EMCH (Figura 13)
[0269] Se añadió metanol (extra seco, 3,00 ml) y TFA (0,020 ml, 0,260 mmol) a S01861 (121 mg, 0,065 mmol) y EMCH.TFA (110 mg, 0,325 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se sometió a MP-LC preparativa1. Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (120 mg, 90 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 96 %.
LRMS (m/z): 2069 [M-1]1'
T.r. LC-MS (min): 1,084
Síntesis de dendrón(-L-S01861)4 (Figura 53)
Intermedio 1:
(((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo
[0270] Se disolvieron ácido 6 -azidohexanoico (0,943 g, 6,00 mmol), EDCI.HCl (1,21 g, 6,30 mmol) y Oxyma Pure (0,938 g, 6,60 mmol) en DMF (10,0 ml) y la mezcla se agitó durante 5 min. A continuación, se añadió una solución de (azanodiilbis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo (1,82 g, 6,00 mmol) en DMF (5,00 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 5 horas, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (50 ml), una solución saturada de bicarbonato de sodio (2 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (gradiente de acetato de etilo-heptano, 10:90 aumentando hasta 100:0) para dar el compuesto del título (2,67 g, 100 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 98 %.
LRMS (m/z): 287/343/465 [M-155/M-99/M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 2,022A
Intermedio 2:
Dihidrocloruro de N,N-bis(2-aminoetil)-6-azidohexanamida
[0271] Se añadió HCl en isopropanol (5-6 N, 20,0 ml, 110 mmol) a (((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))dicarbamato de di-tert-butilo (2 ,66 g, 6 ,00 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 4 horas, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo (1,49 g, 79 %) como un sólido blanco.
[0272] LRMS (m/z): 243 [M 1]1+
Intermedio 3:
((5S,5'S)-((((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(6-oxohexano-6,1,5-triil))tetracarbamato de tetra-tert-butilo
[0273] A una solución de diclorhidrato de N,N-bis (2-aminoetil)-6-azidohexanamida (1,19 g, 3,76 mmol) en DMF (30,0 ml) y DIPEA (2,62 ml, 15,1 mmol) se le añadió Boc-Lys(Boc)-OOp (3,69 g, 7,90 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (100 ml) y una solución saturada de bicarbonato de sodio (5 x 100 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando hasta 0:100) para dar el producto del título (3,07 g, 91 %) como un sólido ligeramente amarillento. Pureza basada en LC-MS 94 %.
LRMS (m/z): 800/900/922 [M-99/M 1/M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 2.172A
Intermedio 4
3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo
[0274] 4-Se disolvieron trifluoroacetato de nitrofenilo (5,17 g, 22,0 mmol) y ácido 3-(acetiltio)propiónico (2,96 g, 20,0 mmol) en DCM (50,0 ml). A continuación, se añadió DIPEA (6,97 ml, 40,0 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (50 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (50 ml), una solución saturada de bicarbonato de sodio (5 x 50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con Na2S04, se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100: 0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (4,90 g, 91 %) como un sólido ligeramente amarillento. Pureza basada en LC-MS 99 %.
LRMS (m/z): 292 [M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 1,942A
Intermedio 5:
tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida
[0275] Se disolvió ((5S,5'S)-((((6-azidohexanoil)azanodiil)bis(etano-2,1-diil))bis(azanodiil))bis(6-oxohexano-6,1,5-triil))tetracarbamato de tetra-tert-butilo (1,80 g, 2,00 mmol) en HCl en isopropanol (5-6 N, 50,0 ml, 275 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo como un sólido blanco.
LRMS (m/z): 250 [M 2]2+, 500 [M 1]1+.
Intermedio 6 :
(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]-N-[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]hexanamida
[0276] A una solución de tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida (1,29 g, 2,00 mmol) en DMF (30 ml) y DIPEA (3,48 ml, 20,0 mmol) se le añadió 3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo (2,26 g, 8,40 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana . La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se disolvió en DCM/metanol (95: 5, v/v, 100 ml). La solución resultante se lavó con una solución de bisulfato de potasio 1 N (100 ml), una solución de hidróxido de sodio 1 N (3 x 100 ml) y salmuera (100 ml), se secó con Na2SO4 , se filtró y se evaporó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v)(gradiente de 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (1,33 g, 65 %) como un sólido blanco. En la LC-MS se encontró una impureza (15 %) con valores m/z correspondientes al producto con un grupo tioacetato desprotegido. La impureza se formó durante o después del tratamiento. Pureza basada en LC-MS 85 %.
LRMS (m/z): 510 [M 2]2+, 1019/1041 [M 1/M 23]1+
T.r. LC-MS (min): 1,862B
[0277] Intermedio 7:
Formiato de N,N'-((9S,19S)-14-(6-aminohexanoil)-1-mercapto-9-(3-mercaptopropanamido)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-tetraazatricosano-19,23-diil) bis(3-mercaptopropanamida)
[0278] Se disolvió la estructura de base 2 (102 mg, 0,100 mmol) en metanol (1,00 ml). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (0,440 ml, 0,440 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (0,500 ml, 0,500 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y se coevaporó con metanol (2 x 10 ml). El residuo se disolvió en una mezcla de metanol/agua (9: 1, v/v, 1,00 ml) y la solución resultante se sometió a MP-LC preparativa.2 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (75,6 mg, 87 %) como un aceite pegajoso incoloro. Pureza basada en LC-MS 96 %.
LRMS (m/z): 513 [M 2]2+, 825 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,422A
Intermedio 8 :
Dendrón(-L-SO1861)4-amina
[0279] Se disolvió formato de N,N'-((9S,19S)-14-(6-aminohexanoil)-1-mercapto-9-(3-mercaptopropanamido)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-tetraazatricosano-19,23-diil)bis(3-mercaptopropanamida) (2,73 mg, 3,13 μMol) en una mezcla de NH4HCO3 20 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3: 1, v/v, 3,00 ml). A continuación, se añadió SO1861-EMCH (29,2 mg, 0,014 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3B Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (12,3 mg, 43 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 97 %.
LRMS (m/z): 1517 [M-6]6-, 1821 [M-5]5-2276 [M-4]4-T.r. LC-MS (min): 4,395A
Intermedio 9:
Dendrón(-L-S01861)4-azida
[0280] Se disolvió dendrón(S01861)4-amina (6,81 mg, 0,748 jmol) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (2,90 mg, 7,48 jmol) en DMF (1,00 ml ). A continuación, se añadió DIPEA (1,302 |_il, 7,48 |jMol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.30 Las fracciones correspondientes al producto se agruparon inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (5,86 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 90 %.
LRMS (m/z): 2344 [M-4]4
T.r. LC-MS (min): 4,785B
Intermedio 10:
Dendrón(-L-SO1861)4-maleimida1
[0281] Se disolvió dendrón(SO1861)4-amina (8,12 mg, 0,891 jmol) y 2,5-1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-oato de dioxopirrolidin-1-ilo (3,94 mg, 8,91 jmol) en DMF (1,00 ml). A continuación, se añadió DIPEA (1,55 jl, 8,91 jmol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 3 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.30 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (6,76 mg, 80 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 66 %.
LRMS (m/z): 2358 [M-4]4-T.r. LC-MS (min): 2,136C
Intermedio 11:
Dendrón(-L-SO1861)4-maleimida2
[0282] Se disolvió la estructura de base 2 (5,10 mg, 5,00 jmol) en metanol (100 jl). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (22,0 jl, 22,0 jmol) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (25,0 jL , 25,0 jmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y se coevaporó con metanol (2 x 5 ml). El residuo resultante se disolvió en una mezcla de NH4HCOO 20 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3:1, v/v, 3,242 ml). De esta solución, directamente, se añadieron 1000 j l a SO1861-EMCH (14,4 mg, 6,94 jMol, 4,5 equiv. En comparación con la estructura de base) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se liofilizó durante la noche. Al residuo resultante se añadieron 3-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2h-pirrol-1(5h)-il)propanamido)etoxi)etoxi)propanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (5,84 mg, 0,014 mmol) y DMF (1,00 ml). A continuación, se añadió DIPEA (2,39 jl, 0,014 mmol) y la suspensión se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3C Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (10,9 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 80 %.
LRMS (m/z): 2354 [M-4]4
T.r. LC-MS (min): 4,165B
Síntesis de dendrón(-L-SO1861)8 (Figura 15)
Intermedio 1:
N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2],6-bis({[(tertbutoxi)carbonil]amino})hexanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis({[(tertbutoxi)carbonil]amino})hexanamido]pentil]carbamoil}-5-{[(tert-butoxi)carbonil]amino}pentil]carbamato de tert-butilo
[0283] Se disolvió tetrahidrocloruro de (S)-2,6-diamino-N-(2-(6-azido-N-(2-((S)-2,6-diaminohexanamido)etil)hexanamido)etil)hexanamida (964 mg, 1,50 mmol ) en DMF (25,0 ml) y trietilamina (2,08 ml, 15,0 mmol). A continuación, se añadió Boc-Lys(Boc)-ONp (3,36 g, 7,18 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100:0 aumentando a 0:100) para dar el producto del título (2,71 g, 100 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 97 %.
LRMS (m/z): 807 [M-198]2+
T.r. LC-MS (min): 2,352B
Intermedio 2:
0ctahidrocloruro de (2S, 2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-diamino-10-(6-azidohexanoil)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-trioxo-7,10,13,20-tetraazahexacosano-1,5-diil)bis(2,6-diaminohexanamida) [0284] El intermedio 1 (2,71 g, 1,50 mmol) se disolvió en HCl en isopropanol (5-6 N, 25,0 ml, 138 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el crudo resultante se coevaporó con DCM (3 x 20 ml) para dar el producto del título crudo como un sólido blanco.
LRMS (m/z): 203/254 [M-200/M+4]4+, 338 [M+3]3+, 507 [M+2]2+, 1012 [M+1]1+
Intermedio 3:
(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]-N-[(1S)-1-{[2-(6-azido-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]hexanamido]etil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis[3-(acetilsulfanil)propanamido]hexanamido]pentil]hexanamida
[0285] Se añadió DMF (20,0 ml), trietilamina (320 jl, 2,30 mmol) y 3-(acetiltio)propanoato de 4-nitrofenilo (595 mg, 2 ,21 mmol) a octahidrocloruro de (2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-diamino-10-(6-azidohexanoil)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-trioxo-7,10,13,20-tetraazahexacosan-1,5-diil)bis(2,6-diaminohexanamida) (300 mg, 0,230 mmol). La suspensión resultante se sonicó a 60 °C durante 30 min y se dejó en agitación a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se evaporó al vacío y el residuo se purificó realizando primero cromatografía flash (DCM-metanol/DCM (1/9, v/v) gradiente 100: 0 aumentando a 0:100), seguido de MP-LC preparativa2 para dar el producto del título (70 mg, 15 %) como un sólido blanco. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 685 [M 3]3+
T.r. LC-MS (min): 1,912A
Intermedio 4:
Formiato de (2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-amino-N-{2-[(2S)-2,6-bis[(2S)-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido))hexanamido]hexanamidoetil}hexanamido)etil]carbamoil}-5-[(2S)-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido)hexanamido]pentil]-2,6-bis(3-sulfanilpropanamido)hexanamida
[0286] La estructura de base 4 (10,0 mg, 4,87 jmol) se disolvió en metanol (200 jl). A continuación, se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 N recién preparada (42,9 jl, 0,043 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió una solución de trimetilfosfina 1,0 M en THF (24,4 jl, 0,024 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se diluyó con agua (1 ml) y se sometió directamente a MP-LC preparativa.2 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (4,02 mg, 48 %) como un sólido blanco esponjoso.
LRMS (m/z): 564 [M 3]3+, 846 [M 2]2+ T.r. LC-MS (min): 1,542C
T.r. LC-MS (min): 1,542C
Intermedio 5:
Dendrón(-L-SO1861)8-amina
[0287] La estructura de base 5 (0,52 mg, 0,299 jMol) y SO1861-EMCH (29,2 mg, 0,014 mmol) se disolvieron en una mezcla de NH4HCO320 mM con TCEP/acetonitrilo 0,5 mM (3: 1, v/v, 1,00 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió TCEP (0,30 mg, 1,05 |jMol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min. A continuación, la mezcla se sometió directamente a LC-MS preparativa.3B Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (2,17 mg, 40 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 97 %.
LRMS (m/z): 2282 [M-8]8-, 2607 [M-7]7-T.r. LC-MS (min): 4,415A
Ejemplo 6
Síntesis de S01861-porción conectora trifuncional-oligonucleótido de BNA (Figura 16)
Materiales y métodos
Porción conectora trifuncional
[0288] La porción conectora trifuncional (DBC0, TC0, maleimida) se adquirió en Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, Texas).
Oligonucleótido HSP27BNA
[0289] Los oligonucleótidos de HSP27BNA(-tiol) (secuencia 5'-GGCacagccagtgGCG-3 ') (Zhang et al., 2011) se adquirieron en Bio-Synthetic Inc. (Lewisville, Texas)
Intermedio 1:
SO1861-azida
[0290] A SO1861 60 mg, 0,032 mmol)) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecano-15-hidrazida (39,3 mg, 0,129 mmol) se añadió metanol (extra seco, 1,00 ml) y TFA (9,86 |_il, 0,129 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a MP-LC preparativa.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 2150 [M-1]1-T.r. LC-MS (min): 1,103B
Intermedio 2:
SO1861-porción conectora trifuncional
[0291] Se disolvieron SO1861-azida (45 mg, 0,021 mmol) y porción conectora trifuncional (26,5 mg, 0,022 mmol) en d Mf (2,50 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.30 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 89 %.
LRMS (m/z): 1677 [M-2]2-T.r. LC-MS (min): 2,546A
Intermedio 3:
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecano-15-amida
[0292] Se añadió metanol (extra seco, 2,00 ml) y TFA (11,1 μL, 0,145 mmol) a 1-(4-formilbenzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (28,0 mg, 0,048 mmol) y e Mc h .t Fa (24,5 mg, 0,072 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 50 °C. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo resultante se purificó mediante MP-LC.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (33,4 mg, 88 %) como un sólido esponjoso de color púrpura intenso. Pureza basada en LC-MS 92 %.
LRMS (m/z): 394 [M 2]2+, 789 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,287A
Intermedio 4:
Metiltetrazina -oligonucleótido de BNA
[0293] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (70,0 mg, 0,012 mmol) en NH4HCO3 20 mM (20,0 ml). A continuación, se añadió TCEP (14,3 mg, 0,050 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (5000 xg durante 30 min). A continuación, se añadió una solución de NH4HCO320 mM con TCEP 2,5 mM (20,0 ml) a la solución del residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO3 20 mM (30.0 ml) y la mezcla resultante se añadió a una solución de (E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il) hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (14,8 mg, 18,8 μMol) en acetonitrilo (10,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se congeló y se liofilizó durante el fin de semana para producir el producto del título crudo como un sólido esponjoso de color rosa. Al producto crudo se le añadió una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la suspensión resultante se filtró con un filtro de jeringa de 0,45 μM. El filtrado se filtró usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. A continuación, de nuevo se añadió una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) a la solución del residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la mezcla resultante se liofilizó durante la noche para producir el producto del título (90,0 mg, 115 %) en forma de un sólido esponjoso de color rosa. Pureza basada en LC-MS 91 %.
LRMS (m/z): 1631 [M-4]4-, 2174 [M-3]3
T.r. LC-MS (min): 0,737B
Intermedio 5:
S01861-porción conectora trifuncional- oligonucleótido de BNA
[0294] Se disolvieron oligonucleótido de metiltetrazina-BNA (90,0 mg, 0,014 mmol) y S01861-porción conectora trifuncional (48,6 mg, 0,014 mmol) en una mezcla de agua/acetonitrilo (4: 1, v/v, 12,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 15 min, la mezcla se sometió a LC-MS preparativa.4* Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (82,0 mg, 60 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 92 % (2 picos con ambos valores m/z correspondientes al compuesto del título).
LRMS (m/z): 1641 [M-6 ]6-, 1970 [M-5]5-T.r. LC-MS (min): 3,24 y 3,406B
Intermedio 1:
SO1861-azida
[0295] Se añadió metanol (extra seco, 1,00 ml) y TFA (9,86 μl, 0,129 mmol) a SO1861 60 mg, 0,032 mmol)) y 1-azido-3,6,9,12-tetraoxapentadecano-15-hidrazida (39,3 mg, 0,129 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se sometió a MP-LC preparativa.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 2150 [M-1]1'
T.r. LC-MS (min): 1,103B
Intermedio 2:
SO1861-porción conectora trifuncional
[0296] Se disolvieron SO1861-azida (45 mg, 0,021 mmol) y porción conectora trifuncional (26,5 mg, 0,022 mmol) en d Mf (2,50 ml) y la mezcla resultante se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.3C Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (58,4 mg, 84 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 89 %.
LRMS (m/z): 1677 [M-2]2
T.r. LC-MS (min): 2,546A
Intermedio 3:
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida
[0297] Se añadió metanol (extra seco, 2,00 ml) y TFA (11,1 μL, 0,145 mmol) a 1-(4-formilbenzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida ( 28,0 mg, 0,048 mmol) y e Mc h .t Fa (24,5 mg, 0,072 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a 50 °C. Después de 30 min, se evaporó la mezcla de reacción al vacío y el residuo resultante se purificó mediante MP-LC.1 Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (33,4 mg, 88 %) como un sólido esponjoso de color púrpura intenso. Pureza basada en LC-MS 92 %.
LRMS (m/z): 394 [M 2]2+, 789 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,287A
Intermedio 4:
Metiltetrazina-oligonudeótido de BNA
[0298] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (70,0 mg, 0,012 mmol) en NHaHCO3 20 mM (20,0 ml). A continuación, se añadió TCEP (14,3 mg, 0,050 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (5000 x g durante 30 min). A continuación, se añadió una solución de NH4HCO320 mM con TCEP 2,5 mM (20,0 ml) a la solución de residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO3 20 mM (30.0 ml) y la mezcla resultante se añadió a una solución de (E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil)hidraziniliden)metil)benzamido)-N-(4-(6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencil)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan-15-amida (14,8 mg, 18,8 μMol) en acetonitrilo (10,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se congeló y se liofilizó durante el fin de semana para producir el producto del título crudo como un sólido esponjoso de color rosa. Al producto crudo se le añadió una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la suspensión resultante se filtró sobre un filtro de jeringa de 0,45 μM. El filtrado se filtró usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. A continuación, se añadió de nuevo una solución de NH4HCO320 mM (20,0 ml) a la solución de residuo y la mezcla resultante se filtró de nuevo usando un filtro centrífugo con las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM (20,0 ml) y la mezcla resultante se liofilizó durante la noche para producir el producto del título (90,0 mg, 115 %) en forma de un sólido esponjoso de color rosa. Pureza basada en LC-MS 91 %.
LRMS (m/z): 1631 [M-4]4-, 2174 [M-3]3-T.r. LC-MS (min): 0,737B
Intermedio 5:
SO1861-porción conectora trifuncional-oligonudeótido de BNA
[0299] Se disolvieron oligonucleótido de BNA-metiltetrazina (90,0 mg, 0,014 mmol) y SO1861-porción conectora trifuncional (48,6 mg, 0,014 mmol) en una mezcla de agua/acetonitrilo (4:1, v/v, 12,0 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 15 min, la mezcla se sometió a LC-MS preparativa.4A Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (82,0 mg, 60 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 92 % (2 picos con ambos valores m/z correspondientes al compuesto del título).
LRMS (m/z): 1641 [M-6 ]6-, 1970 [M-5]5-T.r. LC-MS (min): 3,24 y 3,406B
Ejemplo 7
Conjugación de SO1861-oligonucleótido de BNA
[0300] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (1,10 mg, 0,187 μmol) en NH4HCO320 mM con TCEP 1,0 mM (500 μl) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (14000 xg durante 30 min). La solución del residuo se diluyó con NH4HCO320 mM con TCEP 1,0 mM (500 μl) y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución de residuo se diluyó con NH4HCO320 mM/ acetonitrilo (3:1, v/v, 1,00 ml) y la mezcla resultante se añadió a S01861-EMCH (3,54 mg, 0,375 μMol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.44. Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (1,25 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 100 %.
LRMS (m/z): 1561 [M-5]5-1951 [M-4]4-T.r. LC-MS (min): 2,466B
Conjugación de dendrón(S01861)4-oligonudeótido de BNA (Figura 17)
[0301] Se disolvió disulfuro de oligonucleótido de BNA HSP27 (1,1 mg, 0,187 μmol) en NH4HC0320 mM con TCEP 1,0 mM (500 μl) y la mezcla se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la mezcla de reacción se filtró usando un filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 3000 Da (14000 xg durante 30 min). La solución del residuo se diluyó con NH4HC0320 mM con TCEP 1,0 mM (500 μl) y la mezcla resultante se filtró de nuevo en las mismas condiciones descritas anteriormente. La solución del residuo se diluyó con NH4HCO3 20 mM/ acetonitrilo (3: 1, v/v, 1,0 ml) y la mezcla resultante se añadió a dendrón(SO1861)4-maleimida1 (3,54 mg, 0,375 μMol). La mezcla de reacción se agitó durante 1 min y se dejó reposar a temperatura ambiente. Después de 10 min, la mezcla de reacción se sometió a LC-MS preparativa.4* Las fracciones correspondientes al producto se combinaron inmediatamente, se congelaron y se liofilizaron durante la noche para dar el compuesto del título (1,25 mg, 85 %) como un sólido blanco esponjoso. Pureza basada en LC-MS 94 %
LRMS (m/z): 1896 [M-8 ]8-, 2167 [M-7]7-T.r. LC-MS (min): 3,776B
Síntesis de dendrón(NEM)4 (Figura 18)
[0302] A bencil bis(2-((S)-2,6-bis(3-mercaptopropanamido)hexanamido)etil)carbamato (1,69 mg, 2,00 μmol) y N-etilmaleimida (1,05 mg, 8,40 μMol) se añadió una mezcla de NH4HCO320 mM/ acetonitrilo (3:1, v/v, 2,00 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se liofilizó durante la noche. El residuo resultante se purificó mediante LC-MS 3A preparativa para dar el compuesto del título (1,53 mg, 57 %) en forma de un sólido esponjoso de color blanco. Pureza basada en LC-MS 98 %.
LRMS (m/z): 1346 [M 1]1+
T.r. LC-MS (min): 1,433A
Ejemplo 8
Modelo de ratón de tumor de ratón A431 y estudios de silenciamiento génico in v itro e in v ivo Materiales y métodos
[0303] HSP27BNA con oligonucleótidos de porciones conectoras (secuencia 5'-GGCacagccagtgGCG-3 ') (Zhang et al., 2011) se adquirieron en Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, Texas)
Análisis de aislamiento de ARN y expresión génica in v itro
[0304] El ARN de las células se aisló y analizó de acuerdo con protocolos estándar (Biorad)
Modelo de tumor de ratón in v ivo
[0305] El estudio con ratones se realizó en CrownBio (China) de acuerdo con los protocolos y procedimientos estándar. Modelo: Modelo de xenoinjerto de carcinoma epidermoide humano subcutáneo A431 en ratones nude BALB/c hembra. Se realizó un seguimiento del volumen del tumor y se recolectaron muestras de tumor para el análisis de silenciamiento génico (ver a continuación)
Análisis de expresión génica y aislamiento de ARN de muestras tumorales de ratones
[0306] Se aisló el ARN total de los tumores usando TriZol (Thermo Fisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se resuspendió en agua libre de nucleasas (NFW). Se comprobó la integridad del ARN de las muestras de ARN en el gel. Para preparar ADNc, primero se mezclaron 100 ng de ARN total con hexámeros aleatorios (Qiagen; concentración final 2 μM) en un volumen final de 12,5 μl en NFW, se desnaturalizaron durante 5 min a 70 °C e inmediatamente se enfriaron en hielo. A continuación, se añadieron 7,5 μl de una mezcla de síntesis de ADNc, que constaba de 4 μl de tampón 5xRT (Promega), 0,4 μl de dNTP 25 mM (Promega), 1 μl 200 U/μL de enzima mmLV RT (Promega), 0,5 μL 40 U/μL Inhibidor de ARNasa (Promega) y 1,6 μL de NFW. Se utilizó el siguiente protocolo de síntesis de ADNc: 1) 10 minutos 25 °C 2) 60 minutos 37 °C 3) 5 minutos 85 °C 4) ~ 4 °C
[0307] Para una sola reacción de qPCR se preparó la siguiente mezcla: 1 μL de ADNc, 0,05 μL de cebador directo (250 μM), 0,05 μL de cebador inverso (250 μM), 8,9 μl de LNFW, 10 μl de SYBR Green (Bio-Rad). Se utilizó el siguiente protocolo de qPCR: 1 ciclo: 5 minutos 95 °C, 40 ciclos: 15 s 95 °C 30 s 60 °C.
[0308] La expresión del gen HSP27 se calculó utilizando 2 -(CtHSP27-GEOMEAN (Ctrefi ;Ctref2;Ctref3;Ctref4)), donde refl, ref2, ref3 y ref4 son los genes de referencia IMMT, EIF2S2, GUSB y UBC para el análisis de los tumores. Se eligieron cuatro genes de referencia basándose en la forma de realización de un análisis GeNORM entre nueve genes de referencia analizados para elegir el gen de referencia más ideal y estable para estas muestras de tumor. Para ello, se importaron los resultados de qPCR en el programa informático Qbase+, mediante el cual se calculan dos medidas de calidad: el coeficiente de variación de los niveles de expresión génica de referencia normalizados (V); y el valor M de estabilidad geNorm (M)1. Un gen de referencia con un M ≤0,2 y un V ≤0,15 se considera muy estable. En función de este análisis, se eligieron IMMT y EIF2S2 como los genes de referencia más estables. Sin embargo, UBC y GUSB también se añadieron al grupo de genes de referencia para mejorar aún más la precisión de la normalización. Cada muestra se analizó como réplica técnica triplicada en una máquina de qPCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad).
Figure imgf000093_0001
Ejemplo 9
Síntesis de conjugados
Anticuerpos monoclonales, SO1861, saponinas QS
[0309] Se compraron Trastuzumab (Herceptin®), cetuximab (Erbitux®) y T-DM1 (Kadcyla®) en una farmacia (Charite, Berlín). El anticuerpo monoclonal CD71 se adquirió de BioCell (Okt9, n° BE0023). La SO1861 se aisló y purificó en Analyticon Discovery GmbH a partir de un extracto vegetal crudo obtenido de Saponaria officinalis L. Se compró extracto de saponina de Quillaja Saponaria (QSmix) (Sigma Aldrich, # S4521)
materiales
[0310] Trastuzumab (Tras, Herceptin®, Roche), cetuximab (Cet, Erbitux®, Merck KGaA), clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, 98 %, Sigma-Aldrich), ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB, reactivo de Ellman, 99 %, Sigma-Aldrich), columnas de centrifugación y desalinización Zeba™ (2 ml, Thermo-Fisher), geles de proteínas Bis-Tris NuPAGE™ al 4-12 % (Thermo-Fisher), tampón de desarrollo NuPAGE™ MES s Ds Running Buffer (Thermo-Fisher), Estándar de proteínas preteñido Novex™ Sharp (Thermo-Fisher), solución de tinción de proteínas PageBlue ™ (Thermo-Fischer), kit de ensayo de proteínas Pierce™ BCA (Thermo-Fisher), N-etilmaleimida (NEM, 98 %, Sigma-Aldrich), 1,4-Ditiotreitol (DtT, 98 %, Sigma-Aldrich), Sephadex G25 (GE Healthcare), Sephadex G50 M (GE Healthcare), Superdex 200P (GE Healthcare), Alcohol isopropílico (IPA, 99,6 %, VWR), Tris(hidroximetil)aminometano (Tris, 99 %, Sigma-Aldrich), clorhidrato de Tris(hidroximetil)aminometano (Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-Histidina (99 %, Sigma-Aldrich) ), D-(+)-Trehalosa dihidrato (99 %, Sigma-Aldrich), monolaurato de polioxietilen(20)sorbitán (TWEEN 20, Sigma-Aldrich), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, Thermo-Fisher), clorhidrato de guanidina (99 %, Sigma-Aldrich), sal disódica del ácido etilendiaminotetraacético dihidrato (EDTA-Na2, 99 %, Sigma-Aldrich), filtros estériles de 0,2 μM y 0,45 μM (Sartorius), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC, Thermo-Fisher), Diantina-Cys (Dia-Cys, Diantina mutante con una única cisteína C-terminal, Proteogenix), concentrador Vivaspin T4 y T15 (Sartorius), Superdex 200PG (GE Healthcare), tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP, Thermo-Fisher), oligonucleótido de HSP27 BNA disulfuro (biosíntesis), hexafluorfosfato de [O-(7-Azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N-tetrametiluronio] (HATU, 97 %, Sigma-Aldrich), Dimetilsulfóxido (DMSO, 99 %, Sigma-Aldrich), sal de trifluoroacetato de N-(2-aminoetil)maleimida (AEM, 98 %, Sigma-Aldrich), L-cisteína (98,5 %, Sigma-Aldrich), agua desionizada (DI) recién extraída de Ultrapure Lab Water Systems (MilliQ, Merck), agarosa de níquel-ácido nitrilotriacético (ní-nta agarose), glicina (99,5 %, VWR), ácido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzoico) ( Reactivo de Ellman, DTNB, 98 %, Sigma-Aldrich), fluoresceína de anhídrido S-acetilmercaptosuccínico (reactivo SAMSA, Invitrogen) Bicarbonato de sodio (99,7 %, Sigma-Aldrich), carbonato de sodio (99,9 %, columnas Sigma-Aldrichal), columnas de desalinización PD MiniTrap con resina Sephadex G-25 (Ge Healthcare), columna de desalinización PD10 G25 (GE Healthcare), columnas de desalinización Zeba Spin de 0,5, 2, 5 y 10 ml (Thermo-Fisher), filtros centrífugos Vivaspin T4 10 kDa MWCO, T4 100 kDa MWCO, y T15 (Sartorius), columna Biosep s3000 aSEC (Phenomenex), unidades de ultrafiltración Vivacell MWCO de 10 y 30 kDa (Sartorius), filtro de flujo rápido Nalgene (Thermo-Fisher), Métodos
MALDI-TOF-MS
[0311] Se registraron espectros de tiempo de vuelo de ionización/desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF) en un espectrómetro de masas MALDI (Bruker Ultrafex III). Por lo general, la muestra disuelta en agua MilliQ en un rango de nanomoles a micromoles se depositó en la microplaca (microplaca de acero pulido MTP 384 target plate polished steel T F, Bruker Daltons) utilizando super-DHB (99 %, Fluka) o ácido sinapínico (SA, 99 %, Sigma-Aldrich) como la matriz disuelta en acetonitrilo (MADLI-TOF-MS ensayado, Sigma)/TFA al 0,1 % (7: 3 v/v) mediante el método de gota seca. PepMix (estándar de calibración de péptidos, Bruker Daltons) o ProteoMass (estándar de calibración de proteínas, Sigma-Aldrich) sirvieron como estándares de calibración. El modo RP se refiere al modo reflector positivo. El modo RN se refiere al modo reflector negativo. El modo LP se refiere al modo lineal positivo.
Diálisis
[0312] Se utilizaron membranas de celulosa regenerada: MWCO = 1 y 2 kDa (Spectra/Por) y MWCO = 12-14 kDa (Carl Roth) para realizar la diálisis. Normalmente, la diálisis se realizó durante 24 h con 1 L de disolvente que se cambió tras las primeras 6 h del proceso.
Liofilización
[0313] La liofilización se realizó en un Alpha 1-2 LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). Normalmente, las muestras se congelaron con nitrógeno líquido y se colocaron en el liofilizador a alto vacío. UV-Vis
[0314] Las mediciones de absorbancia se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 25 UV-Vis o Thermo NanoDrop ND-2000 en el rango espectral de 200-750 nM.
[0315] Las concentraciones se determinaron utilizando un espectrómetro Thermo Nanodrop 2000 o Lambda 25 utilizando los siguientes parámetros:
Trastuzumab DO280 = 1,5 (mg/ml)-1 cm-1
Cetuximab DO280 = 1,4 (mg/ml)-1 cm-1
oligonucleótido HSP27 DO260 = 153000 M-1 cm-1; Rz260:280= 1,819
Dia-Cys DO280 = 0,57 (mg/ml)-1 cm-1
PEG4-SPDP (PDT) DO343 = 8 080 M-1 cm-1
SAMSA-Fluoresceína DO495 = 64500 M-1 cm-1; Rz280:495 = 0,232
Ellmans (TNB) DO412 = 14150 M-1 cm-1
Cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC)
[0316] Se realizó una cromatografía de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) para purificar la proteína marcada con histidina y los conjugados de proteína. Brevemente, se pipeteó agarosa Ni-NTA (10 ml) en una columna de flujo por gravedad para un volumen de lecho de 5 ml. La resina se lavó con 20 ml de agua desionizada y se añadieron 5 ml de una solución de NiSO4 100 mM. La resina se lavó de nuevo cinco veces con 5 ml de agua desionizada y se equilibró cinco veces con DPBS. La solución de proteína se incubó con la agarosa Ni-NTA lavada con rotación a 4 °C durante 30 min. Posteriormente, la solución de proteína Ni-NTA se pipeteó de nuevo a la columna de flujo por gravedad. Se recogió el flujo a través y la resina se lavó tres veces con 5 ml de DPBS. Luego se eluyó la muestra inmovilizada aumentando la concentración de imidazol de 50 ml de 125 mM, pH 8 a 50 ml de 250 mM, pH 8. Las fracciones de elución se dializaron con PBS pH 7,4 para obtener la muestra purificada.
Cromatografía de exclusión por tamaño
[0317] La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se llevó a cabo en un purificador AKTA. Las muestras se analizaron mediante SEC usando una columna Biosep SEC-S3000 o una columna Sephadex G50M (10 x 40 cm) eluyendo con solución de TBS/alcohol isopropílico (85:15 v/v). Las purezas de la muestra se determinaron mediante la integración del pico de la muestra de anticuerpo con respecto a los picos agregados de trazas.
Método de Ellman
[0318] Se llevó a cabo la prueba de Ellman (o método de Ellman) para determinar cuantitativamente la concentración de tiol en una muestra mediante espectrofotometría. La presencia de tioles se indicó mediante la liberación estequiométrica del 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB) del reactivo de Ellman en presencia de tioles. El TNB obtiene un máximo de absorción a 412 nM y un coeficiente de extinción de DO412 = 14150 M-1 cm-1 en sistemas tamponados. Brevemente, se mezclaron 2 μL de una solución de 0,5 mg/ml del reactivo de Ellman (ácido 5,5-Ditiobis(2-nitrobenzoico), DTNB) en tampón de fosfato (0,1 M, EDTA 1 mM, pH 7,4) con 20 μL de una muestra que contiene tiol en tampón. La mezcla se agitó con vórtex durante 5 segundos. Luego, se midió la absorbancia de UV-Vis a 412 nM en un Thermo Nanodrop 2000 para determinar la concentración de TNB y, por lo tanto, el contenido de tiol de la muestra.
Producción de diantina
[0319] La diantina se expresó en un cultivo de bacterias y la proteína se purificó siguiendo los pasos convencionales de cultivo celular y purificación de proteínas conocidas en la técnica.
Producción de conjugados de saporina
[0320] Se compraron conjugados de trastuzumab-saporina, cetuximab-saporina, CD71mab-saporina preparados especialmente por Advanced Targeting Systems (San Diego, CA). La IgG-saporina y saporina se adquirieron de Advanced Targeting Systems.
Síntesis de anticuerpo-(Cys-dendrón-(L-SO1861)n)n
[0321] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con saponina dendrítica [dendrón-(L-SO1861)4-maleimida] mediante una porción conectora tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que lleva a cabo una reacción de tipo Michael tioleno entre Ab y saponina dendrítica. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cetuximab-(S-dendrón-(L-S01861)4)4:
Se desaló cetuximab en tampón DPBS pH 7,5 y luego se normalizó a 2,50 mg/ml. A una alícuota de Ab (9,19 mg, 61 nMol) se le añadió una alícuota de Solución de PEG4-SPDP recién preparada (5,0 mg/ml, 6,70 equivalentes molares, 411 nMol), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación, la reacción se detuvo con la adición de glicina (20 mg/ml, 7,7 μl), luego se redujo el resto de SPD in situ mediante la adición de TCEP (5,0 mg/ml, 4,0 equivalentes molares por SPDP, 1,64 μMol). Esta mezcla se mezcló con rodillos durante 15 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. El Ab-SH resultante se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización por centrifugación Zeba en TBS pH 7,5. El Ab-SH se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a Ab = 5,4). Al volumen de Ab-SH (7,41 mg, 1,93 mg/ml, 49 nMol) se le añadió una alícuota de solución recién preparada de dendrón-(L-SO1861)4-maleimida en DMSO (10 mg/ml, 8,0 equivalentes molares por Ab, 0,4 μMol, 3,16 mg, 0,32 ml), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante la noche a 20 °C. Además de la reacción de conjugación, se retiraron dos alícuotas del Ab-SH desalinizado (0,25 mg, 1,67 nMol) antes de la conjugación y se hicieron reaccionar con NEM (8,0 equivalentes molares por Ab, 13,3 nMol, 6,7 μl de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 μl) durante la noche a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación durante 18 horas (antes de la adición de NEM), la mezcla de conjugado crudo se centrifugó brevemente y se extrajo una alícuota de 100 μl para su análisis por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizaron mediante el método de Ellman para obtener la incorporación de dendrón-(L-SO1861)4. A la masa Ab-dendrón-(L-SO1861)4 se le añadió una alícuota de solución NEM recién preparada (2,5 mg/ml, 5,0 equivalentes molares, 0,25 μMol) y la mezcla se purificó mediante una columna Sephadex G50 de 1,6 x 30 cm eluyéndola con DPBS pH 7,5 para dar el conjugado Cetuximab-(S-dendrón-(L-SO1861)4)4. El producto se filtró a 0 ,2 μM para aclararlo y luego se concentró cuidadosamente para a aproximadamente 3 mg/ml usando un concentrador vivaspin T15 (3000 g, intervalos de 5 minutos, 5 °C) para dar el conjugado final Cetuximab-(S-dendrón(L-SO1861)4)4. Rendimiento: 4,41 mg, 48 %. Relación de dendrón-(L-SO1861)4 a Ab = 4,4.
Tabla 2. Resultados de reacción resumidos
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Anticuerpo-(L-SO1861)n (como se ilustra en la figura 12)
[0322] Trastuzumab, Cetuximab se denominan "Ab" en lo sucesivo. Ab se conjugó con la saponina SO18161-EMCH mediante una reacción de conjugación de tioleno tipo Michael en DAR de 1, 2, 3, 4, 5 y 6. La molécula de SO1861-EMCH obtiene un enlace lábil (L) de hidrazona entre su estructura y su grupo maleimida, lo que genera un enlace lábil entre la saponina y Ab. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-SO1861)4:
A una solución de Cetuximab (40 mg, 8,0 ml) se le añadieron 10 jl/m l de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.HCl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón de TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5.
[0323] Al Cetuximab dividido en cuatro porciones (cada una de 9,73 mg, 4,864 mg/ml, 65 nMol) se añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (0,5-2,0 mg/ml, 1,15-7,02 equivalentes molares, 75-455 nMol), las mezclas se agitaron brevemente en vórtex y luego se incubaron durante 300 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de SO1861-EMCH), se extrajo una alícuota de alrededor de 1 mg (0,210 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Estas alícuotas se caracterizaron mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a Ab = 2,0, 4,2, 5,9 y 6 ,8 respectivamente). A cada uno de los Ab-SH a granel se añadió una alícuota de solución SO1861-EMCH recién preparada (2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por 'tiol', 0,15-0,61 |jMol, 0,16-0,63 ml), las mezclas se agitaron brevemente y luego se incubaron durante 120 minutos a 20 °C. Además de cada reacción de conjugación, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,25 mg, 1,67 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 4,3-17,4 nMol, 2,2-8,7 j l de una solución de 0,25 mg/ml) o Tampón TBS pH 7,5 (2,2-8,7 j l) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se retiró una alícuota de 0,200 ml de mezcla de Ab-SO1861-EMCH y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizaron mediante el método de Ellman para obtener incorporaciones de SO1861-EMCH. A la mezcla de Ab-SO1861-EMCH a granel se añadió una alícuota de solución NEM recién preparada (2,5 mg/ml, 2,5-10 equivalentes molares, 0,15-0,58 jMol) y las mezclas se purificaron mediante columnas de desalinización zeba spin eluyendo con DPBS pH 7,5 para dar conjugados purificados de Cetuximab-(L-SO1861). Los productos se normalizaron a 2,5 mg/ml y se filtraron a 0,2 jM antes de dispensarlos para su evaluación biológica.
Figure imgf000096_0001
T l n i i n r i n r mi r l ^ r l n r z m L 1 1
Figure imgf000096_0002
T l 4 i i l i L 1 1
Síntesis de anticuerpo-(S-SO1861)n
S ín te s is d e S O 1861 -S -M a l
[0324] Se colocaron SO1861 de Saponaria officinalis L (15,4 mg, 8,28 jMol) y HATU (140 mg, 368 jMol, 44,5 equivalentes molares) en forma sólida en un vial de vidrio de 20 ml con agitador magnético y se añadieron 5 ml de DMSO para disolver los materiales. La mezcla disuelta se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Después de 30 min, se añadió 1 ml de solución de AEM recién preparada (65 mg, 256 jMol, 31 equivalentes molares) en DMSO a la mezcla de SO1861-HATU en agitación. La mezcla de reacción se agitó durante 17 horas a temperatura ambiente. Después de agitación durante 17 horas, la mezcla se diluyó con agua desionizada y se dializó extensamente durante 24 h con agua desionizada utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo blanco.
[0325] Rendimiento: 7,22 mg (44 %).
[0326] Se utilizaron además alícuotas secas para la caracterización mediante MALDI-TOF-MS.
[0327] MALDI-TOF-MS (modo RN) (Figura x a): m/z 1983 Da ([M-H]-, Conjugado SO1861-S-Mal), 2136 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-S-Mal).
[0328] MALDI-TOF-MS (modo RP) (Figura x b): m/z 2007 Da ([M Na]+, Conjugado SO1861-S-Mal), 2107 Da ([M-Na]+, conjugado de saponina-S-Mal).
[0329] El grupo funcional maleimida se verificó mezclando el SO1861-S-Mal purificado con una solución de L-cisteína recién preparada (1000 moles de exceso) y observando el cambio de masa esperado en MALDI-TOF-MS 8Figura x) produciendo un conjugado de cisteína en m/z 2103 Da.
C o n ju g a c ió n d e a n tic u e rp o s
[0330] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Se conjugó Ab con la saponina SO18161-S-Mal mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. La saponina obtiene un enlace amida estable (S) entre su estructura y su grupo maleimida, lo que genera un enlace estable entre la saponina y Ab.
[0331] Se hizo un intercambio de tampones de 5 mg de Ab disuelto en solución salina fosfatada (PBS) a solución salina tris(hidroximetil)-aminometano (TBS) pH 7,5 a través de una columna de desalación zeba spin y se normalizó a una concentración de 3 mg/ml. Al Ab se le añadió una alícuota de solución de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) recién preparada (0,25 mg/ml, 2,92 equivalentes molares), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 90 min a 20 °C. Después, el Ab-SH resultante se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Se analizó una alícuota mediante método de Ellman para determinar el contenido de sulfhidrilo. El Ab-SH obtenido se dividió en una sola porción para la conjugación y dos alícuotas de 0,25 mg para los controles. A la porción principal de AB-SH se le añadió una alícuota de solución de SO1861-S-Mal recién preparada (2 mg/ml, 2 equivalentes molares con respecto al contenido de sulfhidrilo), a la segunda alícuota de control se le añadió tampón TBS pH 7,5. Cada mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 2 horas a 20 °C. Después, se analizó una alícuota de cada uno mediante el método de Ellman para determinar el contenido de sulfhidrilo que quedaba en el conjugado con respecto a los controles. Después de la purificación mediante filtración en gel a través de una columna de desalación por centrifugación zeba spin en p Bs de Dulbecco, pH 7,1, se obtuvo Ab-S-SO1861. El conjugado se analizó adicionalmente mediante SEC para determinar el % de pureza. Para la muestra de Trastuzumab-(S-SO1861)4 se determinó una pureza del 99 %. Para la muestra de Cetuximab-(S-SO1861)4 se determinó una pureza del 98,3 %. Los volúmenes de retención para Trastuzumab-(S-SO1861)4 (9.1 ml) y Cetuximab-(S-SO1861)4 (8,8 ml) fueron similares y son coherentes con un Ab no modificado (por ejemplo, IgG).
Anticuerpo-(L-HSP27 BNA)n
Síntesis de Trastuzumab-(L-HSP27)4,, Cetuximab-(L-HSP27)4, mediante PEG4-SPDP con un DAR4 y síntesis de Cetuximab-(L-HSP27)2 mediante PEG4-SPDP con un DAR2
[0332] Trastuzumab, Cetuximab, se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con HSP27 BNA disulfuro a través de un succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato de tetra(etilenglicol) (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y HSP27 BNA. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-HSP27 BNA)4:
Se hizo reaccionar oligonucleótido de HSP27 BNA disulfuro (2,7 mg, 470 nMol, 6,10 mg/ml) con TCEP (10 equivalentes molares, 4,7 μMol, 1,34 mg, 50 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, el oligo-SH se purificó mediante una columna de desalación PD10 G25 con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo oligo-SH (2,48 mg, 90 %, 1,24 mg/ml, relación de SH a oligonucleótido = 0,8) [0333] Se hizo reaccionar trastuzumab (1,5 mg, 10,3 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución de PEG4-SPDP recién preparada (6,81 equivalentes molares, 70,1 nMol, 39 μg) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (15,1 μl de 2 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desaló mediante una columna de desalinización zeba con elución con TBS pH 7,5. Una alícuota del Tras-S-PEG4-SPDP resultante se extrajo y se analizó mediante análisis UV-Vis. La incorporación de SPDP se determinó usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM (relación de SPDP a Ab: 4). El resto de Tras-(S-PEG4-SPDP)4 se hizo reaccionar con una alícuota de oligonucleótido HSP27 recién preparado (oligo-SH) (8 equivalentes molares, 82,4 nMol, 1,24 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó el conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de HSP27 mediante el desplazamiento de piridiil-2-tiona (PDT) a 343 nM. El conjugado crudo se purificó usando una columna Sephadex G50 de 1,6 x 33 cm con elución con DPBS pH 7,5. El trastuzumab-(L-HSP27)4 resultante se obtuvo como una sola porción. Rendimiento: n.d . Pureza: 96 %, relación HSP27 BNA a Ab = 4,4
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Tabla 5 Condiciones resultados de reacción resumidos
Anticuerpo-(L-HSP27 BNA-L-bloqueado)"
Trastuzumab-(L-HSP27-L-bloqueado)4,, Cetuximab-(L-HSP27-L-bloqueado)
[0334] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con un derivado de HSP27 portador de maleimido (Mal), que se denominará en lo sucesivo "HSP27-Mal". El Ab se conjugó con HSP27-Mal mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. El HSP17-Mal obtiene un enlace lábil (L) hidrazona entre su estructura y su función maleimida, generando un enlace lábil entre el HSP27 BNA y Ab. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-HSP27 BNA-L-bloqueado)n:
El trastuzumab se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina pH 6. A una alícuota de 20 mg (4,0 ml) se agregaron 10 μl/ml de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.Hcl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5. A trastuzumab (20,30 mg, 4,920 mg/ml, 0,14 μMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1,00 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 0,32 μMol), la mezcla se agitó brevemente y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C. con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de HSP27-Mal), se extrajo una alícuota de alrededor de 2 mg (0,439 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a ab = 4,0). Al Ab-SH (5,1 mg, 35 nMol) se añadió una alícuota del derivado HSP27-Mal (recién preparado en TBS pH 7,5, 2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por 'tiol', 182 nMol), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación del derivado de Trasuzumab-HSP27 BNA, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 3,3 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 17,3 nMol, 6,7 μl de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 μl) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se retiró una alícuota de 0,100 ml de mezcla de Ab-HSP27 BNA y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó mediante el método de Ellman para obtener la incorporación de HSP27. A la mezcla de Ab-HSP27 a granel se añadió una alícuota de solución de NEM recién preparada (0,25 mg/ml, 2,5 equivalentes molares, 89 nMol) y la mezcla se purificó mediante filtración en gel usando un Sephadex G50M de 1,6 x 30 cm con elución con DPBS pH 7,5 seguido por filtración centrífuga repetida y lavado usando un concentrador MWCO de 100 KDa para dar conjugado Trastuzumab-(L-HSP27-L-bloqueado)4 purificado. Los productos se filtraron a 0,2 μM antes de su distribución para evaluación biológica.
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Tabla 6 Condiciones resultados de reacción resumidos
Anticuerpo-(Cys-porción conectora trifuncional-(L-SO1861)-(L-HSP27 BNA))n
Trastuzumab-[S-Tri-(L-SO1861)-(L-HSP27)]4, Trastuzumab-[S-Tri-(bloqueado)-(L-HSP27)]4, Cetuximab-[S-Tri-(L-S 01861)-(L-HSP27)]4, Cetuximab-[S-Tri-(bloqueado)-(L-HSP27)]4
[0335] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó mediante una reacción tioleno de tipo Michael con dos derivados de HSP27 BNA portadores de maleimida (Mal) diferentes que se denominan en lo sucesivo "HSP27-Mal". Estos derivados de HSP27-Mal fueron, a saber: 1) Mal-porción conectora trifuncional-(L-SO1861)-(L-HSP27), 2) Mal-porción conectara trifuncional-(bloqueada)-(L-HSP27). El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-[S-porción conectora trifuncionañ-(L-SO1861)-(L-HSP27 BNA)]4:
El trastuzumab se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina pH 6. A una alícuota de 20 mg (4,0 ml) se agregaron 10 μl/ml de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.Hcl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5.
[0336] A trastuzumab (20,30 mg, 4,920 mg/ml, 0,14 μMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1,00 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 0,32 μMol), la mezcla se agitó brevemente y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de la construcción), se extrajo una alícuota de alrededor de 2 mg (0,439 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Estas alícuotas se caracterizaron mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a ab = 4,0). El Ab-SH a granel se dividió en dos alícuotas (1,1 mg, 7,6 nMol y 1,2 mg, 8,3 nMol), y a cada alícuota se le añadió una alícuota de cada uno de los derivados de HSP27 BNA-Mal1-2 (recién preparados en TBS pH 7,5, 2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por "tiol", 40 nMol y 43 nMol), las mezclas se agitaron en vórtex brevemente y luego se incubaron durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación de derivados de trastuzumab-HSP27 BNA 2, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 3,3 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 17,3 nMol, 6,7 μl de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 μl) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), una alícuota de 0,100 ml de la mezcla de Ab-construcción se extrajo y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización por centrifugación Zeba en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó por el método de Ellman para obtener la incorporación de derivados de HSP27 BNA 2. A cada mezcla de Ab-construcción a granel se añadió una alícuota de solución de NEM recién preparada (0,25 mg/ml, 2,5 equivalentes molares, 19 y 21 nMol) y las mezclas se purificaron mediante filtración en gel usando un Sephadex G50M de 1,6 x 30 cm con elución con DPBS pH 7,5 seguido de filtración centrífuga repetida y lavado usando un concentrador MWCO de 100 KDa para dar conjugados de Trastuzumab-construcción 1-2. Los productos se filtraron a 0,2 μM antes de su distribución para su evaluación biológica.
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Anticuerpo-(L-SO1861)n-(L-HSP27 BNA)n
Síntesis de Trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4, Cetuximab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4 mediante PEG4-SPDP con un DAR4
Síntesis de Cetuximab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)2 (FBR703 STB17/7-8) mediante PEG4-SPDP con un DAR2
[0337] Trastuzumab-(L-SO1861)4, Cetuximab-(L-SO1861)4 se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con BNA HSP27 disulfuro a través de una porción conectora tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y HSP27 BNA. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4:
Se hizo reaccionar oligonucleótido de HSP27 BNA disulfuro (2,7 mg, 470 nMol, 6,10 mg/ml) con TCEP (10 equivalentes molares, 4,7 μMol, 1,34 mg, 50 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos.
Después, el oligo-SH se purificó mediante una columna de desalinización PD10 G25 con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo oligo-SH (2,48 mg, 90 %, 1,24 mg/ml, relación de SH a oligonucleótido = 0,8)
[0338] Se hizo reaccionar Trastuzumab-(L-SO1861)4 (1,3 mg, 8,7 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución de PEG4-SPDP recién preparada (9,26 equivalentes molares, 80,3 nMol, 45 jg ) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (15,1 j l de 2 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización zeba con elución con TBS pH 7,5. Una alícuota del Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP) se extrajo y se analizó mediante análisis UV-Vis. Se determinó la incorporación de SPDP usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM (relación SPDP a Ab = 4). El resto de Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SpDP) se hizo reaccionar con una alícuota de oligonucleótido HSP27 recién preparado (oligo-SH) (8 equivalentes molares, 54,8 nMol, 0,32 mg, 1,24 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó el conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de HSP27 mediante el desplazamiento de piridiil-2-tiona (PDT) a 343 nM. El conjugado crudo se purificó usando una columna Sephadex G50 de 1,6 x 33 cm con elución con Dp BS pH 7,5. El trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-HSP27 BNA)4 resultante se obtuvo como una sola porción. Rendimiento: 0,47 mg, 45 % (0,49 mg/ml), relación HSP27 a Ab = 3,5
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Anticuerpo-(L-QS Mix)n
[0339] Trastuzumab, Cetuximab, se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó con la saponina QS Mix-EMCH mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-L-QS Mix:
Trastuzumab ("Ab", 600 mg) se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina recién preparado de pH 6 (histidina 5 mM pH 6, trehalosa al 2 %, Tween 20 al 0,01 %). Se añadieron 10 jL/mL de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/mL, 1,05M), concentrado de Tris.HCL (623 mg/mL, 3,95M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón de TBS 50 mM, e DtA 2,5 mM, pH 7,5. A trastuzumab (603,8 mg, 4,887 mg/ml, 4,0 jMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 9,5 jMol, 2,72 mg), la mezcla se agitó a mano para mezclarla y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de QS Mix-EMCH), se retiró una alícuota de 2 mg (0,409 ml) de Ab-SH y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman. A la masa Ab-SH se le añadió una alícuota de solución QS Mix-EMCH recién preparada (2 mg/ml, 5,2 equivalentes molares, 21 jMol, 21,6 ml), las mezclas se agitaron en vórtex brevemente y luego se incubaron durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 0,134 ml, 3,33 nMol) con NEM (8,00 equivalentes, 26,6 nMol, 3,3 jg , 13,3 jL de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (13,3 jL) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se extrajo una alícuota de 2 mg (0,481 ml) de mezcla Ab-QS Mix-EMCH y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización giratoria Zeba en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó mediante el método de Ellman para obtener incorporaciones QS Mix-EMCH. A la mezcla Ab-QS Mix-EMCH a granel se añadió una alícuota de solución NEM recién preparada (2,5 mg/ml, 5 equivalentes molares, 20 jMol, 2,51 mg) y la mezcla se almacenó a 2-8°C durante la noche. El conjugado se purificó mediante una columna Sephadex G50M de 10 x 40 cm con elución con DPBS pH 7,5 para dar el conjugado de Trastuzumab-(L-QS Mix) purificado. El producto en su conjunto se concentró y luego se normalizó a 5 mg/ml usando un concentrador vivacell 100 (2000 g, 4 °C, 200 minutos). El producto se filtró a 0,2 jM y se distribuyó para evaluación biológica. Rendimiento: n.d. Relación de QS mix a Ab = 4,1.
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Anticuerpo-(L-HSP27BNA-L-SO1861)n
Trastuzumab-(L-HSP27BNA-L-SO1861)4, Cetuximab-{L-HSP27BNA-L-SO1861)4 con un DAR4.
[0340] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con una saponina SO1861 y un derivado de HSP27 portador de maleimido (Mal) que se denomina en lo sucesivo "HSP27-Mal". El Ab se conjugó con HSP27-Mal mediante una reacción de conjugación de tioleno de tipo Michael. El HSP17-Mal obtiene un enlace lábil (L) hidrazona entre su estructura y su función maleimida, con lo que se genera un enlace lábil entre el HSP27 BNA y Ab. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-HSP27 BNA-L-SO1861)4:
El trastuzumab se reconstituyó a 21 mg/ml con agua desionizada (DI), luego se diluyó a 5 mg/ml usando tampón de histidina pH 6. A una alícuota de 20 mg (4,0 ml) se agregaron 10 jl/m l de cada uno de concentrado de Tris (127 mg/ml, 1,05 M), concentrado de Tris.HCl (623 mg/ml, 3,95 M) y concentrado de EDTA-Na2 (95 mg/ml, 0,26 M) para dar un tampón TBS 50 mM, EDTA 2,5 mM pH 7,5. A trastuzumab (20,30 mg, 4,920 mg/ml, 0,14 jMol) se le añadió una alícuota de solución de TCEP recién preparada (1,00 mg/ml, 2,35 equivalentes molares, 0,32 |jMol), la mezcla se agitó brevemente y luego se incubó durante 90 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de la incubación (antes de la adición de HSP27-Mal), se extrajo una alícuota de alrededor de 2 mg (0,439 ml) de Ab-SH de cada mezcla y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó mediante análisis UV-vis y método de Ellman (relación tiol a ab = 4,0). A la masa Ab-SH (4,7 mg, 32 nMol) se añadió una alícuota del derivado HSP27-Mal (recién preparado en TBS pH 7,5, 2 mg/ml, 1,3 equivalentes molares por 'tiol', 166 nMol), la mezcla se agitó en vórtex brevemente y luego se incubó durante 120 minutos a 20 °C. Además de la reacción de conjugación del derivado de Trasuzumab-HSP27 BNA, se hicieron reaccionar dos alícuotas de Ab-SH desalinizado (0,5 mg, 3,3 nMol) con NEM (1,3 equivalentes molares por 'tiol', 17,3 nMol, 6,7 j l de una solución de 0,25 mg/ml) o tampón TBS pH 7,5 (6,7 j l) durante 120 minutos a 20 °C, como controles positivo y negativo, respectivamente. Después de la incubación (antes de la adición de NEM), se retiró una alícuota de 0,100 ml de mezcla de Ab-HSP27 BNA y se purificó mediante filtración en gel usando una columna de desalinización zeba spin en TBS pH 7,5. Esta alícuota se caracterizó por UV-vis y, junto con los controles positivo y negativo, se caracterizó mediante el método de Ellman para obtener la incorporación de HSP27. A la mezcla de Ab-HSP27 a granel se añadió una alícuota de solución de NEM recién preparada (0,25 mg/ml, 2,5 equivalentes molares, 80 nMol) y la mezcla se purificó por filtración en gel usando un Sephadex G50M de 1,6 x 30 cm con elución con DPBS pH 7,5 seguido por filtración centrífuga repetida y lavado usando un concentrador MWCO de 100 KDa para dar el conjugado Trastuzumab-(L-HSP27 BNA-L-SO1861)4 purificado. Los productos se filtraron a 0,2 jM antes de su distribución para su evaluación biológica.
Figure imgf000101_0001
C
Anticuerpo-(L-SO1861 )n-(S-Diantina)n
Síntesis de trastuzumab-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2 y Cetuximab-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2 a través de SMCC con un DAR2
[0341] Trastuzumab-L-SO1861 y Cetuximab-L-SO1861 se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó con Diantina-Cys mediante una porción conectora de succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), lo que proporciona un enlace amida (S) estable entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 jMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, con una relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0342] Se hizo reaccionar trastuzumab-(L-SO1861)4 (1,5 mg, 10 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución SMCC recién preparada (4,83 equivalentes molares, 48,3 nMol, 16 jg ) en DMSO (0,5 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 j l de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. El Tras-(L-SO1861)-(S-SMCC) (1,22 mg, 8,1 nMol, 2,03 mg/ml) resultante se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys recién reducida (3,2 equivalentes molares, 32,5 nMol, 0,97 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, el conjugado se concentró a ≤ 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5. El conjugado tras-(L-SO1861)4-(S-Diantina)2 resultante se obtuvo como fracciones de alto peso molecular (HMW) (0,36 mg, 30 %, 0,34 mg/ml, relación diantina a Ab = no determinada) y bajo peso molecular (LMW) (0,49 mg, 40 %, 0,30 mg/ml, relación de diantina a Ab = no determinada). Rendimiento: n.d. Pureza: 79,3 %.
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T bl 11 C di i l d d ió id
12. Anticuerpo-(S-diantina)n
Síntesis de Trastuzumab-(S-Diantina)2, Cetuximab-(S-diantina)2, a través de SMCC con un DAR2
[0343] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". El Ab se conjugó con Diantina-Cys mediante una porción conectora de succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) que proporciona un enlace amida (S) estable entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-(S-Diantina)2:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 μMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0344] Se hizo reaccionar trastuzumab (1,5 mg, 10 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de solución SMCC recién preparada (3,16 equivalentes molares, 31,6 nMol) en DMSO (0,5 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 |μl de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. El Tras-(S-SMCC) resultante (1,22 mg, 8,1 nMol, 2,03 mg/ml) se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys recién reducida (3,2 equivalentes molares, 32,5 nMol, 0,97 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, el conjugado se concentró a ≤ 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5.
[0345] Rendimiento: n.d. Pureza: 99 %.
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Tabla 12 Condiciones resultados de reacción resumidos
Anticuerpo-(L-S01861)n-(L-diantina)n
Síntesis de Trastuzumab-(L-SO1861)4-(L-Diantina)2 y Cetuximab-(L-SO1861)4-(L-Diantina)2 mediante PEG4-SPDP con un DAR2
[0346] Trastuzumab-L-S01861 y Cetuximab-L-S01861 se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con Diantina-Cys a través de un tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-L-S01861:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 μMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0347] Trastuzumab-(L-S01861)4 (0.75 mg, 5 nMol, 2,50 mg/ml) se hizo reaccionar con una alícuota de solución de PEG4-SPDP recién preparada (4,95 equivalentes molares, 24,75 nMol, 14 jg ) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 j l de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. Se extrajo una alícuota de Tras-(L-SO1861)-(S-PEG4-SPDP) y se analizó mediante análisis UV-Vis. La incorporación de SPDP se determinó usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM (relación de SPDP a Ab = 2,4). El resto de Tras-(L-SO1861)-(S-PEG4-SPDP) se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys (proteína-SH) recién preparada (4 equivalentes molares, 20 nMol, 0,6 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó una alícuota del conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de Diantina-Cys por desplazamiento de PDT. Después, el conjugado se concentró a ≤ 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5. Relación de diantina a Ab = 2). Rendimiento: n.d. Pureza: 60,5 %.
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Anticuerpo-(L-diantina)"
Trastuzumab-(L-diantina)2, Cetuximab-(L-diantina)2 y síntesis a través de PEG4-SPDP con un DAR2
[0348] Trastuzumab y Cetuximab se denominan en lo sucesivo "Ab". Ab se conjugó con Diantina-Cys a través de una porción conectora tetra(etilenglicol) succinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (PEG4-SPDP) que forma un puente disulfuro lábil (L) entre Ab y Diantina. El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Trastuzumab-L-SO1861:
Se hizo reaccionar diantina-Cys (7,8 mg, 261 nMol, 0,78 mg/ml) con TCEP (5 equivalentes molares, 1,31 jMol, 0,37 mg, 1 mg/ml) durante 30 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la proteína-SH se purificó mediante una columna de desalinización de zeba con elución en TBS pH 7,5 y se utilizó rápidamente. Se obtuvo proteína-SH (5,2 mg, 67 %, 0,52 mg/ml, relación de SH a proteína = 1 ± 0,1).
[0349] Se hizo reaccionar trastuzumab (0,75 mg, 5 nMol, 2,50 mg/ml) con una alícuota de Solución de PEG4-SPDP recién preparada (3,35 equivalentes molares, 16,75 nMol) en DMSO (1 mg/ml) durante 60 minutos a 20 °C con mezclador de rodillos. Después, la reacción se inactivó con glicina (18,1 j l de 1 mg/ml de solución recién preparada en TBS pH 7,5) y luego se desalinizó mediante una columna de desalinización Zeba con elución con TBS pH 7,5. Se extrajo una alícuota del Tras-(S-PEG4-SPDP) y se analizó mediante análisis UV-Vis. La incorporación de SPDP se determinó usando TCEP para liberar piridiil-2-tiona (PDT) y mediante análisis UV-vis a 343 nM. El resto de Tras-(S-PEG4-SPDP) se hizo reaccionar con una alícuota de Diantina-Cys (proteína-SH) recién preparada (4 equivalentes molares, 20 nMol, 0,6 mg, 0,52 mg/ml) y se incubó durante la noche a 20 °C con mezclador de rodillos. Después de 17 horas, se analizó una alícuota del conjugado mediante análisis UV-vis para determinar la incorporación de Diantina-Cys por desplazamiento de p Dt . Después, el conjugado se concentró a ≤ 1 ml usando un concentrador vivaspin T4 y se purificó usando una columna Superdex 200PG de 1,6 x 37 cm con elución con DPBS pH 7,5. Relación de diantina a Ab = 2). Rendimiento: n.d. Pureza: 67,7 %.
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Ejemplo 10
Materiales y métodos
[0350] En nuestra investigación actual, se investigó un modelo de estructura de base que consiste en cuatro brazos moleculares para la unión de la saponina mediante una base de Schiff (imina) y un brazo para la química clic. La estructura polimérica (Figura 19) es un dendrímero de polietilenglicol pentavalente de la primera generación (es decir, número de ciclos de ramificación repetidos) que se adquirió de Iris Biotech GmbH (Marktredwitz, Alemania). La saponina (en este ejemplo, SA1641) se purificó a partir de un extracto crudo compuesto de saponina de la especie Gypsophila llamada Saponinum album obtenido de Merck (Darmstadt, Alemania). El extracto crudo en polvo (2,5 g) se hidrolizó en agua (100 ml) con hidróxido de sodio (0,2 g). La solución se agitó durante 20 h a 40 °C y luego se complementó con ácido acético glacial hasta que se alcanzó un pH de 5,0. Para eliminar los taninos, la solución se agitó en un embudo de decantación con 30 ml de butanol. Se recapturó la fase acuosa y se repitió la extracción con butanol dos veces. Las fases de butanol se suplementaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se agruparon. Se evaporó el butanol y el polvo de saponina restante se resolvió en metanol al 20 % hasta una concentración final de 30 mg/ml. Después de una breve sonicación, se separaron diferentes saponinas mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los tubos (excluyendo la columna) se enjuagaron con agua tibia (40 °C) a un flujo de 1,5 ml/min y luego se incluyó la columna Eurospher RP-C18 (5 μM, 250 x 8 mM) con isopropanol (100 %). Se aplicaron saponinas a la columna y se eluyeron con un gradiente de metanol (20 % de metanol a 70 % de metanol en 30 min a 1,5 ml/min en agua suplementada con ácido trifluoroacético al 0,01 % seguido de metanol al 70 % durante 60 min más) (Sama et al., 2018). Se analizaron alícuotas de las fracciones para determinar su contenido de SA1641 mediante espectrometría de masas con ionización por electropulverización (ESI-MS). Se reunieron las fracciones que contenían SA1641 puro y se evaporó el metanol. La solución acuosa se congeló como una película delgada en un matraz giratorio de fondo redondo mediante el uso de hielo seco. Después de almacenamiento durante 16 h a-80 °C, la muestra se liofilizó. Para producir la estructura de base como se define en la invención, la estructura polimérica (0,2 mM) y SA1641 (3,2 mM) se disolvieron en agua (aproximadamente pH 8 ) y se mezclaron volúmenes iguales y se agitaron durante 24 h a 26°C. Luego, se añadió cianoborohidruro de sodio (NaCNBHa; 0,1 M) en un exceso molar de 4 veces referido a SA1641 y la muestra se incubó durante 24 h más. A continuación, se verificó la estructura mediante cromatografía líquida de ultra resolución (UPLC)/ESI-MS. Las muestras se aplicaron a una columna RP-C4 y se eluyeron con un gradiente de metanol (metanol al 25 % a metanol al 80 % en 15 min en agua suplementada con ácido trifluoroacético al 0,01 % de seguido de metanol al 80 % durante 10 min más). Las fracciones se analizaron mediante el uso de LockSpray ™, que es una fuente de iones diseñada específicamente para la medición de masa exacta con ionización por electropulverización utilizando espectrómetros de masas LC-time-of-flight (LC-T0F) de Waters Corporation.
Resultados
[0351] La Tabla de la Figura 20 muestra el espectro de masas teóricamente esperado obtenido de un cálculo con la calculadora de patrones de isótopos enviPat Web 2.0. El patrón considera la carga de la molécula y la aparición natural de isótopos, razón por la cual se espera más de un pico para una sola sustancia. Los datos experimentales (Figura 20) obtenidos por UPLC/ESI-Ms muestran casi exactamente los mismos picos en m/z 758-760 con la misma intensidad que la esperada, lo que demuestra una unión exitosa de SA1641 a la estructura polimérica.
Ejemplo 11
Materiales y métodos
[0352] Como ejemplo de una sustancia activa farmacéutica, se utilizó la toxina diantina-factor de crecimiento epidérmico (diantina-EGF) dirigida. Se añadió el plásmido His-diantina-EGF-pET11d (Weng et al, 2009) (100 ng) a 20 μL de Escherichia coli Rosetta™ 2 (DE3) μLysS Competent Cells (Novagen, San Diego, CA, EE. UU.). Las células se transformaron mediante choque térmico (30 min en hielo, 90 s a 42 °C y 1 min en hielo). Posteriormente, se añadieron 300 μl de caldo de lisogenia (LB) y la suspensión se incubó durante 1 h a 37 °C mientras se agitaba a 200 r.p.m. Se inoculó una placa de agar de caldo de lisogenia precalentada con 50 μg/ml de ampicilina con 100 μl de suspensión de bacterias y la placa se incubó durante la noche a 37 °C. Se inoculó caldo de lisogenia (3 ml) con 50 μg/mL de ampicilina con una colonia de la placa y se incubaron las bacterias durante 8 h a 37 °C y 200 r.p.m. La suspensión (50 μl) se añadió a 500 ml de caldo de lisogenia con 50 μg/ml de ampicilina y se incubó durante la noche a 37 °C y 200 r.p.m. Posteriormente, el volumen se aumentó a 2,0 L y las bacterias crecieron en las mismas condiciones hasta que se alcanzó una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nM de 0,9. A continuación, se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. La expresión de proteínas duró 3 h a 37 °C y 200 r.p.m. Finalmente, la suspensión bacteriana se centrifugó a 5000 x g y 4 °C durante 5 min, se resuspendió en 20 ml de PBS (NaCl137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HP048,1 mM, KH2P041,47 mM) y se almacenó a -20 °C hasta su uso. Para la purificación, las suspensiones bacterianas se descongelaron y se lisaron mediante sonicación. Los lisados se centrifugaron (15800 x g, 4 °C, 30 min) y se añadió imidazol hasta una concentración final de 20 mM. El sobrenadante se incubó con 2 ml de agarosa de ácido Ni-nitrilotriacético bajo agitación continua durante 30 min a 4 °C en presencia de imidazol 20 mM. Posteriormente, el material se vertió en una columna de 20 ml y se lavó tres veces con 10 ml de tampón de lavado (NaH2P0450 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) y diantina EGF eluidos por porciones de 10 ml de concentraciones crecientes de imidazol (31, 65, 125 y 250 mM) en tampón de lavado. Las fracciones de eluato (2 ml) se dializaron durante la noche a 4 °C con a 2,0 l de PBS. La diantina-EGF desalinizada se concentró mediante un Amicon® Ultra-15 (10 kDa) y se cuantificó la concentración de proteína.
[0353] Para introducir un grupo de química clic adecuado en diantina-EGF, se disolvió éster de alquino-PEG-N-hidroxisuccinimidilo en un exceso molar de 8 veces referido a diantina-EGF en dimetilsulfóxido y se añadió a 9 volúmenes de diantina-EGF (1 mg en NaH2PO4/N/A2HPO40,2 M, pH 8). Después de la incubación a temperatura ambiente durante 4 h, se separó el alquino no unido mediante el uso de una columna PD10 (GE-Healthcare, Freiburg, Alemania). La química clic con la estructura polimérica se llevó a cabo mediante cicloadición de alquino-azida catalizada por cobre (I). Alquino-diantina-EGF (0,02 mM), dendrímero (0,05 mM), CuSO4 (0,1 mM), tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (0,5 mM) y ascorbato de sodio (5 mM) se incubaron con agitación suave durante 1 h a temperatura ambiente en NaH2PO4/N/A2HPO4 0,1 M, pH 8. A continuación, se separaron las sustancias de bajo peso molecular utilizando una columna PD10.
[0354] Para probar la eficacia de la invención, se realizó un ensayo de viabilidad con células HER14. Estas células son fibroblastos transfectados de forma estable con el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano y, por lo tanto, son células diana de la toxina diantina-EGF dirigida. Se sembraron células HER14 (2000 células/100 μl/pocillo) en pocillos de placas de cultivo celular de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 % a 37 °C, 5 % CO2 y 98 % de humedad. A continuación, se añadieron las diferentes sustancias de prueba (véanse los resultados y la Figura 21) por triplicado en un volumen de 25 μL y se complementaron con 25 μL adicionales de medio. Después de una incubación de 72 h, se añadieron 30 μl de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (0,5 mg/ml en agua) por pocillo y se incubó durante 2 h. Después de eso, el medio se retiró cuidadosamente y se reemplazó por una solución acuosa que contenía isopropanol al 10 % (v/v), dodecilsulfato de sodio al 5 % (p/v) y HCl 400 mM, y se incubó durante 5 min. El formazán solubilizado se cuantificó fotométricamente a 570 nM en un lector de microplacas (Spectra MAX 340 PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Las células sin tratar se normalizaron a 1 y todas las muestras se refirieron al control sin tratar. La significancia se determinó mediante pruebas t de dos muestras independientes.
Resultados
[0355] La estructura polimérica, en el ejemplo un dendrímero pentamérico (Pentrimer), no tiene ningún efecto citotóxico sobre las células diana, ni en ausencia ni en presencia de SA1641 (Figura 27, columnas 2 y 3). En ausencia de la estructura de base, la toxina dirigida (diantina-EGF) muestra la mitad de la toxicidad máxima a una concentración de 0,1 nM (columna 4). En presencia de SA1641, la misma concentración da como resultado la destrucción de todas las células, lo que indica la capacidad general de SA1641 para actuar como un potenciador del escape endosomal (columna 5). La presencia de la estructura polimérica no afecta a la toxicidad de diantina-EGF ni en presencia ni en ausencia de SA1641 (columnas 6 y 7), lo que indica que la estructura de base no afecta a la toxicidad de diantina-EGF. Para unir la estructura polimérica modelo mediante química clic a la sustancia farmacéuticamente activa de ejemplo de diantina-EGF, la sustancia tenía que unirse antes con un grupo alquino. Como consecuencia de esta modificación, la diantina-EGF perdió algo de actividad (compárese las columnas 8 y 9 con 6 y 7, respectivamente); sin embargo, la modificación no dirigida de alquino no afecta a la idea de la invención y tampoco se requiere en aplicaciones futuras. Hubo que introducir el alquino de forma no dirigida con fines de prueba solo con el riesgo de afectar al centro farmacéuticamente activo de la toxina. Un fabricante de una sustancia farmacéuticamente activa puede introducir la posición de clic durante la síntesis directamente en la sustancia en una posición de su elección en la que la actividad de la sustancia no se vea afectada. No hubo pérdida adicional de actividad con la reacción de química clic entre la sustancia farmacéuticamente activa modificada con alquino y la estructura polimérica, lo que indica que la estructura polimérica en sí no era tóxica (columnas 10 y 11).
Ejemplo 12
Materiales
[0356] Los siguientes productos químicos se utilizaron tal como se compraron: metanol (MeOH, LiChrosolv, Merck), hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico (EMCH, 95 %, TCI Chemicals), ácido trifluoroacético (TFA, 99,8 %, Carl Roth), 2-mercaptoetanol ( 98 %, Sigma-Aldrich), poli(amidoamina) (dendrímero PAMAM, núcleo de etilendiamina, solución de generación 5.0, Sigma-Aldrich), cianina 3 ácido carboxílico (Cy3-COOH, 95 %, Lumiprobe), 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]piridinio hexafluorofosfato 3-óxido, N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]piridina-1-ilmetilen]-N-metilmetanaminio hexafluorofosfato N-óxido (HATU, 97 %, Sigma-Aldrich), porción V de albúmina sérica bovina (BSA, Carl Roth), dimetilsulfóxido (DMSO, 99 %, Carl Roth), clorhidrato de 2-iminotiolano (98 %, Sigma-Aldrich), rodamina b (RhodB, 95 %, Merck), solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS, Gibco), ácido clorhídrico (HCl, 37 %, Merck), NHS-PEG13-DBCO (Click Chemistry Tools), Alexa Fluor 488 5-t Fp (Thermo-Fischer), azido-PEG3-SS-NHS (Conju-Probe), cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3, 95 %, Sigma-Aldrich) persulfato de amonio (APS, 98 %, Sigma-Aldrich), N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TMEDA, 99 %, Sigma-Aldrich), péptido personalizado SESDDAMFCDAMDESDSK (95 % , PeptideSynthetics), azido-dPEG12-NHS (95 %, Quanta Biodesign), dendrón PFd-G4-Azida-NH-BOC (4G-dendrón, 95 %, Polymer Factory), Cianina5-DBCO (Cy5-DBCO, 95 %, Lumiprobe), Cloroformo (CHCh, 99,5 %, Sigma), filtros centrífugos Amicon Ultra de 0,5 ml (mWCo de 3 kDa, Sigma), mPEG-SCM (mPEG2k-NHS, 95,6 %, Creative PEG Works), filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml (MWCO de 10 kDa, Sigma).
Métodos
MALDI-TOF-MS
[0357] Se registraron espectros MALDI-TOF en un espectrómetro de masas MALDI (Bruker Ultrafex III). Por lo general, la muestra disuelta en agua MilliQ en un rango nanomolar a micromolar se depositó en la diana (MTP 384 placa de acero pulido TF, Bruker Daltons) usando super-DHB (99 %, Fluka) o ácido sinapínico (SA, 99 %, Sigma-Aldrich) como matriz disuelta en acetonitrilo (analizado por MADLI-TOF-MS, Sigma)/TFA al 0,1 % (7:3 v/v) mediante el método de gotas secas. PepMix (estándar de calibración de péptidos, Bruker Daltons) o ProteMass (estándar de calibración de proteínas, Sigma-Aldrich) sirvieron como estándares de calibración. El modo RP se refiere al modo reflector positivo. El modo RN se refiere al modo reflector negativo. El modo LP se refiere al modo lineal positivo.
H-RMN
[0358] El análisis de RMN de H1 se realizó usando un espectrómetro de RMN Bruker de 400 MHz. La preparación de la muestra, en la que se habían disuelto 2 mg de muestra en 0,8 ml de metanol-Ü4 (99 %, Deutero), se realizó 24 h antes de la medición.
UV-Vis
[0359] Las mediciones de UV-Vis se realizaron en un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 en el rango espectral de 200-750 nM.
Cromatografía de exclusión por tamaño
[0360] La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se realizó con Sephadex G 25 Superfine de GE Healthcare y en columnas PD10 preempaquetadas (GE Healthcare, Sephadex G 25 M). El material se activó mediante hinchamiento en el eluyente respectivo antes de realizar la cromatografía.
Diálisis
[0361] Se utilizaron membranas de celulosa regenerada: MWCO = 1 y 2 kDa (Spectra/Por) y MWCO = 12-14 kDa (Carl Roth) para realizar la diálisis. Normalmente, la diálisis se realizó durante 24 h con 1 L de disolvente, que se cambió después de las primeras 6 h del proceso.
Liofilización
[0362] La liofilización se realizó en un Alpha 1-2 LD plus (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH). Normalmente, las muestras se congelaron con nitrógeno líquido y se colocaron en el liofilizador a alto vacío. Síntesis de SO1861-EMCH
[0363] Se colocaron SO1861 de Saponaria officinalis L (59 mg, 31,7 μMol) y EMCH (301 mg, 888 μMol) en un matraz redondo con agitador y se disolvieron en 13 ml de metanol. Se añadió TFA (400 |_il, cat.) a la solución y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un agitador magnético RCT B (IKA Labortechnik). Después de agitación durante 3 h, la mezcla se diluyó con agua MilliQ o PBS y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ o PBS utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo blanco. Rendimiento 62,4 mg (95 %). Las alícuotas secas se utilizaron adicionalmente para la caracterización mediante RMN de 1H y MALDI-TOF-MS.
[0364] RMN de 1H (400 MHz, metanol-Ü4) (Figura 22 A, SO1861): 5 = 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones del esqueleto de azúcar), 9,43 (1H, s, protón de aldehído de saponina, Ha).
[0365] RMN de 1H (400 MHz, metanol-Ü4) (Figura 22 B. SO1861-EMCH, tratratamiento del crudo de reacción con PBS): 5 = 0,50-5,50 (m, triterpenoide de saponina y protones del esqueleto de azúcar), 6,79 (2 H, s, protones de maleimida, HC), 7,62-7,68 (1 H, m, protón de hidrazona, HB).
[0366] MALDI-TOF-MS (modo RP) (Figura 12 A): miz 2124 Da ([M K]+, saponina-EMCH), miz 2109 Da ([M K] , SO1861-EMCH), miz 2094 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH)
[0367] MALDI-TOF-MS (modo RN) (Figura 28): miz2275 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2244 Da ([M-h ]", conjugado de saponina-EMCH), 2222 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2178 Da ([M-H]-, conjugado saponina-EMCH), 2144 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2122 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2092 Da ([M-H]-, conjugado de saponina-EMCH), 2070 Da ([M-H]-, SO1861-EMCH), 2038 Da ([M-H]-, SO1832-EMCH), 1936 Da ([M-H]-, SO1730-EMCH), 1861 Da ([M-H]-, SO1861).
SO1861 -EMCH-mercaptoetanol
[0368] A SO1861-EMCH (0,1 mg, 48 nMol) se añadieron 200 |_il de mercaptoetanol (18 mg, 230 μMol) y la solución se agitó durante 1 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 1 h, la solución se diluyó con metanol y se dializó extensamente durante 4 h con metanol utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (SpectraiPor 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, se extrajo una alícuota y se analizó mediante MALDI-TOF-MS.
[0369] MALDI-TOF-MS (Figura 23B) (modo RP): miz 2193 Da ([M K]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol), miz 2185 Da ([M K]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol), miz 2170 Da ([M Na]+, SO1861-EMCH-mercaptoetanol).
Síntesis de BSA-SO1861
[0370] Se añadió 2-iminotiolano (231 μg, 1,1 μMol) disuelto en 47 μL de PBS a una solución de BSA-RhodB (10 mg, 0,15 μMol) en 200 μL de PBS y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente a través de una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml) y se añadió SO1861-EMCH (1 mg, 0,5 μMol) disuelto en 100 μL de PBS a la porción de BSA-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, el BSA-SO1861 se concentró mediante filtración centrífuga a 4 000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado.
[0371] MALDI-TOF-MS (Figura 15 A) (modo LP): miz 74.2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 4 SO1861 unidas), 72,2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 3 SO1861 unidas), 70,2 kDa ([M H]+, BSA-SO1861 con 2 SO1861 unidas), 37,0 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 4 SO1861 unidas), 35,9 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 3 SO1861 unidas), 34,7 kDa ([M H]2+, BSA-SO1861 con 2 SO1861 unidas).
Cy3-PAMAM
[0372] Se colocaron μL 720 de PAMAM disuelta en metanol (30 mg, 1,04 μMoL) en un matraz redondo de 250 ml y se extrajo el metanol mediante un evaporador rotatorio (20 mbar, 60 °C). La PAMAM restante se disolvió en 9 ml de DMSO. Se añadió HATU (7,6 mg, 20 μMol) disuelto en 0,5 ml de Dm SO a una solución de Cy3-COOH (0,6 mg, 1,2 μMol) en DMSO y la mezcla se agitó durante 1 h a 800 r.p.m a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf ). Después de la agitación durante 1 h, se añadió la solución de HATU-Cy3 a la solución de PAMAM en agitación y la mezcla de reacción se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (SpectraiPor 6) con un MWCO de 2 kDa. Después de la diálisis, el volumen de la solución de conjugado se redujo mediante un evaporador rotatorio (20 mbar, 60 °C) y la solución de conjugado concentrada se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml). La primera porción se recogió y liofilizó para obtener el conjugado rosa viscoso PAMAM-Cy3. La formación del conjugado PAMAM-Cy3 se confirmó mediante cromatografía en capa fina (metanoliagua, viv 1: 1) y la aparición de una banda más rápida en una columna superfina Sephadex G 25. Rendimiento 21,3 mg (63 %). La relación molar de colorante por PAMAM determinada por espectrofotometría UV-Vis fue de 0,43.
[0373] MALDI-TOF-MS (Figura 33 A) (modo LP): miz 28,0 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM).
Síntesis Cy3-PAMAM-SO1861
[0374] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)5. Se añadió 2-iminotiolano (1 mg, 6,7 μMol) disuelto en 250 μL de agua MilliQ a una solución de PAMAM-Cy3 (0,5 mg, 17 nMol) en 125 μL de agua MilliQ y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente por una columna de exclusión de tamaño superfino Sephadex G25 (volumen de columna de 16 ml) y se añadió S01861-EMCH (176 μg, 85 nMol) disuelto en 40 μL de agua MilliQ a la porción de Cy3-PAMAM-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf).
Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución Cy3-PAMAM-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) a través de filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,5 mg (75 %).
[0375] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en las Figuras 33 B-D y la Figura 34. MALDI-TOF-MS de Cy3-PAMAM-(SO1861)a (Figura 33 B) (modo LP): miz 38,4 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-SO1861), 17,9 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861).
[0376] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5, Cy3-PAMAM-(SO1861)13, Cy3-PAMAM-(SO1861)51y Cy3-PAMAM-(SO1861 )27, se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes de los materiales de partida 2-iminotiolano y SO1861-EMCH. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 15.
Figure imgf000108_0001
T l 1 P i l í i PAMAM 1 1
Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861
[0377] Cy3-PAMAM (0,5 mg, 18 nMol), SO1861 (2,3 mg, 1,24 μMol) y HATU (64,6 mg, 170 μMol) se disolvieron por separado en 200 μL de DMSO. Las soluciones de SO1861 y HATU se mezclaron y agitaron durante 20 min a 800 r.p.m y a temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 20 min, se añadió solución Cy3-PAMAM a la solución SO1861-HATU en agitación y se dejó agitar la mezcla de reacción durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4 000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado de Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17 se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,77 mg (69 %).
[0378] MALDI-TOF-MS (Figura 35) (modo LP): miz 62.3 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 35,7 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
Marcado con colorante y desprotección de 4G-dendrón
[0379] Se colocó PFd-G4-Azida-NH-BOC (4G-dendrón) (9,75 mg, 2,11 μMol) en un tubo de reacción de 2 ml (Eppendorf) y se disolvió en 200 μL de DMSO. Se añadieron 100 μL de una solución de Cy5-DBCO en DMSO (1,72 μMol * ml-1, 170 nMol) a la solución de 4G-dendrón (dendrón de 4a generación) y la mezcla se agitó durante 12 horas a temperatura ambiente y 800 r.p.m en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (SpectraiPor 7) con un MWCO de 1 kDa. Después de la diálisis, la solución se liofilizó para obtener un polvo azul. El producto crudo se usó tal como se obtuvo por liofilización para el paso de desprotección.
[0380] Se disolvió 4G-dendrón liofilizado parcialmente marcado con Cy5 en 12 ml de CHCl3 en matraz redondo de 50 ml con agitador. Se añadieron 12 ml de TFA y la mezcla de reacción se agitó durante 3 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un agitador magnético RCT B (IKA Labortechnik). Después de la agitación durante 3 h, se extrajo el disolvente a presión reducida (50 °C, 30 mbar) en un evaporador rotatorio (Heidolph WB 2000). Después de la evaporación, el lote se disolvió en agua MilliQ y se pasó a través de una columna de exclusión por tamaño PD10. La formación del conjugado 4G-dendrón se confirmó mediante cromatografía en capa fina (metanol/agua, v/v 1: 1) y la aparición de una banda más rápida en una columna PD10. La porción obtenida de la cromatografía de exclusión por tamaño se liofilizó para obtener un polvo azul.
[0381] Rendimiento 5,7 mg (93 %). La relación molar de colorante por Dendrón G4 determinada por espectrofotometría UV-Vis fue de 0,012.
[0382] MALDI-T0F-MS (Figura 32 B) (modo RP): m/z 3956 Da ([M Na]+, Cy5-4G-dendrón PF6-contraión), 3820 Da ([M Na]+, Cy5-4G-dendrón-PF6'contraión), 3617 Da ([M H]+, Impureza 4G-dendrón), 3017 ([M H]+, 4G-dendrón).
Síntesis de 4G-dendrón-SO1861
[0383] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más baja de 4G-dendrón a SO1861-EMCH. Se añadió 2-iminotiolano (2,65 mg, 19,2 μMol) disuelto en 300 μL de agua MilliQ a una solución de dendrón G4 parcialmente marcada con Cy5 (0,577 mg, 192 nMol) en 252 μL de agua MilliQ y la mezcla se agitó durante 40 min a 800 r.p.m. y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 40 min, la mezcla de reacción se pasó inmediatamente a través de una columna de exclusión por tamaño PD10 y se añadió SO1861-EMCH (1,19 mg, 575 nMol) disuelto en 100 μL de agua MilliQ a la porción de 4G-dendrón-SH recogida. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se concentró mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra (MWCO de 3 kDa). El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 90 nMol (47 %).
[0384] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 33. MALDI-TOF-MS de 4G-dendrón-SO1861 (Figura 33 C) (modo LP): m/z 10,19 kDa ([M H]+, Cy5-4G-dendrón-[SO1861]s), 9,27 kDa ([M H]+, 4G-dendrón-[SO1861]s), 7,92 kDa ([M H]+, Cy5-4G-dendrón-[SO1861]2), 7,14 kDa ([M H]+, 4G-dendrón-[SO1861]2), 5,86 kDa ([M H]+, Cy5-4G-dendrón-[SO1861]1), 5,07 kDa ([M H]+, 4G-dendrón-[SO1861]1).
[0385] La síntesis de otros conjugados de 4G-dendrón-(SO1861)n se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida SO1861-EMCH. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 16.
Figure imgf000109_0001
T l 1 P r m r r i n r l ín i 4 n r n 1 1
Tiolación de PAMAM
[0386] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más alta de PAMAM a 2-iminotiolano. A una solución de PAMAM (333 μg, 12,8 nMol) disuelta en 30 μL de metanol se añadió 2-iminotiolano (0,53 mg, 3,84 μMol) disuelto en 128 μL de agua MilliQ. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se lavó 4 veces con agua MilliQ mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra (MWCO de 3 kDa) a 15 °C y 13500 r.p.m. Después del lavado, la muestra se liofilizó para obtener un sólido blanco. No se determinó el rendimiento.
[0387] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 51. MALDI-TOF-MS de PAMAM-(SH)108 (Figura 51 C) (modo LP): m/z 41.5 kDa ([M H]+, PAMAM-[SH]10s).
[0388] La síntesis de otros conjugados de PAMAM-iminotiolano se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida 2-iminotiolano. Para la reacción de partida de 2-iminotiolano más baja, se utilizó Cy3-PAMAM.
[0389] Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 17.
Figure imgf000110_0001
PEGilación de PAMAM
[0390] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para la relación más baja de PAMAM a mPEG2k. A una solución de PAMAM (333 μg, 12,8 nMol) disuelta en 10 μL de DMSO se añadió mPEG2k-NHS (0,268 mg, 128 nMol) disuelto en 13 μL de DMSO. La mezcla de reacción se agitó durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (Spectra/Por 6) con un MWCO de 2 kDa. Después de la diálisis, el lote se concentró mediante filtración centrífuga usando filtros centrífugos Amicon Ultra de 15 ml (MWCO de 10 kDa). El lote concentrado se pasó a través de una columna de exclusión por tamaño PD10 seguido de liofilización para obtener un polvo esponjoso blanco. No se determinó el rendimiento.
[0391] Los espectros MALDI-TOF-MS se ilustran en la Figura 52. MALDI-TOF-MS de PAMAM-(mPEG2k)3 (Figura 52 C) (modo LP): m/z 33.46 kDa ([M H]+, PAMAM-[mPEG2k]s).
[0392] La síntesis de otros conjugados de PAMAM-mPEG2k se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en los equivalentes del material de partida mPEG2k-NHS. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 18.
Figure imgf000110_0002
Síntesis de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO
[0393] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10. Cy3-PAMAM-(SO1861)27 (0.41 mg, 4,71 nMol) se liofilizó y se disolvió en 100 μL de DMSO. Se añadió éster de DBCO-PEG13-NHS (0,197 mg, 188 nMol) disuelto en DMSO a la solución de Cy3-PAMAM-SO1861 y la mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,1 mg (22 %).
[0394] MALDI-TOF-MS (Figura 36 D) (modo LP): m/z 92.5 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO), 53,0 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO).
[0395] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5-(DBCO)38 y Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente. Los respectivos equivalentes del material de partida y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 19.
Figure imgf000110_0003
Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO
[0396] Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)1 (0,3 mg, 4,8 nMol) se liofilizó y se disolvió en 100 μL de DMSO. Se añadió éster de DBCO-PEG13-NHS (0,202 mg, 194 nMol) disuelto en DMSO a la solución Cy3-pAMAM-NC-SO1861 y la mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 3 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 0,1 mg (22 %). La espectrometría de masas indica la conjugación de 30 restos de DBCO por molécula de PAMAM. MALDI-TOF-MS (Figura 36 B) (modo LP): miz 93.2 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO), 49,6 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO1.
Expresión de EGFdiantina y diantina
[0397] Se transformó ADN plasmídico (His-diantina-EGF-pET11d o His-diantina-pET1 1d) [20] en Escherichia coli NiCo21 (DE3) químicamente competente (New England Biolabs®, Inc.) y se cultivó en 3 ml de caldo de lisogenia complementado con 50 μgiml de ampicilina a 37 °C durante 5 h a 200 r.p.m. Estas bacterias se usaron para inocular 500 ml de caldo de lisogenia suplementado con 50 μgiml de ampicilina para cultivarlo durante la noche a 37 °C. Posteriormente, el volumen del cultivo se aumentó hasta 2 L y las bacterias se cultivaron hasta una densidad óptica (A600) de 0,9. La expresión de proteínas se indujo mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Las células se cultivaron adicionalmente durante 3 horas a 37 °C y 200 r.p.m. Después de la centrifugación (5 min, 5000 g, 4 °C), los sedimentos celulares se resuspendieron en 20 ml de solución salina tamponada con fosfato (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) con Ca2+ y mg2+, pH 7,4) y se almacenaron a -20 °C. Después de la descongelación, las proteínas se liberaron mediante un dispositivo de ultrasonido (Branson Sonifier 250, G. Heinemann). La solución se centrifugó (15800 x g, 30 min, 4 °C) y se ajustó a una concentración de imidazol de 20 mM. La construcción contenía una etiqueta de histidina N-terminal y se purificó mediante cromatografía en ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Alemania). Después de eluir con imidazol (20-250 mM), los eluatos se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (12 %). Las fracciones que contenían diantina-EGF o diantina se dializaron con 2 l de tampón de dominio de unión a quitina (tris(hidroximetil)-aminometanoiHCl 20 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 al 0,1 %, pH 8,0) a 4 °C. La purificación adicional mediante cromatografía de afinidad en columna de quitina sirvió para eliminar proteínas bacterianas con actividad de unión a agarosa Ni-NTA. Después de la elución con tampón de dominio de unión a quitina, las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE (12 %). Las fracciones que contenían diantina-EGF o diantina se dializaron con 5 L de PBS a 4 °C. Las proteínas purificadas se concentraron mediante dispositivos de filtro centrífugo Amicon (10 kDa, Millipore, Eschborn, Alemania). La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo de ácido bicinconínico (Pierce, Rockford, EE. UU.).
Síntesis de Diantina-EGF-Alexa488
[0399] Se colocó una solución de diantina-EGF (240 μg, 6,7 nMol) en PBS en un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa y se centrifugó tres veces a 4000 r.p.m y 4 °C durante 30 min. Después de cada ciclo, el filtro Amicon se volvió a llenar con tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9. Después del tercer ciclo de centrifugación, el volumen se redujo a 0,5 ml mediante centrifugación. La solución de carbonato de sodio de diantina-EGF se colocó en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió Alexa Fluor ™ 4885-TFP (50 μg, 56 nMol) disuelto en 10 μl de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 80 min. Después de la agitación, la mezcla se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño Sephadex G25 M (GE Healthcare, columna PD10). El conjugado diantina-EGF-Alexa488 se almacenó en solución en tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9 en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: 210 μg (85 %).
[0399] MALDI-TOF-MS (Figura 37 D) (modo LP): miz 36,8 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488), miz 33.6 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488), 18,8 kDa ([M H]2+, diantina-EGF-Alexa488), 16,6 kDa ([M H]2+, diantina-EGF-Alexa488).
Síntesis de Diantina-Alexa488
[0400] Se colocó una solución de diantina (184 μg, 6,2 nMol) en PBS en un filtro Amicon Ultra 15 con un MWC0 de 3 kDa y se centrifugó tres veces a 4000 r.p.m y 4 °C durante 30 min. Después de cada ciclo, el filtro Amicon se volvió a llenar con tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9. Después del tercer ciclo de centrifugación, el volumen se redujo a 0,5 ml mediante centrifugación. La solución de carbonato sódico y diantina se colocó en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió Alexa Fluor ™ 4885-TFP (16,7 μg, 19 nMol) disuelto en 3,5 μl de DMS0 a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 rpm y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 80 min. Después de la agitación, la mezcla se pasó a través de una columna de exclusión de tamaño Sephadex G25 M (GE Healthcare, columna PD 10). El conjugado de diantina-Alexa488 se almacenó en solución en tampón de carbonato de sodio 0,1 M a pH 9 en el frigorífico y se tomaron alícuotas para análisis. Rendimiento: no determinado MALDI-T0F-MS (Figura 38 D) (modo LP): miz 30.7 kDa ([M H]+, Diantina-Alexa488).
Síntesis de diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3 y diantina-EGF-Alexa488-PEGi2-n3
[0401] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3. Se colocó una solución de carbonato de sodio de Diantina-EGF-Alexa488 (70 μg, 1,9 nMol) en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió azido-PEG3-S-S-NHS (120 μg, 272 nMol) disuelto en 9 μL de DMS0 a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 12 h. Después de la agitación, la mezcla de reacción se diluyó con PBS y se lavó con PBS mediante filtración centrífuga a 4000 r.p.m y 4 °C usando un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa.
[0402] Rendimiento: 54 μg (70 %).
[0403] MALDI-TOF-MS (Figura 37 E) (modo LP): miz 40,8 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3), miz 37,5 kDa ([M H]+, diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-Ns).
[0404] La síntesis de diantina-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3 y diantina-EGF-Alexa488-PEG12-n3 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en la porción conectora azido-PEG utilizada. La respectiva porción conectora azido-PEG, sus equivalentes de adición y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 20.
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Diantina-Alexa488-S-S-PEG-N3
[0405] Se colocó una solución de carbonato de sodio de Diantina-Alexa488 (24,5 μg, 0,8 nMol) en un tubo de reacción de 2 ml y se añadió azido-PEG3-S-S-NHS (34 μg, 78 nMol) disuelto en 9 μL de DMSO a la solución de proteína. La mezcla se agitó a 800 r.p.m y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 12 h. Después de la agitación, la mezcla de reacción se diluyó con PBS y se lavó con PBS mediante filtración centrífuga a 4000 r.p.m y 4 °C usando un filtro Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa.
[0406] Rendimiento: 10,3 μg (39 %).
[0407] MALDI-TOF-MS (Figura 38 E) (modo LP): miz 32.9 kDa ([M H]+, Diantina-Alexa488-S-S-PEG-Ns).
Síntesis del conjugado Cy3-PAMAM-Saponina-Toxina
[0408] El procedimiento se describe a modo de ejemplo para Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO. Se mezcló una solución de Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO (17 μg, 0,184 nMol) en agua MilliQ con una solución de diantina-EGF-Alexa488-SS-PEG3-Na (3,6 μg, 0,089 nMol) en PBS en un tubo de reacción de 1,5 ml y la mezcla de reacción se agitó a 800 r.p.m y 15 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 2 h. Después de la agitación, se tomaron pequeñas alícuotas para analizarlas mediante SDS-PAGE y obtener imágenes de fluorescencia en un sistema de imágenes Molecular Imager® VersaDoc ™ MP 4000 (Bio-Rad) (Figura 39).
[0409] La síntesis de Cy3-PAMAM-(SO1861)5-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-(SO1861)27-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-Diantina-EGF-Alexa488, Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-Diantina-Alexa488 y Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-Diantina-EGF-Alexa488 se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en el lote de PAMAM-saponina-DBCO usado, el lote de toxina azido usada y sus equivalentes de adición. Los respectivos equivalentes de los materiales de partida se destacan en la Tabla 21.
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Síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora
[0410] Cy3-PAMAM (0,19 mg, 13 nMol) y SO1861 (0,73 mg, 0,39 μMol) se disolvieron por separado en 200 μL de tampón de acetato 0,1 M a pH 5. Las soluciones de SO1861 y Cy3-PAMAM se mezclaron y agitaron durante 20 min a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 20 min, se añadió NaCNBH3 (5 mg, 81 μMol) a la solución de reacción con agitación y la mezcla de reacción se dejó agitar durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación durante 12 h, la mezcla de reacción se diluyó con agua MilliQ y se dializó extensamente durante 24 h con agua MilliQ utilizando tubos de membrana de celulosa regenerada (ZelluTrans, Carl Roth) con un MWCO de 12-14 kDa. Después de la diálisis, la solución de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 se concentró usando filtración centrífuga a 4000 r.p.m (15 °C) mediante filtros Amicon Ultra 15 con un MWCO de 3 kDa. El conjugado se almacenó como solución en el frigorífico y se tomaron alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado [0411] MALDI-TOF-MS (Figura 40 B, C) (modo LP): miz 88,7 kDa ([M H]+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861), 49,2 kDa ([M H]2+, Cy3-PAMAM-NC-SO1861).
[0412] La síntesis de Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)30 y Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)10, se realizó mediante la metodología descrita anteriormente, pero difiere en el tiempo después del cual el agente reductor NaCNBH3 se añadió al lote de reacción. El momento de la adición de NaCNBH3 y la masa respectiva de los conjugados se destacan en la Tabla 22.
Tabla 22. Parámetros de reacción de síntesis de Cy3-PAMAM-NC-SO1861 mediante aminación reductora.
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Síntesis de poli(SO1861)
[0413] Se disolvió SO1861-EMCH (0,13 mg, 63 nMol) en 30 μl de agua MilliQ desgasificada. Se añadió APS (0,2 μg, 0,8 nMol) disuelto en 4 μl de agua MilliQ desgasificada a la solución de SO1861-EMCH y la solución se colocó en un ThermoMixer C (Eppendorf) a 60°C. Luego, se añadió TMEDA (cat., 0,5 μl) a la mezcla y la mezcla se agitó a 800 r.p.m y 60 °C en un ThermoMixer C (Eppendorf) durante 2 h. Después de 2 h, se extrajo una pequeña alícuota para su análisis mediante espectrometría de masas.
[0414] MALDI-TOF-MS (Figura 42 C) (modo LP): miz 18.2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)g), 16,0 kDa ([M H]+, poli(SO1861)s), 14,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)7), 12,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)a), 10,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)5), 8,2 kDa ([M H] , poli(SO1861)4), 6,2 kDa ([M H]+, poli(SO1861)3).
Unión de péptidos y SO1861-EMCH
[0415] El péptido personalizado con la secuencia SESDDAMFCDAMDESDSK (0,6 mg, 0,3 μMol) y SO1861-EMc H (0,8 mg, 0,39 μmol) se disolvieron por separado en 200 |_il de PBS. Las soluciones de SO1861-EMCH y de péptidos se mezclaron y agitaron durante 12 h a 800 r.p.m y temperatura ambiente en un ThermoMixer C (Eppendorf). Después de la agitación, se extrajeron pequeñas alícuotas para su análisis. Rendimiento: no determinado MALDI-TOF-MS (Figura 45 B) (modo RN): miz 4.05 kDa ([M H]-, péptido-SO1861), 3,92 kDa ([M H]-, péptido-SO1730), 1,98 kDa ([M H]-, péptido), 1,86 kDa ([M H]-, SO1861).
Ensayo de viabilidad celular
[0416] Después del tratamiento, las células se incubaron durante 72 horas a 37 °C antes de que se determinara la viabilidad celular mediante un ensayo MTS, realizado según las instrucciones del fabricante (ensayo de proliferación celular CellTiter 96® AQueous One Solution, Promega). Brevemente, la solución de MTS se diluyó 20x en DMEM sin rojo de fenol (PAN-Biotech GmbH) suplementado con FBS al 10 % (PAN-Biotech GmbH). Las células se lavaron una vez con 200 μl de PBS por pocillo, después de lo cual se añadieron 100 μl de solución de MTS diluida por pocillo. La placa se incubó durante aproximadamente 20-30 minutos a 37 °C. Posteriormente, se midió la densidad óptica a 492 nM en un lector de placas Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo Scientific). Para la cuantificación, la señal de fondo de los pocillos de “solo medio'' se restó de todos los demás pocillos antes de calcular la proporción de células sin trataritratadas, dividiendo la señal de fondo corregida de los pocillos no tratados por la señal de fondo corregida de los pocillos tratados.
Análisis FACS
[0417] Se sembraron células HeLa en DMEM (PAN-Biotech GmbH) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (PAN-Biotech GmbH) y penicilinaiestreptomicina al 1 % (PAN-Biotech GmbH), a 500000 ciplaca en placas de 10 cm y se incubaron durante 48 horas (5 % CO2, 37 °C), hasta alcanzar una confluencia del 90 %. A continuación, las células se tripsinizaron (TryμlE Express, Gibco Thermo Scientific) en células individuales. 0,75 x 106 células se transfirieron a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifugaron (1400 r.p.m, 3 min). El sobrenadante se descartó dejando sumergido el sedimento celular. El sedimento se disoció golpeando suavemente el tubo Falcon en un agitador de vórtice y las células se lavaron con 4 ml de PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, 2 % FBS). Después de lavar, las células se resuspendieron en 3 ml de PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, FBS al 2 %) y dividido en partes iguales en 3 tubos FACS de fondo redondo (1 mlitubo). Las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en 200 μL de PBS frío (Mg2+ y Ca2+ libre, FBS al 2 %) o 200 μl de solución de anticuerpo; que contiene 5 μL de anticuerpo en 195 μL de PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, 2 % FbS). Se usó IgG1 de ratón APC, K Isotype Ctrl FC (n. ° 400122, Biolegend) como control de isotipo, y se usó APC anti-EGFR humano (n. ° 352906, Biolegend) para teñir el receptor de Eg Fr , HER2: APC anti-CD340 humano (erbB2iHER-2) (324408, Biolegend). CD71: APC anti-CD71 humano # 334108, Biolegend. Las muestras se incubaron durante 30 min a 4 °C en un mezclador de tubo de rodillo. Posteriormente, las células se lavaron 3 veces con PBS frío (sin mg2+ y Ca2+, FBS al 2 %) y se fijaron durante 20 min a temperatura ambiente utilizando una solución de PFA al 2 % en PBS. Las células se lavaron 2 veces con PBS frío y se resuspendieron en 250-350 μl de PBS frío para el análisis FACS. Las muestras se analizaron con un sistema de citometría de flujo BD FACSCanto Il (BD Biosciences) y el software FlowJo.
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T l 2 Ni l E FR HER2 D71 i
Resultados
[0418] Teniendo en cuenta los grupos químicos disponibles para las reacciones de conjugación con la molécula S01861, se han identificado cuatro grupos químicos: los alcoholes y dioles de los residuos de azúcar, el grupo aldehído del esqueleto triterpenoide, el ácido carboxílico de uno de los residuos de azúcar (ácido glucurónico) y el grupo alqueno del esqueleto triterpenoide, como se destaca en la Figura 24.
[0419] En vista de los pros y los contras de cada grupo químico identificado (Tabla 24), los grupos aldehído y alcohol son los más adecuados para reacciones de conjugación reversibles, mientras que el alqueno y el ácido carboxílico (ácido glucurónico) son los grupos más adecuados para reacciones de conjugación irreversibles/estables. El grupo aldehido dentro de la estructura de la molécula de S01861, sin embargo, es el más adecuado para reacciones de conjugación reversibles, en comparación con los alcoholes. Por un lado, porque solo hay un aldehído presente en la estructura que permite reacciones quimioselectivas. Por otro lado, debido a que el aldehído puede realizar reacciones de conjugación reversibles con una variedad de grupos químicos tales como aminas, hidrazidas e hidroxilaminas, formando restos que se pueden escindir con ácidos como iminas, hidrazonas y oximas. Este factor permite una libertad de elección sobre el grupo químico para la reacción de conjugación reversible deseada. Por el contrario, los alcoholes son buenos candidatos para la reacción de conjugación reversible a través de la formación de acetales y cetales, pero carecen de quimioselectividad, ya que están presentes en una gran cantidad en la estructura glicosídica.
[0420] Para la formación de un enlace irreversible y estable, el ácido carboxílico es el más adecuado, ya que puede formar amidas y ésteres con las herramientas habituales utilizadas en la química de péptidos (por ejemplo, reacción con aminas mediante la formación de amidas mediadas por carbodiimidas).
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[0421] Así, para el desarrollo de una saponina potenciadora del escape endosomal (como SO1861) se ha establecido una metodología que permite la generación de saponinas no escindibles y escindibles 'listas para conjugar' (Figura 25) utilizando los grupos químicos más adecuados presentes en SO1861.
[0422] Para producir saponinas no escindibles "listas para conjugar", el grupo carboxílico de SO1861 se activa mediante un reactivo utilizado en la química de unión de péptidos para generar un éster activo (por ejemplo, hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio, HATU). El éster activo resultante de SO1861 es capaz de reaccionar con aminas formando conjugados estables unidos a amida (Figura 25 A).
[0423] Para producir saponinas escindibles "listas para conjugar", el grupo aldehído de SO1861 se hace reaccionar con una porción conectora EMCH (hidrazida de ácido £-maleimidocaproico). El grupo hidrazida de EMCH forma un enlace hidrazona escindible en medio ácido con el aldehído de SO1861. Al mismo tiempo, la porción conectora EMCH presenta un grupo maleimida que es reactivo con tiol (grupo sulfhidrilo) y, por tanto, puede conjugarse con tioles (Figura 25 B).
[0424] El grupo maleimida de SO1861-EMCH realiza una reacción de adición de Michael rápida y específica con tioles y estructuras poliméricas que llevan tiol cuando se lleva a cabo en un rango de pH de 6,5 a 7,5 (Figura 25 B). Además, el enlace hidrazona sensible en medio ácido entre SO1861 y EMCH se puede utilizar para realizar la liberación de saponina desde una estructura de base en un ambiente ácido (Figura 26). Por tanto, la porción conectora EMCH satisface tanto la necesidad de una estrategia de escisión por pH como de una estrategia de conjugación a una estructura polimérica.
[0425] Con respecto a la longitud ideal del espaciador EMCH para la conjugación a una estructura polimérica, la simulación por ordenador (PerkinElmer, ChemBio3D, Ver. 13.0.0.3015) muestra que el grupo maleimida de S01861-EMCH está ubicado en la periferia de la molécula y, por lo tanto, debe ser accesible para estructuras polimérica que lleven tiol (Figura 27).
[0426] Para sintetizar el S01861-EMCH, se ha desarrollado una estrategia que permite la conversión del grupo aldehído de la S01861 a EMCH (Figura 28 A). El conjugado S01861-Em Ch se aisló y caracterizó con éxito mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (véase la sección de materiales y métodos, Figura 22B) y espectrometría de masas con ionización con analizador de tiempo de vuelo/desorción láser asistida por matriz (mAlDI-TOF-MS) como se muestra en la Figura 28 B y 28 C, y la Figura 23 A.
[0427] Para evaluar la hidrólisis dependiente del pH del enlace hidrazona, se disolvió SO1861-EMCH en una solución de HCl a pH 3 y se registraron los espectros MALDI-TOF-MS en dos puntos diferentes en el tiempo (Figura 29). Como se muestra en la Figura 29 A y 29 B, una clara tendencia decreciente del pico en m/z 2070 Da que corresponde a SO1861-EMCH es visible en la Figura 29 B. Dado que la SO1861 se genera durante la hidrólisis, se registró un aumento del pico en m/z 1861 Da que acompañó la tendencia decreciente en m/z 2070 Da. Estos resultados demuestran que el enlace de hidrazona responde a la hidrólisis y se escinde incluso si está unido a SO1861.
[0428] Para conjugar SO1861-EMCH a una estructura polimérica, las aminas accesibles de la estructura polimérica se convierten en tioles con la ayuda del agente 2-iminotiolano. Los tioles libres generados sobre la estructura polimérica actúan entonces como nucleófilos para la adición de tioleno de tipo Michael al grupo maleimida de SO1861-EMCH (Figura 30). Esta metodología desarrollada es adecuada para la conjugación de SO1861-EMCH a cualquier estructura polimérica disponible que obtenga grupos amina accesibles, y permite además un control sobre el número de moléculas de SO1861 conjugadas en función de la estructura polimérica, respectivamente.
O [0429] La primera prueba de concepto para la conjugación de saponinas ‘listas para conjugar' a una estructura polimérica se obtuvo mediante el uso de la amina de una proteína (ejemplo de estructura de base de poliaminoácidos), la albúmina de suero bovino (BSA). Después de la conjugación, con la espectrometría de masas se obtuvieron los picos correspondientes de BSA-SO1861 en m/z ~ 70, ~ 72 y ~ 74 kDa (Figura 31 A). En comparación con la masa detectada de BSA con m/z 66 kDa (Figura 31 B), las masas obtenidas de BSA-SO1861 corresponden a una mezcla de conjugados de BSA-SO1861 que consiste en 2, 3 y 4 moléculas de SO1861 por BSA.
[0430] La siguiente prueba de concepto para la conjugación de 'saponinas listas para conjugar' a una estructura polimérica se obtuvo mediante el uso del dendrímero poli(amidoamina) de 5a generación (G5) que lleva amina (PAMAM con colorante rojo fluorescente unido covalentemente (Cy3)). Se utilizó PAMAM-Cy3 como estructura polimérica para la conjugación tanto con SO1861-EMCH como con SO1861-HATU y sirvió como modelo para la conjugación de SO1861 con una estructura polimérica (Figura 32).
[0431] Todos los grupos amina accesibles de Cy3-PAMAM se convirtieron en tioles usando un exceso de 3 veces de 2-iminotiolano por aminas Cy3-PAMAM seguido de la reacción con SO1861-EMCH. Se utilizaron tres equivalentes de adición diferentes (5, 20 y 57) de SO1861-EMCH para los tres lotes de reacción. Después de la reacción, las masas registradas de los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 en MALDI-TO1-MS muestran un incremento de las masas correspondientes al aumentar la cantidad añadida de SO1861-EMCH (Figura 33). Las tres cantidades de adición diferentes correspondieron a una masa obtenida de m/z 38,4 kDa, m/z 53,9 kDa y m/z 133,8 kDa para los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 que corresponden a 6, 13 y 51 moléculas de SO1861 unidas por dendrímero PAMAM, como se muestra en la Figura 33 B-D.
[0432] En otra reacción, solo un cierto número de aminas PAMAM se convirtieron en tioles antes de la reacción con SO1861-EMCH. En este documento, se utilizaron dos equivalentes de adición diferentes de 2-iminotiolano (8 y 32) y dos equivalentes de adición diferentes de SO1861-EMCH (5 y 30), respectivamente. Después de la reacción, los espectros respectivos de los conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 en MALDI-TOF-MS muestran picos en m/z 37,7 kDa (5 equivalentes de adición de SO1861-EMCH) y en m/z 87,0 kDa (30 equivalentes de adición de SO1861-EMCH) como se muestra en la Figura 34. Las masas obtenidas en m/z 37,7 kDa y m/z 87,0 kDa corresponden a conjugados Cy3-PAMAM-SO1861 con 5 y 30 moléculas de SO1861 unidas, y demuestran que con este método se conjugaron casi todos los SO1861-EMCH alimentados.
[0433] Para la generación de un conjugado de saponina no escindible según el pH, se activó el ácido carboxílico de SO1861 con HATU y luego se hizo reaccionar con las aminas de Cy3-PAMAM formando una amida estable con respecto al pH unida entre Cy3-PAMAM y SO1861. La masa resultante del conjugado se detectó mediante MALDI-TOF-MS con una masa de m/z 62,3 kDa que corresponde al conjugado Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (NC = no escindible) con 17,5 de moléculas SO1861 unidas por PAMAM (Figura 32 B, Figura 35).
[0434] A continuación, las estructuras de base conjugadas con saponina se conjugaron con puntos de enlace para una posible conjugación con terapias dirigidas (por ejemplo, toxinas dirigidas) a través de la denominada cicloadición de alquino-azida promovida por tensión anular (SPAAC, química clic) para obtener una estructura de base funcionalizada. Para esta reacción, Cy3-PAMAM-SO1861 (Figura 36 C, D) y Cy3-PAMAM-NC-SO1861 (Figura 36 B) se conjugaron a una porción conectora NHS-PEG13-DBCO heterobifuncional que generó un alquino deformado en la superficie de los conjugados (Figura 36 A). El resto NHS (N hidroxisuccinimida) de la porción conectora reaccionó con las aminas restantes de los conjugados PAMAM-saponina formando un enlace amida entre la estructura de base y la porción conectara. El resto de DBCO (dibenzociclooctina) resultante en los conjugados es capaz de realizar SPAAC con las azidas correspondientes en las terapias dirigidas.
[0435] La diantina-EGF sirvió como una toxina dirigida modelo y la diantina sirvió como una toxina no dirigida. Ambas toxinas se marcaron con Alexa Fluor™ 488 usando el derivado de tetrafluorofenil éster (TFP) del tinte. Las proteínas marcadas con tinte se conjugaron luego a una porción conectora NHS-SS-PEG 3-azida heterobifuncional para obtener el resto químico correspondiente para la SPAAC a los conjugados PAMAM-saponina. Las mediciones de Maldi-TOF-MS mostraron que se unieron una molécula de Alexa Fluor™ 488 y 9 moléculas de NHS-SS-PEG3-azida por molécula de diantina-EGF (Figura 37, Figura 38). Además, la diantina-EGF marcada con Alexa Fluor ™488 se conjugó con una porción conectora de NHS-PEG12-azida heterobifuncional que carecía del puente disulfuro y, por tanto, generaría una construcción no escindible por toxina.
[0436] Los conjugados Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO O Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO se hicieron reaccionar con azido-toxinas marcadas con Alexa Fluor 488 para realizar una cicloadición de alquino-azida promovida por tensión anular. La conjugación entre los agentes reactivos se indicó mediante electroforesis en gel y la colocalización de las señales fluorescentes de Cy3, que solo se adhiere al polímero PAMAM, y Alexa Fluor™ 488, que solo se adhiere a las toxinas, en un gel de poliacrilamida después de la electroforesis en gel (Figura 39).
[0437] Como estructura polimérica alternativa al dendrímero PAMAM, se utilizó un dendrón G4 (PFd-G4-Azide-NH-BOC, Polymer Factory) con 16 grupos terminales amino funcionales y un grupo azido en el punto focal para la conjugación con SO1861 (Figura 46). La ventaja de usar un dendrón en lugar de un dendrímero es el punto focal que muestra la estructura del dendrón. Este punto focal permite la conjugación directa a una toxina dirigida sin la necesidad de su modificación posterior con funciones clic ortogonales (Figura 47). Como se muestra en la Figura 47, el dendrón se sometió a la misma metodología que se describe para el dendrímero PAMAM. Brevemente, después del marcaje y desprotección parcial con colorante (Figura 48), los grupos amino del dendrón se convirtieron en tioles usando el reactivo tiolante 2-iminotiolano seguido de conjugación con SO1861-EMCH. Para la conjugación con SO1861-EMCH se utilizaron tres equivalentes de adición diferentes de SO1861-EMCH. Los conjugados dendrón-SO1861 se analizaron mediante MALDI-TOF-MS. Como era de esperar, las especies conjugadas de 1 y 2 moléculas de SO1861 por molécula de dendrón se obtuvieron cuando se utilizaron equivalentes de adición bajos de SO1861-EMCH de 3 y 10 (Figura 49 B, C). Se obtuvieron especies conjugadas de dendrón-SO1861 más altas de hasta 9 moléculas de SO1861 por dendrón (Figura 49 A) cuando se utilizó una alimentación equivalente de 22 moléculas de SO1861-EMCH por molécula de dendrón. En experimentos adicionales, el dendrón funcionalizado con saponina se conjugará con toxinas dirigidas sobre su punto focal para producir una estructura de base funcionalizada, y se evaluará biológicamente.
[0438] Los ejemplos anteriores demuestran que se ha desarrollado una metodología que permite la conjugación de una cantidad determinada de moléculas de SO1861 u otras moléculas potenciadoras del escape endosomal a una estructura polimérica para una liberación citoplásmica mejorada de sustancias terapéuticas tales como toxinas dirigidas.
[0439] Para evaluar más otras metodologías de conjugación de SO1861 a una estructura polimérica, se utilizó la vía de aminación reductora. Para ello, el grupo aldehído de SO1861 se conjugó directamente con aminas PAMAM formando un enlace imina. La formación del enlace imina fue seguida de una etapa de aminación reductora mediante la adición del agente reductor cianoborohidruro de sodio formando un enlace amina estable al pH entre SO1861 y PAMAM (Figura 40 A). De manera similar al enfoque EMCH y HATU, esta metodología permite un control sobre el número de saponinas conjugadas por polímero, como se muestra en la Figura 40 B, C. En este caso, se produjeron conjugados PAMAM-saponina que obtuvieron un número de 10 (Figura 40 B) y 30 (Figura 40 C) moléculas de SO1861 por PAMAM.
[0440] Otro enfoque para el desarrollo de una estructura de base de SO1861 entre los polímeros y proteínas mencionados es el enfoque de poli(SO1861). La idea de este enfoque es generar un polímero que conste únicamente de moléculas de SO1861, con enlaces escindibles sensibles al pH que liberan la SO1861. Además, la poli(SO1861) debería poder realizar reacciones de conjugación a toxinas y biopolímeros. El objetivo principal de este enfoque es mantenerlo lo más simple y rentable posible. Dado que ya se ha desarrollado un protocolo para la generación de SO1861 escindible en medio ácido (enfoque SO1861-EMCH), sería interesante ver si es posible polimerizar el SO1861-EMCH mediante la simple adición de un iniciador de polimerización sin modificar más la SO1861 o identificar otros sitios de conjugación en la molécula de SO1861. En el pasado, varios artículos han tratado sobre la polimerización de grupos maleimida usando iniciadores de radicales que atacan el doble enlace del grupo maleimida y así inician una polimerización radical a lo largo de los dobles enlaces de las maleimidas (29-31). Dado que SO1861-EMCH tiene un grupo maleimida en su estructura, este grupo podría explorarse potencialmente para reacciones de polimerización de radicales para producir una poli(SO1861) con función escindible en medio ácido. Si la reacción de polimerización tiene un tiempo de reacción razonable, los polímeros de SO1861 generados podrían inactivarse con un inhibidor de radicales que no solo inactive la reacción, sino que también genere un grupo funcional para la conjugación de toxina o biopolímero. Tal esquema de reacción se ilustra en la Figura 41. En este caso, el sistema de persulfato de amonio (APS) y tetrametiletilendiamina (TMEDA) se muestra a modo de ejemplo como generador de radicales, y el aminopropanotiol sirve como un inhibidor de radicales modelo. Usando aminopropanotiol como un ejemplo de atenuador, el grupo amina generado podría modificarse adicionalmente específicamente en un grupo utilizable para química clic o usarse para conjugar directamente la poli(SO1861) con una toxina.
[0441] En la polimerización por radicales libres, las condiciones de reacción tienen una gran influencia en las propiedades del polímero y el resultado de la reacción. Por ejemplo, la temperatura, la concentración del monómero y la concentración del iniciador desempeñan un papel importante en la formación del polímero y deben ajustarse con precisión de acuerdo con las propiedades deseadas del polímero. Como las polimerizaciones por radicales se llevan a cabo habitualmente a temperaturas superiores a 50 °C, las primeras reacciones se realizaron a una temperatura de 60 °C. Fue interesante ver si la polimerización de SO1861-EMCH podía iniciarse espontáneamente y si APS y TMEDA influirían en el grado de polimerización. Así, se llevaron a cabo tres reacciones, utilizando la misma concentración de SO1861-EMCH, pero diferentes en su composición de APS/TMEDA. En la primera reacción, solo el SO1861-EMCH se calentó hasta 60 °C durante 3 h, mientras que la segunda reacción contenía SO1861-EMCH y APS, y la tercera reacción contenía SO1861-EMCH, APS y TMEDA. (Para estos experimentos se utilizaron la misma cantidad y concentración de materiales de partida que se mencionan en la sección de Materiales y Métodos "Síntesis de poli(SO1861)"). Los lotes se analizaron mediante MALDI-TOF-MS como se muestra en la Figura 42 A-C. Curiosamente, se demostró que SO1861-EMCH comenzó a formar oligómeros consistentes en 2, 3, 4, 5 y 6 moléculas de SO1861 de forma espontánea al calentarse hasta 60 °C (Figura 42 A). La suma de 11-3 equivalentes de APS a la misma temperatura no influyó en esta tendencia (Figura 42 B). Sin embargo, al usar el sistema iniciador de APS/TMEDA, se pudieron detectar oligómeros de SO1861 de hasta 9 moléculas de SO1861 con un peso molecular de 18,2 kDa (Figura 42 C). Además, los picos obtenidos para los oligómeros parecían mucho más grandes en comparación con los picos de la Figura 42 A y 42 B, lo que indica un mayor consumo de SO1861-EMCH para esta reacción.
[0442] Para ajustar aún más las condiciones de reacción, se evaluarán otros iniciadores como los azoiniciadores, como 2,2'-azobis [2-metil-N-(2-hidroxietil)propionamida] y azobisisobutironitrilo, así como otras técnicas de polimerización como como polimerización radicalaria controlada (polimerización radicalaria por transferencia de átomos, transferencia de cadena mediante adición-fragmentación reversible, etc.). Además, podría considerarse otra porción conectora de hidrazida como sustituto de EMCH que obtenga un grupo funcional (tal como un residuo de acrilo o acrolol) que sea más adecuada para la polimerización por radicales que el grupo maleimida.
[0443] Otro enfoque para el desarrollo de una estructura de base SO1861 es el enfoque de ADN. La idea de este enfoque es utilizar el concepto del llamado ADN origami (Kolb et al, 2004; Bird et al, 1988). El ADN origami como estructura polimérica o polimérica ensamblada para conjugar saponinas a ella puede ofrecer varias ventajas inherentes que incluyen estabilidad, adaptabilidad progresiva y control preciso del tamaño y forma final de la estructura de base de ADN-saponina resultante. Dado que estos nanoportadores de ADN están compuestos de ADN natural, son biocompatibles y no muestran toxicidad para las células vivas, y pueden facilitar la liberación de carga de los compartimentos celulares internos. La multivalencia de una estructura de este tipo puede permitir un ajuste preciso de las capacidades de focalización y una alta capacidad para una variedad de cargas útiles, como fluoróforos y toxinas. Por lo tanto, en este enfoque se identifican cadenas de ADN que ofrecen grupos funcionales químicos en los extremos 3 'y 5' respectivamente, y que pueden hibridar solo en ciertas áreas deseadas de la secuencia que permiten un control sobre la forma final de la construcción. Los grupos químicos deben utilizarse para unir saponinas, por ejemplo, mediante una reacción tioleno entre el SO1861-EMCH ya desarrollado y un grupo tiol en una de las cadenas de ADN 3 'y 5'. La cadena de ADN complementaria puede ofrecer un grupo de función clic que se puede utilizar para unirse a una toxina dirigida. El concepto se ilustra en la Figura 43.
[0444] Es posible imaginar un enfoque similar utilizando una secuencia de péptidos específica, en lugar de cadenas de ADN, que sea capaz de unirse y liberar saponinas y que se pueda polimerizar formando una gran estructura similar a un poli(péptido). En este enfoque, se ha identificado y comprado una secuencia de péptidos que tiene una longitud que se ajusta al tamaño calculado de una molécula SO1861-EMCH, que tiene un residuo de cisteína en el medio de la secuencia y que obtiene un grupo amina tanto en el extremo N-terminal como en el C-terminal. El residuo de cisteína se puede utilizar para conjugar SO1861-EMCH mediante una reacción tioleno del grupo maleimida de SO1861-EMCH y el grupo tiol del residuo de cisteína. Los dos grupos amina se pueden utilizar para polimerizar el conjugado péptido-SO1861 con un reticulante adecuado como se muestra en la Figura 44.
[0445] Los ensayos de conjugación han demostrado que la conjugación de SO1861-EMCH con el péptido personalizado (secuencia: SESDDAMFCDAMDESDSK) tuvo éxito. El péptido que lleva una cisteína reactiva con maleimida en el medio de la secuencia y su conjugación con SO1861-EMCH se analizó mediante MALDI-TOF-MS (Figura 45). El espectro de MALDI-TOF-MS muestra el pico esperado para el conjugado péptido-SO1861 en m/z 4053 Da y un pico adicional en m/z 3821 Da que es el conjugado péptido-SO1861 de la correspondiente saponina-EMCH de SO1730. Como SO1861-EMCH se utilizó en un ligero exceso (1,3 equivalentes) y no se detectó ningún pico de SO1861-EMCH después de la reacción se puede suponer que la conjugación fue cuantitativa. Para iniciar las primeras reacciones de polimerización del péptido-S01861, se utilizará tartrato de disuccinimidilo como reticulante reactivo con amina.
[0446] Dado que las propiedades de mejora del escape endosomal de la SO1861 solo se exponen a un pH endosomal bajo (≤pH5), la estructura de base o la estructura de base funcionalizada no debe contener grupos químicos que puedan interferir en la acidificación de los endosomas y, por lo tanto, bloquear la actividad de la SO1861.
[0447] Se analizaron las estructuras poliméricas que contienen amina de una PAMAM G5 (128 aminas primarias y aproximadamente 126 aminas terciarias) y 4G-dendrón (16 aminas primarias), con el fin de determinar si estas moléculas inhiben la capacidad de mejora del escape endosomal de SO1861. Se realizaron experimentos de coadministración de PAMAM (nativa o tiolada) o dendrón (nativo) en combinación con diantina-EGF y diversas concentraciones de SO1861 en células HeLa. Como control para la inhibición de la acidificación endosomal se utilizó cloroquina.
[0448] Las células HeLa muestran suficientes cantidades de EGFR en la superficie celular (Figura 50 A). Se observa que tanto la PAMAM "nativa" como la cloroquina inhiben el escape endosomal mediado por SO1861 de la toxina dirigida y la subsiguiente muerte celular en las células Hela (Figura 50 B). PAMAM a 500 nM inhibe incluso en la misma medida que la cloroquina, un inhibidor de la acidificación endosomal, mientras que el dendrón 667 nM no tiene ningún efecto. Para abordar aún más si la actividad inhibidora de la PAMAM 'nativa' se debe a la disponibilidad de grupos amino de la PAMAM, los grupos amino primarios de PAMAM se tiolaron parcialmente mediante reacción con 2-iminotiolano (Figura 51), lo que resultó en 16 de 128 (Figura 51 C), 65/128 (Figura 51 D) y 108/128 (Figura 51 E) aminas primarias bloqueadas. Se observa que la tiolación de 65 y 108 aminas primarias supera la inhibición del escape endosomal mediado por SO1861, mientras que la tiolación de hasta 16 grupos de aminas todavía muestra los efectos inhibidores del escape endosomal mediado por SO1861 de la toxina dirigida (Figura 50 C). Los grupos amino primarios de PAMAM también se pegilaron parcialmente mediante una reacción con mPEG2k-NHS (Figura 52), lo que resultó en 3 de 128 (Figura 52 C), 8/128 (Figura 52 D) y 18/128 (Figura 52 E) aminas primarias bloqueadas. El bloqueo de solo 3 aminas primarias mediante PEGilación ya es suficiente para revertir la inhibición del escape endosomal mediado por SO1861 (Figura 51 D). El efecto de protección de la PEGilación probablemente se extiende más allá del pequeño número de aminas que se convierten, ya que se sabe que la PEGilación introduce una capa de hidratación que puede proteger a una molécula completa, si se alcanza un nivel suficiente.
[0449] Estos resultados demuestran que la presencia de un cierto número de grupos amino libres en estructuras poliméricas, tales como PAMAM, puede bloquear la acidificación endosomal y, así, inhibir la actividad de escape endosomal de SO1861 u otros glucósidos. Cuando el número de grupos amino es menor, como se muestra para el dendrón G4, o si los grupos amino se han protegido, como por tiolación o PEGilación, el efecto inhibidor se invierte.
REFERENCIAS
[0450]
Weng, A.; Thakur, M.; Beceren-Braun, F.; Bachran, D.; Bachran, C.; Riese, S.B.; Jenett-Siems, K.; Gilabert-Oriol, R.; Melzig, M.F.; Fuchs, H. The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins. Molecular oncology 2012, 6, 323-332. saponinum album in a synergistic way. Journal of immunotherapy 2009, 32, 713-725.
Sama, S.; Jerz, G.; Schmieder, P.; Joseph, J.F.; Melzig, M.F.; Weng, A. Plant derived triterpenes from Gypsophila elegans M.Bieb. enable non-toxic delivery of gene loaded nanoplexes. Journal of Biotechnology 2018, 284, 131-139
Kolb, H.C.; Finn, M.G.; Sharpless, K.B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angewandte Chemie 2001, 40, 2004-2021.
Bird, R.E.; Hardmann, K.D.; Jacobson, J.W.; Johnson, S.; Kaufman, B.M.; Lee, S.M.; Lee, T.; Pope, S.H.; Riordan, G.S.; Whitlow, M. Single-chain antigen-binding proteins. Science 1988, 242, 423-426.
Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger and ID Horak, Downmodulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Conjugado que comprende
un anticuerpo, definido como una inmunoglobulina (Ig) o un fragmento de unión funcional o un dominio de unión del mismo;
al menos una saponina que está unida covalentemente al anticuerpo,
y al menos una porción efectora que comprende o consiste en uno o más de un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico, donde al menos una porción efectora está unida covalentemente al anticuerpo, ya sea a través de al menos una porción conectora o directamente; y
donde la al menos una saponina es una saponina triterpenoide y/o una saponina triterpénica bisdesmosídica que pertenece al tipo de un 12,13-dehidrooleanano con un grupo funcional aldehído en la posición C-23 y que comprende un grupo funcional ácido glucurónico en un sustituyente carbohidrato en el grupo C-3beta-OH de la saponina.
2. Conjugado según la reivindicación 1, donde la al menos una saponina es una saponina específica única o es una mezcla de dos o más saponinas diferentes, y/o donde la al menos una saponina tiene una masa molecular de 3000 Dalton o menos, preferiblemente 2500 Dalton o menos, más preferiblemente 2300 Dalton o menos, lo más preferiblemente 2000 Dalton o menos, tal como 1500 Dalton - 1900 Dalton.
3. Conjugado según la reivindicación 1 o 2, donde la al menos una saponina es una o más de las saponinas NP-005236, AMA-1, AMR, alfa-Hederina, NP-012672, NP-017777, NP-017778, NP-017774 , NP-018110, NP-017772, NP-018109, NP-017888, NP-017889, NP-018108, AE X55, NP-017674, NP-017810, NP-003881, NP-017676, NP-017677, NP- 017706, NP-017705, NP-017773, NP-017775, QS-7 QS-7 api, QS-17, beta-escina la, saponina de té I, saponina de té J, assamsaponina F, ácido primúlico 1, AS64R, AS6. 2 I, SO1861, SA1657, GE1741, SA1641, QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl , QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, saponina de quillaja, Saponinum album, QS-18, Quil-A, Gyp1, gipsósido A, AG1, AG2 , SOO542, SO1584, SO1658, SO1674, SO1832, saponina con estructura A:
Figure imgf000120_0001
o cualquiera de sus estereómeros y/o cualquier combinación de estas, preferiblemente la saponina es SO1861 y/o GE1741 y/o SA1641 y/o QS-21 y/o una saponina con un núcleo de aglicona de ácido quillaico, un sustituyente carbohidrato Gal-(1^-2)-[Xyl-(1^3)]-GlcA en el grupo C-3beta-OH y un sustituyente carbohidrato Glc-(1^3)-Xyl-(1^4)-Rha-(1^2)-[Xyl-(1^3)-4-OAc-Qui-(1^4)]-Fuc en el grupo C-28-OH, y/o es ácido 3-O-beta-D-galactopiranosil-(1^2)-[beta-D-xilopiranosil-(1^ 3)]-beta-D-glucuronopiranosil quillaico 28-O-beta-D-glucopiranosil-(1^3)-beta-D-xilopiranosil-(1^4)-alfa-L-ramnopiranosil-(1^2) -[beta-D-xilopiranosil-(1^3)-4-OAcbeta-D-quinovopiranosil-(1^4)]-beta-D-fucopiranósido, más preferiblemente la saponina es SO1861 y/o QS-21, o en donde la al menos una saponina es una saponina bisdesmosídica que tiene una masa molecular de al menos 1500 Dalton y que comprende un triterpeno de tipo oleanano que contiene un grupo aldehído en la posición C-23 y opcionalmente un grupo hidroxilo en la posición C-16, con una primera cadena lateral de carbohidratos ramificada en la posición C-3, donde dicha primera cadena lateral de carbohidratos ramificada contiene opcionalmente ácido glucurónico, donde la saponina contiene un grupo éster con una segunda cadena lateral de carbohidrato ramificada en la posición C-28, donde dicha segunda cadena de carbohidratos ramificada comprende preferiblemente al menos cuatro unidades carbohidrato, opcionalmente contiene al menos un resto acetilo, por ejemplo, dos restos acetilo y/u opcionalmente comprende desoxi-carbohidratos y/u opcionalmente comprende quinovosa y/u opcionalmente comprende glucosa y/u opcionalmente comprende ácido 4-metoxicinámico y/u opcionalmente comprende ácido 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico y/u opcionalmente comprende ácido 5-O-[5-O-Rha-(1^2)-Ara/Api-3,5-dihidroxi-6-metiloctanoil]-3,5-dihidroxi-6-metil-octanoico unido a un carbohidrato a través de un enlace éster, o donde la saponina es QS-21 o una o varias de las saponinas QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B -api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS-18, QS1861, QS1861 protonada (QS1862), Quil-A.
4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
donde el anticuerpo se selecciona de entre IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, o cualquier fragmento de unión a antígenos de estos, preferiblemente se selecciona de entre un anticuerpo monoclonal, anticuerpo policlonal, anticuerpo humano, anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, anticuerpo con remodelación de la superficie, anticuerpo antiidiotípico, anticuerpo de ratón, anticuerpo de rata, anticuerpo híbrido de rata/ratón, anticuerpo de llama, anticuerpo de llama de cadena pesada, anticuerpo de cadena pesada, una molécula que comprende o consiste en un dominio Vhh, un dominio Vh, un fragmento Fab, scFv, Fv, dAb, F(ab)2, Fcab, y/o
donde el anticuerpo puede unirse a una molécula de la superficie celular, preferiblemente un receptor de las células tumorales tal como un receptor específico de las células tumorales, más preferiblemente un receptor seleccionado de entre CD71, CA125, EpCAM(17-1A), CD52, CEA, CD44v6, FAP , EGF-IR, integrina, sindecano-1, integrina vascular alfa-V beta-3, HER2, EGFR, CD20, CD22, receptor de folato 1, CD146, CD56, CD19, CD138, receptor CD27L, PSMA, CanAg, integrina-alfaV , CA6, CD33, mesotelina, Cripto, CD3, CD30, CD239, CD70, CD123, CD352, DLL3, CD25, efrina A4, MUC1, Trop2, CEACAM5, CEACAM6, HER3, CD74, PTK7, Notch3, FGF2, C4.4A, FLT3 , CD38, FGFR3, CD7, PD-L1, CTLA4, CD52, PDGFRA, VEGFR1, VEGFR2, preferiblemente seleccionados de entre CD71, HER2 y EGFR,
y/o
donde el anticuerpo es o comprende un anticuerpo monoclonal o al menos un fragmento de unión a la molécula de la superficie celular o un dominio del mismo, y preferiblemente comprende o consiste en cualquiera de cetuximab, daratumumab, gemtuzumab, trastuzumab, panitumumab, brentuximab, inotuzumab, moxetumomab, polatuzumab , obinutuzumab, OKT-9 anticuerpo monoclonal anti-CD71 de tipo IgG, pertuzumab, rituximab, ofatumumab, Herceptin, alemtuzumab, pinatuzumab, OKT-10 anticuerpo monoclonal anti-CD38, o anticuerpos monoclonales anti-HER2 como trastuzumab y pertuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD20 como rituximab, ofatumumab, tositumomab e ibritumomab, anticuerpos monoclonales anti-CA125 como oregovomab, anticuerpos monoclonales anti-EpCAM (17-1A) como edrecolomab, anticuerpos monoclonales anti-EGFR como cetuximab, panitumumab y nimotuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD30 como brentuximab, anticuerpos monoclonales anti-CD33 como gemtuzumab y huMy9-6, anticuerpos monoclonales anti-integrina alfa-v beta-3 vascular como etaracizumab, anticuerpos monoclonales anti-CD52 como alemtuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD22 como epratuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CEA como labetuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD44v6 como bivatuzumab, anticuerpos monoclonales anti-FAP como sibrotuzumab, anticuerpos monoclonales anti-CD19 como huB4, anticuerpos monoclonales anti-CanAg como huC242, anticuerpos monoclonales anti-CD56 como huN901, anticuerpos monoclonales anti-CD38 como daratumumab, anticuerpos monoclonales anti-CA6 como DS6, anticuerpo monoclonales anti-IGF-IR como cixutumumab y 3B7, anticuerpos monoclonales anti-integrina como CNTO 95 y anticuerpos monoclonales anti-sindecano-1 como B-B4, preferiblemente cetuximab o trastuzumab u OKT-9, o al menos un fragmento de unión a una molécula de la superficie celular o dominio de estos.
5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde al menos uno de un oligonucleótido, un ácido nucleico y un ácido xenonucleico se selecciona preferiblemente de entre uno o más de entre un vector, un gen, un transgén que induce el suicidio celular, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos antisentido (ASO, AON), ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), aptámero de ADN, aptámero de ARN, ARNm, ADN minicircular, ácido péptidonucleico (APN), oligómero de morfolino fosforamidato (PMO), ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido nucleico con puente (BNA), ácido 2'-desoxi-2'-fluoroarabino nucleico (FANA), 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), ácido nucleico con puente de 2'-O,4'-aminoetileno, ácido 3'-fluorohexitol nucleico (FHNA), un plásmido, ácido nucleico glicólico (ANG) y ácido treonucleico (ATN) o un derivado de los mismos, más preferiblemente un BNA o un oligonucleótido antisentido seleccionado de entre PNA, PMO, LNA y BNA.
6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde al menos una porción efectora son dos oligonucleótidos diferentes, tales como oligonucleótidos antisentido, para silenciar dos genes diferentes.
7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la unión covalente entre la al menos una saponina y el anticuerpo y/o la porción efectora comprende una función aldehído en la saponina, preferiblemente una función aldehído en la posición C-23 en una saponina bisdesmosídica triterpénica que pertenece al tipo de 12,13-deshidrooleanano, y/o donde la unión covalente entre la al menos una saponina y el anticuerpo comprende un residuo de aminoácido del anticuerpo.
8. Conjugado según la reivindicación 7, donde el grupo aldehído de la al menos una saponina, preferiblemente el grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina, está acoplada covalentemente a la porción conectora hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico, donde dicha porción conectora está unida covalentemente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo en el anticuerpo y/o en la al menos una porción efectora, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la al menos una saponina está unida covalentemente al anticuerpo y/o a la al menos una porción efectora ya sea directamente o a través de al menos una porción conectora tal como una porción conectora bifuncional, por ejemplo basada eb hidrazida de ácido N-£-maleimidocaproico y/o basada en 1-[bis(dimetilamino)metileno]-lH-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, o una porción conectora trifuncional, como la porción conectora trifuncional:
Figure imgf000122_0001
10. Conjugado según la reivindicación 9, donde la porción conectora trifuncional comprende un segundo grupo químico con al menos una saponina unida covalentemente, un tercer grupo químico para la unión covalente al anticuerpo y un primer grupo químico para la unión covalente a la al menos una porción efectora, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional:
Figure imgf000122_0002
11. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la al menos una saponina está unida covalentemente al anticuerpo y a la al menos una porción efectora a través de al menos una porción conectora que comprende una porción conectora trifuncional a la que tanto el anticuerpo como la al menos una porción efectora están unidos, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional:
Figure imgf000123_0001
12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 8-11, donde la al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde opcionalmente dicha porción conectora escindible se somete a escisión en condiciones ácidas, reductoras, enzimáticas o inducidas por la luz, y preferiblemente la porción conectora escindible comprende un enlace escindible seleccionado de entre un enlace hidrazona o un enlace hidrazida que se somete a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo, proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras tales como un enlace disulfuro, y/o donde al menos una porción conectora comprende al menos una porción conectora escindible, donde dicha porción conectora escindible se somete a escisión en vivo en condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o en los lisosomas de las células de mamífero, preferiblemente de las células humanas, preferiblemente a pH 4,0 - 6,5, y más preferiblemente a pH ≤ 5,5.
13. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la al menos una saponina está unida covalentemente a una cadena lateral de lisina, formando un enlace amida, y/o a una cadena lateral de cisteína, formando un enlace tioéter o un puente disulfuro, donde la lisina y/o la cisteína están comprendidas por el anticuerpo, y donde la al menos una saponina está unida directamente a la lisina y/o la cisteína, o está unida a través de al menos una porción conectora que comprende opcionalmente una porción conectora escindible y/o o una porción conectora trifuncional como la porción conectora trifuncional:
Figure imgf000123_0002
, preferiblemente donde la porción conectora se basa en hidrazida del ácido N-£-maleimidocaproico y/o se basa en de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, una porción conectora trifuncional como la porción conectora trifuncional:
Figure imgf000124_0001
, una porción conectora escindible, y/o implica cualquiera o más de un puente disulfuro, un enlace tioéter, un enlace amida, un enlace hidrazida.
14. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde la al menos una saponina está unida covalentemente al anticuerpo y/o a la al menos una porción efectora a través de al menos una porción conectora, donde la porción conectora es o comprende una estructura base que comprende un polímero o estructura oligomérica y que además comprende al menos un cuarto grupo químico para la unión covalente de la estructura base al anticuerpo y/o a la al menos una porción efectora,
preferiblemente, donde la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base a través de un enlace escindible y/o a través de un enlace no escindible, preferiblemente donde el enlace escindible se somete a escisión en cualquiera de las condiciones ácidas, reductoras condiciones, condiciones enzimáticas y condiciones inducidas por la luz, y preferiblemente el enlace escindible comprende un enlace hidrazona o enlace de hidrazida que se somete a escisión en condiciones ácidas, y/o un enlace susceptible de proteólisis, por ejemplo, proteólisis por catepsina B, y/o un enlace susceptible de escisión en condiciones reductoras, como un puente disulfuro,
más preferiblemente, donde el enlace escindible se somete a escisión en vivo en condiciones ácidas como las presentes en los endosomas y/o en los lisosomas de las células de mamífero, preferiblemente de las células humanas, preferiblemente a pH 4,0 - 6,5, y más preferiblemente a pH ≤ 5,5.
15. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 14,
donde la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estuctura base a través de uno o más de un enlace imina, un enlace hidrazona, un enlace hidrazida, un enlace oxima, un enlace 1,3-dioxolano, un puente disulfuro, un enlace tio-éter, un enlace amida, un enlace peptídico o un enlace éster, preferiblemente a través de al menos una porción conectora,
o
donde la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estuctura base a través de uno o más de un enlace imina, un enlace hidrazona y un enlace hidrazida, dicho enlace es preferiblemente escindible, donde preferiblemente la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estuctura base a través del grupo aldehído en la posición C-23 de la al menos una saponina, preferiblemente donde el grupo aldehido en la posición C-23 de la al menos una saponina está unido covalentemente a la porción conectora N-Hidrazida del ácido £-maleimidocaproico, donde dicha porción conectora se une covalentemente a través de un enlace tioéter a un grupo sulfhidrilo de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base, tal como un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
16. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 14, donde la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estructura base a través de un enlace amida, donde preferiblemente la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estuctura base a través del grupo ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-0H de la al menos una saponina, cuando está presente, y donde preferiblemente el grupo ácido glucurónico en el sustituyente de carbohidrato del grupo C-3beta-0H de la al menos una saponina está unido covalentemente a la porción conectora 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-óxido hexafluorofosfato, donde dicha porción conectora está unida covalentemente a través de un enlace amida a un grupo amino de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base, tal como un grupo amino de una lisina o un extremo N de la estructura polimérica u oligomérica de la estructura de base.
17. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 14-16, donde la al menos una saponina está unida covalentemente a la estructura polimérica u oligomérica de la estuctura base, involucrando en el enlace covalente el grupo aldehido en la posición C-23 de la al menos una saponina, cuando está presente, y/o involucrando en el enlace covalente el grupo ácido glucurónico en el sustituyente carbohidrato del grupo C-3beta-OH de la al menos una saponina, cuando está presente, y en donde preferiblemente al menos un cuarto grupo químico de la estuctura base, para la unión covalente de la estuctura base al anticuerpo y/o a la al menos una porción efectora, es un grupo de química clic, preferiblemente seleccionado de entre cualquiera o más de una tetrazina, una azida, un alqueno o un alquino, o un derivado cíclico de estos grupos, preferiblemente un grupo azida.
18. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, donde la estructura polimérica u oligomérica de la estuctura base comprende un polímero lineal, ramificado y/o cíclico, oligómero, dendrímero, dendrón, polímero dendronizado, oligómero dendronizado, un ADN, un polipéptido, polilisina, un polietilenglicol o un ensamblaje de estas estructuras poliméricas u oligoméricas, donde dicho ensamblaje se construye preferiblemente mediante reticulación covalente.
19. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde la al menos una saponina es un número definido de saponinas o un rango definido de saponinas, preferiblemente 1-128 saponinas o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8 , 10, 16, 32, 64 o 128 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, como 7, 9, 12 saponinas, y preferiblemente donde el conjugado comprende más de una saponina, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6 , 8, 10, 16, 32, 64 o 1-100 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, como 7, 9, 12 saponinas, unidas covalentemente de manera directa a un residuo de aminoácido del anticuerpo y/o a la al menos una porción efectora y preferiblemente a través de un residuo de aminoácido de la al menos una porción efectora, preferiblemente a una cisteína y/o a una lisina, y/o unidas covalentemente a través de al menos una porción conectora y/o a través de al menos una porción conectora escindible y/o a través de al menos una estructura base polimérica u oligomérica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, preferiblemente 1 a 8 de tales estructuras base o 2 a 4 de tales estructuras base, en donde 1 a 32 saponinas, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 16 o 32 saponinas, o cualquier número de saponinas entre estos, tal como 7, 9, 12 saponinas, están unidas covalentemente a la al menos una estructura base.
20. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, donde la al menos una saponina se une covalentemente al anticuerpo y a la al menos una porción efectora a través de una porción conectora trifuncional, comprendiendo la porción conectora trifuncional un segundo grupo químico con al menos una saponina unida covalentemente directamente o a través de una porción conectora tal como una porción conectora escindible y/o a través de la estructura de base que comprende una estructura polimérica u oligomérica y un cuarto grupo químico según cualquiera de las reivindicaciones 14-20 para la unión covalente de la estuctura base a la porción conectora trifuncional, comprendiendo la porción conectora trifuncional además un tercer grupo químico para la unión covalente al anticuerpo y comprendiendo un primer grupo químico para la unión covalente a la al menos una porción efectora, donde el anticuerpo está unido al tercer químico y/o la al menos una porción efectora está unida al primer grupo químico, preferiblemente la porción conectora trifuncional es la porción conectora trifuncional:
Figure imgf000125_0001
21. Composición farmacéutica que comprende el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-20 y opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable.
22. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1-20 o composición farmacéutica según la reivindicación 21, para su uso como medicamento.
Figure imgf000126_0001
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