CN113453722A - 改良的细胞靶向结合分子 - Google Patents

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鲁本·波斯特尔
亨德里克·福斯
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
Saprami Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及治疗性组合，其包含第一蛋白质分子并包含第二药物组合物，所述第一蛋白质分子包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点，所述第一蛋白质分子具有与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合的至少一个皂苷，所述第二药物组合物包含不同于所述第一蛋白质分子的第二蛋白质分子，所述第二蛋白质分子包含用于结合不同于所述第一细胞表面分子的第二细胞表面分子的第二表位的第二结合位点，并且包含效应子部分，其中所述第二表位不同于所述第一表位。本发明的方面是包含本发明的所述第一蛋白质分子和所述第二蛋白质分子的组合物。本发明还涉及包含本发明的所述第一蛋白质分子和效应子部分的抗体‑药物缀合物。本发明的方面涉及包含本发明的所述组合物或所述抗体‑药物缀合物并且任选地还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明还涉及用作药物的本发明的所述治疗性组合或所述组合物或所述抗体‑药物缀合物或所述药物组合物。本发明还涉及用于治疗或预防癌症的本发明的所述治疗性组合。

Description

改良的细胞靶向结合分子
技术领域
本发明涉及包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点的第一蛋白质分子，所述第一蛋白质分子具有通过至少一个连接子和/或通过寡聚或多聚支架与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合或直接与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合的至少一个皂苷。本发明还涉及治疗性组合，其中所述治疗性组合包含第一药物组合物和第二药物组合物，所述第一药物组合物包含本发明的所述第一蛋白质分子，所述第二药物组合物包含不同于所述第一蛋白质分子的第二蛋白质分子，所述第二蛋白质分子包含用于结合不同于所述第一细胞表面分子的第二细胞表面分子的第二表位的第二结合位点，并且包含效应子部分，其中所述第二表位不同于所述第一表位。此外，本发明涉及治疗性组合，其中所述治疗性组合包含(a)本发明的所述第一药物组合物，其包含根据本发明的所述第一蛋白质分子并且包含用于结合所述第一细胞表面分子上的第一表位的所述第一结合位点；和(b)包含第三蛋白质分子的第三药物组合物，所述第三蛋白质分子包含用于结合(a)的细胞表面分子上的第一表位的所述第一结合位点和效应子部分，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点与所述第三蛋白质分子的第一结合位点相同，并且其中所述第一蛋白质分子可以结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的所述第一表位与所述第三蛋白质分子可以结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的所述第一表位相同。本发明的一个方面是包含本发明的所述第一蛋白质分子和本发明的所述第二蛋白质分子的组合物。本发明的一个方面涉及包含本发明的所述第一蛋白质分子和本发明的所述第三蛋白质分子的组合物。本发明还涉及包含本发明的所述第一蛋白质分子和以下中的任一种或多种的组合物：寡核苷酸，核酸，异种核酸，优选选自载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或它们的衍生物中的任一种或多种。本发明还涉及包含本发明的所述第一蛋白质分子和效应子部分的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物。本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含本发明的所述组合物或本发明的所述抗体-药物缀合物或本发明的所述配体-药物缀合物，并且任选地还包含药学上可接受的赋形剂。本发明还涉及用作药物的本发明的所述治疗性组合或本发明的所述组合物或本发明的所述抗体-药物缀合物或配体-药物缀合联物或本发明的所述药物组合物。
背景技术
具有治疗性生物活性的分子在理论上在许多情况下适合作为有效治疗性药物应用，以用于治疗有此需要的人类患者的疾病(如癌症)。典型的实例是小分子生物活性部分。然而，目前临床中使用的许多(如果不是全部)潜在的类药物分子和治疗剂存在众多弊端和缺点中的至少一种。当施用于人体时，除了针对待治疗疾病或健康问题的潜在方面的生物学活性之外，治疗性活性分子还可以发挥脱靶效应。此类脱靶效应是不期望的，并且存在诱发所施用分子的健康甚至危及生命的副作用的风险。正是此类不良事件的发生导致许多类药物化合物和治疗性部分未能通过III期临床试验或甚至IV期临床试验(上市后随访)。因此，强烈期望提供药物分子(如小分子治疗剂)，其中药物分子的治疗效果应该，例如，(1)对驱动疾病的生物因素或生物过程具有高度特异性，(2)足够安全，(3)足够有效，(4)充分针对患病细胞，对非患病细胞几乎没有或没有脱靶活性，(5)具有足够及时的作用方式(例如所施用的药物分子应在特定时间范围内到达人类患者体内的靶位点，并应在靶位点保持特定时间范围)，和/或(6)在患者体内具有足够长的持续治疗活性等等。尽管已经进行了长期和深入的研究，并且尽管在个别解决遇到的困难和缺点的几个领域取得了令人印象深刻的进展，但不幸的是，迄今为止，具有许多或甚至所有上述有益特征的“理想”治疗剂仍无法应用于患者。
化学疗法是癌症治疗中最重要的治疗选择之一。然而，它通常与较低的治疗窗口有关，因为它对癌细胞比对健康组织中的分裂细胞更没有特异性。单克隆抗体的发明提供了利用它们的特异性结合性质作为将细胞毒性剂靶向递送至癌细胞同时不伤害正常细胞的机制的可能性。这可以通过细胞毒性效应物(也被称为有效载荷或弹头)与抗体的化学缀合来实现，以创建抗体-药物缀合物(ADC)。通常，使用非常有效的有效载荷(如emtansine(DM1))，它们的非缀合形式具有有限的治疗指数(比较毒性剂量与有效剂量的比值)。DM1与曲妥珠单抗的缀合物(ado-曲妥珠单抗-emtansine)，也被称为Kadcycla，在猴中将DM1的耐受剂量提高了至少两倍。在过去的几十年中，已经为开发治疗性ADC做出了巨大的努力和投资。然而，尽管临床前数据很有希望，但将ADC引入临床仍然具有挑战性。2000年批准用于临床的第一个ADC是吉妥珠单抗ozogamicin(Mylotarg，CD33靶向的，Pfizer/Wyeth)，用于治疗复发性急性髓细胞性白血病(AML)。然而，麦罗塔(Mylotarg)由于许多问题(包括其安全性状况)，应美国联邦药物管理局(the Federal Drug Administration，FDA)的要求被撤出市场。与接受常规化学疗法的患者相比，接受麦罗塔治疗的患者更容易死亡。2017年，麦罗塔于再次被允许以较低的推荐剂量、与化学疗法组合或单独使用的不同方案以及新的患者群体进入市场。迄今为止，只有5种ADC被批准用于临床，同时大约55种ADC的临床开发已中止。然而，人们的兴趣仍然很高，目前在近600项临床试验中，大约有80种ADC仍处于临床开发阶段。
尽管有可能使用患者通常无法耐受的有毒有效载荷，但低治疗指数(比较毒性剂量与有效剂量的比值)是导致许多ADC在临床开发中中止的主要问题，这可能是由以下数种机制引起的：诸如对正常细胞的脱靶毒性、对细胞毒剂发展出抗性以及药物在循环中过早释放。FDA对ADC的系统审查发现，大多数ADC的毒性状况可以根据使用的有效载荷进行分类，而不是使用的抗体，这表明毒性主要由有效载荷的过早释放决定。在大约55种中止的ADC中，估计至少有23种是由于治疗指数不佳造成的。例如，曲妥珠单抗-tesirine缀合物(ADCT-502，HER-2靶向，ADC治疗剂)的开发最近因治疗指数狭窄而中止，这可能是由于表达相当大水平的HER2的肺组织中的中靶、脱组织效应造成的。此外，由于缺少主要终点，3期试验中的几种ADC已被中止。例如，在患有新诊断的胶质母细胞瘤患者中测试的迪妥昔珠单抗-莫福汀缀合物(ABT-414，EGFR靶向，AbbVie)的3期试验，和在患有铂抗性卵巢癌的患者中测试的米妥昔单抗-索星(soravtansine)缀合物(IMGN853，叶酸受体α(FRα)靶向，ImmunoGen)最近被停止治疗，没有显示出生存益处。需要特别注意的是，一些ADC的临床使用剂量可能不足以发挥其全部抗癌活性。例如，ado-曲妥珠单抗-emtansine在人体中的MTD为3.6mg/kg。在乳腺癌的临床前模型中，ado-曲妥珠单抗-emtansine在3mg/kg或以上的剂量水平诱导肿瘤消退，但在15mg/kg时观察到更有效的功效。这表明在临床给药剂量下，ado-曲妥珠单抗-emtansine可能不会发挥其最大的潜在抗肿瘤作用。
ADC主要由抗体、细胞毒性部分(如有效载荷)和连接子组成。在新ADC的设计和开发中，针对ADC的每个组分，已经提出并实施了几种新策略以克服现有问题。例如，通过识别和验证抗体组分的足够抗原性靶点，通过选择在肿瘤中具有高表达水平而在正常组织中很少或不表达的抗原，存在于细胞表面可被循环的ADC接近的抗原和在结合后允许ADC内化到细胞中的抗原；和可替代活性机制；设计和优化连接子以提高ADC的溶解度和药物抗体比(DAR)，并克服可将化学治疗性剂转运出细胞的蛋白质诱导的抗性；通过包含更多有效载荷来提高DAR比值，选择和优化抗体以提高抗体的同质性和可开发性。除了ADC的技术发展外，还正在部署新的临床和转化策略以最大化治疗指数，诸如通过分次给药改变给药方案；进行生物分布研究；包括用于优化患者选择、及早捕获应答信号并监测应答持续时间和深度以及为联合研究提供信息的生物标志物。
具有临床潜力的ADC的实例是被评估为淋巴恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的治疗选择的那些ADC，诸如本妥昔单抗vedotin、奥英妥珠单抗ozogamicin、莫西妥单抗(moxetumomab)pasudotox和波妥珠单抗vedotin。在临床试验中测试了结合(恶性)B细胞上的CD79b的波妥珠单抗vedotin和结合CD22的匹那妥珠单抗vedotin，其中每种ADC都与共同施用的利妥昔单抗组合，利妥昔单抗是一种结合CD20并且不提供有效载荷的单克隆抗体[B.Yu和D.Liu,Antibody-drug conjugates in clinical trials for lymphoidmalignancies and multiple myeloma；Journal of Hematology&Oncology(2019)12:94]。单克隆抗体的组合(如这些实例)是另一种方法，并试图达到组合许多或甚至所有上述ADC所期望的特征的“灵丹妙药”。
与此同时，在过去的几十年里，基于核酸的治疗剂正在开发中。治疗性核酸可以基于脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)和短干扰RNA(siRNA)、微小RNA以及DNA和RNA适配体，以用于诸如基因疗法、RNA干扰(RNAi)的方法。它们中的许多通过抑制DNA或RNA表达共享相同的基本作用基础，从而防止与疾病相关的异常蛋白质的表达。基因治疗领域正在进行数量最大的临床试验，其中全球有近2600项正在进行或已完成的临床试验，但只有约4％进入3期。随后是用ASO的临床试验。与ADC类似，尽管探索了大量技术，但治疗性核酸在临床开发过程中面临两个主要问题：递送到细胞中和脱靶效应。例如，ASO(如肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)和桥接核酸(BNA))正在被研究作为有吸引力的策略以特异性抑制靶基因，尤其是难以用小分子抑制剂或中和抗体靶向的那些基因。目前，正在研究不同ASO在许多神经退行性疾病(如亨廷顿病、帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症)以及几个癌症阶段中的功效。ASO作为潜在治疗剂的应用需要安全有效的方法将它们递送到靶细胞和组织的细胞质和/或细胞核。尽管ASO的临床相关性已被证明，但体外和体内的细胞摄取效率低下，限制了ASO的功效，并且一直是治疗剂开发的障碍。细胞摄取可能<2％的剂量，这导致活性部位的ASO浓度过低，无法获得有效和持续的结果。因此，这需要增加导致脱靶效应的施用剂量。最常见的副作用是补体级联的激活、凝血级联的抑制和toll样受体介导的免疫系统刺激。
化学治疗剂最常见的是小分子，然而，它们的功效受到严重的脱靶毒副作用以及溶解性差、清除速度快和肿瘤暴露有限的阻碍。支架-小分子药物缀合物(如多聚物-药物缀合物(PDC))是具有药理学活性的大分子构建体，其包含与载体支架(例如聚乙二醇(PEG))结合的小分子药物的一个或多个分子。
这种缀合原理引起了广泛的关注，并且已经被研究了几十年。大多数处于临床前或临床开发阶段的小分子药物的缀合物用于肿瘤适应症。然而，截至2014年，只有一种与癌症无关的药物(Movantik，一种阿片类物质拮抗剂纳洛酮的PEG寡聚物缀合物，AstraZeneca)被批准用于治疗患有慢性疼痛患者的阿片类物质诱导的便秘，这是一种非肿瘤适应症。迄今为止，将药物-支架缀合物的应用转化为人类对象的治疗几乎没有临床成功。例如，PK1(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物阿霉素；由Pharmacia，Pfizer开发)在小鼠模型的实体瘤和白血病中均显示出强大的抗癌活性，并且正在接受肿瘤适应症的临床研究。尽管它显示出显著降低了非特异性毒性并改善了人体的药代动力学，但在患者中抗癌功效的改善却是微不足道的，因此中止了PK1的进一步开发。
支架-小分子药物缀合物的失败至少部分归因于其在肿瘤部位的不良积累。例如，虽然在小鼠模型中，PK1在肿瘤中的积累比在健康组织(肝脏、肾脏、肺、脾脏和心脏)中高45-250倍，但在临床试验中仅在一小子集患者中观察到肿瘤中的积累。
上述问题的潜在解决方案是将纳米颗粒系统应用于药物递送，诸如脂质体。脂质体是由一层或多层磷脂双分子层组成的球形囊泡，其在磷脂分散在水中时自发形成。磷脂的两亲性特征为其提供了自组装、乳化和润湿性质，并且这些性质可以被用于新药和新药递送系统的设计。包封在脂质体递送系统中的药物与直接施用药物相比具有多种优势，诸如改善和控制药代动力学和药效学、组织靶向性质、降低的毒性和增强的药物活性。此类成功的实例是脂质体封装形式的小分子化学疗法药物阿霉素(Doxil：阿霉素的聚乙二醇化脂质体封装形式；Myocet：非聚乙二醇化脂质体阿霉素)，已被批准用于临床。
因此，仍然需要找到一种解决方案，其允许药物疗法(如抗肿瘤疗法)在期望时适用于非全身性使用，其中药物具有例如可接受的安全性状况、很低的脱靶活性、足够的功效、从患者体内清除率足够低等。
发明概述
对于本发明的实施方案，第一目标是提供改进的生物活性化合物或包含此类改进的生物活性化合物的组合物。
本发明的实施方案的数个目标之一是为在向有需要的人类患者施用小分子治疗性活性化合物时遇到的非特异性问题提供解决方案。本发明的实施方案的数个目标之一是为药物对生物因子或驱动疾病的生物过程具有非最佳特异性的问题提供解决方案。本发明实施方案的数个目标之一是为当前药物在施用于有需要的人类患者时安全特性不足的问题提供解决方案。本发明的实施方案的数个目标之一是为当前药物在施用于有需要的人类患者时不如预期有效的问题提供解决方案。本发明的实施方案的数个目标之一是为当前药物在施用于有需要的人类患者时没有充分针对患病细胞而对非患病细胞几乎没有或没有脱靶活性的问题提供解决方案。本发明的实施方案的数个目标之一是为当前药物在施用于有需要的人类患者时没有足够及时的作用模式(例如，所施用的药物分子应在特定时间范围内到达人类患者体内的靶位点，并应在靶位点保持特定时间范围)的问题提供解决方案。本发明的实施方案的数个目标之一是为当前药物在施用于有需要的人类患者时在患者体内没有足够长的持续治疗活性的问题提供解决方案。
本发明的实施方案的上述目标中的至少一个通过提供本发明的第一蛋白质分子来实现，所述第一蛋白质分子包含细胞靶向部分和至少一个皂苷，所述第一蛋白质分子还适合用作药物或适合于包含在根据本发明的药物组合中，并且适合用作根据本发明制造的本发明的ADC或抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)的半成品。所述治疗性组合包含含有共价结合皂苷的所述第一蛋白质分子并包含含有效应分子(也被称为效应子部分)的第二蛋白质分子，其中所述第一和第二蛋白质分子包含针对暴露在靶细胞的不同细胞表面分子上的不同表位的不同结合位点，其中所述不同的细胞表面分子由同一靶细胞表达并暴露在同一靶细胞表面上。
将关于具体实施方案描述本发明，但本发明不限于此而仅由权利要求书限制。除非另有说明，本文所述的本发明的实施方案可以组合和协作操作。
本发明的一个方面涉及包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点的第一蛋白质分子，所述第一蛋白质分子具有通过至少一个连接子和/或通过寡聚或多聚支架与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合或直接与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合的至少一个皂苷。根据本发明，所述第一蛋白质分子是应用于例如治疗性组合的成品，所述治疗性组合包含第一药物组合物，所述第一药物组合物包含具有与其共价偶联的皂苷的所述第一蛋白质分子(包含具有共价偶联的皂苷的所述第一蛋白质分子的第一缀合物)。其次，具有共价连接的皂苷的所述第一蛋白质分子也是半成品。所述第一蛋白质分子可以连接到例如至少一种效应子部分，诸如酶、毒素(如蛋白质毒素)、寡核苷酸(如BNA)，从而提供根据本发明的ADC或AOC，所述ADC或AOC具有一个或多个共价连接的皂苷，任选地通过连接子和/或寡聚或多聚支架。因此，本发明的一个方面涉及包含所述第一蛋白质分子或由所述第一蛋白质分子组成的缀合物，所述第一蛋白质分子包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点，其中至少一个皂苷通过至少一个连接子与所述第一蛋白质分子共价结合和/或至少一个皂苷通过寡聚或多聚支架与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合，或与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基直接共价结合。
一实施方案是本发明的所述第一蛋白质分子，其中所述第一结合位点包含以下或由以下组成：免疫球蛋白、或免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段。
一实施方案是本发明的所述第一蛋白质分子，其中至少一个皂苷是三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，以及任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团，和/或分离自霞草属(Gypsophila)物种和/或皂属(Saponaria)物种和/或麦仙翁属(Agrostemma)物种和/或皂树属(Quillaja)物种例如皂皮树(Quillaja saponaria)的皂苷。
一实施方案是本发明的所述第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点结合的所述第一细胞表面分子的第一表位是肿瘤细胞特异性受体的肿瘤细胞特异性第一表位，所述肿瘤细胞特异性受体优选选自：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、血管整合素α-V、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，更优选选自：CD71、EGFR、HER2。
一实施方案是本发明的所述第一蛋白质分子，其中所述肿瘤细胞特异性第一表位、第一肿瘤细胞表面分子或第一肿瘤细胞特异性受体是在本发明的所述第一蛋白质分子与所述第一表位或所述第一分子或所述第一受体结合后被所述肿瘤细胞内化的第一表位或第一分子或第一受体，并且其中优选地，当所述第一蛋白质分子与包含所述第一表位的细胞表面分子、肿瘤细胞表面分子或肿瘤细胞特异性受体结合时，经受例如通过内吞作用的肿瘤细胞受体介导的内化，或例如通过内吞作用的肿瘤细胞表面分子介导的内化。
本发明的一个方面涉及治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：(a)包含本发明的所述第一蛋白质分子和任选的药学上可接受的赋形剂的第一药物组合物；和(b)包含不同于所述第一蛋白质分子的第二蛋白质分子的第二药物组合物，所述第二蛋白质分子包含用于结合不同于第一细胞表面分子的第二细胞表面分子的第二表位的第二结合位点并且包含效应子部分，所述第二药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂，其中所述第二表位不同于所述第一表位。
本发明的一个方面涉及治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：(a)本发明的所述第一药物组合物，其包含根据本发明的所述第一蛋白质分子并且包含用于结合所述第一细胞表面分子上的第一表位的第一结合位点，所述第一药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂；(b)包含第三蛋白质分子的第三药物组合物，所述第三蛋白质分子包含用于结合(a)的细胞表面分子上的第一表位的第一结合位点和效应子部分，所述第三药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点和所述第三蛋白质分子的第一结合位点相同，并且其中所述第一蛋白质分子可以结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的第一表位与所述第三蛋白质分子可以结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的第一表位相同。
一实施方案是本发明的所述第一蛋白质分子和/或所述第二蛋白质分子，其是用于制造与至少一个皂苷缀合的ADC的半成品，或者其是用于制造与至少一个皂苷缀合的AOC的半成品，所述至少一个皂苷通过共价键，优选通过至少一个连接子，并且优选通过至少一个皂苷与其共价连接的寡聚或多聚支架，优选通过连接子，与所述ADC或所述AOC偶联(图91、图92)。
一实施方案是本发明的所述第一蛋白质分子和/或本发明的治疗性组合，其中所述第一结合位点和/或所述第二结合位点是或包含单克隆抗体或其至少一个细胞表面分子结合片段和/或结构域，并且优选包含以下中的任一种或由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、和表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种细胞受体结合片段和/或结构域，条件是所述第一蛋白质分子的第一结合位点不同于所述第二蛋白质分子的第二结合位点。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述第二蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含以下中的任一种或多种或由以下中的任一种或多种组成：寡核苷酸、核酸、异种核酸中。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述第二蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含至少一种蛋白质分子或由至少一种蛋白质分子组成，优选所述至少一种蛋白质分子选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、酶(如脲酶和Cre-重组酶)、核糖体失活蛋白质、蛋白质毒素。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述第二蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含至少一种有效载荷或由至少一种有效载荷组成，优选所述至少一种有效载荷选自以下中的任一种或多种：靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述第一蛋白质分子包含多于一个皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64或1-100个皂苷，或它们之间任意数量的皂苷(如7、9、12个皂苷)，其直接与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合，优选与半胱氨酸和/或赖氨酸结合，和/或通过至少一个连接子和/或通过至少一个可裂解的连接子和/或通过至少一个多聚或寡聚支架(优选1-8个此类支架或2-4个此类支架)共价结合，其中至少一个支架任选地基于树枝化基元，其中1-32个皂苷(如2、3、4、5、6、8、10、16、32个皂苷)或它们之间其任意数量(如7、9、12个皂苷)的皂苷与至少一个支架共价结合。
本发明的一个方面涉及包含本发明的所述第一蛋白质分子和本发明的所述第二蛋白质分子的组合物。
本发明的一个方面涉及包含本发明的所述第一蛋白质分子和本发明的所述第三蛋白质分子的组合物。
一实施方案是本发明所述的组合物，其包含所述第二或第三蛋白质分子连同所述第一蛋白质分子，其中所述第二蛋白质分子或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分是根据本发明的效应子部分中的任一种并且优选是BNA。
一实施方案是包含本发明所述的第一蛋白质分子和以下中的任一种或多种的组合物：寡核苷酸，核酸，异种核酸，优选选自载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或它们的衍生物中的任一种或多种，更优选BNA，例如沉默HSP27蛋白表达的BNA。
本发明的一个方面涉及包含本发明所述的第一蛋白质分子和效应子部分的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物。
一实施方案是本发明所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物，其中所述抗体可以于以下中的任一种结合：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素α-V、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，更优选选自：CD71、EGFR、HER2，和/或其中所述抗体是或包含以下中的任一种：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，和/或其中所述抗体-药物缀合物包含以下中的任一种：吉妥单抗ozogamicin、本妥昔单抗vedotin、曲妥珠单抗emtansine、奥英妥珠单抗ozogamicin、莫西妥单抗pasudotox和波妥珠单抗vedotin以及表A2和表A3的抗体-药物缀合物，或其中所述配体-药物缀合物包含用于结合细胞表面分子的至少一种配体，如EGF或细胞因子。
一实施方案是本发明所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物，其中所述效应子部分是根据本发明的效应子部分中的任一种或多种。
本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含本发明所述的组合物或本发明所述的抗体-药物缀合物或本发明所述的配体-药物缀合物，并且任选地还包含药学上可接受的赋形剂。
一实施方案是用作药物的本发明所述的治疗性组合或本发明所述的组合物或本发明所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物或本发明所述的药物组合物。
本发明的一个方面涉及以下ADC和AOC以及它们的半成品缀合物中的任一种，其包含本发明所述的第一蛋白质分子和/或本发明所述的第二蛋白质分子和/或本发明所述的第三蛋白质分子和包含本发明所述的至少一种效应分子或包含本发明所述的至少一个皂苷，或两者：
抗EGFR抗体-SO1861；
抗EGFR抗体-GE1741；
抗EGFR抗体-SA1641；
抗EGFR抗体-Quil-A；
抗EGFR抗体-QS-21；
抗EGFR抗体-皂皮树(Quillaja saponaria)的水溶性皂苷级分中的皂苷；
西妥昔单抗-皂苷；
西妥昔单抗-三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团；
西妥昔单抗-SO1861；
西妥昔单抗-GE1741；
西妥昔单抗-SA1641；
西妥昔单抗-Quil-A；
西妥昔单抗-QS-21；
西妥昔单抗-皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷；
抗HER2抗体-皂苷；
抗HER2抗体-三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团；
抗HER2抗体-SO1861；
抗HER2抗体–GE1741；
抗HER2抗体-SA1641；
抗HER2抗体-Quil-A；
抗HER2抗体-QS-21；
抗HER2抗体-皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷；
曲妥珠单抗-皂苷；
曲妥珠单抗-三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团；
曲妥珠单抗-SO1861；
曲妥珠单抗-GE1741；
曲妥珠单抗-SA1641；
曲妥珠单抗-Quil-A；
曲妥珠单抗-QS-21；
曲妥珠单抗-皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷；
抗CD71抗体-皂苷；
抗CD71抗体-三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团；
抗CD71抗体-SO1861；
抗CD71抗体-GE1741；
抗CD71抗体-SA1641；
抗CD71抗体-Quil-A；
抗CD71抗体-QS-21；
抗CD71抗体-皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷；
OKT-9-皂苷；
OKT-9-三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团；
OKT-9-SO1861；
OKT-9-GE1741；
OKT-9-SA1641；
OKT-9-Quil-A；
OKT-9-QS-21；
OKT-9-皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷；
抗EGFR抗体-寡核苷酸；
抗EGFR抗体-反义寡核苷酸；
抗EGFR抗体-siRNA；
抗EGFR抗体-反义BNA；
抗EGFR抗体-反义BNA(HSP27)；
抗EGFR抗体-蛋白质毒素；
抗EGFR抗体-核糖体失活蛋白；
抗EGFR抗体-石竹苷；
抗EGFR抗体-皂草素；
西妥昔单抗-寡核苷酸；
西妥昔单抗-反义寡核苷酸；
西妥昔单抗-siRNA；
西妥昔单抗-反义BNA；
西妥昔单抗-反义BNA(HSP27)；
西妥昔单抗-蛋白质毒素；
西妥昔单抗-核糖体失活蛋白；
西妥昔单抗-石竹素；
西妥昔单抗-皂草素；
抗HER2抗体-寡核苷酸；
抗HER2抗体-反义寡核苷酸；
抗HER2抗体-siRNA；
抗HER2抗体-反义BNA；
抗HER2抗体反义BNA(HSP27)；
抗HER2抗体-蛋白质毒素；
抗HER2抗体-核糖体失活蛋白；
抗HER2抗体-石竹素；
抗HER2抗体-皂草素；
曲妥珠单抗-寡核苷酸；
曲妥珠单抗-反义寡核苷酸；
曲妥珠单抗-siRNA；
曲妥珠单抗-反义BNA；
曲妥珠单抗-反义BNA(HSP27)；
曲妥珠单抗-蛋白质毒素；
曲妥珠单抗-核糖体失活蛋白；
曲妥珠单抗-石竹素；
曲妥珠单抗-皂草素；
抗CD71抗体-寡核苷酸；
抗CD71抗体-反义寡核苷酸；
抗CD71抗体-siRNA；
抗CD71抗体-反义BNA；
抗CD71抗体-反义BNA(HSP27)；
抗CD71抗体-蛋白质毒素；
抗CD71抗体-核糖体失活蛋白；
抗CD71抗体-石竹素；
抗CD71抗体-皂草素；
OKT-9-寡核苷酸；
OKT-9-反义寡核苷酸；
OKT-9-siRNA；
OKT-9-反义BNA；
OKT-9-反义BNA(HSP27)；
OKT-9-蛋白质毒素；
OKT-9-核糖体失活蛋白；
OKT-9-石竹素；
OKT-9-皂草素；
抗EGFR抗体(-寡核苷酸)(-皂苷)，其中所述寡核苷酸为反义寡核苷酸、siRNA、反义BNA和反义BNA(HSP27)中的任一种或多种，其中所述皂苷为以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，其中抗EGFR抗体优选为西妥昔单抗；
抗EGFR抗体(-蛋白质毒素)(-皂苷)，其中蛋白质毒素是核糖体失活蛋白、石竹素和皂草素中的任一种或多种，并且其中皂苷为以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，其中抗EGFR抗体优选为西妥昔单抗；
抗HER2抗体(-寡核苷酸)(-皂苷)，其中所述寡核苷酸为反义寡核苷酸、siRNA、反义BNA和反义BNA(HSP27)中的任一种或多种，并且其中所述皂苷为以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，其中抗HER2抗体优选为曲妥珠单抗；
抗HER2抗体(-蛋白质毒素)(-皂苷)，其中蛋白质毒素是核糖体失活蛋白、石竹素和皂草素中的任一种或多种，并且其中皂苷为以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，其中抗HER2抗体优选为曲妥珠单抗；
抗CD71抗体(-寡核苷酸)(-皂苷)，其中所述寡核苷酸为反义寡核苷酸、siRNA、反义BNA和反义BNA(HSP27)中的任一种或多种，并且其中皂苷为以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，其中抗CD71抗体优选为OKT-9；和
抗CD71抗体(-蛋白质毒素)(-皂苷)，其中蛋白质毒素是核糖体失活蛋白、石竹素和皂草素中的任一种或多种，并且其中皂苷为以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，其中抗CD71抗体优选为OKT-9。
一实施方案是本发明所述的第一蛋白质分子、本发明所述的半成品缀合物或本发明所述的缀合物，其中所述第一结合位点选自：西妥昔单抗、曲妥珠单抗、OKT-9，和/或其中所述效应分子选自：石竹素、皂草素和反义BNA(HSP27)，和/或其中皂苷选自SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷。
一实施方案是根据本发明的缀合物，其中所述蛋白质分子选自西妥昔单抗、曲妥珠单抗、OKT-9，和/或其中所述分子选自石竹素、皂草素和反义BNA(HSP27)，和/或其中皂苷选自SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷。
本发明的一个方面涉及ADC或AOC或半成品ADC缀合物或半成品AOC缀合物，其包含本发明所述一蛋白质分子并包含至少一种本发明所述应分子和/或包含本发明所述的结构C的至少一个皂苷：
A(–S)b(–E)c
结构C,
其中A是第一结合位点；
S是皂苷；
E是效应分子；
b＝0-64，优选为：0、1、2、3、4、8、16、32、64或它们之间的任意整数或部分；
c＝0-8，优选为：0、1、2、3、4、6、8或它们之间的任意整数或部分，
其中S与A和/或E偶联，E与A和/或S偶联，优选S与A偶联且E与A偶联。
一实施方案是本发明的结构C，其中A是抗EGFR抗体(如西妥昔单抗)、抗HER2抗体(如曲妥珠单抗)、抗CD71抗体(如OKT-9)和/或其中S是以下中的任一种或多种：三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团、SO1861、GE1741、SA1641、Quil-A、QS-21和皂皮树的水溶性皂苷级分中的皂苷，和/或其中E是以下中的任一种或多种：寡核苷酸、反义寡核苷酸、siRNA、反义BNA和反义BNA(HSP27)，和/或以下中的任一种或多种：蛋白质毒素、核糖体失活蛋白、石竹素和皂草素。
一实施方案是本发明的结构C，本发明所述的缀合物或本发明所述的半成品缀合物或本发明所述的第一蛋白质分子，其中皂苷(如果存在)和/或效应分子(如果存在)通过至少一个连接子(如可裂解连接子)，和/或通过至少一个寡聚或多聚支架(如基于N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼(EMCH)琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)和1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯(HATU)，以及如基于树枝化基元(如G4-树枝化基元)的支架)或三功能连接子(如方案II的三功能连接子)共价偶联，和/或其中至少所述第一蛋白质分子的第一结合位点的赖氨酸侧链和/或半胱氨酸侧链(优选单克隆抗体或其片段或结构域)参与皂苷和/或效应分子和/或连接子和/或可裂解连接子和/或支架的共价键，其中优选皂苷和/或效应分子与所述第一蛋白质分子(优选抗体)的第一结合位点共价连接，其中共价连接包含酰胺键、腙键、二硫键或由酰胺键、腙键、二硫键组成。
本发明的一个方面涉及任何上述本发明缀合物或本发明所述半成品缀合物或本发明所述第一蛋白质分子作为药物的用途。
本发明的一个方面涉及本发明所述的任何缀合物或本发明所述的半成品缀合物或本发明的所述第一蛋白质分子用于治疗或预防癌症或自身免疫性疾病的用途。
图91和图92显示了具有共价偶联的皂苷的本发明所述的ADC和具有共价偶联的皂苷的本发明所述的OAC的实例。
定义
术语“连接子”有其常规的科学含义并且本文是指通过肽键复合的化学部分或氨基酸残基的线性段，它将分子或原子连接到另一个分子(例如配体或效应分子或支架)上。通常，连接子包含通过化学键连接的原子链。本领域已知的任何连接子分子或连接子技术均可以被用于本公开。在指明时，连接子是用于通过适合与连接子形成共价键或键的此类分子上的化学基团共价结合分子的连接子。连接子可以是不可裂解的连接子，例如连接子在生理条件下是稳定的。连接子可以是可裂解的连接子，例如在酶的存在下或在特定的pH范围或值下，或在生理条件下(如内体(如晚期内体)的细胞内条件下和哺乳动物细胞(如人细胞)的溶酶体中)可裂解的连接子。可用于本公开内容的示例性连接子包括但不限于N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼(EMCH)、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)和1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)。
术语“三功能连接子”有其常规的科学含义并且本文是指通过三个分子中的每一个上的化学基团连接三个分子的连接子。技术人员能够基于本公开内容和公知常识设计此类三功能连接子。此类三功能连接子可以表现出例如马来酰亚胺基团，其可以被用于与表现出硫醇基团的靶向配体缀合以进行硫醇-烯反应。此外，三功能连接子可以表现出二苯并环辛炔(DBCO)基团，以与带有叠氮基的皂苷进行所谓的应变促进炔-叠氮环加成反应(SPAAC，点击化学)。最后，三功能连接子可以获得第三官能团(如反式环辛烯(TCO)基团)，以与带有四嗪(Tz)的效应分子进行所谓的逆电子需求狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)(IEDDA)反应。技术人员将理解三功能连接子的化学基团可以是所有三个相同或不同的，或者连接子可以包含用于将分子连接到三功能连接子的两个相同化学基团。三功能连接子之间形成的键可以是共价键或非共价键，优选共价键。三功能连接子与一个或两个或三个结合分子之间通过各自的化学基团形成的键可以是可裂解的(不稳定的)键，诸如在细胞内(如人细胞的哺乳动物细胞内体和溶酶体)的酸性条件下可裂解的，或者可以是不可裂解的键。当然，三功能连接子可以包含用于形成共价键的一个或两个化学基团，而另外的两个或一个化学基团分别用于形成非共价键。当然，三功能连接子可以包含用于形成可裂解键的一个或两个化学基团，而另外的两个或一个化学基团分别用于形成不可裂解的键。
术语“可裂解的”(如在术语“可裂解的连接子”或“可裂解的键”中使用的)具有其常规的科学含义并且本文是指在酸性条件、还原条件、酶促条件或光诱导条件下经历裂解。例如，可裂解连接子可在酸性条件下经历裂解，优选地，所述可裂解连接子在如存在于哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中的酸性条件下(优选在pH 4.0-6.5，更优选pH≤5.5)在体内经历裂解。作为另一个实例，可裂解连接子可以经历酶(通过组织蛋白酶)裂解。此外，在还原条件下可裂解的共价键的一个实例是二硫键。
在寡聚或多聚支架的上下文中，术语“寡聚物”和“多聚物”具有其常规的科学含义。此处的多聚物是指具有分子结构主要或完全由大量相同或相似的单元结合在一起构成的物质；这里的寡聚物是指其分子由相对较少的重复单元组成的聚合物。例如，包含5-10个或更少相同或相似单元的结构可以被称为寡聚结构，而包含10-50个或更多单体单元的结构可以被称为多聚结构，而包含10个单体单元的结构可以被称为寡聚或多聚的结构。
术语“结合位点”有其常规的科学含义并且本文是指分子上的区域或表位，例如另一个分子可以结合的蛋白质、DNA或RNA。
术语“支架”具有其常规的科学含义并且本文是指一个或多个分子(如配体分子、效应分子)可以直接或通过连接子(如可裂解连接子)与其共价结合的寡聚或多聚模板或载体或基体(基础分子或基础结构)。支架可以具有结构有序的形成，诸如多聚物、寡聚物、树枝状大分子、树枝状多聚物或树枝状寡聚物，或者具有组装的多聚物结构(如水凝胶、微凝胶、纳米凝胶、稳定的多聚物胶束或脂质体)，但排除由单体的非共价组装组成的结构(如胆固醇/磷脂混合物)。支架可以包含多聚或寡聚结构，诸如聚或寡聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺)；或结构，诸如聚乙二醇；聚或寡聚(酯)，诸如聚(丙交酯)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物；或聚(糊精)、聚或寡糖，诸如环糊精或聚右旋糖；或结构，诸如天然和/或人工多聚或寡氨基酸，诸如聚赖氨酸或肽或蛋白质、DNA寡聚或多聚体、稳定的RNA多聚体或PNA(肽核酸)多聚体。优选地，多聚物或寡聚结构是生物相容的，其中生物相容是指多聚或寡聚结构在生物体中不显示出显著的急性或慢性毒性，并且可以原样排泄或完全降解为身体新陈代谢可排泄的和/或生理的化合物。代谢。
术语“配体”具有其常规的科学含义并且本文是指可以选择性地结合靶细胞(例如靶癌细胞或靶自身免疫细胞)处表达的靶细胞表面分子或靶细胞表面受体。配体可以结合靶细胞上的受体或其他抗原所包含的表位。优选地，细胞结合配体是抗体。
如本文所用的，术语“抗体”以最广义使用，其是指被限定为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质的免疫球蛋白(Ig)，或免疫球蛋白的功能性结合片段或结合结构域。在本发明的上下文中，免疫球蛋白的“结合片段”或“结合结合域”被限定为亲本免疫球蛋白的抗原结合片段或结构域或其他衍生物，其基本上保持此类亲本免疫球蛋白的抗原结合活性。功能片段和功能结构域是本发明意义上的抗体，即使它们对抗原的亲和力低于亲本免疫球蛋白的亲和力。根据本发明的“功能片段和结构域”包括但不限于F(ab')2片段、Fab'片段、Fab片段、scFv、dsFv、单域抗体(sdAb)、单价IgG、scFv-Fc、还原型IgG(rIgG)、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fc融合蛋白、纳米抗体、可变V结构域(如VHH、Vh)以及其他类型的抗原识别免疫球蛋白片段和结构域。可以对片段和结构域进行工程化，以最大限度地减少或完全去除CH1结构域和CL结构域之间发生的分子间二硫键相互作用。功能片段和结构域因其较小的尺寸而具有更大的肿瘤渗透优势。此外，与完整的免疫球蛋白相比，功能片段或结构域可以更均匀地分布在整个肿瘤块中。
本发明的抗体(免疫球蛋白)可以是双功能的或多功能的。例如，双功能抗体的一个臂对一种受体或抗原具有特异性，而另一臂识别不同的受体或抗原。可替代地，双功能抗体的每个臂可以对靶细胞的相同受体或抗原的不同表位具有特异性。
本发明的抗体(免疫球蛋白)可以是但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、表面重整抗体、抗独特型抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、大鼠/小鼠杂交抗体、美洲驼抗体、美洲驼仅重链抗体、仅重链抗体和兽用抗体。优选地，本发明的抗体(免疫球蛋白)是单克隆抗体。表面重整的、嵌合的、人源化的和完全人抗体也是更优选的，因为它们不太可能在人类中引起免疫原性。本发明的ADC的抗体优选与在癌细胞、自身免疫细胞、患病细胞、异常细胞表面上表达的抗原特异性结合，同时使任何健康细胞基本上未改变(例如通过不结合此类正常细胞，或通过与此类健康细胞在数量和/或亲和力上以较低的程度结合)。
可用于本发明ADC的特异性抗体包括但不限于抗HER2单克隆抗体(如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)、抗CD20单克隆抗体(如利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗和替伊莫单抗)、抗CA125单克隆抗体(如奥戈伏单抗)、抗EpCAM(17-1A)单克隆抗体(如依决洛单抗)、抗EGFR单克隆抗体(如西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗)、抗CD30单克隆抗体(如本妥昔单抗)、抗CD33单克隆抗体(如吉妥珠单抗和huMy9-6)、抗血管整合素α-vβ-3单克隆抗体(如伊瑞西珠)、抗CD52单克隆抗体(如阿仑珠单抗)、抗CD22单克隆抗体(如依帕珠单抗)、抗CEA单克隆抗体(如拉贝珠单抗)、抗CD44v6单克隆抗体(比伐珠单抗)、抗FAP单克隆抗体(如西罗珠单抗)、抗CD19单克隆抗体(如huB4)、抗CanAg单克隆抗体(huC242)、抗CD56单克隆抗体(如huN901)、抗CD38单克隆抗体(如达雷妥尤单抗)、抗CA6单克隆抗体(如DS6)、抗IGF-IR单克隆抗体(如西妥木单抗和3B7)、抗整合素单克隆抗体(CNTO95)、以及抗多配体蛋白聚糖-1单克隆抗体(如B-B4)。
结合靶细胞的细胞受体或抗原的抗体以外的任何其他分子也可以被用作本发明的配体-药物缀合物和提供有根据本发明的共价结合皂苷的配体的细胞结合配体。这些配体包括但不限于蛋白质、多肽、肽、小分子。这些非抗体配体的实例是干扰素(例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、转铁蛋白、凝集素、表皮生长因子(EGF)和EGF样结构域、胃泌素释放肽(GRP)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、痘苗生长因子(VGF)、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF，例如IGF-1和IGF-2)、其他合适的激素(如促甲状腺激素释放激素(TRH)、促黑色素细胞激素(MSH)、类固醇激素(例如雌激素和雄激素))、生长激素抑制素、淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4和IL-6)、集落刺激因子(CSF例如G-CSF、M-CSF和GM-CSF)、铃蟾肽、胃泌素、Arg-Gly-Asp或RGD、适配体(如AS-1411、GBI-10、针对HIV糖蛋白的RNA适配体)、小分子(例如叶酸、茴香酰胺苯基硼酸(anisamide phenylboronic acid))、维生素(例如维生素D)、碳水化合物(例如透明质酸、半乳糖)。
“效应分子”或“效应部分”或“有效载荷”具有其常规的科学含义，并且在本发明的上下文中是通过与细胞内效应分子靶标相互作用而影响细胞代谢的任何物质，其中该效应分子靶标是细胞内的任何分子或结构，除了内吞和再循环途径的隔室和囊泡的管腔除外但包括这些隔室和囊泡的膜。因此，细胞内的所述结构包括细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、其他转运囊泡、质膜的内部和细胞质。
效应分子或部分是药物活性物质，诸如毒素(如蛋白质毒素)、药物、多肽或多核苷酸。本发明中的药物活性物质是用于在生物体中实现有益结果的效应分子或部分，所述生物体优选脊椎动物，更优选哺乳动物，例如非人类对象或人类/对象。益处包括疾病和/或症状和/或健康问题的诊断、预后、治疗、治愈和预防(prevention/prophylaxis)。药物活性物质也可能导致不期望的，有时甚至是有害的副作用(如在临床试验中观察到的不良事件)。在这种情况下，必须权衡利弊，以确定药物活性物质是否适合特定情况。如果细胞内药物活性物质的作用主要对整个生物体有益，则该细胞被称为靶细胞。如果细胞内的效应主要对整个生物体有害，则该细胞被称为脱靶细胞。在人工系统(如细胞培养和生物反应器)中，靶细胞和脱靶细胞取决于目的并由用户定义。效应分子和部分的实例是药物、毒素、多肽(如酶)、多核苷酸(包括包含非天然氨基酸或核酸的多肽和多核苷酸)及它们的任意组合。
作为药物的效应分子或效应子部分可以包括但不限于抗癌剂、抗炎剂和抗感染剂(例如抗真菌剂、抗细菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)。优选地，本发明的药物分子是抗癌剂或抗自身免疫剂。合适的抗癌剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂和激酶抑制剂。“抗癌剂”的定义中还包括：例如(i)用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，芳香酶调节肾上腺中雌激素的产生；(iii)抗雄激素；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，尤其是抑制与异常细胞增殖有关的信号通路中基因表达的那些反义寡核苷酸；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因治疗疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；(ix)抗血管生成剂；以及任何上述物质的药学上可接受的盐、酸、溶剂化物和衍生物。
作为毒素的效应分子或部分可以包括但不限于蛋白质毒素(例如细菌衍生的毒素和植物衍生的毒素)、靶向微管蛋白丝的毒素、靶向DNA的毒素、靶向RNA的毒素。蛋白质毒素的实例是皂草素(saporin)、石竹素(dianthin)、蓖麻毒素(ricin)、modeccin、相思豆毒素(abrin)、蒴莲根毒蛋白(volkensin)、槲寄生素、志贺毒素、志贺样毒素、假单胞菌外毒素(PE，也称为外毒素A)、白喉毒素(DT)和霍乱毒素。靶向微管蛋白丝的毒素的实例是美登木素类(例如DM1和DM4)、澳瑞他汀(例如单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF))、类毒素、tubulysin、念珠藻素、根霉素。靶向DNA的毒素的实例是卡奇霉素：N乙酰基-γ卡奇霉素、CC-1065类似物、倍癌霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、苯二氮卓类、喜树碱类似物和蒽环类。靶向DN毒素的实例是鹅膏蕈碱、剪接抑制素和泰兰斯他汀。本发明中所使用的毒素被定义为能够杀死或灭活细胞的药物活性物质。优选地，靶向毒素是仅或至少主要对靶细胞有毒但对脱靶细胞无毒的毒素。靶向毒素的净效应优选对整个生物体是有益的。
作为多肽的效应分子或部分可以是例如恢复失去的功能(如酶置换、基因调节功能)的多肽或毒素。作为效应分子的多肽的实例是，例如，Cas9；毒素(例如皂草素、石竹素、白树毒素、(去)布加宁((de)bouganin)、农杆菌素、蓖麻毒蛋白(毒素的A链)；美洲商陆抗病毒蛋白、凋亡蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素)、代谢酶(例如精氨琥珀酸裂解酶、精氨琥珀酸合成酶)、凝血级联的酶、修复酶；细胞信号转导酶；细胞周期调节因子；基因调节因子(转录因子，诸如NF-κB或基因阻遏物，诸如甲硫氨酸阻遏物)。
作为多核苷酸的效应分子或效应子部分可以是例如包含编码信息(如编码蛋白质的基因或开放阅读框)的多核苷酸。它还可以包括监管信息，例如启动子或调控元件结合区，或编码微RNA的序列。此类多核苷酸可以包含天然和人工核酸。人工核酸包括，例如肽核酸(PNA)、吗啉和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些中的每一个都通过分子骨架的变化与天然存在的DNA或RNA区分开来。作为效应分子的核苷酸的实例是但不限于例如DNA：单链DNA(例如腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的DNA)；线性双链DNA(例如凝血因子IX基因)；环状双链DNA(例如质粒)；RNA：mRNA(例如TAL效应分子核酸酶)、tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、反义RNA；反义寡核苷酸(ASO、AON，例如PNA、PMO、LNA和BNA)。
术语“蛋白质”(用于例如“蛋白质分子”和“蛋白质毒素”)是包含至少一串氨基酸残基的分子和毒素，其可以作为单个mRNA的表达产物获得。作为任何翻译后修饰的结果，此类分子或毒素还可以包含任何翻译后修饰、碳水化合物(如N-或O-连接的碳水化合物)、二硫键、磷酸化、硫酸化等，和/或还可以包含任何其他修饰(如由化学修饰产生的那些修饰(例如，将效应子部分、皂苷、支架、配体等)，或直接连接到例如氨基酸侧链，或通过与用于化学修饰蛋白质分子的分子结合的至少一个连接子(共价)，并与蛋白质分子化学结合(共价)术语“蛋白质”还涵盖并包括此类分子的组装体，例如同源二聚体、异源三聚体、异源六聚体或复杂的组装体(如核糖体)。
在例如“特异性结合”和“在肿瘤细胞表面特异性存在或表达的受体或分子靶标”的上下文中，术语“特异性”和“特异性地”具有它们在本领域的正常科学含义艺术并且本文是指相对于第一分子与不同于第二分子的另一分子的任何推定结合，第一分子与第二分子的结合相互作用以更高的亲和力发生或表达，或例如到更高程度的表达，例如考虑受体或分子靶标的数量，相对于在第二类型细胞(如健康细胞等)处的相同受体或分子靶标的表达的程度，第一类型细胞(如肿瘤细胞、自身免疫细胞、患病细胞、异常细胞)表面上的细胞表面受体或分子靶标的数量，其中相对于在肿瘤细胞等上的任何表达程度，在第二类型细胞处的表达可以完全不存在或非常低。此外，术语“特异性”，例如在“特异性结合”中，具有本领域已知的正常科学含义，并且本文具有指示可以与具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力的另一分子相互作用的分子的含义。类似地，术语“特异性”是指例如两个分子之间或细胞与分子之间的相互作用，其具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力。结合分子(如免疫球蛋白)通过它们的结合位点(如免疫球蛋白的免疫球蛋白可变区)结合分子上的结合位点(如表位、细胞表面受体等)，具有比分子间背景相互作用更高的结合亲和力。在本发明的上下文中，背景相互作用通常是具有低10E-4M的KD的亲和力的相互作用。类似地，“特异性结合结构域”是优先结合分子上的结合位点(如表位、细胞表面受体等)的结构域，具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力。在本发明的上下文中，“背景相互作用”通常是亲和力低于10E-4M的KD的相互作用。优选地，特异性结合结构域以高于约10E-5M的KD的亲和力结合。
术语“结合”被定义为可以与背景相互作用区分开来的分子之间的相互作用。
在整个说明书中，术语“片段”是指作为蛋白质结构域的一部分或构建完整蛋白质结构域的氨基酸序列。根据本发明的结合片段必须对相应的靶标(例如在患病细胞(如肿瘤细胞)的表面上如细胞表面受体)具有结合特异性。
术语“ADC”或“抗体-药物缀合物”具有技术人员已知的常规科学含义并且本文是指一类被设计作为用于治疗例如癌症的靶向疗法的生物制药药物。与化学疗法不同，ADC旨在靶向并杀死肿瘤细胞，同时保留健康细胞。ADC由与生物活性细胞毒性(抗癌)有效载荷或药物相连的抗体组成。ADC组合了单克隆抗体的靶向能力和细胞毒性药物的杀癌能力。它们被设计为旨在区分健康细胞和患病组织(如肿瘤中的肿瘤细胞)。
术语“皂苷集”具有其正常含义并且本文是指Merck KGaA(达姆施塔特，德国)生产的皂苷混合物，其含有来自重瓣丝石竹(Gypsophila paniculata)和Gypsophila arostii的皂苷，含有SA1657和主要是SA1641。
术语“皂树皂苷(Quillajasaponin)”具有其正常含义并且本文是指皂皮树的皂苷级分，因此是所有其他QS皂苷的来源，主要包含QS-18和QS-21。
“QS-21”或“QS21”具有其常规的科学含义并且本文是指QS-21A-apio(～63％)、QS-21A-xylo(～32％)、QS-21B-apio(～3.3％)和QS-21B-xylo(～1.7％)的混合物。
类似地，“QS-21A”具有其常规的科学含义并且本文是指QS-21A-apio(～65％)和QS-21A-xylo(～35％)的混合物。
类似地，“QS-21B”具有其常规的科学含义并且本文是指QS-21B-apio(～65％)和QS-21B-xylo(～35％)的混合物。
术语“Quil-A”是指商售来自皂皮树的半纯化提取物，并且含有不同数量的50多种不同皂苷，其中许多包含在QS-7、QS-17、QS18和QS-21中发现的C-3β-OH基团处的三萜-三糖亚结构Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-。在Quil-A中发现的皂苷列于van Setten(1995)，表2[Dirk C.van Setten、Gerrit van de Werken、Gijsbert Zomer和GideonF.A.Kersten，Glycosyl Compositions and Structural Characteristics of thePotential Immuno-adjuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria MolinaExtract Quil A,RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY,VOL.9,660-666(1995)]。Quil-A和皂树皂苷是来自皂皮树的皂苷级分，并且两者都含有大量不同的皂苷，且含量大部分重叠。这两个级分的具体组成不同，因为这两个级分是通过不同的纯化程序获得的。
术语“QS1861”和术语“QS1862”指的是QS-7和QS-7api。QS1861的分子量为1861道尔顿，QS1862的分子量为1862道尔顿。QS186被描述于Fleck等人(2019)，表1中的第28行[Juliane Deise Fleck、Andresa Heemann Betti、Francini Pereira da Silva、EduardoArtur Troian、Cristina Olivaro、Fernando Ferreira和Simone Gasparin Verza，Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis:ParticularChemical Characteristics and Biological Activities,Molecules 2019,24,171；doi:10.3390/molecules24010171]。所描述的结构是QS-7的api变体QS1862。分子质量为1862道尔顿，因为该质量是包括葡糖醛酸处的质子的正式质量。在中性pH下，分子被去质子化。在负离子模式的质谱仪中测量时，测量的质量为1861道尔顿。
说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等被用于区分相似的要素，并不一定用于描述顺序或时间顺序。在适当的情况下，这些术语可以互换。本发明的实施方案可以以不同于本文所描述或图示的其他顺序操作。
此外，各种实施方案，虽然被称为“优选的”或“例如(e.g./for example)”或“特别地”被解释为可以实施本发明的示例性方式而不是限制本发明的范围。
权利要求中使用的术语“包含”不应被解释为限于其后列出的要素或步骤；它不排除其他要素或步骤。需要将其解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除其一个或多个其他特征、整数、步骤或组分或组的存在或添加。因此，表述“包含A和B的药物组合物”的范围不应限于仅由组分A和B组成的药物组合物，而是就本发明而言，药物组合物的唯一列举的组分是A和B，并且权利要求还应被解释为包括那些组件的等效物。类似地，表述“包括步骤A和步骤B的方法”的范围不应限于仅由步骤A和步骤组成的方法，而是就本发明而言，该方法仅列举的步骤是A和B，并且权利要求还应被解释为包括这些步骤的等价物。
此外，不定冠词“一个/种(a/an)”对特征的引用不排除存在多于一个/种特征(如组分、赋形剂、皂苷等)的可能性，除非上下文清楚要求有一个且只有一个特征。因此，不定冠词“一个/种(a/an)”通常意指“至少一个/种”。
附图简述
图1.抗体-蛋白质毒素+未缀合的SO1861的体内研究。用不同浓度的曲妥珠单抗-皂草素(i.v.)+1.5mg/kg的未缀合的SO1861处理BT474荷瘤小鼠(在曲妥珠单抗-皂草素处理前1小时进行subQ注射)。
图2.未缀合的皂苷介导的内体逃逸和靶细胞杀伤增强。A)在有或没有1.5pM的EGF石竹素B的情况下，用SO1861、SO1832、SO1862(SO1861的异构体)或SO1904处理的HeLa细胞(EGFR+)的细胞活力分析；B)用EGF石竹素和固定浓度的SO1861、SO1832、SO1862(SO1861的异构体)或SO1904处理的HeLa细胞(EGFR+)的细胞活力分析。A)和B)的轴和图例是相同的。C)在有或没有1.5pM的EGF石竹素的情况下，用SO1861或GE1741处理的HeLa细胞(EGFR+)的细胞活力分析。D)在有或没有1.5pM的EGF石竹素的情况下，用各种QSmix(来自皂皮树的皂苷混合物)处理的HeLa细胞(EGFR+)的细胞活力分析。C)和D)的Y轴相同。
图3.未缀合的SO1861与SO1861-EMCH活性的对比。根据本发明，EGFR靶向反义BNA寡核苷酸递送和癌细胞中的基因沉默。A、B、C)在有或没有1.5pM的EGF石竹素的情况下，用SO1861或SO1861-EMCH处理的A431(EGFR++)、HeLa(EGFR+)或A2058(EGFR-)细胞的细胞活力分析。D、E)在有或没有1.5pM的EGF石竹素的情况下，用SO1861或SO1861-N3处理的A431(EGFR++)或HeLa(EGFR+)细胞的细胞活力分析。A)、B)、C)、D)和E)的轴和图例相同。即，图3的A-C的图例展示在图3的C旁边；图3的D和图3的E的图例展示在图3的E旁边。
图4.未缀合的SO1861与SO1861-EMCH(不稳定的)与SO1861-S(稳定的)的对比。在有或没有EGF石竹素的情况下，用SO1861、SO1861-S(S＝HATU，稳定的连接子)和SO1861-EMCH(不稳定的连接子)处理的HeLa细胞(EGFR+)的细胞活力分析。
图5.EGFR靶向的反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。用西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+100nM的HSP27BNA处理的A431(EGFR++)和A2058(EGFR-)细胞的HSP27mRNA的表达分析。A)和B)的轴和图例相同，并且图例展示在图5的B旁边。C)和D)的Y轴相同。
图6.荷瘤小鼠的肿瘤靶向反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。与对照组相比，在A431荷瘤小鼠中用，HSP27BNA+西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9处理的小鼠显示出有效的肿瘤靶向基因沉默。
图7.1T2C的体内活性。与对照相比，在A431荷瘤小鼠中，50mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4+25mg/kg的西妥昔单抗-(-L-HSP27BNA)4的1T2C组合显示出强烈的肿瘤靶向基因沉默。
图8.1T2C的体内活性。在PDX肿瘤小鼠模型(高HER2表达)中，40mg/kg的曲妥珠单抗-(CYS-L-SO1861)4+0.02/0.03mg/kg的曲妥单抗-皂草素的1T2C组合显示有效的肿瘤生长抑制。
图9.1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR++)(A、C)和CaSKi细胞(EGFR+)(B、D)中的EGFR靶向的细胞杀伤。A、B)A431(A)和CaSKi(B)细胞上的西妥昔单抗-(CYS-L-SO1861)3,7滴定+固定浓度的10pM的西妥昔单抗-皂草素和对照。C、D)A431(C)和CaSKi(D)细胞上的西妥昔单抗-皂草素滴定+固定浓度的75nM的西妥昔单抗-CYS-L-SO1861)3,7和对照。
图10.1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在HeLa细胞(EGFR+/-)(A、C)和A2058细胞(EGFR-)(B、D)中的EGFR靶向的细胞杀伤。A、B)HeLa(A)和CaSKi(B)细胞上的西妥昔单抗-(CYS-L-SO1861)3,7滴定+固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素和对照。C、D)HeLa(C)和A2058(D)细胞上的西妥昔单抗-皂草素滴定+固定浓度的75nM西妥昔单抗-CYS-L-SO1861)3,7和对照。
图11：1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在SKBR3细胞(HER2++)中的HER2靶向的细胞杀伤(A、B)。A)在SKBR3细胞上的曲妥珠单抗(CYS-L-SO1861)4滴定+固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素和对照。B)在SKBR3细胞上的曲妥珠单抗-皂草素滴定+固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和对照。
图12.1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在JIMT-1细胞(HER2+/-)(A、C)和MDA-MB-468细胞(HER2-)(B、D)中的HER2细胞杀伤。A、B)在JIMT-1(A)和MDA-MB-468(B)细胞上的曲妥珠单抗Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素和对照。C、D)在JIMT-1(C)和MDA-MB-468(D)细胞上的曲妥珠单抗-皂草素滴定+固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和对照。
图13：氯喹抑制1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合+氯喹，在SK-BR-3(HER2++)和A431细胞(EGFR++)中的HER2和EGFR靶向的细胞杀伤。A)在SK-BR-3细胞上，曲妥珠单抗-皂草素滴定+固定浓度的5nM曲妥珠单抗-Cys-L-SO1861)4+0.5μM的氯喹和对照。B)在A431细胞上的西妥昔单抗-皂草素滴定+固定浓度的5nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8+0.5μM氯喹和对照。
图14：1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR++)和A2058细胞(EGFR-)中的EGFR靶向的基因沉默。A、B)在A431细胞(A)和A2058细胞(B)上的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8滴定+固定浓度的100nM西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4和对照。C、D)在A431细胞(C)和A2058细胞(D)上的西妥昔单抗-(LYS-L-HSP27BNA)4滴定+固定浓度的77nM的西妥昔单抗-(CYS-L-SO1861)3,8和对照。
图15：2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，A)在MDA-MB-468细胞(EGFR++)和HeLa细胞(EGFR+/-)中的EGFR和HER2靶向的细胞杀伤以及在SK-BR-3细胞(HER2++)和JIMT-1细胞(HER2+/-)中HER2靶向的细胞杀伤。A)在MDA-MB-468细胞(A)和HeLa细胞(B)上的西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9滴定+固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素和的对照。C、D)在SK-BR-3细胞(C)和JIMT-1细胞(D)上的曲妥珠单抗(Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4滴定+固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素和对照。
图16.2-靶标2-组分。可以用根据本发明的治疗性组合曲妥珠单抗-皂草素+2.5nM的曲妥单珠抗(CYS-L-SO1861)4有效杀伤SK-BR-3细胞(HER2+/-)，然而T-DM1+2.5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定在如此低的毒素浓度下无效。T-DM1是每个抗体(DAR3.5)携带～3.5个emtansine(DM1)毒素分子的曲妥珠单抗-emtansine
Figure BDA0003222616810000331
图17.1-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR++)(A)和CaSKi细胞(EGFR+)(B)和A2058细胞(EGFR-)中EGFR靶向的细胞杀伤。A、B、C)在A431细胞(A)、CaSKi细胞(B)和A2058细胞(C)中的西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1滴定+固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素或10pM的西妥昔单抗-石竹素和对照。QSmix是来自皂皮树提取物的皂苷混合物。
图18：1-靶标2-组分概念：mAb1-SO1861+mAb1-蛋白质毒素。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)各自独立地与抗体(mAb1)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb1-SO1861和mAb1-蛋白质毒素与细胞表面受体结合，2)受体介导的两种缀合物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性以使得内溶酶体逃逸，4)毒素释放进入细胞质发生，5)毒素诱导细胞死亡。
图19：1-靶标2-组分概念：mAb1-SO1861+mAb2-BNA寡核苷酸。SO1861和反义BNA寡核苷酸各自独立地与抗体(mAb1)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb1-SO1861和mAb1-BNA寡核苷酸与细胞表面受体结合，2)受体介导的两种缀合物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性使得内溶酶体逃逸，4)BNA寡核苷酸释放进入细胞质发生和5)靶基因沉默。
图20：1-靶标2-组分概念：mAb1-(支架(-SO1861)n)n+mAb1-蛋白质毒素。树枝化基元(-SO1861)n和蛋白质毒素(核糖体失活蛋白)各自独立地与抗体(mAb1)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb1-树枝化基元(-SO1861)4和mAb1-蛋白质毒素与细胞表面受体结合，2)受体介导的两种缀合物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性使得内溶酶体逃逸,4)毒素释放到细胞质中发生和5)毒素诱导细胞死亡。
图21：抗体-(-L-SO1861)4与抗体-(-L-SO1861)2的对比。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR++)和SK-BR-3(HER2++)中的HER2和EGFR靶向的细胞杀伤。A)在A431细胞中的西妥昔单抗-(-L-SO1861)4+10pM的西妥昔单抗-皂草素与西妥昔单抗-(-L-SO1861)2+10pM的西妥昔单抗-皂草素的比较。B)在SK-BR-3细胞中的曲妥珠单抗-(-L-SO1861)4+50pM的曲妥珠单抗-皂草素与曲妥珠单抗-(-L-SO1861)2+50pM的曲妥珠单抗-皂草素的比较。
图22：抗体-(-L-SO1861)4与抗体-(-S-SO1861)4的对比。通过根据本发明的治疗性组合，在SK-BR-3(HER2++)中的HER2靶向的细胞杀伤。B)在SK-BR-3细胞中的曲妥珠单抗-(-L-SO1861)4+50pM的曲妥珠单抗-皂草素与曲妥珠单抗-(-S-SO1861)4+50pM的曲妥珠单抗-皂草素的比较。
图23.在A431荷瘤小鼠模型中测试的2T2组分系统显示肿瘤消退。
图24.在A431荷瘤小鼠模型中测试的2T2组分系统显示肿瘤消退和根除。
图25：2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR++/HER2+/-)(A、C)和CaSKi细胞(EGFR++/HER2+/-)(B、D)中的EGFR/HER2靶向的细胞杀伤。A、B)在A431细胞上的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7滴定+固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素和对照。C、D)在Caski细胞上的曲妥珠单抗-皂草素滴定+固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7和对照。A)和B)以及C)和D)的轴和图例相同。即，图25的A和B的图例展现在图25的B的旁边；图25的C和图25的D的图例展现在图25的D的旁边。
图26.2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在HeLa细胞(EGFR+/-/HER2+/-)(A、C)和A2058细胞(EGFR-/HER2+/-)(B、D)中的EGFR/HER2靶向的细胞杀伤。A、B)在HeLa细胞上的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7滴定+固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素和对照。C、D)在A2058细胞上的曲妥珠单抗-皂草素滴定+固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7和对照。A)和B)的轴和图例相同。即，图26的A和B的图例展现在在图26的B的旁边。
图27：2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在SKBR3细胞(HER2++/EGFR+/-)(A，B)中HER2/EGFR靶向的细胞杀伤。A)在SKBR3细胞上的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度的1.5pM EGF石竹素和对照。B)在SKBR3细胞上的EGF石竹素滴定+固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和对照。
图28.2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在JIMT-1细胞(HER2+/-EGFR+/-)(A、C)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++)(B、D)中的HER2/EGFR靶向的细胞杀伤。A、B)在JIMT-1细胞上的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度的1.5pM EGF石竹素和对照。C、D)在MDA-MB-468细胞上的EGF石竹素滴定+固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和对照。A)和B)以及C)和D)的轴和图例相同。即，图28的A和B的图例展现在图28的B的旁边；图28的C和图28的D的图例展现在图28的D的旁边。
图29：2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在SKBR3细胞(HER2++/EGFR+/-)(A、B)中HER2/EGFR靶向的细胞杀伤。A)在SKBR3细胞上的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度的10pM西妥昔单抗皂草素和对照。B)在SKBR3细胞上的西妥昔单抗-皂草素滴定+固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和对照。
图30.2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在JIMT-1细胞(HER2+/-EGFR+/-)(A、C)和MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++)(B、D)中的HER2/EGFR靶向的细胞杀伤。A、B)在JIMT-1细胞上的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4滴定+固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素和对照。C、D)在MDA-MB-468细胞上的西妥昔单抗-皂草素滴定+固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和对照。A)和B)以及C)和D)的轴和图例相同。即，图30的A和B的图例展现在图30的B的旁边；图30的C和图30的D的图例展现在图30的D的旁边。
图31：氯喹抑制2-目标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合+氯喹，在A431细胞(EGFR++/HER2+/-/CD71+)(A、B)、MDA-MB-468细胞(EGFR++/HER2-/CD71+)(C)或SK-BR-3(HER2++/EGFR+/-/CD71+)(D)中的EGFR/HER2、EGFR/CD71或HER2/CD71靶向的细胞杀伤。A)在A431细胞上的曲妥珠单抗-石竹素或曲妥珠单抗-皂草素滴定+固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+800nM的氯喹和对照。B)在A431细胞上的CD71mab-皂草素滴定+固定浓度的10.5nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+500nM的氯喹和对照。C)在MDA-MB-468细胞上的CD71mab-皂草素滴定+固定浓度的10.5nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+500nM的氯喹和对照。D)在SK-BR-3细胞上的CD71mab-皂草素滴定+固定浓度的5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+500nM的氯喹和对照。
图32：2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR++/HER2+/-)(A)和A2058细胞(EGFR-/HER2+/-)(B)中EGFR/HER2靶向的基因沉默。A)在A431细胞(A)和A2058细胞(B)上的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9滴定+固定浓度的100nM曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4和对照。C、D)在A431细胞(A)和A2058细胞(B)上的曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4滴定+固定浓度的77nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9和对照。A)和B)以及C)和D)的轴和图例相同。即，图32的A和B的图例展现在图32的B的旁边；图32的C和图32的D的图例展现在图32的D的旁边。
图33：2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在MDA-MB-468细胞(EGFR++/CD71+)(A)HeLa细胞(EGFR+/-/CD71+)、SK-BR-3细胞(HER2++/CD71+)(B)和JIMT-1细胞(HER2+/-/CD71+)中的EGFR/CD71或HER2/CD71靶向的细胞杀伤。A)在MDA-MB-468细胞上的西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9滴定+固定浓度的10pM CD71mab-皂草素和对照。B)A)在HeLa细胞上的西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9滴定+固定浓度的10pM CD71mab-皂草素和对照。C)在SK-BR-3细胞上的曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4滴定+固定浓度的10pM CD71mab-皂草素和对照。D)在JIMT-1细胞上的曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4滴定+固定浓度的10pM CD71mab-皂草素和对照。
图34.2-靶标2-组分与T-DM1的比对。可以用根据本发明的治疗性组合有效杀伤曲妥珠单抗-皂草素+75nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9杀伤A431细胞(EGFR++/HER2+/-)，但是T-DM1+75nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9的滴定在如此低的毒素浓度下无效。T-DM1是每个抗体携带～3.5个emtansine(DM1)毒素分子的曲妥珠单抗-emtansine
Figure BDA0003222616810000371
图35：对所有细胞系的对照处理。A-D)当曲妥珠单抗(A)、西妥昔单抗(B)、T-DM1、(C)游离毒素：皂草素和石竹素(D)或与非细胞结合IgG(D)偶联的皂草素用指定细胞系SK-BR-3、JIMT-1、MDA-MB-468、A431、CaSki、HeLa、A2058、BT-474处理的细胞活力。
图36.2-靶标2-组分。通过根据本发明的治疗性组合，在A431细胞(EGFR+++/HER2+/-)(A)和CaSKi细胞(EGFR++/HER2+/-)(B)和A2058细胞(EGFR-/HER2+/-)中的EGFR/CD71和EGFR/HER2靶向的细胞杀伤。A、B、C)在A431细胞(A)、CaSKi细胞(B)和A2058细胞(C)上的西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1滴定+固定浓度的10pM曲妥珠单抗-皂草素或10pM的CD71mab-皂草素和对照。QSmix是来自皂皮树提取物的皂苷混合物。图36的A和图36的B的图例展现在图36的B的旁边。
图37：2-靶标2-组分概念：mAb1-SO1861+mAb2-蛋白质毒素。SO1861和毒素(核糖体失活蛋白)各自分别与抗体(mAb)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb1-SO1861和mAb2-蛋白质毒素与其相应的细胞表面受体结合，2)受体介导的两种缀合物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性使得内溶酶体逃逸，4)毒素释放进入细胞质发生和5)毒素诱导细胞死亡。
图38：2-靶标2-组分概念：mAb1-SO1861+mAb2-BNA寡核苷酸。SO1861和反义BNA寡核苷酸各自分别与抗体(mAb)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb1-SO1861和mAb2-BNA寡核苷酸与其相应的细胞表面受体结合，2)两种缀合物受体介导的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性使得内溶酶体逃逸，4)BNA寡核苷酸释放进入细胞质发生和5)靶基因沉默。
图39：2-靶标2-组分概念：mAb1-(支架(-SO1861)n)n+mAb2-蛋白质毒素。树枝化基元(-SO1861)n和蛋白质毒素(核糖体失活蛋白)各自分别与抗体(mAb)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb1-(树枝化基元(-SO1861)4)1)和mAb2-蛋白质毒素与其相应的细胞表面受体缀合，2)受体介导的两种缀合物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变为有活性以使得内溶酶体逃逸，4)毒素释放到细胞质中发生，5)毒素诱导细胞死亡。
图40.肿瘤靶向的蛋白质毒素递送导致荷瘤小鼠的肿瘤体积减小和肿瘤生长抑制。A)与对照相比，A431荷瘤小鼠中西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2的剂量递增(腹膜内，i.p.)显示肿瘤体积减小。B、C)与对照相比，A431荷瘤小鼠中西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-石竹素)2在A431荷瘤小鼠中的剂量递增(腹膜内，i.p.(B)或静脉内，i.v.(C))显示肿瘤生长减少。
图41.荷瘤小鼠中肿瘤靶向的反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。与对照相比，A431荷瘤小鼠中的30mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8显示诱导有效的肿瘤靶向基因沉默。
图42.荷瘤小鼠中的肿瘤靶向的反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。与对照组相比，A431荷瘤小鼠中的30mg/kg的西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7显示诱导有效的肿瘤靶向基因沉默。
图43：根据本发明，癌细胞中的HER2或EGFR靶向的蛋白质毒素递送和细胞杀伤。A、B)在SK-BR-3细胞(HER2++)和MDA-MB-468细胞(HER2-)上的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-石竹素)1,7或曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-石竹素)1,7的处理和和对照。C、D)在A431细胞(EGFR++)和A2058细胞(EGFR-)上的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-石竹素)1,7或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-石竹素)1,7的处理和对照。图43的A和B具有相同的图例，在图43的B的旁边。图43的C和D具有相同的图例，在图43的D的旁边。
图44：根据本发明，癌细胞中EGFR靶向的反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。A、B)在A431细胞(EGFR++)和A2058细胞(EGFR-)上的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)1,7的处理和对照。图44的A和B具有相同的图例，在图44的B的旁边。
图45：根据本发明，癌细胞中HER2靶向的反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。在SK-BR-3细胞(HER2++)上的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5的处理和对照。
图46：根据本发明，癌细胞中EGFR靶向的反义BNA寡核苷酸递送和基因沉默。A、B)在A431细胞(EGFR++)和A2058细胞(EGFR-)上的西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子头-L-HSP27BNA)3,7的处理和对照。
图47：(S)n–(L)(E)概念：mAb-(SO1861)n(蛋白质毒素)n。在半胱氨酸残基(Cys)处的SO1861和在赖氨酸残基处的蛋白质毒素(核糖体失活蛋白)均与相同的抗体(mAb)偶联，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb-(Cys-L-SO1861)4(Lys-蛋白质毒素)2与其相应的细胞表面受体结合，2)受体介导的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当的浓度下，SO1861变得有活性以使得内溶酶体逃逸，4)毒素释放到细胞质中发生和5)毒素诱导细胞死亡。
图48：(S)n–(L)(E)概念：mAb-(SO1861)n(反义BNA寡核苷酸)n。半胱氨酸残基(Cys)上的SO1861和赖氨酸残基上的反义BNA寡核苷酸都与相同的抗体(mAb)偶联，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb-(Cys-SO1861)4(Lys-BNA寡核苷酸)2与其相应的细胞表面受体缀合，2)受体介导的两种偶联物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH值和适当的浓度下，SO1861变得有活性以使得内溶酶体逃逸，4)BNA寡核苷酸释放到细胞质中发生，5)诱导靶基因沉默。
图49：(S)n–(L)(E)概念：mAb-(SO1861-支架-反义BNA寡核苷酸)n。(SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸)n与抗体(mAb)缀合，用于递送和内化到靶细胞中。1)mAb-(SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸)4与其相应的细胞表面受体结合，2)受体介导的两种缀合物的内吞作用发生，3)在低内溶酶体pH和适当浓度下，SO1861变得有活性使得内溶酶体逃逸，4)BNA寡核苷酸释放到细胞质中发生，5)诱导靶基因沉默。
图50.抗体-SO1861缀合程序。显示的是植物来源皂苷SO1861的四个部分与抗体轻链中的四个半胱氨酸连接的连接反应。首先，IgG中的二硫键在暴露于TCEP(三(2-羧乙基)膦)的影响下被破坏；其次，将包含与其结合的化学连接子的皂苷SO1861与三氟乙酸一起添加，并且四个皂苷部分与IgG连接。为了生产可裂解的“即用型缀合物”的皂苷，SO1861的醛基与EMCH(ε-马来酰亚胺己酸酰肼)连接子反应。EMCH的酰肼基与SO1861的醛基形成酸可裂解的腙键。同时，EMCH连接子呈现具有硫醇(巯基)反应性的马来酰亚胺基团，因此可以与IgG的硫醇(即配体部分)缀合。因此，提供了本发明的内体逃逸增强缀合物，和/或提供了本发明的第一结合分子。
图51.SO1861-EMCH的合成。
图52.树枝化基元-(-L-SO1861)4的合成。
图53.树枝化基元-(-L-SO1861)8的合成。
图54.SO181-L-三功能连接子-L-HSP27BNA的合成。
图55.HSP27BNA-树枝化基元-(-L-SO1861)4的合成。
图56.树枝化基元(NEM)4的合成。
图57：具有用于皂苷连接的四个氨基和用于点击化学的叠氮化物基团的支架前体。
图58：皂苷与模型支架偶联的证据。插图显示了偶联皂苷的理论预期峰值和强度分布。通过LC-MS/ESI-MS获得的实验数据显示在m/z为758-760Da处的峰几乎完全相同，证明皂苷偶联成功。
图59：使用靶向的毒素石竹素-表皮生长因子(石竹素-EGF)的细胞毒性测定。未处理的细胞被归一化为1。多聚物结构(Pentrimer)对细胞活力没有影响，无论是在存在或不存在石竹素-EGF和皂苷(SA1641)的情况下，这表明多聚结构没有内在的细胞毒性。可点击的靶向毒素(石竹素-EGF-炔烃)的活性显著降低，这是毒素修饰的结果，但与支架没有任何关系。功能化的多聚结构与未点击的靶向毒素具有相同的活性，这表明支架的功能化不会损害效应分子的活性。在存在和不存在多聚结构地情况下，皂苷的作用是相同的，这表明多聚结构不会损害双组分体系中皂苷的功效。
图60：(A)SO1861和(B)SO1861-EMCH(EMCH＝N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼)的H-NMR谱。(A)9.43ppm(Ha)处的峰对应于SO1861的醛质子。(B)6.79ppm(Hc)处的峰对应于SO1861-EMCH的马来酰亚胺质子，而7.68ppm(Hb)处的峰对应于腙质子。在9.43ppm处没有信号表明醛基发生了定量转换。
图61：(A)SO1861-EMCH和(B)SO1861-EMCH-巯基乙醇的MALDI-TOF-MS谱。(A)RP模式：m/z为2124Da([M+K]+，皂苷-EMCH)，m/z为2109Da([M+K]+，SO1861-EMCH)，m/z为2094Da([M+Na]+，SO1861-EMCH)。(B)RP模式：m/z为2193Da([M+K]+，皂苷-EMCH-巯基乙醇)，m/z为2185Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)，m/z为2170Da([M+Na]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)。
图62：SO1861的结构具有突出的化学基团，用于将增强内体逃逸的皂苷缀合为多聚结构。突出显示的基团是醛(黑色圆圈)、羧酸(虚线圆圈)、烯烃(虚线五边形)和醇(虚线框)。醛基(箭头)是最适合化学选择性和可逆缀合反应的基团。
图63：产生(A)稳定和(B)可裂解的“即用型缀合物”内体逃逸增强剂皂苷的策略。
图64：SO1861-EMCH腙键在酸性条件下的水解。
图65：SO1861-EMCH的结构。(A)标准分子结构，和(B)3D模型。马来酰亚胺基团用圆圈标记。
图66：(A)SO1861-EMCH的合成方案。(B)SO1861(m/z为1861Da)和(C)SO1861-EMCH(m/z为2068Da)在负反射模式下的MALDI-TOF-MS谱。TFA：三氟乙酸，r.t：室温，h：小时和MW：分子量。
图67：SO1861-EMCH在pH3的HCl溶液中水解(A)前和(B)后的MALDI-TOF-MS谱。
图68：SO1861-EMCH与任何含胺聚合物结构缀合的反应方案。
图69：(A)BSA-SO1861(m/z为70.0kDa、72.1kDa、74.2kDa)和(B)BSA(m/z为66.6kDa)的MALDI-TOF-MS谱。
图70:(A)SO1861-EMCH和(B)SO1861-HATU(HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯)与花菁3染料标记的聚酰胺胺(PAMAM)G5树枝状大分子缀合。
图71：(A)Cy3-PAMAM、(B-D)Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱，从(B)上到底部(D)随着SO1861-EMCH进料当量增加。(B)对应于Cy3-PAMAM-SO1861，其中每个PAMAM连接有5个SO1861，(C)对应于Cy3-PAMAM-SO1861，其中每个PAMAM连接有13个SO1861，和(D)对应于Cy3-PAMAM-SO1861，每个连接有51个SO1861。
图72：(A)具有5当量进料SO1861-EMCH的Cy3-PAMAM-SO1861和(B)具有30当量进料SO1861-EMCH的Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱。
图73：Cy3-PAMAM-NC-SO1861(NC＝稳定键(“不可裂解的”))的MALDI-TOF-MS谱。
图74:(A)反应方案以及(B)Cy3-PAMAM-NC-SO1861-二苯并环辛炔(DBCO)、(C)Cy3-PAMAM-(SO1861)5-DBCO和(D)Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO的MALDI-TOF-MS谱。
图75：(A)石竹素-EGF-Alexa488和(B)石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3的反应方案。(C)石竹素-EGF、(D)石竹素-EGF-Alexa488和(E)石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3；Alexa488：Alexa Fluor 488染料的MALDI-TOF-MS谱。
图76：(A)石竹素-Alexa488和(B)石竹素-Alexa488-SS-PEG-N3的反应方案。(C)石竹素、(D)石竹素-Alexa488和(E)石竹素-Alexa488-SS-PEG-N3；Alexa488：Alexa Fluor488染料的MALDI-TOF-MS谱。
图77：在VersaDoc成像系统上进行的SDS-PAGE凝胶的荧光图像。M＝标志物，P＝Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO，D＝石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3，C1＝Cy3-PAMAM-(SO1861)5-石竹素-EGF-Alexa488，C2＝Cy3-PAMAM-NC-SO1861-石竹素-EGF-Alexa488，和C3＝Cy3-PAMAM-(SO1861)27-石竹素-EGF-Alexa488。
图78：(A)Cy3-PAMAM-NC-SO1861通过还原胺化的合成方案。(B和C)各自的MALDI-TOF-MS谱。
图79：使用SO1861-EMCH作为单体、APS/TMEDA系统作为聚合引发剂和氨基丙硫醇作为自由基猝灭剂生成聚(SO1861)的反应方案。
图80：聚(SO1861)反应批次的MALDI-TOF-MS谱。(A)在60℃的SO1861-EMCH，(B)在60℃的SO1861-EMCH+11-3当量的APS，(C)在60℃的SO1861-EMCH+11-3当量的APS/TMEDA。
图81：DNA方法。利用DNA折纸原理生成能够缀合和释放糖苷分子的基于DNA的支架。此外，其中一条DNA链获得点击化学部分，其可以被用于与靶向的毒素缀合以形成功能化支架。bp：碱基对。
图82：聚(肽-SO1861)方法。使用可以缀合和释放糖苷分子并且可以与自身反应形成聚(肽-SO1861)构建体的肽序列。多(肽)链末端可以用可以被用于与毒素缀合的点击化学部分(例如，BCN-NHS连接子)进一步修饰。
图83.(A)天然肽、(B)肽-SO1861缀合物的MALDI-TOF-MS谱。
图84.氨基受保护的G4-树枝化基元的分子结构。
图85.生成基于树枝化基元的支架和功能支架的合成方案。
图86.(A)G4-树枝化基元部分染料标记和脱保护的反应方案。(B)脱保护和部分染料标记的G4-树枝化基元的MALDI-TOF-MS谱。
图87.具有(A)22个进料当量的SO1861-EMCH，(B)10个进料当量的SO1861-EMCH，以及(C)3个进料当量的SO1861-EMCH的G4-树枝化基元-SO1861支架的MALDI-TOF-MS谱。
图88.用(A)如通过HeLa细胞的FACS分析(B，参见表19)所确定的EGFR细胞表面表达处理的HeLa细胞的细胞活力曲线，用SO1861+石竹素-EGF(Dia-EGF)、SO1861+石竹素-EGF+500nM的氯喹、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM、SO1861+石竹素-EGF+667nM的树枝化基元处理的HeLa细胞的细胞活力，(C)用SO1861+石竹素-EFG、SO1861+石竹素-EGF+500nM的氯喹、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM-(SH)16、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM-(SH)65、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM-(SH)108处理的HeLa细胞的细胞活力，(D)用SO1861+石竹素-EGF、SO1861+石竹素-EGF+500nM的氯喹、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM-(mPEG)3、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM-(mPEG)8、SO1861+石竹素-EGF+500nM的PAMAM-(mPEG)18处理的HeLa细胞的细胞活力。
图89.(A)使用硫醇化试剂2-亚氨基硫醇对PAMAM进行硫醇化的反应方案。(B)天然PAMAM、(C)硫醇化的PAMAM-(SH)16、(D)硫醇化的PAMAM-(SH)65和(E)硫醇化的PAMAM-(SH)108的MALDI-TOF-MS谱。
图90.(A)使用PEG化试剂mPEG2k-NHS对PAMAM进行PEG化的反应方案。(B)天然PAMAM、(C)PEG化的PAMAM-(mPEG2k)3、(D)PEG化的PAMAM-(mPEG2k)8和(E)PEG化的PAMAM-(mPEG2k)18的MALDI-TOF-MS谱。
图91：具有连接任何所期望的效应分子的点击化学功能的基本支架。用户确定点击化学位置在效应分子中的位置以及效应分子的所有其他性质，例如，任选配体的选择和位置。
图92：具有连接任何所期望的配体的预先结合的效应分子和点击化学功能的功能化支架。任选地，可以提供pH敏感连接以在到达内体后从支架释放效应分子。
发明详述
为了使生物活性分子发挥作用，该分子必须能够与其靶标结合，例如在血清中，在细胞表面的外部或细胞或细胞器的内部。例如，几乎所有基于蛋白质的靶向毒素的活性部分都必须进入靶细胞的细胞质以介导其靶标调节作用。在许多情况下，毒素仍然无效，因为(1)靶向部分内化能力差并保持与细胞外部的结合，(2)内化后循环回到细胞表面或(3)转运到内溶酶体中退化。尽管这些基本问题几十年来已为人所知，并且在过去的几十年中已经研究了多于500种的靶向毒素，但这些问题仍未得到解决，并且迄今为止，只有一种抗体靶向蛋白质毒素莫西妥单抗pasudotox-tdfk(
Figure BDA0003222616810000451
AstraZenecaPharmaceuticals LP)已被FDA批准用于治疗复发性或难治性毛细胞白血病。
为了克服这些问题，已经描述了许多策略，其包括将毒素重定向到内质网中生物合成途径的内源性细胞膜转运复合物的方法，以及破坏或削弱内(即细胞内吞途径的隔室)体膜完整性的技术，从而促进内体逃逸。这包括使用溶酶体胺，羧酸离子载体，钙通道拮抗剂，病毒、细菌、植物、动物、人类和合成来源的各种细胞穿透肽、其他有机分子和光诱导技术。尽管靶向毒素的功效通常在细胞培养中增加了成百或上千倍，在特殊情况下超过百万倍，但需要将内体逃逸增强剂与其他物质共同施用会带来新的问题，包括额外的副作用、损失靶标特异性、确定治疗窗口的困难和细胞类型依赖性变化。
所有策略(包括物理化学技术)都需要或多或少直接与膜相互作用的增强剂分子，并且基本上包括小化学分子、次级代谢物、肽和蛋白质。所有这些物质的共同特征是，它们本身不是靶向特定细胞的，而是以不同于靶毒素的其他动力学分布。这是当前方法的主要缺点之一。
将关于具体实施方案描述本发明，但本发明不限于此而仅由权利要求书限制。除非另有说明，本文所描述的本发明的实施方案可以组合和协作操作。
虽然已经根据几个实施方案描述了本发明，但是可以预期，在阅读说明书和研究附图和图表后，本领域普通技术人员将明白其替代、修改、置换和等价物。本发明不以任何方式限于图示的实施方案。在不脱离由所附权利要求限定的范围的情况下可以进行改变。
本发明的一个方面涉及包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点的第一蛋白质分子，所述第一蛋白质分子具有通过至少一个连接子和/或通过寡聚或多聚支架与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合或直接与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合的至少一个皂苷。因此，本发明涉及提供缀合物，所述缀合物包含第一蛋白质分子或由其组成，所述第一蛋白质分子包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点，其中至少一个皂苷通过至少一个连接子与第一蛋白质分子共价结合和/或通过寡聚或多聚支架与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基结合，或与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基直接共价结合。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述第一结合位点包含以下或由以下组成：诸如抗体、IgG、包含Vhh结构域或Vh结构域的分子或由Vhh结构域或Vh结构域组成的分子、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段的免疫球蛋白、或免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，和/或包含与细胞表面分子结合的至少一种配体，如EGF或细胞因子。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述第一细胞表面分子的第一表位是第一肿瘤细胞表面分子的肿瘤细胞特异性第一表位，更优选特异性存在于肿瘤细胞的第一肿瘤细胞表面受体的肿瘤细胞特异性第一表位。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述至少一种皂苷是三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团，和/或分离自霞草属(Gypsophila)物种和/或皂属(Saponaria)物种和/或麦仙翁属(Agrostemma)物种和/或皂树属(Quillaja)物种例如皂皮树(Quillaja saponaria)的皂苷。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是单一特定皂苷或者是两种或更多种不同皂苷的混合物，诸如以下中的一种或多种：表A1或方案1中的皂苷、SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、皂素集(Saponinum album)、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、或它们的立体异构体中的任一种和/或它们的任意组合，优选皂苷是SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21和/或具有皂皮酸糖苷核、在C-3β-OH基团处的Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA碳水化合物取代基和在C-28-OH基团处的Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc碳水化合物取代基的皂苷，和/或是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖醛基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃喹啉基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选所述皂苷是SO1861和/或QS-21。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是双糖链皂苷，其具有至少1,500道尔顿的分子量并且包含含有在C-23位置处的醛基以及任选在C-16位置处的羟基的齐墩果型三萜，具有在C-3位置处的第一支链碳水化合物侧链，所述第一支链碳水化合物侧链任选含有葡糖醛酸，其中所述皂苷含有酯基和在C-28位置处的第二支链碳水化合物侧链，所述第二支链碳水化合物链优选包含至少四个碳水化合物单元，其任选地含有至少一个乙酰基残基(如两个乙酰基残基)，和/或任选地包含脱氧碳水化合物和/或任选包含异鼠李糖和/或任选包含葡萄糖和/或任选包含4-甲氧基肉桂酸和/或任选包含5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸和/或任选包含通过酯键与碳水化合物结合的5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基辛酸，或其中所述至少一个皂苷是QS-21或以下中的任一种或多种：QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS-18、QS1861、质子化QS1861(QS1862)、Quil-A
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，其中所述至少一个皂苷通过所述皂苷中的醛官能团，优选地位置C-23中的所述醛官能团，优选地通过至少一个连接子，更优选地通过至少一个可裂解的连接子与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价偶联，其中所述氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷并且包含在所述皂苷的C-3β-OH基团处碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团，其中所述至少一个皂苷通过在所述皂苷的C-3β-OH基团处碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团，优选通过至少一个连接子，与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价偶联，其中所述氨基酸残基优选选自半胱氨酸和赖氨酸。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷的位置C-23中的醛官能团与连接子N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼共价偶联，所述连接子通过硫醚键与所述第一蛋白质分子中的巯基(如半胱氨酸的巯基)共价偶联。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中在所述至少一个皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团与连接子1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯共价偶联，所述连接子通过酰胺键与所述第一蛋白质分子中的胺基团(如赖氨酸的胺基团或所述第一蛋白质分子的N-末端)共价偶联。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点结合的所述第一细胞表面分子的第一表位是所述肿瘤细胞特异性受体的肿瘤细胞特异性第一表位，所述肿瘤细胞特异性受体优选选自：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、血管整合素α-V、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，更优选选自：CD71、EGFR、HER2。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述肿瘤细胞特异性第一表位、第一肿瘤细胞表面分子或第一肿瘤细胞特异性受体是在权利要求1-11中任一项所述的第一蛋白质分子与所述第一表位或所述第一分子或所述第一受体结合后被所述肿瘤细胞内化的第一表位或第一分子或第一受体，并且其中优选地，当所述第一蛋白质分子与包含所述第一表位的细胞表面分子、肿瘤细胞表面分子或肿瘤细胞特异性受体结合时，经受肿瘤细胞受体介导的内化(例如通过内吞作用)，或肿瘤细胞表面分子介导的内化(例如通过内吞作用)。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点包含以下中的任一种或由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，优选它们的至少一种肿瘤细胞特异性受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞特异性受体结合域。
本发明的一个方面涉及治疗性组合，其中其中所述治疗性组合包含：(a)包含本发明所述的第一蛋白质分子和任选的药学上可接受的赋形剂的第一药物组合物；和(b)包含不同于所述第一蛋白质分子的第二蛋白质分子的第二药物组合物，所述第二蛋白质分子包含用于结合不同于所述第一细胞表面分子的第二细胞表面分子的第二表位的第二结合位点，并且包含效应子部分，所述第二药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂，其中所述第二表位不同于所述第一表位。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：(a)本发明所述的第一药物组合物，其包含本发明所述的第一蛋白质分子，其中所述第一细胞表面分子上的所述第一表位是第一肿瘤细胞特异性表面分子上的肿瘤细胞特异性第一表位，优选地特异性存在于肿瘤细胞的第一细胞表面受体上的肿瘤细胞特异性第一表位；和(b)本发明所述的第二药物组合物，其中所述第二细胞表面分子是不同于所述第一肿瘤细胞特异性表面分子的第二肿瘤细胞特异性表面分子，优选地特异性存在于肿瘤细胞的第二细胞表面受体不同于特异性存在于所述肿瘤细胞的所述第一细胞表面受体，并且其中所述第二表位是肿瘤细胞特异性的第二表位。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：(a)本发明所述的第一药物组合物，其包含本发明所述的第一蛋白质分子并且包含用于结合所述第一细胞表面分子上的所述第一表位的所述第一结合位点，所述第一药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂；和(b)包含第三蛋白质分子的第三药物组合物，所述第三蛋白质分子包含用于结合(a)的细胞表面分子上的所述第一表位的所述第一结合位点和效应子部分，所述第三药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点和所述第三蛋白质分子的第一结合位点相同，并且其中所述第一蛋白质分子可以结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的第一表位与所述第三蛋白质分子可以结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的第一表位相同。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：(a)本发明所述的第一药物组合物；和(b)本发明所述的第三药物组合物，其中所述第一细胞表面分子在肿瘤细胞表面上表达，并且优选地所述第一细胞表面分子是肿瘤细胞特异性表面分子，并且其中优选地所述第一表位是第一肿瘤细胞特异性表位。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子或本发明的治疗性组合，其中用于结合所述第一细胞表面分子上的所述第一表位的所述第一结合位点是特异性存在于肿瘤细胞的第一细胞表面受体上的肿瘤细胞特异性第一表位的结合位点。
本发明的发明人抗体药物缀合物(如本发明的第二或第三药物组合物中的第二或第三蛋白质分子)当被施用于还被施用了第一药物组合物的荷瘤哺乳动物(小鼠)时治疗性窗口分别增加。第一蛋白质分子具有与其结合，优选共价，更优选通过可裂解的连接子与其结合的至少一个糖苷(如皂苷)。皂苷像通过增强效应子部分的内体逃逸到其中所期望效应子部分的活性的细胞质中增强了与第二和第三蛋白质分子结合的效应子部分的功效。这种方式已经在比常规剂量的ADC(即第二或第三蛋白质分子)更低的剂量时，在靶细胞附近、在靶细胞处和/或内部，在受包含皂苷的第一蛋白质分子存在的影响下建立了治疗效果。靶细胞例如为患病细胞(如肿瘤细胞)或自身免疫性细胞或B细胞疾病相关B细胞等。效应子部分例如为作为根据本发明ADC的一部分的毒素或作为根据本发明AOC的一部分的寡核苷酸(BNA)。
一实施方案是本发明的治疗性组合，其中所述第二蛋白质分子的第二结合位点和/或所述第三蛋白质分子的第一结合位点包含以下或由以下组成：诸如抗体、IgG、包含Vhh结构域或Vh结构域的分子或由Vhh结构域或Vh结构域组成的分子、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段的免疫球蛋白、或免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，和/或包含与细胞表面分子结合的至少一种配体，如EGF或细胞因子。
一实施方案是包含第二药物组合物的本发明的治疗性组合，其中用于结合所述第二表位的所述第二蛋白质分子的第二结合位点是特异性存在于所述肿瘤细胞的第二细胞表面受体上的肿瘤细胞特异性第二表位的第二结合位点，其中所述第二结合位点不同于所述第一结合位点。
通过用第一和第二蛋白质分子靶向(两种)不同的细胞表面分子，与在不存在细胞靶向的皂苷(第一蛋白质分子)的情况下，此类暴露于仅第二蛋白质分子(如ADC或AOC)相比，皂苷和效应子部分在暴露于细胞表面上的两种不同细胞表面分子的非常相同靶细胞的细胞质处和内部的递送得到改善且更具有特异性。当考虑患者的(相邻)健康细胞时，通过第一蛋白质分子的结合位点和第二蛋白质分子的结合位点选择用于分离靶向的异常细胞，其中结合位点不同并且其中第一和第二蛋白质分子结合的表位(如两种不同的受体，理想地分别具有在第一细胞表面分子和第二细胞表面分子上的第一表位和第二表位)不同并且位于不同种类和类型的细胞表面分子中或其上至高的程度(即比在非靶向细胞(如例如健康细胞)上的表达更高的在靶向细胞(如例如肿瘤细胞或自身免疫细胞)上的两种有区别的和不同的细胞表面分子的表达)，和/或将第一和第二细胞表面分子特异性暴露。优选地，与健康细胞相比，第一和第二结合位点靶向的两种细胞表面分子是相对高和/或特异性表达在靶向的(患病的，肿瘤)细胞上的。一实施方案是药物组合物，其中当与健康(相邻)细胞表面上的第一细胞表面分子和/或第二细胞表面分子的表达相比，第一和第二结合位点中的至少一种和因此第一和第二细胞表面分子(如第一和第二肿瘤细胞受体)中的至少一种特异性表达或相对更高程度的表达。因此，第一表位或第二表位，优选靶向的细胞表面分子上的第一表位和第二表位对靶向的患病细胞是理想独特的，并且至少是特异性存在和暴露于靶向的细胞表面的。第一和第二蛋白质分子与靶向的细胞上的它们各自的第一和第二表位结合后通过第一蛋白质分子和第一靶细胞表面分子和第二蛋白质分子和第二靶细胞表面分子的复合物内吞。当与不应靶向的健康细胞相比时，由于第一和第二蛋白质分子必须通过与两者都在靶向的细胞上表达至足够的程度或独特地表达的两种不同的细胞表面分子结合相互作用而进入相同的靶细胞，如果两种有区别的靶向的细胞表面分子均在一定的最小表达阈值之上，治疗有效量的第一和第二蛋白质分子在靶细胞内的累积是仅可能和会发生的。同时，事实是与第二蛋白质分子结合的效应子部分仅能够在具有共价结合的皂苷的第一蛋白质分子存在下发挥它的细胞内活性(例如细胞毒性或基因沉默)，当第一和第二蛋白质分子均能够通过与充分暴露且表达的第一和第二细胞表面分子结合以足够的量进入靶细胞时，当第一和第二细胞表面分子中的至少一种在健康细胞足够低的表达时，优选当第一和第二靶向的细胞表面分子两者在健康细胞足够低的表达时，也提供了朝向不是效应子部分靶向和影响的健康细胞和健康组织的效应子部分针对阴性和不期望的副作用的保护。即，关于第一和第二细胞表面分子，足够低的表达或甚至不存在暴露的第一和第二细胞表面分子的情况下，以及第一和第二蛋白质分子的第一和第二结合位点分别结合的至少第一细胞表面分子或第二细胞表面分子没有理想地允许第一和第二蛋白质分子两者进入(非靶向的)健康细胞至在概念上将导致在与第一蛋白质分子结合的皂苷的影响下效应子部分的内体逃逸的量。与当第一蛋白质分子没有被加入到治疗性方案相比，由于ADC或AOC可以被以较低的剂量使用，考虑当例如靶向并杀死靶标患病细胞(如肿瘤细胞和自身免疫细胞)以低的程度具有较低风险的发生不期望的副作用进入健康细胞的ADC或AOC。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子或包含第二药物组合物的本发明治疗性组合，其中所述第一和第二蛋白质分子分别包含第一和第二结合位点，其用于分别结合在第一和第二肿瘤细胞特异性受体上的第一和第二肿瘤细胞特异性表位，所述受体不同并且存在于同一肿瘤细胞，其中第一和第二结合位点不同，并且第一和第二肿瘤细胞特异性表位不同。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子或包含第三药物组合物的本发明治疗性组合，其中所述第一和第三蛋白质分子分子包含相同的第一结合位点，其用于结合第一肿瘤细胞特异性受体上的第一肿瘤细胞特异性表位。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子或包含第二药物组合物的本发明治疗性组合，其中所述第一受体和/或第二受体选自：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、血管整合素αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，优选选自：CD71、EGFR、HER2。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子或包含第二药物组合物的本发明治疗性组合，其中所述第一和第二肿瘤细胞特异性受体在与本发明的第一蛋白质分结合后和/或当所述治疗性组合包含第二药物组合物时在与本发明的第二蛋白质分子结合后被所述肿瘤细胞内化，并且其中优选所述第一蛋白质分子和/或所述第二蛋白质分子分别与所述第一和第二肿瘤细胞特异性受体的结合导致所述第一蛋白质分子和所述第一肿瘤细胞特异性受体的复合物以及所述第二蛋白质分子和所述第二肿瘤细胞特异性受体的复合物的肿瘤细胞受体介导的内化(例如通过内吞作用)。
一实施方案是包含本发明的第三药物或根据本发明的第一药物组合物的治疗性组合，其中第一肿瘤细胞受体，优选第一肿瘤细胞特异性受体，在与本发明的第一蛋白质分子结合后和/或与本发明的第三蛋白质分子结合后被肿瘤细胞结合后被肿瘤细胞内化，并且其中优选地，所述第一蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子与所述第一肿瘤细胞受体(诸如所述第一肿瘤细胞特异性受体)的结合之后是所述第一蛋白质分子和第所述第一肿瘤细胞受体的复合物以及所述第三蛋白质分子和所述第一肿瘤细胞受体的复合物的肿瘤细胞受体介导的内化(例如通过内吞作用)。
同步是成功的小鼠递送策略与其在人类中的应用之间缺失的环节。事实上，本发明的发明人在一系列体内小鼠肿瘤模型中建立，与未用ADC和游离皂苷处理的对照动物相比，分别向小鼠施用一定剂量的游离皂苷和一定剂量的ADC(根据本发明的第二或第三蛋白质分子)没有产生任何所期望的抗肿瘤作用(如肿瘤生长延迟、肿瘤消退、减小和肿瘤生长减慢)。与施用ADC的时刻(施用ADC之前、期间和之后施用游离皂苷)相比，使用各种施用途径和使用施用游离皂苷的不同时间点施用游离皂苷。在体内肿瘤模型中测试的ADC是西妥昔单抗-石竹素(含游离SO1861)或曲妥珠单抗-皂草素(含游离SO1861)。改变游离皂苷的剂量并不能提供有效的抗肿瘤活性。所提及的ADC的施用剂量本身不会对荷瘤动物产生任何有益的抗肿瘤作用。令人惊讶的是，本发明的本发明人现在确定，通过用根据本发明的缀合物处理动物，可以实现在各种体外基于哺乳动物细胞的生物测定和/或各种体内动物肿瘤模型中的有益抗肿瘤活性，所述缀合物任选地包含根据本发明的支架，即本发明的第一和第二或第一和第三蛋白质分子的组合。例如，支架是三功能连接子，其通过可裂解或不可裂解的键共价结合皂苷(例如SO1861、QS-21)和/或通过不可裂解的键或可裂解的键共价结合效应子部分(例如石竹素、沉默BNA(HSP27))，和/或共价结合单克隆抗体(如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、OKT-9)，或支架为树枝化基元，诸如例如四个部分(如四个皂苷分子)可以结合的树枝化基元，或用于结合例如两个皂苷和两个效应分子的树枝化基元，所述树枝化基元包含用于(共价)偶联至配体或抗体或其片段或结构域的化学基团。参考实施例部分，举例说明根据本发明的这些支架中的各种，当考虑由例如蛋白质毒素施加的细胞毒性或当考虑肿瘤细胞中的基因沉默时，显示体内和/或体外抗肿瘤细胞活性。
不希望受任何理论的束缚，鉴于考虑用ADC和游离皂苷处理荷瘤动物时观察到的失败，优选同时存在至少一个皂苷和靶细胞(例如肿瘤细胞或自身免疫细胞)内吞途径的隔室或囊泡中的效应子部分(优选毒素或寡核苷酸)。根据本发明发明人的尝试，对于ADC和游离皂苷，同步晚期内体中分子的存在以在体内获得协同效应并不是有益地获得的。在一个方面，本发明优选至少解决以下关于将第二蛋白质分子所包含的效应子部分与第一蛋白质分子所包含的皂苷组合的问题：不希望受任何理论束缚，其中例如内体逃逸活性需要可用于(共价)、特别是单一和可裂解、可保留偶联的皂苷内的唯一合理的化学基团。除了皂苷在疫苗接种方案中的应用之外，已知的限制很可能是在临床研究中为什么未将皂苷与药物活性物质联合使用，其中暗示使用免疫增强佐剂物质，尽管例如表A1和方案I中列出的皂苷的显著的内体逃逸增强剂作用已知超过10年。例如，提供具有共价缀合支架的本发明的第一蛋白质分子至少部分地解决了这些困难。令人惊讶的是，先前在涉及皂苷作为佐剂组分的疫苗接种环境中应用其免疫增强活性的皂苷，现在也适用于(共价)偶联本发明的第一蛋白质分子，用于体外和体内抗肿瘤活性。
可用于本发明的效应子部分优选依赖晚期内体逃逸来发挥其作用。一些效应子(如例如假单胞菌外毒素)在“晚期内体阶段”之前被改道到其他细胞器，因此通常不会受益于与根据本发明的第二蛋白质分子的偶联。然而，此类毒素可适用于本发明，例如，通过删除负责重新路由的信号肽。特别是毒性很强并且只需要一个分子就可以逃离内体以杀死细胞的毒素可能会被修饰为不太有效。如果至少2个，更优选至少5个，更优选至少10个，更优选至少20个，更优选至少50个，最优选至少100个毒素分子逃离内体，则优选使用杀伤细胞的毒素.进一步优选的是，本发明的第二蛋白质分子包含共价缀合的官能化支架，即包含共价结合的效应子部分的支架，用于将包含结合的效应子部分的支架靶向靶细胞(如肿瘤细胞或自身免疫细胞)。此外，为了降低脱靶毒性，细胞膜不可渗透性小分子毒素是优于细胞膜可渗透性毒素的优选效应分子。
本发明中使用的术语“配体”具有其一般含义，并且优选地意指能够结合靶细胞细胞表面上的另一分子或结构的分子或结构，其中所述细胞表面上的分子或结构可以是内吞的并且优选在脱靶细胞上不存在或不那么突出。优选地，细胞表面上的所述分子或结构被组成性内吞。更优选地，本发明中的配体在与所述分子或结构结合后诱导在靶细胞的细胞表面上的所述分子或结构的内吞作用。例如，存在于多种癌细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)就是这种情况。组成性内吞的靶细胞细胞表面上的分子或结构的实例是例如密封蛋白-1或主要组织相容性复合体II类糖蛋白。配体可以是例如抗体、生长因子或细胞因子。在载体分子中将毒素与配体组合是产生靶向毒素的一种可能性。仅在靶细胞中有毒的毒素，因为它仅干扰靶细胞中发生的过程，也可以被视为靶向毒素(因为在脱靶细胞中，它不能发挥其毒性作用，例如凋亡素)。优选地，靶向毒素是与配体或例如单克隆抗体组合的毒素，以便在靶细胞中而不是在脱靶细胞中有活性(因为它只与靶细胞结合并被其内吞)。在包含载体分子的功能化支架中，所述载体分子包含配体和效应子部分(即第二或第三蛋白质分子)，配体或单克隆抗体将效应子部分和支架引导至靶细胞。内化后，至少一种糖苷，优选由第一蛋白质分子和皂苷的缀合物所包含的皂苷，介导效应子部分的内体逃逸。皂苷通常为表A1和方案I中所列出的皂苷，并且优选皂苷为SO1861和/或QS-21，和/或SA1641和/或GE1741。
优选地，当被内吞时，与第二或第三蛋白质分子结合的效应子部分与第二或第三蛋白质分子例如从第二或第三蛋白质分子(例如抗体)分离，所述效应子部分通过与第一蛋白质分子结合的皂苷增强。这可以通过断裂的可裂解键来实现，例如在酸性、还原性、酶促或光诱导条件下。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子和/或包含第二药物组合物的本发明的治疗性组合，其中第一结合位点和/或第二结合位点是或包含单克隆抗体或其至少一种细胞表面分子结合片段和/或结构域，并且优选地包含以下中的任一种或由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、和表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种细胞表面分子结合片段或结构域，条件是所述第一蛋白质分子的所述第一结合位点与所述第二蛋白质分子的所述第二结合位点不同。
一个实施方案是包含本发明的第三药物组合物或根据本发明的第一药物组合物的治疗性组合，当包含在包含第三药物组合物的治疗性组合中时，其中所述第一蛋白质分子和所述第三蛋白质分子的所述第一结合位点包含单克隆抗体或其细胞表面分子结合结构域和/或片段中的至少一种，并且优选地包括以下中的任一种或者由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种细胞表面分子结合片段或结构域，条件是所述第一蛋白质分子的所述第一结合位点与所述第三蛋白质分子的所述第一结合位点相同。
一个实施方案是包含本发明的第二或第三药物组合物的治疗性组合，其中第二蛋白质分子的第二结合位点和/或第三蛋白质分子的第一结合位点是或包含单克隆抗体或其至少一种细胞表面分子结合片段或其结构域，并且优选地包括以下中的任一种或由以下中的任一种组成：吉妥珠单抗ozogamicin、本妥昔单抗vedotin、曲妥珠单抗emtansine、奥英妥珠单抗ozogamicin、莫西妥单抗pasudotox和波妥珠单抗vedotin以及表A2和表A3的抗体-药物缀合物。
本发明的发明人确定此类免疫球蛋白、其结构域、配体等特别适合用作包含第一结合位点的第一蛋白质分子的第一结合位点(以及第三蛋白质分子的相同结合位点)。类似地，本发明的发明人确定此类免疫球蛋白、其结构域、配体等特别适合用作包含第二结合位点的第二蛋白质分子的第二结合位点。例如，抗体和抗体的结合结构域适用于靶向选定细胞表面分子的暴露表面上的表位，这导致将第一和第三(和分别为第二)蛋白质分子靶向表达由第一和第三蛋白质分子靶向的细胞表面分子的靶细胞和/或还靶向表达由第二蛋白质分子靶向的第二细胞表面分子的细胞，这些细胞还表达第一和第三细胞表面分子(这是相同的细胞表面分子)，并且在它们的细胞表面上具有所述细胞表面分子。类似地，靶向靶细胞上的EGFR的配体(如EGF)适合用作第一和第三蛋白质分子中的结合位点，或用作第二蛋白质分子中的第二结合位点，条件是第二结合位点不同于第一和第三结合位点，其中第一和第三结合位点相同。优选的是第一和第三表位或第二表位的结合位点，它们特异性针对第一和第三蛋白质分子与第一细胞表面分子的结合和/或第二蛋白质分子与第二细胞表面分子的结合，第一和第二细胞表面分子暴露在同一靶细胞上。例如，基于抗体或其结构域或结合片段的结合位点为所选定细胞的所选定的第一或第二细胞表面分子上的所选第一、第二、第三表位提供此类所期望的特异性，用于靶向诸如患病细胞、肿瘤细胞、自身免疫细胞等。因此，第一、第二和第三蛋白质分子优选基于抗体或结合分子(片段、结构域)的第一、第二和第三结合位点。
通过用第一和第三蛋白质分子靶向相同的细胞表面分子，皂苷和效应子部分在相同靶细胞的细胞胞质处和内部的递送得到改善且更具特异性。当考虑患者的(相邻)健康细胞时，通过第一和第三蛋白质分子的结合位点选择用于靶向的异常细胞理想地高度和/或特异性地具有细胞表面分子。因此，靶向的细胞表面分子上的表位理想地是靶向的患病细胞所独有的，并且至少特异地存在并暴露于靶向的细胞表面。第一和第三蛋白质分子的结合之后是第一蛋白质分子和靶细胞表面分子的复合物以及第三蛋白质分子和靶细胞表面分子的复合物的内吞作用。由于第一和第三蛋白质分子必须通过与非常相同的细胞表面分子的结合相互作用进入相同的靶细胞，因此只有在靶向的细胞表面分子的表达水平高于某个最小表达阈值时，靶细胞内的第一和第三蛋白质分子的治疗活性量的累积才有可能并发生。同时，事实是与第三蛋白质分子结合的效应子部分仅在具有共价结合皂苷的第一蛋白质分子存在时才能够发挥其细胞内(例如细胞毒性或基因沉默)活性，当第一和第三蛋白质分子均能够通过与充分暴露且表达的表面分子结合以足够的量进入靶细胞时，当靶向的细胞表面分子在健康细胞处足够低的表达时，也提供了朝向例如不是效应子部分靶向和影响的健康细胞和健康组织的效应子部分针对阴性和不期望的副作用的保护。即，由第一和第三蛋白质分子的结合位点结合的细胞表面分子的低表达不允许第一和第三蛋白质分子同时进入一致导致在与第一蛋白质分子结合的皂苷的影响下，效应子部分内体逃逸的量。与当第一蛋白质分子没有被加入到治疗性方案相比，由于ADC或AOC可以被以较低的剂量使用，考虑当例如靶向并杀死靶标患病细胞(如肿瘤细胞和自身免疫细胞)以低的程度具有较低风险的发生不期望的副作用进入健康细胞的ADC或AOC。
在整个说明书和权利要求书(整个申请)中，当考虑第一和第三表位、第一和第三结合位点、第一和第三细胞表面分子时，术语“第一”和“第三”具有相同的含义。即，对于第一和第三蛋白质分子，靶向的表位相同，结合位点相同，靶向的细胞表面分子(如肿瘤细胞(特异性)受体)是相同的。
表A2、A3和A4列出了包含第一和第三蛋白质分子的第一结合位点的第一表位的第一细胞表面分子的优选实例。此外，表A2、A3和A4还列出了包含第二蛋白质分子的第二结合位点的第二表位的第二细胞表面分子的优选实例。当第一和/或第二细胞表面分子在靶细胞上特异性表达时，优选第一和第二细胞表面分子两者，并且当第一结合位点和/或第二结合位点结合的分别在第一和第二细胞表面分子上第一和第二表位时可以分别结合，特异性存在于第一和/或第二细胞表面分子中，将第一、第三和/或第二蛋白质分子特异性靶向至相同的所期望靶细胞(如暴露第一和第二肿瘤细胞表面分子的肿瘤细胞)被促进，而其它细胞不被第一、第三和第二蛋白质分子靶向或以较低程度靶向，所述其它细胞(如不表达第一和/或第二细胞表面分子或确实以较低程度表达第一和/或第二细胞表面分子的健康细胞-的表面分子，优选与靶向(异常)细胞上细胞表面分子的表达相比，不表达第一和第二细胞表面分子或以较低程度表达表达第一和第二细胞表面分子。
一实施方案是包含本发明的第二或第三药物组合物的治疗性组合，其中由第二蛋白质分子和/或由第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含以下中的任一种或多种，或者由以下中的任一种或多种组成：寡核苷酸，核酸，异种核酸，优选选自载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或它们的衍生物中的任一种或多种，更优选BNA，例如沉默HSP27蛋白表达的BNA。
一实施方案是包含本发明的第二或第三药物组合物的治疗性组合，其中由第二蛋白质分子和/或由第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含至少一种蛋白质分子或由至少一种蛋白质分子组成，优选选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、诸如脲酶和Cre-重组酶的酶、核糖体失活蛋白质、蛋白质毒素，更优选选自以下中的任一种或多种：选自表A5的蛋白质毒素中的任一种或多种和/或病毒毒素，诸如凋亡素；细菌毒素，诸如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，诸如α-八叠球菌素；植物毒素，其包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，诸如石竹素(如石竹素-30或石竹素-32)，皂草素(例如皂草素-S3或皂草素-S6)、bouganin或bouganin的去免疫化的衍生物debouganin，志贺样毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫迪素、莫迪素A链、相思豆蛋白毒素、相思豆毒素A链、蒴莲素、蒴莲素A链、槲寄生素、槲寄生素A链；或动物或人类毒素，诸如青蛙核糖核酸酶，或来自人类的颗粒酶B或血管生成素，或它们的任何片段或衍生物；优选地，所述蛋白质毒素是石竹素和/或皂草素。
一实施方案是包含本发明的第二或第三药物组合物的治疗性组合，其中由第二蛋白质分子和/或第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含至少一种有效载荷或由至少一种有效载荷组成，优选地选自靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素中的任一种或多种，更优选地emtansine、pasudotox、美登素衍生物DM1、美登素衍生物DM4、单甲基澳瑞他汀E(MMAE，vedotin)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF，mafodotin)、卡利奇霉素、N-乙酰基-γ卡利奇霉素、吡咯并苯二氮卓(PBD)二聚体、苯二氮卓、CC-1065类似物、倍癌霉素、阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚并苯二氮卓、AZ13599185、念珠藻素、根霉素、甲氨蝶呤、蒽环霉素、喜树碱类似物、SN 38、DX 8951f、依喜替康甲磺酸盐、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、倍癌霉素衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、spliceostatin、泰兰斯他汀、ozogamicin、tesirine、Amberstatin269和soravtansine、或它们的衍生物。
本发明中的药物活性物质是用于在生物体(优选脊椎动物、更优选人类(如癌症患者或自身免疫患者))中实现有益结果的效应子部分。益处包括疾病和/或症状的诊断、预后、治疗、治愈和/或预防。药物活性物质也可能导致不期望的有害副作用。在这种情况下，必须权衡利弊，以确定药物活性物质是否适合特定情况。如果细胞内药物活性物质的作用主要对整个生物体有益，则该细胞称为靶细胞。如果细胞内的效应主要对整个生物体有害，则该细胞称为脱靶细胞。在人工系统(细胞培养和生物反应器)中，靶细胞和脱靶细胞取决于目的并由用户限定。
作为多肽的效应子部分可以是例如恢复失去的功能(如例如酶置换、基因调节功能)的多肽或毒素。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子包含多于一个皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64或1-100个的皂苷，或它们之间的任意数量的皂苷(如7、9、12个皂苷)，其直接共价结合至所述第一蛋白质分子的氨基酸残基，优选地结合至半胱氨酸和/或赖氨酸，和/或通过至少一个连接子和/或通过至少一个可裂解连接子和/或通过至少一个多聚或寡聚支架(优选地1-8个此类支架或2-4个此类支架)共价结合，其中所述至少一个支架任选地是基于树枝化基元，其中1-32个皂苷(如2、3、4、5、6、8、10、16、32个皂苷，或它们之间任意数量的皂苷诸如7、9、12个皂苷)共价结合至至少一个支架。
表A1和方案I以及上述实施方案总结了一系列皂苷，当其与第二分子(例如效应部分或效应分子，诸如毒素、寡核苷酸)以游离形式在一起，与哺乳动物细胞(特别是人肿瘤细胞)接触时，鉴定出它们内体逃逸增强活性。事实上，在使用人肿瘤细胞的基于细胞的生物测定中，对于表A1中列出的皂苷和方案I中的皂苷以及本文所述的本发明的各种实施方案中的皂苷，确定了在这些皂苷的影响下，当与第一蛋白质分子、第二分子(效应子部分)(如核酸和/或毒素(如蛋白质毒素(例如表A5中列出的一种或多种蛋白质毒素)))结合时，当与第二或第三蛋白质分子结合时，所述皂苷被以增加的效率和/或功效递送进入细胞质，大概是通过从(晚期)内体和溶酶体的细胞内释放。即，在没有皂苷的情况下，此类第二分子(与本发明的第二或第三蛋白质分子结合的效应子部分)(例如核酸和/或毒素)的内体和/或溶酶体逃逸是较低效率的。
令人惊讶的是，本发明的发明人现在证明了来自皂皮树的水溶性皂苷级分(包含QS-21及其家族成员QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、QS-18和Quil-A)，当以包含单克隆抗体(本发明的第一蛋白质分子)以及包含效应子部分(上述第二和/或第三蛋白质分子)的第二和/或第三蛋白质分子以及由作为共价缀合物的第一蛋白质分子所包含的至少一种糖苷(如QS-21及其包含在此类QS-21制剂(例如皂皮树的水溶性级分)中家族成员皂苷)的共价缀合物形式施用于哺乳动物物种(人)的肿瘤细胞时，也展示了与单克隆抗体结合的核酸或与单克隆抗体结合的蛋白质毒素(本发明的第二和/或第三蛋白质分子的实例，包括共价结合的寡核苷酸或有效载荷(如(蛋白质)毒素))的增强体外生物效应的能力，其中效应分子与糖苷(例如皂皮树的皂苷级分QS-21、SO1861、SA1641、GE1741)直接或通过连接子或通过多聚或寡聚支架或直接或通过至少一个连接子与例如蛋白质分子共价结合。不希望受任何理论束缚，在来源于皂皮树的皂苷存在下，体外观察到的例如反义BNA介导的肿瘤细胞HSP27表达降低(HSP27基因沉默)的刺激或增强可能(也)与活化皂苷激活肿瘤细胞中的炎性体(例如导致肿瘤细胞焦亡)有关。当在包含皂苷的本发明的第一蛋白质分子存在下，并且靶向与被第二和/或第三蛋白质分子靶向的细胞表面分子相同的(肿瘤)细胞时，与例如反义BNA或石竹素或皂苷缀合的第二和第三蛋白质分子展现出所有或改善的抗肿瘤细胞活性的任何抗肿瘤细胞活性，而在不存在第一蛋白质分子并因此不存在皂苷的情况下，没有观察到针对肿瘤细胞的此类活性。
QS-21以及包含来自皂皮树的QS-21的水溶性皂苷级分早已为人所知，并且以前因其免疫增强能力(例如作为佐剂，例如亚单位疫苗)而被广泛应用。例如，QS-21被应用于人类患者的两项III期临床试验，这些患者接种了与包含QS-21的佐剂的混合的亚单位疫苗和(Glaxo-Smith-Kline,MAGRIT试验,DERMA研究)，其中亚单位是MAGE-A3蛋白，由肿瘤细胞特异性表达和呈递。QS-21增强的抗肿瘤疫苗接种旨在延长癌症患者(黑色素瘤；非小细胞肺癌)的无病生存期。此外，QS-21已在临床试验中作为佐剂进行测试，用于开发抗癌疫苗治疗、用于HIV-1感染的疫苗、开发针对乙型肝炎的疫苗以及使用包含Glaxo-Smith-Kline的佐剂AS01和AS02的QS-21开发抗疟疾疫苗。先前的研究表明，在包含佐剂(AS15；GSK)的QS-21皂苷的影响下，会引发针对呈现在癌细胞表面的MAGE-A3肽的免疫应答。令发明人惊讶的是，皂皮树的皂苷级分，因此可能是QS-21(作为皂皮树的水溶性皂苷级分的一部分)增强了例如与第二蛋白质分子(例如配体EGF)的抗肿瘤细胞活性。
本发明的发明人表明与在不存在具有偶联的皂苷的第一蛋白质分子的情况下，的对照和仅AOC(第三蛋白质分子)相比，具有共价偶联的反义BNA(如BNA(HSP27))并且与具有共价偶联皂苷(例如SO1861、QS-21)的本发明的第一蛋白质分子一起与肿瘤细胞接触的肿瘤细胞靶向单克隆抗体能够在体内使肿瘤中的HSP27沉默，BNA和皂苷通过可裂解键与第一和第三蛋白质分子的各自抗体(例如西妥昔单抗)偶联。将ADC或抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)(如抗体-BNA缀合物)与具有皂苷的第一蛋白质分子共同给药，从而赋予ADC或AOC抗肿瘤细胞活性，而以相同剂量仅使用ADC或AOC没有观察到ADC或AOC的抗肿瘤细胞活性。值得注意的是，与对照组(仅施用媒介物)相比，当分别向不同小鼠组中的荷瘤小鼠施用AOC(第二或第三蛋白质分子)和具有共价偶联皂苷(第一蛋白质分子)的单克隆抗体时，增加了肿瘤细胞中HSP27的表达。当与对照相比时，仅共同施用包含本发明的效应子部分(第二或第三蛋白质分子)的AOC和具有共价偶联皂苷的第一蛋白质分子显示降低的HSP27表达。根据Zhang等人(2011)[YZhang,Z Qu,S Kim,V Shi,B Liao1,P Kraft,R Bandaru,Y Wu,LMGreenberger和ID Horak,Down-modulation of cancer targets using locked nucleicacid(LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection,Gene Therapy(2011)18,326–333]，反义BNA(HSP27)是具有寡核苷酸序列5'-GGCacagccagtgGCG-3'的BNA。值得注意的是，据发明人所知，BNA被设计为作为游离核酸应用。本发明的发明人现在是第一个证明反义BNA可以通过(非)可裂解连接子与配体或抗体共价偶联的，其方式是在体外保留基因沉默活性，更重要的是在体内保留荷瘤动物的肿瘤细胞。这种提供基于BNA的AOC的方法开辟了向有需要的人类(癌症)患者施用靶向BNA的新方法。
本发明的发明人在此公开了诸如通过三功能连接子(例如方案II和结构B的三功能连接子)，或通过包含共价结合皂苷的支架的寡聚或多聚结构将皂苷(如皂皮树的水溶性级分中的皂苷、QS-21、SA1641、SO1861、表A1、方案I)共价偶联至第一蛋白质分子，导致在第一蛋白质分子中共价偶联皂苷的影响下，由第二和/或第三蛋白质分子所包含的效应子部分(如毒素)发挥的改善的细胞毒性。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其包含皂苷，所述皂苷包含方案I中结构A的皂苷的一个或几个或所有指示的结构特征，结构A的皂苷被称为具有‘理想’结构的皂苷，当内体逃逸增强针对存在于与第一蛋白质分子和/或选自方案I中的任何一种或多种其它皂苷的皂苷接触的细胞内体中的效应子部分的活性时：
方案I：
Figure BDA0003222616810000661
方案I(续)
Figure BDA0003222616810000671
方案I(续)
Figure BDA0003222616810000681
方案I(续)
Figure BDA0003222616810000691
Figure BDA0003222616810000701
方案I(续)
Figure BDA0003222616810000711
根据本发明，具有目的是增强与本发明的第二或第三蛋白质分子结合的效应分子的内体逃逸的‘理想’结构的与本发明的第一蛋白质分子结合的糖苷(如根据本发明的皂苷)是根据方案I的结构A的双糖链皂苷，具有至少1,500道尔顿的分子量并且包含含有在C-23位置处的醛基和任选在C-16位置处的羟基的齐墩果型三萜，其中在C-3位置处具有第一支链碳水化合物侧链，所述第一支链碳水化合物侧链任选包含葡糖醛酸，其中皂苷含有在C-28位置处具有第二支链碳水化合物侧链的酯基，所述第二分支碳水化合物链优选包含至少四个碳水化合物单元，任选地包含至少一个乙酰基残基(如两个乙酰基残基)和/或任选地包含脱氧碳水化合物和/或任选地包含奎诺糖和/或任选地包含葡萄糖和/或任选地包含4-甲氧基肉桂酸和/或任选地包含5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸和/或任选包含通过酯键与碳水化合物结合的5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基辛酸。
SO1861与方案I、结构A中展现的“理想结构”不同，仅在于在奎诺糖上只有一个乙酰基残基并具有额外的木糖。用于增强效应分子或效应部分的内体逃逸的皂苷的“理想结构”是优选具有方案I的结构A的皂苷，并且展现出内体逃逸增强活性的皂苷并且具有在方案I的结构A中展现的一种或多种结构特征的皂苷。不希望受任何理论束缚，本发明的发明人相信方案I的结构A代表内体逃逸增强活性的“理想皂苷”(而不是最低要求皂苷)，这意味着并非所有结构(化学基团)都可以或必须存在于每种皂苷中，至少具有足够的内体逃逸增强活性以促进效应子部分在细胞质中的累积，并且这意味着一些皂苷可能具有其他结构元素(如酰基链)，和/或对于展现内体逃逸增强活性的其他皂苷，糖可以不同于方案I中所展现的糖。例如，当考虑方案I中结构A的理想结构时，QS-21皂苷和皂皮树水溶性级分中的一些皂苷(皂皮树；Quil-A)不同于在C-28处的碳水化合物修饰：例如，在QS-21中存在酰基链。在皂皮树的水溶性级分中，皂苷(QS-7、QS1862)与理想结构A相似，并且与SO1861相似。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中至少一个连接子是不可裂解的连接子或可裂解的连接子，其中可裂解的连接子例如在酸性条件、还原条件、酶促条件或光-诱导条件经受裂解，优选可裂解的连接子包含腙键或酰肼键，当与皂苷结合时在酸性条件下经受裂解，和/或包含易于蛋白水解的键(例如组织蛋白酶B的蛋白水解)，和/或是当与皂苷结合时，在还原条件(如二硫键)下容易裂解的键。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中当可裂解连接子与皂苷结合时，可裂解连接子在如在哺乳动物细胞(优选人细胞)的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH 4.0-6.5，更优选pH≤5.5时，在体内经受裂解。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中寡聚或多聚支架包含多聚或寡聚结构并且包含化学基团，所述化学基团用于将支架共价偶联至所述第一蛋白质分子的氨基酸残基。
根据本发明，皂苷通常是方案I的表A1中列出的皂苷。已证明皂苷的活性有益，例如考虑当与第二或第三蛋白质分子共价偶联的效应子部分进入细胞并且在细胞质内累积时，当皂苷与涉及腙键和/或酰肼键，和/或二硫键的第一蛋白质分子共价偶联时的内体逃逸增强活性。此类键类型在酸性条件下很容易在哺乳动物细胞(例如人体细胞)的(晚期)内体和溶酶体内和/或在还原条件下裂解。可替代地，本发明的发明人还证明了皂苷通过在细胞内的生理条件(例如(晚期)内体、溶酶体、细胞质)下不容易裂解的键与第一蛋白质分子的共价偶联也有利于增强皂苷对例如效应子部分(如核酸，例如沉默HSP27的BNA)和蛋白质毒素(如皂草素)的生物效应的活性。在整个申请中，包括权利要求，术语‘可裂解的连接子’、‘可裂解的键’等也被称为‘不稳定的连接子’(‘L’)和‘不稳定键’，当本发明的缀合物为例如任选地包含具有通过连接子与第一蛋白质分子偶联的皂苷的支架和/或通过腙键或二硫键的支架的第一蛋白质分子时，是指例如在(晚期)内体和/或溶酶体中的此类键或连接子的可裂解的上下文中。例如，图6和图7显示了小鼠人类肿瘤中的体内HSP27基因沉默。荷瘤小鼠用根据本发明的第一蛋白质分子处理，所述第一蛋白质分子由单克隆抗体和通过不稳定的连接子(腙键)与其结合的皂苷组成，而第三蛋白质分子包含通过二硫键与单克隆抗体(与第一单克隆抗体相同类型)共价偶联的用于沉默肿瘤细胞中的HSP27基因的结合的反义BNA。即，不希望受任何理论束缚，腙键和二硫键在表达在细胞表面处的靶向的细胞表面分子(在此EGFR)上的表位的靶肿瘤细胞的(晚期)内体和/或溶酶体中被裂解，一旦本发明的治疗性组合被通过例如内吞作用内化。当考虑BNA从内体和/或溶酶体进入细胞质时，键的可裂解可能有助于皂苷的内体逃逸增强活性，尽管此类可裂解不是观察本发明的西妥昔单抗-SO1861缀合物和西妥昔单抗-BNA缀合物的组合的基因沉默效果的必要条件。
技术人员将理解三功能连接子是本发明的适合于共价偶联一个、两个或三个皂苷部分的支架。对于共价偶联一个或两个皂苷部分的三功能连接子是优选的。第二和/或第三结合位点例如适用于共价偶联蛋白质配体(如第一蛋白质分子)。典型的蛋白质配体是用于靶向在细胞表面表达EGFR的(肿瘤)细胞的EGF，以及用于靶向肿瘤细胞或自身免疫细胞的细胞因子。此外，三功能连接子的第二或第三结合位点适用于免疫球蛋白(如单克隆抗体)的共价偶联，即用于结合细胞表面分子的第一蛋白质分子，细胞表面分子为例如肿瘤细胞表面分子，优选地肿瘤细胞特异性分子，更优选在肿瘤细胞表面特异性(过)表达的肿瘤细胞受体。类似地，包含免疫球蛋白结合特异性的免疫球蛋白或其任何片段和/或结构域适用于结合在自身免疫细胞表面表达细胞表面分子(如受体)。因此，在实施方案中，第一蛋白质分子包含三功能连接子，所述连接子包含共价结合的皂苷(例如QS-21、SO1861)或由共价结合的皂苷(例如QS-21、SO1861)组成，并且共价结合结合位点为诸如细胞靶向部分，诸如用于(特异性)结合肿瘤细胞、自身免疫细胞、患病细胞、异常细胞、肺健康细胞或患病B细胞的配体或抗体。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其包括根据方案II的作为支架核心结构的寡聚三功能连接子：
Figure BDA0003222616810000751
其中皂苷通过不稳定的、可裂解的腙连接子(酸敏感性的)和/或通过包含马来酰亚胺的键与三功能连接子支架共价结合，而支架与结合位点(如抗体)的结合是通过不稳定的、可裂解腙连接子(酸敏感性的)和/或通过包含与结合位点中的半胱氨酸(如1、2、3或4个半胱氨酸)键合的马来酰亚胺建立的，从而形成结构B：
Figure BDA0003222616810000752
使得1-4个支架共价结合到单个例如抗体(如单克隆抗体)。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中糖苷分子是皂苷，并且皂苷与第一蛋白质分子之间的连接优选通过酸不稳定键发生，所述键在pH 7.4稳定并且优选在pH 6.5以下，更优选pH6.5至5.0释放皂苷。这例如通过由连接皂苷与第一蛋白质分子的连接子的氨基以及皂苷的醛基形成的亚胺来实现。满足pH条件的其它化学键也可以被用于醛偶联，例如特定的腙或缩醛，分别需要酰肼基和羟基作为连接子的官能团。如果该键是可裂解的键，则皂苷优选通过醛官能团或通过皂苷中的羧基之一，更优选通过醛官能团，优选在23位置处的醛官能团于支架的多聚或寡聚结构连接。可替代地，皂苷优选通过支架的多聚或寡聚结构，通过通过糖苷分子(即皂苷)的醛官能团或羧酸官能团连接支架的多聚或寡聚结构的连接子与第一蛋白质分子连接。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中至少一个皂苷通过稳定键与第一蛋白质分子结合。在更优选的实施方案中，皂苷与第一蛋白质分子之间的稳定键优选通过酰胺偶联或胺形成发生。这例如通过碳二亚胺介导的酰胺键形成来实现，该酰胺键由将皂苷和第一蛋白质分子连接在一起的多聚或寡聚支架结构的氨基和皂苷的活化葡糖醛酸基团实现。满足稳定键定义的化学键也可以被用于醛偶联(例如还原胺化后衍生的特定胺)需要伯氨基作为支架或连接子的多聚或寡聚结构的官能团。如果键是稳定键，则皂苷优选通过皂苷的羧基之一与连接子或支架连接，连接子或支架还与第一蛋白质分子连接。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中皂苷通过根据本发明的支架与结合位点偶联，其中用于将支架共价偶联至结合位点的化学基团是点击化学基团。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中皂苷通过根据本发明的支架与结合位点偶联，其中点击化学基团是四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或这些基团中的任一种的状衍生物，优选叠氮化物。点击化学基团是适用于点击化学的官能性化学基团，其被限定为模块化的、范围广、产率非常高、仅产生无害的副产物、对不同官能团具有高选择性和高耐受性的反应，并且是立体特异性的。所需的工艺特性包括简单的反应条件、容易获得的起始材料和试剂、不使用溶剂或使用温和的溶剂(如水)或易于去除的溶剂，以及简单的产物分离。用于任选地通过支架或连接子将皂苷偶联到第一蛋白质分子中的结合位点的点击化学基团优选是四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或它们的反应性衍生物(如甲基四嗪或马来酰亚胺(烯烃)，更优选炔烃))，或这些基团的环状衍生物(如环辛炔(例如氮杂-二苯并环辛炔、二氟环辛炔、双环[6.1.0]非-4-炔、二苯并环辛炔))。
因此，根据本发明的第一蛋白质分子包含至少一个皂苷。在本文中，“至少一个”意指第一蛋白质分子包含一个皂苷分子，但也可以包含一对(例如两个、三个或四个)皂苷或多个(例如10、20或100个)皂苷。取决于应用，第一蛋白质分子可以包含具有共价结合皂苷的共价结合支架，其中可以设计支架以使其包含限定数量的皂苷。优选地，根据本发明的第一蛋白质分子包含限定数量或范围的皂苷，而不是随机数。这对于与上市许可相关的药物开发尤其有利。在这方面限定的数量意味着第一蛋白质分子优选地包含先前限定数量的皂苷。这例如通过设计包含具有一定数量的用于皂苷连接的可能部分的多聚结构的支架来实现。在理想情况下，所有这些部分都与皂苷和支架偶联，而不是包含先前限定数量的皂苷。设想提供标准的一组支架，其包括例如两个、四个、八个、十六个、三十二个、六十四个等皂苷，以便使用者可以根据他的需要容易地测试最佳数量。一实施方案是包含本发明支架的本发明第一蛋白质分子，其中皂苷存在于限定范围内，例如，在非理想情况下，并非多聚结构中存在的所有部分都结合皂苷。例如，这样的范围可以是每个支架2–4个皂苷分子、每个支架3–6个皂苷分子、每个支架4–8个皂苷分子、每个支架6–8个皂苷分子、每个支架6–12个皂苷分子等等。在这种情况下，如果范围限定为2-4个，那么包含根据本发明的支架的第一蛋白质分子因此包含2、3或4个皂苷。
支架基本上独立于与支架共价结合的皂苷的类型，支架随后(按顺序)共价偶联至第一蛋白质分子。因此，包含支架的第一蛋白质分子是新平台技术的基础产品。由于至少一个共价结合的皂苷介导与第二蛋白质分子结合的效应子部分的细胞内递送，因此根据本发明的支架技术是已知的通过皂苷介导受控的细胞内效应子部分递送的第一系统。该支架提供了优化的功能活性单元，其可以连接到皂苷和由第一蛋白质分子(配体、抗体等)在单一和限定的位置所包含的结合位点。
一实施方案是包含根据本发明的支架的第一蛋白质分子，其中多聚或寡聚结构的单体数量是精确限定的数量或范围。优选地，多聚或寡聚结构包括诸如聚(胺)(例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺))的结构，或诸如聚乙二醇、聚(酯)(如聚(丙交酯))、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物、聚(糊精)、或肽或蛋白质的结构，或诸如天然和/或人工聚氨基酸(例如聚赖氨酸、DNA聚合物、稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物)的结构，可以是线性、支化或环状多聚物、寡聚物、树枝状大分子、树枝状基元、树枝状多聚物、树枝状寡聚物或这些结构的组装体，无论是纯粹的还是混合的。优选地，多聚或寡聚结构是生物相容的，其中生物相容意指多聚或寡聚结构在生物体中不表现出显著的急性或慢性毒性，并且可以原样排泄或完全降解为可排泄的和/或生理的化合物。组装可以通过共价交联或非共价键和/或吸引力来建立。因此，它们也可以形成纳米凝胶、微凝胶或水凝胶，或者它们可以附接到载体上(如无机纳米颗粒、胶体、脂质体、胶束或包含胆固醇和/或磷脂的颗粒状结构)。所述多聚或寡聚结构优选具有精确限定数量或范围的偶联部分，用于偶联糖苷分子(和/或效应分子和/或载体分子，诸如配体、单克隆抗体或其片段)。优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选100％的多聚或低聚结构中精确限定数量或范围的偶联部分被根据本发明的支架中的糖苷分子占据。
优选地，树枝化基元是支化的、明确限定的树状聚合物，在树的起源处具有单个化学可寻址基团，被称为焦点。树枝状大分子是两个或更多个树枝化基元在其焦点处的连接。树枝状多聚物是一个或多个树枝化基元的焦点与多聚物的连接。在优选的实施方案中，提供了根据本发明的支架，其中多聚或低聚结构包含线性、支化或环状多聚物、低聚物、树枝状大分子、树枝化基元、树枝状多聚物、树枝状寡聚物或这些结构的组装体，无论是纯粹的还是混合的，其中组装可以通过共价交联或非共价吸引建立并且可以形成纳米凝胶、微凝胶或水凝胶，并且其中，优选地多聚物是聚(胺)的衍生物(如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺))，和诸聚乙二醇、聚(酯)(如聚(丙交酯))、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物和聚(糊精)的结构，和结构诸如天然和/或人造聚氨基酸(如聚赖氨酸)，或肽或蛋白质或DNA聚合物、稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物的结构。优选地，多聚或寡聚结构是生物相容的。
一实施方案是本发明的治疗性组合或根据本发明使用的治疗性组合，其中第一蛋白质分子包含多于一个共价结合的皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64、128或1-100个皂苷，或它们之间任意数量的皂苷(如7、9、12个皂苷)。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中至少一个皂苷通过根据本发明的至少一个可裂解连接子共价结合至寡聚或多聚支架的多聚或寡聚结构。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中用于将寡聚或多聚支架共价偶联至所述第一蛋白质分子的氨基酸残基的寡聚或聚合支架的化学基团是点击化学基团，优选地选自四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或这些基团的环状衍生物，更优选地，所述化学基团是叠氮化物。
一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其中寡聚或多聚支架的多聚或寡聚结构包含线性、支化和/或环状多聚物、寡聚物、树枝状大分子、树枝化基元、树枝状多聚物、树枝状寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇或这些多聚或寡聚结构的组装体，所述组装体优选通过共价交联建立。
发明人确定，根据以上任何实施方案，皂苷与第一蛋白质分子的共价偶联，优选地通过可裂解的键或连接子，提供了与第二蛋白质分子以及第三蛋白质分子结合的效应子部分的活性的有效和细胞靶向的增强，其中第一和第三蛋白质分子包含相同的第一结合位点，并且其中第一和第二蛋白质分子包含不同的第一和第二结合位点。，当效应子部分也通过使用包含与第一蛋白质分子相同的第一结合位点的第二和/或第三蛋白质分子递送到相同靶细胞中时，当考虑第三蛋白质分子并且分别包含不同的第一和第二结合位点时，当考虑第一和第二蛋白质分子时，直接或通过连接子将皂苷偶联到第一蛋白质分子(如单克隆抗体)的半胱氨酸侧链或赖氨酸侧链上，被证明是在靶细胞内特异性且有效递送效应子部分增强活性的有益方式。
为了更详细地解释本发明，描述了本发明中物质的细胞摄取过程(尽管发明人不希望受任何理论束缚)和使用的术语。通过囊泡出芽将细胞外物质摄取到细胞中被称为内吞作用。所述囊泡出芽的特征在于(1)由细胞溶质蛋白网格蛋白介导的受体依赖性配体摄取，(2)由胆固醇结合蛋白小窝蛋白介导的脂筏摄取，(3)非特异性流体摄取(胞饮作用)，或(4)非特异性颗粒摄取(吞噬作用)。所有类型的内吞作用都会进入以下被称为内吞途径的囊泡运输和物质分类的细胞过程。内吞途径很复杂，尚未完全了解。不希望受任何理论束缚，细胞器可以从头形成并沿着内吞途径成熟为下一个细胞器。然而，现在假设内吞途径涉及通过囊泡运输连接的稳定隔室。隔室是一种复杂的多功能膜细胞器，专门用于细胞的一组特定基本功能。囊泡被认为是短暂的细胞器，组成更简单，被定义为膜封闭容器，其通过从预先存在的隔室出芽而从头形成。与隔室相比，囊泡可以经历成熟，这是一系列生理上不可逆的生化变化。早期内体和晚期内体代表内吞途径中的稳定隔室，而初级内吞囊泡、吞噬体、多泡体(也被称为内体载体囊泡)、分泌颗粒甚至溶酶体代表囊泡。内吞囊泡出现在质膜上，最突出的是来自网格蛋白包被的小坑，首先与早期内体融合，后者是一个pH大约6.5的主要的分选室。大部分内化的货物和膜通过再循环囊泡(再循环途径)循环回到质膜。应降解的成分通过多泡体运输到酸性晚期内体(pH低于6)。溶酶体是可以储存成熟的溶酶体酶，并在需要时将它们运送到晚期内体隔室的囊泡。由此产生的细胞器被称为杂交细胞器或内溶酶体。溶酶体在称为溶酶体重组的过程中从杂交细胞器中萌芽。晚期内体、溶酶体和杂交细胞器是极其动态的细胞器，通常很难区分它们。内吞分子的降解发生在内溶酶体或溶酶体内。内体逃逸是从内吞途径，优选从网格蛋白介导的内吞作用或再循环途径进入细胞质的任何种类隔室或囊泡的内腔主动或被动释放物质。因此，内体逃逸包括但不限于从内体、内溶酶体或溶酶体中释放，包括它们的中间和杂合细胞器。
除非另有特别说明，特别是当涉及糖苷分子(如本发明的皂苷)的内体逃逸机制时，每当本文使用“内体”或“内体逃逸”一词时，它也包括内溶酶体和溶酶体，并且分别从内溶酶体和溶酶体逃逸。进入细胞质后，所述物质可能会移动到其它细胞单元(如细胞核)。
在正式术语中，糖苷是其中糖基通过其异头碳通过糖苷键与另一个基团结合的任何分子。在本发明的上下文中，糖苷分子(如皂苷)是这样的分子，它们能够进一步增强效应子部分的作用，而不希望受任何理论的束缚，特别是通过促进效应子部分的内体逃逸。不希望受任何理论束缚，糖苷分子(皂苷，诸如表A1中列出的那些)与内吞和再循环途径的隔室和囊泡的膜相互作用并使它们对于所述效应子部分渗漏，导致内体逃逸增强。术语“支架能够增强效应部分的内体逃逸”意指与支架的多聚或寡聚结构偶联的至少一个皂苷(糖苷分子)当两个分子都在一个内体(例如晚期内体)中时，能够增强效应部分的内体逃逸，任选地且优选地在至少一个糖苷(如皂苷)从第一蛋白质分子(如从所述第一蛋白质分子所包含的连接子或多聚或寡聚结构)释放之后，例如通过裂解至少一个糖苷(皂苷)和第一蛋白质分子之间的可裂解键(例如通过支架的多聚或寡聚结构和/或通过连接子)。即使根据本发明的至少一个糖苷(如皂苷)和第一蛋白质分子之间的键，任选地通过连接子或支架，可以是“稳定键”，但这并不意味着这种键不能被酶在内体中裂解。例如，糖苷或皂苷，任选地连同连接子或支架的寡聚或多聚结构的一部分，可以从剩余的连接子片段或寡聚或多聚结构上切下。例如，蛋白酶裂解(蛋白质)连接子或蛋白质多聚结构(例如白蛋白)从而释放至少一个糖苷、皂苷。然而，优选地，糖苷分子(优选皂苷)以活性形式释放，优选以它在任选地通过连接子和/或寡聚或多聚支架(准备偶联)偶联到第一蛋白质分子之前的原始形式释放；因此，糖苷(皂苷)在这种裂解后具有其天然结构，或者糖苷(皂苷)具有(部分)化学基团或与其连接的连接子，在这种裂解后，而糖苷生物活性(皂苷生物活性)，例如内体/溶酶体逃逸增强针对存在于同一内体或溶酶体中的效应子部分的活性，在糖苷(皂苷)和载体分子之间的键的所述裂解后得以维持或恢复，即任选包含连接子和/或本发明的支架的第一蛋白质分子。关于本发明，术语“稳定的”关于例如第一蛋白质分子的皂苷和氨基酸残基、连接子、多聚或寡聚结构(支架的)、配体、(单克隆)免疫球蛋白或其结合结构域或片段，和/或效应子(效应子部分、效应分子)之间的键合是指键不容易断裂或至少设计为不容易被例如pH差异、盐浓度或UV-光、还原条件断裂。关于本发明，术语“可裂解的”是指例如皂苷和第一蛋白质分子、连接子、氨基酸残基、支架的多聚或寡聚结构、配体、抗体和/或效应子之间的键是指被设计为易于被例如pH差异、盐浓度破坏，在还原条件下等容易断裂的键。技术人员非常了解这种可裂解的键以及如何制备它们。
在本发明之前，在市场上引入ADC和AOC的主要障碍之一是治疗性窗口小：ADC或AOC的治疗有效剂量伴随着(不可接受的)副作用，阻碍了用ADC患者治疗的发展和影响。通过应用本发明的第一蛋白质分子，现在可以将一个或多个糖苷分子(皂苷)与携带有效载荷的ADC一起或与与寡核苷酸(如根据本发明的BNA(即本发明的特定第二或第三蛋白质分子))缀合的(单克隆)抗体一起引导至(靶)细胞。特别地，以前不可能将第二或第三蛋白质分子的效应子部分和每个效应子部分的(预定义的、可控的)特定数量或范围的糖苷分子(皂苷)同时特异性地引导至细胞的细胞质，例如通过细胞的内吞途径。
本发明所提供的解决方案包括至少一个皂苷与第一蛋白质分子的共价结合。本发明提供的另一种解决方案包括(首先)使用寡聚或多聚支架聚合糖苷分子(皂苷)，并提供具有共价结合皂苷簇的第一蛋白质分子，使一个或多个皂苷能够在期望皂苷作用方式的细胞内位点重新单体化，例如内吞后。“聚合”在本文中意指通过连接子，或直接或通过多聚或寡聚结构形成支架或可逆和/或不可逆多重缀合(修饰的)皂苷，从而形成多聚或寡聚结构以形成支架的皂苷分子与第一蛋白质分子的可逆和/或不可逆多重缀合。在本文中，“再单体化”意指皂苷从第一蛋白质分子、从将皂苷连接到第一蛋白质分子的连接子或从支架上裂解，例如在内吞作用之后，并重新获得(天然)未结合皂苷的化学状态，所述未结合皂苷可以包含或不包含额外的化学基团，诸如用于将皂苷连接至连接子头、第一蛋白质分子的氨基酸残基或支架的化学基团，和/或与皂苷的化学基团(如醛基或羧酸基)结合的(化学)连接子。由于皂苷的复杂化学性质，例如皂苷在支架或其它连接连接子处的“聚合”以及它们在所期望位置(如细胞内)的“再单体化”(例如内吞后)是一项具有挑战性的任务。特别地，用于提供连接子和支架的化学反应包括用于共价结合第一蛋白质分子的共价连接的糖苷，例如，三萜皂苷(糖苷的聚合)，其通常存在于无水有机溶剂中，但皂苷和例如用作承载结合皂苷的支架的生物相容性多聚物是水溶性分子。未经修饰的皂苷的化学性质进一步阻止其自身聚合，另一种可能的解决方案是将多个皂苷(直接)结合到效应分子上，作为效应分子(药物、毒素、多肽或多核苷酸)估计不是很有希望，通常不提供足够的结合位点，并且因为偶联产物会变得非常异质和/或偶联生物活性分子如皂苷和例如肽、毒素、核酸一起承担影响和阻碍在这种含皂苷缀合物中结合在一起的一个或甚至两个分子的活性的风险。此外，存在相当大的风险，即第二或第三蛋白质分子所包含的效应子部分在皂苷与例如ADC或抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)偶联后失去其功能。本发明的实施方案解决了这些缺点中的至少一个。
本发明的一方面涉及包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第二蛋白质分子的组合物。
本发明的一方面涉及包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第三蛋白质分子的组合物。
一实施方案是包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第二蛋白质分子的组合物，或者是包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第三蛋白质分子的组合物，其中第二蛋白质分子或第三蛋白质分子所包含的效应子部分是根据本发明的任一种效应子部分，优选BNA。
本发明的一方面涉及一种组合物，其包含本发明的第一蛋白质分子和寡核苷酸、核酸和异种核酸中的一种或多种，所述寡核苷酸、核酸和异种核酸中的一种或多种优选选自：载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或它们的衍生物，更优选BNA，例如沉默HSP27蛋白表达的BNA(反义BNA(HSP27))。
在本发明的上下文中，效应分子或效应子部分是通过与细胞内效应分子靶标相互作用影响细胞代谢的任何物质，其中该效应分子靶标是细胞内的任何分子或结构，不包括内吞和再循环途径的隔室和囊泡，但包括这些隔室和囊泡的膜。因此，细胞内的所述结构包括细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、其它转运囊泡、质膜的内部和细胞质。在本发明的上下文中，效应子部分的细胞质递送优选地是指效应子部分能够逃逸内体(和/或溶酶体)，如前所限定的，这也包括逃逸内体溶酶体和溶酶体，并且优选地能够逃逸以达到本文所述的效应子部分靶标。本发明还包括一种被称为支架的新型分子，其用于当效应子部分包含在本发明的第二或第三蛋白质分子中并且皂苷包含在第一蛋白质分子中，以预定比例同时将效应子部分和至少一个糖苷分子(例如本发明的皂苷)带入内体中。在本发明的上下文中，支架的多聚或寡聚结构是结构有序的结构，如多聚物、寡聚物、树枝状大分子、树枝状多聚物或树枝状寡聚物，或者是组装的多聚结构(如水凝胶、微凝胶、纳米凝胶、稳定的聚合物胶束或脂质体)，但不包括由单体的非共价组装组成的结构(如胆固醇/磷脂混合物)。术语“多聚物、寡聚物、树枝状大分子、树枝状多聚物或树枝状寡聚物”具有它们的普通含义。特别地，多聚物是具有主要或完全由大量相同或相似单元结合在一起构成的分子结构的物质，而寡聚物是其分子由相对少的重复单元组成的聚合物。对于上述多聚物和寡聚物定义中分别使用的“许多”和“少数”的具体临界值没有达成共识。然而，由于支架可以包含多聚或寡聚结构或两者，因此键合在一起的相似单元的全部数量范围适用于此类结构。即从2个单体单元到100个单体单元、1000个单体单元以及更多个单体单元。例如，包含5个或更少个单元的结构可以被称为寡聚结构，而包含50个单体单元的结构可称为多聚结构。10个单体单元的结构可以被称为寡聚或多聚。如本文所限定的支架还包含至少一个糖苷分子(如本发明的皂苷)。支架优选包括多聚或寡聚结构，诸如多聚或寡聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺)，以及生物相容性结构，诸如聚乙二醇、聚或低聚(酯)，诸如聚(乳酸)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物和聚(糊精)，聚糖或寡糖，诸如环糊精或聚葡萄糖，和多聚或寡聚氨基酸，诸如聚赖氨酸或肽或蛋白质，或DNA寡聚体或多聚体。如本文所限定的组装多聚结构包含至少一个支架和任选的其它单独的多聚或低聚结构。所述组装体的其它单独的多聚或寡聚结构可以是(a)支架(因此包含至少一个糖苷分子，诸如本发明的皂苷)，(b)官能化的支架(因此包含至少一个糖苷分子(如皂苷)，和作为第一蛋白质分子的配体、抗体等)，(c)没有糖苷分子(如本发明的皂苷(例如见表A1))的多聚或寡聚结构，没有作为第一蛋白质分子的配体、抗体等的多聚或寡聚结构。功能化组装多聚结构是组装多聚结构，其包含(a)至少一个功能化支架或(b)包含作为第一蛋白质分子的至少一种配体、抗体等的至少一个支架和至少一个多聚结构。组装的多聚结构中的多聚或寡聚结构不包含任何上述分子(即没有糖苷(如皂苷)，没有第一蛋白质分子(如配体、抗体))作为组装结构的结构组分被特别添加，这有助于建立或稳定组装结构(“胶状”)。不希望受任何理论的束缚，酸性环境似乎是糖苷(皂苷)和效应子部分的协同作用的先决条件。
包含皂苷或者不进一步包含一个或多个(可裂解的)连接子和/或任选的支架的第一蛋白质分子，是否能够扰乱酸性环境并抑制至少一个糖苷(皂苷)的内体逃逸功能)可以很容易地用实施例3中所描述的和本领域已知的测定来确定。这种抑制被描述为“诱导50％细胞杀伤所需的糖苷数量增加的倍数”。优选地，支架不会导致增加，所述增加至少是在使用氯喹作为阳性对照时观察到的获得50％细胞杀伤所必需的糖苷分子(皂苷)的增加。可替代地，并且优选地，包含皂苷或者不进一步包含一个或多个(可裂解的)连接子和/或任选的支架的第一蛋白质分子不会导致糖苷分子增加至少4倍以诱导50％的细胞杀伤，更优选地不会导致至少2倍的增加。将在测定中测量增加的倍数，基本上如实施例4中所述，其中作为阳性对照的氯喹诱导糖苷量(优选皂苷量)的2倍增加，其中皂苷是观察到50％的细胞杀伤的本发明皂苷中的任一种或多种(参见表A1，方案I，先前的实施方案)。
术语“改善或增强效应子部分的作用”意指糖苷分子，优选本发明的皂苷，增加所述效应子部分的功能功效(例如毒素或药物或寡核苷酸(例如BNA)的治疗指数；生物技术过程中修饰剂的代谢功效；细胞培养研究实验中基因的转染功效)，优选通过启用或改进其靶标参与。优选不包括抗原特异性免疫反应的加速、延长或增强。治疗功效包括但不限于更强的治疗效果，优选具有更低的剂量和/或更少的副作用。“改善效应子部分的效果”还可以表示由于缺乏效果而不能使用的效应子部分(并且例如不被称为效应子部分)，当与本发明组合使用时变得有效。本发明提供的其它有益的或所期望的并且可归因于效应子部分和第二或第三蛋白质分子的组合的任何效果被认为是“改进的效果”。在实施方案中，包含结合皂苷并被第一蛋白质分子所包含的支架增强了第二蛋白质分子所包含的效应子部分的作用，该作用是所预期和/或期望的。在包含与蛋白质支架结合的皂苷的第一蛋白质分子的情况下，支架的蛋白质多聚结构本身可能具有例如对血流中胶体渗透压的影响。如果这种效果不是第一蛋白质分子所包含的这种功能化支架的所预期或期望效果，则支架的蛋白质结构不是本发明中所限定的效应子部分。或者，例如在基于DNA或RNA的支架携带结合皂苷并包含在第一蛋白质分子中的情况下，所述DNA或RNA的部分可能具有(非预期的)功能，例如通过干扰表达。如果这种干扰不是最终功能化支架的所预期或期望效果，则支架的DNA或RNA多聚结构不是本发明中所限定的效应子部分。
可以为第一蛋白质分子所包含的内体逃逸增强剂(即糖苷或皂苷，优选根据本发明的皂苷)配制许多优选特征：(1)它们优选无毒且不引起免疫反应，(2)它们优选不介导效应子部分进入脱靶细胞的细胞质摄取，(3)它们在作用位点的存在优选与效应子部分的存在同步，(4)它们优选是可生物降解的或可排泄的，以及(5)它们优选基本上不干扰与内体逃逸增强剂结合的效应分子的生物活性无关的生物体的生物过程，例如与激素相互作用。至少在一定程度上满足上述标准的糖苷分子(如本发明的皂苷)的实例是双糖链三萜，优选双糖链三萜皂苷，诸如SO1861、SA1641、QS-21、GE1741和表A1、方案I中的皂苷。
本发明的一方面涉及包含本发明的第一蛋白质分子和效应子部分的抗体-药物缀合物或抗体-寡核苷酸缀合物或配体-药物缀合物。
一实施方案是本发明的抗体-药物缀合物或抗体-寡核苷酸缀合物或配体-药物缀合物，其中所述抗体可以与以下中的任一种结合：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素α-V、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，优选CD71、EGFR、HER2，和/或是或包含以下中的任一种：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，和/或其中所述抗体-药物缀合物包含以下中的任一种：吉妥单抗ozogamicin、本妥昔单抗vedotin、曲妥珠单抗emtansine、奥英妥珠单抗ozogamicin、莫西妥单抗pasudotox和波妥珠单抗vedotin以及表A2和表A3的抗体-药物缀合物，或其中所述配体-药物缀合物包含用于结合细胞表面分子的至少一种配体，例如EGF或细胞因子。
一实施方案是本发明的抗体-药物缀合物或抗体-寡核苷酸缀合物或配体-药物缀合物，其中效应子部分是根据本发明的效应子部分中任一种或多种。
本发明的一方面涉及包含组合物的药物组合物，所述组合物包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第二蛋白质分子，或包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第三蛋白质分子，或包含本发明的抗体-药物缀合物或包含本发明的抗体-寡核苷酸缀合物或包含本发明的配体-药物缀合物，并且任选地进一步包含药学上可接受的赋形剂。
本发明的一方面涉及本发明的治疗性组合，其包含第二药物组合物或包含第三药物组合物，或包含含有本发明的第一蛋白质分子和本发明的第二蛋白质分子或包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第三蛋白质分子的组合物，或包含本发明的抗体-药物缀合物或抗体-寡核苷酸缀合物或配体-药物缀合物或本发明的药物组合物，以用作药物。
本发明的一方面涉及本发明的治疗性组合，其包含第二药物组合物或包含第三药物组合物，或包含含有本发明的第一蛋白质分子和本发明的第二蛋白质分子或包含本发明的第一蛋白质分子和本发明的第三蛋白质分子的组合物，或包含本发明的抗体-药物缀合物或抗体-寡核苷酸缀合物或配体-药物缀合物或本发明的药物组合物，以用于治疗或预防癌症或自身免疫性疾病。
如前所述，根据本发明的第一蛋白质分子所包含的至少一个皂苷至少增加了本发明中所限定的现有和新效应子部分的功效。由于降低第二或第三蛋白质分子所包含的效应子部分的剂量，潜在的副作用将减少，而不降低功效。因此，本发明提供了用于医学或用作药物的根据本发明的第一蛋白质分子。因此，本发明的一方面涉及用作药物的根据本发明的第一蛋白质分子，所述第一蛋白质分子包含至少一个皂苷。还提供了根据本发明的第一蛋白质分子用于制造药物的用途。尤其是癌症药物，特别是经典的化疗药物，因其副作用而臭名昭著。由于第二或第三蛋白质分子所包含的药物活性物质和第一蛋白质分子所包含的皂苷在时间和地点上具有靶向性和同步性，因为第一和第三蛋白质分子具有在相同的细胞表面分子上的相同表位的相同结合位点，或者因为第一和第二蛋白质分子分别在第一和第二细胞表面分子上具有不同的第一和第二表位的不同结合位点，所以根据本发明的治疗性组合特别适合用作药物，特别是用于治疗癌症的方法中的药物。因此，本发明提供了用于治疗癌症的方法中的根据本发明的治疗性组合或本发明的第一蛋白质分子。本发明还提供了根据本发明的治疗性组合或本发明的第一蛋白质分子，以用于治疗获得性或遗传性病症，特别是单基因缺陷病症的方法。因此，治疗性组合包含第一和第二蛋白质分子和/或包含第一和第三蛋白质分子。因此，本发明的一方面涉及根据本发明的治疗性组合，其中第二或第三蛋白质分子包含共价结合的效应子部分，以用于治疗癌症或自身免疫疾病的方法中。
本发明的第一、第二和第三蛋白质分子在医学中的进一步应用是替代靶细胞中的细胞内酶，这些酶产生的这些酶的量不足或功能不足。由此产生的疾病可能是遗传性的或获得性的。在大多数情况下，只能对症治疗，对于一些罕见疾病，治疗选择不足会导致相关患者的寿命缩短。此类疾病的实例是苯丙酮尿症，这是一种先天性的代谢错误，其导致氨基酸苯丙氨酸的代谢降低。该疾病的特征在于肝酶苯丙氨酸羟化酶的基因突变。苯丙酮尿症目前无法治愈。发病率大约为1:10,000，土耳其已知的最高发病率为1:2,600。具有结合的苯丙氨酸羟化酶或具有编码苯丙氨酸羟化酶的结合多核苷酸的第二或第三蛋白质分子(优选抗体)可以被用于通过使用合适的特异性抗体靶向肝细胞，并替代肝细胞中的缺陷酶。这是使用本发明的治疗性组合的一个实例，所述治疗性组合包含结合与皂苷的第一蛋白质分子和与酶或寡核苷酸结合根据本发明的第二或第三蛋白质分子用于替代或基因疗法。在优选的实施方案中，提供了用于基因疗法或替代疗法的方法中的根据本发明的治疗性组合。
本发明还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含根据本发明的治疗性组合的药物，优选向有需要的患者(优选人癌症患者)施用有效剂量的所述药物。
关于适合施用的形式的考虑是本领域已知的并且包括毒性作用、溶解性、施用途径和维持活性。例如，注射到血流中的药物组合物应该是可溶的。
合适的剂型部分取决于使用或进入途径，例如透皮或注射。无论靶细胞是否存在于多细胞宿主中，此类剂型都应允许化合物到达靶细胞。其它因素是本领域已知的，并且包括诸如阻碍化合物或组合物发挥其作用的毒性和剂型的考虑。
一实施方案是根据本发明的内体逃逸增强缀合物的组合，所述缀合物包含含有至少一个共价结合皂苷的第一蛋白质分子和结合部分，其中所述结合部分包含至少一个效应子部分，所述结合部分是包含结合效应子部分的第二或第三蛋白质分子，其中内体逃逸增强缀合物和结合部分彼此独立地能够特异性结合靶细胞特异性表面分子或结构，从而诱导内体逃逸增强缀合物和靶细胞特异性表面分子的复合物以及结合部分和靶细胞特异性表面分子的复合物的受体介导的内吞作用，其中内体逃逸增强缀合物和结合部分可以通过它们相同的结合位点结合相同的靶标细胞特异性表面分子，或其中内体逃逸增强缀合物和结合部分可以通过不同的结合位点与不同的靶细胞特异性表面分子结合。一实施方案是根据本发明的组合，其中内体逃逸增强缀合物能够与结合部分竞争结合靶细胞特异性表面分子或结构。一实施方案是根据本发明的组合，其中内体逃逸增强缀合物和结合部分彼此独立地能够特异性结合相同表位或不同表位。一实施方案是根据本发明的用于治疗异常(如癌症)的方法中使用的组合，其中所述内体逃逸增强缀合物和所述结合部分将同时或顺序地施用，优选地同时施用。
本发明的一方面涉及试剂盒，所述试剂盒包括含有根据本发明的内体逃逸增强缀合物(即第一蛋白质分子)的第一容器和含有根据本发明的结合部分(即第二和/或第三蛋白质分子)的第二容器，所述试剂盒还包含使用结合分子(即包含第一和第二或第一和第三药物组合物的治疗性组合)的说明书。
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表A2-之前在人类临床环境中研究过，随后从进一步的临床研究中撤回的ADC
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表格A3-达到III期临床研发的ADC
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表A5：来自植物的RIP*
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本发明的一部分是本发明的治疗性组合、第一药物组合物、第一蛋白质分子、第二或第三药物组合物或第二或第三蛋白质分子进一步与结合分子或结合部分和皂苷的共价缀合物(复合物)组，或进一步与药物化合物、抗体等组合，从而提供包含三种或更多种增强剂、药物活性成分等的组合物，例如本发明的缀合物(例如第一蛋白质分子和/或第二或第三蛋白质分子)与与效应分子复合的结合部分组合，进一步与药物组合，所述药物与皂苷连接或不连接，并且其与配体(如靶向免疫球蛋白、其结构域或其片段)偶联或不偶联。此外，一实施方案是本发明的治疗性组合、第一药物组合物、第一蛋白质分子、第二或第三药物组合物或第二或第三蛋白质分子，其中第二或第三蛋白质分子具有两个或更多个效应子部分(如毒素或免疫毒素)，其中两个或多个效应部分相同或不同。
示例性实施方案
一实施方案是本发明的内体逃逸增强缀合物，其中皂苷是在位置23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，并且其中皂苷优选是能够分离自霞草属(Gypsophila)或皂属(Saponaria)物种的皂苷，更优选皂苷是皂苷SO1861或其任何非对映异构体。
一实施方案是本发明的内体逃逸增强缀合物，其中结合位点是至少一个配体(如免疫球蛋白)，其上至少结合有一个效应子部分。
一实施方案是本发明的内体逃逸增强缀合物，其中结合位点是免疫球蛋白或其至少结合细胞表面分子的结合域，其中优选地，细胞表面分子选自以下中的任一种：HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD33、CD239、CD70、CD123、CD352、CD352、DLL3、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD71。
一实施方案是本发明的内体逃逸增强缀合物，其中连接子通过可裂解键与糖苷偶联，并且其中配体是免疫球蛋白，其中优选地，所述可裂解键在酸性、还原性、酶促或光下诱导条件经受裂解，优选可裂解键是共价键，优选亚胺键、腙键、肟键、1,3-二氧戊环键或酯键，其中优选可裂解键是二硫键或肽键。
一实施方案是本发明的内体逃逸增强缀合物，其中皂苷部分是末端皂苷，优选皂苷SO1861，连接子是将皂苷共价连接至第一蛋白质分子的结合位点的化学连接子，并且第一和第三蛋白质分子的相同的第一结合位点是免疫球蛋白(如曲妥珠单抗或西妥昔单抗)，连接子优选提供末端皂苷部分与第一和第三蛋白质分子所包含的第一结合位点之间的可裂解键。
一实施方案是根据本发明的内体逃逸增强缀合物(即第一蛋白质分子)和结合部分(即第二或第三蛋白质分子)的组合，其中结合部分包含至少一个效应子部分，其中内体逃逸增强缀合物和结合部分彼此独立地能够特异性结合靶细胞特异性表面分子或结构，从而诱导内体逃逸增强缀合物和靶细胞特异性表面分子的复合物以及结合部分和靶细胞特异性表面分子的复合物的受体介导的内吞作用。
一实施方案是根据本发明的组合，其中当结合部分是第三蛋白质分子时，内体逃逸增强缀合物和结合部分能够特异性结合相同的靶细胞特异性表面分子或结构。
一实施方案是根据本发明的组合，其中当结合部分是第三蛋白质分子时，内体逃逸增强缀合物能够与结合部分竞争结合靶细胞特异性表面分子或结构。
一实施方案是根据本发明的组合，其中内体逃逸增强缀合物和结合部分能够彼此独立地特异性结合相同表位。
一实施方案是根据本发明的组合，其中当结合部分是第三蛋白质分子时，内体逃逸增强缀合物能够特异性结合第一表位，其与结合部分能够特异性结合的第一表位相同。
一实施方案是根据本发明的组合，其中当结合部分是第二蛋白质分子时，内体逃逸增强缀合物和结合部分能够特异性结合不同的靶细胞特异性表面分子或结构。
一实施方案是根据本发明的组合，其中靶细胞特异性表面分子或结构选自：HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L、PSMA、CanAg、整联蛋白-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD33、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、HER3、CD74、PTK7、Notch3、F4GF2、FLT3、CD71。
一实施方案是根据本发明的组合，其中糖苷分子是双糖链三萜，优选皂苷。
一实施方案是根据本发明的组合，其中糖苷分子是双糖链三萜皂苷。
一实施方案是根据本发明的组合，其中皂苷是在位置23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷。
一实施方案是根据本发明的组合，其中皂苷是可以从霞草属(Gypsophila)或皂属(Saponaria)物种中分离的皂苷。
一实施方案是根据本发明的组合，其中皂苷是SO1861或其任何非对映异构体。
一实施方案是根据本发明的组合，其中至少一个糖苷通过可裂解键与配体(细胞表面分子上表位的结合位点)结合，其中优选地，所述可裂解键在酸性、还原性、酶促或光诱导条件条件下经受裂解，并且其中可裂解的键优选地是二硫键或肽键。
一实施方案是根据本发明的组合，其中可裂解键是共价键，优选亚胺键、腙键、肟键、1,3-二氧戊环键或酯键。
一实施方案是根据本发明的组合，其中内体逃逸增强缀合物包含限定数量的糖苷或限定范围。
一实施方案是根据本发明的组合，其中限定的范围为1-30个糖苷，优选为1-20个，更优选为1-10个，更优选为1-6个，更优选为2-6个，更优选2-5个，更优选3-5个，更优选3-4个糖苷。
一实施方案是根据本发明的组合，其中效应子部分是药学活性物质，诸如毒素(如蛋白质毒素)、药物、多肽或多核苷酸。
一实施方案是根据本发明的组合，其中靶细胞是患病细胞或疾病相关细胞，优选肿瘤细胞或肿瘤相关细胞(例如肿瘤血管细胞)，或免疫细胞(例如调节性T细胞)或自身免疫细胞。
一实施方案是根据本发明的组合，其中至少一个效应子部分通过可裂解键与结合部分(第二或第三蛋白质分子)结合，其中优选地，所述可裂解键在酸性、还原性、酶促或光诱导条件下经受裂解，和/或其中可裂解键是二硫键或肽键。
一实施方案是根据本发明的组合，其中糖苷(皂苷)能够增加效应分子的内体逃逸。
一实施方案是根据本发明的组合，用作药物。
一实施方案是包含根据本发明的组合(先前的实施方案)和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
一实施方案是根据本发明的药物组合物，其还包含至少一种另外的活性药物成分(如另外的免疫球蛋白)。
一实施方案是根据本发明使用的组合或根据本发明的药物组合物用于治疗癌症或自身免疫疾病的方法中。
一实施方案是根据本发明使用的组合，其中内体逃逸增强缀合物(第一蛋白质分子)和结合部分(第二或第三蛋白质分子)要伴随或顺序施用，优选伴随施用。
一实施方案是治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本发明的组合。
一实施方案是治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据本发明的药物组合物。
一实施方案是试剂盒，其包括含有根据本发明的内体逃逸增强缀合物的第一容器和含有根据本发明的结合部分的第二容器，所述试剂盒还包括使用结合分子的说明书。
第一蛋白质分子适合用作制造功能化ADC或功能化AOC的半成品，其中功能化ADC或功能化OAC包含至少一种本发明的共价偶联皂苷和至少一种本发明的效应子部分。一实施方案是本发明的第一蛋白质分子，其还包含直接或通过本发明的连接子，优选地本发明的可裂解连接子，和/或通过本发明的寡聚或多聚支架与本发明的第一蛋白质分子共价结合的本发明的有效载荷或效应子部分(如毒素或寡核苷酸)。例如，此类功能化的ADC或OAC包含直接地或通过(可裂解的)连接子与例如第一蛋白质分子(如配体或抗体(片段))中的半胱氨酸侧链共价偶联的2-4个皂苷，或包含例如包含与其结合的1-16个共价偶联的皂苷的树枝化基元，所述树枝化基元共价偶联例如根据本发明的第一蛋白质分子的半胱氨酸侧链和/或赖氨酸侧链。
通过以下实施例进一步说明本发明，不应将其解释为以任何方式限制本发明。
实施例
实施例A-用本发明的缀合物与ADC的组合治疗哺乳动物的荷瘤的动物导致存活和肿瘤消退
将人A431肿瘤细胞悬浮液皮下注射给雌性Balb/c裸鼠。在小鼠的皮肤下，异种移植动物肿瘤模型中形成了人类表皮癌。注射肿瘤细胞后，允许异种移植肿瘤发展到大约170-180mm3的大小。A431肿瘤细胞具有以下特征：EGFR高表达、CD71中表达、HER2低表达。
在表A中，呈现了对照小鼠和荷瘤小鼠的治疗结果。用针对异种移植肿瘤上的细胞表面受体的人Her2/neu、人EGFR或人CD71的指定抗体治疗荷瘤小鼠。西妥昔单抗与皂苷SO1861共价缀合。SO1861首先具有连接子EMCH(N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼)，其中EMCH是马来酰亚胺-酰肼交联剂，用于将巯基(抗体的还原半胱氨酸))与羰基(醛或酮；此处为皂苷的位置C-23处的醛的羰基)共价缀合。皂苷-EMCH与西妥昔单抗的还原半胱氨酸共价偶联，在EMCH和半胱氨酸侧链之间形成共价硫醚键。ADC曲妥珠单抗-皂草素(共价缀合物)和抗CD71mAb(OKT-9，IgG)-皂草素(共价缀合物)在小鼠中测试了它们的肿瘤攻击功效，测量为用ADC治疗开始后的随时间的肿瘤体。ADC的剂量在肿瘤模型中是次优的。即，根据之前的实验，确定在次优剂量的ADC下，不会观察到肿瘤消退或肿瘤生长停滞。
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这些结果表明，当考虑单独用ADC治疗荷瘤小鼠时无效的剂量的ADC组合治疗(肿瘤生长、小鼠的死亡没有被阻止(安乐死))，与本发明由与皂苷(即SO1861)共价结合的肿瘤细胞特异性受体靶向抗体组成，当单独施用时以非有效剂量向患有癌症的小鼠共价缀合物(肿瘤生长，未防止小鼠死亡预防(安乐死))，提供了有效且灵验的治疗方案，表现为肿瘤消退并延长处理动物的存活期(超过实验持续时间)。当单独施用时没有抗肿瘤活性的与本发明的共价结合的包含皂苷的缀合物组合的ADC的次优剂量，因此为癌症患者提供了有效的治疗选择，其中相对低剂量的ADC是有效。较低剂量的ADC有望降低不良事件的风险，甚至根本没有副作用。此外，当考虑ADC的功效时，本发明的含皂苷缀合物的刺激作用表明，先前已被证明在治疗肿瘤患者时缺乏功效的ADC可能会重新获得关注和价值，因为ADC正如当前的实施例所证明的那样，在组合疗法环境中的疗效得到了提高。参考表A2和表A3，总结了先前在人类临床环境中研究过的ADC，但后来针对一些从进一步临床研究中撤回的ADC。特别是由于观察到缺乏疗效和/或由于不可接受的不良事件的发生而终止临床开发的ADC是当与本发明的共价结合的包含皂苷的缀合物(如所测试的西妥昔单抗-皂苷)组合时可以获得对癌症患者的新价值的ADC。
实施例B–具有内体/溶酶体逃逸增强活性的包含QS-21的皂树皂苷混合物
方案I展现了一系列QS-21皂苷的常见分子结构(部分改编自：Conrado Pedebos、Laércio Pol-Fachin、Ramon Pons、Cilaine V.Teixeira Hugo Verli，Atomic Model andMicelle Dynamics of QS-21Saponin,Molecules 2014,19,3744-3760)。从皂皮树(Sigma-Aldrich，产品编号S4521；Roth，产品编号6857；InvivoGen，产品“Quil-A”)获得的水溶性皂苷的混合物可以被用于本发明的内体/溶酶体逃逸增强缀合物、组合物组合，基于混合物中存在的至少一种单独皂苷(例如QS-21)的内体/溶酶体逃逸增强性质，或基于混合物中所包含的两种或更多种皂苷的组合(如QS-21和QS-7)。
本发明的发明人证明，在基于细胞的生物测定中用哺乳动物肿瘤细胞进行测试时，2.5微克/ml剂量的皂树皂苷混合物能够增强石竹苷的内体逃逸。暴露于细胞的效应子部分是与配体EGF：EGF-石竹素共价偶联的石竹素。对于游离皂苷，所测试的细胞是肿瘤细胞系HeLa，A431、MDA-MB-468、CaSki和A2058用于测试共价偶联西妥昔单抗时的皂苷。
实施例1
在BT474(HER2++)异种移植小鼠模型中，测试了各种浓度的曲妥珠单抗-皂草素(HER2靶向蛋白质-毒素缀合物；静脉注射)与1.5mg/kg SO1861(抗体-毒素注射前1小时；皮下注射)组合的增强功效。当肿瘤大小达到约150mm3时，在第13天开始给药，并在每次处理后确定肿瘤体积。尽管在用1mg/kg和0.3mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素处理的小鼠中观察到肿瘤生长抑制，但在用曲妥珠单抗-皂草素+SO1861组合治疗的小鼠中未观察到增强的肿瘤生长抑制。这表明未缀合的SO1861无法在当前设置和小鼠模型中增强抗体-蛋白质毒素。
实施例2
材料：
QSmix(1)：S4521(Sigma Aldrich)；QSmix(2):6857.1(Carl Roth)QSmix(3):
Figure BDA0003222616810001191
佐剂：vac-quil(InvivoGen/Brenntag)。
以前，各种皂苷(SO1861、SO1642)的功效作为“游离”未缀合分子与配体毒素融合物(例如EGF石竹素)或抗体-蛋白质毒素缀合物合物组合共同施用至细胞，从而增强了表达靶标的细胞的细胞杀伤活性。在这里，在存在和不存在非有效固定浓度的1.5pM EGF石竹素的情况下，在HeLa(EGFR+)细胞上滴定了分离自肥皂草(Saponaria officinalis)的根提取物的三种不同的皂苷分子(SO1861、SO1862(SO1861的异构体)、SO1832和SO1904)。这揭示了与不含EGF石竹素的处理相比，所有测试的皂苷变体(IC50＝300nM；图2的A)的细胞杀伤活性的强烈增强。接下来，用固定浓度的皂苷(～1000nM)滴定EGF石竹素，这表明在低pM浓度的EGF石竹素(IC50＝0.4pM；图2的B)下有很强的靶向细胞杀伤增强作用，观察到所有使用的皂苷SO1861、SO1862(SO1861的异构体)、SO1832和SO1904。单独的EGF-石竹素只能在非常高的浓度(IC50＝10.000pM)下诱导细胞杀伤。这表明这些特定类型的皂苷都具有有效诱导内体逃逸的内在能力，只有非常少量的靶向毒素可用。
为了扩展该测试，分析了来自其它来源的皂苷。从缕丝花(Gypsophila elegansM.Bieb)的根提取物中纯化的皂苷(GE1741)在存在和不存在1.5pM的EGF石竹素的情况下在HeLa细胞上滴定，并与纯化的SO1861进行比较。GE1741还增强了EGFd石竹素诱导的HeLa细胞杀伤，但与SO1861相比，其功效略低。(GE1741 IC50＝800nM；图2的C)并且还展现出更高的一般毒性(在没有EGF石竹素的情况下IC50＝5.000nM；图1的C)。在类似的测试中，将不同部分纯化的皂树皂苷混合物(QSmix 1-3)与1.5pM的EGF石竹素共同施用至HeLa细胞上，这显示出3个(QSmix 1和QSmix 3)中的2个(QSmix 1和QSmix 3)具有与SO1861相似的活性(IC50 QSmix/QSmix3＝300nM；图1的D)。QSmix(2)在增强1.5pM的EGF石竹素诱导的细胞杀伤(IC50＝2000nM；图2的D)方面效率较低，但是，没有观察到一般毒性。这表明，同样在QS提取物中，可以使用特定类型的皂苷，其有效诱导靶向配体毒素EGF石竹素的内体逃逸。
实施例3
根据本发明，为了将SO1861分子与抗体缀合，不稳定/酸敏感连接子(-EMCH或-N3)通过醛基与SO1861缀合，产生SO1861-EMCH或SO1861-N3(图60-图66)。为了验证SO1861-EMCH的活性，在表达EGFR(A431、HeLa)和非表达细胞(A2058)上，在存在和不存在固定的无效(1.5pM)EGF石竹素浓度的情况下滴定分子。在所有三种细胞系中，单独的SO1861显示出强烈的细胞活力降低，而SO1861-EMCH作为单一化合物在高达25.000nM时没有表现出毒性(图3的A-C)。当SO1861-EMCH与1.5pM的EGF石竹素结合时，在EGFR+A431细胞和HeLa细胞中观察到强烈的靶标特异性细胞活力降低(IC50＝3.000nM；图2的A、B)，而EGFR-A2058细胞根本不受影响(图3的C)。SO1861-N3获得了类似的结果。SO1861-N3与1.5pM的EGF石竹素在A431细胞和HeLa细胞上的也显示了有效的细胞杀伤(IC50＝3.000nM)，但没有EGF石竹素，在10.000nM以上观察到一般毒性(图3的D、图2的E)。
对于根据本发的SO1861与抗体的稳定缀合物，稳定的连接子(HATU，图70)通过产生SO1861的SO1861-(S)的羧酸基团与SO1861缀合。为了确定活性，将不同浓度的SO1861-(S)与1.5pM的EGF石竹素共同施用，并在表达EGFR的HeLa细胞中测试细胞杀伤活性。SO1861-(S)显示出与SO1861相似的活性，这表明与羧酸的缀合不影响分子的内体逃逸增强效力，如用SO1861-EMCH所观察到的(图4)。
如图19中所示的，1靶标2-组分系统(1T2C)是mAb1-蛋白质毒素和mAb1-SO1861的组合处理。用DAR 4将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)缀合，并将HSP27BNA寡核苷酸通过赖氨酸残基与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)，导致产生2种缀合物：西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4和西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4。西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹腔施用，(ip))和西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4(静脉给药，(iv))的组合在A431异种移植小鼠肿瘤模型中进行了测试用于EGFR肿瘤靶向基因沉默活性。当肿瘤大小达到～150mm3时，在第12天开始给药，并在第一次给药后72小时收集肿瘤样本，并分析与对照基因mRNA表达水平(参考基因)相比的HSP27基因表达。这表明，与单次给药西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4或西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4单药治疗相比，1次给药50mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4+25mg/kg的西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4导致A431肿瘤中HSP27基因表达降低50％(图7)。与媒介物对照肿瘤相比，观察到40％HSP27基因沉默减少。这表明并使得西妥昔单抗缀合的SO1861+西妥昔单抗缀合的HSP27BNA寡核苷酸的组合，根据1T2C发明，诱导治疗性反义寡核苷酸在实体肿瘤细胞的细胞质中的有效靶向递送，从而诱导体内肿瘤靶向基因沉默。
接下来，SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别并结合人HER2的单克隆抗体)缀合，其中DAR 4导致产生曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4。曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和曲妥珠单抗-皂草素(曲妥珠单抗蛋白毒素缀合物)的组合在具有高HER2表达水平和对曲妥珠单抗单药疗耐药的小鼠肿瘤模型(患者来源的异种移植肿瘤模型，PDX)中进行了测试。与媒介物对照和40mg/kg的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或0.03/0.02mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素单一疗法相比，根据1T2C发明的40mg/kg曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹膜内施用，(ip))+0.03(第1、8天)/0.02(第15、22、30、36、43)mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素的组合(静脉内施用，(iv))显示出强烈的肿瘤生长抑制(图8)。此外，在用较低剂量组合(40mg/kg曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+0.01mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素)治疗的荷瘤小鼠中，未观察到肿瘤生长抑制活性(图8)。这表明并使得曲妥珠单抗缀合的SO1861+曲妥珠单抗缀合的蛋白质毒素的1T2C组合在实体瘤细胞的细胞质中诱导治疗性蛋白质毒素的有效靶向递送，从而在体内诱导肿瘤细胞死亡和肿瘤生长抑制。
1靶标2组分系统(1T2C)是mAb1-SO1861和mAb1-蛋白质毒素的组合处理(图19)
用DAR 3,7将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7)。在固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素(西妥昔单抗，缀合到蛋白质毒素，皂草素)对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达EGFR的细胞(A431，EGFR++；CaSKi,EGFR+)的细胞杀伤。这表明在低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7(A431:IC50＝0,6nM和Caski IC50＝1nM；图9的A、B)下具有强烈的细胞杀伤作用，而西妥昔单抗、西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7或西妥昔单抗+10pM的西妥昔单抗-皂草素不能在表达EGFR的细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明西妥昔单抗缀合的SO1861有效地增强了西妥昔单抗缀合的蛋白质毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导了表达EGFR的细胞的细胞杀伤。与这些细胞系中EGFR表达水平相关的CaSki相比，A431中的细胞杀伤活性更有效。当西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7浓度增加时，也观察到1T2C内两种缀合物之间的EGFR受体结合竞争，由于竞争受体结合和西妥昔单抗-皂草素的内化，细胞杀伤活性下降(图9的A、B)。
接下来，在固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7上对西妥昔单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对表达EGFR的细胞的杀伤。这表明，75nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7与低浓度西妥昔单抗-皂草素组合在表达EGFR的细胞中已经诱导有效的细胞杀伤(A431：IC50＝0.4pM；和CaSKi：IC50＝2pM；图9的C、D)，而单独的西妥昔单抗-皂草素或西妥昔单抗-皂草素+75nM的西妥昔单抗仅在高浓度的西妥昔单抗-皂草素(分别为IC50＝40pM，IC50＝1000pM)在两种细胞系中显示细胞杀伤(图9的C、D)。所有这些都表明，在高表达EGFR的细胞中，相对低浓度的西妥昔单抗-皂草素只有在与低西妥昔单抗-SO1861浓度组合才可以有效并诱导细胞杀伤。在西妥昔单抗-毒素滴定处理中，当比较西妥昔单抗-皂草素在有和没有75nM的西妥昔单抗的情况下的细胞杀伤活性时还观察到1T2C系统内两种缀合物之间的受体竞争(图9的C、D)。
接下来，在固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素上对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7进行了滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对低表达EGFR的细胞或无EGFR表达细胞(HeLa，EGFR+/-；A2058,EGFR-)的细胞杀伤。具有低(HeLa)或无(A2058)EGFR表达的细胞对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+10pM的西妥昔单抗-皂草素的任何组合都不敏感(HeLa：IC50>1000nM；A2058：IC50>1000nM；图10的A、B)。这表明在缺乏足够的EGFR受体表达的情况下，有效的细胞内递送的SO1861浓度不是诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤的最佳(阈值)。接下来，在固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7上对西妥昔单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向蛋白毒素介导的对低(HeLa)或无(A2058)EGFR表达细胞的杀伤作用。低EGFR表达细胞(HeLa)仅在高西妥昔单抗-皂草素浓度与75nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7组合时显示细胞杀伤(HeLa：IC50＝60pM)，图10的C)，而A2058细胞(EGFR-)在任何测试浓度下都不敏感(A2058：IC50>10.000pM；图10的D)。所有这些都表明低或无EGFR受体表达的细胞对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+西妥昔单抗-皂草素的组合不敏感，因为缺乏足够的EGFR受体来促进抗体介导的在内溶酶体隔室中递送足够的SO1861，以促进蛋白质毒素的逃逸。
接下来，SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别和结合人HER2的单克隆抗体，具有DAR 4，(曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)缀合。在固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素(曲妥珠单抗，缀合到蛋白质毒素，皂草素)上对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达HER2的细胞(SK-BR-3，HER2++)的细胞杀伤。这表明在低浓度曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4(SK-BR-3:IC50＝0.8nM；图11的A)下具有强细胞杀伤作用，而等效浓度的曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗+50pM的曲妥珠单抗-皂草素不能在表达HER2的细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明缀合SO1861的曲妥珠单抗有效地增强了曲妥珠单抗缀合的蛋白毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导了对表达HER2的细胞杀伤。当曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4浓度增加时，还观察到1T2C内的两缀合物之间的受体竞争，细胞杀伤活性由于竞争性受体结合和曲妥珠单抗-皂草素的内化而下降(图11的A)。
接下来，根据本发明，在固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4上对曲妥珠单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达HER2的细胞的细胞杀伤。这表明2,5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与低浓度曲妥珠单抗-皂草素组合在表达HER2的细胞中已经诱导有效的细胞杀伤(SK-BR-3：IC50＝2pM；图11的B)，而单独的曲妥珠单抗-皂草素或曲妥珠单抗-皂草素+2.5nM的曲妥珠单抗仅在高浓度曲妥珠单抗-皂草素下显示出细胞杀伤(图11的B)。所有这些都表明，相对低浓度的曲妥珠单抗-皂草素可以有效并且仅与低浓度的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4组合在高表达HER2的细胞中才能诱导细胞杀伤。
接下来，根据本发明，在固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素上对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对低表达HER2的细胞(A431 HER2+/-)或无HER2表达的细胞(JIMT-1：HER2+；MDA-MB-468：HER2-)的细胞杀伤。具有低表达或无HER2表达的细胞对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+50pM的曲妥珠单抗-皂草素的所有任何组合都不敏感(JIMT-1：IC50>1000nM；MDA-MB-468：IC50>1000nM；图13的A、B)。这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，有效的细胞内递送SO1861浓度不是诱导内体蛋白质毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤的最佳(阈值)。接下来，在固定浓度的2,5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4上对曲妥珠单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对低表达或不表达HER2细胞的细胞杀伤。低表达HER2的细胞(JIMT-1)仅在高曲妥珠单抗-皂草素浓度与2,5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4组合时才显示出细胞杀伤作用(JIMT-1：IC50>10.000pM；图13的C)，而MDA-MB-468细胞(HER2-)在任何测试浓度下都不敏感(MDA-MB-468：IC50>10.000pM；图13的D)。
所有这些都表明，由于缺乏足够的HER2受体来促进抗体介导的在内溶酶体区隔室中递送足够的SO1861，以促进蛋白质毒素的逃逸，具有低或无HER2受体表达的细胞对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+曲妥珠单抗-皂草素不敏感。
为了表明1T2C系统的活性由内溶酶体隔室的酸化驱动，根据本发明的1T2C系统与内体酸化抑制剂氯喹组合进行测试。将曲妥珠单抗-皂草素与5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4以及与氯喹组合或不组合一起滴定。曲妥珠单抗-皂草素5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4在高表达HER2的细胞(SK-BR-3、HER2++；IC50＝0.2pM；)中显示出很强的细胞杀伤活性，然而，曲妥珠单抗-皂草素+5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+0.5μM的氯喹导致SK-BR-3(HER2++)细胞中1T2C细胞杀伤活性的强烈抑制(IC50＝40pM)。这表明当内溶酶体的酸化被禁止时，缀合SO1861的抗体的活性降低/被阻断(图14的A)。与西妥昔单抗-皂草素+5nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8+0.5μM的氯喹(IC50＝200pM)在表达EGFR的细胞中(A431、EGFR++；图14的B)相比，用根据本发明的1T2C驱动了相同的结果。
如图20中所示的，1靶标2组分系统(1T2C)也可以是mAb1-SO1861和mAb1-反义BNA寡核苷酸的组合处理。为此，我们使用了针对癌症特异性靶基因mRNA的反义BNA寡核苷酸(在癌细胞中上调)、热休克蛋白27(HSP27)。释放到细胞质中后，反义BNA识别并结合编码HSP27的mRNA，靶向mRNA进行破坏，从而消耗癌细胞内的HSP27 mRNA的表达。根据本发明(图20)，用DAR4将HSP27BNA与西妥昔单抗缀合(西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4)，并与西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8组合测试以增强的在表达EGFR细胞中(A431,EGFR++)和非表达细胞(A2058，EGFR)中的HSP27基因沉默活性。西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8+100nM的西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4在表达EGFR的细胞中显示出强烈的HSP27基因沉默(A431：IC50＝nM，图15的A)，而西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8单独没有显示任何基因沉默活性。在A2058细胞(EGFR-)中，在1T2C组合中未观察到基因沉默活性(图15的B)。接下来，西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4+76.9nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8在表达EGFR的细胞中显示出强烈的HSP27基因沉默活性(A431：IC50＝4nM，图15的C)，而西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8或西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4+77nM的西妥昔单抗的组合未显示任何显著的基因沉默活性(IC50>100nM)。当在非表达EGFR的细胞(A2058)中进行实验时，在1T2C组合中未观察到基因沉默活性(IC50>100nM；图15的D)。所有这些都表明1T2C系统有效地将反义BNA寡核苷酸递送到高表达EGFR的细胞的细胞质，从而诱导BNA靶mRNA的mRNA降解，导致靶基因沉默。
如图21中所示的，1靶标2组分系统(1T2C)也可以是mAb1-(支架(-SO1861)n)n和mAb1-蛋白质毒素的组合处理。用DAR3,9将树枝化基元(-L-SO1861)4与通过半胱氨酸残基(Cys)与缀合的西妥昔单抗缀合，并且测试了西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9与抗EGFR抗体-蛋白质毒素缀合物(西妥昔单抗-皂草素)组合在表达EGFR的细胞(MDA-MB-468)中的增强的细胞杀伤活性。西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9+10pM的西妥昔单抗-皂草素在高表达EGFR的细胞中有效诱导毒素介导的细胞杀伤(IC50＝0.4nM；图16的A)，而这并未被通过西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9或西妥昔单抗+10pM的西妥昔单抗-皂草素或西妥昔单抗诱导(图16的A)。这表明根据1T2C发明，西妥昔单抗缀合的树枝化基元(-L-SO1861)4有效地增强了西妥昔单抗缀合的蛋白毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导高表达HER2细胞的细胞杀伤。类似的1T2C实验在表达低水平EGFR(HeLa,EGFR+/-)的细胞中进行，这表明当使用本发明的1T2C组合时没有细胞杀伤活性(IC50>100pM；图16的B)，这表明在缺乏足够的EGFR受体表达的情况下，有效的细胞内SO1861浓度不是诱导导致毒素介导的细胞杀伤的蛋白质毒素的细胞质递送的最佳(阈值)。
接下来，用DAR4将树枝化基元(-L-SO1861)4与抗HER2抗体曲妥珠单抗通过半胱氨酸缀合(Cys)缀合成曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4，并且测试了在与抗HER2抗体-蛋白质毒素缀合物(曲妥珠单抗-皂草素)组合时在表达HER2的细胞(SK-BR-3、HER2++)中的增强的细胞杀伤活性。曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+50pM的曲妥珠单抗-皂草素有效诱导毒素介导的细胞杀伤(IC50＝2nM，图16的C)，而这不是由曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基(-L-SO1861)4)4或曲妥珠单抗+50nM的曲妥珠单抗-皂草素或曲妥珠单抗(图16的C)诱导的。这表明曲妥珠单抗缀合的树枝化基元(-L-SO1861)4有效地增强了曲妥珠单抗缀合的蛋白质毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导高表达HER2的细胞的细胞杀伤。在表达低水平HER2(JIMT-1,HER2+/-)的细胞中进行的类似实验显示曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+50pM的曲妥珠单抗-皂草素无活性(IC50>200nM；图16的D)，这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，有效的细胞内SO1861浓度不是诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤的最佳(阈值)。
临床批准的ADC，曲妥珠单抗-emtansine(T-DM1)是抗Her2抗体、曲妥珠单抗和小分子毒素emtansine(DAR3.5)的缀合物。根据本发明，将T-DM1与曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4组合滴定并与抗体蛋白毒素缀合物曲妥珠单抗-皂草素+曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4进行比较。而曲妥珠单抗-皂草素+2.5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与单独的曲妥珠单抗-皂草素+2.5nM的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-皂草素相比显示出增强的活性(IC50＝2pM，图17)，T-DM1+25.6nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4没有显示出增强的细胞杀伤活性(IC50>100pM；图17)。这表明根据本发明的1T2C系统不能增强抗体小分子缀合物的递送，因为小分子已经可以被动地穿过(内溶酶体)膜。
1靶标2组分系统(1T2C)也可以是mAb1-QSmix(皂树皂苷的混合物)和mAb1-蛋白质毒素的组合处理。
用DAR 4.1将QSmix-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1。在固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂草素或10pM的西妥昔单抗-石竹素上对西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对A431(EGFR++)、CaSKi(EGFR+)和A2058(EGFR-)的细胞杀伤作用。这表明在A431(EGFR++)和CaSKi(EGFR+)细胞中，低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1+10pM西妥昔单抗-皂草素或10pM的西妥昔单抗-石竹素的强烈的细胞杀伤在(A431：IC50＝3nM，图18的A；CaSKi：IC 50＝1nM，图18的B)，而所有对照处理不能在表达EGFR的细胞中诱导任何细胞杀伤。根据本发明，在不表达EGFR(A2058；EGFR-)的细胞中，未观察到使用组合的HSP27基因沉默(IC50>1000nM；图18的C)。这表明西妥昔单抗缀合的QS21mix有效地增强了西妥昔单抗缀合的蛋白质毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而仅在表达EGFR的细胞中诱导细胞杀伤。
实施例4
用DAR3.9将不稳定的SO1861通过半胱氨酸残基(Cys)与抗EGFR抗体西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9)并测试其增强的反义BNA寡核苷酸导致增强的靶基因沉默。在这项研究中，我们使用了针对癌症特异性靶基因、热休克蛋白27(HSP27)mRNA的反义BNA寡核苷酸。在细胞的细胞质内，HSP27BNA结合编码HSP27的mRNA，靶向mRNA进行破坏，从而降低癌细胞内HSP27的表达。在EGFR++(A431)和EGFR-(A2058)细胞上，在固定浓度的100nM HSP27BNA上对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9进行滴定。根据本发明的组合在A431上显示出有效的HSP27沉默(IC50＝2nM；图5的A)，而单独的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9未观察到沉默。西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9+100nM的HSP27BNA在EGFR-细胞(A2058)中没有显示基因沉默活性(图5的B)。这表明低浓度的抗体缀合的SO1861可以有效地增强反义BNA寡核苷酸的细胞质递送和内溶酶体逃逸，从而在表达靶标的细胞中诱导有效的基因沉默。
接下来，在与固定浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9组合的EGFR++(A431)和EGFR-(A2058)细胞上对HSP27BNA进行滴定。这表明HSP27BNA与28.6nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9或77nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9组合非常有效地增强了A431细胞中的HSP27基因沉默(IC50＝10nM；图15的C)。HSP27BNA单独或与77nM的西妥昔单抗的固定等效物组合效率较低(IC50＝1.000nM；图12的C)。HSP27BNA+77nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.9的组合处理也在EGFR细胞(A2058)上进行了测试，并且这表明没有HSP27基因沉默增强(IC50＝1.000nM；图5的D)。这表明具有低或无EGFR受体表达的细胞对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+HSP27BNA的组合不敏感，而西妥昔单抗靶向的SO1861可以在高EGFR细胞中，在低浓度的非靶向HS27BNA下有效增强HSP27基因沉默。
接下来，用DAR 3,8将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合。根据本发明的组合，在A431异种移植‘裸’小鼠肿瘤模型中测试了西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8+HSP27BNA(反义HSP27BNA寡核苷酸靶向和诱导癌细胞中肿瘤靶标hsp27 mRNA的降解(基因沉默))用于EGFR介导的肿瘤靶向的HSP27基因沉默。当肿瘤大小达到～150mm3并确定HSP27 mRNA表达时，在第12天开始给药。为此，在第一次给药后72小时收集肿瘤样品并分析与细胞对照mRNA表达水平(参考基因)相比的HSP27基因表达水平。荷瘤小鼠(n＝3)在第12天接受处理(腹膜内；ip)：25mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8+25mg的HSP27BNA以及在第15天：25mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8+10mg的HSP27BNA，并且这表明与媒介物对照或单次给药25mg/kg的HSP27BNA相比，肿瘤中HSP27 mRNA的表达降低了25％(图6)。这显示并使得根据本发明，SO1861与靶向抗体的缀合有效地诱导SO1861介导的治疗性反义寡核苷酸在荷瘤小鼠实体瘤中增强的细胞质递送，诱导体内肿瘤靶向基因沉默。
DAR2与DAR4
用DAR3.7(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.7)或DAR2(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)2)将SO1861-EMCH(不稳定连接子，L)通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗缀合。测试了这些西妥昔单抗-SO1861缀合物与10pM的西妥昔单抗-皂草素组合对高表达EGFR的细胞(A431、EGFR++)的增强细胞杀伤活性。这揭示了西妥昔单抗缀合的SO1861、DAR2和DAR4具有相同的细胞杀伤效力(图22的A)。将曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)2.1与50pM的曲妥珠单抗皂草素组合用于高表达HER2细胞(SK-BR-3、HER2++)时进行比较，获得了相同的结果(图22的B)，这显示根据本发明降低缀合的SO1861的量降低有效内体逃逸和毒素介导的细胞杀伤的效力。
稳定与不稳定
用DAR3.7将SO1861-HATU(稳定连接子，S)通过半胱氨酸残基(Cys)与抗EGFR抗体西妥昔单抗缀合(西妥昔单抗-(Cys-S-SO1861)3.7)缀合。与不稳定缀合的(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3.7相比，这种西妥昔单抗-SO1861缀合物与固定浓度的10pM抗EGFR抗体-蛋白质毒素缀合物(西妥昔单抗-皂草素)组合，并测试了对高表达EGFR细胞(MDA-MB-468、EGFR++)的增强细胞杀伤活性。这表明根据本发明的稳定或不稳定的抗体缀合的SO1861在与非有效浓度的抗体-蛋白质毒素缀合物组合时，显示出相同的细胞杀伤活性(图23的A)。当曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与曲妥珠单抗-(Cys-S-SO1861)4和50pM的曲妥珠单抗-皂草素组合进行比较时，在SK-BR-3细胞(HER2++)中揭示了相同的数据(图23的B)。所有这些表明根据本发明的稳定或不稳定的缀合的SO1861有效地起作用，诱导抗体缀合的毒素的内体逃逸。
2靶标2组分系统(体内)
2靶标2组分系统(2T2C)是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白质毒素的组合处理(图37)。用DAR 4将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合，导致产生：西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4。如在图37中所示的，在A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+)异种移植‘裸’小鼠肿瘤模型中测试西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4和曲妥珠单抗-皂草素或CD71mab-皂草素的组合用于EGFR肿瘤靶向细胞杀伤。进行剂量递增以确定治疗功效(第9天：0.3mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素或0.1mg/kg的CD71mab-皂草素+5mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4；第14天,18:0.1mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素或0.05mg/kg的CD71mab-皂草素+5mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4；第21天：0.05mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素或0.05mg/kg的CD71mab-皂草素+15mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4；第28天：0.02mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素或0.02mg/kg的CD71mab-皂草素+15mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO18)4曲妥珠单抗-皂草素/西妥昔单抗-SO1861。对照分别采用相同的给药方案，仅西妥昔单抗(iv)每天给药25mg/kg)。在第32天(虚线)、第35天和第39天，我们开始组合根据25mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹腔注射(ip)+0.02mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素或0.02CD71mab-皂草素(静脉内给药，(iv)))的2T2C发明，并且与媒介物对照、25mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4或0.02mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素/CD71mab-皂草素单药疗法相比，这揭示出两2T2C组合组的强的肿瘤消退(图24)。2T2C系统甚至胜过西妥昔单抗，临床上使用的针对EGFR的单克隆抗体。接下来我们进行了相同的实验，但随后我们开始使用25mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4(腹腔注射(ip)+0.03mg/kg的曲妥珠单抗-皂草素或0.03CD71mab-皂草素(静脉内施用，(i.v.))处理，在第9天和第14天给药，然后每周给药1次。根据本发明的2T2C系统在所有小鼠中显示肿瘤消退，甚至在两个2T2C组中的1只小鼠中，完全根除肿瘤(肿瘤体积＝0mm3)(图25)。同样在这里，对照显示出肿瘤体积的强烈增加，而该A431小鼠模型的阳性对照，西妥昔单抗仅显示肿瘤生长抑制，但没有消退(图25)。这显示并实现了根据本发明的西妥昔单抗缀合的SO1861+曲妥珠单抗缀合的蛋白质毒素或CD71mab缀合的蛋白质毒素的2T2C系统方法在体内在荷瘤小鼠的实体瘤的细胞质中诱导治疗性蛋白质毒素的高效靶向递送，从而在一些小鼠中诱导甚至完全根除肿瘤，在其它小鼠中甚至在大尺寸肿瘤(2000mm3)中诱导强烈的肿瘤消退。
2靶标2组分系统(体外)
结果
2靶标2组分系统(2T2C)是mAb1-SO1861和mAb2-蛋白质毒素的组合处理(图37)。用DAR 3,7将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7)。如图37中所示的，用固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素(曲妥珠单抗，缀合到蛋白质毒素，皂草素)对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达EGFR/HER2的细胞(A431)，EGFR++/HER2+/-；CaSKi，EGFR+/HER2+/-)细胞的细胞杀伤。这表明在低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7下具有强细胞杀伤作用(A431：IC50＝3nM和CaSKi IC50＝10nM；图26的A、B)，而等效浓度的西妥昔单抗、西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7或西妥昔单抗+50pM的曲妥珠单抗-皂草素不能诱导表达EGFR/HER2的细胞中的任何细胞杀伤活性。这表明，相对低浓度的西妥昔单抗-SO1861缀合物有效地增强了曲妥珠单抗缀合的蛋白毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导了对高EGFR/低HER2表达细胞的有效细胞杀伤。
接下来，在固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7上对曲妥珠单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对表达EGFR/HER2细胞的杀伤作用。这表明75nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7与低浓度曲妥珠单抗-皂草素组合在表达的EGFR/HER2细胞中已经诱导有效的细胞杀伤(A431：IC50＝5pM；和CaSKi：IC50＝1pM；图26的C、D)，而单独的曲妥珠单抗-皂草素或曲妥珠单抗-皂草素+75nM西妥昔单抗在两种细胞系中均未显示显著的细胞杀伤活性(IC50>10.000pM)(图26的C、D)。所有这些都表明，在高EGFR/低HER2表达细胞中，相对低浓度的曲妥珠单抗-皂草素可以有效并与低西妥昔单抗-SO1861缀合物浓度组合诱导细胞杀伤。
接下来，如图37中所示的，在固定浓度的50pM曲妥珠单抗-皂草素上对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)或A2058(EGFR-/HER2+/-)的的细胞杀伤。HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞两者在低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+50pM的曲妥珠单抗-皂草素下没有显示细胞杀伤(HeLa：IC50＝400nM；A2058：IC50>400nM；图27的A、B)。这表明在没有足够的受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内递送的SO1861浓度(阈值)来诱导内体逃逸和蛋白质毒素的细胞质递送。接下来，在固定浓度的75nM西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7上对曲妥珠单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向蛋白毒素介导的对HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)或A2058(EGFR-/HER2+/-)的细胞杀伤。HeLa(EGFR+/-/HER2+/-)和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞均未显示细胞杀伤活性(HeLa：IC50>10.000pM；A2058：IC50>10.000pM；图27的C、D)。所有这些都表明EGFR受体表达低或无表达的细胞对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+曲妥珠单抗-皂草素的组合不敏感，因为缺乏足够的EGFR受体来促进抗体介导的递送足够的SO1861(阈值)以确保细胞质内毒素的内体逃逸。
接下来，用DAR 4将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别和结合人HER2的单克隆抗体)缀合(曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)。在固定浓度的1.5pM EGF石竹素(EGFR靶向的配体毒素融合蛋白)上对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达HER2/EGFR的细胞(SK-BR-3：HER2++/EGFR+/-)的细胞杀伤。这揭示了在低浓度曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+1.5pM的EGF石竹素(SK-BR-3:IC50＝1nM；图28的A)下的强细胞杀伤，而等效浓度的曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗+1.5pM的EGF石竹素不能在HER2++/EGFR+/-表达细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明曲妥珠单抗缀合的SO1861有效地增强了EGF融合蛋白毒素的内体逃逸(在非有效浓度下)，从而诱导高HER2/低EGFR表达细胞的细胞杀伤。
接下来，在固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4上对EGF石竹素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对表达SK-BR-3的细胞(HER2++/EGFR+/-)的细胞杀伤。这表明2.5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与低浓度EGF石竹素组合在表达HER2/EGFR的细胞中已经诱导有效的细胞杀伤(SK-BR-3：IC50＝1pM)(图28的B)，而单独的EGF石竹素或EGF石竹素+2.5nM的曲妥珠单抗没有显示出细胞杀伤活性(IC50>10.000pM)(图28的B)。所有这些都表明，相对低浓度的EGF石竹素可以有效并仅与低曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4浓度组合在高HER2/低EGFR表达细胞中诱导细胞杀伤。
接下来，在固定浓度的1.5pM EGF石竹素上对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)或MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++)的细胞杀伤。两种细胞系对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+1.5pM的EGF石竹素的任何组合都不敏感(JIMT-1：IC50>1000nM；MDA-MB-468：IC50>1000nM；图29的A、B)。这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内递送SO1861浓度(阈值)来诱导内体逃逸和蛋白质毒素的细胞质递送。
接下来，在固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4上EGF石竹素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)或MDA-MB-468细胞(HER2-/EGFR++)的细胞杀伤。无论是否含有2,5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4，两种细胞系均在高浓度EGF石竹素下显示出细胞杀伤作用(JIMT-1:IC50＝10.000pM；MDA-MB-468:IC50＝200pM图29的C、D)。
所有这些都表明HER2受体表达低或无表达的细胞对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,7+1.5pM的EGF石竹素的组合不敏感，因为缺乏足够的HER2受体来促进抗体介导的递送足够的SO1861(阈值)以确保细胞的细胞质内毒素的内体逃逸。
接下来，用DAR 4将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与曲妥珠单抗(识别和结合人HER2的单克隆抗体)缀合(曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4)。如图37中所示的，在固定浓度的5pM西妥昔单抗-皂草素(EGFR靶向的抗体-蛋白质毒素缀合物)上对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达HER2/EGFR的细胞(SK-BR-3：HER2++/EGFR+/-)的细胞杀伤。这表明在低浓度曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+5pM西妥昔单抗-皂草素下的强的细胞杀伤(SK-BR-3：IC50＝1nM；图30的A)，而等效浓度的曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4或曲妥珠单抗+5pM的西妥昔单抗-皂草素不能在表达HER2++/EGFR+/-的细胞中诱导任何细胞杀伤活性。这表明曲妥珠单抗缀合的SO1861有效地增强了西妥昔单抗缀合的蛋白质毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导了对表达HER2++/EGFR+/-细胞的细胞杀伤。
接下来，在固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4和75nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4上对西妥昔单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对表达HER2/EGFR(SK-BR-3：HER2++/EGFR+/-)细胞的细胞杀伤。这表明2.5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4与低浓度的西妥昔单抗-皂草素组合在SK-BR-3细胞中已经诱导有效的细胞杀伤(SK-BR-3：IC50＝1pM；图30的B)，而单独的西妥昔单抗-皂草素或西妥昔单抗-皂草素+2.5nM曲妥珠单抗仅在高浓度曲妥珠单抗-皂草素显示细胞杀伤(SK-BR-3：IC50>4000pM；图30的B)。所有这些都表明，相对低浓度的西妥昔单抗-皂草素可以有效并仅与低浓度曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4组合在表达HER2++/EGFR+/-的细胞中诱导细胞杀伤。
接下来，在固定浓度的5pM西妥昔单抗皂草素上对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)和MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)细胞的细胞杀伤。两种细胞系都对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+5pM的西妥昔单抗-皂草素的组合不敏感(JIMT-1：IC50>1000nM；MDA-MB-468：IC50>1000nM；图31的A、B)。这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内递送SO1861浓度(阈值)来诱导内体逃逸和蛋白质毒素的细胞质递送。
接下来，在固定浓度的2.5nM曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4对西妥昔单抗-皂草素进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对JIMT-1(HER2+/-/EGFR+/-)和MDA-MB-468(HER2-/EGFR++)细胞的细胞杀伤。无论是否含有2.5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4，两种细胞系在相似的西妥昔单抗-皂草素浓度下显示出细胞杀伤(JIMT-1：IC50＝80pM；MDA-MB-468：IC50＝100pM；图31的C、D)。
所有这些都表明，由于缺乏足够的HER2受体来促进抗体介导的足够的SO1861(阈值)以确保细胞的细胞质内毒素的内体逃，具有低或无HER2受体表达的细胞对曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+西妥昔单抗-皂草素不敏感。
为了表明缀合的SO1861的活性是由内体隔室的酸化驱动的，根据本发明的2T2组分系统与内体酸化抑制剂氯喹组合进行了测试。曲妥珠单抗-皂草素+77nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9或曲妥珠单抗-石竹素+77nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9在A431(EGFR++/HER2+/-)细胞中显示出强大的细胞杀伤活性，而根据本发明，当800nM的氯喹与两种组合共同施用时，这种2T2C活性被抑制(图32的A)。在A431(EGFR++/CD71+)和MDA-MB-468(EGFR++/CD71+)细胞中测试CD71mab-皂草素+10.5nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+500nM的氯喹时(图32的B、图9的C)，或当CD71mab-皂草素+5nM的曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)4+500nM的氯喹在SK-BR-3(HER2++/CD71+)细胞中测试时(图32的D)，观察到相同的结果。这表明当内体的酸化被阻断时，2T2C系统中缀合的SO1861的细胞内活性可以被抑制。
2靶标2组分系统(2T2C)也是mAb1-SO1861和mAb2-反义BNA寡核苷酸的组合处理(图38)。因此，还与针对癌症特异性靶基因热休克蛋白27(HSP27)的mRNA的反义BNA寡核苷酸组合对2T2C系统进行了测试。释放到细胞质中后，反义BNA识别并结合编码HSP27的mRNA，靶向mRNA进行破坏，从而消耗癌细胞内的HSP27表达。如图38中所示的，用DAR4.4将HSP27BNA与曲妥珠单抗缀合(曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4)，并且与西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9组合测试用于增强A431(EGFR++/HER2+/-)细胞和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞中的HSP27基因沉默活性。在固定浓度的100nM的曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4上对西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9进行滴定，并且确定了靶向的HSP27BNA介导的基因沉默活性。与单独的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9相比，西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9+100nM的曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4在A431细胞(EGFR++/HER2+/-)中显示出很强的基因沉默活性(A431：IC50＝1nM；图33的A)。在A2058细胞(EGFR-/HER2+/-)中，根据本发明的组合没有显示出HSP27基因沉默(A2058：IC50>100nM；图33的B)。这表明西妥昔单抗缀合的SO1861有效地增强了曲妥珠单抗缀合的BNA寡核苷酸(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而在表达EGFR++/HER2+/-的细胞中诱导靶基因沉默。
接下来，如图38中所示的，在固定浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9上对曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4进行滴定，并且确定了在A431(EGFR++/HER2+/-)细胞和A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞中靶向的HSP27BNA介导的基因沉默活性。曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4+77nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9在A431(EGFR++/HER2+/-)显示强的基因沉默活性(A431:IC50＝1nM；图33的C)，而单独的曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4或的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9或曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4+77nM的西妥昔单抗未显示任何显著的基因沉默活性(IC50>100nM)。A2058(EGFR-/HER2+/-)细胞在根据本发明的组合中没有显示任何基因沉默活性(A2058：IC50>100nM；图33的D)。所有这些都表明，相对低浓度的曲妥珠单抗-HSP27BNA可以有效并仅与低浓度的西妥昔单抗-(-L-SO1861)组合在表达HER2++/EGFR+/-的细胞中诱导细胞杀伤。
2靶标2组分系统(2T2C)也可以是mAb1-(树枝化基元(-SO1861)n)n和mAb2-蛋白质毒素的组合处理(图39)。如图39中所示的，用DAR3,9将树枝化基元(-L-SO1861)4与抗EGFR抗体西妥昔单抗通过半胱氨酸残基(Cys)缀合(西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9)，并且在表达MDA-MB-468(EGFR++/CD71+)的细胞中测试了与抗CD71抗体蛋白毒素缀合物(CD71mab-皂草素)组合的增强的细胞杀伤活性。西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9)+10pM的CD71mab-皂草素在表达MDA-MB-468(EGFR++/CD71+)的细胞中有效诱导毒素介导的细胞杀伤(IC50＝0.4nM，图34的A)，而这不能被通过西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9)或西妥昔单抗+10pM的CD71mab-皂草素或西妥昔单抗诱导(图34的A)。这表明西妥昔单抗缀合的树枝化基元(-L-SO1861)4有效地增强了CD71mab蛋白毒素的内体逃逸(在非有效浓度下)，从而诱导细胞杀伤表达EGFR++/CD71+的细胞。在HeLa细胞(HER2+/-/CD71+)细胞中进行了类似的实验，并且结果表明没有西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9)+10pM的CD71mab-皂草素的活性(IC50>100nM，图34的B)，这表明在缺乏足够的EGFR受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体逃逸和蛋白质毒素的细胞质递送。
接下来，用DAR4将树枝化基元(-L-SO1861)4与抗HER2抗体曲妥珠单抗通过半胱氨酸缀合(Cys)，并且测试了trastuzumab-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4并在表达SK-BR-3细胞(HER2++/CD71+)细胞中测试与抗CD71抗体蛋白毒素缀合联物(CD71mab-皂草素)组合的增强的细胞杀伤活性。曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+10pM的CD71mab-皂草素在SK-BR3细胞中有效诱导毒素介导的细胞杀伤(IC50＝3nM，图34的C)，而这不是由曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4或曲妥珠单抗(等价物)+10pM的CD71mab-皂草素或曲妥珠单抗诱导的(图34的C)。这表明根据本发明的曲妥珠单抗缀合的树枝化基元(-L-SO1861)4有效地增强了CD71mab-蛋白毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导了表达HER2++/CD71+的细胞的细胞杀伤。在JIMT-1细胞(HER2+/-/CD71+)中进行了类似的实验，这表明没有曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+10pM的CD71mab-皂草素的活性(IC50>100nM，图34的C)，这表明在缺乏足够的HER2受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体逃逸和蛋白质毒素的细胞质递送。
临床批准的ADC，曲妥珠单抗-emtansine(T-DM1)是抗Her2抗体、曲妥珠单抗和小分子毒素emtansine(DAR3-4)的缀合物。根据本发明，在2T2C系统内与西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)4组合测试T-DM1。与单独的T-DM1或T-DM1+77nM的西妥昔单抗相比，T-DM1+77nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9没有显示出增强的细胞杀伤活性(IC50＝80.000pM，图35)，而根据本发明，与单独的曲妥珠单抗-皂草素+75nM的西妥昔单抗或曲妥珠单抗-皂草素相比，曲妥珠单抗-皂草素+75nM的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7显示出增强的细胞杀伤活性(IC50＝3pM，图35)。所有这些都表明2T2C系统不会增强抗体缀合的小分子的递送，这些小分子已经能够被动穿过细胞(内体)膜。
结果
2靶标2组分系统(1T2C)也可以是mAb1-QSmix(来自皂皮树的皂苷的混合物)和mAb2-蛋白质毒素的组合处理。
用DAR4,1将QSmix-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1)。在固定浓度的10pM曲妥珠单抗-皂草素或CD71mab-皂草素上对西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1进行滴定，并且确定了靶向的蛋白质毒素介导的对A431(EGFR++/HER2+/-/CD71+)和CaSKi(EGFR+/HER2+/-/CD71+)细胞杀伤。这表明在低浓度的西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1+10pM的曲妥珠单抗-皂草素下强的细胞杀伤(A431：IC50＝100nM；图36的A CaSKi：IC50＝10nM图36的B)，以及与西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1+10pM的CD71mab-皂草素(A431：IC50＝3nM，图36的A；CaSKi：IC50＝0.8nM，图36的B)，而西妥昔单抗、西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1或西妥昔单抗+10pM的曲妥珠单抗-皂草素或西妥昔单抗+10pM的CD71mab-皂草素不能在表达EGFR++/HER2+/-/CD71+或EGFR+/HER2+/-/CD71+的细胞中诱导任何细胞杀伤。这表明相对低浓度的西妥昔单抗-Qsmix缀合物有效地增强了曲妥珠单抗缀合的蛋白质毒素以及CD71mab缀合的蛋白毒素(在非有效浓度下)的内体逃逸，从而诱导了表达EGFR++/HER2+/-/CD71+或EGFR+/HER2+/-/CD71+细的有效细胞杀伤胞。当对A2058细胞(EGFR-/HER2+/-/CD71+)进行相同实验时，西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1+10pM的曲妥珠单抗-皂草素或西妥昔单抗-(Cys-L-QSmix)4,1+10pM的CD71mab-皂草素没有可以观察到的活性(图36的C)，这表明在缺乏足够的EGFR受体表达的情况下，未达到有效的细胞内递送QS皂苷浓度(阈值)以诱导内体逃逸和蛋白质毒素的细胞质递送。
实施例5
SO1861通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(不稳定)和石竹素(蛋白质毒素)通过赖氨酸残基(Lys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(稳定)，从而产生：西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2。如图47中所示的，在A431(EGFR++)异种移植小鼠肿瘤模型中测试了缀合物的EGFR肿瘤靶向细胞杀伤。当时肿瘤大小达到～150mm3时，在第12天开始给药，并在每次给药后确定肿瘤体积。小鼠如下处理(腹膜内；ip；剂量递增)：在第12天：0.5mg/kg；第15天：1mg/kg和第24天：1.5mg/kg与西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2或西妥昔单抗-(Lys-S-石竹素)1,6。在第26天，与对照组相比，在用西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2处理的荷瘤小鼠中可以观察到肿瘤体积减少(图40的A)。这表明SO1861与抗体-蛋白质毒素(稳定)缀合物的不稳定缀合可以增强肿瘤靶向的抗体-蛋白质毒素的靶向治疗功效，从而诱导更有效的肿瘤靶向治疗。
接下来，SO1861通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(不稳定)和石竹素(蛋白质毒素)通过赖氨酸残基(Lys)结合与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合(不稳定)，从而产生：西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-石竹素)2。如图47中所示的，在A431(EGFR++)异种移植小鼠肿瘤模型中测试了缀合物的EGFR肿瘤靶向细胞杀伤。当时肿瘤大小达到～150mm3时，在第12天开始给药，并在每次给药后确定肿瘤体积。小鼠如下处理(腹膜内；ip；剂量递增)：在第12天：0.5mg/kg；第15天：1mg/kg，第24天：1.5mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2或西妥昔单抗-(Lys-S-石竹素)1,6。这表明，与对照相比，35天后，用西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2处理的荷瘤小鼠显示出肿瘤生长抑制(图40的B)。当小鼠(n＝3；接受(静脉内，静脉注射；剂量递增)在第12天：0.5mg/kg；第15天：1mg/kg，第18天：2mg/kg，第24天：2.5mg/kg的根据本发明的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2，与对照(数据代表1只小鼠，因为2只小鼠在处理期间死亡)相比还可以观察到肿瘤生长抑制。这表明SO1861与抗体-蛋白质毒素(不稳定)缀合物的不稳定缀合可增强肿瘤靶向抗体-蛋白质毒素的靶向治疗功效，从而诱导更有效的肿瘤靶向治疗。
接下来，用DAR 3,9将SO1861-EMCH通过半胱氨酸残基(Cys)与西妥昔单抗(识别和结合人EGFR的单克隆抗体)缀合，并且用DAR1,8将反义HSP27BNA寡核苷酸(在癌细胞中靶向并诱导肿瘤靶标hsp27 mRNA的降解(基因沉默))通过不稳定的(L)连接子连接到抗体的赖氨酸残基(Lys)，导致产生西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8。根据本发明，如在图48中所示的，在A431异种移植‘裸’小鼠肿瘤模型中测试了西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8的EGFR介导的肿瘤靶向的HSP27基因沉默。当时肿瘤大小达到～150mm3时，在第12天开始给药，并确定HSP27 mRNA的表达。为此，在第一次给药后72小时收集肿瘤样品，并分析与细胞对照mRNA表达水平(参考基因)相比的HSP27基因表达水平。用30mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-HSP27BNA)1,8处理的(腹膜内；i.p.)的荷瘤小鼠(n＝3)显示在1次给药后，与单次给药西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8或西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)1,5相比，肿瘤中的HSP27 mRNA表达减少40％(图41)。与媒介物对照的肿瘤相比，观察到25％的HSP27基因表达降低。这表明并使得根据本发明，SO1861和HSP27BNA与相同靶向抗体的缀合有效诱导SO1861介导的治疗性反义寡核苷酸在荷瘤小鼠实体瘤中增强的细胞质递送，诱导肿瘤靶向基因沉默。
在另一实例中，设计并产生了具有3个特定化学端基的三功能连接子支架，用于与一个臂上的SO1861和另一臂上的HSP27BNA缀合，以产生SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA。接下来，根据本发明，如图49中所示的，SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA与其第三臂缀合至抗EGFR抗体西妥昔单抗的半胱氨酸残基(Cys)(西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7)，并在A431异种移植‘裸’小鼠肿瘤模型中测试EGFR介导的肿瘤靶向基因沉默活性。当时肿瘤大小达到～150mm3时，在第12天开始给药，并确定HSP27mRNA表达。为此，在第一次给药后72小时收集肿瘤样品并分析与细胞对照mRNA表达水平(参考基因)相比的HSP27基因表达水平。这表明，与单次给药25mg/kg的西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8或25mg/kg的西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4单一疗法相比，1次给药30mg/kg的西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7导致肿瘤中HSP27基因表达降低40％(图42)。与媒介物对照肿瘤相比，在用1剂西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7处理的荷瘤小鼠中观察到HSP27基因表达降低25％。这表明并使得西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7在荷瘤小鼠实体瘤中有效诱导SO1861介导的治疗性反义寡核苷酸的增强细胞质递送，诱导体内靶向基因沉默。
在根据本发明的另一实施例中，SO1861(不稳定)和蛋白质毒素、石竹素(不稳定或稳定)与HER2靶向抗体曲妥珠单抗缀合。如图47中所示的，生产并测试了曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-石竹素)1,7或曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-石竹素)1,7用于增强SK-BR-3(HER2++)和MDA-MB-468(HER2-)细胞中的细胞杀伤。曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-石竹素)1,7(IC50＝0,8nM)和曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-石竹素)1,7(IC50＝0,8nM)有效诱导SK-BR-3细胞(HER2++)的细胞杀伤(图43的A)。这在用曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-(Lys-L-石竹素)1,7、曲妥珠单抗-(Lys-S-石竹素)1,7或曲妥珠单抗-(L-SO1861)3,8单独处理的SK-BR-3细胞中未观察到(图43的A)。根据本发明，在MDA-MB-468细胞(HER2-)中没有观察到任何缀合物的细胞杀伤活性(图43的B)。这表明SO1861与靶向HER的抗体-蛋白质毒素缀合物的缀合有效地诱导了SO1861介导的蛋白质毒素在靶细胞中的增强细胞质递送，导致靶细胞死亡。
在根据本发明的另一实施例中，SO1861(不稳定)和蛋白质毒素、石竹素(不稳定或稳定)与靶向EGFR的抗体西妥昔单抗缀合。如图47中所示的，测试西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-石竹素)2或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-S-石竹素)2在A431(EGFR++)和A2058细胞(EGFR-)中增强的细胞杀伤细胞。与单独的西妥昔单抗-(Lys-L-石竹素)1,6(IC50＝2pM)、西妥昔单抗-(Lys-S-石竹素)1,6(IC5＝2pM)相比，西妥昔单抗(Cys-L-SO1861)3,9(Lys-L-石竹素)2(IC50＝0,3nM)与西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-S-石竹素)1,7在A431细胞(EGFR++)中显示出增强的细胞杀伤(图43的C)。在A2058细胞(EGFR-)中，根据本发明的组合没有显示任何细胞杀伤活性(IC50>200nM；图43的D)。这表明SO1861与靶向EGFR的抗体-蛋白质毒素缀合物的缀合有效地增强了SO1861介导的蛋白质毒素在靶细胞中的细胞质递送，导致靶细胞死亡增强。
在根据本发明的另一实施例中，SO1861(不稳定)和HSP27BNA寡核苷酸(不稳定)与靶向EGFR的抗体西妥昔单抗缀合。根据本发明，如在图48中所示的，测试西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8在A431细胞(EGFR++)和A2058(EGFR-)细胞中增强的HSP27基因沉默。与单独的西妥昔单抗、西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)3,9或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8相比，西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8在A431细胞中有效诱导HSP27基因沉默(IC50＝3nM)(图44的A)。在A2058细胞(EGFR-)中，用西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,8未观察到基因沉默活性(IC50>100nM；图44的B)。这表明并使得根据本发明，SO1861和HSP27BNA与相同靶向抗体的缀合有效诱导靶细胞中治疗性反义寡核苷酸的SO1861介导的增强的细胞质递送，诱导靶向基因沉默。
在根据本发明的另一实施例中，SO1861(不稳定)和HSP27BNA寡核苷酸(不稳定)与靶向HER2抗体曲妥珠单抗缀合。如图48中所示的，根据本发明，测试曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5在SK-BR-3细胞(HER2++)细胞中增强的HSP27基因沉默。与单独的曲妥珠单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4,4相比，曲妥珠单抗-(Cys-L-SO1861)3,8(Lys-L-HSP27BNA)3,5在SK-BR-3细胞中有效诱导HSP27基因沉默(图45)。这表明并使得根据本发明的SO1861和HSP27BNA与靶向HER2的抗体的缀合有效地诱导SO1861介导的治疗性反义寡核苷酸在靶细胞中增强的细胞质递送，诱导靶向基因沉默。
在另一实施例中，如图49中所示的，根据本发明，测试了西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7在A431(EGFR++)和A2058(EGFR-)细胞中增强的HSP27基因沉默。与单独的西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4或西妥昔单抗-(西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,7(图46的A)相比，西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7在A431中有效诱导HSP27的基因沉默。在A2058细胞(EGFR-)中，仅在高(>80nM)浓度的西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7下观察到基因沉默活性(IC50＝100nM；图46的B)。这表明并使得在高表达EGFR的细胞中，西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7有效诱导SO1861介导的治疗性反义寡核苷酸在靶细胞中增强的细胞质递送，诱导靶向基因沉默。
实施例6
图50的A-D显示了当曲妥珠单抗(图50的A)、西妥昔单抗(图50的B)或T-DM1(图50的C)、未缀合的蛋白质毒素、皂草素、石竹素和皂草素与(非细胞结合)IgG抗体(图50的D)缀合时，施用于各种癌细胞系SK-BR-3、JIMT-1、MDA-MB-468、A431、CaSki、HeLa、A2058的相对细胞活力。
曲妥珠单抗和西妥昔单抗暴露于大多数细胞系时不影响或几乎不影响细胞活力，当曲妥珠单抗暴露于SK-BR-3细胞时，通过阻断HER2生长因子受体的功能对细胞生长抑制产生一些影响，当西妥昔单抗暴露于相对高剂量的MDA-MB-468细胞时，通过阻断EGFR生长因子受体的功能，对细胞生长抑制产生一些影响。
TDM-1或ado-曲妥珠单抗emtansine，是美国食品和药物管理局(U.S.Food andDrug Administration)批准的靶向疗法，用于治疗：HER2阳性转移性乳腺癌，此前曾接受赫赛汀(化学名称：曲妥珠单抗)和紫杉烷化疗；如果在使用赫赛汀和紫杉烷化疗进行新辅助(手术前)治疗后发现残留病灶，则为手术后早期HER2阳性乳腺癌。TDM-1是赫赛汀(曲妥珠单抗)和化疗药物emtansine的组合。图8的C显示TDM-1导致在>1000pM浓度下测试的所有细胞系的细胞活力降低。
游离毒素皂草素和石竹素以及与对照IgG偶联的毒素皂草素对所测试细胞系上的任何细胞表面分子没有亲和力，在很宽的测试毒素浓度范围内，高达100.000pM，对细胞活力没有或几乎没有任何影响，(图50的D)。
实施例7
树枝化基元(-L-SO1861)n的合成(图52、图53、图54)
材料和方法
缩写
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EDCI.HCl 3-((乙胺基)亚甲基氨基)-N,N-二甲基丙烷-1-氯化铵
EMCH.TFA N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼，三氟乙酸盐
min 分钟
r.t. 保留时间
TCEP 三(2-羧乙基)膦盐酸盐
Temp 温度
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
分析方法
LC-MS方法1,1
仪器：Agilent1200 Bin。泵：G1312A，脱气机；自动进样器，ColCom，DAD：AgilentG1316A，210、220和220-320nm，PDA：210-320nm，MSD：Agilent LC/MSD G6130B ESI，pos/neg100-1000；ELSD Alltech 3300气体流量1.5ml/min，气体温度：40℃；柱子：WatersXSelectTM CSH C18，30×2.1mm，3.5μm，温度：35℃，流量：1mL/min，梯度：t0＝5％A，t1.6min＝98％A，t3min＝98％A，后置时间：1.3min，洗脱液A：含0.1％甲酸的乙腈，洗脱液B：含0.1％甲酸的水。
LC-MS方法2，2
仪器：Agilent 1260Bin。泵：G7112B，多重进样器，柱补偿器，DAD：安捷伦G7115A，210、220和220-320nm，PDA：210-320nm，MSD：安捷伦LC/MSD G6130B ESI，质量范围取决于产物的分子量：
Apos/neg 100-1000
Bpos/neg 100-1400
ELSD Alltech 3300气体流量1.5ml/min，气体温度：40℃；柱：Waters XSelectTMC18，30×2.1mm，3.5μm，温度：40℃，流量：1mL/min，梯度：t0＝5％A，t1.6min＝98％A，t3min＝98％A，后置时间：1.3min钟，洗脱液A：含0.1％甲酸的乙腈，洗脱液B：含0.1％甲酸的水。
LC-MS方法3，3
仪器：Waters IClass；Bin。泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA:UPPDATC,210-320nm,SQD:ACQ-SQD2 ESI,pos/neg800-1500；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm，温度：25℃，流量：0.6mL/min，梯度：t0＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3min，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：含10mM碳酸氢铵的水(pH＝9.5)。
LC-MS方法4，4
仪器：Waters IClass；Bin。泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA,PDA:UPPDATC,210-320nm，SQD:ACQ-SQD2 ESI,pos/neg1500-2500；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm温度：25℃，流量：0.6mL/min，梯度：t0＝15％A，t2.0min＝60％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3min，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：含10mM碳酸氢铵的水(pH＝9.5)。
LC-MS方法5，5
仪器：Waters IClass；Bin。泵：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：
Apos/neg 1500-2500
Bneg 2000-3000
ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：Acquity C18，50×2.1mm，1.7μm温度：60℃，流量：0.6mL/min，梯度：t0＝2％A，t5.0min＝50％A，t6.0min＝98％A，后置时间：1.0min，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：含10mM碳酸氢铵的水(pH＝9.5)。
制备方法
制备型MP-LC方法1,1
仪器类型：RevelerisTMprep MPLC；柱：Waters XSelectTM CSH C18(145×25mm，10μ)；流量：40mL/min；柱温：室温；洗脱液A：含10mM碳酸氢铵的水pH＝9.0)；洗脱液B：99％乙腈+含1％10mM碳酸氢铵的水；梯度：t0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B；检测UV：210、225、285nm。
制备型MP-LC方法2,2
仪器类型：RevelerisTMprep MPLC；柱：Phenomenex LUNA C18(3)(150×25mm,10μ)；流量：40mL/min；柱温：室温；洗脱液A：含0.1％(v/v)甲酸的水，洗脱液B：含0.1％(v/v)甲酸的乙腈；梯度：t0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B；检测UV：210、225、285nm。
制备型LC-MS方法1,3
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B四极杆；HPLC仪器类型：AgilentTechnologies 1290制备型LC；柱：Waters XSelectTM CSH(C18,100×30mm,10μ)；流量：25ml/min；柱温：室温；洗脱液A：100％乙腈；洗脱液B：含10mM碳酸氢铵的水pH＝9.0；lin.梯度取决于产物的极性：
At0＝20％A，t2min＝20％A，t8.5min＝60％A，t10min＝100％A，t13min＝100％A
Bt0＝5％A，t2min＝5％A，t8.5min＝40％A，t10min＝100％A，t13min＝100％A
Ct0＝10％A，t2min＝10％A，t8.5min＝50％A，t10min＝100％A，t13min＝100％A
检测：DAD(220-320nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100–800；基于DAD的级分收集。
制备型LC-MS方法2,4
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B四极杆；HPLC仪器类型：AgilentTechnologies 1290制备型LC；柱：Waters XBridge Shield(C18,150×19mm,5μ)；流量：25ml/min；柱温：室温；洗脱液A：100％乙腈；洗脱液B：含10mM碳酸氢铵的水pH＝9.0；lin.梯度：t0＝5％A，t2.5min＝5％A，t11min＝40％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A；检测：DAD(220-320nm)；检测：MSD(ESI pos/neg)质量范围：100–800；基于级分收集的DAD
快速色谱
Grace Reveleris
Figure BDA0003222616810001481
C-815闪光灯；溶剂递送系统：具有自动预注的3活塞泵，4个独立通道，单次运行最多可输送4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管线；最大泵流速250mL/min；最大压力50巴(725psi)；检测：UV 200-400nm，组合多达4个UV信号并扫描整个UV范围，ELSD；柱尺寸：仪器上4-330g，鲁尔接口类型，750g至3000g(具有任选支架)。
SO1861-EMCH的合成(图52)
向SO1861(121mg，0.065mmol)和EMCH.TFA(110mg，0.325mmol)中加入甲醇(超干，3.00mL)和TFA(0.020mL,0.260mmol)。反应混合物在室温下搅拌。1.5小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC1。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：2069[M-1]1-
LC-MSr.t.(min):1.084
树枝化基元(-L-SO1861)4的合成(图53)
中间体1：
二叔丁基(((6-叠氮己酰基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸酯
将6-叠氮己酸(0.943g，6.00mmol)、EDCI.HCl(1.21g，6.30mmol)和Oxyma Pure(0.938g，6.60mmol)溶解在DMF(10.0mL)中并将混合物搅拌5min。接着加入含二叔丁基(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基))二氨基甲酸酯(1.82g，6.00mmol)的DMF(5.00mL)溶液并将反应混合物在室温下搅拌。5小时后真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在乙酸乙酯(50mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥、过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(乙酸乙酯-庚烷梯度，10:90升至100:0)纯化残余物，得到呈白色固体状的标题化合物(2.67g,100％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z)：287/343/465[M-155/M-99/M+23]1+
LC-MS r.t.(min):2.022A
中间体2：
N,N-双(2-氨基乙基)-6-叠氮己酰胺二盐酸盐
向二叔丁基(((6-叠氮己酰基)氮杂二烷基)双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸酯(2.66克，6.00mmol)中加入含HCl的异丙醇(5-6N，20.0mL，110mmol))并在室温下搅拌反应混合物。4小时后，真空蒸发反应混合物，并将所得粗产物与DCM(3×20mL)共蒸发，得到粗标题产物(1.49g，79％)，为白色固体。
LRMS(m/z)：243[M+1]1+
中间体3：
四叔丁基((5S,5'S)-(((((6-叠氮己酰基)氮杂二烷基)双(乙烷-2,1-二基))双(氮杂二烷基))双(6-氧基己烷)-6,1,5-三基))四氨基甲酸酯
向含N,N-双(2-氨基乙基)-6-叠氮己酰胺二盐酸盐(1.19g,3.76mmol)的DMF(30.0mL)和DIPEA(2.62mL,15.1mmol)的溶液中加入Boc-Lys(Boc)-ONp(3.69g,7.90mmol)并将混合物在室温下搅拌过夜。真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在乙酸乙酯(100mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(100mL)和饱和碳酸氢钠溶液(5×100mL)洗涤，用Na2SO4干燥、过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，得到呈淡黄色的固体标题产物(3.07g，91％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z)：800/900/922[M-99/M+1/M+23]1+
LC-MSr.t.(min):2.172A
中间体4：
4-硝基苯基3-(乙酰硫基)丙酸酯
将三氟乙酸4-硝基苯基酯(5.17g,22.0mmol)和3-(乙酰硫基)丙酸(2.96g,20.0mmol)溶解在DCM(50.0mL)中。接着，加入DIPEA(6.97mL，40.0mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在乙酸乙酯(50mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠溶液(5×50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥、过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，得到呈淡黄色固体的标题产物(4.90g，91％)。基于LC-MS的纯度为99％。
LRMS(m/z)：292[M+23]1+
LC-MSr.t.(min):1.942A
中间体5：
(S)-2,6-二氨基-N-(2-(6-叠氮基-N-(2-((S)-2,6-二氨基六氨基)乙基)六氨基)乙基)己酰胺四盐酸盐
将四叔丁基((5S,5'S)-(((((6-叠氮己酰基)氮杂二烷基)双(乙烷-2,1-二基))双(氮杂二烷基))双(6-氧基己烷)-6,1,5-三基))四氨基甲酸酯(1.80g，2.00mmol)溶解在含HCl的异丙醇(5-6N，50.0ml，275mmol)中，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，所得粗产物与DCM(3×20mL)共蒸发，得到白色固体的粗标题产物。
LRMS(m/z):250[M+2]2+，500[M+1]1+
中间体6：
(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰氨基]-N-[2-(6-叠氮基-N-{2-[(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰氨基])]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]己酰胺
向含(S)-2,6-二氨基-N-(2-(6-叠氮基-N-(2-((S)-2,6-二氨基六氨基)乙基)六氨基)乙基)己酰胺四盐酸盐(1.29g,2.00mmol)的DMF(30mL)和DIPEA(3.48mL,20.0mmol)溶液中加入3-(乙酰硫基)丙酸4-硝基苯基酯(2.26g,8.40mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过周末。真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在DCM/甲醇(95:5，v/v，100mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(100mL)、1N氢氧化钠溶液(3×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥、过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，得到呈白色固体状的标题产物(1.33g，65％)。在LC-MS上发现杂质(15％)，其m/z值对应于具有一个脱保护硫代乙酸酯基团的产物。杂质是在后处理过程中或后形成的。基于LC-MS的纯度为85％。
LRMS(m/z):510[M+2]2+，1019/1041[M+1/M+23]1+
LC-MSr.t.(min):1.862B
中间体7：
N,N'-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-氢硫基-9-(3-氢硫基丙烷氨基)-3,10,18-三氧-4,11,14,17-tetraazatricosane-19,23-二基)双(3-氢硫基丙酰胺)甲酸酯
将支架2(102mg，0.100mmol)溶解在甲醇(1.00ml)中。接着，加入新制备的1N氢氧化钠溶液(0.440ml，0.440mmol)并将反应混合物在室温下搅拌。30min后，加入含1.0M三甲基膦的THF溶液(0.500ml，0.500mmol)并将所得混合物在室温下搅拌。30min后，将反应混合物真空蒸发并与甲醇(2×10mL)共蒸发。将残余物溶解在甲醇/水的混合物(9:1，v/v，1.00mL)中，并将所得溶液进行制备型MP-LC2。与产物对应的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜得到标题化合物(75.6mg，87％)，为无色粘性油。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z):513[M+2]2+，825[M+1]1+
LC-MSr.t.(min):1.422A
中间体8：
树枝化基元(-L-SO1861)4-胺
将N,N'-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-氢硫基-9-(3-氢硫基丙烷氨基)-3,10,18-三氧-4,11,14,17-tetraazatricosane-19,23-二基)双(3-氢硫基丙酰胺)甲酸酯(2.73mg，3.13μmol)溶解在20mM的NH4HCO3与0.5mM TCEP/乙腈(3:1，v/v，3.00mL)的混合物中。接着，加入SO1861-EMCH(29.2mg，0.014mmol)并将反应混合物在室温下搅拌。1.5小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS3B。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(12.3mg，43％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z):1517[M-6]6-,1821[M-5]5-,2276[M-4]4-
LC-MSr.t.(min):4.395A
中间体9：
树枝状基元(-L-SO1861)4-叠氮化物
将树枝化基元(SO1861)4-胺(6.81mg，0.748μmol)和2,5-二氧吡咯烷酮-1-基1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(2.90mg，7.48μmol)溶解在DMF(1.00mL)中。接下来，加入DIPEA(1.302μL,7.48μmol)并将混合物振摇1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS3C。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(5.86mg，84％)。基于LC-MS的纯度为90％。
LRMS(m/z)：2344[M-4]4-
LC-MSr.t.(min):4.785B
中间体10：
树枝化基元(-L-SO1861)4-马来酰亚胺1
树枝化基元(SO1861)4-胺(8.12mg,0.891μmol)和2,5-二氧代吡咯烷酮-1-基1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(3.94mg,8.91μmol)将溶解在DMF(1.00mL)中。接下来，加入DIPEA(1.55μL,8.91μmol)并将混合物振摇1min，然后在室温下静置。3小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS3C。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(6.76mg，80％)。基于LC-MS的纯度为66％。
LRMS(m/z)：2358[M-4]4-
LC-MSr.t.(min):2.136C
中间体11：
树枝化基元(-L-SO1861)4-马来酰亚胺2
将支架2(5.10mg，5.00μmol)溶解在甲醇(100μL)中。接下来，加入新配制的1N氢氧化钠溶液(22.0μL，22.0μmol)，将混合物振摇1min，然后在室温下静置。30min后，加入含1.0M三甲基膦的THF溶液(25.0μL，25.0μmol)，将所得混合物振摇1min并在室温下静置。30min后，真空蒸发反应混合物并与甲醇(2×5mL)共蒸发。将所得残留物溶解在20mMNH4HCO3与0.5mM的TCEP/乙腈(3:1,v/v,3.242mL)的混合物中。从该溶液中，直接将1000μL加入SO1861-EMCH(14.4mg，6.94μmol，与支架相比为4.5当量)，并将混合物振摇1min，然后在室温下静置。10min后，将反应混合物冻干过夜。向所得残留物，添加2,5-二氧代吡咯烷酮-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧-2h-吡咯-1(5h)-基)丙酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(5.84mg，0.014mmol)和DMF(1.00mL)。接下来，加入DIPEA(2.39μL,0.014mmol)并将悬浮液振摇1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS3C。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜以得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(10.9mg，85％)。基于LC-MS的纯度为80％。
LRMS(m/z)：2354[M-4]4-
LC-MS r.t.(min):4.165B
树枝化基元(-L-SO1861)8的合成(图54)
中间体1：
叔丁基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(6-叠氮基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2],6-双({[(叔丁氧基)羰基]氨基})六氨基]六氨基]乙基}六氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双({[(叔丁氧基)羰基]氨基})六氨基]戊基]氨基甲酰基}-5-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}戊基]氨基甲酸酯
(S)-2,6-二氨基-N-(2-(6-叠氮基-N-(2-((S)-2,6-二氨基六氨基)乙基)六氨基)乙基)己酰胺四盐酸盐(964mg,1.50mmol))溶解在DMF(25.0mL)和三乙胺(2.08mL，15.0mmol)中。接着，加入Boc-Lys(Boc)-ONp(3.36g，7.18mmol)并将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空蒸发反应混合物并通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物以得到标题产物(2.71g，100％)，其为白色固体。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z)：807[M-198]2+
LC-MS r.t.(min):2.352B
中间体2：
(2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-二氨基-10-(6-叠氮基己酰基)-15-((S)-2,6-二氨基己酰氨基)-6,14,21-三氧-7,10,13,20-四氮杂二十六烷-1,5-二基)双(2,6-二氨基己酰胺基)八盐酸盐
将中间体1(2.71g，1.50mmol)溶解在含HCl的异丙醇(5-6N，25.0ml，138mmol)中，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。接下来，真空蒸发反应混合物，所得粗产物与DCM(3×20mL)共蒸发，得到白色固体的粗标题产物。
LRMS(m/z):203/254[M-200/M+4]4+,338[M+3]3+,507[M+2]2+,1012[M+1]1+
中间体3：
(2S)-2,6-双[3-(乙酰基硫基)丙酰氨基]-N-[(1S)-1-{[2-(6-叠氮基-N-{2-[(2S)-2,6-]双[(2S)-2,6-双[3-(乙酰基硫基)丙酰胺基]己酰胺基]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰胺基]己酰胺基]戊基]己酰胺
向(2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-二氨基-10-(6-叠氮基己酰)-15-((S)-2,6-二氨基己酰氨基)-6,14,21-三氧-7,10,13,20-四氮杂二十六烷-1,5-二基)双(2,6-二氨基己酰胺基)八盐酸盐(300mg，0.230mmol)加入DMF(20.0mL)、三乙胺(320μL，2.30mmol)和3-(乙酰硫基)丙酸4-硝基苯基酯(595mg，2.21mmol)。将所得悬浮液在60℃超声处理30min，并在室温下搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，通过首先进行快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，然后通过制备型MP-LC2至得到呈白色固体状的标题产物(70mg，15％)。纯度基于LC-MS100％。
LRMS(m/z)：685[M+3]3+
LC-MS r.t.(min):1.912A
中间体4：
(2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-氨基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰氨基)己酰氨基]己酰氨基]乙基}己酰氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双(3-硫酰丙酰氨基)己酰氨基]戊基]-2,6-双(3-硫酰丙酰氨基)己酰胺甲酸酯
将支架4(10.0mg,4.87μmol)溶解在甲醇(200μL)中。接下来，加入新制备的1N氢氧化钠溶液(42.9μL,0.043mmol)，并将所得混合物振摇1min并在室温静置。30min后，加入含1.0M三甲基膦溶液的THF(24.4μL，0.024mmol)，将所得混合物振摇1min并在室温静置。30min后，将反应混合物用水(1mL)稀释并直接进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到白色蓬松固体de标题化合物(4.02mg，48％)。
LRMS(m/z):564[M+3]3+,846[M+2]2+
LC-MSr.t.(min):1.542C
中间体5：
树枝化基元(-L-SO1861)8-胺
将支架5(0.52mg,0.299μmol)和SO1861-EMCH(29.2mg,0.014mmol)溶解在20mMNH4HCO3与0.5mMTCEP/乙腈(3:1,v/v,1.00mL)的混合物中，并将所得混合物振摇1min并在室温下静置。30min后，加入TCEP(0.30mg，1.05μmol)并将反应混合物振摇1min。接下来，将混合物直接进行制备型LC-MS3B。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(2.17mg，40％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z):2282[M-8]8-,2607[M-7]7-
LC-MSr.t.(min):4.415A
实施例8
SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸的合成(图55)
材料和方法
三功能连接子
三功能连接子(DBCO、TCO、马来酰亚胺)在Bio-SynthesisInc.(路易斯维尔,德克萨斯)订购。
HSP27BNA寡核苷酸
HSP27BNA(-硫醇)寡核苷酸(序列5'-GGCacagccagtgGCG-3')(Zhang等人,2011)购自Bio-synthesisInc.(路易斯维尔,德克萨斯)。
中间体1：
SO1861-叠氮化物
向SO186160mg,0.032mmol))和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰肼(39.3mg,0.129mmol)中加入甲醇(超干,1.00mL)和TFA(9.86μl,0.129mmol)并将反应混合物振摇1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC1。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。纯度基于LC-MS100％。
LRMS(m/z)：2150[M-1]1-
LC-MSr.t.(min):1.103B
中间体2：
SO1861-三功能连接子
将SO1861-叠氮化物(45mg，0.021mmol)和三功能连接子(26.5mg，0.022mmol)溶解在DMF(2.50mL)中，并将所得混合物振摇1min并在室温下静置。30min后，将反应混合物进行制备型LC-MS3C。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：1677[M-2]2-
LC-MSr.t.(min):2.546A
中间体3：
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰氨基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
向1-(4-甲酰基苯甲酰氨基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(28.0mg，0.048mmol)和EMCH.TFA(24.5mg，0.072mmol)加入甲醇(超干，2.00mL)和TFA(11.1μL，0.145mmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌。30min后，真空蒸发反应混合物，所得残留物通过MP-LC1纯化。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜以得到呈亮紫色蓬松固体状的标题化合物(33.4mg，88％)。基于LC-MS的纯度为92％。
LRMS(m/z):394[M+2]2+,789[M+1]1+
LC-MSr.t.(min):1.287A
中间体4：
甲基四嗪-BNA寡核苷酸
将HSP27 BNA寡核苷酸二硫化物(70.0mg,0.012mmol)溶解在20mM NH4HCO3(20.0mL)中。接着，加入TCEP(14.3mg，0.050mmol)并将反应混合物振摇1min并在室温下静置。使用截留分子量为3000Da(5000×g进行30min)的离心过滤器过滤反应混合物。接着，将20mM NH4HCO3与2.5mM TCEP(20.0mL)的溶液加入到残留物溶液中，并在上述相同条件下再次过滤所得混合物。残留物溶液用20mM NH4HCO3(30.0mL)稀释并将所得混合物加入含(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(14.8mg，18.8μmol)的乙腈(10.0mL)溶液。将反应混合物振摇1min并在室温下静置。30min后，将反应混合物冷冻并冻干过周末，得到呈粉红色蓬松固体状的粗标题产物。向粗产物中加入20mMNH4HCO3(20.0mL)溶液，所得悬浮液通过0.45μm注射器过滤器过滤。使用离心过滤器以与上述相同的条件过滤滤液。接着，将20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液再次加入到残留物溶液中，并通过使用具有上述相同条件的离心过滤器再次过滤所得混合物。用20mM NH4HCO3(20.0mL)稀释残留物溶液并将所得混合物冻干过夜以产生呈粉红色蓬松固体状的标题产物(90.0mg,115％)。基于LC-MS的纯度为91％。
LRMS(m/z):1631[M-4]4-,2174[M-3]3-
LC-MSr.t.(min):0.737B
中间体5：
SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸
将甲基四嗪-BNA寡核苷酸(90.0mg，0.014mmol)和SO1861-三官能连接子(48.6mg，0.014mmol)溶解在水/乙腈(4:1，v/v，12.0mL)的混合物中。将反应混合物振摇1min并在室温下静置。15min后，将混合物进行制备型LC-MS4A。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(82.0mg，60％)。基于LC-MS的纯度为92％(2个峰的m/z值对应于标题化合物)。
LRMS(m/z):1641[M-6]6-,1970[M-5]5-
LC-MS r.t.(min)：3.24和3.406B
中间体1：
SO1861-叠氮化物
向SO186160mg,0.032mmol))和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰肼(39.3mg,0.129mmol)中加入甲醇(超干,1.00mL)和TFA(9.86μl,0.129mmol)并将反应混合物振摇1min并在室温静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC1。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。纯度基于LC-MS100％。
LRMS(m/z)：2150[M-1]1-
LC-MSr.t.(min):1.103B
中间体2：
SO1861-三功能连接子
将SO1861-叠氮化物(45mg，0.021mmol)和三官能连接子(26.5mg，0.022mmol)溶解在DMF(2.50mL)中，将所得混合物振摇1min并在室温下静置。30min后，将反应混合物进行制备型LC-MS3C。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z)：1677[M-2]2-
LC-MSr.t.(min):2.546A
中间体3：
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)肼亚基)甲基)苯甲酰氨基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-yl)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
向1-(4-甲酰基苯甲酰基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(28.0mg，0.048mmol)和EMCH.TFA(24.5mg，0.072mmol)加入甲醇(超干，2.00mL)和TFA(11.1μL，0.145mmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌。30min后，真空蒸发反应混合物，所得残留物通过MP-LC1纯化。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜以得到呈亮紫色蓬松固体状的标题化合物(33.4mg，88％)。基于LC-MS的纯度为92％。
LRMS(m/z):394[M+2]2+,789[M+1]1+
LC-MSr.t.(min):1.287A
中间体4：
甲基四嗪-BNA寡核苷酸
将HSP27 BNA寡核苷酸二硫化物(70.0mg,0.012mmol)溶解在20mM NH4HCO3(20.0mL)中。接着，加入TCEP(14.3mg，0.050mmol)并将反应混合物振摇1min并在室温下静置。使用截留分子量为3000Da(5000×g进行30min)的离心过滤器过滤反应混合物。接着，将20mM NH4HCO3与2.5mM TCEP(20.0mL)的溶液加入到残留物溶液中，并在上述相同条件下再次过滤所得混合物。残留物溶液用20mM NH4HCO3(30.0mL)稀释并将所得混合物加入含(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(14.8mg，18.8μmol)的乙腈(10.0mL)溶液。将反应混合物振摇1min并在室温静置。30min后，将反应混合物冷冻并冻干过周末，得到呈粉红色蓬松固体状的粗标题产物。向粗产物中加入20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液，所得悬浮液通过0.45μm注射器过滤器过滤。使用离心过滤器以与上述相同的条件过滤滤液。接着，将20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液再次加入到残留物溶液中，并通过使用具有上述相同条件的离心过滤器再次过滤所得混合物。用20mM NH4HCO3(20.0mL)稀释残留物溶液并将所得混合物冻干过夜以产生呈粉红色蓬松固体状的标题产物(90.0mg,115％)。基于LC-MS的纯度为91％。
LRMS(m/z):1631[M-4]4-,2174[M-3]3-
LC-MSr.t.(min):0.737B
中间体5：
SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸
将甲基四嗪-BNA寡核苷酸(90.0mg，0.014mmol)和SO1861-三官能连接子(48.6mg，0.014mmol)溶解在水/乙腈(4:1，v/v，12.0mL)的混合物中。将反应混合物振摇1min并在室温静置。15min后，将混合物进行制备型LC-MS4A。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(82.0mg，60％)。基于LC-MS的纯度为92％(2个峰的m/z值对应于标题化合物)。
LRMS(m/z):1641[M-6]6-,1970[M-5]5-
LC-MS r.t.(min)：3.24和3.406B
实施例9
SO1861-BNA寡核苷酸缀合物
将HSP27 BNA寡聚二硫化物(1.10mg，0.187μ)溶解在含有1.0mM TCEP(500μL)的20mM NH4HCO3中，将混合物振摇1min，然后在室温下静置。1小时后，使用截留分子量为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(14000×g进行30min)。残留溶液用含有1.0mM TCEP(500μL)的20mM NH4HCO3稀释，并将所得混合物在上述相同条件下再次过滤。用20mMNH4HCO3/乙腈(3:1,v/v,1.00mL)稀释残留物溶液，并将所得混合物加入SO1861-EMCH(3.54mg,0.375μmol)。将反应混合物振摇1min并在室温下静置。10min后，将反应混合物进行制备型LC-MS4A。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(1.25mg，85％)。纯度基于LC-MS100％。
LRMS(m/z):1561[M-5]5-,1951[M-4]4-
LC-MSr.t.(min):2.466B
树枝化基元(SO1861)4-BNA寡核苷酸缀合(图56)
HSP27 BNA寡聚二硫化物(1.1mg，0.187μmol)溶解在含有1.0mM TCEP(500μL)的20mM NH4HCO3中，将混合物振摇1min，然后在室温下静置。1小时后，使用截留分子量为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(14000×g进行30min)。残留物溶液用含有1.0mMTCEP(500μL)的20mM NH4HCO3稀释，并将所得混合物在上述相同条件下再次过滤。将残留物溶液用20mM NH4HCO3/乙腈(3:1,v/v,1.0mL)稀释，并将所得混合物加入到树枝化基元(SO1861)4-马来酰亚胺1(3.54mg,0.375μmol)中。将反应混合物振摇1min并在室温下静置。10min后，将反应混合物进行制备型LC-MS4A。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(1.25mg，85％)。基于LC-MS的纯度94％。
LRMS(m/z):1896[M-8]8-,2167[M-7]7-
LC-MS r.t.(min):3.776B
树枝化基元(NEM)4的合成(图57)
向双(2-((S)-2,6-双(3-巯基丙酰胺基)己酰胺基)乙基)氨基甲酸苄酯(1.69mg,2.00μmol)和N-乙基马来酰亚胺(1.05mg,8.40μmol)中加入20mM NH4HCO3/乙腈(3:1，v/v，2.00mL)的混合物并将反应混合物在室温下搅拌。2小时后，将反应混合物冻干过夜。通过使用制备型LC-MS3A纯化所得残留物，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(1.53mg，57％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z)：1346[M+1]1+
LC-MS r.t.(min):1.433A
实施例10
A431小鼠肿瘤小鼠模型和体内外基因沉默研究
材料和方法
具有连接子寡核苷酸(序列5'-GGCacagccagtgGCG-3')的HSP27BNA(Zhang等人，2011年)购自Bio-Synthesis公司(路易斯维尔,德克萨斯)。
体外RNA分离和基因表达分析
根据标准方案(Biorad)从细胞中分离并分析RNA
体内小鼠肿瘤模型
小鼠研究在CrownBio(中国)根据标准方案和程序进行。模型：雌性BALB/c裸鼠皮下A431人表皮样癌异种移植模型。监测肿瘤体积并收集肿瘤样品用于基因沉默分析(参见下文)
小鼠肿瘤样品的RNA分离和基因表达分析
根据制造商的说明，使用TriZol(Thermo Fisher)从肿瘤中分离总RNA。将分离的RNA重新悬浮在无核酸酶水(NFW)中。在凝胶上检查RNA样品的RNA完整性。为了制备cDNA，首先将100ng总RNA与随机六聚体(Qiagen；终浓度2μM)混合在NFW中，最终体积为12.5μl，在70℃下变性5min，然后立即在冰上冷却。接下来，添加7.5μl cDNA合成混合物，其由4μl 5xRT缓冲液(Promega)、0.4μl的25mM dNTP(Promega)、1μl的200U/μLMMLVRT-酶(Promega)、0.5μL的40U/μLRNA酶抑制剂(Promega)和1.6μL的NFW组成。使用以下cDNA合成方案：1)10分钟25℃2)60分钟37℃3)5分钟85℃4)∞4℃。
对于单次qPCR反应，制备了以下混合物：1μL cDNA、0.05μL正向引物(250μM)、0.05μL反向引物(250μM)、8.9μl LNFW、10μlSYBRGreen(Bio-Rad)。使用以下qPCR方案：1个循环：5分钟95℃，40个循环：15s 95℃+30s 60℃。
使用2-(CtHSP27–GEOMEAN(Ctref1；Ctref2；Ctref3；Ctref4))计算HSP27基因表达，其中ref1、ref2、ref3和ref4是用于肿瘤分析的参考基因IMMT、EIF2S2、GUSB和UBC。根据GeNORM分析在测试的九个参考基因中选择四个参考基因，为该肿瘤样品选择最理想和最稳定的参考基因。为此，将qPCR结果导入Qbase+软件程序，通过该程序计算两个质量度量：归一化参考基因表达水平的变异系数(V)；和geNorm稳定性M值(M)1。M<0.2和V<0.15的参考基因被认为非常稳定。基于此分析，IMMT和EIF2S2被选为最稳定的参考基因。然而，UBC和GUSB也被添加到参考基因组中，以进一步提高归一化的准确性。每个样品在CFX96实时qPCR机器(Bio-Rad)上进行技术分析，一式三份。
表1.qPCR中使用的引物如下所示：
基因 引物 <u>序列(5′-3′)</u>
UBC 正向 CAGCCGGGATTTGGGTCG
反向 CACGAAGATCTGCATTGTCAAGT
GUSB 正向 TGCGTAGGGACAAGAACCAC
反向 GGGAGGGGTCCAAGGATTTG
IMMT 正向 AACCCACACCTGCACTTTCA
反向 TTTTCCTGTTGTGCAAGGCG
EIF2S2 正向 CCACAAGTCGTCCGAGTAGG
反向 GGAGATGTTTGGGCTGACGA
HSP27 正向 GCAGTCCAACGAGATCACCA
反向 TAAGGCTTTACTTGGCGGCA
实施例11
缀合物的合成
单克隆抗体、SO1861、QS皂苷
曲妥珠单抗
Figure BDA0003222616810001641
西妥昔单抗
Figure BDA0003222616810001642
和T-DM1
Figure BDA0003222616810001643
购自药房(夏洛蒂，柏林)。CD71单克隆抗体购自BioCell(Okt9,#BE0023)。SO1861是由Analyticon Discovery GmbH从从肥皂草获得的粗植物提取物分离和纯化的。购买了皂皮树皂苷提取物(QSmix)(SigmaAldrich,#S4521)。
材料
曲妥珠单抗(Tras,
Figure BDA0003222616810001651
Roche)、西妥昔单抗(Cet、
Figure BDA0003222616810001652
MerckKGaA)、三(2-羧乙基)磷化氢盐酸盐(TCEP、98％、Sigma-Aldrich)、5,5-二硫化双(2-对硝基苯甲酸))(DTNB，Ellman试剂，99％，Sigma-Aldrich)，ZebaTMSpin脱盐柱(2mL，Thermo-Fisher)，NuPAGETM4-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Thermo-Fisher)，NuPAGETMMES SDS运行泳缓冲液(Thermo-Fisher)、NovexTMSharp预染蛋白质标准品(Thermo-Fisher)、PageBlueTM蛋白质染色溶液(Thermo-Fischer)、PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒(Thermo-Fisher)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、98％、Sigma-Aldrich)、1，4-二硫苏糖醇(DTT、98％、Sigma-Aldrich)、SephadexG25(GEHealthcare)、SephadexG50M(GEHealthcare)、Superdex200P(GEHealthcare)、异丙醇(IPA，99.6％，VWR)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，99％，Sigma-Aldrich)，三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCL，Sigma-Aldrich)，L-组氨酸(99％，Sigma-Aldrich))、D-(+)-海藻糖脱水物(99％、Sigma-Aldrich)、聚乙二醇山梨糖醇单月桂酸酯(吐温20，Sigma-Aldrich)，Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Thermo-Fisher)，盐酸胍(99％，Sigma-Aldrich)，乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA-Na2，99％，Sigma-Aldrich)、无菌过滤器0.2μm和0.45μm(Sartorius)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己醇-1-羧酸酯(SMCC、Thermo-Fisher)、石竹素-Cys(Dia-Cys，具有单个C-末端半胱氨酸功能的石竹素突变体，Proteogenix)，VivaspinT4和T15浓缩器(Sartorius)，Superdex200PG(GEHealthcare)，四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(PEG4-SPDP，Thermo-Fisher)，HSP27BNA二硫化物寡核苷酸(Biosynthesis)，[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N,N-四甲基脲-六氟磷酸盐](HATU，97％，Sigma-Aldrich)，二甲基亚砜(DMSO，99％，Sigma-Aldrich)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(AEM，98％，Sigma-Aldrich)、L-半胱氨酸(98.5％，Sigma-Aldrich)、去离子水(DI)取自超纯实验室用水系统(MilliQ，默克)，镍-次氮基三乙酸琼脂糖(Ni-NTA琼脂糖，Protino)，甘氨酸(99.5％，VWR)，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(Ellman试剂，DTNB，98％、Sigma-Aldrich)、S-乙酰巯基琥珀酸酐荧光素(SAMSA试剂、Invitrogen)碳酸氢钠(99.7％、Sigma-Aldrich)、碳酸钠(99.9％、Sigma-Aldrich)、具有SephadexG-25树脂的PDMiniTrap脱盐柱(GEHealthcare)、PD10G25脱盐柱(GEHealthcare)、0.5、2、5和10mL中的Zeba Spin脱盐柱(Thermo-Fisher)，Vivaspin离心过滤器T410kDaMWCO、T4100kDaMWCO和T15(Sartorius)、Bioseps3000aSEC柱(Phenomenex)、Vivacell超滤单元10和30kDa MWCO(Sartorius)、Nalgene快速流体过滤器(Thermo-Fisher)。
方法
MALDI-TOF-MS
在MALDI-质谱仪(BrukerUltrafexIII)上记录基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)谱。通常，使用溶解在乙腈(MADLI-TOF-MS测试，Sigma)/0.1％TFA(7:3v/v)中的超级-DHB(99％,Fluka)或芥子酸(SA,99％,Sigma-Aldrich)作为基质，通过干燥液滴法在靶标(MTP384靶板磨光钢T F,Bruker Daltons)上点出纳摩尔至微摩尔范围的溶解在MilliQ水中的样品。PepMix(肽校准标准，Bruker Daltons)或ProteoMass(蛋白质校准标准，Sigma-Aldrich)用作校准标准品。RP模式是指反射器正模式。RN模式是指反射器负模式。LP模式是指线性正模式。
透析
再生纤维素膜：MWCO＝1和2kDa(Spectra/Por)，MWCO＝12–14kDa(CarlRoth)用于进行透析。通常，使用1L溶剂进行透析24h，该溶剂在该过程的前6小时后更换。
冻干
冷冻干燥在Alpha1-2LD plus(Martin Christ GefriertrocknungsanlagenGmbH)上进行。通常，样品用液氮冷冻，然后放入高真空的冷冻干燥机中。
UV-Vis
吸光度测量在Perkin Elmer Lambda 25UV-Vis或Thermo NanoDrop ND-2000分光光度计上进行，光谱范围为200-750nm。
使用Thermo Nanodrop 2000或Lambda 25光谱仪使用以下参数确定浓度：
曲妥珠单抗OD280＝1.5(mg/ml)-1cm-1
西妥昔单抗OD280＝1.4(mg/ml)-1cm-1
HSP27寡核苷酸OD260＝153,000M-1cm-1；Rz260:280＝1.819
Dia-CysOD280＝0.57(mg/ml)-1cm-1
PEG4-SPDP(PDT)OD343＝8,080M-1cm-1
SAMSA-荧光素OD495＝64,500M-1cm-1；Rz280:495＝0.232
Ellmans(TNB)OD412＝14,150M-1cm-1
固定化金属离子亲和色谱分析法(IMCA)
进行镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)色谱分析以纯化组氨酸标记的蛋白质和蛋白质缀合物。简而言之，将Ni-NTA琼脂糖(10mL)移入重力流柱中，柱床体积为5mL。树脂用20mL去离子水洗涤，再加入5mL的100mM NiSO4溶液。用5mL去离子水再次洗涤树脂五次，并用DPBS平衡五次。蛋白质溶液与洗涤过的Ni-NTA琼脂糖在4℃下旋转孵育30min。之后，将Ni-NTA蛋白质溶液吸回到重力流柱中。收集流出液，并用5mL DPBS洗涤树脂3次。然后通过将咪唑浓度从50mL的125mM，pH8增加到50mL的250mM，pH8来洗脱固定的样品。针对PBS pH7.4透析洗脱级分以获得纯化的样品。
尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(SEC)在AKTA纯化器上进行。使用BiosepSEC-S3000柱或SephadexG50M柱(10×40cm)通过SEC分析样品，用TBS/异丙醇溶液(85:15v/v)洗脱。样品纯度通过抗体样品峰相对于痕量聚集体峰的积分确定。
Ellman测定
进行Ellman测试(或Ellman测定)以通过分光光度法定量测定样品中的硫醇浓度。在硫醇的存在下，2-硝基-5-硫代苯甲酸酯(TNB)从Ellman试剂中的化学计量释放表明硫醇的存在。TNB在412nm处获得最大吸收，在缓冲系统中的消光系数为OD412＝14,150M-1cm-1。简而言之，将2μL的0.5mg/mL含Ellman试剂(5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)，DTNB)磷酸盐缓冲液(0.1M，1mMEDTA，pH7.4)溶液与20μL的含有硫醇的样品的缓冲液混合。将混合物涡旋5秒。然后，在Thermo Nanodrop 2000上测量412nm处的UV-Vis吸光度，以确定TNB浓度，从而确定样品的硫醇含量。
石竹素的产生
在细菌培养物中表达石竹素，并按照本领域已知的常规细胞培养和蛋白质纯化步骤纯化蛋白质。
皂草素缀合物的产生
定制的曲妥珠单抗-皂草素西妥昔单抗-皂草素、CD71mab-皂草素缀合物是从Advanced Targeting Systems(SanDiego,CA)生产和购买的。IgG-皂草素和皂草素购自Advanced Targeting Systems。
抗体-(Cys-树枝化基元-(L-SO1861)n)n的合成
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab与树枝状皂苷[树枝化基元-(L-SO1861)4-马来酰亚胺]通过四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子缀合，在Ab和树枝状皂苷进行硫醇-烯Michael类型的反应。西妥昔单抗-(S-树枝化基元-(L-SO1861)4)4示例性描述了该程序：
将西妥昔单抗脱盐到DPBS pH7.5缓冲液中，然后归一化为2.50mg/ml。向等分试样Ab(9.19mg，61nmol)中加入等分试样新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(5.0mg/ml，6.70摩尔当量，411nmol)，短暂涡旋混合物，然后在20℃下滚筒混合孵育60分钟。孵育后，加入甘氨酸(20mg/ml，7.7μl)淬灭反应，然后通过加入TCEP(5.0mg/ml，4.0摩尔当量/SPDP，1.64μmol)原位还原SPDP部分。将该混合物在20℃下通过滚轴混合进行滚轴混合15分钟。使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将所得Ab-SH纯化至TBS pH7.5。Ab-SH通过UV-vis分析和Ellman分析进行表征(硫醇与Ab的比率＝5.4)。向大量Ab-SH(7.41mg,1.93mg/ml,49nmol)中加入等分试样新鲜制备的含树枝化基元-(L-SO1861)4-马来酰亚胺溶液的DMSO(10mg/ml，8.0摩尔当量/Ab，0.4μmol,3.16mg,0.32ml)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育过夜。除了缀合反应外，在缀合前取出两等分试样的脱盐Ab-SH(0.25mg，1.67nmol)，并与NEM(8.0摩尔当量/Ab，13.3nmol，6.7μl0.25mg/ml溶液)反应或TBS pH7.5缓冲液(6.7μl)在20℃下过夜，分别作为阳性和阴性对照。孵育18小时后(在加入NEM之前)，将粗缀合物混合物短暂离心，并取出100μl等分试样用于UV-vis分析，并与阳性和阴性对照一起通过Ellman测定进行表征以获得树枝化基元-(L-SO1861)4合并。向大量Ab–树枝化基元-(L-SO1861)4混合物中加入等分试样新鲜制备的NEM溶液(2.5mg/ml，5.0摩尔当量，0.25μmol)，并将混合物通过1.6×30cm Sephadex G50柱纯化，用DPBS pH7.5洗脱以得到纯化的西妥昔单抗-(S-树枝化基元-(L-SO1861)4)4缀合物。将产物过滤至0.2μm以澄清，然后使用vivaspinT15浓缩器(3,000g，5分钟间隔，5温度)小心浓缩至约3mg/ml得到最终的西妥昔单抗-(S-树枝化基元(L-SO1861)4)4缀合物。产率：4.41mg，48％。树枝化基元-(L-SO1861)4与Ab之比＝4.4。
表2.总结反应结果
Figure BDA0003222616810001691
Figure BDA0003222616810001701
抗体-(L-SO1861)n(如图51中所示的)
曲妥珠单抗、西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab在1、2、3、4、5和6的DAR下通过Michae型硫醇-烯缀合反应与皂苷SO18161-EMCH缀合。SO1861-EMCH分子在其结构之间获得不稳定的(L)腙键及其马来酰亚胺官能在皂苷和Ab之间产生不稳定的键。该程序是针对曲妥珠单抗-(L-SO1861)4的示例性描述：
向西妥昔单抗(40mg,8.0ml)溶液中加入Tris浓缩物(127mg/ml,1.05M)、Tris.HCl浓缩物(623mg/ml,3.95M)和EDTA-Na2浓缩物(95mg/ml,0.26M)各10μl/ml得到50mMTBS、2.5mMEDTA缓冲液(pH7.5)。
向分成四份(每份9.73mg、4.864mg/ml、65nmol)的西妥昔单抗中加入等分试样的新鲜制备的TCEP溶液(0.5–2.0mg/ml，1.15–7.02摩尔当量，75–455nmol)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下通过滚筒混合孵育300min。孵育后(在添加SO1861-EMCH之前)，约从每个混合物中取出1mg(0.210ml)等分试样的Ab-SH，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)。这些等分试样通过UV-vis分析和Ellman测定进行表征(硫醇与抗体的比率分别为2.0、4.2、5.9和6.8)。向每个大量Ab-SH中加入等分试样新鲜制备的SO1861-EMCH溶液(2mg/ml，每‘硫醇’1.3摩尔当量，0.15–0.61μmol，0.16–0.63ml)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育120min。除了每个缀合反应外，两等分试样脱盐Ab-SH(0.25mg，1.67nmol)与NEM(每‘硫醇’1.3摩尔当量，4.3–17.4nmol，2.2–8.7μl的0.25mg/ml溶液)或TBS(pH7.5)缓冲液(2.2–8.7μl)在20℃下放置120min，分别作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，取出0.200ml等分试样的Ab–SO1861-EMCH混合物，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)。该等分试样通过UV-vis进行表征，并且与阳性和阴性对照一起通过Ellman的测定进行表征，以获得SO1861-EMCH掺入。向大量Ab–SO1861-EMCH混合物中加入等分试样新鲜制备的NEM溶液(2.5mg/ml，2.5–10摩尔当量，0.15–0.58μmol)，混合物通过zeba旋转脱盐柱纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱至得到纯化的西妥昔单抗–(L-SO1861)缀合物。将产物归一化为2.5mg/ml并过滤至0.2μm，然后分配用于生物学评估。
表3.曲妥珠单抗-L-SO1861缀合物的总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001711
表4.西妥昔单抗-L-SO1861缀合物的总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001712
抗体-(S-SO1861)n的合成
SO1861-S-Mal的合成
将来自肥皂草L的SO1861(15.4mg，8.28μmol)和HATU(140mg，368μmol，44.5摩尔当量)作为固体放入带有磁力搅拌器的20mL玻璃小瓶中，并加入5mLDMSO以溶解材料。溶解的混合物在室温下搅拌30min。30min后，将1mL新制备的含AEM溶液(65mg，256μmol，31摩尔当量)的DMSO加入搅拌的SO1861-HATU混合物中。在室温下搅拌反应混合物17小时。搅拌17小时后，将混合物用去离子水稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por7)对去离子水充分透析24h。透析后，将溶液冻干，得到白色粉末。
产率：7.22mg(44％)。
干燥的等分试样进一步被用于通过MALDI-TOF-MS进行表征。
MALDI-TOF-MS(RN模式)：m/z1983Da([M-H]-，SO1861-S-Mal缀合物)，2136Da([M-H]-，皂苷-S-Mal缀合物)。
MALDI-TOF-MS(RP模式)：m/z2007Da([M+Na]+，SO1861-S-Mal缀合物)，2107Da([M-Na]+，皂苷-S-Mal缀合物)。
通过将纯化的SO1861-S-Mal与新鲜制备的L-半胱氨酸溶液(1000摩尔过量)混合并观察MALDI-TOF-MS中预期的质量位移，在m/z2103Da处产生半胱氨酸缀合物，从而验证马来酰亚胺官能。
抗体缀合
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过Michae型硫醇-烯缀合反应与皂苷SO18161-S-Mal缀合。皂苷在其结构和马来酰亚胺官能之间获得稳定的(S)酰胺键，从而在皂苷和Ab之间产生稳定的键。
将溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5mg Ab通过zeba旋转脱盐柱缓冲液交换至三(羟甲基)-氨基甲烷缓冲盐水(TBS，pH7.5)，并归一化为3mg/mL的浓度。向Ab中加入等分试样新鲜制备的三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液(0.25mg/mL，2.92摩尔当量)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育90min。之后，所得的Ab-SH使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤纯化到TBS(pH7.5)。通过Ellman测定分析等分试样以确定巯基含量。将获得的Ab-SH分成用于缀合的单个部分和用于对照的两份0.25mg等分试样。向AB-SH的主要部分加入等分试样新鲜制备的SO1861-S-Mal溶液(2mg/mL，2mol当量，相对于巯基含量)，向第二对照等分试样加入缓冲液TBS(pH7.5)。将每种混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育2小时。之后，通Ellman测定分析每个等分试样，以确定相对于对照，缀合物中剩余的巯基含量。通过zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤纯化到Dulbecco的PBS(pH7.1)后，获得了Ab-S-SO1861。通过SEC进一步分析缀合物以确定％纯度。
对于曲妥珠单抗-(S-SO1861)4样品，测定的纯度为99％。对于西妥昔单抗-(S-SO1861)4样品，测定的纯度为98.3％。注意到曲妥珠单抗-(S-SO1861)4(9.1mL)和西妥昔单抗-(S-SO1861)4(8.8mL)的保留体积相似，并且与未修饰的Ab(例如IgG)一致。
抗体-(L-HSP27 BNA)n
通过PEG4-SPDP和DAR4合成曲妥珠单抗-(L-HSP27)4、西妥昔单抗-(L-HSP27)4和通过PEG4-SPDP和DAR2合成西妥昔单抗-(L-HSP27)2
曲妥珠单抗、西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子与HSP27 BNA二硫化物缀合，在Ab和HSP27 BNA之间形成不稳定的(L)二硫键。该程序是针对曲妥珠单抗-(L-HSP27 BNA)4的示例性描述：
HSP27 BNA二硫化物寡核苷酸(2.7mg，470nmol，6.10mg/ml)与TCEP(10摩尔当量，4.7μmol，1.34mg，50mg/ml)在20℃和滚筒混合下反应30min。之后，寡核苷酸-SH通过PD10G25脱盐柱纯化，洗脱到TBS(pH7.5)中并立即使用。获得寡核苷酸-SH(2.48mg，90％，1.24mg/ml，SH与寡核苷酸比率＝0.8)
曲妥珠单抗(1.5mg，10.3nmol，2.50mg/ml)与等分试样新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(6.81摩尔当量，70.1nmol，39μg)在DMSO(1mg/ml)中于20℃和滚筒混合下反应60min。之后，将反应用甘氨酸(在TBS(pH7.5)15.1μ的l2mg/ml新鲜制备的溶液)淬灭，然后通过zeba脱盐柱脱盐，用TBS(pH7.5)洗脱。取出所得等分试样的Tras-S-PEG4-SPDP并通过UV-Vis分析进行测试。使用TCEP释放吡啶基-2-硫酮(PDT)并在343nm处通过UV-vis分析确定SPDP掺入(SPDP与Ab比率：4)。剩余的Tras-(S-PEG4-SPDP)4与等分试样的新鲜制备的HSP27寡核苷酸(寡核苷酸-SH)(8摩尔当量，82.4nmol，1.24mg/ml)反应，并在20℃和滚筒混合下孵育过夜。17小时后，通过UV-vis分析来分析缀合物以通过在343nm处置换吡啶基-2-硫酮(PDT)来确定HSP27的掺入。使用1.6×33cm的Sephadex G50柱纯化粗缀合物，用DPBS(pH7.5)洗脱。得到的曲妥珠单抗-(L-HSP27)4作为单一级分获得。产量：n.d.。纯度：96％，HSP27 BNA与Ab的比率＝4.4
表5.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001741
n.d.＝不确定
抗体-(L-HSP27 BNA-L-封闭的)n
曲妥珠单抗-(L-HSP27-L-封闭的)4、西妥昔单抗-(L-HSP27-L-封闭的)
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab与带有HSP27衍生物的马来酰亚胺(Mal)缀合，其在下文中称为“HSP27-Mal”。Ab通过Michael型硫醇-烯缀合反应与HSP27-Mal缀合。HSP17-Mal在其结构和马来酰亚胺官能之间获得了不稳定的(L)腙键，从而在HSP27 BNA和Ab之间产生了不稳定的键。该程序是针对曲妥珠单抗-(L-HSP27BNA-L-封闭的)n的示例性描述：
用去离子水(DI)将曲妥珠单抗重构至21mg/ml，然后使用pH6的组氨酸缓冲液稀释至5mg/ml。向20mg(4.0ml)等分试样中加入各10μl/ml的Tris浓缩物(127mg/ml，1.05M)、Tris.HCl浓缩物(623mg/ml，3.95M)和EDTA-Na2浓缩物(95mg/ml，0.26M)得到50mMTBS、2.5mM EDTA缓冲液(pH7.5)。向曲妥珠单抗(20.30mg，4.920mg/ml，0.14μmol)中加入等分试样新鲜制备的TCEP溶液(1.00mg/ml,2.35摩尔当量,0.32μmol)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃和滚筒混合下孵育90min。孵育后(在添加HSP27-Mal之前)，约从每个混合物中取出2mg(0.439ml)等分试样的Ab-SH，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)中。该等分试样通过UV-vis分析和Ellman测定(硫醇与ab比率＝4.0)进行表征。向大量Ab-SH(5.1mg,35nmol)中加入HSP27-Mal衍生物的等分试样(在TBS(pH7.5)中新鲜制备的，2mg/ml，1.3摩尔当量/'硫醇'，182nmol)，混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育120min。除了曲妥珠单抗–HSP27BNA衍生物缀合反应外，两等分试样脱盐Ab-SH(0.5mg，3.3nmol)与NEM反应(每‘硫醇’1.3摩尔当量，17.3nmol，6.7μl的0.25mg/ml溶液)或TBS(pH7.5)缓冲液(6.7μl)在20℃下放置120min，分别作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，取出0.100ml等分试样的Ab-HSP27 BNA混合物，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)。该等分试样通过UV-vis进行表征，并且与阳性和阴性对照一起通过Ellman的测定表征以获得HSP27掺入。向大量Ab–HSP27混合物中加入等分试样新鲜制备的NEM溶液(0.25mg/ml，2.5摩尔当量，89nmol)，混合物使用1.6×30cm Sephadex G50M通过凝胶过滤纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱，然后通过使用100KDa MWCO浓缩器重复离心过滤和洗涤，以得到纯化的曲妥珠单抗-(L-HSP27-L-封闭的)4缀合物。在分配用于生物学评估之前，将产物过滤至0.2μm。
表6.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001751
Figure BDA0003222616810001761
抗体-(Cys-三功能连接子-(L-SO1861)-(L-HSP27 BNA))n
曲妥珠单抗-[S-三-(L-SO1861)-(L-HSP27)]4，曲妥珠单抗-[S-三-(封闭的)-(L-HSP27)]4，西妥昔单抗-[S-三-(L-SO1861)-(L-HSP27)]4，西妥昔单抗-[S-三-(封闭的)-(L-HSP27)]4
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过Michael型硫醇-烯反应与两种不同的带有HSP27 BNA衍生物的马来酰亚胺(Mal)(以下称为“HSP27-Mal”)缀合。这些HSP27-Mal衍生物是：1)Mal-三功能连接子-(L-SO1861)-(L-HSP27)，2)Mal-三功能连接子-(封闭的)-(L-HSP27)。该程序是针对曲妥珠单抗-[S-三功能连接子-(L-SO1861)-(L-HSP27BNA)]4的示例性描述：
用去离子水(DI)将曲妥珠单抗重构至21mg/ml，然后使用pH6的组氨酸缓冲液稀释至5mg/ml。向20mg(4.0ml)等分试样中加入各10μl/ml的Tris浓缩物(127mg/ml，1.05M)、Tris.HCl浓缩物(623mg/ml，3.95M)和EDTA-Na2浓缩物(95mg/ml，0.26M)以得到50mMTBS、2.5mMEDTA缓冲液(pH7.5)。
向曲妥珠单抗(20.30mg,4.920mg/ml,0.14μmol)中加入等分试样新鲜制备的TCEP溶液(1.00mg/ml，2.35摩尔当量，0.32μmol)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃和滚筒混合下孵育90min。孵育后(在添加构建体之前)，约从每个混合物中取出2mg(0.439ml)等分试样的Ab-SH，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)中。这些等分试样通过UV-vis分析和Ellman测定(硫醇与ab的比率＝4.0)进行表征。将大量Ab-SH分成两等分试样(1.1mg,7.6nmol和1.2mg,8.3nmol)，并向每等分试样添加等分试样的每种HSP27BNA-Mal衍生物1–2(在TBS(pH7.5)、2mg/ml、1.3摩尔当量/‘硫醇’、40nmol和43nmol中新鲜制备)的等分试样，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育120min。除了曲妥珠单抗–HSP27 BNA衍生物2缀合反应外，两等分试样脱盐Ab-SH(0.5mg，3.3nmol)与NEM(每‘硫醇’1.3摩尔当量，17.3nmol，6.7μl的0.25mg/ml溶液)或TBS(pH7.5)缓冲液(6.7μl)在20℃下反应120min，分别作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，取出0.100ml等分试样的Ab-构建体2混合物，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)中。该等分试样通过UV-vis进行表征，并且与阳性和阴性对照一起通过Ellman测定进行表征，以获得HSP 27BNA衍生物2的掺入。向每份大量Ab-构建体混合物中加入等份试样新鲜制备的NEM溶液(0.25mg/ml，2.5摩尔当量，19和21nmol)，混合物使用1.6×30cm Sephadex G50M通过凝胶过滤纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱，然后使用100KDa MWCO浓缩器重复离心过滤和洗涤，得到纯化的曲妥珠单抗–构建体1–2缀合物。在分配用于生物学评估之前，将产物过滤至0.2μm。
表7.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001771
抗体-(L-SO1861)n-(L-HSP27 BNA)n
通过PEG4-SPDP和DAR4合成曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4、西妥昔单抗-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4通过PEG4-SPDP和DAR2合成西妥昔单抗-(L-SO1861)4-(L-HSP27)2(FBR703 STB17/7-8)
曲妥珠单抗-(L-SO1861)4、西妥昔单抗-(L-SO1861)4在下文中称为“Ab”。Ab通过四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2吡啶基二硫基)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子与HSP27 BNA二硫化物缀合，在Ab和HSP27BNA之间形成不稳定的(L)二硫键。该程序是针对曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4的示例性描述：
HSP27 BNA二硫化物寡核苷酸(2.7mg，470nmol，6.10mg/ml)与TCEP(10摩尔当量，4.7μmol，1.34mg，50mg/ml)在20℃和滚筒混合下反应30min。之后，寡核苷酸-SH通过PD10G25脱盐柱纯化，洗脱到TBS(pH7.5)中并立即使用。获得寡核苷酸-SH(2.48mg，90％，1.24mg/ml，SH与寡核苷酸比率＝0.8)。
曲妥珠单抗-(L-SO1861)4(1.3mg，8.7nmol，2.50mg/ml)与等分试样的新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(9.26摩尔当量，80.3nmol,45μg)在DMSO(1mg/ml)中于20℃下用滚轴混合反应进行60min。之后，将反应用甘氨酸(15.1μl的在TBS(pH7.5)中的2mg/ml新鲜制备的溶液)淬灭，然后通过zeba脱盐柱脱盐，用TBS(pH7.5)洗脱。取出所得等分试样的Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP)并通过UV-Vis分析进行测试。SPDP掺入使用TCEP释放吡啶基-2-硫酮(PDT)并通过在343nm处的UV-vis分析确定(SPDP与Ab比率＝4)。剩余的Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP)与等分试样新鲜制备的HSP27寡核苷酸(寡核苷酸-SH)(8摩尔当量，54.8nmol，0.32mg，1.24mg/ml)反应并孵育在20℃下用滚轴混合过夜。17小时后，通过UV-vis分析来分析缀合物以通过在343nm处置换吡啶基-2-硫酮(PDT)来确定HSP27的掺入。使用1.6×33cm Sephadex G50柱纯化粗缀合物，用DPBS(pH7.5)洗脱。得到的曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(L-HSP27 BNA)4作为单一级分获得。产量：0.47mg，45％(0.49mg/ml)，HSP27与Ab的比率＝3.5。
表8.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001791
n.d.＝不确定
抗体-(L-QS混合物)n
曲妥珠单抗、西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过Michael型硫醇-烯缀合反应与皂苷QS混合物-EMCH缀合。该程序是针对曲妥珠单抗-L-QS混合物的示例性描述：
用去离子水(DI)将曲妥珠单抗(“Ab”，600mg)重构为21mg/mL，然后使用新鲜制备的pH6的组氨酸缓冲液(5mM组氨酸pH6，2％海藻糖，0.01％吐温20)稀释至5mg/mL。分别加入10μL/mLTris浓缩物(127mg/mL，1.05M)、Tris.HCL浓缩物(623mg/mL，3.95M)和EDTA-Na2浓缩物(95mg/ml，0.26M)以得到50mM TBS、2.5mM EDTA缓冲液(pH7.5)。向曲妥珠单抗(603.8mg,4.887mg/mL,4.0μmol)中加入等分试样的新鲜制备的TCEP溶液(1mg/mL,2.35摩尔当量，9.5μmol，2.72mg)，用手摇晃混合物混合，然后孵育在20℃和滚筒混合下进行90min。孵育后(在添加QS混合物-EMCH之前)，取出2mg(0.409mL)等分试样的Ab-SH，使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)。该等分试样通过UV-vis分析和Ellman测定进行表征。向大量Ab-SH中加入等分试样新鲜制备的QS混合物-EMCH溶液(2mg/mL，5.2摩尔当量，21μmol，21.6mL)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃孵育120min。除缀合反应外，两等分试样脱盐Ab-SH(0.5mg，0.134mL，3.33nmol)与NEM(8.00当量，26.6nmol，3.3μg，13.3μL的0.25mg/mL溶液)或TBS(pH7.5)缓冲液(13.3μL)在20℃反应120min，分别作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，约取出2mg(0.481mL)等分试样的Ab–QS混合物-EMCH混合物，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)中。该等分试样通过UV-vis进行表征，并与阳性和阴性对照一起通过Ellman测定进行表征，以获得QS混合物-EMCH掺入。向大量Ab–QS混合物-EMCH混合物中加入等分试样新鲜制备的NEM溶液(2.5mg/mL，5摩尔当量，20μmoL，2.51mg)，并将混合物在2-8℃下储存过夜。缀合物通过10×40cm Sephadex G50M柱纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱，得到纯化的曲妥珠单抗–(L-QS混合物)缀合物。将整个产物浓缩，然后使用vivacell 100浓缩器(2,000g，4℃，200min)归一化至5mg/mL。将产物过滤至0.2μm并分配用于生物学评估。产量：n.d.，QS混合物与抗体比＝4.1。
表9.总结反应结果
方法 测量 结果
分析SEC 纯度 n.d.
产率 质量(百分比) n.d.
Ellman测定 QS混合物-EMCH掺入 4.1
抗体-(L-HSP27BNA-L-SO1861)n
用DAR4的曲妥珠单抗-(L-HSP27BNA-L-SO1861)4、西替昔单抗-(L-HSP27BNA-L-SO1861)4
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中被称为“Ab”。Ab与皂苷SO1861和带有HSP27衍生物的马来酰亚胺(Mal)缀合，以下被称为“HSP27-Mal”。Ab通过Michael型硫醇-烯缀合反应与HSP27-Mal缀合。HSP17-Mal在其结构和马来酰亚胺官能之间获得了不稳定的(L)腙键，从而在HSP27 BNA和Ab之间产生了不稳定的键。该程序是针对曲妥珠单抗-(L-HSP27BNA–L-SO1861)4的示例性描述：
用去离子水(DI)将曲妥珠单抗重构至21mg/ml，然后使用pH6的组氨酸缓冲液稀释至5mg/ml。向20mg(4.0ml)等分试样中加入各10μl/ml的Tris浓缩物(127mg/ml，1.05M)、Tris.HCl浓缩物(623mg/ml，3.95M)和EDTA-Na2浓缩物(95mg/ml，0.26M)以得到50mM TBS、2.5mM EDTA缓冲液(pH7.5)。向曲妥珠单抗(20.30mg,4.920mg/ml,0.14μmol)中加入等分试样新鲜制备的TCEP溶液(1.00mg/ml，2.35摩尔当量，0.32μmol)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃和滚筒混合下孵育90min。孵育后(在添加HSP27-Mal之前)，约从每个混合物中取出2mg(0.439ml)等分试样的Ab-SH，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)中。该等分试样通过UV-vis分析和Ellman测定进行表征(硫醇与ab比率＝4.0)。向大量Ab-SH(4.7mg,32nmol)中加入HSP27-Mal衍生物的等分试样(在TBS(pH7.5)中新鲜制备，2mg/ml，1.3摩尔当量/'硫醇'，166nmol)，混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育120min。除了曲妥珠单抗–HSP27 BNA衍生物缀合反应外，两等分试样的脱盐Ab-SH(0.5mg，3.3nmol)与NEM(1.3摩尔当量/‘硫醇’，17.3nmol，6.7μl的0.25mg/ml溶液)或TBS(pH7.5)缓冲液(6.7μl)在20℃下反应120min，分别作为阳性和阴性对照。孵育后(在添加NEM之前)，取出0.100ml等分试样的Ab-HSP27 BNA混合物，并使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将其纯化至TBS(pH7.5)。该等分试样通过UV-vis进行表征，并且与阳性和阴性对照一起通过Ellman的测定表征以获得HSP27掺入。向大量Ab–HSP27混合物中加入等分试样新鲜制备的NEM溶液(0.25mg/ml，2.5摩尔当量，80nmol)，并使用1.6×30cm Sephadex G50M将混合物通过凝胶过滤纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱，然后通过使用100KDa MWCO浓缩器重复离心过滤和洗涤，得到纯化的曲妥珠单抗-(L-HSP27BNA-L-SO1861)4缀合物。在分配用于生物学评估之前，将产物过滤至0.2μm。
表10.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001811
抗体-(L-SO1861)n-(S-石竹素)n
通过SMCC和DAR2合成曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(S-石竹素)2和西妥昔单抗-(L-SO1861)4-(S-石竹素)2
曲妥珠单抗-L-SO1861和西妥昔单抗-L-SO1861在下文中称为“Ab”。Ab通过琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)连接子与石竹素-Cys缀合，在Ab和石竹素之间提供稳定的(S)酰胺键。该程序是针对曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(S-石竹素)2的示例性描述：
石竹素-Cys(7.8mg，261nmol，0.78mg/ml)与TCEP(5摩尔当量,，1.31μmol，0.37mg,1mg/ml)在20℃和滚筒混合下反应30min。之后，蛋白质-SH通过zeba脱盐柱纯化，洗脱到TBS(pH7.5)中并立即使用。获得蛋白质-SH(5.2mg,67％,0.52mg/ml,SH与蛋白质比率＝1±0.1)。
曲妥珠单抗-(L-SO1861)4(1.5mg,10nmol,2.50mg/ml)与等分试样的新鲜制备的SMCC溶液(4.83摩尔当量,48.3nmol,16μg)在DMSO(0.5mg/ml)中在20℃和滚筒混合下反应60min。之后，将反应用甘氨酸(18.1μl的1mg/ml在TBS(pH7.5)中新鲜制备的溶液)淬灭，然后通过zeba脱盐柱脱盐，用TBS(pH7.5)洗脱。将所得Tras-(L-SO1861)-(S-SMCC)(1.22mg,8.1nmol,2.03mg/ml)与等分试样新鲜还原的石竹素-Cys(3.2摩尔当量，32.5nmol，0.97mg，0.52mg/ml)反应并在20℃和滚筒混合下孵育过夜。17小时后，使用vivaspinT4浓缩器将缀合物浓缩至≤1ml，并使用1.6×37cm Superdex200PG柱纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱。得到的Tras-(L-SO1861)4-(S-石竹素)2缀合物为高分子量(HMW)(0.36mg，30％，0.34mg/ml，石竹素与Ab的比率＝未确定)和低分子量(LMW)(0.49mg,40％,0.30mg/ml,石竹素与Ab比率＝未确定)级分。产量：未定，纯度：79.3％。
表11.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001821
Figure BDA0003222616810001831
n.d.＝未确定
12.抗体-(S-石竹素)n
通过SMCC与DAR2合成曲妥珠单抗-(S-石竹素)2,西妥昔单抗-(S-石竹素)2
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)连接子与石竹素-Cys缀合，在Ab和石竹素之间提供稳定的(S)酰胺键。该程序是针对曲妥珠单抗-(S-石竹素)2的示例性描述：
石竹素-Cys(7.8mg，261nmol，0.78mg/ml)与TCEP(5摩尔当量，1.31μmol，0.37mg，1mg/ml)在20℃和滚筒混合下反应30min。之后，蛋白质-SH通过zeba脱盐柱纯化，洗脱到TBS(pH7.5)中并立即使用。获得蛋白质-SH(5.2mg,67％,0.52mg/ml,SH与蛋白质比率＝1±0.1)。
曲妥珠单抗(1.5mg,10nmol,2.50mg/ml)与等分试样的新鲜制备的SMCC溶液(3.16摩尔当量,31.6nmol)在DMSO(0.5mg/ml)中在20℃和滚筒混合下反应60min。之后，将反应用甘氨酸(18.1μl的1mg/ml在TBS(pH7.5)中新鲜制备的溶液)淬灭，然后通过zeba脱盐柱脱盐，用TBS(pH7.5)洗脱。将所得Tras-(S-SMCC)(1.22mg,8.1nmol,2.03mg/ml)与新鲜还原的石竹素-Cys(3.2摩尔当量,32.5nmol,0.97mg,0.52mg/ml)的等分试样反应并在20℃和滚筒混合下孵育过夜。17小时后，使用vivaspinT4浓缩器将缀合物浓缩至≤1ml，并使用1.6×37cm Superdex200PG柱纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱。
产量：未定，纯度：99％。
表12.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001832
Figure BDA0003222616810001841
n.d.＝未确定
抗体-(L-SO1861)n-(L-石竹素)n
通过PEG4-SPDP与DAR2合成曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(L-Dainthin)2和西妥昔单抗-(L-SO1861)4-(L-Dainthin)2
曲妥珠单抗-L-SO1861和西妥昔单抗-L-SO1861在下文中称为“Ab”。Ab通过四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子与石竹素-Cys缀合，在Ab和石竹素之间形成不稳定的(L)二硫键。该程序是针对曲妥珠单抗-L-SO1861的示例性描述：
将石竹素-Cys(7.8mg,261nmol,0.78mg/ml)与TCEP(5摩尔当量,1.31μmol,0.37mg,1mg/ml)在20℃和滚筒混合下反应30min。之后，蛋白质-SH通过zeba脱盐柱纯化，洗脱到TBS(pH7.5)中并立即使用。获得蛋白质-SH(5.2mg,67％,0.52mg/ml,SH与蛋白质比率＝1±0.1)。
曲妥珠单抗-(L-SO1861)4(0.75mg,5nmol,2.50mg/ml)与等分试样的新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(4.95摩尔当量,24.75nmol,14μg)在DMSO(1mg/ml)中于20℃和滚筒混合下反应60min。之后，将反应用甘氨酸(18.1μl的1mg/ml在TBS(pH7.5)中新鲜制备的溶液)淬灭，然后通过zeba脱盐柱脱盐，用TBS(pH7.5)洗脱。取出所得等分试样的Tras-(L-SO1861)-(S-PEG4-SPDP)并通过UV-Vis分析进行测试。使用TCEP释放吡啶基-2-硫酮(PDT)并通过在343nm处的UV-vis分析确定SPDP掺入(SPDP与Ab的比率＝2.4)。剩余的Tras-(L-SO1861)-(S-PEG4-SPDP)与等分试样的新鲜制备的石竹素-Cys(蛋白质-SH)(4摩尔当量，20nmol，0.6mg，0.52mg/ml)反应，并在20℃和滚筒混合下培养过夜。17小时后，通过UV-vis分析来分析等分试样的缀合物以确定通过置换PDT而掺入的石竹素-Cys。之后，使用vivaspinT4浓缩器将缀合物浓缩至≤1ml，并使用1.6×37cm Superdex200PG柱纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱。石竹素与Ab的比率＝2)。产量：未定，纯度：60.5％。
表13.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001851
n.d.＝未确定
抗体-(L-石竹素)n
曲妥珠单抗-(L-石竹素)2,西妥昔单抗-(L-石竹素)2和通过PEG4-SPDP与DAR2合成
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab通过四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子与石竹素-Cys缀合，在Ab和石竹素之间形成不稳定的(L)二硫键。该程序是针对曲妥珠单抗-L-SO1861的示例性描述：
将石竹素-Cys(7.8mg,261nmol,0.78mg/ml)与TCEP(5摩尔当量,1.31μmol,0.37mg,1mg/ml)在20℃和滚筒混合下反应30min。之后，蛋白质-SH通过zeba脱盐柱纯化，洗脱到TBS(pH7.5)中并立即使用。获得蛋白质-SH(5.2mg,67％,0.52mg/ml,SH与蛋白质比率＝1±0.1)。
将曲妥珠单抗(0.75mg,5nmol,2.50mg/ml)与等分试样的新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(3.35摩尔当量,16.75nmol)在DMSO(1mg/ml)中于20℃和滚筒混合下反应60min。之后，将反应用甘氨酸(18.1μl的1mg/ml在TBS(pH7.5)中的新鲜制备的溶液)淬灭，然后通过zeba脱盐柱脱盐，用TBS(pH7.5)洗脱。取出所得等分试样的Tras-(S-PEG4-SPDP)并通过UV-Vis分析进行测试。使用TCEP释放吡啶基-2-硫酮(PDT)并通过在343nm处的UV-vis分析确定SPDP掺入。剩余的Tras-(S-PEG4-SPDP)与等分试样新鲜制备的石竹素-Cys(蛋白质-SH)(4摩尔当量，20nmol，0.6mg，0.52mg/ml)反应，并在20℃和滚筒混合下孵育过夜。17小时后，通过UV-vis分析来分析等分试样的缀合物以确定通过置换PDT而石竹素-Cys的掺入。之后，使用vivaspinT4浓缩器将缀合物浓缩至≤1ml，并使用1.6×37cm Superdex200PG柱纯化，用DPBS(pH7.5)洗脱。石竹素与Ab的比率＝2)。产量：未定，纯度：67.7％。
表14.总结反应条件和结果
Figure BDA0003222616810001861
n.d.＝未确定
实施例12
材料和方法
在我们目前的工作中，我们研究了模型支架，其由四个分子臂组成，用于通过Schiff碱(亚胺)结合皂苷，并且一个分子臂用于点击化学。聚合物结构(图19)是从IrisBiotech GmbH(马克特雷德维茨，德国)购买的基于第一代五价聚乙二醇的树枝状大分子(即重复支化循环的次数)。皂苷(在本实施例中为SA1641)是从来自Merck(达姆施塔特，德国)的称为皂苷专集的丝石竹属物种的皂角苷复合粗提取物中纯化的。将粉末状粗提取物(2.5g)在水(100mL)中用氢氧化钠(0.2g)水解。将溶液在40℃下搅拌20h，然后补充冰醋酸直至达到pH5.0。为了去除单宁，将溶液在分液漏斗中与30mL丁醇一起振荡。回收水相并重复丁醇萃取两次。丁醇相补充有无水硫酸钠，过滤并合并。蒸发丁醇，将剩余的皂苷粉末溶解在20％甲醇中至最终浓度为30mg/mL。短时间超声处理后，通过高效液相色谱(HPLC)分离不同的皂苷。管(不包括色谱柱)用温水(40℃)以1.5mL/min的流量冲洗，然后包括Eurospher RP-C18柱(5μm，250×8mm)和异丙醇(100％)。将皂苷加到柱子上并用甲醇梯度洗脱(30min内以1.5mL/min从含20％甲醇到70％甲醇的补充有0.01％三氟乙酸的水，然后用70％甲醇再洗脱60min)(Sama等人,2018)。通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析等分试样的级分的SA1641含量。合并含有纯SA1641的级分并蒸发甲醇。使用干冰将水溶液在旋转圆底烧瓶中冷冻成薄膜。在–80℃下储存16h后，将样品冻干。为了生产本发明中所限定的支架，将聚合物结构(0.2mM)和SA1641(3.2mM)溶解在水(大约pH8)中，等体积混合并在26℃下振摇24小时。然后以参考SA1641的4倍摩尔过量加入氰基硼氢化钠(NaCNBH3；0.1M)，并将样品再孵育24h。然后通过超高效液相色谱(UPLC)/ESI-MS验证结构。将样品上样到RP-C4柱上，并用甲醇梯度洗脱(15min内从含25％甲醇到80％甲醇的补充有0.01％三氟乙酸的水，然后是80％甲醇再洗脱10min)。使用LockSprayTM分析级分，LockSprayTM是一种离子源，专为使用Waters Corporation的LC飞行时间(LC-TOF)质谱仪通过电喷雾电离进行精确质量测量而设计。
结果
图58的插图显示了从使用同位素模式计算器enviPatWeb2.0计算获得的理论上预期的质谱图。该模式考虑了分子的电荷和同位素的自然存在，这就是对单一物质预期不止一次探出的原因。通过UPLC/ESI-MS获得的实验数据(图58)显示在m/z758–760处的峰几乎完全相同，强度与预测的相同，从而证明SA1641与聚合物结构成功偶联。
实施例13
材料和方法
作为药物活性物质的实例，我们使用了靶向的毒素石竹素-表皮生长因子(石竹素-EGF)。将质粒His-石竹素-EGF-pET11d(Wengetal,2009)(100ng)添加到20μL大肠杆菌(Escherichia coli)RosettaTM2(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen,圣地亚哥,CA,美国)。通过热休克(冰上30min，42℃下90s和冰上1min)转化细胞。此后，加入300μL溶原性肉汤(LB)，并将悬浮液在37℃孵育1小时，同时以200rpm振荡。在含有50μg/mL氨苄青霉素的预热溶原肉汤琼脂平板上接种100μl细菌悬浮液，并将平板在37℃下孵育过夜。用平板上的菌落接种含有50μg/mL氨苄青霉素的溶原性肉汤(3mL)，并将细菌在37℃和200rpm下培养8h时。将悬浮液(50μL)添加到500mL含有50μg/mL氨苄青霉素的溶原肉汤中，并在37℃和200rpm下孵育过夜。随后，体积扩大到2.0L，细菌在相同条件下生长，直到波长600nm处的光密度达到0.9。此后，通过添加终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达。蛋白表达在37℃和200rpm下持续3h。最后，将细菌悬浮液在5,000×g和4℃下离心5min，重新悬浮在20mL PBS(137mMNaCl、2.7mMKCl、8.1mMNa2HPO4、1.47mMKH2PO4)中，并在–20℃下储存直至使用。为了纯化，将细菌悬浮液解冻并通过超声裂解。将裂解物离心(15,800×g，4℃，30min)并加入咪唑至终浓度为20mM。在20mM咪唑的存在下，将上清液与2mL的Ni-次氮基三乙酸琼脂糖在4℃下连续振荡培养30min。随后，将材料倒入20mL柱中，并用10mL洗涤缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)洗涤3次，并用在洗涤缓冲液中10mL部分浓度递增的咪唑(31、65、125和250mM)洗涤石竹素-EGF。洗脱液级分(2mL)在4℃下用2.0L PBS透析过夜。通过
Figure BDA0003222616810001881
Ultra-15(10kDa)浓缩脱盐石竹蛋白-EGF，并定量蛋白质浓度。
为了将合适的点击化学基团引入石竹素-EGF，将相对于石竹素-EGF摩尔过量8倍的炔烃-PEG5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二甲亚砜中，并添加到9体积的石竹素-EGF(0.2MNaH2PO4/Na2HPO4中1mg，pH8)。在室温下孵育4h后，使用PD10柱(GE-Healthcare，弗莱堡，德国)分离未结合的炔烃。具有聚合物结构的点击化学是通过铜(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成反应进行的。将炔-石竹素-EGF(0.02mM)、树枝状大分子(0.05mM)、CuSO4(0.1mM)、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(0.5mM)和抗坏血酸钠(5mM)在室温下0.1MNaH2PO4/Na2HPO4(pH8)轻轻搅拌孵育1h。然后使用PD10柱分离低分子量物质。
为了测试本发明的功效，我们用HER14细胞进行了活力测定。这些细胞是用人表皮生长因子受体稳定转染的成纤维细胞，因此是靶向毒素石竹素-EGF的靶细胞。将HER14细胞(2,000个细胞/100μL/孔)接种到96孔细胞培养板的孔中，并在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中在37℃、5％CO2和98％湿度下培养24h。然后将不同的测试物质(参见结果和图59)以25μL的体积一式三份添加，并补充另外25μL的培养基。孵育72h后，每孔加入30μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(0.5mg/mL水溶液)并孵育2h。此后，小心除去培养基并用含有10％(v/v)异丙醇、5％(w/v)十二烷基硫酸钠和400mM HCl的水性溶液代替，并孵育5min。在酶标仪(Spectra MAX 340PC,MolecularDevices,森尼维耳市,CA,美国)中以570nM光度定量测定溶解的甲臜。未处理的细胞归一化为1，所有样品均指未处理的对照。通过未配对的两样本t检验确定显著性。
结果
聚合结构，在实例中为五聚体树枝状大分子(五聚体)，在不存在或存在SA1641的情况下对靶细胞没有任何细胞毒性作用(图59，第2和3列)。在没有支架的情况下，靶向毒素(石竹素-EGF)在浓度为0.1nM时表现出最大毒性的一半(第4列)。在SA1641存在下，相同浓度导致所有细胞死亡，表明SA1641作为内体逃逸增强剂的一般能力(第5列)。聚合结构的存在不影响在存在或不存在SA1641的情况下的石竹素-EGF的毒性(第6和7列)，表明支架不影响石竹素-EGF的毒性。为了通过点击化学将模型聚合结构偶联到示例性药物活性物质石竹素-EGF，该物质必须先与炔基偶联。由于这种修饰，石竹素-EGF失去了一些活性(分别将第8列和第9列与第6列和第7列进行比较)，然而，未定向的炔烃修饰不影响本发明的思想，并且在未来的应用中也不需要。为了测试目的，我们不得不以一种非定向的方式引入炔烃，只是有阻碍毒素药物活性中心的风险。药物活性物质的制造商可以在合成过程中将点击位置直接引入物质中他选择的位置，在该位置物质的活性不受影响。当将炔烃修饰的药物活性物质点击到聚合结构上时，没有额外的活性损失，表明聚合结构本身没有毒性(第10和11栏)。
实施例14
材料
使用购买的以下化学品：甲醇(MeOH，LiChrosolv，Merck)、N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼(EMCH，95％，TCIChemicals)、三氟乙酸(TFA，99.8％，CarlRoth)、2-巯基乙醇(98％，Sigma-Aldrich)、聚(酰胺胺)(PAMAM树枝状大分子，乙二胺核心，第5.0代溶液，Sigma-Aldrich)、花菁3羧酸(Cy3-COOH，95％，Lumiprobe)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐，N-[(二甲氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲胺六氟磷酸盐N-氧化物(HATU，97％，Sigma-Aldrich)、牛血清白蛋白组分V(BSA，CarlRoth)、二甲亚砜(DMSO，99％，CarlRoth)、2-亚氨基硫烷盐酸盐(98％，Sigma-Aldrich)、罗丹明b(RhodB，95％，默克)、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)、盐酸(HCl，37％，默克)，NHS-PEG13-DBCO(Click Chemistry Tools)、Alexa FluorTM4885-TFP(Thermo-Fischer)、叠氮基-PEG3-SS-NHS(Conju-Probe)、氰基硼氢化钠(NaCNBH3,95％,Sigma-Aldrich),过硫酸铵(APS,98％,Sigma-Aldrich)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA,99％,Sigma-Aldrich)、定制肽SESDDAMFCDAMDESDSK(95％,PeptideSynthetics)、叠氮基-dPEG12-NHS(95％,QuantaBiodesign),PFd-G4-叠氮化物-NH-BOC树枝化基元(G4-树枝化基元,95％,PolymerFactory)、花青素苷5-DBCO(Cy5-DBCO，95％，Lumiprobe)、氯仿(CHCl3，99.5％，Sigma)、Amicon Ultra 0.5mL离心过滤器(3kDaMWCO，Sigma)、mPEG-SCM(mPEG2k-NHS，95.6％，Creative PEG Works)，Amicon Ultra15mL离心过滤器(10kDaMWCO，Sigma)。
方法
MALDI-TOF-MS
MALDI-TOF光谱记录在MALDI-质谱仪(Bruker Ultrafex III)上。通常，使用溶解在乙腈(MADLI-TOF-MS测试，Sigma)/0.1％TFA(7:3v/v)中的超级-DHB(99％,Fluka)或芥子酸(SA,99％,Sigma-Aldrich)作为基质，通过干燥液滴法在靶标(MTP 384靶板磨光钢T F,Bruker Daltons)上点出纳摩尔至微摩尔范围的溶解在MilliQ水中的样品。PepMix(肽校准标准，Bruker Daltons)或ProteoMass(蛋白质校准标准，Sigma-Aldrich)用作校准标准品。RP模式是指反射器正模式。RN模式是指反射器负模核磁共振。LP模式是指线性正模式。
H-NMR
使用Bruker 400MHz NMR光谱仪进行1H NMR分析。在测量前24h进行样品制备，其中2mg样品已溶解在0.8mL甲醇-D4(99％，Deutero)中。
UV-Vis
UV-Vis测量在NanoDrop ND-1000分光光度计上进行，光谱范围为200-750nm。
尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(SEC)使用来自GEHealthcare的Sephadex G 25Superfine和预装PD10柱(GEHealthcare，Sephadex G 25M)进行。在进行色谱分析之前，通过在相应的洗脱液中溶胀来活化该材料。
透析
再生纤维素膜：MWCO＝1和2kDa(Spectra/Por)，MWCO＝12–14kDa(CarlRoth)用于进行透析。通常，使用1L溶剂进行透析24h，该溶剂在该过程的前6小时后更换。
冻干
冷冻干燥在Alpha1-2 LD plus(Martin Christ GefriertrocknungsanlagenGmbH)上进行。通常，样品用液氮冷冻，然后放入高真空的冷冻干燥机中。
SO1861-EMCH合成
将来自肥皂草L的SO1861(59mg,31.7μmol)和EMCH(301mg,888μmol)置于带有搅拌器的圆烧瓶中，并溶解在13mL甲醇中。将TFA(400μL,约)添加到溶液中，并将反应混合物在RCT B磁力搅拌器(IKA Labortechnik)上以800rpm和室温搅拌3h。搅拌3h后，将混合物用MilliQ水或PBS稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por7)对MilliQ水或PBS彻底透析24h。透析后，将溶液冻干，得到白色粉末。产量62.4mg(95％)。干燥的等分试样进一步被用于通过1H NMR和MALDI-TOF-MS进行表征。
1H NMR(400MHz，甲醇-D4)(图60的A，SO1861)：δ＝0.50–5.50(m，皂苷三萜和糖骨架质子)，9.43(1H，s，皂苷的醛质子，Ha)。
1H NMR(400MHz，甲醇-D4)(图60的B。SO1861-EMCH，PBS处理)：δ＝0.50–5.50(m，皂苷三萜和糖骨架质子)，6.79(2H，s，马来酰亚胺质子，Hc),7.62-7.68(1H,m,腙质子,Hb)。
MALDI-TOF-MS(RP模式)(图61的A)：m/z2124Da([M+K]+，皂苷-EMCH)，m/z2109Da([M+K]+，SO1861-EMCH),m/z2094Da([M+Na]+,SO1861-EMCH)
MALDI-TOF-MS(RN模式)：m/z2275Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2244Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2222Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)、2178Da([M-H]-、皂苷-EMCH偶联物)、2144Da([MH]-、皂苷-EMCH偶联物)、2122Da([MH]-、皂苷-EMCH缀合物)、2092Da([M-H]-,皂苷-EMCH缀合物)、2070Da([M-H]-,SO1861-EMCH)、2038Da([M-H]-,SO1832-EMCH),1936Da([M-H]-,SO1730-EMCH、1861Da([M-H]-,SO1861)。
SO1861-EMCH-巯基乙醇
向SO1861-EMCH(0.1mg,48nmol)中加入200μL巯基乙醇(18mg,230μmol)，并在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温振荡溶液1h。振荡1h后，将溶液用甲醇稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por7)对甲醇彻底透析4h。透析后，取出等分试样并通过MALDI-TOF-MS进行分析。
MALDI-TOF-MS(图61的B)(RP模式)：m/z2193Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)、m/z2185Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)、m/z2170Da([M+Na]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)。
BSA-SO1861合成
将溶解在47μL PBS中的2-亚氨基硫烷(231μg，1.1μmol)加入到含BSA-RhodB溶液(10mg，0.15μmol)的200μL PBS中，并在室温下在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温振荡混合物40min。振荡40min后，将反应混合物立即通过Sephadex G25超细尺寸排阻柱(16mL柱体积)并将溶解在100μLPBS中的SO1861-EMCH(1mg，0.5μmol)加入收集的BSA-SH级分中。将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温振荡12h。振荡12h后，BSA-SO1861通过MWCO为3kDa的AmiconUltra15过滤器以4,000rpm(15℃)离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：未确定。
MALDI-TOF-MS(图69的A)(LP模式)：m/z74.2kDa([M+H]+，连接有4个SO1861的BSA-SO1861)，72.2kDa([M+H]+，连接有3个SO1861的BSA-SO1861)，70.2kDa([M+H]+，连接有2个SO1861的BSA-SO1861)，37.0kDa[M+H]2+，连接有4个SO1861的BSA-SO1861)，35.9kDa([M+H]2+，连接有SO1861的BSA-SO1861)，34.7kDa([M+H]2+，连接有2个SO1861的BSA-SO1861)。
Cy3-PAMAM
将溶解在甲醇中的720μL的PAMAM(30mg,1.04μmol)放入250mL圆烧瓶中，并通过旋转蒸发仪(20mbar,60℃)除去甲醇。剩余的PAMAM溶解在9mL的DMSO中。将溶于0.5mL DMSO的HATU(7.6mg,20μmol)添加到溶于DMSO的Cy3-COOH(0.6mg,1.2μmol)溶液中，并在ThermoMixerC(Eppendorf)上在室温以800rpm振荡混合物1h。振荡1h后，将HATU-Cy3溶液加入到搅拌的PAMAM溶液中，并将反应混合物在室温下搅拌12h。搅拌12h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为2kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por6)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，通过旋转蒸发器(20毫巴，60℃)减少缀合物溶液的体积，并将浓缩的缀合物溶液通过SephadexG25超细尺寸排阻柱(16mL柱体积)。收集第一级分并冻干以获得粘稠的粉红色PAMAM-Cy3缀合物。PAMAM-Cy3缀合物的形成通过薄层色谱法(甲醇/水，v/v1:1)和SephadexG25超细柱上出现更快的条带进行确认。产量21.3mg(63％)。通过UV-Vis分光光度法测定的染料/PAMAM摩尔比为0.43。
MALDI-TOF-MS(图71的A)(LP模式)：m/z28.0kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM)。
Cy3-PAMAM-SO1861的合成
Cy3-PAMAM-(SO1861)5的过程被描述为示例性的。将溶解在250μL MilliQ水中的2-亚氨基硫烷(1mg，6.7μmol)加入到含PAMAM-Cy3溶液的125μL MilliQ水中(0.5mg，17nmol)中，并在ThermoMixerC(Eppendorf)上在室温下以800rpm的速度振荡混合物40min。振荡40min后，将反应混合物立即通过SephadexG25超细尺寸排阻柱(16mL柱体积)并将溶解在40μL MilliQ水中的SO1861-EMCH(176μg，85nmol)添加到收集的Cy3-PAMAM-SH级分。将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温振荡12h。振荡12h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，CarlRoth)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，Cy3-PAMAM-SO1861溶液通过MWCO为3kDa的Amicon Ultra15过滤器以4000rpm(15℃)离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：0.5mg(75％)。
MALDI-TOF-MS光谱如图71的B-D和图72所示。Cy3-PAMAM-(SO1861)6的MALDI-TOF-MS(图71的B)(LP模式)：m/z38.4kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-SO1861)，17.9kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-SO1861)。
Cy3-PAMAM-(SO1861)5、Cy3-PAMAM-(SO1861)13、Cy3-PAMAM-(SO1861)51和Cy3-PAMAM-(SO1861)27的合成已通过上述方法进行，但有所不同在原料2-亚氨基硫戊环和SO1861-EMCH的进料当量中。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表15中突出显示。
表15.Cy3-PAMAM-SO1861合成的反应参数。
Figure BDA0003222616810001951
Cy3-PAMAM-NC-SO1861的合成
将Cy3-PAMAM(0.5mg,18nmol)、SO1861(2.3mg,1.24μmol)和HATU(64.6mg,170μmol)分别溶解在200μL DMSO中。将SO1861和HATU溶液在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温混合并振荡20min。振荡20min后，将Cy3-PAMAM溶液加入到振荡的SO1861-HATU溶液中，并将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温振荡12h。振荡12h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，CarlRoth)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，Cy3-PAMAM-NC-SO1861溶液通过MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17缀合物作为溶液储存在冰箱中，并取等分试样进行分析。产量：0.77mg(69％)。
MALDI-TOF-MS(图73)(LP模式)：m/z62.3kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)，35.7kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)。
G4-树枝化基元染料标记和脱保护
PFd-G4-叠氮化物-NH-BOC(G4-树枝化基元)(9.75mg,2.11μmol)放入2mL反应管(Eppendorf)并溶解在200μL DMSO中。将100μL Cy5-DBCODMSO溶液(1.72μmol*mL-1,170nmol)添加到G4-树枝化基元溶液中，并在ThermoMixerC(Eppendorf)上在室温和800rpm下振荡混合物12h。振荡12h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por7)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，将溶液冻干，得到蓝色粉末。将冻干所得的粗产物用于脱保护步骤。
将部分Cy5标记的冻干G4-树枝状基元溶解在50mL带有搅拌器的圆烧瓶中的12mLCHCl3中。加入12mL TFA并将反应混合物在RCT B磁力搅拌器(IKA Labortechnik)上以800rpm和室温搅拌3h。搅拌3h后，在旋转蒸发器(Heidolph WB 2000)上减压(50℃,30mbar)除去溶剂。蒸发后，将批次溶解在MilliQ水中并通过PD10尺寸排阻柱。G4-树枝化基元缀合物的形成通过薄层色谱上的色谱法(甲醇/水，v/v1:1)和PD10柱上更快条带的出现得到证实。将所得的尺寸排阻色谱馏分冻干，得到蓝色粉末。
产量5.7mg(93％)。通过UV-Vis分光光度法测定的染料/G4-树枝化基元摩尔比为0.012。
MALDI-TOF-MS(RP模式)：m/z 3956Da([M+Na]+，Cy5-G4-树枝化基元+PF6-反离子)，3820Da([M+Na]+，Cy5-G4-树枝化基元-PF6-抗衡离子)，3617Da([M+H]+，G4-树枝状基元杂质)，3017([M+H]+，G4-树枝状基元)。
G4-树枝化基元-SO1861的合成
对于最低的G4-树枝化基元与SO1861-EMCH的比率，示例性地描述了过程。将溶解在300μL MilliQ水中的2-亚氨基硫烷(2.65mg，19.2μmol)加入到部分Cy5标记的G4-树枝化基元溶液(0.577mg，192nmol)中，在252μL MilliQ水中，混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡40min。振荡40min后，将反应混合物立即通过PD10尺寸排阻柱，并将溶解在100μL MilliQ水中的SO1861-EMCH(1.19mg，575nmol)添加到收集的G4-树枝化基元-SH级分中。将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡12h。振荡12h后，使用Amicon Ultra离心过滤器(3kDa MWCO)通过离心过滤浓缩反应混合物。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产率：90nmol(47％)。
MALDI-TOF-MS光谱如图87中所示。G4-树枝化基元-SO1861(图87的C)(LP模式)的MALDI-TOF-MS：m/z10.19kDa([M+H]+，Cy5-G4-树枝化基元-[SO1861]3),9.27kDa([M+H]+,G4-树枝化基元-[SO1861]3),7.92kDa([M+H]+,Cy5-G4-树枝化基元-[SO1861]2),7.14kDa([M+H]+,G4-树枝化基元-[SO1861]2),5.86kDa([M+H]+,Cy5-G4-树枝化基元-[SO1861]1),5.07kDa([M+H]+,G4-树枝化基元-[SO1861]1)。
其他G4-树枝状化合物-(SO1861)n缀合物的合成已通过上述方法进行，但起始材料SO1861-EMCH的进料当量不同。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表16中突出显示。
表16.G4-树枝化基元-SO1861合成的反应参数。
Figure BDA0003222616810001971
PAMAM硫醇化
对于最高PAMAM与2-亚氨基硫烷比率，示例性地描述过程。向溶解在30μL甲醇中的PAMAM(333μg，12.8nmol)溶液中加入溶解在128μL MilliQ水中的2-亚氨基硫烷(0.53mg，3.84μmol)。将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡12h。振荡12h后，使用Amicon Ultra离心过滤器(3kDa MWCO)在15℃和13500rpm下通过离心过滤将反应混合物用MilliQ水洗涤4次。洗涤后将样品冻干以获得白色固体。产量未确定。
MALDI-TOF-MS谱如图89所示。PAMAM-(SH)108的MALDI-TOF-MS(LP模式)(图89的E)：m/z 41.5kDa([M+H]+，PAMAM-[SH]108)。
其它PAMAM-亚氨基硫烷缀合物的合成已通过上述方法进行，但不同之处在于起始材料2-亚氨基硫烷的进料当量。对于最低的2-亚氨基硫烷进料反应，已使用Cy3-PAMAM。
起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表17中突出显示。
表17.PAMAM-SH合成的反应参数。
Figure BDA0003222616810001981
PAMAM PEG化
对于最低的PAMAM与mPEG2k的比率，示例性的描述了过程。向溶解在10μL DMSO中的PAMAM(333μg，12.8nmol)溶液中加入溶解在13μL DMSO中的mPEG2k-NHS(0.268mg，128nmol)。将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡12h。振荡12h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为2kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por6)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，通过使用Amicon Ultra15mL离心过滤器(10kDaMWCO)的离心过滤将批次浓缩。浓缩的批次通过PD10尺寸排阻柱，然后冷冻干燥以获得白色蓬松粉末。产量未确定。
MALDI-TOF-MS谱如图90所示。PAMAM-(mPEG2k)3的MALDI-TOF-MS(LP模式)(图90的C)：m/z33.46kDa([M+H]+，PAMAM-[MPEG2k]3)。
其它PAMAM-mPEG2k缀合物的合成已通过上述方法进行，但不同之处在于起始材料mPEG2k-NHS的进料当量。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表18中突出显示。
表18.PAMAM-mPEG2k合成的反应参数。
Figure BDA0003222616810001991
Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO的合成
对于Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10，示例性的描述了过程。将Cy3-PAMAM-(SO1861)27(0.41mg,4.71nmol)冷冻并溶解在100μLDMSO中。将溶解在DMSO中的DBCO-PEG13-NHS酯(0.197mg,188nmol)添加到Cy3-PAMAM-SO1861溶液中，并将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡。振荡3h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，CarlRoth)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO溶液通过MWCO为3kDa的Amicon Ultra15过滤器以4,000rpm(15℃)离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：0.1mg(22％)。
MALDI-TOF-MS(图74的D)(LP模式)：m/z92.5kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO)，53.0kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO)。
Cy3-PAMAM-(SO1861)5-(DBCO)38和Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10的合成已通过上述方法进行。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表19中突出显示。
表19.Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO合成的反应参数。
Figure BDA0003222616810001992
Figure BDA0003222616810002001
Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO合成。
将Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17(0.3mg,4.8nmol)冷冻并溶解在100μL DMSO中。将溶解在DMSO中的DBCO-PEG13-NHS酯(0.202mg,194nmol)添加到Cy3-PAMAM-NC-SO1861溶液中，并将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡。振荡3h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，CarlRoth)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO溶液通过MWCO为3kDa的AmiconUltra15过滤器以4,000rpm(15℃)离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：0.1mg(22％)。质谱表明每个PAMAM分子有30个DBCO部分的缀合。
MALDI-TOF-MS(图74的B)(LP模式)：m/z93.2kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO)，49.6kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO)。
EGF石竹素和石竹素表达
质粒-DNA(His-石竹素-EGF-pET11d或His-石竹素-pET11d)[20]被转化到具有化学活性的大肠杆菌NiCo21(DE3)(
Figure BDA0003222616810002002
Inc.)中并在补充50μg/mL氨苄青霉素的3mL溶原肉汤中于37℃以200rpm的速度生长5h。这些细菌被用于接种补充有50μg/mL氨苄青霉素的500mL溶原性肉汤，于37℃过夜培养。随后，培养体积扩大到2L，细菌生长直到光密度(A600)为0.9。通过添加终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达。细胞在37℃和200rpm下进一步生长3h。离心(5min，5,000g，4℃)后，将细胞沉淀重悬在20mL磷酸盐缓冲盐水(含Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4)中，并在–20℃下储存。解冻后，通过超声装置(Branson Sonifier 250，G.Heinemann)释放蛋白质。将溶液离心(15,800×g，30min，4℃)并调整至20mM咪唑浓度。该构建体含有N-末端His标签，并通过镍氮基三乙酸色谱法(Ni-NTA琼脂糖,Qiagen,Hilden,德国)纯化。用咪唑(20-250mM)洗脱后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(12％)分析洗脱液。在4℃下用2L几丁质结合域缓冲液(20mM三(羟甲基)-氨基甲烷/HCl、500mMNaCl、1mMEDTA、0.1％吐温-20，pH8.0)透析含有石竹素-EGF或石竹素的级分。通过几丁质柱亲和色谱进一步纯化用于去除对Ni-NTA琼脂糖具有结合活性的细菌蛋白质。用几丁质结合域缓冲液洗脱后，通过SDS-PAGE(12％)分析级分。在4℃下用5L PBS透析含有石竹素-EGF或石竹素的级分。通过Amicon离心过滤装置(10kDa，Millipore，埃施波恩，德国)浓缩纯化的蛋白质。通过二辛可宁酸测定(Pierce，罗克福德，美国)确定蛋白质浓度。
石竹素-EGF-Alexa488的合成
将PBS中的石竹素-EGF(240μg，6.7nmol)溶液放入MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器中，并在4,000rpm和4℃下离心30min 3次。每个循环后，Amicon过滤器重新填充pH9的0.1M碳酸钠缓冲液。第三次离心循环后，通过离心将体积减少至0.5mL。将石竹素-EGF碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶解在10μL DMSO中的Alexa FluorTM4885-TFP(50μg，56nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡80min。振荡后，将混合物通过Sephadex G25M尺寸排阻柱(GEHealthcare，PD10柱)。将石竹素-EGF-Alexa488缀合物储存在冰箱中pH9的0.1M碳酸钠缓冲液中，并取等分试样进行分析。产量：210μg(85％)。
MALDI-TOF-MS(图75的D)(LP模式)：m/z36.8kDa([M+H]+，石竹素-EGF-Alexa488)，m/z33.6kDa([M+H]+，石竹素-EGF-Alexa488)、18.8kDa([M+H]2+,石竹素-EGF-Alexa488)、16.6kDa([M+H]2+,石竹素-EGF-Alexa488)。
石竹素-Alexa488的合成
将PBS中的石竹素(184μg，6.2nmol)溶液放入MWCO为3kDa的Amicon Ultra15过滤器中，并在4,000rpm和4℃下离心30min 3次。每个循环后，Amicon过滤器重新填充pH9的0.1M碳酸钠缓冲液。第三次离心循环后，通过离心将体积减少至0.5mL。将石竹素碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶解在3.5μL DMSO中的Alexa FluorTM4885-TFP(16.7μg，19nmol)添加到蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡80min。振荡后，将混合物通过Sephadex G25M尺寸排阻柱(GEHealthcare，PD10柱)。将石竹素-Alexa488缀合物储存在冰箱中pH9的0.1M碳酸钠缓冲液中，并取等分试样进行分析。产量：未确定
MALDI-TOF-MS(图76的D)(LP模式)：m/z30.7kDa([M+H]+，石竹素-Alexa488)。
石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3和石竹素-EGF-Alexa488-PEG12-N3合成
程序被描述为示例性的对于石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3，示例性的描述了过程。将石竹素-EGF-Alexa488(70μg，1.9nmol)碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶于9μLDMSO的叠氮基-PEG3-S-S-NHS(120μg，272nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和15℃振荡12h。振荡后，将反应混合物用PBS稀释，并通过使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra15过滤器在4,000rpm和4℃下通过离心过滤用PBS洗涤。
产量：54μg(70％)。
MALDI-TOF-MS(图75的E)(LP模式)：m/z40.8kDa([M+H]+，石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3)，m/z37.5kDa([M+H]+,石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3)。
已通过上述方法进行了石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3和石竹素-EGF-Alexa488-PEG12-N3的合成，但所使用的叠氮基-PEG连接子有所不同。表20中突出显示了相应的叠氮基-PEG连接子、它们的进料当量和相应的缀合物质量。
表20.石竹素-EGF-Alexa488-PEG-N3合成的反应参数
Figure BDA0003222616810002031
石竹素-Alexa488-S-S-PEG-N3
将石竹素-Alexa488(24.5μg，0.8nmol)碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶于9μL DMSO的叠氮基-PEG3-S-S-NHS(34μg，78nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和15℃振荡12h。振荡后，将反应混合物用PBS稀释，并通过使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器在4,000rpm和4℃下通过离心过滤用PBS洗涤。
产量：10.3μg(39％)。
MALDI-TOF-MS(图76的E)(LP模式)：m/z32.9kDa([M+H]+，石竹素-Alexa488-S-S-PEG-N3)。
Cy3-PAMAM-皂苷-毒素缀合物的合成
对于Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO，示例性地描述了过程的过程。将MilliQ水中的Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO(17μg，0.184nmol)溶液与在1.5mL反应管中的PBS中的石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG3-N3(3.6μg，0.089nmol)溶液混合，并将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和15℃振荡2h。振荡后，取出小等分试样，在Molecular
Figure BDA0003222616810002032
VersaDocTMMP4000成像系统(Bio-Rad)上通过SDS-PAGE和荧光成像进行分析(图77)。
Cy3-PAMAM-(SO1861)5-SS-石竹素-EGF-Alexa488、Cy3-PAMAM-(SO1861)27-SS-石竹素-EGF-Alexa488、Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-石竹素-EGF-Alexa488、Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-石竹素-Alexa488和Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-石竹素-EGF-Alexa488，已通过上述方法进行，但在使用的PAMAM-皂苷-DBCO批次、使用的叠氮基毒素批次及其进料当量方面有所不同。起始材料的相应进料当量在表21中突出显示。
表21.Cy3-PAMAM-皂苷-毒素合成的反应参数
Figure BDA0003222616810002041
通过还原胺化合成Cy3-PAMAM-NC-SO1861
将Cy3-PAMAM(0.19mg，13nmol)和SO1861(0.73mg，0.39μmol)分别溶解在200μL的pH5的0.1M醋酸盐缓冲液中。将SO1861和Cy3-PAMAM溶液混合并在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡。振荡20min后，将NaCNBH3(5mg，81μmol)加入到振摇反应溶液中，并将反应混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下振荡12h。振荡12h后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，CarlRoth)对MilliQ水彻底透析24h。透析后，Cy3-PAMAM-NC-SO1861溶液通过MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：未确定
MALDI-TOF-MS(图78的B、C)(LP模式)：m/z88.7kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)，49.2kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)。
Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)30和Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)10的合成已通过上述方法进行，但不同之处在于将还原剂NaCNBH3添加到反应批次中的时间。NaCNBH3添加的相应时间和缀合物的相应质量在表22中突出显示。
表22.通过还原胺化合成Cy3-PAMAM-NC-SO1861的反应参数。
Figure BDA0003222616810002051
聚(SO1861)的合成
将SO1861-EMCH(0.13mg，63nmol)溶解在30μL脱气MilliQ水中。将溶解在4μL脱气MilliQ水中的APS(0.2μg，0.8nmol)添加到SO1861-EMCH溶液中，并将该溶液置于ThermoMixerC(Eppendorf)中，温度为60℃。然后，将TMEDA(cat.，0.5μL)添加到混合物中，并将混合物在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和60℃下振荡2h。2h后，取出一小部分用于质谱分析。
MALDI-TOF-MS(图80的C)(LP模式)：m/z18.2kDa([M+H]+，聚(SO1861)9)，16.0kDa([M+H]+，聚(SO1861)8),14.2kDa([M+H]+,聚(SO1861)7),12.2kDa([M+H]+,聚(SO1861)6),10.2kDa([M+H]+,聚(SO1861)5),8.2kDa([M+H]+,聚(SO1861)4),6.2kDa([M+H]+,聚(SO1861)3)。
SO1861-EMCH肽偶联
将序列为SESDDAMFCDAMDESDSK(0.6mg,0.3μmol)的定制肽和SO1861-EMCH(0.8mg,0.39μmol)分别溶解在200μL PBS中。SO1861-EMCH和肽溶液在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下混合并振荡12h。振荡后取出小等分试样进行分析。产量：未确定
MALDI-TOF-MS(图83的B)(RN模式)：m/z4.05kDa([M+H]-，肽-SO1861)，3.92kDa([M+H]-，肽-SO1730)，1.98kDa([M+H]-,肽),1.86kDa([M+H]-,SO1861)。
细胞活力测定
处理后，细胞在37℃下孵育72h，然后根据制造商的说明(
Figure BDA0003222616810002061
AqueousOne Solution Cell Proliferation Assay,Promega)通过MTS分析确定细胞活力。简而言之，将MTS溶液在不含酚红并补充有10％FBS(PAN-BiotechGmbH)的DMEM(PAN-BiotechGmbH)中稀释20×。每孔用200μL PBS洗涤细胞一次，然后每孔加入100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育大约20-30分钟。随后，在Thermo Scientific Multiskan FC读板机(ThermoScientific)上测量492nm处的光密度。为了量化，在将未处理孔的背景校正信号除以处理孔的背景校正信号计算未处理/处理细胞的比率之前，从所有其他孔中减去‘仅培养基’孔的背景信号。
FACS分析
在10cm培养皿中，将HeLa细胞以500,000c/板接种在补充有10％胎牛血清(PAN-Biotech GmbH)和1％青霉素/链霉素(PAN-Biotech GmbH)的DMEM(PAN-Biotech GmbH)中，并孵育48hr(5％CO2，37℃)，直到汇合度达到90％。接下来，细胞被胰蛋白酶消化(TryplEExpress，Gibco Thermo Scientific)成单细胞。将0.75×106个细胞转移到15mL falcon管中并离心(1,400rpm，3min)。弃去上清液，同时让细胞沉淀物浸没。通过在涡旋振荡器上轻轻敲击falcon管使沉淀分离，并用4mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤细胞。洗涤后，将细胞重新悬浮在3mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中，并在3个圆底FACS管(1mL/管)上等分。细胞再次离心并重悬于200μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)或200μL抗体溶液中；在195μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中含有5μL抗体。将APC小鼠IgG1,κ同种型CtrlFC(#400122,Biolegend)用作同种型对照，并将APC抗人EGFR(#352906,Biolegend)用于染色EGFR受体，HER2:APC抗人CD340(erbB2/HER-2)(324408,Biolegend)。CD71：APC抗人CD71#334108，Biolegend。样品在滚筒混合器上在4℃下孵育30min。然后，将细胞用冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤3×，并在室温下使用2％PFA的PBS溶液固定20min。细胞用冷PBS洗涤2×，并重新悬浮在250-350μL冷PBS中用于FACS分析。用BD FACSCantoII流式细胞术系统(BD Biosciences)和FlowJo软件分析样品。
表23.各种细胞的EGFR、HER2和CD71表达水平
Figure BDA0003222616810002071
结果
考虑到可用于与SO1861分子发生缀合反应的化学基团，如图62中突出显示的，已经鉴定了四个化学基团。糖残基的醇和二醇、三萜骨架上的醛基、糖残基之一(葡萄糖醛酸)上的羧酸以及三萜骨架上的烯烃基团。
鉴于每个鉴定的化学基团的优缺点(表24)，醛和醇基团最适合可逆缀合反应，而烯烃和羧酸(葡萄糖醛酸)是最适合不可逆/稳定缀合反应的基团。然而，SO1861分子结构中的醛基最适合醇类的可逆缀合反应。一方面，因为结构中只有一种醛可以进行化学选择性反应。另一方面，因为醛可以与各种化学基团(如胺、酰肼和羟胺)进行可逆的缀合反应，形成可酸裂解的部分(如亚胺、腙和肟)。这个因素使得可以自由选择所期望的可逆缀合反应的化学基团。相反，醇类也是通过形成缩醛和缩酮进行可逆缀合反应的良好候选者，但缺乏化学选择性，因为它们在糖苷结构上大量存在。
对于不可逆和稳定键的形成，羧酸是最合适的，因为它可以用肽化学中使用的常用工具形成酰胺和酯(例如，通过碳二亚胺介导的酰胺形成与胺反应)。
表24.可用于皂苷缀合反应的官能团
Figure BDA0003222616810002081
因此，为了开发内体逃逸增强皂苷(例如SO1861)，已经建立了一种方法，其允许使用存在于SO1861上的最适合的化学基团生成不可裂解和可裂解的‘即用型缀合物’皂苷(图63)。
为了生产不可裂解的‘即用型缀合物’皂苷，SO1861的羧基通过肽缀合化学中使用的试剂活化以生成活性酯(例如1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯，HATU)。所得SO1861的活性酯能够与胺反应形成稳定的酰胺键合缀合物(图63的A)。
为了生产可裂解的“即用型缀合物”皂苷，SO1861的醛基与EMCH(ε-马来酰亚胺己酸酰肼)连接子反应。EMCH的酰肼基团与SO1861的醛形成酸可裂解的腙键。同时，EMCH连接子呈现具有硫醇(巯基)反应性的马来酰亚胺基团，因此可以与硫醇缀合(图63的B)。
SO1861-EMCH的马来酰亚胺基团在6.5-7.5的pH值范围内进行时，会与硫醇和带有硫醇的多聚结构发生快速且特异性的Michael加成反应(图63的B)。此外，SO1861和EMCH之间的酸敏感腙键可以被用于在酸性环境中从支架中释放皂苷(图64)。因此，EMCH连接子满足了对pH可裂解策略和与多聚结构的缀合策略的需要。
关于与多聚结构缀合的理想EMCH间隔长度，计算机模拟(PerkinElmer,ChemBio3D,Ver.13.0.0.3015)表明SO1861-EMCH上的马来酰亚胺基团位于分子的外围，因此应该可以访问承载硫醇的多聚结构(图65)。
为了合成SO1861-EMCH，已开发出一种策略，其允许将SO1861上的醛基转化为EMCH(图66的A)。SO1861-EMCH缀合物被分离并通过核磁共振谱(参见材料和方法部分，图60的B)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)成功表征，如图66的B和图66的C，以及图61的A中所示的。
为了测试腙键的pH依赖性水解，将SO1861-EMCH溶解在pH3的HCl溶液中，并在两个不同的时间点记录MALDI-TOF-MS谱(图67)。如图67的A和B中所示的，在图67的B中可以看到对应于SO1861-EMCH的m/z2070Da处的峰明显下降趋势。由于SO1861是在水解过程中生成的，因此m/z1861Da处的峰增加的记录伴随着m/z2070Da处的下降趋势。这些结果表明腙键对水解反应有应答，即使它连接在SO1861上也会被裂解。
为了将SO1861-EMCH与多聚结构结合，多聚结构的可接近的胺在试剂2-亚氨基硫醇的帮助下转化为硫醇。多聚结构上生成的游离硫醇然后作为硫醇-烯Michael型加成到SO1861-EMCH的马来酰亚胺基团的亲核试剂(图68)。这种开发的方法适用于将SO1861-EMCH与任何可获得的多聚结构缀合，以获得可访问的胺基团，并且还允许根据多聚结构分别控制缀合SO1861分子的数量。
通过使用蛋白质的胺(多氨基酸支架实例)，牛血清白蛋白(BSA)，获得了“即用型缀合皂苷”与多聚结构缀合的概念的第一个证明。缀合后，在m/z～70、～72和～74kDa处获得BSA-SO1861的相应峰的质谱(图69的A)。与m/z66kDa的BSA检测质量相比(图69的B)，获得的BSA-SO1861质量对应于每个BSA由2、3和4个SO1861分子组成的BSA-SO1861缀合物的混合物。
通过使用含胺的第5代(G5)树枝状大分子聚(酰胺胺)(PAMAM与共价偶联的红色荧光染料(Cy3))，获得了“即用型缀合皂苷”与多聚结构缀合的概念证明。PAMAM-Cy3被用作与SO1861-EMCH和SO1861-HATU缀合的多聚结构，并用作SO1861与多聚结构缀合的模型(图70)。
Cy3-PAMAM的所有可接近的胺基团都使用3倍过量的2-亚氨基硫烷/Cy3-PAMAM胺转化为硫醇，然后与SO1861-EMCH反应。三个不同的进料当量(5、20和57)SO1861-EMCH用于三个反应批次。反应后，Cy3-PAMAM-SO1861缀合物在MALDI-TOF-MS上记录的质量显示相应质量随着SO1861-EMCH进料的增加而增加(图71)。三种不同的进料对应于Cy3-PAMAM-SO1861缀合物获得的m/z38.4kDa、m/z53.9kDa和m/z133.8kDa质量，其对应于每个PAMAM树枝状大分子连接的6、13和51个SO1861分子，如图71的B-D所示的。
在另一反应中，只有一定数量的PAMAM胺在与SO1861-EMCH反应之前转化为硫醇。这里，分别使用了两种不同的2-亚氨基硫烷进料当量(8和32)和两种不同的SO1861-EMCH进料当量(5和30)。反应后，Cy3-PAMAM-SO1861缀合物在MALDI-TOF-MS上的各自光谱在m/z37.7kDa(SO1861-EMCH的5个进料当量)和m/z87.0kDa(SO1861-EMCH的30个进料当量)处出现峰，如图72所示的。在m/z37.7kDa和m/z87.0kDa处获得的质量对应于Cy3-PAMAM-SO1861缀合物，其中连接了5个和30个SO1861分子，并证明使用该方法几乎所有SO1861-EMCH进料被缀合。
为了生成不可pH裂解的皂苷缀合物，SO1861的羧酸用HATU活化，然后与Cy3-PAMAM的胺反应，形成结合在Cy3-PAMAM和SO1861之间的pH稳定酰胺。通过MALDI-TOF-MS检测得到的缀合物质量，质量为m/z62.3kDa，其对应于Cy3-PAMAM-NC-SO1861(NC＝不可裂解的)缀合物，每个PAMAM连接有17.5个SO1861分子(图70的B，图73)。
接下来，通过所谓的菌株促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC，点击化学)将皂苷缀合的支架缀合到连接点，以便可能与靶向治疗剂(例如靶向毒素)缀合以获得功能化支架。对于该反应，Cy3-PAMAM-SO1861(图74的C、D)和Cy3-PAMAM-NC-SO1861(图74的B)与异双功能NHS-PEG13-DBCO连接子缀合，在缀合物表面产生应变炔(图74的A)。连接子的NHS(N羟基琥珀酰亚胺)部分与PAMAM-皂苷缀合物的剩余胺反应，在支架和连接子之间形成酰胺键。缀合物上产生的DBCO(二苯并环辛炔)部分能够与相应的叠氮化物对靶向治疗剂进行SPAAC。
石竹素-EGF作为模型靶向毒素，而石竹素作为非靶向毒素。两种毒素均使用染料的四氟苯酯(TFP)衍生物用Alexa FluorTM488进行标记。然后将染料标记的蛋白质与异双功能NHS-SS-PEG3-叠氮化物连接子缀合，以获得SPAAC与PAMAM-皂苷缀合物的相应化学部分。Maldi-TOF-MS测量结果表明，每个石竹素-EGF分子都连接了一个Alexa FluorTM488染料和9个NHS-SS-PEG3-叠氮化物分子(图75、图76)。此外，Alexa FluorTM488标记的石竹素-EGF与缺乏二硫键的异双功能NHS-PEG12-叠氮化物连接子缀合，并因此会产生不可毒素裂解的构建体。
Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO和Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO缀合物与AlexaFluorTM488标记的叠氮基毒素反应以进行菌株促进的炔烃-叠氮环加成反应。通过凝胶电泳和仅连接在PAMAM多聚物上的Cy3和仅连接在聚丙烯酰胺凝胶上的毒素上的AlexaFluorTM488的荧光信号的共定位来指示反应试剂之间的缀合(凝胶电泳后)(图77)。
作为PAMAM树枝状大分子的可替代多聚结构，具有16个功能性氨基端基和焦点处的叠氮基的G4-树枝化基元(PFd-G4-叠氮化物-NH-BOC，Polymer Factory)被用于与SO1861的缀合(图84)。使用树枝化基元而不是树枝状大分子的优势在于树枝化基元所展示的焦点。该焦点允许直接结合靶毒素，无需使用正交点击功能对其进行后修饰(图85)。如图85所示，树枝化基元经历了与PAMAM树枝状大分子所述相同的方法。简而言之，在部分染料标记和脱保护后(图86)，使用硫醇化试剂2-亚氨基硫烷将树枝化基元的氨基转化为硫醇，然后与SO1861-EMCH缀合。对于与SO1861-EMCH的缀合，使用了SO1861-EMCH的三种不同进料当量。树枝化基元-SO1861缀合物通过MALDI-TOF-MS进行分析。正如预期的那样，当使用3和10的低SO1861-EMCH进料当量时，获得了每个树枝化基元的1和2个SO1861分子的缀合物种类(图87的B、C)。当使用相当于每个树枝化基元22个SO1861-EMCH分子的进料当量时，获得了每个树枝化基元高达9个SO1861分子的更高的树枝状分子-SO1861缀合物种类(图87的A)。在进一步的实验中，皂苷功能化的树枝化基元将在其焦点上与靶标毒素缀合以产生功能化的支架，并将进行生物学评估。
前面的实施例表明，已经开发出一种方法，其允许将确定量的SO1861分子或其它内体逃逸增强剂分子与多聚结构缀合，以增强治疗性物质(例如靶向毒素)的细胞质递送。
为了进一步测试SO1861与多聚物结构的其它缀合方法，使用了还原胺化途径。为此，SO1861的醛基直接与PAMAM胺缀合，形成亚胺键。通过添加还原剂氰基硼氢化钠在SO1861和PAMAM之间形成pH稳定的胺键，在亚胺键形成之后进行还原胺化步骤(图78的A)。类似于EMCH和HATU方法，该方法允许控制每个多聚物的缀合皂苷数量，如图78的B、C所示。此处，生产了PAMAM-皂苷缀合物，其数量为10(图78的B)和每个PAMAM有30个(图78的C)SO1861分子。
在所讨论的多聚物和蛋白质方法中开发SO1861支架的另一种方法是聚(SO1861)方法。这种方法的想法是生成仅由SO1861分子组成的多聚物，具有释放SO1861的pH敏感可裂解键。此外，聚(SO1861)应该能够对毒素和生物聚合物进行缀合反应。这种方法的主要目标是使其尽可能简单和具有成本效益。由于已经开发了产生酸可裂解SO1861的方案(SO1861-EMCH方法)，看看是否有可能通过简单地添加聚合引发剂来聚合SO1861-EMCH而无需进一步修改SO1861或识别SO1861分子上的其它缀合位点。过去，有几篇论文讨论了通过使用自由基引发剂来聚合马来酰亚胺基团，这些引发剂会攻击马来酰亚胺基团的双键，从而沿着马来酰亚胺基团的双键引发自由基聚合(29-31)。由于SO1861-EMCH在其结构中显示了一个马来酰亚胺基团，该基团可能被探索用于自由基聚合反应，以产生具有酸裂解功能的聚(SO1861)。如果聚合反应具有合理的反应时间，则生成的SO1861多聚物可以用自由基淬灭剂淬灭，自由基淬灭剂不仅可以淬灭反应，还可以生成用于毒素或生物多聚物缀合的官能团。图79中说明了这样的反应方案。这里，过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)的系统以示例方式显示为自由基产生剂，氨基丙硫醇用作模型自由基猝灭剂。使用氨基丙硫醇作为猝灭剂示例，可以将生成的胺基团具体地进一步修饰为可点击的基团或用于将聚(SO1861)直接缀合到毒素上。
在自由基聚合中，反应条件对聚合物性质和反应结果有巨大影响。例如，温度、单体浓度和引发剂浓度对形成聚合物起着主要作用，必须根据所期望的聚合物性质进行微调。由于自由基聚合通常在50℃以上的温度下进行，因此第一反应是在60℃的温度下进行的。有趣的是SO1861-EMCH聚合是否可以自发引发以及APS和TMEDA是否会对聚合度产生影响。因此，使用相同的SO1861-EMCH浓度进行了三个反应，但它们的APS/TMEDA组成不同。在第一反应中，仅将SO1861-EMCH加热至60℃并保持3h，而第二反应包含SO1861-EMCH和APS，第三反应包含SO1861-EMCH、APS和TMEDA。(对于这些实验，使用的起始材料的量和浓度与材料和方法部分“聚(SO1861)合成”中提到的相同)。如图80的A-C所示，批次已通过MALDI-TOF-MS进行分析。有趣的是，已经表明SO1861-EMCH在加热到60℃时开始自发形成由2、3、4、5和6个SO1861分子组成的寡聚物(图80的A)。在相同温度下添加11-3当量APS对这一趋势没有影响(图80的B)。然而，当使用APS/TMEDA的引发剂系统时，最多可以检测到9个SO1861分子的SO1861寡聚物，其分子量为18.2kDa(图80的C)。此外，与图80的A和B中的峰相比，获得的寡聚物峰似乎要大得多，这表明该反应消耗了更高的SO1861-EMCH。
为了进一步微调反应条件，将测试其它引发剂，诸如偶氮引发剂，如2,2'-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]和偶氮双异丁腈，以及其它聚合技术，诸如作为受控自由基聚合(原子转移自由基聚合、可逆加成-断裂链转移等)。此外，可以考虑使用另一种酰肼连接子作为EMCH的替代物，其获得比马来酰亚胺基团更适合自由基聚合的官能团(例如丙烯酰基或丙烯醇残基)。
另一开发SO1861支架的方法是DNA方法。这种方法的想法是利用所谓的DNA折纸的概念(Kolb等人，2004年；Bird等人，1988年)。DNA折纸作为聚合或组装的聚合结构将皂苷与其结合，可以提供几个固有的优势，包括稳定性、可扩展性和对所得DNA皂苷支架的最终尺寸和形状的精确控制。由于这些DNA纳米载体由天然DNA组成，因此它们具有生物相容性，对活细胞没有毒性，并且可以减轻货物从内部细胞隔室中的释放。这种结构的多价性可以进一步允许微调靶向能力和各种有效载荷(如荧光团和毒素)的高容量。因此，在这种方法中，鉴定出的DNA链分别在3'和5'末端提供化学官能团，并且只能在序列的某些所需区域进行杂交，从而可以控制构建体的最终形状。化学基团应用于缀合皂苷，例如通过已经开发的SO1861-EMCH与3'和5'DNA链之一上的硫醇基团之间的硫醇-烯反应。互补的DNA链可以提供一个点击功能组，其可以被用于与靶标毒素缀合。该概念如图81所示。
通过使用特定的肽序列而不是能够结合和释放皂苷并且可以聚合形成大的聚(肽)样结构的DNA链，可以想象类似的方法。在此方法中，已鉴定并购买了长度与SO1861-EMCH分子的计算大小相符的肽序列，该序列在序列中间提供了一个半胱氨酸残基，并且在N-末端和C-末端两处提供了胺基。半胱氨酸残基可以被用于通过SO1861-EMCH的马来酰亚胺基团和半胱氨酸残基的硫醇基团的硫醇-烯反应缀合SO1861-EMCH。如图82所示的，两个胺基团可以被用于聚合肽-SO1861缀合物与合适的交联剂。
缀合研究表明SO1861-EMCH与定制肽(序列：SESDDAMFCDAMDESDSK)的缀合是成功的。通过MALDI-TOF-MS分析在序列中间带有马来酰亚胺反应性半胱氨酸的肽及其与SO1861-EMCH的缀合(图83)。MALDI-TOF-MS谱显示了肽-SO1861缀合物的预期峰在m/z4053Da处和一个另外的峰在m/z3821Da，它是SO1730的相应皂苷-EMCH的肽-SO1861缀合物。由于SO1861-EMCH已略微过量使用(1.3当量)并且反应后未检测到SO1861-EMCH峰，因此可以假设缀合是定量的。为了开始肽-SO1861的第一次聚合反应，酒石酸二琥珀酰亚胺酯将被用作胺反应性交联剂。
由于SO1861的内体逃逸增强性质仅在低内体pH值(<pH5)下暴露，因此支架或功能化支架不应包含能够干扰内体酸化并因此阻断SO1861活性的化学基团。
测试了G5PAMAM(128个伯胺以及大约126个叔胺)和G4-树枝化基元(16个伯胺)的含胺多聚结构，以确定这些分子是否抑制SO1861的内体逃逸增强能力。在HeLa细胞上进行PAMAM(天然或硫醇化)或树枝化基元(天然)与石竹素-EGF和各种SO1861浓度的组合施用实验。使用氯喹作为抑制内体酸化的对照。
HeLa细胞显示出足够的EGFR细胞表面水平(图88的A)。据观察，‘天然’PAMAM和氯喹均抑制SO1861介导的靶向毒素的内体逃逸以及Hela细胞中随后的细胞杀伤(图88的B)。500nM的PAMAM抑制甚至与内体酸化抑制剂氯喹同等程度，而667nM的树枝化基元根本没有效果。为了进一步确定‘天然’PAMAM的抑制活性是否是由于PAMAM中氨基的可用性，PAMAM的伯氨基通过与2-亚氨基硫烷反应而部分硫醇化(图89)，导致128个中的16个(图89的C)、65/128(图89的D)和108/128(图89的E)个封闭的伯胺。观察到65和108个伯胺的硫醇化克服了SO1861介导的内体逃逸的抑制，而多达16个胺基团的硫醇化仍显示出SO1861介导的靶向毒素内体逃逸的抑制作用(图88的C)。PAMAM的伯氨基也通过与mPEG2k-NHS的反应部分PEG化(图90)，产生128个中的3个(图90的C)、8/128(图90的D)和18/128(图90的E))个封闭的伯胺。通过PEG化仅阻断3个伯胺已经足以逆转对SO1861介导的内体逃逸的抑制(图89的D)。PEG化的屏蔽效应很可能超出了转化的少量胺，因为已知PEG化会引入一个水合层，如果达到足够的水平，可以屏蔽整个分子。
这些结果表明，多聚结构(如PAMAM)上存在一定数量的游离氨基可以阻断内体酸化，从而抑制SO1861或其它糖苷的内体逃逸活性。当氨基的数量较少时，如G4-树枝化基元所示，或者如果氨基已被屏蔽，如硫醇化或PEG化，抑制作用就会逆转。
参考文献
Weng,A.；Thakur,M.；Beceren-Braun,F.；Bachran,D.；Bachran,C.；Riese,S.B.；Jenett-Siems,K.；Gilabert-Oriol,R.；Melzig,M.F.；Fuchs,H.The toxin component oftargeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase bysaponins.Molecular oncology 2012,6,323-332.
saponinum album in a synergistic way.Journal of immunotherapy 2009,32,713-725.
Sama,S.；Jerz,G.；Schmieder,P.；Joseph,J.F.；Melzig,M.F.；Weng,A.Plantderived triterpenes from Gypsophila elegans M.Bieb.enable non-toxic deliveryof gene loaded nanoplexes.Journal of Biotechnology 2018,284,131-139.
Kolb,H.C.；Finn,M.G.；Sharpless,K.B.Click Chemistry:Diverse ChemicalFunction from a Few Good Reactions.Angewandte Chemie 2001,40,2004-2021.
Bird,R.E.；Hardmann,K.D.；Jacobson,J.W.；Johnson,S.；Kaufman,B.M.；Lee,S.M.；Lee,T.；Pope,S.H.；Riordan,G.S.；Whitlow,M.Single-chain antigen-bindingproteins.Science 1988,242,423-426.
Y Zhang,Z Qu,S Kim,V Shi,B Liao1,P Kraft,R Bandaru,Y Wu,LMGreenberger and ID Horak,Down-modulation of cancer targets using lockednucleic acid(LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection,GeneTherapy(2011)18,326–333.

Claims (48)

1.第一蛋白质分子，其包含用于结合第一细胞表面分子的第一表位的第一结合位点，所述第一蛋白质分子具有至少一个皂苷，所述至少一个皂苷通过至少一个连接子和/或通过寡聚或多聚支架与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合或直接与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价结合。
2.根据权利要求1所述的第一蛋白质分子，其中所述第一结合位点包含以下或由以下组成：免疫球蛋白、或免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，诸如抗体、IgG、包含Vhh结构域或Vh结构域的分子或由Vhh结构域或Vh结构域组成的分子、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段，和/或包含与细胞表面分子结合的至少一种配体诸如EGF或细胞因子或由与细胞表面分子结合的至少一种配体诸如EGF或细胞因子组成。
3.根据权利要求1或2的所述第一蛋白质分子，其中所述第一细胞表面分子的第一表位是第一肿瘤细胞表面分子的肿瘤细胞特异性第一表位，更优选为特异性存在于肿瘤细胞的第一肿瘤细胞表面受体的肿瘤细胞特异性第一表位。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是三萜皂苷和/或在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，并且任选地在皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包含葡糖醛酸官能团，和/或分离自霞草属(Gypsophila)物种和/或皂属(Saponaria)物种和/或麦仙翁属(Agrostemma)物种和/或皂树属(Quillaja)物种例如皂皮树(Quillaja saponaria)的皂苷。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是单一特定皂苷或者是两种或更多种不同皂苷的混合物，诸如以下中的一种或多种：表A1或方案1中的皂苷、SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、皂素集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、或它们的立体异构体中的任一种和/或它们的任意组合，优选所述皂苷是SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21和/或具有皂皮酸糖苷核、在C-3β-OH基团处的Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA碳水化合物取代基和在C-28-OH基团处的Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc碳水化合物取代基的皂苷，和/或是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖醛基皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃喹啉基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选所述皂苷是SO1861和/或QS-21。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷为分子量为至少1,500道尔顿并且包含含有在C-23位置处的醛基以及任选在C-16位置处的羟基的齐墩果型三萜，具有在C-3位置处的第一支链碳水化合物侧链的双糖链皂苷，所述第一支链碳水化合物侧链任选含有葡糖醛酸，其中所述皂苷含有酯基和在C-28位置处的第二支链碳水化合物侧链，所述第二支链碳水化合物链优选包含至少四个碳水化合物单元，其任选含有至少一个乙酰基残基如两个乙酰基残基，和/或任选地包含脱氧碳水化合物和/或任选地包含异鼠李糖和/或任选包含葡萄糖和/或任选包含4-甲氧基肉桂酸和/或任选包含5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸和/或任选包含通过酯键与碳水化合物结合的5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基辛酸，或其中至少一个皂苷是QS-21或以下中的任一种或多种：QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS-18、QS1861、质子化QS1861(QS1862)、Quil-A。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是属于在位置C-23中具有醛官能团的12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，其中所述至少一个皂苷通过所述皂苷中的醛官能团，优选地位置C-23中的所述醛官能团，优选地通过至少一个连接子，更优选地通过至少一个可裂解的连接子与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价偶联，其中所述氨基酸残基优选地选自半胱氨酸和赖氨酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷是在位置C-23中具有醛官能团的属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，并且包含在所述皂苷的C-3β-OH基团处碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团，其中所述至少一个皂苷通过在所述皂苷的C-3β-OH基团处碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团，优选通过至少一个连接子，与所述第一蛋白质分子的氨基酸残基共价偶联，其中所述氨基酸残基优选地选自半胱氨酸和赖氨酸。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷的位置C-23中的醛官能团与连接子N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼共价偶联，所述连接子通过硫醚键与所述第一蛋白质分子中的巯基诸如半胱氨酸的巯基共价偶联。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的第一蛋白质分子，其中在所述至少一个皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团与连接子1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯共价偶联，所述连接子通过酰胺键与所述第一蛋白质分子中的胺基团诸如赖氨酸的胺基团或所述第一蛋白质分子的N-末端共价偶联。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点结合的所述第一细胞表面分子的第一表位是所述肿瘤细胞特异性受体的肿瘤细胞特异性第一表位，所述肿瘤细胞特异性受体优选地选自：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、血管整合素α-V、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，更优选地选自：CD71、EGFR、HER2。
12.根据权利要求3或11所述的第一蛋白质分子，其中所述肿瘤细胞特异性第一表位、第一肿瘤细胞表面分子或第一肿瘤细胞特异性受体是在权利要求1-11中任一项所述的第一蛋白质分子与所述第一表位或所述第一分子或所述第一受体结合后被所述肿瘤细胞内化的第一表位或第一分子或第一受体，并且其中优选地，当所述第一蛋白质分子与包含所述第一表位的细胞表面分子、肿瘤细胞表面分子或肿瘤细胞特异性受体结合时，经受例如通过内吞作用的肿瘤细胞受体介导的内化，或例如通过内吞作用的肿瘤细胞表面分子介导的内化。
13.根据权利要求11或12所述的第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点包含以下中的任一种或由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，优选它们的至少一种肿瘤细胞特异性受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞特异性受体结合域。
14.治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：
(a)第一药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的第一蛋白质分子和任选的药学上可接受的赋形剂；和
(b)第二药物组合物，其包含不同于所述第一蛋白质分子的第二蛋白质分子，所述第二蛋白质分子包含用于结合不同于所述第一细胞表面分子的第二细胞表面分子的第二表位的第二结合位点，并且包含效应子部分，所述第二药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂，其中所述第二表位不同于所述第一表位。
15.根据权利要求14所述的治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：
(a)权利要求14所述的第一药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述第一细胞表面分子上的所述第一表位是第一肿瘤细胞特异性表面分子上的肿瘤细胞特异性第一表位，优选地特异性存在于肿瘤细胞的第一细胞表面受体上的肿瘤细胞特异性第一表位；和
(b)权利要求14所述的第二药物组合物，其中所述第二细胞表面分子是不同于所述第一肿瘤细胞特异性表面分子的第二肿瘤细胞特异性表面分子，优选地特异性存在于肿瘤细胞的第二细胞表面受体不同于特异性存在于所述肿瘤细胞的所述第一细胞表面受体，并且其中所述第二表位是肿瘤细胞特异性第二表位。
16.治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：
(a)权利要求14或15所述的第一药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的第一蛋白质分子并且包含用于结合所述第一细胞表面分子上的所述第一表位的所述第一结合位点，所述第一药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂；和
(b)包含第三蛋白质分子的第三药物组合物，所述第三蛋白质分子包含用于结合(a)的细胞表面分子上的所述第一表位的所述第一结合位点和效应子部分，所述第三药物组合物任选地还包含药学上可接受的赋形剂，
其中所述第一蛋白质分子的第一结合位点和所述第三蛋白质分子的第一结合位点相同，并且其中所述第一蛋白质分子能够结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的第一表位与所述第三蛋白质分子能够结合的所述第一细胞表面分子和所述第一细胞表面分子上的第一表位相同。
17.治疗性组合，其中所述治疗性组合包含：
(a)权利要求16所述的第一药物组合物；和
(b)权利要求16所述的第三药物组合物，
其中所述第一细胞表面分子在肿瘤细胞表面上表达，并且优选地所述第一细胞表面分子是肿瘤细胞特异性表面分子，并且其中优选地所述第一表位是第一肿瘤细胞特异性表位。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的第一蛋白质分子或权利要求14-17中任一项所述的治疗性组合，其中用于结合所述第一细胞表面分子上的所述第一表位的所述第一结合位点是特异性存在于肿瘤细胞的第一细胞表面受体上的肿瘤细胞特异性第一表位的结合位点。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的治疗性组合，其中所述第二蛋白质分子的第二结合位点和/或所述第三蛋白质分子的第一结合位点包含以下或由以下组成：免疫球蛋白、免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，例如抗体、IgG、包含Vhh结构域或Vh结构域的分子或由Vhh结构域或Vh结构域组成的分子、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段，和/或包含与细胞表面分子结合的至少一种配体诸如EGF或细胞因子或由与细胞表面分子结合的至少一种配体诸如EGF或细胞因子组成。
20.根据从属于权利要求14或15或18中的任一项时的权利要求14、15或18、19中任一项所述的治疗性组合，其中用于结合所述第二表位的所述第二蛋白质分子的第二结合位点是特异性存在于所述肿瘤细胞的第二细胞表面受体上的肿瘤细胞特异性第二表位的第二结合位点，其中所述第二结合位点不同于所述第一结合位点。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的第一蛋白质分子或从属于权利要求14或15或18或19中的任一项时的权利要求14、15或18、19、20中任一项所述的治疗性组合，其中所述第一和第二蛋白质分子包含分别用于结合第一和第二肿瘤细胞特异性受体上的第一和第二肿瘤细胞特异性表位的所述第一和第二结合位点，所述受体不同并且存在于同一肿瘤细胞，其中所述第一和第二结合位点不同并且所述第一和第二肿瘤细胞特异性表位不同。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的第一蛋白质分子或从属于权利要求16-19中任一项时的权利要求16、17或18-20中任一项所述的治疗性组合，其中所述第一和第三蛋白质分子包含相同的第一结合位点，其用于结合第一肿瘤细胞特异性受体上的第一肿瘤细胞特异性表位。
23.根据权利要求21或22所述的第一蛋白质分子或治疗性组合，其中所述第一受体和/或第二受体选自：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、血管整合素αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，优选地选自：CD71、EGFR、HER2。
24.根据权利要求21或23所述的第一蛋白质分子和/或权利要求21或23所述的治疗性组合，其中所述第一和第二肿瘤细胞特异性受体在与权利要求1-21或23中任一项所述的第一蛋白质分子和/或从属于权利要求14或15或18-21中任一项时的权利要求14、15或18-21或23中任一项所述的第二蛋白质分子结合后被所述肿瘤细胞内化，并且其中优选所述第一蛋白质分子和/或所述第二蛋白质分子分别与所述第一和第二肿瘤细胞特异性受体的结合导致所述第一蛋白质分子和所述第一肿瘤细胞特异性受体的复合物以及所述第二蛋白质分子和所述第二肿瘤细胞特异性受体的复合物的例如通过内吞作用的肿瘤细胞受体介导的内化。
25.根据权利要求22或23所述的治疗性组合或权利要求22或23所述的第一药物组合物，其中所述第一肿瘤细胞受体，优选所述第一肿瘤细胞特异性受体，在与权利要求1-20、22或23中任一项所述的第一蛋白质分子结合后和/或在与从属于权利要求16-20中任一项时的权利要求16、17或18-20、22中任一项所述的第三蛋白质分子结合后被所述肿瘤细胞内化，并且其中优选地，所述第一蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子与诸如所述第一肿瘤细胞特异性受体的所述第一肿瘤细胞受体的结合之后是所述第一蛋白质分子和所述第一肿瘤细胞受体的复合物以及所述第三蛋白质分子和所述第一肿瘤细胞受体的复合物的例如通过内吞作用的肿瘤细胞受体介导的内化。
26.根据从属于权利要求1-15或18-21中任一项时的权利要求1-15或18-21或24中任一项所述的第一蛋白质分子，和/或权利要求14、15、18-21或24中任一项所述的治疗性组合，其中所述第一结合位点和/或所述第二结合位点是或包含单克隆抗体或其至少一种细胞表面分子结合片段和/或结构域，并且优选地包括以下中的任一种或者由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体和表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种细胞表面分子结合片段或结构域，条件是所述第一蛋白质分子的所述第一结合位点不同于所述第二蛋白质分子的所述第二结合位点。
27.根据从属于权利要求16-20中的任一项时的权利要求16、17或18-20、22中任一项所述的治疗性组合或从属于权利要求16-20中的任一项时的权利要求16、17或18-20中任一项所述的第一药物组合物，其中所述第一蛋白质分子和所述第三蛋白质分子的所述第一结合位点包含单克隆抗体或其细胞表面分子结合结构域和/或片段中的至少一种，并且优选地包括以下中的任一种或者由以下中的任一种组成：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种细胞表面分子结合片段或结构域，条件是所述第一蛋白质分子的所述第一结合位点与所述第三蛋白质分子的所述第一结合位点相同。
28.根据权利要求14-27中任一项所述的治疗性组合，其中所述第二蛋白质分子的所述第二结合位点和/或所述第三蛋白质分子的第一结合位点是或包含单克隆抗体或其至少一种细胞表面分子结合片段或结构域，并且优选地包括以下中的任一种或由以下中的任一种组成：吉妥珠单抗ozogamicin、本妥昔单抗vedotin、曲妥珠单抗emtansine、奥英妥珠单抗ozogamicin、莫西妥单抗pasudotox和波妥珠单抗vedotin以及表A2和表A3的抗体-药物缀合物。
29.根据权利要求14-28中任一项所述的治疗性组合，其中由所述第二蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含以下中的任一种或多种，或者由以下中的任一种或多种组成：寡核苷酸，核酸，异种核酸，优选选自载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基乙烯桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或它们的衍生物中的任一种或多种，更优选地BNA，例如沉默HSP27蛋白表达的BNA。
30.根据权利要求14-29中任一项所述的治疗性组合，其中由所述第二蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含至少一种蛋白质分子或由至少一种蛋白质分子组成，优选选自以下中的任一种或多种：肽、蛋白质、诸如脲酶和Cre-重组酶的酶、核糖体失活蛋白质、蛋白质毒素，更优选选自以下中的任一种或多种：选自表A5的蛋白质毒素中的任一种或多种和/或病毒毒素，诸如凋亡素；细菌毒素，诸如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，诸如α-八叠球菌素；植物毒素，其包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，诸如石竹素，例如石竹素-30或石竹素-32，皂草素，例如皂草素-S3或皂草素-S6、bouganin或bouganin的去免疫化的衍生物debouganin，志贺样毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫迪素、莫迪素A链、相思豆蛋白毒素、相思豆毒素A链、蒴莲素、蒴莲素A链、槲寄生素、槲寄生素A链；或动物或人类毒素，诸如青蛙核糖核酸酶，或来自人类的颗粒酶B或血管生成素，或它们的任何片段或衍生物；优选地，所述蛋白质毒素是石竹素和/或皂草素。
31.根据权利要求14-30中任一项所述的治疗性组合，其中由所述第二蛋白质分子和/或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分包含至少一种有效载荷或由至少一种有效载荷组成，优选地选自靶向核糖体的毒素、靶向延伸因子的毒素、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素中的任一种或多种，更优选地emtansine、pasudotox、美登素衍生物DM1、美登素衍生物DM4、单甲基澳瑞他汀E(MMAE，vedotin)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF，mafodotin)、卡利奇霉素、N-乙酰基-γ卡利奇霉素、吡咯并苯二氮卓(PBD)二聚体、苯二氮卓、CC-1065类似物、倍癌霉素、阿霉素、紫杉醇、多西他赛、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚并苯二氮卓、AZ13599185、念珠藻素、根霉素、甲氨蝶呤、蒽环霉素、喜树碱类似物、SN 38、DX 8951f、依喜替康甲磺酸盐、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、倍癌霉素衍生物、鹅膏蕈碱、α-鹅膏蕈碱、spliceostatin、泰兰斯他汀、ozogamicin、tesirine、Amberstatin269和soravtansine、或它们的衍生物。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述第一蛋白质分子包含多于一个皂苷，优选2、3、4、5、6、8、10、16、32、64或1-100个皂苷，或它们之间的任意数量的皂苷，诸如7、9、12个皂苷，其直接共价结合至所述第一蛋白质分子的氨基酸残基，优选地结合至半胱氨酸和/或赖氨酸，和/或通过至少一个连接子和/或通过至少一个可裂解连接子和/或通过至少一个多聚或寡聚支架优选地1-8个此类支架或2-4个此类支架共价结合，其中所述至少一个支架任选地是基于树枝化基元，其中1-32个皂苷诸如2、3、4、5、6、8、10、16、32个皂苷，或它们之间任意数量的皂苷诸如7、9、12个皂苷共价结合至至少一个支架。
33.根据权利要求7-32中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个连接子是不可裂解的连接子或可裂解的连接子，其中所述可裂解的连接子例如在酸性条件、还原条件、酶促条件或光诱导条件经受裂解，优选地所述可裂解的连接子包含当与皂苷结合时会在酸性条件下经受裂解的腙键或酰肼键，和/或包含易于蛋白水解的键，例如组织蛋白酶B的蛋白水解，和/或者是当与皂苷结合时易于在还原条件下裂解的键，诸如二硫键。
34.根据权利要求7-33中任一项所述的第一蛋白质分子，其中当所述可裂解连接子与皂苷结合时，所述可裂解的连接子在哺乳动物细胞，优选人细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH4.0-6.5，更优选在pH≤5.5时，在体内经受裂解。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述寡聚或多聚支架包含多聚或寡聚结构并且包含化学基团，所述化学基团用于将所述支架共价连接至所述第一蛋白质分子的氨基酸残基。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述至少一个皂苷通过权利要求32-34中任一项所述的至少一个可裂解连接子共价结合至所述寡聚或多聚支架的多聚或寡聚结构。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的第一蛋白质分子，其中用于将所述寡聚或多聚支架共价偶联至所述第一蛋白质分子的氨基酸残基的所述寡聚或多聚支架的化学基团是点击化学基团，优选地选自四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或这些基团的环状衍生物，更优选地，所述化学基团是叠氮化物。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的第一蛋白质分子，其中所述寡聚或多聚支架的多聚或寡聚结构包含线性、支化和/或环状多聚物、寡聚物、树枝状大分子、树枝化基元、树枝化多聚物、树枝状寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇或这些多聚或寡聚结构的组装体，所述组装体优选通过共价交联建立。
39.组合物，其包含权利要求1-38中任一项所述的第一蛋白质分子和权利要求14、15或18-38中任一项所述的第二蛋白质分子。
40.组合物，其包含权利要求1-38中任一项的第一蛋白质分子和权利要求16-38中任一项所述的第三蛋白质分子。
41.根据权利要求39或40所述的组合物，其中由所述第二蛋白质分子或所述第三蛋白质分子所包含的效应子部分是权利要求29所述的效应子部分中的任一种，优选BNA。
42.组合物，其包含权利要求1-41中任一项所述的第一蛋白质分子以及寡核苷酸、核酸和异种核酸中的任一种或多种，优选选自以下中的任一种：载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯吗啉代寡聚体(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2’-脱氧-2’-氟阿拉伯核酸(FANA)、2’-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2’-O,4’-氨基乙烯桥接核酸、3’-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)或它们的衍生物，更优选BNA，例如沉默HSP27蛋白表达的BNA。
43.抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物，其包含权利要求1-42中任一项所述的第一蛋白质分子和效应子部分。
44.如权利要求43所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物，其中所述抗体能够与以下中的任一种结合：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、多配体蛋白聚糖-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素α-V、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝配蛋白A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，更优选选自：CD71、EGFR、HER2，和/或是或包含以下中的任一种：西妥昔单抗、达雷木单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、本妥昔单抗、奥英妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、IgG型OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那妥珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或它们的至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，和/或其中所述抗体-药物缀合物包含以下中的任一种：吉妥单抗ozogamicin、本妥昔单抗vedotin、曲妥珠单抗emtansine、奥英妥珠单抗ozogamicin、莫西妥单抗pasudotox和波妥珠单抗vedotin以及表A2和表A3的抗体-药物缀合物，或其中所述配体-药物缀合物包含用于结合细胞表面分子的至少一种配体诸如EGF或细胞因子。
45.如权利要求43或44所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物，其中所述效应子部分是权利要求29-31所述的效应子部分中的任一种或多种。
46.药物组合物，其包含权利要求39-42中任一项所述的组合物或权利要求43-45中任一项所述的抗体-药物缀合物或权利要求43-45中任一项所述的配体-药物缀合物，以及任选地还包含药学上可接受的赋形剂。
47.权利要求14-38中任一项所述的治疗性组合或权利要求39-42中任一项所述的组合物或权利要求43-45中任一项所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物或权利要求46所述的药物组合物，其用作药物。
48.权利要求14-38中任一项所述的治疗性组合或权利要求39-42中任一项所述的组合物或权利要求43-45中任一项所述的抗体-药物缀合物或配体-药物缀合物或权利要求46所述的药物组合物，其用于治疗或预防癌症或自身免疫性疾病。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114222750A (zh) * 2019-07-25 2022-03-22 萨普雷米科技有限公司 改善治疗窗的皂苷衍生物

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017281497B2 (en) 2016-06-22 2023-04-06 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded RNA-editing oligonucleotides
US11491247B2 (en) 2017-05-02 2022-11-08 Cornell University Methods and reagents for tumor targeting with greater efficacy and less toxicity
AU2019411278A1 (en) * 2018-12-21 2021-08-12 Sapreme Technologies B.V. Saponin conjugates
CN113527498B (zh) * 2020-04-16 2022-03-04 上海洛启生物医药技术有限公司 抗Trop2纳米抗体及其应用
IL299360A (en) * 2020-06-24 2023-02-01 Sapreme Tech Bv Combination of antibody-drug conjugation and antibody-saponin conjugation
CN116261469A (zh) * 2020-06-24 2023-06-13 萨普雷米科技有限公司 包含含有vhh的adc或aoc和皂苷或配体-皂苷缀合物的组合
IL299356A (en) * 2020-06-24 2023-02-01 Sapreme Tech Bv hydrazone derivatives of saponin
CN116194148A (zh) * 2020-06-24 2023-05-30 萨普雷米科技有限公司 GalNAc-寡核苷酸缀合物和皂苷的治疗性组合及其用途
WO2021261992A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of galnac and saponin, therapeutic composition comprising said conjugate and a galnac-oligonucleotide conjugate
EP4171644A2 (en) * 2020-06-24 2023-05-03 Sapreme Technologies B.V. Saponin derivatives for use in medicine
WO2022055351A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of saponin, oligonucleotide and galnac
WO2022055352A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 Sapreme Technologies B.V. Semicarbazone-based saponin conjugate
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
CA3191387A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
WO2022164316A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Sapreme Technologies B.V. Semicarbazone-based saponin conjugate
EP4355369A1 (en) * 2021-06-18 2024-04-24 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of saponin, oligonucleotide and galnac
WO2023038517A1 (en) 2021-09-09 2023-03-16 Sapreme Technologies B.V. Semicarbazone-based saponin conjugate
WO2023121447A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 Sapreme Technologies B.V. Conjugate of a single domain antibody, a saponin and an effector molecule, pharmaceutical composition comprising the same, therapeutic use of said pharmaceutical composition
CA3240612A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Miriam Verena Bujny Targeted saponin-nucleic acid conjugates for treatment of muscle wasting disorders
WO2023121444A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sapreme Technologies B.V. Compositions comprising therapeutic nucleic acid and targeted saponin for the treatment of muscle-wasting disorders
WO2023121445A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Sapreme Technologies B.V. Compositions comprising therapeutic nucleic acid and saponin for the treatment of muscle-wasting disorders
WO2023249473A1 (ko) * 2022-06-24 2023-12-28 주식회사 피노바이오 하나의 항체에 2종의 약물-링커 접합체가 연결된 항체-약물 접합체
WO2024013361A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Oligonucleotides for adar-mediated rna editing and use thereof
WO2024013360A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Proqr Therapeutics Ii B.V. Chemically modified oligonucleotides for adar-mediated rna editing
WO2024046622A1 (en) * 2022-09-01 2024-03-07 Sapreme Technologies B.V. Compositions of polyplexes and saponins
EP4331609A1 (en) * 2022-09-01 2024-03-06 Sapreme Technologies B.V. Methods and compositions for enhanced polyplex delivery
EP4331610A1 (en) * 2022-09-01 2024-03-06 Sapreme Technologies B.V. Polyplex-saponin covalent conjugate

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591829A (en) * 1987-05-29 1997-01-07 Matsushita; Shuzo Antibodies modified with toxic substance
US20120183621A1 (en) * 2010-11-12 2012-07-19 Rutgers, The State University Of New Jersey Synergistic combinations to reduce particle dose for targeted treatment of cancer and its metastases

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5583112A (en) * 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5856571A (en) * 1995-06-07 1999-01-05 Cellpro, Incorporated Semicarbazide-containing linker compounds for formation of stably-linked conjugates and methods related thereto
KR100578317B1 (ko) * 1997-05-20 2006-05-11 갈레니카 파마슈티칼스 인크. 면역보강성 및 면역자극 활성을 갖는 트리테르펜 사포닌유사체
WO2000009075A2 (en) * 1998-08-14 2000-02-24 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified saponins and the use thereof as adjuvants
AU2002240250A1 (en) * 2002-02-04 2003-09-09 Antigenics Inc. Immunostimulant compositions comprising aminoalkyl glucosaminide phosphates and saponins
WO2004092329A2 (en) * 2003-04-08 2004-10-28 Galenica Pharmaceuticals, Inc. Semi-synthetic saponin analogs with carrier and immune stimulatory activities for dna and rna vaccines
EP1623715B1 (en) * 2004-07-13 2012-09-19 Charité - Universitätsmedizin Berlin A composition comprising a pharmacologically active agent coupled to a target cell specific component, and a saponin
CA2578205A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-30 The Regents Of The University Of Michigan Partially acetylated dendrimers and related methods of use
EP1973576B1 (en) 2005-11-28 2019-05-15 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
ES2630205T3 (es) * 2006-11-20 2017-08-18 Duecom Uso de partículas que contengan lípidos que comprenden saponínas quillaja para el tratamiento del cáncer
US20110230430A1 (en) * 2008-03-26 2011-09-22 National Research Council Of Canada Saponin extract from saponaria spp. and uses thereof
US8309614B2 (en) * 2008-04-11 2012-11-13 Cedars-Sinai Medical Center Poly(beta malic acid) with pendant leu-leu-leu tripeptide for effective cytoplasmic drug delivery
WO2011054811A1 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Santaris Pharma A/S Rna antagonists targeting hsp27 combination therapy
EP2569000B1 (en) * 2010-05-13 2017-09-27 Indiana University Research and Technology Corporation Glucagon superfamily peptides exhibiting nuclear hormone receptor activity
CN102652836A (zh) * 2011-03-03 2012-09-05 华中科技大学同济医学院附属协和医院 靶向释药的抗癌蛋白质或多肽聚合物前药及其制备方法
MX2014007121A (es) * 2011-12-14 2014-09-04 Seattle Genetics Inc Nuevos conjugados de principio activo-ligante (adc) y su uso.
WO2014082065A1 (en) * 2012-11-26 2014-05-30 President And Fellows Of Harvard College Trioxacarcins, trioxacarcin-antibody conjugates, and uses thereof
AR095962A1 (es) * 2013-04-01 2015-11-25 Moreinx Ab Nanopartículas, compuestas de esterol y saponina de quillaja saponaria molina, proceso para preparación y uso de las mismas como portadores para moléculas anfipáticas o hidrófobas en el campo de la medicina incluyendo tratamiento de cáncer y compuestos relacionados con alimentos
GB201400994D0 (en) * 2014-01-21 2014-03-05 Ucl Business Plc Drug delivery system
CN106892957B (zh) * 2015-12-17 2018-11-16 广州中医药大学 一种齐墩果烷型三萜皂苷类化合物及其制备方法和应用
EP3469000A1 (en) * 2016-06-08 2019-04-17 AbbVie Inc. Anti-b7-h3 antibodies and antibody drug conjugates
AU2019411278A1 (en) * 2018-12-21 2021-08-12 Sapreme Technologies B.V. Saponin conjugates
WO2022055352A1 (en) * 2020-09-10 2022-03-17 Sapreme Technologies B.V. Semicarbazone-based saponin conjugate

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591829A (en) * 1987-05-29 1997-01-07 Matsushita; Shuzo Antibodies modified with toxic substance
US20120183621A1 (en) * 2010-11-12 2012-07-19 Rutgers, The State University Of New Jersey Synergistic combinations to reduce particle dose for targeted treatment of cancer and its metastases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ROGER GILABERT-ORIOL等: ""Combinatorial approach to increase efficacy of Cetuximab, Panitumumab and Trastuzumab by dianthin conjugation and co-application of SO1861"，Roger Gilabert-Oriol等，《Biochemical Pharmacology》，第97卷，第247-255页", 《BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY》, vol. 97, pages 247 - 255 *
ROGER GILABERT-ORIOL等: "Modified Trastuzumab and Cetuximab Mediate Efficient Toxin Delivery While Retaining Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity in Target Cells", 《MOL. PHARMACEUTICS》, vol. 10, pages 4347 - 4357, XP055677139, DOI: 10.1021/mp400444q *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114222750A (zh) * 2019-07-25 2022-03-22 萨普雷米科技有限公司 改善治疗窗的皂苷衍生物

Also Published As

Publication number Publication date
CA3124064A1 (en) 2020-06-25
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EP3808379A1 (en) 2021-04-21
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SG11202106574UA (en) 2021-07-29
SG11202106612QA (en) 2021-07-29
DK3897738T3 (da) 2024-02-19
EP3897739C0 (en) 2024-04-17
KR20210107073A (ko) 2021-08-31
DK4015003T3 (da) 2023-06-12
KR20210110323A (ko) 2021-09-07
AU2019407234A1 (en) 2021-08-19
WO2020126620A3 (en) 2020-07-23
AU2019411276A1 (en) 2021-08-12
EP3897738B1 (en) 2024-01-24
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EP3773737B1 (en) 2021-09-01
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US20220313834A1 (en) 2022-10-06
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