CN113507941A - 生物活性分子簇 - Google Patents

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covalently
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鲁本·波斯特尔
亨德里克·福斯
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
Saprami Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种适用于将至少一种生物活性分子共价结合到载体分子上的分子支架，所述支架包括：聚合结构和与所述聚合结构共价结合的所述生物活性分子，并且其中支架进一步包括用于将支架共价偶联至载体分子的化学基团。生物活性分子的分子量小于或等于3,000道尔顿，诸如1,700道尔顿至1,950道尔顿。在一些实施方式中，生物活性分子是两亲分子。当多于一种生物活性分子与聚合(或寡聚)结构共价结合时，生物活性分子是单一特定分子或不同类型分子的混合物。特别地，本发明涉及基于单克隆抗体的抗体‑药物缀合物，由于(一组)增效剂分子，例如ADC的有效载荷诸如蛋白质毒素或寡核苷酸的共价连接，或者由于ADC和包括(一组)增效剂分子的细胞靶向缀合物共同给药于有需要的患者，而具有改善的药物治疗窗。本发明还涉及一种用于制备适合于将生物活性分子与载体分子共价结合的支架的方法，从而提供一组增效剂分子。此外，本发明涉及一种用于制备与载体分子共价结合的支架的方法，该支架包括共价结合的生物活性分子，该载体分子包括抗体和有效载荷。

Description

生物活性分子簇
技术领域
本发明涉及适合于将至少一种生物活性分子诸如治疗分子与载体分子共价结合的分子支架。特别地，本发明涉及基于单克隆抗体的抗体-药物缀合物，由于(一组)增效剂分子，例如ADC的有效载荷诸如蛋白质毒素或寡核苷酸的共价连接，或者由于ADC和包括(一组)增效剂分子的细胞靶向缀合物共同给药于有需要的患者，而具有改善的药物治疗窗。本发明还涉及一种用于制备适合于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合的支架的方法，其中这种生物活性分子与支架共价结合。
背景技术
具有治疗生物活性的分子在理论上在许多情况下适合作为有效治疗药物应用，用于治疗有需要的人类患者的疾病诸如癌症。一个典型示例是小分子生物活性部分。然而，目前在临床中使用的许多(如果不是全部)潜在的类药物分子和疗法至少存在诸多缺点和弊端中的一种。当给药于人体时，除了针对待治疗疾病或健康问题的潜在方面的生物学活性之外，治疗活性分子还可以发挥脱靶效应。这种脱靶效应是不希望的，并且存在所给药分子诱发健康甚至危及生命的副作用的风险。正是此类不良事件的发生导致许多类药物化合物和治疗部分未能通过III期临床试验甚至IV期临床试验(上市后跟进)。因此，强烈希望提供药物分子，诸如小分子疗法，其中药物分子的治疗效果应该例如，(1)对驱动疾病的生物因子或生物过程具有高度特异性，(2)足够安全，(3)足够有效，(4)足够针对患病细胞，对非患病细胞几乎没有或没有脱靶活性，(5)具有足够及时的作用方式(例如给药的药物分子应在一定的时间范围内到达人类患者的靶位点，并应在一定的时间范围内停留在靶位点)，和/或(6)在患者体内具有足够长的持续治疗活性等。不幸的是，迄今为止，尽管已经进行了长期和深入的研究，尽管在个别解决的几个领域取得了令人瞩目的进展，但仍遇到了困难和弊端，具有上述许多甚至所有有益特征的“理想”疗法仍无法提供给患者。
化疗是癌症治疗中最重要的治疗选择之一。然而，它通常与较低的治疗窗口相关联，因为与健康组织中的分裂细胞相比，它对癌细胞没有特异性。单克隆抗体的发明提供了利用其特异性结合特性作为将细胞毒性剂靶向递送至癌细胞同时保护正常细胞的机制的可能性。这可以通过细胞毒性效应物(也称为有效载荷或弹头)与抗体的化学缀合来实现，以创建抗体-药物缀合物(ADC)。通常，使用非常强力的有效载荷，诸如丹宁(DM1)，它们的非缀合形式具有有限的治疗指数(毒性剂量与有效剂量的比率)。DM1与曲妥珠单抗(ado-曲妥珠单抗丹宁)的缀合，也称为Kadcycla，在猴中将DM1的耐受剂量提升了至少两倍。在过去的数十年中，已经为研发治疗性ADC做出了巨大的努力和投资。然而，尽管临床前数据很有希望，但将ADC引入临床仍然具有挑战性。在2000年批准用于临床的第一个ADC是吉妥珠单抗奥佐霉素(Mylotarg，CD33靶向，辉瑞/惠氏)，用于治疗复发性急性髓细胞白血病(AML)。然而，由于许多问题包括其安全性，应美国联邦药物管理局(FDA)的要求，Mylotarg被撤出市场。与接受常规化疗的患者相比，接受Mylotarg治疗的患者更容易出现死亡。Mylotarg于2017年再次以更低的推荐剂量、不同的时间表结合化疗或单独使用，以及新的患者群体再次进入市场。迄今为止，只有5个ADC被批准用于临床，同时大约55个ADC的临床研发已停止。然而，人们的兴趣仍然很高，目前约有80种ADC在近600项临床试验中仍处于临床研发阶段。
尽管有可能使用患者通常无法耐受的毒性有效载荷，但低治疗指数(毒性剂量与有效剂量的比率)是导致许多ADC在临床研发中停用的主要问题，这可能由数种机制引起，诸如对正常细胞的脱靶毒性、对细胞毒剂产生抗性以及药物在循环中过早释放。FDA对ADC的系统审查发现，大多数ADC的毒性特征可以根据使用的有效载荷而非使用的抗体进行分类，这表明毒性主要由有效载荷的过早释放决定。在大约55种停用的ADC中，估计至少有23种是由于治疗指数不佳。例如，曲妥珠单抗替西林缀合物(ADCT-502、HER-2靶向、ADC治疗剂)的研发最近因治疗指数狭窄而停用，这可能是由于肺组织中的靶向、组织外效应，其表现了相当的HER2水平。此外，由于缺少主要终点，3期试验中的数个ADC已停用。例如，在新诊断的胶质母细胞瘤的患者中测试的德帕妥珠单抗马服丁缀合物(ABT-414，EGFR靶向，AbbVie)的3期试验，以及在铂类耐药卵巢癌患者中测试的米维妥昔单抗索拉维坦缀合物(IMGN853，叶酸受体α(FRα)靶向，免疫基因)最近停止，显示没有存活益处。需要注意的是，某些ADC的临床使用剂量可能不足以发挥其全部抗癌活性。例如，ado-曲妥珠单抗丹宁在人体中的MTD为3.6mg/kg。在乳腺癌的临床前模型中，ado-曲妥珠单抗丹宁在3mg/kg或以上的剂量水平诱导肿瘤消退，但在15mg/kg时观察到更有力的功效。这表明在临床给药剂量下，ado-曲妥珠单抗丹宁可能不会发挥其最大的潜在抗肿瘤效果。
ADC主要由抗体、细胞毒性部分(诸如有效载荷)和连接子组成。在新ADC的设计和研发中已经提出并实施了数种新策略，以克服现有问题，针对ADC的每个成分。例如，通过识别和验证抗体成分的足够抗原靶点，通过选择在肿瘤中具有高表达水平而在正常组织中很少或不表达的抗原，存在于细胞表面可被循环的ADC进入的抗原，以及结合后允许ADC内化到细胞中的抗原；以及替代活性机制；设计和优化连接子，以提高ADC的溶解度和药物抗体比(DAR)，并克服可将化疗药物转运出细胞的蛋白质诱导的耐药性；通过包含更多有效载荷来提高DAR比率，选择和优化抗体以提高抗体的同质性和可研发性。除了ADC的技术发展外，还正在部署新的临床和转化策略以最大化治疗指数，诸如通过分次给药改变给药方案；进行生物分布研究；包括用于优化患者选择、及早捕获反应信号并监测反应持续时间和深度以及为联合研究提供信息的生物标志物。
具有临床潜力的ADC的一个示例是那些ADC，诸如布伦妥昔单抗维多丁、伊妥珠单抗奥佐霉素、莫西妥单抗pasudotox和波妥珠单抗维多丁，它们被评估为淋巴恶性肿瘤和多发性骨髓瘤的治疗选择。波妥珠单抗维多丁与(恶性)B细胞上的CD79b结合，而匹那珠单抗维多丁与CD22结合，在临床试验中进行了测试，其中ADC均与共同给药的利妥昔单抗结合，利妥昔单抗是一种结合CD20的单克隆抗体，未提供有效载荷[B.Yu和D.Liu，Antibody-drugconjugates in clinical trials for lymphoid malignancies and multiple myeloma；Journal of Hematology&Oncology(2019)12:94]。单克隆抗体的组合(诸如这些示例)是另一种方法，并试图达到结合许多甚至所有上述ADC所期望特征的“灵丹妙药”。
与此同时，在过去的数十年里，基于核酸的疗法正在研发中。治疗性核酸可以基于脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)和短干扰RNA(siRNA)、微RNA以及DNA适配体和RNA适配体，用于诸如基因治疗、RNA干扰(RNAi)等方法。它们中的许多通过抑制DNA表达或RNA表达共享相同的基本作用基础，从而防止与疾病相关的异常蛋白质的表达。基因治疗领域中正在进行的临床试验数量最多，全球有近2600项正在进行或已完成的临床试验，但只有约4％进入第3阶段。随后是ASO的临床试验。与ADC类似，尽管探索了大量技术，但是治疗性核酸在临床研发过程中面临两个主要问题：递送到细胞中和脱靶效应。例如，诸如肽核酸(PNA)、氨基磷酸吗啉代寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)和桥接核酸(BNA)等ASO正被研究作为一种有吸引力的策略来抑制特异性靶向基因，尤其是那些基因难以用小分子抑制剂或中和抗体靶向。目前，正在研究不同ASO在许多神经退行性疾病中的功效，诸如亨廷顿病、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症和肌萎缩侧索硬化症，以及数个癌症阶段。ASO作为潜在治疗剂的应用需要安全有效的方法将其递送到靶细胞和组织的细胞质和/或细胞核。尽管ASO的临床相关性已被证明，但体外和体内的细胞摄取效率低下，限制了ASO的功效，并且一直是治疗发展的障碍。细胞摄取可能小于剂量的2％，导致活性部位的ASO浓度过低，无法获得有效和持续的结果。因此，这需要增加给药剂量，这会导致脱靶效应。最常见的副作用是补体级联的激活、凝血级联的抑制和Toll样受体介导的免疫系统刺激。
化疗药物最常见的是小分子，然而，它们的功效受到严重的脱靶副作用、溶解性差、清除速度快和肿瘤暴露有限的阻碍。支架-小分子药物缀合物，诸如聚合物-药物缀合物(PDC)是具有药理活性的大分子构建体，其包括与载体支架(例如聚乙二醇(PEG))结合的一个或多个小分子药物分子。
这种缀合原理引起了广泛的关注，并且已经被研究了数十年。大多数处于临床前或临床研发阶段的小分子药物的缀合物用于肿瘤适应症。然而，截至2014年，只有一种与癌症无关的药物(Movantik，一种阿片拮抗剂纳洛酮的PEG寡聚物缀合物，阿斯利康)被批准用于治疗慢性疼痛患者的阿片类药物引起的便秘，这是一种非肿瘤适应症。迄今为止，将药物-支架缀合物的应用转化为人类受试者的治疗几乎没有临床成功。例如，PK1(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物多柔比星；Pharmacia，辉瑞公司研发)在小鼠模型的实体瘤和白血病中均显示出强大的抗癌活性，并且正在接受肿瘤适应症的临床研究。尽管它显示出显着降低了非特异性毒性并改善了人体的药代动力学，但在患者中抗癌功效的改善却是微不足道的，因此停止了PK1的进一步研发。
支架-小分子药物缀合物的失败至少部分归因于其在肿瘤部位的不良积累。例如，虽然在小鼠模型中PK1在肿瘤中的积累比在健康组织(肝、肾、肺、脾和心脏)中高45-250倍，但在临床试验中仅在一小部分患者中观察到在肿瘤中的积累。
上述问题的一个潜在解决方案是将纳米颗粒系统应用于药物递送，诸如脂质体。脂质体是由一层或多层磷脂双分子层组成的球形囊泡，当磷脂分散在水中时自发形成。磷脂的两亲性特征为其提供了自组装、乳化和润湿特性，这些特性可用于新药和新药递送系统的设计。封装在脂质体递送系统中的药物与直接给药相比具有多种优势，诸如改善和控制药代动力学和药效学、组织靶向特性、降低毒性和增强药物活性。这种成功的一个示例是脂质体封装形式的小分子化疗药物多柔比星(Doxil：多柔比星的一种聚乙二醇化脂质体封装形式；Myocet：一种非聚乙二醇化脂质体多柔比星)，已被批准用于临床。
因此，仍然需要找到一种解决方案，其允许药物疗法，诸如抗肿瘤疗法，在需要时适用于非全身性使用，其中药物具有例如可接受的安全性、很少的脱靶活性、足够的功效、从患者体内清除率足够低等。
发明内容
对于本发明的一个实施方式，第一个目标是提供改进的生物活性化合物或包括这种改进的生物活性化合物的合成物。
本发明的实施方式的数个目标之一是提供对非特异性问题的解决方案，该问题在向有需要的人类患者施用小分子治疗活性化合物时遇到。本发明的实施方式的数个目标之一是为药物对导致疾病的生物因素或生物过程具有非最佳特异性的问题提供解决方案。本发明的实施方式的数个目标之一是提供一种解决当前药物在给药于有需要的人类患者时安全特征不足的问题的方案。本发明的实施方式的数个目标之一是提供一种解决当前药物在给药于有需要的人类患者时不如预期有效的问题的方案。本发明的实施方式的数个目标之一是提供一种解决当前药物在施用于有需要的人类患者时未充分针对患病细胞而对非患病细胞几乎没有或没有脱靶活性的问题的解决方案。本发明的实施方式的数个目标之一是为当前药物没有足够及时的作用模式的问题提供解决方案(例如，给药的药物分子应在一定时间范围内到达人类患者的目标部位，并应在一定时间范围内停留在目标部位)，当给药于有需要的人类患者时。本发明的实施方式的数个目标之一是提供一种解决当前药物在给药于有需要的人类患者时在患者体内没有足够长的持续治疗活性的问题的方案。
本发明的实施方式的至少一个上述目的通过提供适合于将至少一种生物活性分子诸如治疗分子与本发明的载体分子共价结合的分子支架来实现。
将关于特定实施方式描述本发明，但本发明不限于此而仅由权利要求限制。除非另有说明，否则在本文中描述的本发明的实施方式可以组合和协作操作。
本发明的一个方面涉及一种适用于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合的支架，该支架包括聚合结构或寡聚结构，并且至少一种生物活性分子与所述聚合结构或寡聚结构共价结合，其中支架进一步包括用于将支架与载体分子共价偶联的第一化学基团。
一个实施方式为本发明的支架，其中至少一种生物活性分子的分子量小于或等于3,000道尔顿，优选小于或等于2,500道尔顿，更优选小于或等于2,300道尔顿，最优选小于或等于2,000道尔顿，诸如1,700道尔顿-1,950道尔顿。
一个实施方式为本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是两亲分子。
一个实施方式为本发明的支架，其中当多于一种生物活性分子与支架所包括的聚合结构或寡聚结构共价结合时，至少一种生物活性分子是单一特定分子或不同分子的混合物。
一个实施方式为本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是可以从霞草属(Gypsophila)物种和/或皂属(Saponaria)物种和/或麦仙翁属(Agrostemma)物种和/或皂树属(Quillaja)物种例如皂皮树(Quillaja saponaria)中分离的皂苷，或为单一特定皂苷或为两种或多种不同皂苷的混合物，诸如表A1或方案I中的一种或多种皂苷、SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、皂素集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832，或其任何立体异构体和/或其任何组合，优选皂苷是SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21和/或具有皂皮酸糖苷核的皂苷、在C-3β-OH基团处的Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA碳水化合物取代基和在C-28-OH基团处的Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc碳水化合物取代基，和/或为3-O-β-D-吡喃半乳糖-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-d吡喃葡萄糖醛酸皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4-OAc-β-D-吡喃喹啉-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选皂苷是SO1861和/或QS-21。
一个实施方式为本发明的支架，其中至少一种生物活性分子经由可裂解的键与支架的聚合结构或寡聚结构共价结合，其中可裂解的键在哺乳动物细胞，优选人类细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下在体内经受裂解，优选在pH4.0-6.5，更优选在pH≤5.5。
一个实施方式为本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是限定数量的糖苷分子或限定范围的糖苷分子，优选1-128个或至少2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、16个、32个、64个或128个糖苷分子，或其中的任意数量的糖苷分子，诸如7个、9个、或12个糖苷分子。
一个实施方式为本发明的支架，其中聚合结构或寡聚结构包括线性、支化和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元(dendron)、树枝化聚合物、树枝化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇，或这些聚合结构或寡聚结构的组装体，该组装体优选通过共价交联建立。
一个实施方式为本发明的支架，其中载体分子包括或由以下组成：免疫球蛋白、免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，诸如抗体、IgG、包括或由以下组成的分子：Vhh结构域或Vh结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段，或包括或由以下至少一种组成：非蛋白质配体和/或至少一种用于结合细胞表面分子的蛋白质配体诸如EGF或细胞因子。
一个实施方式为本发明的支架，其中载体分子包括至少一种效应分子或由至少一种效应分子组成，或其中当载体还包括例如一种免疫球蛋白时，载体进一步包括至少一种效应分子，其中效应分子是活性药物物质中的至少一种，诸如有效载荷、毒素、药物、多肽、寡核苷酸、核酸、异种核酸、酶诸如脲酶和Cre-重组酶、蛋白质毒素、或核糖体失活蛋白中的任何一种或多种。
本发明的一个方面涉及一种用于制备适合于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合的支架的方法，该方法包括：a)提供聚合结构或寡聚结构，包括用于将聚合结构或寡聚结构与载体分子共价偶联的第一化学基团并且包括与第一化学基团不同的第二化学基团中的至少一个，其中每个第二化学基团用于将至少一种生物活性分子之一共价偶联至寡聚结构或聚合结构；以及b)经由第二化学基团将至少一种生物活性分子共价偶联至聚合结构或寡聚结构，其中优选地，生物活性分子是本发明的任何一种生物活性分子，诸如皂苷、三萜皂苷、双糖链三萜，更优选为SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21，从而提供支架。
本发明的一个方面涉及一种制备与载体分子共价结合的支架的方法，该支架包括至少一种共价结合的生物活性分子，该方法包括：a)提供包括至少一种生物活性分子的支架，生物活性分子与支架中的聚合结构或寡聚结构共价结合，优选提供根据本发明的支架或通过本发明的方法可获得的支架或由本发明的方法获得的支架；以及b)将a)的支架与根据本发明的载体分子共价偶联，从而提供与载体分子共价结合的支架，支架包括至少一种共价结合的生物活性分子。
一个实施方式为根据本发明的支架或根据本发明的方法，其中当任一效应分子与支架共价结合并且与哺乳动物细胞接触时，或当效应分子在支架存在下与哺乳动物细胞接触时，支架能够增加根据本发明的效应分子的内体逃逸和/或溶酶体逃逸。
定义
术语“连接子”有其常规的科学含义，这里指的是通过肽键络合的化学部分或氨基酸残基的线性段，它将一个分子或一个原子连接到另一个分子上，例如配体或效应分子或支架。通常，连接子包括通过化学键连接的原子链。本领域中已知的任何连接子分子或连接子技术均可用于本公开。在指明时，连接子是用于通过适合于与连接子形成共价连接或键的此类分子上的化学基团共价结合分子的连接子。连接子可以是不可裂解的连接子，例如连接子在生理条件下是稳定的。连接子可以是可裂解的连接子，例如在酶的存在下或在特定的pH范围或值下，或在生理学条件下，诸如内体中的细胞内条件，诸如次级内体和哺乳动物细胞如人类细胞的溶酶体中可裂解的连接子。可用于本公开内容的示例性连接子包括但不限于：N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼(EMCH)、琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯或3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)和1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化六氟磷酸盐(HATU)。
术语“三功能连接子”有其常规的科学含义，这里指的是经由三个分子中的每一个上的化学基团连接三个分子的连接子。技术人员能够基于本公开和公知常识设计这种三功能连接子。这种三功能连接子可以表现出例如马来酰亚胺基团，其可用于与具有硫醇基团的靶向配体缀合以进行硫醇-烯反应。此外，三功能连接子可以表现出二苯并环辛炔(DBCO)基团，以与带有叠氮基的皂苷进行所谓的菌株促进炔-叠氮环加成反应(SPAAC，点击化学)。最后，三功能连接子可以获得第三个官能团，诸如反式环辛烯(TCO)基团，以与带有四嗪(Tz)的效应分子进行所谓的逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应。技术人员将理解三功能连接子的化学基团可以全部三个相同或不同，或者连接子可以包括用于将分子连接到三功能连接子的两个相同化学基团。三功能连接子之间形成的键可以是共价键或非共价键，优选共价键。三功能连接子与一个或两个或三个结合分子之间经由各自的化学基团形成的键，可以是可裂解的(不稳定的)键，诸如细胞内在酸性条件下可裂解如内体和哺乳动物细胞如人类细胞的溶酶体，或者可以是不可裂解的键。当然，三功能连接子可以涵盖一个或两个用于形成共价键的化学基团，而另外的两个或一个化学基团分别用于形成非共价键。当然，三功能连接子可以涵盖一个或两个用于形成可裂解键的化学基团，而另外的两个或一个化学基团分别用于形成不可裂解的键。
诸如在术语“可裂解的连接子”或“可裂解的键”中使用的术语“可裂解的”有其常规的科学含义，这里指的是在诸如酸性条件、还原条件、酶促条件或光诱导条件的条件下发生裂解。例如，可裂解的连接子可以在酸性条件下发生裂解，优选地可裂解连接子在哺乳动物细胞，优选人类细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下在体内经受裂解，优选在pH4.0-6.5，更优选在pH≤5.5。作为另一个示例，可裂解的连接子可以由酶裂解，例如酶切，诸如组织蛋白酶B。此外，在还原条件下可裂解的共价键的一个示例是二硫键。
在寡聚物支架或聚合物支架的上下文中，术语“寡聚物”和“聚合物”有其常规的科学含义。这里聚合物是指分子结构主要或完全由大量相同或相似的单元结合在一起构成的物质；这里寡聚物是指其分子由相对较少的重复单元组成的聚合物。例如，包括5-10个或更少相同或相似单元的结构可以被称为寡聚结构，而包括10-50个或更多单体单元的结构可以被称为聚合结构，而包括10个单体单元的结构可以被称为寡聚或聚合。
术语“结合位点”有其常规的科学含义，这里指的是分子上的区域或表位，例如另一个分子可结合的蛋白质、DNA或RNA。
术语“支架”有其常规的科学含义，这里指的是寡聚模板或聚合模板或载体或基底(基础分子或基础结构)，而一个或多个分子，例如配体分子、效应分子可以直接或经由连接子如可裂解连接子与之共价结合。支架可以具有结构有序的构造，诸如聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元或树枝化聚合物，或者具有组装的聚合结构，诸如水凝胶、微凝胶、纳米凝胶、稳定的聚合胶束或脂质体，但不包括由单体的非共价组装组成的结构，诸如胆固醇/磷脂混合物。支架可以包括聚合结构或寡聚结构，诸如聚或寡聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺)；或诸如聚乙二醇、聚或寡聚(酯)的结构，如聚(丙交酯)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物；或聚(糊精)、聚糖或寡糖，诸如环糊精或聚葡萄糖；或诸如天然和/或人工聚或寡氨基酸的结构，诸如聚赖氨酸或肽或蛋白质、DNA寡聚或聚合物、稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物。优选地，聚合结构或寡聚结构是生物相容的，其中生物相容是指聚合结构或寡聚结构在生物体中不表现出显着的急性或慢性毒性，并且可以通过身体的代谢原样排泄或完全降解为可排泄的和/或生理的化合物。
术语“配体”有其常规的科学含义，这里指的是可以选择性地结合靶细胞表面分子或靶细胞表面受体的任何分子在靶细胞表达，例如，靶向癌细胞或靶向自身免疫细胞。配体可以结合靶细胞上的受体或其他抗原所包括的表位。优选地，细胞结合配体是抗体。
如在本文中所使用的，术语“抗体”以最广义使用，其可以指定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质的免疫球蛋白(Ig)，或免疫球蛋白的功能性结合片段或结合结构域。在本发明的上下文中，免疫球蛋白的“结合片段”或“结合结构域”被定义为基本上保持这种亲本免疫球蛋白的抗原结合活性的亲本免疫球蛋白的抗原结合片段或结构域或其他衍生物。功能片段和功能结构域是本发明意义上的抗体，即使它们对抗原的亲和力低于亲本免疫球蛋白的亲和力。根据本发明的“功能片段和-结构域”包括但不限于F(ab')2片段、Fab'片段、Fab片段、scFv、dsFv、单域抗体(sdAb)、单价IgG、scFv-Fc、还原型IgG(rIgG)、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、Fc融合蛋白、纳米抗体、可变V结构域，诸如VHH、Vh和其他类型的抗原识别免疫球蛋白片段和结构域。可以对片段和结构域进行改造，以最大限度地减少或完全去除CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫键相互作用。功能片段和-结构域因其较小的尺寸而具有更大的肿瘤渗透优势。此外，与完整的免疫球蛋白相比，功能片段或结构域可更均匀地分布在整个肿瘤块中。
本发明的抗体(免疫球蛋白)可以是双功能的或多功能的。例如，双功能抗体的一个臂对一种受体或抗原具有特异性，而另一臂识别不同的受体或抗原。或者，双功能抗体的每个臂可以对靶细胞的相同受体或抗原的不同表位具有特异性。
本发明的抗体(免疫球蛋白)可以是但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、表面重整抗体、抗独特型抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、大鼠/小鼠杂交抗体、美洲驼抗体、美洲驼仅重链抗体、仅重链抗体和兽用抗体。优选地，本发明的抗体(免疫球蛋白)是单克隆抗体。表面重整的、嵌合的、人源化的和完全人抗体也更为优选，因为它们不太可能在人类中引起免疫原性。本发明的ADC抗体优选与在癌细胞、自身免疫细胞、患病细胞、异常细胞表面上表达的抗原特异性结合，同时使任何健康细胞基本保持不变(例如通过不结合此类正常细胞)，或通过与此类健康细胞在数量和/或亲和力上的结合程度较低)。
可用于本发明的ADC的特异性抗体包括但不限于：抗HER2单克隆抗体，诸如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗，抗CD20单克隆抗体，诸如利妥昔单抗、奥法木单抗、托西妥单抗和伊布单抗，抗CA125单克隆抗体，诸如奥瑞戈单抗，抗EpCAM(17-1A)单克隆抗体，诸如依决洛单抗，抗-EGFR单克隆抗体诸如西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗，抗CD30单克隆抗体诸如布伦妥昔单抗，抗CD33单克隆抗体诸如吉妥珠单抗和huMy9-6，抗血管整合素α-vβ-3单克隆抗体诸如伊瑞西珠，抗-CD52单克隆抗体诸如阿仑单抗、抗CD22单克隆抗体诸如依帕珠单抗、抗CEA单克隆抗体诸如拉贝珠单抗、抗CD44v6单克隆抗体诸如比伐单抗、抗FAP单克隆抗体诸如西布妥珠单抗、抗CD19单克隆抗体诸如huB4，抗CanAg单克隆抗体诸如huC242，抗CD56单克隆抗体诸如huN901，抗CD38单克隆抗体诸如达雷妥尤单抗，抗CA6单克隆抗体诸如DS6，抗IGF-IR单克隆抗体诸如西妥木单抗和3B7，抗整合素单克隆抗体诸如CNTO 95，以及抗syndecan-1单克隆抗体诸如B-B4。
结合靶细胞的细胞受体或抗原的抗体以外的任何其他分子也可用作本发明的配体-药物缀合物的细胞结合配体和提供有根据本发明的共价结合皂苷的配体。这些配体包括但不限于蛋白质、多肽、肽、小分子。这些非抗体配体的示例是干扰素(例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)、转铁蛋白、凝集素、表皮生长因子(EGF)和EGF样结构域、胃泌素释放肽(GRP)、血小板-衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、痘苗生长因子(VGF)、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF，例如IGF-1和IGF-2)，其他合适的激素，诸如促甲状腺激素释放激素(TRH)、促黑素细胞激素(MSH)、类固醇激素(例如雌激素和雄激素)、生长激素抑制素、淋巴因子(例如IL-2、IL-3、IL-4和IL-6)、集落刺激因子(CSF例如G-CSF、M-CSF和GM-CSF)、铃蟾肽、胃泌素、Arg-Gly-Asp或RGD、适配体(例如AS-1411、GBI-10、抗HIV糖蛋白的RNA适配体)、小分子(例如叶酸、茴香酰胺苯基硼酸)、维生素(例如维生素D)、碳水化合物(例如透明质酸、半乳糖)。
“效应分子”或“效应部分”或“有效载荷”有其常规的科学含义，并且在本发明的上下文中是通过与细胞内效应分子靶标相互作用而影响细胞代谢的任何物质，其中该效应分子靶标是细胞内的任何分子或结构，不包括内吞和再循环途径的隔室和囊泡的管腔，但包括这些隔室和囊泡的膜。因此，细胞内的所述结构包括细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、其他转运囊泡、质膜的内部和细胞质。
效应分子或-效应部分是药物活性物质，诸如毒素如蛋白质毒素、药物、多肽或多核苷酸。本发明中的药物活性物质是用于在生物体中(优选脊椎动物，更优选哺乳动物，诸如非人类受试者或人类/受试者)实现有益结果的效应分子或部分。益处包括疾病和/或症状和/或健康问题的诊断、预后、治疗、治愈和预防(预防法)。药物活性物质也可能导致不希望的，有时甚至是有害的副作用(诸如在临床试验中观察到的不良事件)。在这种情况下，必须权衡利弊，以确定药物活性物质是否适合特定情况。如果细胞内药物活性物质的效应主要对整个生物体有益，则该细胞称为靶细胞。如果细胞内的效果主要对整个生物体有害，则该细胞称为脱靶细胞。在细胞培养和生物反应器等人工系统中，靶细胞和脱靶细胞取决于目的并由用户定义。效应分子和-部分的示例是药物、毒素、多肽(诸如酶)、多核苷酸(包括含非天然氨基酸或核酸的多肽和多核苷酸)及其任何组合。
作为药物的效应分子或效应部分可以包括但不限于抗癌剂、抗炎剂和抗感染剂(例如抗真菌剂、抗菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂)。优选地，本发明的药物分子是抗癌剂或抗自身免疫剂。合适的抗癌剂包括但不限于烷化剂、抗代谢物、纺锤体毒植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂和激酶抑制剂。“抗癌剂”的定义中还包括：例如(i)用于调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，芳香酶调节肾上腺中雌激素的产生；(iii)抗雄激素；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，尤其是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号途径中基因表达的反义寡核苷酸；(vii)诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂等核酶；(viii)诸如基因治疗疫苗等疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；(ix)抗血管生成剂；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸、溶剂化物和衍生物。
作为毒素的效应分子或效应部分可以包括但不限于蛋白质毒素(例如细菌衍生的毒素和植物衍生的毒素)、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素、靶向RNA的毒素。蛋白质毒素的示例是皂草素、石竹素、蓖麻毒素、莫德霉素、相思豆毒素、沃尔肯辛、黏蛋白、志贺毒素、志贺样毒素、假单胞菌外毒素(PE，也称为外毒素A)、白喉毒素(DT)和霍乱毒素。靶向微管蛋白的毒素的示例是美登木素类(例如DM1和DM4)、耳他汀类药物(例如单甲基耳他汀E(MMAE)和单甲基耳他汀F(MMAF))、类毒素、微管溶素、隐霉素、根瘤菌素。DNA靶向毒素的示例是加利车霉素：N乙酰基-γ加利车霉素、CC-1065类似物、多霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、苯二氮卓类、喜树碱类似物和蒽环类。DNA靶向毒素的示例是鹅膏菌素、剪接抑制素和泰兰他汀。本发明中使用的毒素被定义为能够杀死或灭活细胞的药物活性物质。优选地，靶向毒素是仅或至少主要对靶细胞有毒但对脱靶细胞无毒的毒素。靶向毒素的净效应优选对整个生物体是有益的。
作为多肽的效应分子或效应部分可以是例如恢复失去的功能诸如酶置换、基因调节功能或毒素的多肽。作为效应分子的多肽的示例是，例如，Cas9；毒素(例如皂草素、石竹素、白树胶素、(去)布加宁、农杆菌素、蓖麻毒素(毒素A链)；商陆抗病毒蛋白、凋亡素、白喉毒素、假单胞菌外毒素)、代谢酶(例如精氨琥珀酸裂解酶、精氨琥珀酸合成酶)、凝血级联酶，修复酶；细胞信号转导酶；细胞周期调节因子；基因调节因子(转录因子诸如NF-κB或基因阻遏物如蛋氨酸阻遏物)。
作为多核苷酸的效应分子或效应部分可以是例如包括编码信息的多核苷酸，诸如编码蛋白质的基因或开放阅读框。它还可以包括调节信息，例如催化剂或调节元素结合区，或编码微RNA的序列。这种多核苷酸可以包括天然和人工核酸。人工核酸包括，例如肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些核酸中的每一个都通过分子骨架的变化与天然存在的DNA或RNA区分开来。作为效应分子的核苷酸的示例是但不限于例如DNA：单链DNA(例如腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的DNA)；线性双链DNA(例如凝血因子IX基因)；环状双链DNA(例如质粒)；RNA：mRNA(例如TAL效应分子核酸酶)、tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、反义RNA；反义寡核苷酸(ASO、AON，例如PNA、PMO、LNA和BNA)。
术语“蛋白质”，用于例如“蛋白质分子”和“蛋白质毒素”是指至少包括一串氨基酸残基的分子和毒素，其可作为单个mRNA的表达产物而获得。这样的分子或毒素可以进一步包括任何转化后修饰，碳水化合物诸如N-或O-连接的碳水化合物、二硫键、磷酸化、硫酸化等，作为任何转化后修饰的结果，和/或可以进一步包括任何其他修饰，诸如由化学修饰(例如，效应部分、皂苷、支架、配体等的连接，直接连接到例如氨基酸侧链，或经由至少一个连接子)产生的那些修饰(共价)结合到用于化学修饰蛋白质分子的分子，并且化学(共价)结合到蛋白质分子。术语“蛋白质”还涵盖并包括此类分子的组装体，例如同二聚体、异三聚体、异六聚体或复杂的组装体，诸如核糖体。
在例如“特异性结合”和“在肿瘤细胞表面特异性存在或表达的受体或分子靶标”等的上下文中，术语“特异性”和“特异性地”具有其在本领域中已知的正常科学意义，这里指的是例如第一分子与第二分子的结合相互作用，其相对于第一分子与不同于第二分子的另一分子的任何推定结合，以更高的亲和力发生，或者例如表达或到更高程度的表达，当例如考虑受体或分子靶标的数量，相对于表达的程度，第一类细胞诸如肿瘤细胞、自身免疫细胞、患病细胞、异常细胞表面上的细胞表面受体或分子靶标的数量，在第二类细胞诸如健康细胞等处的相同受体或分子靶标，其中相对于在肿瘤细胞等上的任何表达程度，在第二类细胞处的表达可以完全不存在或非常低。此外，术语“特异性”，例如在“特异性结合”中，具有本领域已知的正常科学含义，并且在此具有指示可以与具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力的另一分子相互作用的分子的含义。类似地，术语“特异性”是指例如两个分子之间或细胞与分子之间的相互作用，其具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力。结合分子诸如免疫球蛋白经由它们的结合位点如免疫球蛋白的免疫球蛋白可变区结合到分子上的结合位点，诸如表位、细胞表面受体等，具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力。在本发明的上下文中，背景相互作用通常是具有低于10E-4M KD的亲和力的相互作用。类似地，“特异性结合结构域”是优先结合分子上的结合位点的结合结构域，诸如表位、细胞表面受体等，具有比分子之间的背景相互作用更高的结合亲和力。在本发明的上下文中，“背景相互作用”通常是具有低于10E-4M KD的亲和力的相互作用。优选地，特异性结合结构域以高于约10E-5M KD的亲和力结合。
术语“结合”被定义为可以与背景相互作用区分开来的分子之间的相互作用。
在整个说明书中，术语“片段”是指作为蛋白质结构域的一部分或构建完整蛋白质结构域的氨基酸序列。根据本发明的结合片段必须对相应的靶标诸如细胞表面受体具有结合特异性，例如在患病细胞诸如肿瘤细胞的表面上。
术语“ADC”或“抗体-药物缀合物”具有技术人员已知的常规科学含义，这里指的是一类设计为靶向治疗的生物药物，用于治疗例如癌症。与化学疗法不同，ADC旨在靶向并杀死肿瘤细胞，同时保留健康细胞。ADC由与生物活性细胞毒性(抗癌)有效载荷或药物连接的抗体组成。ADC结合了单克隆抗体的靶向能力和细胞毒性药物的杀癌能力。它们被设计旨在区分健康细胞和病变组织，诸如肿瘤中的肿瘤细胞。
术语“皂素集”有其正常含义，这里指的是默克公司(德国达姆施塔特)生产的皂苷混合物，含有来自霞草属的皂苷，含有SA1657，主要是SA1641。
术语“皂树皂苷(Quillajasaponin)”有其正常含义，这里指的是皂皮树的皂苷部分，因此是所有其他QS皂苷的来源，主要包含QS-18和QS-21。
“QS-21”或“QS21”有其常规的科学含义，这里指的是QS-21A-apio(～63％)、QS-21A-xylo(～32％)、QS-21B-apio(～3.3％)和QS-21B-xylo(～1.7％)的混合物。
类似地，“QS-21A”有其常规的科学含义，这里指的是QS-21A-apio(～65％)和QS-21A-xylo(～35％)的混合物。
类似地，“QS-21B”有其常规的科学含义，这里指的是QS-21B-apio(～65％)和QS-21B-xylo(～35％)的混合物。
术语“Quil-A”是指一种市售的皂皮树半纯化提取物，含有不同数量的50多种不同的(水溶性)皂苷，其中许多含有在QS-7、QS-17、QS18和QS-21中发现的三萜-三糖亚结构在C-3β-OH基团处的Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA。在Quil-A中发现的皂苷列于vanSetten(1995)，表2[Dirk C.van Setten、Gerrit van de Werken、Gijsbert Zomer和Gideon FA Kersten，Glycosyl Compositions and Structural Characteristics of thePotential Immuno-adjuvant Active Saponins in the Quillaja saponaria MolinaExtract Quil A,RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY,VOL.9,660-666(1995)]。Quil-A和皂树皂苷是皂皮树皂苷的级分，且两者均含有多种不同皂苷，含量大体重叠。这两个级分的具体组成不同，因为这两个部分是通过不同的纯化程序获得的。
术语“QS1861”和术语“QS1862”指的是QS-7和QS-7api。QS1861的分子量为1861道尔顿，QS1862的分子量为1862道尔顿。QS1862在Fleck等人中有所描述：(2019)在表1中，行号28[Juliane Deise Fleck、Andresa Heemann Betti、Francini Pereira da Silva、Eduardo Artur Troian、Cristina Olivaro、Fernando Ferreira和Simone GasparinVerza，Saponins from Quillaja saponaria and Quillaja brasiliensis:ParticularChemical Characteristics and Biological Activities,Molecules 2019,24,171；doi:10.3390/molecules24010171]。所描述的结构是QS-7的api变体QS1862。分子量为1862道尔顿，因为该质量是包括葡糖醛酸处的质子形式的质量。在中性pH值下，分子被去质子化。在负离子模式的质谱仪中测量时，测量的质量为1861道尔顿。
说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三等用于区分相似的元素，并不一定用于描述顺序或时间顺序。在适当的情况下，这些术语可以互换。本发明的实施方式可以以不同于在本文中所描述的或图示的其他顺序操作。
此外，各种实施方式，尽管称为“优选”或“举例”或“例如”或“特别是”，解释为可以实现本发明的示例性方式而不是限制本发明的范围。
在权利要求中使用的术语“包括”不应被解释为限于其后列出的元素或步骤；其不排除其他元素或步骤。需要将其解释为指定提及的所述特征、整数、步骤或成分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤或组成分其组合的存在或添加。因此，表达“包括A和B的药物组合物”的范围不应限于仅由成分A和B组成的药物组合物，而是就本发明而言药物组合物仅列举的成分是A和B，并且进一步的权利要求应被解释为包括那些成分的等效物。类似地，表达“包括步骤A和步骤B的方法”的范围不应限于仅由步骤A和B组成的方法，而是就本发明而言方法仅列举的步骤是A和B，并且进一步的权利要求应被解释为包括那些步骤的等效物。
此外，不定冠词“a”或“an”对特征的引用不排除存在多个特征(例如成分、赋形剂、皂苷等)的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个特征。因此，不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。
附图说明
图1：用30mg/kg西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)、25mg/kg西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4或25mg/kg西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)处理的A431异种移植“裸”小鼠肿瘤模型中的体内HSP27表达。
图2：用西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)、西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)处理的EGFR表达A431细胞中体外增强的HSP27基因沉默。
图3：A、B、C和D的图例和轴是相同的。A.用西妥昔单抗、西妥昔单抗+10pM西妥昔单抗-皂草素、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO18614)3,9和西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9+10pM西妥昔单抗-皂草素在EGFR表达细胞(MDA-MB-468)中的细胞杀伤活性。B.用曲妥珠单抗、曲妥珠单抗+50pM曲妥珠单抗-皂草素、曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4和曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+50pM曲妥珠单抗-皂草素在HER2表达细胞(SK-BR-3)中的细胞杀伤活性。C.用西妥昔单抗、西妥昔单抗+10pM西妥昔单抗-皂草素、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO18614)3,9和西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9+10pM西妥昔单抗-皂草素在EGFR表达细胞(HeLa)中的细胞杀伤活性。D.用曲妥珠单抗、曲妥珠单抗+50pM曲妥珠单抗-皂草素、曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4和曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+50pM曲妥珠单抗-皂草素在HER2表达细胞(JIMT-1)中的细胞杀伤活性。
图4：A、B、C和D的图例和轴是相同的。A.用西妥昔单抗、西妥昔单抗+10pMCD71mab-皂草素、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9+10pM CD71mab-皂草素、西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4或西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4+10pM CD71mab-皂草素在EGFR++/CD71+细胞(MDA-MB-468)中的细胞杀伤活性。B.用曲妥珠单抗、曲妥珠单抗+10pMCD71mab-皂草素、曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4、曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+10pM CD71mab-皂草素、曲妥珠单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,7或曲妥珠单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,7+10pM CD71mab-皂草素在HER2++/CD71+(SK-BR-3)细胞系中的细胞杀伤活性。C.用西妥昔单抗、西妥昔单抗+10pM CD71mab-皂草素、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9+10pM CD71mab-皂草素、西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4或西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4+10pM CD71mab-皂草素在EGFR+/CD71+细胞(CaSki)中的细胞杀伤活性。D.用曲妥珠单抗、曲妥珠单抗+10pM CD71mab-皂草素、曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4、曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+10pM CD71mab-皂草素、曲妥珠单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,7或曲妥珠单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,7+10pM CD71mab-皂草素在HER2+/-/CD71+细胞(JIMT-1)中的细胞杀伤活性。
图5：T-DM1、T-DM1+25.6nM曲妥珠单抗或T-DM1+5.3nM曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4在HER2表达细胞(SK-BR-3)中的细胞杀伤活性。
图6：与单独的HSP27BNA相比HSP27BNA-树枝化基元(-L-SO1861)4的HSP27基因沉默活性。
图7：A.在酸性条件下从树枝化基元(-L-SO1861)4中释放SO1861的示意图。B.树枝化基元(-L-SO1861)4本身(顶部)的UPLC紫外痕量(PDA)，反应混合物包括50μL含有水/乙腈/TFA的溶液和树枝化基元(-L-SO1861)4，30分钟后(中间)和1.5小时后的反应混合物(底部)。C.LRMS对图7的B观察到的m/z值的解释。
图8：A和B的图例和轴是相同的。A.用“裸”树枝化基元(树枝化基元(NEM)4)、树枝化基元(NEM)4+10pM EGF石竹素、树枝化基元(-L-SO1861)4或树枝化基元(L-SO1861)4+10pMEGF石竹素在EGFR表达A431细胞中的细胞杀伤活性。B.用“裸”树枝化基元(树枝化基元(NEM)4)、树枝化基元(NEM)4+10pM EGF石竹素、树枝化基元(-L-SO1861)4或树枝化基元(L-SO1861)4+10pM EGF石竹素在EGFR表达HeLa细胞中的细胞杀伤活性。
图9：A、B和C的图例和轴是相同的。A.曲妥珠单抗对一系列癌细胞的细胞活力的效果。B.西妥昔单抗对一系列癌细胞的细胞活力的效果。C.T-DM1对一系列癌细胞的细胞活力的效果。
图10：单克隆抗体-(SO1861-支架-反义BNA oligo)缀合物的示意图。
图11：1-靶标2-成分系统的示意图，该系统使用与毒素结合的单克隆抗体和与包括皂苷的支架结合的相同单克隆抗体。
图12：2-靶标2-成分系统的示意图，该系统使用与毒素结合的单克隆抗体和与包括皂苷的支架结合的具有不同靶标的不同的单克隆抗体。
图13：SO1861-EMCH合成的反应方案。
图14：树枝化基元(-L-SO1861)4合成的反应方案。
图15：树枝化基元(-L-SO1861)8合成的反应方案。
图16：SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA的合成的反应方案。
图17：树枝化基元(SO1861)4-HSP27BNA寡核苷酸缀合物的合成的反应方案。
图18：树枝化基元(NEM)4(“裸”树枝化基元)合成的反应方案。
图19：模型支架由四个用于经由希夫碱(亚胺)结合皂苷的分子臂和一个用于点击化学的臂组成。聚合结构是第一代的五价聚乙二醇基树枝状聚合物。
图20：插入的附图显示了使用SA1641皂苷的模型支架的理论预期质谱图，该图通过使用同位素模式计算器enviPatWeb 2.0进行计算而获得。通过LC-MS/ESI-MS获得的实验数据显示，在m/z 758–760Da处的峰几乎完全相同，证明皂苷偶联成功。
图21：在用五聚体树枝状聚合物(pentrimer)、SA1641存在下的五聚体、石竹素-EGF、SA1641存在下的石竹素-EFG、石竹素-EGF存在下的五聚体，以及石竹素-EGF和SA1641存在下的五聚体处理后的HER14细胞的细胞活力。
图22：A.SO1861的H-NMR谱。B.SO1861-EMCH((EMCH＝N-ε-马来酰亚胺酸氢化叠层核磁共振物)缀合物的H-NMR谱。
图23：A.SO1861-EMCH缀合物的MALDI-TOF-MS谱。B.SO1861-EMCH-巯基乙醇缀合物的MALDI-TOF-MS谱。
图24：SO1861结构具有突出显示的化学基团，用于将内体逃逸增强皂苷缀合到聚合结构。突出显示的基团是醛(黑色圆圈)、羧酸(虚线圆圈)、烯烃(虚线五边形)和醇(虚线框)。
图25：A.制备稳定的“即用型缀合物”内体逃逸增强剂皂苷的示意图。B.制备可裂解“即用型缀合物”内体逃逸增强剂皂苷的示意图。
图26：SO1861-EMCH的腙键在酸性条件下的水解。
图27：A.SO-1861-EMCH缀合物的标准分子结构。马来酰亚胺基团用圆圈标记。B.SO1861-EMCH缀合物的3D模型。马来酰亚胺基团用圆圈标记。
图28：A.SO1861-EMCH的合成方案。B.SO1861在负反射模式下的MALDI-TOF-MS谱。TFA：三氟乙酸，r.t：室温，h：小时，MW：分子量。C.SO1861-EMCH在负反射模式下的MALDI-TOF-MS谱。TFA：三氟乙酸，r.t：室温，h：小时，以及MW：分子量。
图29：A.在pH 3的HCl溶液中水解前SO1861-EMCH的MALDI-TOF-MS谱。B.在pH 3的HCl溶液中水解后SO1861-EMCH的MALDI-TOF-MS谱。
图30：SO1861-EMCH与任何含胺聚合结构缀合的反应方案。
图31：A.BSA-SO1861的MALDI-TOF-MS谱。B.BSA的MALDI-TOF-MS谱。
图32：A.SO1861-EMCH与花青3染料标记的聚酰胺型胺(PAMAM)G5树枝状聚合物缀合的反应方案。B.(B)SO1861-HATU(HATU＝1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]3-氧化六氟磷酸盐)与花青3染料标记的聚酰胺胺(PAMAM)G5树枝状聚合物缀合的反应方案。
图33：A.Cy3-PAMAM的MALDI-TOF-MS谱。B.每个PAMAM附有5个SO1861的Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱。C.每个PAMAM附有13个SO1861的Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱。D.每个PAMAM附有51个SO1861的Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱。
图34：A.Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱，5当量进料SO1861-EMCH。B.Cy3-PAMAM-SO1861的MALDI-TOF-MS谱，30当量进料SO1861-EMCH。
图35：Cy3-PAMAM-NC-SO1861的MALDI-TOF-MS谱(NC＝稳定键(“不可裂解”)。
图36：A.Cy3-PAMAM-NC-SO1861-二苯并环辛炔(DBCO)的反应方案。B.Cy3-PAMAM-NC-SO1861-二苯并环辛炔(DBCO)的MALDI-TOF MS谱。C.Cy3-PAMAM-(SO1861)5-DBCO的MALDI-TOF-MS谱。D.Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO的MALDI-TOF-MS谱。
图37：A.石竹素-EGF-Alexa488的反应方案。B.石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3的反应方案。C.石竹素-EGF的MALDI-TOF-MS谱。D.石竹素-EGF-Alexa488的MALDI-TOF-MS谱。E.石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3的MALDI-TOF-MS谱。
图38：A.石竹素-Alexa488的反应方案。B.石竹素-Alexa488-SS-PEG-N3的反应方案。C.石竹素的MALDI-TOF-MS谱。D.石竹素-Alexa488的MALDI-TOF-MS谱。E.石竹素-Alexa488-SS-PEG-N3的MALDI-TOF-MS谱。
图39：在VersaDoc成像系统上进行的SDS-PAGE凝胶的荧光图像。M＝标记，P＝Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO，D＝石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG-N3，C1＝Cy3-PAMAM-(SO1861)5-石竹素-EGF-Alexa488，C2＝Cy3-PAMAM-NC-SO1861-石竹素-EGF-Alexa488，和C3＝Cy3-PAMAM-(SO1861)27-石竹素-EGF-Alexa488。
图40：A.Cy3-PAMAM-NC-SO1861经由还原胺化的合成方案。B.经由还原胺化合成的Cy3-PAMAM-NC-SO1861的MALDI-TOF-MS谱，每个PAMAM有10个SO1861。C.经由还原胺化合成的Cy3-PAMAM-NC-SO1861的MALDI-TOF-MS谱，每个PAMAM有30个SO1861。
图41：使用SO1861-EMCH作为单体、APS/TMEDA系统作为聚合引发剂和氨基丙硫醇作为自由基猝灭剂生成聚(SO1861)的反应方案。
图42：A.SO1861-EMCH的聚(SO1861)反应批次在60℃的MALDI-TOF-MS谱。B.在60℃的SO1861-EMCH+11-3当量APS的聚(SO1861)反应批次的MALDI-TOF-MS谱。C.在60℃的SO1861-EMCH+11-3当量APS/TMEDA的聚(SO1861)反应批次的MALDI-TOF-MS谱。
图43：DNA方法的示意图。利用DNA折纸原理生成能够缀合和释放糖苷分子的基于DNA的支架。此外，其中一条DNA链获得点击化学部分，其可用于与靶向毒素缀合以形成功能化支架。bp：碱基对。
图44：聚(肽-SO1861)方法的示意图。使用可缀合和释放糖苷分子并且可与自身反应以形成聚(肽-SO1861)构建体的肽序列。多(肽)链末端可用点击化学部分(例如，BCN-NHS连接子)进一步修饰，可用于与毒素缀合。
图45：A.天然肽的MALDI-TOF-MS谱。B.肽-SO1861缀合物的MALDI-TOF-MS谱。
图46：具有受保护氨基团的G4-树枝化基元的分子结构。
图47：用于生成基于树枝化基元的支架的合成方案。
图48：A.G4-树枝化基元的部分染料标记和脱保护的反应方案。B.脱保护和部分染料标记的G4-树枝化基元的MALDI-TOF-MS谱。
图49：A.G4-树枝化基元-SO1861支架的MALDI-TOF-MS谱，具有22个SO1861-EMCH的进料当量。B.G4-树枝化基元-SO1861支架的MALDI-TOF-MS谱，具有10个SO1861-EMCH的进料当量。C.G4-树枝化基元-SO1861支架的MALDI-TOF-MS谱，具有3个SO1861-EMCH的进料当量。
图50：A.通过HeLa细胞的FACS分析确定的EGFR细胞表面表达。B.用SO1861+石竹素-EGF(Dia-EGF)、SO1861+石竹素-EGF+500nM氯喹、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM、SO1861+石竹素-EGF+667nM树枝化基元治疗的HeLa细胞的细胞活力。C.用SO1861+石竹素-EGF、SO1861+石竹素-EGF+500nM氯喹、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM-(SH)16、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM-(SH)65、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM-(SH)108治疗的HeLa细胞的细胞活力。D.用SO1861+石竹素-EGF、SO1861+石竹素-EGF+500nM氯喹、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM-(mPEG)3、SO1861+石竹素-EGF+500nMPAMAM-(mPEG)8、SO1861+石竹素-EGF+500nM PAMAM-(mPEG)18治疗的HeLa细胞的细胞活力。
图51：A.使用硫醇化试剂2-亚氨基硫醇对PAMAM进行硫醇化的反应方案。B.天然PAMAM的MALDI-TOF-MS谱。C.硫醇化PAMAM-(SH)16的MALDI-TOF-MS谱。D.硫醇化PAMAM-(SH)65的MALDI-TOF-MS谱。E.硫醇化PAMAM-(SH)108的MALDI-TOF-MS谱。
图52：A.使用聚乙二醇化试剂mPEG2k-NHS对PAMAM进行聚乙二醇化的反应方案。B.天然PAMAM的MALDI-TOF-MS谱。C.PEG化PAMAM-(mPEG2k)3的MALDI-TOF-MS谱。D.PEG化PAMAM-(mPEG2k)8的MALDI-TOF-MS谱。E.聚乙二醇化PAMAM-(mPEG2k)18的MALDI-TOF-MS谱。
图53：具有点击化学功能以连接任何所需效应分子的基本支架的示意图。
图54：具有预结合效应分子和点击化学功能以连接任何所需配体的功能化支架的示意图。可选地，可提供pH敏感连接以在到达内体后从支架中释放效应分子。
具体实施方式
为了使生物活性分子发挥作用，该分子必须能够与其靶标结合，例如在血清中，在细胞表面的外部或细胞或细胞器的内部。例如，几乎所有基于蛋白质的靶向毒素的活性部分都必须进入靶细胞的细胞质以介导其靶标调节效果。在许多情况下，毒素仍然无效，因为(1)靶向部分内化能力差并保持与细胞的外部的结合，(2)内化后循环回到细胞表面或(3)转运到内溶酶体，并在那里降解。尽管这些基本问题数十年来已为人所知，并且在过去的数十年中已经研究了500多种靶向毒素，但这些问题仍未得到解决，迄今为止，只有一种抗体靶向蛋白质毒素莫西妥单抗pasudotox-tdfk(
Figure BDA0003222052890000261
阿斯利康制药公司)已被FDA批准用于治疗复发性或难治性毛细胞白血病。
为了克服这些问题，已经描述了许多策略，包括将毒素重定向到内质网中生物合成途径的内源性细胞膜转运复合物的方法，以及破坏或削弱内体(即细胞中内吞途径的隔室)的膜完整性的技术，从而促进内体逃逸。这包括使用溶酶体胺、羧酸离子载体、钙通道拮抗剂、病毒、细菌、植物、动物、人类和合成来源的各种细胞穿透肽，其他有机分子和光诱导技术。尽管靶向毒素的功效通常在细胞培养中增加了成百上千倍，在特殊情况下超过百万倍，但需要将内体逃逸增强剂与其他物质共同给药会带来新的问题，包括额外的副作用、损失靶向特异性、确定治疗窗口的困难和细胞类型依赖性变化。
所有策略，包括物理化学技术，都需要或多或少直接与膜相互作用的增强剂分子，并且基本上包括小化学分子、次级代谢物、肽和蛋白质。所有这些物质的一个共同特征是，它们本身并不是针对细胞特异性的，而是以不同于靶向毒素的其他动力学分布。这是当前方法的主要弊端之一。
将关于特定实施方式描述本发明，但本发明不限于此而仅由权利要求限制。除非另有说明，在本文中描述的本发明的实施方式可以组合和协作操作。
虽然本发明已经根据几个实施方式进行了描述，但是可以预期，在阅读说明书和研究附图和图表后，本领域的普通技术人员将清楚其替代、修饰、置换和等价物。本发明不以任何方式限于图示的实施方式。在不脱离由所附权利要求限定的范围的情况下可以进行改变。
本发明的一个方面是一种适用于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合的支架，该支架包括聚合结构或寡聚结构，并且至少一种所述生物活性分子与所述聚合结构或寡聚结构共价结合，其中支架进一步包括用于将支架与载体分子共价偶联的第一化学基团。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子的分子量小于或等于3,000道尔顿，优选小于或等于2,500道尔顿，更优选小于或等于2,300道尔顿，最优选小于或等于2,000道尔顿，诸如1,700道尔顿-1,950道尔顿。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是两亲分子。这种两亲分子，例如(磷)脂质、糖苷诸如皂苷，通常可以是部分或形成层诸如双层和脂质层，例如细胞膜，和/或可以是囊泡的一部分，例如细胞内。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中当多于一种生物活性分子与支架所包括的聚合结构或寡聚结构共价结合时，至少一种生物活性分子是单一特定分子或不同分子的混合物。通常，生物活性分子从天然来源获得或衍生，和/或通常生物活性分子包括一种、两种或更多种几乎相同或相似的分子。一个示例是包括皂苷的水溶性成分，从皂皮树(‘Quil-A’)获得，它涵盖一系列的皂树皂苷，诸如QS-21、QS-18、QS-7。另一个示例是QS-21xyl和QS-21api的混合物。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是糖苷，优选双糖链三萜或三萜皂苷，更优选双糖链三萜皂苷，最优选属于12,13-脱氢齐墩果烷类型在C-23位置处具有醛官能团的双糖链三萜皂苷，并且任选地在皂苷的在C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包括葡糖醛酸官能团。
在本发明之前，不可能将单个或多个糖苷分子引导至(靶)细胞。特别是，不可能将一个效应分子(例如作为ADC的一部分)和每个效应分子的特定数量或范围的糖苷分子同时特异性地引导到细胞的胞质溶胶，诸如经由细胞的内吞途径。本发明提供的溶液固定甚至聚合糖苷分子，并且能够在需要糖苷的作用模式的细胞内位点处重新单体化，例如，内吞作用后。在本文中的“聚合”是指糖苷分子与聚合结构或寡聚结构可逆和/或不可逆的多重缀合以形成一个支架或(修饰的)糖苷分子的可逆和/或不可逆的多重缀合从而形成聚合结构或寡聚结构以形成一个支架。“重新单体化”在本文中是指例如在内吞作用后从支架上裂解糖苷分子并重新获得未结合的糖苷分子的(天然)化学状态，该未结合的糖苷分子可以包括或不包扩额外的化学基团诸如用于将糖苷连接到支架和/或(化学)连接子的化学基团。由于糖苷分子的复杂化学性质，糖苷分子的“聚合”和它们在所需位置(诸如细胞内)的“重新单体化”，例如，内吞作用后，是一项具有挑战性的任务。特别是，用于提供包括共价连接的糖苷(例如三硅皂苷(糖苷的聚合))的本发明的支架的化学反应，一般存在于无水有机溶剂中，但糖苷分子和生物相容性聚合物是水溶性分子。未修饰的糖苷分子本身的化学特性进一步阻止聚合，另一种可能的解决方案是将多个糖苷分子(直接)结合到效应分子上，估计不是很有前途，作为一种效应分子(药物、毒素、多肽或多核苷酸)通常不提供足够的结合位点，因为偶联产物会变得非常异质和/或偶联生物活性分子诸如糖苷和例如肽、毒素、核酸一起承担影响和阻碍在这种含糖苷缀合物中结合在一起的一个或甚至两个分子的活性的风险。此外，偶联后效应分子失去功能的风险很大。本发明解决了这些缺点中的至少一个。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是可以从霞草属物种和/或皂属物种和/或农杆菌属物种和/或皂树属物种例如皂皮树中分离的皂苷，或为单一特定皂苷或为两种或多种不同皂苷的混合物，诸如表A1或方案I中的一种或多种皂苷、SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂角皂苷、皂素集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832，或其任何立体异构体和/或其任何组合，优选皂苷是SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21和/或具有皂皮酸糖苷核的皂苷、在C-3β-OH基团处的Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA碳水化合物取代基和在C-28-OH基团处的Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc碳水化合物取代基，和/或为3-O-β-D-吡喃半乳糖-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-d吡喃葡萄糖醛酸皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4-OAc-β-D-吡喃喹啉-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选皂苷是SO1861和/或QS-21。
表A1和方案I以及上述实施方式总结了一系列皂苷，当与第二分子(例如效应部分或效应分子)一起接触哺乳动物细胞诸如游离形式的人类细胞时，它们的内体逃逸增强活性已被鉴定。事实上，在基于细胞的生物测定中，对于表A1中列出的皂苷和方案I中的皂苷，在这些皂苷的影响下，第二分子诸如核酸和/或毒素诸如蛋白质毒素(例如一种或更多种的在表A5中列出的蛋白质毒素)，从(次级)内体和溶酶体以增加的效率和/或功效在细胞内释放。也就是说，这种第二分子(即效应部分，效应分子)的内体和/或溶酶体逃逸，例如核酸和/或毒素，如果没有皂苷，效率会降低。
令人惊讶的是，本发明人现在证明了来自皂皮树的水溶性皂苷级分，其包括QS-21及其族成员QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、QS-18，也称为'Quil-A'，还表现出增强体外生物效应的能力，例如与单克隆抗体结合的核酸或与单克隆抗体结合的蛋白质毒素，当作为单个共价缀合物共同给药于哺乳动物物种(人类)的肿瘤细胞时，共价缀合物包括单克隆抗体、效应分子(上述第二分子)并且包括至少一种糖苷，诸如QS-21及其族成员皂苷涵盖在在这种QS-21制剂中，其中效应分子和糖苷，例如QS-21、SO1861、SA1641、GE1741直接或经由至少一个连接子与聚合支架或寡聚支架共价结合，或其中糖苷与效应分子共价结合并且效应分子与聚合支架或寡聚支架共价结合。或者，糖苷和效应分子分别与支架共价结合，其中单克隆抗体也分别与该皂苷、毒素、支架的缀合物结合，其中支架是三功能连接子涵盖聚合结构或寡聚结构，例如在Scheme II和Structure B中概述的支架。不希望受任何理论束缚，在皂皮树衍生的皂苷存在下观察到的例如皂草素-或石竹素介导的肿瘤细胞杀伤的刺激或增强作用可能(也)涉及皂苷激活肿瘤细胞中的炎性体，例如导致肿瘤细胞焦亡。
QS-21以及皂皮树的水溶性皂苷级分早已长期为人所知，并且以前因其免疫增强能力而被广泛应用，例如作为佐剂，例如亚单位疫苗。例如，QS-21应用于人类患者的两阶段III期临床试验，这些患者接种了亚单位疫苗混合了包括QS-21的佐剂(葛兰素史克，MAGRIT试验，DERMA研究)，其中亚单位是MAGE-A3蛋白，由肿瘤细胞特异性表达和呈递。QS-21增强的抗肿瘤疫苗接种旨在延长癌症患者(黑色素瘤；非小细胞肺癌)的无病生存期。此外，QS-21已在临床试验中作为佐剂进行测试，用于研发抗癌疫苗治疗、用于HIV-1感染的疫苗、研发针对乙型肝炎的疫苗以及使用包括佐剂AS01和AS02的葛兰素史克公司(Glaxo-Smith-Kline)的QS-21研发抗疟疾疫苗。先前的研究表明，在包括佐剂(AS15；GSK)的QS-21皂苷的影响下，会引发针对呈现在癌细胞表面的MAGE-A3肽的免疫反应。令发明人惊讶的是，包括QS-21的皂皮树级分中的皂苷增强了例如有效载荷诸如蛋白质毒素(石竹素)的抗肿瘤细胞活性。例如，该皂苷与西妥昔单抗共价偶联，当配体-石竹素缀合物在存在西妥昔单抗的情况下暴露于肿瘤细胞时，石竹素对几种人类肿瘤细胞系的毒性作用确立。在示例部分中概述了进一步的细节。
类似地，皂苷增强核酸的抗肿瘤细胞活性，诸如寡核苷酸BNA(HSP27)以沉默(肿瘤)细胞中的HSP27表达。发明人表明，靶向肿瘤细胞的单克隆抗体，诸如西妥昔单抗，具有共价偶联的反义BNA(HSP27)和共价偶联的皂苷(此处为SO1861)，BNA和皂苷均经由可裂解的键与抗体偶联(此处为腙键)，BNA和SO1861均通过其与三功能连接子(此处为方案II的三功能寡聚支架)偶联，与对照和仅与ADC相比，不含偶联皂苷的ADC能够在体内使肿瘤中的HSP27沉默。因此，将ADC与皂苷缀合而得到包括BNA和皂苷的缀合物，该组合赋予ADC以相同剂量的ADC未见的抗肿瘤细胞活性。值得注意的是，与对照组(仅载体给药)相比，ADC和具有共价偶联皂苷的单克隆抗体在单独给药于不同小鼠组中的荷瘤小鼠时增加了肿瘤细胞中HSP27的表达。与对照组相比，只有包括具有共价偶联皂苷和效应分子的本发明的支架的ADC显示出降低的HSP27表达。根据Zhang等人(2011)[YZhang、Z Qu、S Kim、V Shi、B Liao1、P Kraft、R Bandaru、Y Wu、LM Greenberger和ID Horak，Down-modulation of cancertargets using locked nucleic acid(LNA)-based antisense oligonucleotideswithout transfection,Gene Therapy(2011)18,326-333]，反义BNA(HSP27)是具有寡核苷酸序列5'-GGCacagccagtgGCG-3'的BNA。值得注意的是，据发明者所知，BNA被设计为作为游离核酸而应用。本发明人现在是第一个证明反义BNA可以通过(非)可裂解连接子与配体或抗体共价偶联的，其方式是在体外保留基因沉默活性，更重要的是在体内保留荷瘤动物的肿瘤细胞。这种方法开辟了向有需要的人类(癌症)患者给药靶向BNA的新方法。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是双链节皂苷，其分子量至少为1,500道尔顿，并且包括在C-23位置处含有醛基和任选在C-16位置处含有羟基的齐墩果型三萜，在C-3位置处具有第一支链碳水化合物侧链，该第一支链碳水化合物侧链任选地包含葡糖醛酸，其中皂苷含有酯基，在C-28位置处具有第二支链碳水化合物侧链，该第二支链碳水化合物链优选包括至少四个碳水化合物单元，任选地包含至少一个乙酰基残基诸如两个乙酰基残基和/或任选地包括脱氧碳水化合物和/或任选地包括奎诺糖和/或任选地包括葡萄糖和/或任选地包括4-甲氧基肉桂酸和/或任选地包括5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸和/或任选地包括5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸经由酯键与碳水化合物结合，或其中至少一种皂苷是QS-21或QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS-18、QS1861、质子化QS1861(QS1862)、Quil-A中的任何一种或多种。这种皂苷在表A1和方案I中进一步举例说明。本发明人在此证明将皂苷诸如QS-21、SA1641、SO1861、皂皮树的水溶性皂苷级分共价偶联至支架，诸如树枝化基元或三功能连接子，例如方案II和结构B的三功能连接子，支架进一步包括共价结合的效应分子，诸如蛋白质毒素，诸如石竹素或皂草素，和/或(肿瘤)细胞表面分子靶向配体或部分，诸如用于与(肿瘤)细胞表面受体结合的单克隆抗体，在共价偶联皂苷的影响下，导致改善了毒素产生的细胞毒性。
一个实施方式为根据本发明的支架，其包括皂苷作为生物活性分子，该皂苷包括方案I中结构A的皂苷的一个或几个或所有指定的结构特征，和/或选自方案I中的任何一种或多种其他皂苷的皂苷：
方案I
Figure BDA0003222052890000331
方案I(继续)
Figure BDA0003222052890000341
方案I(继续)
Figure BDA0003222052890000351
方案I(继续)
Figure BDA0003222052890000361
方案I(继续)
Figure BDA0003222052890000371
根据本发明，具有“理想”结构的生物活性分子是根据方案I的结构A的双链节皂苷，该分子具有用于增强作为载体分子与本发明的支架结合的效应分子的内体逃逸的“理想”结构，具有至少1,500道尔顿的分子量，并且包括在C-23位置处含有醛基和任选在C-16位置处含有羟基的齐墩果型三萜，在C-3位置处具有第一支链碳水化合物侧链，第一支链碳水化合物侧链任选地包含葡糖醛酸，其中皂苷含有酯基，在C-28位置处具有第二支链碳水化合物侧链，第二支链碳水化合物链优选包括至少四个碳水化合物单元，任选地包含至少一个乙酰基残基诸如两个乙酰基残基和/或任选地包括脱氧碳水化合物和/或任选地包括奎诺糖和/或任选地包括葡萄糖和/或任选地包括4-甲氧基肉桂酸和/或任选地包括5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸和/或任选地包括5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸经由酯键与碳水化合物结合。
SO1861与方案I、结构A中显示的“理想结构”不同，只有在奎诺糖上只有一个乙酰基残基并且有一个额外的木糖。用于增强效应分子或效应部分的内体逃逸的皂苷的“理想结构”是优选具有方案I的结构A的皂苷，并且显示出内体逃逸增强活性的皂苷具有一种或多种结构特征，显示在方案I的结构A中。不希望受任何理论束缚，发明人相信方案I的结构A表示内体逃逸增强活性的“理想皂苷”(而不是最低要求皂苷)，这意味着并非所有结构都可以或必须存在于每种皂苷中，并具有至少足够的内体逃逸增强活性，以促进效应部分在细胞质中的积累，这意味着一些皂苷可能具有其他结构元素，诸如酰基链，和/或对于显示内体逃逸增强活性的其他皂苷，糖可能与方案I中显示的糖不同。例如，当考虑方案I中结构A的理想结构时，QS-21皂苷和皂皮树(Quillaja saponins；Quil-A)水溶性部分中的一些皂苷在C-28处的碳水化合物修饰不同：例如在QS-21中存在酰基链。在皂皮树的水溶性级分中，皂苷诸如QS-7、QS1862等与理想结构A相似，与SO1861相似。
为了更详细地解释本发明，描述了在本发明中的物质的细胞摄取过程(尽管发明人不希望受任何理论束缚)和使用的术语。通过囊泡出芽将细胞外物质摄取到细胞中称为内吞作用。所述囊泡出芽的特征在于：(1)细胞溶质蛋白网格蛋白介导的受体依赖性配体摄取，(2)胆固醇结合蛋白小窝蛋白介导的脂筏摄取，(3)非特异性液体摄取(胞饮作用)，或(4)非特异性颗粒摄取(吞噬作用)。所有类型的内吞作用都会进入以下称为内吞途径的囊泡输送和物质分类的细胞过程。内吞途径很复杂，尚未完全了解。不希望受任何理论束缚，细胞器可以重新形成并沿着内吞途径成熟为下一个细胞器。然而，现在假设内吞途径涉及经由囊泡交通连接的稳定隔室。隔室是一种复杂的多功能膜细胞器，专门用于细胞的一组特定基本功能。囊泡被认为是短暂的细胞器，组成更简单，被定义为膜封闭容器，通过从预先存在的隔室出芽而重新形成。与隔室相比，囊泡可以经历成熟，这是一系列生理上不可逆的生化变化。初级内体和次级内体表示内吞途径中的稳定隔室，而初级内吞囊泡、吞噬体、多泡体(也称为内体载体囊泡)、分泌颗粒甚至溶酶体表示囊泡。内吞囊泡出现在质膜上，最突出的是来自网格蛋白包被的小坑，首先与初级内体融合，后者是一个主要的分选隔室，pH值约为6.5。大部分内化的货物和膜通过再循环囊泡(再循环途径)循环回到质膜。应降解的成分经由多泡体输送到酸性次级内体(pH值低于6)。溶酶体是一种囊泡，可以储存成熟的溶酶体酶，并在需要时将它们递送到次级内体隔室。由此产生的细胞器称为混合细胞器或内溶酶体。溶酶体在称为溶酶体重组的过程中从混合细胞器中萌芽。次级内体、溶酶体和混合细胞器是极其动态的细胞器，通常很难区分它们。内吞分子的降解发生在内溶酶体或溶酶体内。内体逃逸是从内吞途径，优选从网格蛋白介导的内吞作用或再循环途径进入细胞质的任何种类隔室或囊泡的内管腔主动或被动释放物质。因此，内体逃逸包括但不限于从内体、内溶酶体或溶酶体中释放，包括它们的中间和混合细胞器。除非另有特别说明，特别是当涉及糖苷分子的内体逃逸机制时，否则每当在本文中使用“内体”或“内体逃逸”一词时，它还包括内溶酶体和溶酶体，以及分别从内溶酶体和溶酶体逃逸。进入细胞质后，所述物质可能会移动到其他细胞单位，诸如细胞核。在正式术语中，糖苷是其中糖基通过其异头碳经由糖苷键与另一个基团结合的任何分子。在本发明的上下文中，糖苷分子是这样的分子，它们能够进一步增强效应分子的效应，而不希望受任何理论的束缚，特别是通过促进效应分子的内体逃逸。不希望受任何理论束缚，糖苷分子与内吞和再循环途径的隔室和囊泡的膜相互作用并使它们对于所述效应分子渗漏，导致内体逃逸增加。术语“支架能够增加效应分子的内体逃逸”是指与支架的聚合结构或寡聚结构偶联的至少一个糖苷分子，当两个分子都在一个内体例如次级内体内时能够增强效应分子的内体逃逸，任选地且优选地在至少一种糖苷从聚合结构或寡聚结构中释放之后，例如，通过裂解至少一种糖苷和聚合结构或寡聚结构之间的可裂解键。即使至少一种糖苷和支架之间的键可以是“稳定键”，但这并不意味着这样的键不能在内体中被例如酶裂解。例如，可以将糖苷与连接子或部分聚合结构一起从剩余的聚合结构上裂解。例如，蛋白酶可以切割蛋白质聚合结构，例如白蛋白，从而释放至少一种糖苷。然而，优选糖苷分子以活性形式释放，优选以其在(准备)偶联到支架之前的原始形式释放；因此，糖苷在这种裂解后具有其天然结构，或者糖苷在这种裂解后具有(部分)与其结合的化学基团或连接子，而糖苷生物活性，例如内体/溶酶体逃逸增强对存在于同一内体或溶酶体中的效应分子的活性，在糖苷和载体分子之间的结合的所述裂解后得以维持或恢复，例如，本发明的支架。关于本发明，关于皂苷、(支架的)聚合结构或寡聚结构、配体、(单克隆)免疫球蛋白或其结合结构域或其片段和/或效应物(效应部分，效应分子)之间的键，术语“稳定”是指键不容易断裂或至少设计为不容易被例如pH差异、盐浓度或UV光断裂。关于本发明，关于皂苷、本发明支架的聚合结构或寡聚结构、配体、抗体和/或效应物之间的键，术语“可裂解”是指键被设计为易于通过以下方式断裂，例如pH差异、盐浓度、还原条件等。技术人员非常了解这种可裂解键以及如何制备它们。
在本发明上下文中的效应分子或效应部分是通过与细胞内效应分子靶标相互作用而影响细胞代谢的任何物质，其中该效应分子靶标是细胞内的任何分子或结构，不包括内吞和再循环途径的隔室和囊泡的管腔，但包括这些隔室和囊泡的膜。因此，细胞内的所述结构包括细胞核、线粒体、叶绿体、内质网、高尔基体、其他转运囊泡、质膜的内部和细胞质。在本发明的上下文中，效应分子的胞质递送优选是指效应分子能够逃逸内体(和/或溶酶体)，如前文所定义，这也包括逃逸内溶酶体和溶酶体，并且优选能够到达在本文中所述的效应分子靶标。本发明是一种新型分子，称为支架，其用于以预定比例同时将效应分子和至少一个糖苷分子带入内体中。在本发明的上下文中，支架的聚合结构或寡聚结构是结构有序的结构，诸如聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化聚合物或树枝化寡聚物，或者是组装的聚合结构，诸如水凝胶、微凝胶、纳米凝胶、稳定的聚合胶束或脂质体，但不包括由单体的非共价组装组成的结构，诸如胆固醇/磷脂混合物。术语“聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化聚合物或树枝化寡聚物”具有其通常的含义。特别是，聚合物是具有主要或完全由大量相同或相似单元结合在一起构成的分子结构的物质，而寡聚物是一种聚合物，其分子由相对较少的重复单元组成。对于上述聚合物和寡聚物定义中分别使用的“许多”和“少数”的具体定义没有达成共识。然而，由于支架可以包括聚合结构或寡聚结构或两者，因此结合在一起的相似单元的全部数量范围适用于这种结构。即，从2个单体单元到100个单体单元、1000个单体单元等等。例如包括5个或更少个单体单元的结构可以称为寡聚结构，而包括50个单体单元的结构可以称为聚合结构。10个单体单元的结构可以称为寡聚或聚合。如在本文中所定义的支架进一步包括至少一个糖苷分子。支架优选包括聚合结构或寡聚结构，诸如聚或寡聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺)，和诸如聚乙二醇、聚或寡聚(酯)的生物相容结构，如聚(丙交酯)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物，和聚(糊精)、聚或寡糖，诸如环糊精或聚葡萄糖，和聚或寡氨基酸，诸如聚赖氨酸或肽或蛋白质、或DNA寡聚或聚合物。如在本文中所定义的组装聚合结构包括至少一个支架和任选的其他单独的聚合结构或寡聚结构。所述组装体的其他单独的聚合结构或寡聚结构可以是：(a)支架(因此包括至少一个糖苷分子)，(b)功能化支架(因此包括至少一个糖苷分子和配体、抗体等和/或效应分子，(c)聚合结构或寡聚结构，其包括至少一种配体、抗体等和/或至少一种效应物，或(d)聚合结构或寡聚结构，没有糖苷分子，没有配体、抗体等，也没有效应分子。功能化组装聚合结构是一种组装聚合结构，包含：(a)至少一种功能化支架或(b)至少一种支架和至少一种聚合物结构，聚合物结构包括至少一种配体、抗体等和/或至少一种效应物。不包括任何上述分子(即没有糖苷、配体、抗体或效应物)的组装聚合结构内的聚合结构或寡聚结构特别被添加为组装结构的结构成分，这有助于构建或稳定组装结构(“胶状”)。发明人已经发现，特别是在偶联到糖苷分子之后，包括具有许多伯胺、仲胺和/或叔胺基团的聚合结构的支架不会特别增强内体逃逸。在这方面尤其不优选的是包括仲胺基团的聚合结构和寡聚结构。不希望受任何理论束缚，酸性环境似乎是糖苷和效应物之间协同作用的先决条件，并且相信这些胺基会扰乱次级内体中的酸性环境。因此，能够扰乱酸性环境的支架，例如，由于胺基团的存在，优选不涵盖在根据本发明的支架内。然而，伯胺基团当然可以被阻断或屏蔽，例如通过硫醇化或聚乙二醇化。在适当阻断或屏蔽伯胺基团之后，该方法是技术人员已知的，这样的支架涵盖在权利要求中。
在一个特别优选的实施方式中，本发明提供了基本上不抑制效应分子的内体(和溶酶体)逃逸的支架，并且优选地包括小于10个，更优选地小于5个，更优选地小于2个，最优选地不含伯胺、仲胺或叔胺基团。为清楚起见，强调被例如硫醇化或聚乙二醇化阻断的伯胺基不再称为胺基团。
支架是否能够扰乱酸性环境并抑制至少一种糖苷的内体逃逸功能可以通过如在实施例4中描述的和本领域已知的测定而容易地确定。这种抑制被描述为“诱导50％细胞杀伤所需的糖苷数量增加的倍数”。优选的是，支架不会导致增加，即当使用氯喹作为阳性对照时，至少观察到的获得50％细胞杀伤所需的糖苷分子的增加。或者，并且优选地，支架不会导致糖苷分子增加至少4倍以诱导50％的细胞杀伤，更优选地不会导致至少2倍增加。增加倍数将在测定中测量，基本上如在实施例4中所述，其中氯喹作为阳性对照诱导糖苷量增加2倍以观察50％的细胞杀伤。
术语“提高或增强效应分子的效果”是指糖苷分子增加该效应分子的功能功效(例如毒素或药物或寡核苷酸诸如BNA的治疗指数；生物技术过程中改性剂的代谢功效；基因在细胞培养研究实验中的转染功效)，优选通过启用或改善其靶标参与。优选不包括抗原特异性免疫反应的加速、延长或增强。治疗功效包括但不限于更强的治疗效果，优选具有更低的剂量和/或更少的副作用。“提高效应分子的效果”还可以表示由于缺乏效果而不能使用的效应分子(并且是例如不被称为效应分子)，当与本发明组合使用时变得有效。本发明提供的任何其他有益的或期望的并且可归因于效应分子和支架的组合的效果都被认为是“提高的效果”。在一个实施方式中，支架增强效应分子的效果，该效果是预期和/或期望的。在蛋白质支架的情况下，蛋白质聚合物结构本身可以具有例如对血流中胶体渗透压的效果。如果这种效果不是最终功能化支架的预期或期望效果，则支架的蛋白质结构不是本发明中定义的效应分子。或者，例如在基于DNA或基于RNA的支架的情况下，该DNA或RNA的部分可以具有(非预期的)功能，例如，通过干扰表达。如果这种干扰不是最终功能化支架的预期或期望效果，则支架的DNA聚合结构或RNA聚合结构不是本发明中定义的效应分子。
可以为内体逃逸增强剂(即根据本发明的糖苷)配制许多优选特征：(1)它们优选无毒且不引起免疫反应，(2)它们优选不介导效应分子进入脱靶细胞的细胞溶质摄取，(3)它们在作用位点的存在优选与效应分子的存在同步，(4)它们优选是可生物降解的或可排泄的，以及(5)它们优选基本上不干扰与内体逃逸增强剂结合的效应分子的生物活性无关的生物体的生物过程，例如与激素相互作用。至少在一定程度上满足上述标准的糖苷分子的示例是双糖链三萜，优选双糖链三萜皂苷，诸如SO1861、SA1641、QS-21、GE1741。
一个实施方式是根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子，优选糖苷，经由不可裂解的键或经由可裂解的键与聚合结构或寡聚结构共价结合，其中优选地，所述可裂解的键在酸性条件、还原条件、酶促条件或光诱导条件下发生裂解，更优选地，可裂解的键是在酸性条件下发生裂解的腙键或酰肼键，和/或是对蛋白水解敏感的键，例如通过组织蛋白酶B进行蛋白水解，和/或是在还原条件下易裂解的键，诸如二硫键。根据本发明，生物活性分子通常是本发明的皂苷(也参见表A1，方案I)。它已被证明对皂苷的活性有益，例如当皂苷与涉及腙键，和/或酰肼键，和/或二硫键的支架共价偶联时，当考虑到与皂苷共价偶联到同一支架上的效应分子进入细胞并在细胞质内积累时，细胞内的内体逃逸增强活性。这种键类型在酸性条件下和/或在还原条件下很容易在哺乳动物细胞例如人类细胞(次级)的内体和溶酶体内裂解。或者，本发明人还证明了皂苷经由在细胞内生理条件下不易裂解的键，例如(次级)内体，溶酶体，细胞质，与载体分子共价偶联，也有利于皂苷对例如效应部分诸如核酸(例如BNA沉默HSP27)和蛋白质毒素诸如皂草素，的生物效应的增强活性。在整个申请中，包括权利要求，术语“可裂解连接子”、“可裂解的键”等也称为“不稳定连接子”(“L”)和“不稳定键”，例如在(次级)内体和/或溶酶体中的这种键或连接子裂解的情况下，当本发明的缀合物，例如带有皂苷的支架，经由腙键或二硫键与支架偶联被称为支架。例如，图1显示了小鼠肿瘤中的体内HSP27基因沉默。荷瘤小鼠用根据本发明的支架治疗，该支架包括寡聚三功能连接子(参见方案II和结构B)，皂苷SO1861经由腙键共价结合于其上，用于沉默肿瘤细胞中HSP27基因的反义BNA，经由腙键与支架共价偶联，单克隆抗EGFR抗体西妥昔单抗经由二硫键与支架共价偶联，其中腙键和二硫键称为可裂解的键，因此称为不稳定键。换言之，不希望受任何理论束缚，一旦包括本发明的支架的缀合物被内化，例如内吞作用，腙键和二硫键在细胞表面表达EGFR的靶向肿瘤细胞的(次级)内体和/或溶酶体中被裂解。当考虑BNA从内体和/或溶酶体进入细胞质时，键的裂解可能有助于皂苷的内体逃逸增强活性，尽管这种裂解不是观察包括三功能连接子的西妥昔单抗(皂苷)(BNA)缀合物，即本发明的支架的基因沉默效果的必要条件。
技术人员将理解，这种三功能连接子是本发明的适合于共价偶联一个、两个或三个皂苷部分的支架。对于一个或两个皂苷部分的三功能连接子共价偶联是优选的。第二结合位点和/或第三结合位点例如适用于共价偶联效应部分诸如有效载荷，例如蛋白质毒素，小分子毒素、核酸。三功能连接子的第二结合位点或第三结合位点例如也适用于共价偶联非蛋白质配体以靶向细胞诸如肿瘤细胞或自身免疫细胞，和/或用于偶联蛋白质配体。典型的蛋白质配体是用于靶向在细胞表面表达EGFR的(肿瘤)细胞的EGF，以及用于靶向肿瘤细胞或自身免疫细胞的细胞因子。此外，三功能连接子的第二结合位点或第三结合位点适用于免疫球蛋白诸如单克隆抗体的共价偶联，用于结合细胞表面分子诸如肿瘤细胞表面分子，优选肿瘤细胞特异性分子，更优选在肿瘤细胞表面特异性(过-)表达的肿瘤细胞受体。类似地，包含免疫球蛋白的结合特异性的免疫球蛋白或其任何片段和/或结构域适用于结合细胞表面分子，诸如在自身免疫细胞的表面表达的受体。因此，在一个实施方式中，三功能连接子包括共价结合的皂苷或由共价结合的皂苷组成，例如QS-21、SO1861、共价结合的效应部分，诸如毒素或寡核苷酸，诸如BNA，以及共价结合的细胞靶向部分，诸如用于(特异性)结合肿瘤细胞、自身免疫细胞、患病细胞、异常细胞、非健康细胞、B细胞疾病的配体或抗体。
一个实施方式是本发明的支架，包括作为支架核心结构的寡聚三功能连接子，根据方案II：
Figure BDA0003222052890000451
Figure BDA0003222052890000461
其中皂苷和此处作为示例的效应部分经由不稳定的、可裂解的腙连接子(酸敏感性)和/或经由含马来酰亚胺的键共价结合到三功能连接子支架上，当考虑效应部分时，任选载体分子中的半胱氨酸，而支架与载体分子诸如抗体或连接子的(任选的)结合是经由不稳定、可裂解的腙连接子(酸敏感性)和/或经由与载体分子中的半胱氨酸的含马来酰亚胺的键建立的，诸如1、2、3或4个半胱氨酸与其形成结构B：
Figure BDA0003222052890000462
从而使1-4个支架与单个载体分子(诸如单克隆抗体)共价结合。因此，根据本发明，单个载体分子诸如抗体、配体、效应部分可以与单一支架诸如方案II和结构B的三功能连接子共价缀合，或与两个或更多个支架共价缀合，两个或更多个支架相同或不同，并且两个或更多个支架任选地包括相同(数量)或不同(数量)共价结合的皂苷。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子经由可裂解键与聚合结构或寡聚结构共价结合，其中所述可裂解键在哺乳动物细胞，优选人类细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下在活体内经受裂解，优选在pH4.0至6.5，更优选在pH≤5.5。当支架处于这样的细胞内酸性环境例如次级内体中时，这种可裂解的键促进生物活性分子诸如一种或多种皂苷的释放。不希望受任何理论束缚，当考虑存在于内体或溶酶体内的效应部分的内体逃逸时，内体和/或溶酶体内的游离皂苷可以有助于皂苷的内体逃逸增强活性，这种内体逃逸增强活性与结合到例如支架的皂苷的活性相比更高或更有效。发明人确定皂苷经由诸如腙键、酰胺键、二硫键等键结合到支架和载体分子上，都能够改善(肿瘤)细胞内效应部分或效应分子的细胞毒性效果，诸如蛋白质毒素和寡核苷酸(如反义BNA)等多种多样的有效载荷。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子经由亚胺键、腙键、酰肼键、肟键、1,3-二氧戊环键、二硫键、硫醚键、酰胺键、肽键或酯键与支架的聚合结构或寡聚结构共价结合，优选经由至少一个连接子，其中优选地，生物活性分子是本发明的一种或多种皂苷。发明人证明了当细胞(诸如肿瘤细胞)暴露于支架(诸如寡聚三功能连接子或树枝化基元，携带共价偶联的皂苷)和效应部分(诸如反义BNA或皂草素)时，使用这种键将例如皂苷共价偶联到支架上会增强效应部分的效果和活性。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种皂苷的在C-23位置处的醛官能团参与与支架的聚合结构或寡聚结构的共价结合，和/或，如果存在，至少一种皂苷的在C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团参与与支架的聚合结构或寡聚结构的共价结合，或经由直接结合或经由至少一个连接子。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种皂苷的在C-23位置处的醛官能团与连接子N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼共价偶联，该连接子经由硫醚键共价偶联至支架的聚合结构或寡聚结构中的巯基，诸如半胱氨酸的巯基。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种皂苷的在C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中的葡糖醛酸官能团与连接子1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化六氟磷酸盐共价偶联，该连接子经由酰胺键共价偶联至支架的聚合结构或寡聚结构中的胺基，诸如赖氨酸的胺基或蛋白质分子的氨基端。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中糖苷分子为皂苷，并且皂苷和支架内的聚合结构或寡聚结构之间的连接优选经由酸不稳定键发生，该键在pH 7.4稳定并且优选在pH 6.5以下释放皂苷，更优选在pH6.5和5.0之间。这例如经由由聚合结构或寡聚结构的氨基和皂苷的醛基形成的亚胺来实现。满足pH条件的其他化学键也可用于醛偶联，例如特定的腙或缩醛，分别需要酰肼基和羟基作为聚合结构或寡聚结构的官能团。如果该键是可裂解的键，则皂苷优选经由醛官能团或经由皂苷中的羧基之一，更优选经由醛官能团，优选在23位的醛官能团附接至支架的聚合结构或寡聚结构。或者，皂苷优选经由连接子连接至支架的聚合结构或寡聚结构，该连接子经由醛官能团或经由糖苷分子的羧酸官能团连接支架的聚合结构或寡聚结构。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一个糖苷分子经由稳定键与聚合结构或寡聚结构结合。在更优选的实施方式中，至少一个糖苷分子是皂苷，并且皂苷与支架的聚合结构或寡聚结构之间的稳定键优选经由酰胺偶联或胺形成发生。这例如经由碳二亚胺介导的酰胺键形成来实现，该酰胺键由聚合结构或寡聚结构的氨基和皂苷的活化葡糖醛酸基团形成。满足稳定键定义的化学键也可用于醛偶联，例如还原胺化后衍生的特定胺，需要伯氨基作为聚合结构或寡聚结构的官能团。如果键是稳定键，则皂苷优选经由皂苷的羧基之一附接到支架上。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中用于将支架与载体分子共价偶联的化学基团是点击化学基团。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中点击化学基团是四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或任何这些基团的环状衍生物，优选叠氮化物。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中支架进一步包括用于偶联效应分子和/或配体、抗体、结合结构域或其片段的点击化学基团。点击化学基团是适用于点击化学的功能性化学基团，其定义为模块化、范围广、产量非常高、仅产生无害的副产物、对不同官能团具有高选择性和高耐受性的反应，并且是立体特异性的。所需的工艺特性包括简单的反应条件、容易获得的起始材料和试剂、不使用溶剂或使用温和的溶剂(如水)或易于去除的溶剂，以及简单的产物分离。点击化学基团优选是四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或这些基团的反应衍生物，诸如甲基四嗪或马来酰亚胺(烯烃)，更优选炔烃，或这些基团的环状衍生物，诸如环辛炔(例如氮杂-二苯并环辛炔、二氟环辛炔、双环[6.1.0]非-4-炔、二苯并环辛炔)。
因此，根据本发明的支架包括至少一个糖苷分子。在本文中，“至少一个”是指支架包括一个糖苷分子，但也可以包括一对(例如两个、三个或四个)糖苷分子或多个(例如10、20或100个)糖苷分子。根据应用，可以设计支架以使其包括限定数量的糖苷分子。优选地，根据本发明的支架包括限定数量或范围的糖苷分子，而不是随机数。这对于与上市许可相关的药物研发尤其有利。在这方面定义的数目是指支架优选地包括先前定义数目的糖苷分子。这例如通过设计具有一定数量的糖苷连接的可能部分的聚合结构来实现。在理想情况下，所有这些部分都与糖苷分子偶联，并且支架包括预先定义数量的糖苷分子。设想提供一组标准的支架，包括例如两个、四个、八个、十六个、三十二个、六十四个等的糖苷分子，以便用户可以根据其需要轻松地测试最佳数量。一个实施方式是本发明的支架，其中糖苷以限定的范围存在，例如，在非理想情况下，并非聚合结构中存在的所有部分都结合糖苷分子。例如，这种范围可以是每个支架2-4个糖苷分子、每个支架3-6个糖苷分子、每个支架4-8个糖苷分子、每个支架6-8个糖苷分子、每个支架6-12个糖苷分子等等。在这种情况下，如果范围定义为2-4，则根据本发明的支架因此包括2、3或4个糖苷分子。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中聚合结构或寡聚结构的单体数量是精确限定的数量或范围。优选地，聚合结构或寡聚结构包括诸如聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺)的结构；或诸如聚乙二醇、聚(酯)的结构，如聚(丙交酯)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物，聚(糊精)或肽或蛋白质，或诸如天然和/或人工聚氨基酸的结构，例如聚赖氨酸、DNA聚合物、稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物，呈线性、支化或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元、树枝化聚合物、树枝化寡聚物或这些聚合结构或寡聚结构的组装体，无论是纯粹的还是混合的。优选地，聚合结构或寡聚结构是生物相容的，其中生物相容是指聚合结构或寡聚结构在生物体中不表现出显着的急性或慢性毒性，并且可以通过身体的代谢原样排泄或完全降解为可排泄的和/或生理的化合物。组装体可以通过共价交联或非共价键和/或吸引力来建立。因此，它们也可以形成纳米凝胶、微凝胶或水凝胶，或者它们可以附接到载体上，诸如无机纳米颗粒、胶体、脂质体、胶束或包括胆固醇和/或磷脂的颗粒状结构。所述聚合结构或寡聚结构优选带有精确限定数量或范围的偶联部分，用于偶联糖苷分子(和/或效应分子和/或载体分子，诸如配体、单克隆抗体或其片段)。优选至少50％，更优选至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％，更优选至少99％，最优选聚合结构或寡聚结构中精确限定数量或范围的偶联部分的100％被根据本发明的支架中的糖苷分子占据。
优选地，树枝化基元是分支的、明确定义的树枝状聚合物，在树的起源处具有单个化学可寻址基团，称为焦点。树枝状聚合物是两个或多个树枝化基元在其焦点处的连接。树枝状聚合物是一个或多个树枝化基元的焦点与聚合物的连接。在一个优选的实施方式中，提供了根据本发明的支架，其中聚合结构或寡聚结构包括线性、支化或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元、树枝化聚合物、树枝化寡聚物或这些聚合结构或寡聚结构的组装体，无论是纯粹的还是混合的，其中组装体可以通过共价交联或非共价吸引建立，并且可以形成纳米凝胶、微凝胶或水凝胶，并且其中，优选地，聚合物是聚(胺)的衍生物，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺胺)，和诸如聚乙二醇、聚(酯)的结构，如聚(丙交酯)、聚(内酰胺)、聚丙交酯-共-乙交酯共聚物和聚(糊精)，和诸如天然和/或人工聚氨基酸的结构，诸如聚赖氨酸，或肽或蛋白质(例如配体或抗体，诸如表A2-A4中任一项的单克隆抗体)或DNA聚合物、稳定的RNA聚合物或PNA(肽核酸)聚合物。优选地，聚合结构或寡聚结构是生物相容的。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中所述效应分子是药物活性物质，诸如毒素、药物、多肽和/或多核苷酸。一个实施方式是本发明的支架，其中效应分子是毒素、微RNA或编码蛋白质的多核苷酸。通常，载体分子涵盖用于将支架靶向到例如肿瘤细胞或自身免疫细胞或与B细胞疾病相关的细胞的蛋白质分子。优选地，载体分子包括免疫球蛋白或免疫球蛋白的至少一个或多个结合结构域和/或其结合片段，这种免疫球蛋白优选地选自表A2至表A4中任一项的单克隆抗体中的任一种，诸如西妥昔单抗、OKT-9、曲妥珠单抗。
本发明中的药物活性物质是用于在生物体中(优选脊椎动物，更优选人类，诸如癌症患者或自身免疫患者)实现有益结果的效应分子。益处包括疾病和/或症状的诊断、预后、治疗、治愈和/或预防。药物活性物质也可能导致不希望的有害副作用。在这种情况下，必须权衡利弊，以确定药物活性物质是否适合特定情况。如果细胞内药物活性物质的效果主要对整个生物体有益，则该细胞称为靶细胞。如果细胞内的效果主要对整个生物体有害，则该细胞称为脱靶细胞。在细胞培养和生物反应器等人工系统中，靶细胞和脱靶细胞取决于目的并由用户定义。
作为多肽的效应分子可以是例如恢复失去的功能诸如酶置换、基因调节功能或毒素的多肽。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中支架是三功能连接子，连接子包括：第二化学基团，至少一个生物活性分子与第二化学基团共价结合，第三化学基团，用于与分子共价结合，以及包括第一化学基团，用于与载体共价结合，优选地三功能连接子是方案II和结构B的所述三功能连接子。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中至少一种生物活性分子是限定数量的糖苷分子或限定范围的糖苷分子，优选1-128个或至少2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、16个、32个、64个或128个糖苷分子，或其中的任意数量的糖苷分子，诸如7个、9个、或12个糖苷分子。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中聚合结构或寡聚结构包括线性、支化和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元、树枝化聚合物、树枝化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇，或这些聚合结构或寡聚结构的组装体，组装体优选通过共价交联建立。
支架基本上与共价结合到支架上的效应分子的类型无关。因此，支架是新平台技术的基础产物。由于至少一种共价结合的糖苷介导细胞内递送，根据本发明的支架技术是已知的第一个通过糖苷介导对照细胞内效应分子递送的系统。
同步是非常成功的小鼠递送策略与其在人类中的应用之间所缺失的环节。事实上，发明人在一系列体内小鼠肿瘤模型中确定，分别给药于小鼠一定剂量的游离皂苷和一定剂量的ADC，与未以ADC和游离皂苷治疗的对照动物相比，没有产生任何所需的抗肿瘤活性，诸如延迟肿瘤生长、肿瘤消退、肿瘤生长减少和减慢等。与给药ADC的时刻(给药ADC之前、期间和之后给药游离皂苷)相比，使用多种给药途径和使用游离皂苷给药的不同时间点给药游离皂苷。在体内肿瘤模型中测试的ADC是西妥昔单抗-石竹素(含游离SO1861)或曲妥珠单抗-皂草素(含游离SO1861)。改变游离皂苷的剂量并不能提供有效的抗肿瘤活性。所提及的ADC的给药剂量本身不会对荷瘤动物产生任何有益的抗肿瘤效果。令人惊讶的是，本发明人现在确定，在各种体外基于哺乳动物细胞的生物测定和/或各种体内动物肿瘤模型中的有益抗肿瘤活性可以通过用根据本发明的缀合物治疗动物来实现，所述缀合物包括根据本发明的支架。例如，支架是经由可裂解连接子具有多达四个共价结合的皂苷分子(例如SO1861)的树枝化基元。例如，支架是三功能连接子，其具有经由可裂解键或不可裂解连接共价结合的皂苷(例如SO1861、QS-21)，并具有共价结合的效应部分(例如，石竹素，经由不可裂解键或可裂解键沉默BNA(HSP27)，并且具有共价结合的单克隆抗体，诸如西妥昔单抗、曲妥珠单抗、OKT-9，或者支架是树枝化基元，诸如四个部分可以结合的树枝化基元，诸如四个皂苷分子，或用于结合例如两个皂苷和两个效应分子的树枝化基元，该树枝化基元包括用于(共价)偶联到配体或抗体或其片段或结构域的化学基团。参考示例部分，举例说明了根据本发明的这些支架中的各种支架，当考虑细胞毒性由例如蛋白质毒素发挥时或考虑肿瘤细胞中的基因沉默时，显示体内和/或体外抗肿瘤细胞活性。
本发明的支架提供了优化的和功能活性的单元，该单元可以连接到效应分子和/或配体、抗体等，在单个和限定的位置，优选经由共价键，当需要用于预期目的时，经由可裂解共价键。
不希望受任何理论束缚，鉴于考虑到用ADC和游离皂苷治疗荷瘤动物时观察到的失败，优选同步两者的存在，至少一种糖苷，优选皂苷和效应分子，优选毒素或寡核苷酸诸如BNA，在靶细胞，例如肿瘤细胞或自身免疫细胞的内吞途径的隔室或囊泡中。根据发明人的多次尝试，以ADC和游离皂苷，同步次级内体中分子的存在以在体内获得协同效应并不是有益地获得的。一方面，本发明优选解决了以下关于将效应分子和糖苷分子结合在一种包括本发明的支架的化合物中的至少一个以下问题：(1)每个效应分子所需糖苷分子的数量是限定的数量或范围(例如，优选1个或更多，优选至少2个，更优选至少3个，更优选至少5个，更优选至少6个，更优选至少10个，更优选至少15个，更优选至少20个，更优选至少25个，更优选至少27个，最优选至少30个或更多个)，使得简单的化学连接不是有利的；(2)内体逃逸活性需要例如皂苷内唯一合理的化学基团，其可用于(共价)，特别是单一的和可裂解的、可保留的偶联；(3)效应分子可能不具备合适的反基团进行偶联；以及(4)当不能自由扩散时，糖苷可能失去与胆固醇相互作用的必要潜力。所有这些限制很可能是为什么在临床研究中除了皂苷在疫苗接种方案中的应用之外糖苷没有与药物活性物质结合使用的原因，其中暗示使用免疫增强佐剂物质，尽管例如表A1和方案I中列出的皂苷的显着内体逃逸增强剂效果已10多年来为人所知。根据本发明的支架至少部分地解决了这些困难。令人惊讶的是，先前在涉及皂苷作为佐剂成分的疫苗接种环境中应用其免疫增强活性的皂苷，现在也适用于(共价)偶联到本发明的支架上，暗示缀合物中包括带有皂苷的支架并进一步具有效应分子和任选的细胞靶向部分，诸如配体或抗体，(共价)结合到其上，用于体外和体内抗肿瘤活性。
在其基本形式中，支架包括带有至少一个糖苷分子的聚合和/或寡聚结构，例如特定皂苷，诸如SO1861(表A1，图13)。在一个优选实施方式中，提供了一种支架，其中糖苷分子经由可裂解键与聚合结构或寡聚结构结合，其中优选地，所述可裂解键在酸性条件、还原条件、酶促条件或光诱导条件下进行裂解，更优选在酸性条件下。优选地，可裂解键是亚胺、腙、肟、1,3-二氧戊环、二硫化物、酰肼或酯。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中糖苷分子是SA1641、SO1861、GE1741、QS-21或它们的任何立体异构体，诸如它们的任何非对映异构体。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中载体分子包括或由以下任一种组成：蛋白质分子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、脂质、脂肪、脂肪酸、纳米颗粒、碳水化合物或其组合的任何共价结合的缀合物或共价结合的复合物。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中载体分子包括或由以下组成：免疫球蛋白、免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，诸如抗体、IgG、包括或由以下组成的分子：Vhh结构域或Vh结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段，或包括或由以下至少一种组成：非蛋白质配体和/或至少一种用于结合细胞表面分子的蛋白质配体诸如EGF或细胞因子。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中载体分子包括或由至少一个结合结构域和/或至少一个结合片段组成，用于结合细胞表面受体，诸如选自CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、syndecan-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝素A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2的肿瘤细胞特异性细胞表面受体，优选地选自CD71、EGFR、HER2。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中载体分子包括或由以下任一种组成：西妥昔单抗(cetuximab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、布伦妥昔单抗(brentuximab)、伊妥珠单抗(inotuzumab)、莫西妥单抗(moxetumomab)、波妥珠单抗(polatuzumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、IgG型的OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗(pertuzumab)、利妥珠单抗(rituximab)、奥法木单抗(ofatumumab)、赫赛汀、阿仑单抗(alemtuzumab)、匹那珠单抗(pinatuzumab)、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或其至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或其至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，诸如其至少一种肿瘤细胞特异性受体结合片段和/或其至少一种肿瘤细胞特异性受体结合结构域。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中支架适合与载体分子形成共价键，当载体分子包括至少一个半胱氨酸和/或赖氨酸时，共价键优选涉及载体分子的半胱氨酸侧链和/或载体分子的赖氨酸侧链。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中载体分子包括至少一种效应分子或由至少一种效应分子组成，或其中当载体还包括根据本发明的免疫球蛋白、其结合片段、其结合结构域等时，载体进一步包括至少一种效应分子，其中效应分子是活性药物物质中的至少一种，诸如有效载荷、毒素、药物、多肽、寡核苷酸、核酸、异种核酸、酶诸如脲酶和Cre-重组酶、蛋白质毒素、或核糖体失活蛋白中的任何一种或多种。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中蛋白质毒素包括或由以下任何一种或多种组成：选自表A5的蛋白质毒素和/或病毒毒素诸如凋亡素；细菌毒素，诸如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，诸如α-肉毒素；植物毒素，包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，诸如石竹素，例如石竹素-30或石竹素-32、皂草素，例如皂草素-S3或皂草素-S6、布加宁或布加宁的去免疫衍生物布加宁、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫德霉素、莫德霉素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、沃尔肯辛、沃尔肯辛A链、黏蛋白、黏蛋白A链；或动物或人类毒素，诸如青蛙核糖核酸酶，或来自人类的颗粒酶B或血管生成素，或其任何片段或衍生物；优选蛋白质毒素为石竹素和/或皂草素。
一个实施方式为根据本发明的支架，其中寡核苷酸、异种核酸或核酸包括或由以下任何一种或多种组成：载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸吗啉代寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基亚乙基桥接核酸、3'-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)，或其衍生物，优选BNA，例如用于沉默HSP27蛋白质表达的BNA。
利用本发明的支架，现在可以设计和制造单成分、非病毒临床应用基因递送技术。例如，本发明的支架允许研发基于非病毒的基因递送技术，其以较低的治疗剂量增强治疗功效，从而改善患者的健康。本发明的支架，特别是当共价结合载体分子诸如单克隆抗体以结合到(肿瘤、自身免疫)细胞表面特异性分子时，以及当结合到载体分子诸如寡核苷酸例如BNA时，允许克服基因递送领域长期存在的主要瓶颈，即基因治疗产品通过内体膜高效、安全和经济地转移到细胞质/核糖体中。事实上，基因疗法是未来对多种疾病进行的先进疗法的最有希望的治疗选择之一。成功的基因递送需要靶细胞的识别以及基因的细胞溶质和核质摄取。非病毒基因治疗领域中的主要问题之一是用于患者治疗用途的基因材料的低效和缺乏安全性的递送。
因此，当应用包括细胞靶向载体分子诸如配体或优选抗体(其片段、结构域)并包括寡核苷酸诸如反义BNA的本发明的支架时，发明人现在可以克服基因递送领域长期存在的主要瓶颈：基因治疗产品通过内体膜安全转移到细胞质/核糖体中。本发明的支架表示设计用于允许用所有已知的遗传因子靶向任何可寻址细胞类型的技术，从而确保更好的患者治疗，不仅限于遗传性疾病，而且也用于癌症治疗，因此对于广大患者群体很重要。基于本发明的支架的技术是用作内体逃逸增强剂(EEE)的载体的聚合支架或寡聚支架，诸如表A1和方案I以及根据本发明的任何实施方式的皂苷，用于靶向配体或(单克隆)(肿瘤细胞特异性)抗体，以及用于效应部分，在这里是效应物基因，诸如LNA或BNA。本发明的支架的用途，例如包括细胞靶向抗体(片段)和寡核苷酸(诸如BNA)，具有将任何种类的生物大分子带入细胞质和细胞核的潜力。全球众多研究团体和公司正在不断研究新靶向配体和单克隆(人的，人化的)抗体的研发。对于旨在在患病细胞(诸如癌细胞)的细胞质中递送的寡核苷酸也是如此。因此，本发明的支架提供了用于通过点击化学将当前和未来的靶向配体和抗体以及当前和未来的治疗性寡核苷酸(以及有效载荷诸如蛋白质毒素)连接到本发明的寡聚支架模块或聚合支架模块的分子界面，允许定制的药物应用以及组织和细胞靶向技术领域中的未来发展。本发明的支架可以与抗体和配体结合作为共价偶联的载体分子。全球基因治疗市场正在迅速增长，涵盖了广泛疾病领域的潜在治疗方法，诸如癌症、心血管疾病、帕金森症、阿尔茨海默氏症、艾滋病毒和许多罕见(单基因)疾病。当前基于病毒载体的基因治疗技术面临着重大挑战，诸如安全性、制造物流和相关的高成本。本发明的支架允许在表示当前病毒基因递送技术的替代方案的技术平台中使用。因此，本发明的支架适用于在用于研发针对诸如癌症、心血管疾病、帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、艾滋病毒和许多罕见(单基因)疾病等疾病的非病毒基因治疗方法中实现。本发明的支架适用于研发新的治疗方法，通过制备基于非病毒载体的基因治疗，诸如基于靶向反义BNA来转化抗体-药物缀合物(ADC)和基于寡核苷酸的治疗的领域。本发明的支架的应用，特别是在与抗体和寡核苷酸诸如BNA的共价缀合物中的应用由于本发明而成为可能的许多有益方法之一。例如，本发明的支架的使用现在允许利用哺乳动物细胞的内吞途径。内吞作用被用于治疗剂的递送，其中本发明的支架有助于与支架缀合的例如siRNA的改善的摄取和内体逃逸。本发明的支架适合与用作例如有效载荷、寡核苷酸的递送增强剂的小分子一起使用。因此，带有共价偶联寡核苷酸诸如BNA和带有共价偶联细胞靶向部分诸如配体和优选抗体(结构域或片段)的本发明的支架为当前内体逃逸增强剂和基因治疗产品所见的当前问题提供了解决方案，涉及它们作为两个成分的应用，因此使治疗批准和临床适用性复杂化，因为本发明的这种支架是涵盖皂苷、基因产物诸如BNA和(肿瘤)细胞靶向部分如(单克隆)抗体的单一缀合物治疗分子。因此，本发明提供了一种非病毒基因递送技术，其中内体逃逸增强剂(例如表A1、方案I、本发明实施方式的糖苷)、基因治疗产品(根据本发明的寡核苷酸，诸如BNA)和靶向配体或抗体(根据例如表A2、表A3、表A4，本发明的实施方式)都与本发明的一种分子支架结合。因此，本发明的这种支架为当前和未来的大分子药物提供了对多种疾病和广大患者群体的治疗机会。通过应用包括至少一种皂苷、至少一种寡核苷酸和至少一种特异性细胞靶向部分诸如免疫球蛋白的本发明的这种支架，解决了分别应用内体逃逸增强剂和基因治疗产品的当前方法中明显的问题，目前的方法不能确保两种化合物同时处于相互作用位点。现在通过使用本发明的支架克服了这个问题。换言之，本发明的这种支架提供了一种非病毒基因递送技术，其中两种化合物即皂苷和基因产物诸如BNA的同步性(时间和地点)增加。
基因疗法可以帮助治疗遗传性、以前无法治愈的疾病，诸如囊性纤维化、舞蹈病、亨廷顿病或血友病。然而，目前还存在一些问题尚未解决：例如，治疗基因必须精确地到达体内特定的靶细胞。另一方面，治疗基因应该被靶细胞吸收，但治疗基因不应被破坏。当前的基因治疗方法使用病毒作为基因的渡口。然而，这些程序涉及相当大的风险，并且不能转移到引入其他生物分子。一个实施方式是本发明的支架包括(植物衍生的)糖苷，用于使用平台技术，该技术不仅允许在作为载体分子与支架结合时递送基因，而且允许递送不同的治疗生物分子导入靶细胞。因此，本发明的支架用于研发基于核酸的囊性纤维化、舞蹈病、亨廷顿病或血友病的治疗。因此，利用本发明的支架，一种新的基因治疗策略可用于改善遗传病患者的健康，包括囊性纤维化、亨廷顿病和血友病患者。作为本发明的一部分，研发了一种非病毒基因递送技术，该技术结合了植物衍生的内体逃逸增强剂(糖苷)、基因治疗产品和靶向配体，这些都与单个分子支架结合。与目前可用的策略相比，基于本发明的支架的所得非病毒基因疗法在较低剂量下显示出提高了约40倍的递送效率。因此，本发明的支架用于临床应用，诸如用于修复或替换缺陷基因，例如在囊性纤维化患者中，以及用于靶向递送特定基因，例如以破坏癌细胞。事实上，本发明的支架适用于由遗传缺陷引起的任何疾病的治疗方案—诸如囊性纤维化、亨廷顿病和血友病，这些疾病目前无法治愈。使用本发明的支架的基因治疗有助于克服当前的两个问题：第一，本发明的支架可以将治疗基因递送至体内的特定靶细胞；第二，治疗基因进入这些细胞的内部，但没有被破坏，因为存在皂苷、寡核苷酸产物和靶向部分，诸如用于结合靶细胞的抗体，所有这些都与本发明的寡聚支架或聚合支架共价连接。
一个实施方式是根据本发明的支架，其中效应分子包括至少一种有效载荷或由至少一种有效载荷组成，优选选自以下任何一种或多种：靶向毒素核糖体、靶向毒素延伸因子、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素，更优选地选自以下任何一种或多种：丹宁、pasudotox、美登木素衍生物DM1、美登木素衍生物DM4、单甲基耳他汀E(MMAE，维多丁)、单甲基耳他汀F(MMAF、马服丁)、加利车霉素，N乙酰基-γ加利车霉素，吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、苯二氮卓类、CC-1065类似物、多霉素、多柔比星、紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚并苯二氮卓、AZ13599185、隐霉素、根瘤菌素、甲氨蝶呤、蒽环类、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依沙康、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、多霉素衍生物、鹅膏菌素、α-鹅膏菌素、剪接抑制素、泰兰他汀、奥佐霉素、替西林、安伯他汀269和索拉维坦，或其衍生物。
一个实施方式是根据本发明的支架，其中载体分子包括效应分子和单克隆抗体的共价连接组合或由其组成，优选选自表A2和表A3的吉妥珠单抗奥佐霉素、布伦妥昔单抗维多丁、曲妥珠单抗丹宁、伊妥珠单抗奥佐霉素、莫西妥单抗pasudotox、波妥珠单抗维多丁以及抗体药物缀合物。
本发明的一个方面涉及一种用于制备适合于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合的支架的方法，方法包括：a)提供聚合结构或寡聚结构，包括用于将聚合结构或寡聚结构与载体分子共价偶联的第一化学基团并且包括与第一化学基团不同的第二化学基团中的至少一个，其中每个第二化学基团用于将至少一种生物活性分子之一共价偶联至寡聚结构或聚合结构；以及b)经由第二化学基团将至少一种生物活性分子共价偶联至聚合结构或寡聚结构，其中优选地，生物活性分子是本发明的任何一种生物活性分子，更优选为SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21和/或表A1和/或方案I的任何皂苷，从而提供支架。
聚合结构或寡聚结构优选是根据本发明的任何聚合结构或寡聚结构。类似地，用于共价偶联的第一化学基团和第二化学基团是根据本发明实施方式的化学基团。生物活性分子优选是本发明的方面和实施方式的任何生物活性分子。优选地，生物活性分子是根据本发明的皂苷，并且同样优选地，皂苷经由连接子诸如根据本发明的可裂解连接子与支架共价偶联。本发明的典型支架是三功能连接子和树枝化基元。
一个实施方式是本发明的方法，其中至少一种生物活性分子是本发明前述方面和实施方式的糖苷和皂苷中的任一种；和/或其中至少一种生物活性分子通过根据本发明前述方面和实施方式中任一项的连接子连接至支架；和/或其中根据本发明前述实施方式和方面中任一项的皂苷通过共价键连接至支架；和/或其中皂苷通过本发明前述实施方式中任一项的可裂解键连接至支架。
本发明的一个方面涉及一种制备与载体分子共价结合的支架的方法，支架包括至少一种共价结合的生物活性分子，方法包括：a)提供包括至少一种生物活性分子的支架，生物活性分子与所述支架中的聚合结构或寡聚结构共价结合，优选提供根据本发明的支架或可通过本发明的方法获得的支架或通过本发明的方法获得的支架；以及b)将a)的支架与根据本发明的载体分子共价偶联，从而提供与载体分子共价结合的支架，支架包括至少一种共价结合的生物活性分子，优选根据本发明的支架。
一个实施方式是本发明的方法，其中至少一种生物活性分子是本发明前述方面和实施方式的糖苷和皂苷中的任一种；和/或其中至少一种生物活性分子通过根据本发明前述方面和实施方式中任一项的连接子偶联至支架；和/或其中根据本发明前述实施方式和方面中任一项的皂苷通过共价键连接至支架；和/或其中皂苷通过本发明前述实施方式中任一项的可裂解键偶联至支架；和/或其中载体分子是或包括根据本发明前述实施方式和方面中任一项的有效载荷和效应分子中的任一个，和/或是或包括根据本发明前述方面和实施方式中任一项的配体和免疫球蛋白、单克隆抗体和/或任一结合结构域或其片段中的任何一种。通常，生物活性分子是SO1861、SA1641、GE1741、QS-21中的任一种。通常，载体分子包括或者是西妥昔单抗、曲妥珠单抗、OKT-9。通常，效应分子或有效载荷是BNA、蛋白质毒素、石竹素、皂草素、寡核苷酸。本发明的优选生物活性分子是来自皂皮树的皂苷级分，例如皂皮树的水溶性皂苷级分。
一个实施方式是根据本发明的支架或根据本发明的方法，特别是当至少一种生物活性分子是糖苷诸如本发明的皂苷时，尤其是当皂苷是SO1861、SA1641、GE1741和/或QS-21时，其中当任一所述效应分子与支架共价结合并且与哺乳动物细胞接触时，特别是肿瘤细胞，例如在人类主体中，或当所述效应分子在本发明的支架存在下与哺乳动物细胞接触时，特别是肿瘤细胞，例如在人类主体中，支架能够增加根据本发明的效应分子的(次级)内体逃逸和/或溶酶体逃逸。
作为效应分子的多肽(蛋白质分子)的示例是，例如，Cas9；毒素(例如皂草素、石竹素、白树胶素、(去)布加宁、农杆菌素、蓖麻毒素(毒素A链)；商陆抗病毒蛋白、凋亡素、白喉毒素、假单胞菌外毒素)、代谢酶(例如精氨琥珀酸裂解酶、精氨琥珀酸合成酶)、凝血级联酶，修复酶；细胞信号转导酶；细胞周期调节因子；基因调节因子(转录因子诸如NF-κB或基因阻遏物如蛋氨酸阻遏物)。
作为多核苷酸的效应分子可以是例如包括编码信息的多核苷酸，诸如编码蛋白质的基因或开放阅读框。它还可以包括调节信息，例如催化剂或调节元素结合区，或编码微RNA的序列。这种多核苷酸可以包括天然和人工核酸。人工核酸包括，例如肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)，以及乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。这些核酸中的每一个都通过分子骨架的变化与天然存在的DNA或RNA区分开来。作为效应分子的核苷酸的示例是例如DNA：单链DNA(例如腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的DNA)；线性双链DNA(例如凝血因子IX基因)；环状双链DNA(例如质粒)；RNA：mRNA(例如TAL效应分子核酸酶)、tRNA、rRNA、siRNA、miRNA、反义RNA。
本发明中的毒素是能够杀死细胞的药物活性物质。优选地，靶向毒素是仅或至少主要对靶细胞有毒但对脱靶细胞无毒的毒素。
可用于本发明的效应分子优选依赖次级内体逃逸来发挥其效果。一些效应物，例如假单胞菌外毒素，在“次级内体阶段”之前被改道到其他细胞器，因此通常不会受益于根据本发明的支架。然而，这种毒素可适用于本发明，例如，通过删除负责改道的信号肽。特别是毒性很强并且只需要一个分子就可以逃逸内体以杀死细胞的毒素，可被修饰为不太强力。如果至少2个，更优选至少5个，更优选至少10个，更优选至少20个，更优选至少50个，最优选至少100个毒素分子逃逸内体，则优选使用杀死细胞的毒素。进一步优选功能化支架，即包括共价结合的效应分子和/或配体和/或单克隆抗体等的本发明的支架，用于将支架靶向靶细胞诸如肿瘤细胞或自身免疫细胞，对于与支架共价结合的每个效应分子，包括至少2:1、更优选至少5:1、更优选至少10:1、更优选至少20:1、最优选至少50:1的糖苷分子的比率。特别是在包括组装的聚合结构的功能化支架中，其中糖苷分子和效应分子附接到所述组装内的不同聚合结构上，相对于在这种组装中的效应分子，优选具有至少10:1，更优选至少20:1，更优选至少50:1，更优选至少100:1，最优选至少200:1的糖苷分子的比率。此外，为了减少脱靶毒性，细胞膜不可渗透性小分子毒素是优于细胞膜可渗透性毒素的优选效应分子。
本发明进一步提供了一种功能化支架，其包括至少一种根据本发明的支架，其偶联至a)至少一种效应分子，b)至少一种配体，c)至少一种效应分子和另外至少一种配体(图10至图12、图54)，d)至少一种效应分子，其自身带有至少一种配体(图53)，或e)至少一种配体，其自身带有至少一种效应分子。a)至e)中的这种偶联可通过可裂解(不稳定)或稳定(不可裂解)键实现。优选地，a)至e)中的偶联经由点击化学键独立发生。优选地，功能化支架能够增强效应物的内体逃逸。一个实施方式是本发明的支架，其中支架是根据本发明的功能化支架，其中所述至少一种效应分子是药物活性物质，诸如毒素、药物、多肽和/或多核苷酸。一个实施方式是本发明的功能化支架，其中效应分子是毒素或编码蛋白质的多核苷酸。
本发明中使用的术语“配体”具有其一般含义，优选地是指能够结合靶细胞的细胞表面上的另一分子或结构的分子或结构，其中所述细胞表面上的分子或结构可以是内吞并且优选在脱靶细胞上不存在或不那么突出。优选地，细胞表面上的所述分子或结构被组成性内吞。更优选地，本发明中的配体在与所述分子或结构结合后在靶细胞的细胞表面诱导所述分子或结构的内吞作用。例如，存在于多种癌细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)就是这种情况。组成性内吞的靶细胞细胞表面上的分子或结构的示例是例如克劳丁-1或主要组织相容性复合体II类糖蛋白。配体可以是例如抗体、生长因子或细胞因子。在载体分子中将毒素与配体结合是产生靶向毒素的一种可能性。仅在靶细胞中有毒的毒素，因为它仅干扰靶细胞中发生的过程，也可以被视为一种靶向毒素(因为在脱靶细胞中，它不能发挥其毒性作用，例如凋亡素)。优选地，靶向毒素是与配体或例如单克隆抗体组合的毒素，以便在靶细胞中而不是在脱靶细胞中有活性(因为它只与靶细胞结合并被其内吞)。在包括载体分子的功能化支架中，所述载体分子包括配体和效应分子，配体或单克隆抗体将效应分子和支架引导至靶细胞。内化后，至少一种糖苷，优选皂苷，介导效应分子的内体逃逸。皂苷通常为表A1和方案I中列出的皂苷，优选皂苷为SO1861和/或QS-21，和/或SA1641和/或GE1741。
不提供与支架共价连接的载体分子的本发明的支架，诸如效应分子和/或细胞靶向配体或抗体，即非功能化支架，所提供的支架可提供给例如，药物制造商，其将负责将单独的效应分子或效应分子与配体，或抗体与支架的偶联。如果需要，药物制造商可添加可裂解单元以从支架和/或配体、抗体，例如通过在效应分子和配体和/或效应分子之间插入二硫键并点击位置，以释放效应分子。本发明还提供了支架的(预)功能化版本，其中该功能化支架已经带有效应分子，例如一种杀伤肿瘤细胞的毒素(图54)。与内体效应分子释放相关的根据本发明的支架的活性优选已经包括在支架中。功能化支架可以提供给制药工业，例如用于现有和未来治疗性抗体的进一步研发，以及抗体的任何供应商或所有者以功能化靶向抗体。功能化支架也可用于生物技术公司或用于研究。
对于本发明的支架，在载体分子中包括与支架共价结合的效应分子，并且在载体分子中包括与支架共价结合的细胞靶向部分，诸如免疫球蛋白，诸如在表A2至表A4中所列的，发明人现在首次提供了具有共价结合糖苷、效应分子和单克隆抗体的缀合物，以及具有共价结合糖苷和效应分子的缀合物，以及具有共价结合糖苷和细胞靶向分子诸如配体或单克隆抗体(片段、结构域)的缀合物，用于在靶向患病细胞诸如肿瘤细胞内靶向递送效应分子。尽管可能以系统方式向有需要的患者给药(优选定点、局部给药)，但本发明的支架在承载和暴露配体或抗体的结合配偶体的靶细胞内特异性地发挥其细胞内活性，当为支架提供这样一种配体或抗体时，该配体或抗体优先和特异性地结合到所需的靶细胞上。以这种方式，如果例如效应分子还提供有相同或不同的靶细胞特异性配体或抗体，特异性用于结合存在于相同靶细胞(诸如靶肿瘤细胞或靶自身免疫细胞)上的相同或不同细胞表面分子，效应分子和与配体或抗体结合的糖苷被定向并理想地积累在相同靶向(患病)细胞的相同的(次级)内体、溶酶体中，其中效应分子的细胞杀伤效果是预期的。
新的(功能化)支架具有许多优点：
1)使用功能化支架，即包括共价结合的效应分子和配体或抗体的本发明的支架，产生单成分系统，即效应分子和内体逃逸增强剂，即至少一种糖苷，是由于细胞靶向配体或抗体的存在，优选单克隆抗体诸如表A2-A4中的任何一种抗体，以预定比例同时递送至内体。
2)至少一个糖苷分子现在也通过联合使用效应分子的靶向配体或单克隆抗体而靶向；因此，糖苷不会分布在整个身体中，而是被细胞随机摄取，这有助于减少可能的副作用并扩大治疗窗口。
3)每个效应分子的糖苷分子数量可精确定义，因此可以减少到所需的最小值；可避免多余糖苷分子的副作用。每个效应分子的限定数量的糖苷分子也有助于特定药物的上市许可。
4)本发明允许提供与任何可用的配体和/或(单克隆)抗体(或其至少一个结合片段和/或-结构域)一起使用的预制效应分子负载支架(功能化支架)，这使得本发明最适合平台研发。
5)如果支架或功能化支架附接到载体分子，载体分子也可能带有配体或抗体和/或效应分子。在这种情况下，载体分子被认为是一个连接子。
本发明的另一种应用是例如基因治疗。生物大分子例如多核苷酸的有效细胞内递送目前仍然是主要障碍。与传统的非特异性DNA转染系统相反，本发明不限于DNA并且对靶细胞具有特异性。已知的病毒系统对靶细胞是有效且特异性的，然而，它们仅适用于DNA。此外，它们具有免疫和炎症反应的风险，具有潜在的致癌活性，并且在每个个案中都需要复杂而昂贵的准备程序。此处介绍的技术的新颖性基于其基础性、灵活性和易用性。
一个实施方式是本发明的支架，其中支架是功能化支架，其中支架包括载体分子，载体分子包括至少一种配体或抗体，所述至少一种配体或抗体能够特异性结合靶细胞特异性表面分子或结构，其中优选地，功能化支架在结合后与表面分子一起被内吞。优选地，所述靶细胞是患病细胞或疾病相关细胞，优选肿瘤细胞、肿瘤相关细胞(例如肿瘤血管细胞)、免疫细胞(例如T调节细胞)或具有单基因缺陷的细胞。术语“靶细胞特异性表面分子”是指该分子优选在靶细胞中表达并且在较小程度上在非靶细胞中表达，无论是定性还是定量。这种靶细胞特异性表面分子的示例是受体EGFR，其在肿瘤细胞上上调但也在例如皮肤中的成纤维细胞和HER2上表达(以较低水平)，其在乳腺癌细胞中过度表达。然而，许多靶细胞特异性表面分子功能片段和结构域提供了本领域已知的优势，并且技术人员非常有能力为特定目的选择靶细胞特异性表面分子，即区分特定疾病或应用的靶细胞与非靶细胞。对于肿瘤细胞特异性受体结合抗体的示例，还参见表A2、表A3和表A4，并且还参见上文描述的关于适合由本发明的支架包括的载体分子靶向的肿瘤细胞特异性受体的实施方式，例如单克隆抗体。如在本文中所使用的，“单基因缺陷”具有其通常的含义，即在身体的几乎所有细胞中发生的单个基因的修饰。突变可能存在于一条或两条染色体上(从父母各自继承的一条染色体)。虽然相对罕见，但单基因缺陷影响着全世界数百万人。科学家目前估计，已知有超过10,000种人类疾病是单基因疾病。迄今为止已知的单基因疾病的非限制性示例是：镰状细胞病、囊性纤维化、多囊肾病和泰-萨克斯病。
一个实施方式是本发明的支架，其中支架是根据本发明的功能化支架，其中支架包括与其共价结合并包括配体和/或抗体的载体分子，至少一种配体是抗体或其衍生物或片段(例如VHH或scFv)、细胞因子、生长因子或抗体样分子，诸如适体或设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。DARPin是基因工程抗体模拟蛋白，通常表现出高度特异性和高亲和力的靶蛋白结合。它们源自天然锚蛋白，负责多种细胞功能。它们构成了一类新的强效、特异性和多功能小蛋白(通常为14至18kDa)疗法，并在各种研究、诊断和治疗应用中用作研究工具。迄今为止已知的抗体或其衍生物的其他非限制性示例是：(i)Fab'或Fab片段，由可变轻结构域、可变重结构域、恒定轻结构域和恒定重结构域1组成的单价片段，或如WO2007059782中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，二价片段包括通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段；(iii)Fd片段主要由可变重结构域和恒定重结构域组成；以及(iv)基本上由抗体单臂的可变轻结构域和可变重结构域组成的Fv片段。此外，虽然Fv片段的两个结构域，可变轻结构域和可变重结构域，由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成连接子连接起来，使它们能够制成单个蛋白质链，其中可变轻区和可变重区配对形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv))。
优选地，通过糖苷分子(例如皂苷)增强效应的效应分子在被内吞时与支架和/或配体或抗体分离。这可以通过断裂的可裂解键来实现，例如，在酸性条件下、还原条件下、酶促条件下或光诱导条件下。一个实施方式是本发明的支架，因此，该支架是根据本发明的功能化支架，其中所述至少一种效应分子经由可裂解键结合至所述支架和/或所述至少一种配体或抗体，其中优选地，所述可裂解键在酸性条件下、还原条件下、酶促条件下或光诱导条件下经受裂解。优选地，可裂解键是亚胺、腙、肟、1,3-二氧戊环、二硫键或酯，更优选二硫键或腙键。
一个实施方式是本发明的支架，其中支架是根据本发明的功能化支架，其中所述至少一种效应分子经由稳定键例如通过酰胺偶联或胺形成与所述支架和/或所述至少一种配体或抗体结合。这例如，通过支架的聚合结构或寡聚结构的氨基和效应分子或配体上的活化羧酸基团，经由碳二亚胺介导的酰胺键形成来实现。
一个实施方式是根据本发明的支架或功能化支架，进一步包括载体，诸如纳米颗粒、脂质体、胶束、胶体或包括胆固醇和/或磷脂的颗粒状结构。
如前所述，包括在根据本发明的支架内的至少一个糖苷分子增加了本发明中定义的至少当前和新的效应分子的功效。由于在不降低功效的情况下降低效应分子的剂量，将减少潜在的副作用。因此，本发明提供了根据本发明的支架或根据本发明的功能化支架用于医学或用作药物。因此，本发明的一个方面涉及根据本发明的支架，该支架至少包括本发明的效应分子和/或根据本发明的抗体，优选效应分子和抗体两者，用作药物。还提供了根据本发明的支架或根据本发明的功能化支架用于制造药物的用途。尤其是癌症药物，特别是经典的化疗药物，因其副作用而臭名昭著。由于药物活性物质和糖苷分子在时间和地点上的靶向和同步，根据本发明的支架或功能化支架对于用作药物尤其有价值，特别是用于治疗癌症的方法中。本发明因此提供根据本发明的支架或根据本发明的功能化支架用于治疗癌症的方法中。本发明还提供了根据本发明的支架或根据本发明的功能化支架，用于治疗获得性或遗传性病症，特别是单基因缺陷病症的方法中。因此，本发明的一个方面涉及根据本发明的支架，该支架包括共价结合的载体分子，该载体分子包括至少本发明的效应分子和/或根据本发明的抗体，优选地效应分子和抗体两者，用于治疗癌症或自身免疫疾病的方法中。
本发明的一个方面涉及本发明的支架，包括用于靶向肿瘤细胞的效应分子和/或抗体，用于治疗或预防癌症，其中支架给药于有需要的人类受试者。
本发明的一个方面涉及对患有癌症或有患癌症风险并且需要所述治疗的人类受试者的治疗，治疗包括向人类受试者给药有效剂量的药物组合物的步骤，药物组合物包括本发明的支架或包括本发明的功能化支架，这种支架包括效应部分与皂苷或单克隆抗体与皂苷，或效应分子和单克隆抗体两者与皂苷。本发明的一个方面涉及用作药物的本发明的支架。本发明的一个方面涉及本发明的支架，用于在有需要的人类受试者中治疗或预防癌症或自身免疫疾病的方法中。本发明的一个方面涉及本发明的支架或功能化支架的使用或包括所述支架或功能化支架的药物组合物，用于制造用于抗癌疗法或抗自身免疫疾病疗法的药物。支架或功能化支架优选至少包括载体分子，该载体分子包括效应分子和/或抗体，优选抗体和效应分子两者。
在医学上的另一个应用是在产生这些酶的量不足或功能不足的靶细胞中替代细胞内酶。由此产生的疾病可能是遗传性的或获得性的。在大多数情况下，只能对症治疗，而对于一些罕见疾病，治疗选择不足会导致相关患者的寿命缩短。这种疾病的一个例子是苯丙酮尿症，这是一种先天性的代谢错误，导致氨基酸苯丙氨酸的代谢降低。该疾病的特征在于肝酶苯丙氨酸羟化酶的基因突变。苯丙酮尿症目前无法治愈。发病率约为1:10,000，已知的最高发病率在土耳其为1:2,600。具有苯丙氨酸羟化酶或编码苯丙氨酸羟化酶的多核苷酸的功能化支架可用于通过使用合适的配体靶向肝细胞并替代肝细胞中的缺陷酶；与包括苯丙氨酸羟化酶或编码苯丙氨酸羟化酶的多核苷酸的载体分子共价结合的支架可用于通过使用合适的配体靶向肝细胞并替代肝细胞中的缺陷酶。这是使用包括载体分子或根据本发明的功能化的支架的支架用于替代治疗或基因治疗的一个示例。在一个优选的实施方式中，提供了根据本发明的支架或包括载体分子的本发明的支架或根据本发明的功能化支架，用于基因治疗或替代治疗的方法中。
本发明还可用于生物技术过程。一个可能的应用是真核生物细胞内开关的生物分子工程。转录开关靶向mRNA聚合水平的基因表达，转化开关靶向将mRNA信号转化为蛋白质的过程，而转化后开关控制蛋白质如何相互作用以减弱或中继信号。优化后，这些细胞开关可根据研发人员指定的诱因“打开”和“关闭”细胞功能。这些诱因包括小分子、激素和药物。要应用开关，诱因必须进入靶细胞。因此，在目前的应用中，只能使用既不特异于靶细胞也不对所选开关具有高特异性的小的、可扩散的分子。功能化支架或包括具有更复杂且因此更特异性的非扩散效应分子的载体分子的支架可用于靶向特定开关，并且合适配体的使用可限制对靶细胞的效果。一个实施方式是包括载体分子的本发明的支架或根据本发明的功能化的支架，用于增强效应分子的效果，优选在体外。优选地，该用途用于增强在体外的转录开关的效果。
另一个应用是本发明在基础研究中的应用。对于细胞过程的功能分析，通常需要将蛋白质带入细胞，这种方法称为蛋白质转染。例如，为了研究鸡病毒蛋白凋亡蛋白导致真核细胞凋亡的分子机制，需要将纯化的蛋白质带入靶细胞。然而，现有的蛋白质转染试剂盒的特点是功效低、缺乏对靶细胞的特异性和高毒性，因此不能用于许多应用，特别是当代谢途径是研究的一部分时。支架包括本发明的共价连接的载体分子或功能化，其中任一者具有凋亡素，并且使用合适的配体，可用于进行此类研究。一个实施方式是本发明的支架，支架包括根据本发明的载体分子或根据本发明的功能化支架，用于多肽转染，优选在体外。还提供了支架、包括载体分子的根据本发明的支架或根据本发明的功能化支架用于多核苷酸转染，优选在体外。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括给药包括根据本发明的支架的药物，或优选地，包括根据本发明的功能化支架，或优选地包括，包括载体分子的本发明的支架，载体分子包括效应分子或单克隆抗体，优选包括根据本发明的单克隆抗体和效应分子两者，用于有需要的患者，优选向有需要的患者给药有效剂量的所述药物，优选人类癌症患者。
支架或功能化支架代表一种平台技术，其可以
·为当前和新的ADC提供更宽的治疗窗口，其中ADC可以包括有效载荷，诸如毒素、蛋白质毒素、寡核苷酸、BNA；
·提供高效的大分子细胞溶质递送；
·促进细胞研究和生物技术应用；
·对多种疾病具有治疗潜力，诸如癌症和自身免疫性疾病、类风湿性关节炎；
·用于诱导细胞破坏(例如癌细胞)；
·通过降低患病细胞所需的治疗水平来减少不必要的副作用；
·减少对效应分子产生免疫反应的风险(因为需要更少的效应分子，但不希望受任何理论束缚，可能也因为抗原通过内体呈递到MHC分子上的途径被破坏)；
·开启高效操纵基因的可能性；
·通过提高功效复活失败的候选药物，特别是ADC；
·由生物相容性和可降解和/或可排泄的材料制成；
·依赖于由内体pH值触发的温和且无害的效应分子释放。
使用任何类型的配体(例如抗体、其片段和结构域，或适体)和效应分子的可能性确保了灵活性。可以使用点击化学的复杂实现来提供用户友好的界面，以将该技术应用于自己的配体和效应分子。本发明的平台技术提供了多种可能性，诸如作为独立产物的可点击支架的制备，这允许用户根据自己的判断简单地偶联其任何效应分子和/或配体(图53)，或功能化支架或包括与其共价连接的载体分子的支架的制备，其中基础支架已经与效应分子(诸如表A5的蛋白质毒素)和/或配体诸如单克隆抗体(如表A2、表A3、表A4的抗体)偶联，这允许用户偶联其配体以将效应分子引导至所需的靶细胞(图54)。包括共价偶联载体分子的可能支架或可能的功能化支架是连接至核糖体失活蛋白的支架，例如石竹素，皂草素。这种具有高靶向细胞杀伤潜力的有毒酶可用于点击任何未来的抗体或市场上已有的专为识别肿瘤细胞而设计的抗体，诸如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、吉妥珠单抗、OKT-9或奥比妥珠单抗(下一代ADC技术)，或前述实施方式和表A2至表A4中列出的任何抗体。作为核酸效应分子，微RNA(miRNA，多核苷酸)或miRNA抑制剂，或LNA或BNA可用于例如，创建功能化支架，以实现高效和低剂量的细胞溶质递送。miRNA或miRNA抑制剂作为新型疗法具有很高的潜力，能够改变细胞内的基因程序，从而改变细胞功能。
本发明进一步提供了一种用于制备支架、优选地根据本发明的支架的方法，该支架包括至少一个糖苷分子，该糖苷分子能够改善效应分子的效果，并与聚合结构或寡聚结构结合，该方法包括：提供聚合结构或寡聚结构；以及将至少一个糖苷分子偶联到所述聚合结构或寡聚结构上。优选地，至少一个糖苷分子增加所述效应分子的内体逃逸。优选地，糖苷是根据本发明的表A1和方案I中列出的任何皂苷。特别地，由此获得的支架增加了所述效应分子的内体逃逸。优选地，至少一个糖苷分子是双糖链三萜，更优选双糖链三萜皂苷，更优选属于12,13-脱氢齐墩果烷类型在23位具有醛官能团的双糖链三萜皂苷，更优选可从霞草属物种或皂荚属物种分离的皂苷，最优选SA1641和/或SO1861，或它们的任何非对映异构体。优选地，至少一个糖苷分子经由可裂解键与聚合结构或寡聚结构偶联，其中优选地，所述可裂解键在酸性条件下、还原条件下、酶促条件下或光诱导条件下经受裂解，更优选地，其中可裂解键是亚胺、腙、肟、1,3-二氧戊环、二硫键或酯，更优选二硫键或腙键。如果该键是可裂解键，则皂苷优选经由在23位的醛官能团或经由皂苷中的羧基之一，更优选经由醛官能团附接至支架。
一个实施方式是本发明的支架或与载体分子结合的根据本发明的支架或本发明的功能化支架，其中至少一个糖苷分子经由稳定键与聚合结构或寡聚结构结合。一个实施方式是本发明的支架或包括共价结合的载体分子的根据本发明的支架，其中至少一个糖苷分子是皂苷并且皂苷与支架之间的稳定键优选经由酰胺偶联或胺形成发生。这例如经由碳二亚胺介导的酰胺键形成来实现，该酰胺键由聚合结构或寡聚结构的氨基和皂苷的活化葡糖醛酸基团形成。满足稳定条件的化学键也可用于醛偶联，例如还原胺化后衍生的特定胺，需要伯氨基作为聚合结构或寡聚结构的官能团。如果键是稳定键，则皂苷优选经由皂苷的羧基之一附接到支架上。
优选地，支架进一步包括用于偶联至载体分子诸如效应分子和/或配体和/或单克隆抗体(其片段、结构域)，优选偶联至效应分子和免疫球蛋白两者的点击化学基团。免疫球蛋白优选是表A2、表A3、表A4的单克隆抗体。单克隆抗体和效应分子优选一起形成根据本发明的ADC，诸如表A4的ADC。优选地，点击化学基团是四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或这些基团的环状衍生物，诸如环辛炔(例如氮杂-二苯并环辛炔、二氟环辛炔、双环[6.1.0]非-4-炔、或二苯并环辛炔)。
一个实施方式是根据本发明的用于制备支架、优选地本发明的支架的方法，其中糖苷分子的数量是限定的数量或限定的范围。优选地，聚合结构或寡聚结构包括线性、支化或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元、树枝化聚合物、树枝化寡聚物或这些结构的组装体，无论是纯粹的还是混合的，其中组装体可以通过共价交联或非共价吸引建立，并且可以形成水凝胶或纳米凝胶，并且其中，优选地，聚合物是聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚氨基酸或DNA聚合物的衍生物，或者其中寡聚物或聚合物是葡聚糖、乳酸、核酸或肽核酸的衍生物。在优选的实施方式中，效应分子是药物活性物质，诸如毒素、药物、多肽和/或多核苷酸。
还提供了一种用于制备包括载体分子的根据本发明的支架或本发明的功能化支架的方法，该方法包括：提供包括多种糖苷分子和聚合结构或寡聚结构的支架，优选根据本发明的支架或可通过根据本发明的用于制备支架的方法获得的支架；以及偶联a)至少一种效应分子，b)至少一种配体，诸如单克隆抗体，c)至少一种效应分子和另外至少一种配体，优选靶向肿瘤细胞受体的单克隆抗体，d)至少一种效应物自身带有至少一种配体，诸如用于结合肿瘤细胞受体的单克隆抗体，或e)至少一种配体，例如靶向肿瘤细胞的单克隆抗体，其自身带有至少一种效应物，至支架。优选地，a)-e)中的偶联经由点击化学键独立发生。一个实施方式是本发明的方法，其中在c)中，支架与至少一种效应分子和另外至少一种配体偶联，优选靶向肿瘤细胞受体的单克隆抗体，其中效应分子和配体(例如单克隆抗体)都与本身与支架结合的连接子结合。技术人员能够基于本公开和公知常识设计这种三功能连接子，诸如方案II和结构B的三功能连接子(也参见图16)。这种三功能连接子可以表现出例如马来酰亚胺基团，其可以用于与具有硫醇基团的靶向配体缀合以进行硫醇-烯反应。此外，三功能连接子可以表现出二苯并环辛炔(DBCO)基团，以与带有叠氮基的皂苷进行所谓的菌株促进炔-叠氮环加成反应(SPAAC，点击化学)。最后，三功能连接子可以获得第三个官能团，诸如反式环辛烯(TCO)基团，以与带有四嗪(Tz)的效应分子进行所谓的逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应。一个实施方式是本发明的方法，其中所述至少一种效应分子是药学活性物质，诸如毒素、药物、多肽或多核苷酸。一个实施方式是本发明的方法，其中至少一种效应分子是毒素或多核苷酸。优选地，所述至少一种配体，诸如用于结合肿瘤细胞受体的单克隆抗体，能够特异性结合能够进行内吞作用的靶细胞特异性表面分子或结构，优选抗体或其片段，细胞因子、生长因子、适体或设计的锚蛋白重复蛋白。优选地，所述靶细胞是患病细胞或疾病相关细胞，优选肿瘤细胞、肿瘤相关细胞(例如肿瘤血管细胞)、免疫细胞(例如T调节细胞)或具有单基因缺陷的细胞。一个实施方式是根据本发明的方法，所述方法用于制备功能化支架或包括载体分子的根据本发明的支架，其中所述至少一种效应分子与支架和/或所述至少一种配体经由可裂解键偶联，其中优选地，所述可裂解键在酸性条件下、还原条件下、酶促条件下或光诱导条件下经受裂解。一个实施方式是根据本发明的用于制备支架或功能化支架的方法，该方法进一步包括：将所述支架或功能化支架偶联至载体，其中所述载体优选是一种纳米颗粒、脂质体、胶束、胶体或包括胆固醇和/或磷脂的颗粒状结构。
本发明提供了药物组合物，其包括根据本发明的支架或根据本发明的功能化支架或包括共价偶联的载体分子的根据本发明的支架，以及任选的药学上可接受的载体。这种药物组合物用于治疗患者，特别是用于治疗癌症或获得性或遗传性病症，特别是单基因缺陷病症。
本发明的另一方面提供了根据本发明的包括化合物或化合物的组合的药物组合物，以及生理学上可接受的载体。“药物组合物”是指形式上适合给药于哺乳动物，优选人类的组合物。优选地，药物组合物含有足够量的以适当药物形式存在的根据本发明的化合物以对人类发挥治疗效果。
关于适合给药的形式的考虑是本领域已知的并且包括毒性效果、溶解度、给药途径和维持活性。例如，注射到血液中的药物组合物应该是可溶的。
合适的剂型部分取决于使用或进入途径，例如透皮或注射。无论靶细胞是否存在于多细胞宿主中，这种剂型都应允许化合物到达靶细胞。其他因素是本领域已知的，并且包括诸如阻碍化合物或组合物发挥其效果的毒性和剂型的考虑。
一个实施方式是本发明的支架，其中支架包括限定数量的糖苷或限定范围的糖苷。一个实施方式是本发明的支架，其中支架包括限定数量的糖苷或限定范围的糖苷，其中限定范围在1-30个糖苷之间，优选在1-20个之间，更优选在1-10个之间，更优选在1-6个之间，更优选在2-6个之间，更优选在2-5个之间，更优选在3-5个之间，更优选在3-4个糖苷之间。
一个实施方式是本发明的支架，其中支架包括共价结合的载体分子，该载体分子包括细胞靶向结合位点，并且是或包括例如用于结合靶细胞上的细胞表面受体的(单克隆)抗体。一个实施方式是本发明的支架，其中支架包括共价结合的载体分子，该载体分子包括细胞靶向结合位点，并且是或包括例如用于结合靶细胞上的细胞表面受体的(单克隆)抗体，其中靶细胞是患病细胞或疾病相关细胞，优选肿瘤细胞或肿瘤相关细胞(例如肿瘤血管细胞)，或免疫细胞(例如T调节细胞)，或自身免疫细胞。
一个实施方式是本发明的支架，其中生物活性分子是糖苷，其中所述糖苷能够增加共价结合到支架的载体分子所包括的效应分子的内体逃逸。
一个实施方式是本发明的支架，其中支架是药物组合物的一部分，除支架外，药物组合物还包括至少一种其他活性药物成分，诸如其他免疫球蛋白。
一个实施方式是本发明的支架或根据本发明的药物组合物，用于治疗癌症或自身免疫疾病的方法中。
一个实施方式是本发明的支架，用于治疗癌症的方法中，该方法包括向有需要的患者给药本发明的支架，其中支架包括共价结合的载体分子，载体分子包括或由以下组成：本发明的效应分子和/或本发明的配体或细胞靶向抗体。
一个实施方式是本发明的支架，用于治疗癌症的方法中，该方法包括向有需要的患者给药根据本发明的药物组合物。
Figure BDA0003222052890000751
Figure BDA0003222052890000761
Figure BDA0003222052890000771
Figure BDA0003222052890000781
表A2-之前在人类临床环境中研究过，随后从进一步的临床研究中撤回的ADC
Figure BDA0003222052890000782
Figure BDA0003222052890000791
Figure BDA0003222052890000801
Figure BDA0003222052890000811
Figure BDA0003222052890000821
Figure BDA0003222052890000831
Figure BDA0003222052890000841
Figure BDA0003222052890000851
Figure BDA0003222052890000861
表格3-达到III期临床研发的ADC
Figure BDA0003222052890000862
Figure BDA0003222052890000871
Figure BDA0003222052890000872
Figure BDA0003222052890000881
表A5：来自植物的RIP*
Figure BDA0003222052890000882
Figure BDA0003222052890000891
Figure BDA0003222052890000901
Figure BDA0003222052890000911
Figure BDA0003222052890000921
Figure BDA0003222052890000931
Figure BDA0003222052890000941
Figure BDA0003222052890000951
Figure BDA0003222052890000961
通过以下实施例进一步说明本发明，不应将其解释为以任何方式限制本发明。
实施例
实施例A-用本发明的缀合物结合ADC治疗荷瘤哺乳动物导致存活和肿瘤消退
将人类A431肿瘤细胞悬浮液皮下注射给雌性Balb/c裸鼠。在小鼠的皮肤下，在异种移植动物肿瘤模型中形成了人类表皮癌。注射肿瘤细胞后，允许异种移植肿瘤发展到大约170-180mm3的大小。A431肿瘤细胞具有以下特点：EGFR高表达、CD71中表达、HER2低表达。
在表A中，呈现了对照小鼠和荷瘤小鼠的治疗结果。以针对人Her2/neu、人EGFR或人CD71的指定抗体治疗荷瘤小鼠，这些抗体是异种移植肿瘤上的细胞表面受体。西妥昔单抗与皂苷SO1861共价缀合。SO1861首先配备了连接子EMCH(N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼)，其中EMCH是马来酰亚胺-酰肼交联剂，用于将巯基(抗体的还原半胱氨酸)与羰基(醛或酮；此处为皂苷C-23位置醛的羰基)共价缀合。皂苷-EMCH与西妥昔单抗的还原半胱氨酸共价偶联，在EMCH和半胱氨酸侧链之间形成共价硫醚键。ADC曲妥珠单抗-皂草素(共价缀合物)和抗CD71 mAb(OKT-9，IgG)-皂草素(共价缀合物)在小鼠中测试了它们的肿瘤攻击功效，ADC治疗开始后的时间测量为肿瘤体积。ADC的剂量在肿瘤模型中是次优的。换言之，根据之前的实验，确定在ADC的次优剂量下，不会观察到肿瘤消退或肿瘤生长停滞。
Figure BDA0003222052890000962
Figure BDA0003222052890000971
这些结果表明，当考虑单独用ADC治疗荷瘤小鼠时，以无效的剂量的ADC联合治疗(肿瘤生长，小鼠的死亡没有被阻止(安乐死))，本发明的缀合物由靶向肿瘤细胞特异性受体的抗体共价缀合皂苷组成，即SO1861，给药于患有癌症的小鼠的共价缀合物，该共价缀合物以非有效剂量单独给药时(肿瘤生长，小鼠的死亡没有被阻止(安乐死))，提供了有效且有功效的治疗方案，表现为肿瘤消退并延长治疗动物的存活期(超过实验持续时间)。ADC的次优剂量与本发明的共价结合的包括皂苷的缀合物组合，当单独给药时没有抗肿瘤活性，因此为癌症患者提供了有效的治疗选择，其中相对低剂量的ADC是有功效的。较低剂量的ADC有望降低不良事件的风险，甚至根本没有副作用。此外，当考虑ADC的功效时，本发明的包括皂苷缀合物的刺激效果表明，先前已被证明在肿瘤患者治疗方面缺乏功效的ADC可能会重新获得关注和价值，因为ADC功效在联合治疗设置中得到提高，如当前示例所示。参考表A2和表A3，总结了以前在人类临床环境中研究过的ADC，但后来针对一些从进一步临床研究中撤回的ADC进行了总结。特别是由于观察到缺乏功效和/或由于不可接受的不良事件的发生而终止临床研发的ADC，是当与本发明的共价结合的包括皂苷的缀合物组合时可以获得对癌症患者的新价值的ADC，诸如测试的西妥昔单抗皂苷。
实施例B–包括QS-21的皂皮树的皂苷混合物，具有内体/溶酶体逃逸增强活性
方案I显示了一系列QS-21皂苷的常见分子结构(部分改编自：Conrado Pedebos、Laércio Pol-Fachin、Ramon Pons、Cilaine V.Teixeira Hugo Verli，Atomic Model andMicelle Dynamics of QS-21Saponin,Molecules 2014,19,3744-3760)。从皂皮树(Sigma-Aldrich，产品编号S4521；Roth，产品编号6857；InvivoGen，产品“Quil-A”)获得的水溶性皂苷的混合物可以应用于本发明的内体/溶酶体逃逸增强缀合物、组合物、组合，基于混合物中存在的至少一种单独皂苷的内体/溶酶体逃逸增强特性，例如QS-21，或基于混合物中包括的两种或更多种皂苷的组合，诸如QS-21和QS-7。
本发明人证明，在基于细胞的生物测定中用哺乳动物肿瘤细胞进行测试时，2.5微克/毫升剂量的皂皮树中皂苷混合物能够增强石竹素的内体逃逸。暴露于细胞的效应部分是与配体EGF共价偶联的石竹素：EGF-石竹素。测试的细胞是肿瘤细胞系HeLa的游离皂苷，以及A431、MDA-MB-468、CaSki和A2058用于测试与西妥昔单抗共价偶联时的皂苷。
实施例1
设计并制备了具有特定化学端基(DBCO、TCO)的三功能连接子支架，用于与一个臂上的SO1861分子和另一臂上的反义HSP27BNA寡核苷酸(靶向并诱导癌细胞中肿瘤靶标hsp27 mRNA的降解)缀合(不稳定，(L)缀合)以制备SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA(图16)。SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA与其第三臂(马来酰亚胺)缀合至半胱氨酸残基(Cys)抗EGFR抗体，西妥昔单抗(西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)4)。
这种包括缀合物的支架在A431异种移植“裸”小鼠肿瘤模型中测试了EGFR介导的肿瘤靶向基因沉默活性。在第12天开始给药，当肿瘤大小达到约170mm3时，并且在第一次给药后72小时收集肿瘤样品，并且分析与细胞对照mRNA表达(参考基因)相比的HSP27基因表达。这表明，与单次给药西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8或西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4单一疗法(图1)相比，1次25mg/kg西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7导致肿瘤中HSP27基因表达减少40％。与载体对照肿瘤相比，观察到基因沉默减少了25％。这表明并使得缀合的SO1861可以在体内有效地诱导治疗性寡核苷酸在肿瘤中的靶向递送。
为了进一步加强这一点，如在图2中所示，在体外测试了西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA DAR4)4在EGFR表达(A431)中增强的HSP27基因沉默。单独与西妥昔单抗-(Lys-L-HSP27BNA)4或西妥昔单抗-(Cys-L-SO1861)3,8相比(图2)，西妥昔单抗-Cys-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27BNA)3,7在A431细胞中有效诱导HSP27基因沉默。
实施例2
1靶标2-成分系统是mAb1-(树枝化基元(SO1861)n)n和mAb1-效应物的组合治疗，如在图11中所示，而2靶标2-成分系统是mAb1-(树枝化基元(SO1861)n)n+mAb2-效应物的组合，如在图12中所示。
树枝化基元(-L-SO1861)4经由半胱氨酸残基(Cys)与DAR3,9、西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9缀合，与抗EGFR抗体，西妥昔单抗缀合，并且在EGFR表达细胞(MDA-MB-468)中，测试了与抗EGFR抗体-蛋白质毒素缀合物(西妥昔单抗-皂草素)组合的增强细胞杀伤活性。西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9+10pM西妥昔单抗-皂草素在高EGFR表达细胞中有效诱导毒素介导的细胞杀伤，而这不是由西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9或西妥昔单抗(等效物)+10pM西妥昔单抗-皂草素或西妥昔单抗诱导的(图3的A)。在表达低水平EGFR(HeLa)的细胞中进行的类似实验显示，西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9(图3的C)没有活性，表明在缺乏足够EGFR受体表达的情况下，未达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)以诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。
接下来，树枝化基元(-L-SO1861)4经由半胱氨酸(Cys)与DAR4，曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4缀合，与抗HER2抗体，曲妥珠单抗缀合，并且在HER2表达细胞(SK-BR-3)中，测试了与抗HER2抗体-蛋白质毒素缀合物(曲妥珠单抗-皂草素)组合的增强细胞杀伤活性。曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4+50pM曲妥珠单抗-皂草素有效诱导毒素介导的细胞杀伤，而这不是由曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4或曲妥珠单抗(等效物)+50pM曲妥珠单抗-皂草素或曲妥珠单抗诱导的(图3的B)。在表达低水平HER2(JIMT-1)的细胞中进行的类似实验显示，曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4(图3的D)没有活性，表明在缺乏足够HER2受体表达的情况下，未达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)以诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。
接下来，缀合至抗体的赖氨酸的西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9或西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4(Lys＝树枝化基元(-L-SO1861)4在EGFR++/CD71+细胞(MDA-MB-468)中的2靶标2成分系统中测试与10pM CD71mab-皂草素的组合。这表明两种缀合物的细胞杀伤活性都有很强的增强，而这不是由西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9或西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4或西妥昔单抗(等效物)+10pM CD71mab-皂草素或西妥昔单抗(图4的A)诱导的。在表达较低水平EGFR(CaSKi、EGFR+/CD71+)的细胞中进行的类似实验显示，西妥昔单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)3,9或西妥昔单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4(图4的C)的活性降低，与高表达子中的活性(图4的A)相比，表明在EGFR受体表达水平较低的细胞中，有效的细胞内SO1861浓度较低，导致毒素介导的细胞杀伤活性降低。
使用曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4或曲妥珠单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,7与CD71mab-皂草素联合对HER2++/CD71+(SK-BR-3)细胞系进行了相同的实验，与对照相比显示出强烈的细胞杀伤活性(图4的B)。当曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4或曲妥珠单抗-Lys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,7在HER2+/-/CD71+(JIMT-1)上测试与10pM CD71mab-皂草素结合，未观察到细胞杀伤活性，表明在没有足够的HER2受体表达的情况下，没有达到有效的细胞内SO1861浓度(阈值)来诱导内体蛋白毒素逃逸和毒素介导的细胞杀伤。
接下来，测试了曲妥珠单抗-Cys-(树枝化基元(-L-SO1861)4)4,4+曲妥珠单抗-丹宁(T-DM1，抗体-小分子毒素缀合物)在HER2表达细胞(SK-BR-3)中增强的细胞杀伤活性。与单独的T-DM1或T-DM1+等效曲妥珠单抗相比，这种组合没有观察到增强的细胞杀伤，因为内体膜没有形成小分子到达细胞质的屏障。(图5)。
实施例3
材料和方法
树枝化基元(SO1861)4-BNA寡核苷酸合成(图17)
HSP27BNA寡聚二硫化物(1.1mg，0.187μmol)溶解在含有1.0mM TCEP(500μl)的20mM的NH4HCO3中，并将混合物振摇1分钟并在室温下静置。1小时后，使用截留分子量为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(14000×g，30min)。残留溶液用20mM的NH4HCO3和1.0mM的TCEP(500μL)稀释，所得混合物在上述相同条件下再次过滤。用20mM的NH4HCO3/乙腈(3:1,v/v,1.0mL)稀释残留溶液，并将所得混合物加入树枝化基元(SO1861)4-马来酰亚胺1(3.54mg,0.375μmol)(图17)。将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。10分钟后，将反应混合物进行制备型LC-MS.4A将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(1.25mg，85％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z):1896[M-8]8-,2167[M-7]7-
LC-MS r.t.(min):3.776B
结果
HSP27BNA寡核苷酸(反义BNA寡核苷酸靶向癌症靶标的mRNA转录物，热休克蛋白27(HSP27BNA))与树枝化基元(-L-SO1861)4(HSP27BNA-树枝化基元(-L-SO1861)4缀合，图17)并与A431癌细胞共同给药。作为读出，确定了A431细胞中HSP27 mRNA的基因沉默。这表明与单独的HSP27BNA相比，HSP27BNA-树枝化基元(-L-SO1861)4治疗导致HSP27基因沉默活性的提高(图6)。
实施例4
方法
SO1861释放测定
向树枝化基元(SO1861)4-Cbz(0.05mg)(图7的A)中加入50μL含有水/乙腈/TFA(1.00mL/1.00mL/4滴)的溶液。将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。随着时间的推移，使用UPLC-MS4跟踪SO1861的释放。
结果
SO1861分子在酸性条件下从树枝化基元(-L-SO1861)4(图7的A)中的释放效率已经确定(图7的A)。图7的B显示了树枝化基元(-L-SO1861)4本身(顶部)、30分钟后的反应混合物(中间)和1.5小时后的反应混合物(底部)的UPLC UV痕量(PDA)。图7的C显示了LRMS对观察到的m/z值的解释。以下m/z值与相应的UV r.t.(min)观察到：r.t.＝1.46,2282[M-4]4-(A,树枝化基元(-L-SO1861)4)；r.t.＝1.43,2427[M-3]3-(B，树枝化基元(-L-SO1861)3)；r.t.＝1.38,1812[M-3]3-(C,树枝化基元(-L-SO1861)2)；r.t.＝1.29,1797[M+2]2+(D，树枝化基元-L-SO1861)；r.t.＝1.22,1862[M-1]1-(E,SO1861)；r.t.＝1.05,1747/1769[M+1/M+23]1+(F，树枝化基元-)。
接下来，测试了树枝化基元(-L-SO1861)4对靶向毒素EGF石竹素在EGFR表达细胞(A431和HeLa)上的增强递送。这表明，树枝化基元(-L-SO1861)4+10pM EGF石竹素可以诱导增强的毒素介导的细胞杀伤，而“裸”树枝化基元(树枝化基元(NEM)4)或树枝化基元(-L-SO1861)4或树枝化基元(NEM)4+10pM EGF石竹素在这些浓度下没有表现出增强的细胞杀伤(图8的A、图8的B)。
实施例5
树枝化基元(-L-SO1861)n合成(图13，图14，图15)
材料和方法
缩写
DCM 二氯甲烷
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
EDCI.HCl 3-((乙基亚氨基)亚甲氨基)-N,N-二甲基丙烷-1-氯化铵
EMCH.TFA N-(ε-马来酰亚胺己酸)酰肼，三氟乙酸盐
min 分钟
r.t. 室温
TCEP 三(2-羧乙基)膦盐酸盐
Temp 温度
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
分析方法
LC-MS方法1,1
仪器：安捷伦1200Bin.泵：G1312A，脱气机；自动进样器，ColCom，DAD：安捷伦G1316A，210、220和220-320nm，PDA：210-320nm，MSD：安捷伦LC/MSD G6130B ESI，正/负100-1000；ELSD Alltech 3300气体流量1.5ml/min，气体温度：40℃；色谱柱：Waters XSelectTMCSH C18，30×2.1mm，3.5μm，温度：35℃，流速：1mL/min，梯度：t0＝5％A，t1.6min＝98％A，t3min＝98％A，后置时间：1.3分钟，洗脱液A：0.1％甲酸的乙腈溶液，洗脱液B：0.1％甲酸的水溶液。
LC-MS方法2,2
仪器：安捷伦1260Bin.泵：G7112B，多重进样器，色谱柱补偿器，DAD：安捷伦G7115A，210、220和220-320nm，PDA：210-320nm，MSD：安捷伦LC/MSD G6130B ESI，质量范围取决于产物的分子量：
A正/负100-1000
B正/负100-1400
ELSD Alltech 3300气体流量1.5毫升/分钟，气体温度：40℃；色谱柱：WatersXSelectTM C18，30×2.1mm，3.5μm，温度：40℃，流速：1mL/min，梯度：t0＝5％A，t1.6min＝98％A，t3min＝98％A，后置时间：1.3分钟，洗脱液A：0.1％甲酸的乙腈溶液，洗脱液B：0.1％甲酸的水溶液。
LC-MS方法3,3
仪器：Waters IClass；Bin.泵：UPIBSM，SM：UPISMFTN与SO；UPCMA,PDA:UPPDATC,210-320nm,SQD:ACQ-SQD2 ESI,正/负800-1500；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；色谱柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm温度：25℃，流速：0.6mL/min，梯度：t0＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3分钟，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液(pH＝9.5)。
LC-MS方法4,4
仪器：Waters IClass；Bin.泵：UPIBSM，SM：UPISMFTN与SO；UPCMA,PDA:UPPDATC,210-320nm,SQD:ACQ-SQD2 ESI,正/负1500-2500；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；色谱柱：Waters XSelectTM CSH C18，50×2.1mm，2.5μm温度：25℃，流速：0.6mL/min，梯度：t0＝15％A，t2.0min＝60％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3分钟，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液(pH＝9.5)。
LC-MS方法5,5
仪器：Waters IClass；Bin.泵：UPIBSM，SM：UPISMFTN与SO；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2 ESI，质量范围取决于产物的分子量：
A正/负1500-2500
B正/负2000-3000
ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；色谱柱：Acquity C18，50×2.1mm，1.7μm温度：60℃，流速：0.6mL/min，梯度：t0＝2％A，t5.0min＝50％A，t6.0min＝98％A，后置时间：1.0分钟，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液(pH＝9.5)。
制备方法
制备型MP-LC方法1,1
仪器类型：RevelerisTMprep MPLC；色谱柱：Waters XSelectTM CSH C18(145×25mm，10μ)；流量：40mL/min；柱温：室温；洗脱液A：10mM碳酸氢铵水溶液pH＝9.0；洗脱液B：99％乙腈+1％10mM碳酸氢铵水溶液；梯度：t0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B；检测UV：210、225、285nm。
制备型MP-LC方法2,2
仪器类型：RevelerisTMprep MPLC；色谱柱：Phenomenex LUNA C18(3)(150×25mm,10μ)；流量：40mL/min；柱温：室温；洗脱液A：0.1％(v/v)甲酸水溶液，洗脱液B：0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度：t0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝5 0％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B；检测UV：210、225、285nm。
制备型LC-MS方法1,3
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B四极杆；HPLC仪器类型：AgilentTechnologies 1290制备型LC；色谱柱：Waters XSelectTM CSH(C18,100×30mm,10μ)；流量：25mL/min；柱温：室温；洗脱液A：100％乙腈；洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液pH＝9.0；lin.梯度取决于产物的极性：
At0＝20％A，t2min＝20％A，t8.5min＝60％A，t10min＝100％A，t13min＝100％A
Bt0＝5％A，t2min＝5％A，t8.5min＝40％A，t10min＝100％A，t13min＝100％A
Ct0＝10％A，t2min＝10％A，t8.5min＝50％A，t10min＝100％A，t13min＝100％A
检测：DAD(220-320nm)；检测：MSD(ESI正/负)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集。
制备型LC-MS方法2,4
MS仪器类型：Agilent Technologies G6130B四极杆；HPLC仪器类型：AgilentTechnologies 1290制备型LC；色谱柱：Waters XBridge Shield(C18,150×19mm,5μ)；流量：25mL/min；柱温：室温；洗脱液A：100％乙腈；洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液pH＝9.0；lin.梯度：t0＝5％A，t2.5min＝5％A，t11min＝40％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A；检测：DAD(220-320nm)；检测：MSD(ESI正/负)质量范围：100-800；基于级分收集的DAD
快速色谱法
Grace Reveleris
Figure BDA0003222052890001061
C-815闪光灯；溶剂递送系统：带自动灌注功能的3活塞泵，4个独立通道单次运行最多可输送4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管线；最大泵流速250mL/min；最大压力50bar(725psi)；检测：UV 200-400nm，组合多达4个UV信号并扫描整个UV范围，ELSD；色谱柱尺寸：仪器上4-330g，luer型，750g至3000g(带可选支架)。
SO1861-EMCH合成(图13)
向SO1861(121mg,0.065mmol)和EMCH.TFA(110mg,0.325mmol)中加入甲醇(超干,3.00mL)和TFA(0.020mL,0.260mmol)。反应混合物在室温下搅拌。1.5小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC.1将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(120mg，90％)。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z)：2069[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.084
树枝化基元(-L-SO1861)4合成(图14)
中间体1：
二叔丁基(((6-叠氮己酰基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸酯
将6-叠氮己酸(0.943g，6.00mmol)、EDCI.HCl(1.21g，6.30mmol)和纯氧化苦参碱(0.938g，6.60mmol)溶解在DMF(10.0mL)中并将混合物搅拌5分钟。接着加入二叔丁基(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基))二氨基甲酸酯(1.82g，6.00mmol)在DMF(5.00mL)中的溶液并将反应混合物在室温下搅拌。5小时后真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在乙酸乙酯(50mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠溶液(2×50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(乙酸乙酯-庚烷梯度，10:90升至100:0)纯化残余物，得到呈白色固体状的标题化合物(2.67g,100％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z):287/343/465[M-155/M-99/M+23]1+
LC-MS r.t.(min):2.022A
中间体2：
N,N-双(2-氨基乙基)-6-叠氮己酰胺二盐酸盐
向二叔丁基(((6-叠氮己酰基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))二氨基甲酸酯(2.66g，6.00mmol)中加入HCl的异丙醇溶液(5-6N，20.0mL，110mmol)并在室温下搅拌反应混合物。4小时后，真空蒸发反应混合物，所得粗产物与DCM(3×20mL)共蒸发，得到粗标题产物(1.49g，79％)，为白色固体。
LRMS(m/z):243[M+1]1+
中间体3：
四叔丁基((5S,5'S)-(((((6-叠氮己酰基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))双(氮杂二基))双(6-氧代己烷-6,1,5-三基))四氨基甲酸酯
向N,N-双(2-氨基乙基)-6-叠氮己酰胺二盐酸盐(1.19g,3.76mmol)在DMF(30.0mL)和DIPEA(2.62mL,15.1mmol)中的溶液中加入Boc-Lys(Boc)-ONp(3.69g,7.90mmol)并将混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在乙酸乙酯(100mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(100mL)和饱和碳酸氢钠溶液(5×100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的标题产物(3.07g，91％)。基于LC-MS的纯度为94％。
LRMS(m/z):800/900/922[M-99/M+1/M+23]1+
LC-MS r.t.(min):2.172A
中间体4：
4-硝基苯基3-(乙酰硫基)丙酸酯
将4-硝基苯三氟乙酸酯(5.17g,22.0mmol)和3-(乙酰硫基)丙酸(2.96g,20.0mmol)溶解在DCM(50.0mL)中。接下来，加入DIPEA(6.97mL，40.0mmol)并将反应混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在乙酸乙酯(50mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠溶液(5×50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的标题产物(4.90g，91％)。基于LC-MS的纯度为99％。
LRMS(m/z):292[M+23]1+
LC-MS r.t.(min):1.942A
中间体5：
S)-2,6-二氨基-N-(2-(6-叠氮基-N-(2-((S)-2,6-二氨基六氨基)乙基)六氨基)乙基)己酰胺四盐酸盐
将四叔丁基((5S,5'S)-(((((6-叠氮己酰基)氮杂二基)双(乙烷-2,1-二基))双(氮杂二基))双(6-氧代己烷-6,1,5-三基))四氨基甲酸酯(1.80g，2.00mmol)溶解在异丙醇(5-6N，50.0ml，275mmol)中HCl中，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，所得粗产物与DCM(3×20mL)共蒸发，得到粗标题产物，为白色固体。
LRMS(m/z):250[M+2]2+,500[M+1]1+
中间体6：
(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰氨基]-N-[2-(6-叠氮基-N-{2-[(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰氨基])]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]己酰胺
(S)-2,6-二氨基-N-(2-(6-叠氮基-N-(2-((S)-2,6-二氨基六氨基)乙基)六氨基)乙基)己酰胺四盐酸盐(1.29g,2.00mmol)在DMF(30mL)和DIPEA(3.48mL,20.0mmol)中的溶液中加入3-(乙酰硫基)丙酸4-硝基苯基酯(2.26g，8.40mmol)并将反应混合物在室温搅拌过周末。真空蒸发反应混合物并将残余物溶解在DCM/甲醇(95:5，v/v，100mL)中。所得溶液用1N硫酸氢钾溶液(100mL)、1N氢氧化钠溶液(3×100mL)和盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残余物，得到呈白色固体状的标题产物(1.33g，65％)。在LC-MS上发现杂质(15％)，其m/z值对应于具有一个脱保护硫代乙酸酯基团的产物。杂质是在后处理过程中或后形成的。基于LC-MS的纯度为85％。
LRMS(m/z):510[M+2]2+,1019/1041[M+1/M+23]1+
LC-MS r.t.(min):1.862B
中间体7：
N,N'-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-巯基-9-(3-巯基丙酰氨基)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-四氮杂三十二烷-19,23-二基)双(3-巯基丙酰胺)甲酸酯
将支架2(102mg,0.100mmol)溶解在甲醇(1.00ml)中。接下来，加入新制备的1N氢氧化钠溶液(0.440ml，0.440mmol)并将反应混合物在室温搅拌。30分钟后，加入1.0M三甲基膦的THF溶液(0.500ml，0.500mmol)并将所得混合物在室温搅拌。30分钟后，将反应混合物真空蒸发并与甲醇(2×10mL)共蒸发。将残余物溶解在甲醇/水的混合物(9:1，v/v，1.00mL)中，并将所得溶液进行制备型MP-LC.2与产物对应的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(75.6mg，87％)，为无色粘性油。基于LC-MS的纯度为96％。
LRMS(m/z):513[M+2]2+,825[M+1]1+
LC-MS r.t.(min):1.422A
中间体8：
树枝化基元(-L-SO1861)4-胺
N,N'-((9S,19S)-14-(6-氨基己酰基)-1-巯基-9-(3-巯基丙酰氨基)-3,10,18-trioxo-4,11,14,17-四氮杂三十二烷-19,23-二基)双(3-巯基丙酰胺)甲酸酯(2.73mg，3.13μmol)溶解在20mM NH4HCO3与0.5mM TCEP/乙腈(3:1，v/v，3.00mL)的混合物中。接下来，加入SO1861-EMCH(29.2mg，0.014mmol)并将反应混合物在室温下搅拌。1.5小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS.3B将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(12.3mg，43％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z):1517[M-6]6-,1821[M-5]5-,2276[M-4]4-
LC-MS r.t.(min):4.395A
中间体9：
树枝化基元(-L-SO1861)4-叠氮化物
树枝化基元(-L-SO1861)4-胺(6.81mg，0.748μmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-yl 1-叠氮基-3,6,9,12-四氧十五烷-15-oate(2.90mg，7.48μmol)溶解在DMF(1.00毫升)中。接下来，加入DIPEA(1.302μL,7.48μmol)并将混合物振摇1分钟并在室温静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS.3C将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(5.86mg，84％)。基于LC-MS的纯度为90％。
LRMS(m/z):2344[M-4]4-
LC-MS r.t.(min):4.785B
中间体10：
树枝化基元(-L-SO1861)4-马来酰亚胺1
树枝化基元(-L-SO1861)4-胺(8.12mg,0.891μmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酸酯(3.94mg,8.91μmol)溶解在DMF(1.00mL)中。接下来，加入DIPEA(1.55μL,8.91μmol)并将混合物振摇1分钟并在室温静置。3小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS.3C将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(6.76mg，80％)。基于LC-MS的纯度为66％。
LRMS(m/z):2358[M-4]4-
LC-MS r.t.(min):2.136C
中间体11：
树枝化基元(-L-SO1861)4-马来酰亚胺2
将支架2(5.10mg,5.00μmol)溶解在甲醇(100μL)中。接下来，加入新制备的1N氢氧化钠溶液(22.0μL,22.0μmol)并将混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，加入1.0M三甲基膦的THF(25.0μL，25.0μmol)溶液，将所得混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后真空蒸发反应混合物并与甲醇(2×5mL)共同蒸发。将所得残留物溶解在20mM NH4HCO3与0.5mMTCEP/乙腈(3:1，v/v，3.242mL)的混合物中。从该溶液中，直接将1000μL加入SO1861-EMCH(14.4mg，6.94μmol，与支架相比为4.5当量)并将混合物振摇1分钟并在室温下静置。10分钟后，将反应混合物冻干过夜。对于所得残留物，加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧-2h-吡咯-1(5h)-基)丙酰胺)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(5.84mg,0.014mmol)和DMF(1.00mL)。接下来，加入DIPEA(2.39μL,0.014mmol)并将悬浮液振摇1分钟并在室温静置。2小时后，将反应混合物进行制备型LC-MS.3C将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(10.9mg，85％)。基于LC-MS的纯度为80％。
LRMS(m/z):2354[M-4]4-
LC-MS r.t.(min):4.165B
树枝化基元(-L-SO1861)8合成(图15)
中间体1：
叔丁基N-[(1S)-1-{[(1S)-1-{[2-(6-叠氮基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2],6-双({[(tert-丁氧基)羰基]氨基})六氨基]六氨基]乙基}六氨基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双({[(叔丁氧基)羰基]氨基})六氨基]戊基]氨基甲酰基}-5-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}戊基]氨基甲酸酯
(S)-2,6-二氨基-N-(2-(6-叠氮基-N-(2-((S)-2,6-二氨基六氨基)乙基)六氨基)乙基)己酰胺四盐酸盐(964mg，1.50mmol)溶解在DMF(25.0mL)和三乙胺(2.08mL,15.0mmol)中。接下来，加入Boc-Lys(Boc)-ONp(3.36g,7.18mmol)并将反应混合物在室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物并通过快速色谱法(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0升至0:100)纯化残余物，得到标题产物(2.71g，100％)，为白色固体。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z):807[M-198]2+
LC-MS r.t.(min):2.352B
中间体2：
(2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-二氨基-10-(6-叠氮己酰基)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-三氧-7,10,13,20-四氮杂二十六烷-1,5-二基)双(2,6-二氨基己酰胺)八盐酸盐
将中间体1(2.71g,1.50mmol)溶于HCl的异丙醇溶液(5-6N,25.0ml,138mmol)并将反应混合物在室温搅拌过夜。接下来，真空蒸发反应混合物并将所得粗产物与DCM(3×20mL)共蒸发以得到呈白色固体状的粗标题产物。
LRMS(m/z):203/254[M-200/M+4]4+,338[M+3]3+,507[M+2]2+,1012[M+1]1+
中间体3：
(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰氨基]-N-[(1S)-1-{[2-(6-叠氮基-N-{2-[(2S)-2,6-]双[(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰胺基]己酰胺基]己酰胺基]乙基}己酰胺基)乙基]氨基甲酰基}-5-[(2S)-2,6-双[3-(乙酰硫基)丙酰胺基]己酰胺基]戊基]己酰胺
向(2S,2'S)-N,N'-((5S,15S,22S)-22,26-二氨基-10-(6-叠氮己酰基)-15-((S)-2,6-diaminohexanamido)-6,14,21-三氧-7,10,13,20-四氮杂二十六烷-1,5-二基)双(2,6-二氨基己酰胺)八盐酸盐(300mg,0.230mmol)加入DMF(20.0mL)、三乙胺(320μl,2.30mmol)和4-硝基苯基3-(乙酰硫基)丙酸酯(595mg,2.21mmol)。将所得悬浮液在60℃超声处理30分钟，并在室温搅拌过夜。真空蒸发反应混合物，并通过首先进行快速色谱纯化(DCM-甲醇/DCM(1/9，v/v)梯度100:0上升至0:100)纯化残留物，然后进行制备型MP-LC2得到呈白色固体状的标题产物(70mg，15％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z):685[M+3]3+
LC-MS r.t.(min):1.912A
中间体4：
(2S)-N-[(1S)-1-{[2-(6-氨基-N-{2-[(2S)-2,6-双[(2S)-2,6-双(3-硫烷基丙酰氨基)己酰氨基]己酰氨基]乙基}己酰氨基)乙基]氨基甲酰}-5-[(2S)-2,6-双(3-硫酰丙酰氨基)己酰氨基]戊基]-2,6-双(3-硫酰丙酰氨基)己酰胺甲酸酯
支架4(10.0mg，4.87μmol)溶解在甲醇(200μl)中。接下来，加入新鲜制备的1N氢氧化钠溶液(42.9μL,0.043mmol)，将所得混合物振摇1分钟，然后在室温静置。30分钟后，加入1.0M三甲基膦的THF溶液(24.4μL，0.024mmol)，将所得混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，反应混合物用水(1mL)稀释并直接进行制备型MP-LC.2对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体的标题化合物(4.02mg，48％)。
LRMS(m/z):564[M+3]3+,846[M+2]2+
LC-MS r.t.(min):1.542C
中间体5：
树枝化基元(-L-SO1861)8-胺
将支架5(0.52mg,0.299μmol)和SO1861-EMCH(29.2mg,0.014mmol)溶解在20mMNH4HCO3与0.5mM TCEP/乙腈(3:1,v/v,1.00mL)的混合物中，将所得混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，加入TCEP(0.30mg，1.05μmol)并将反应混合物振摇1分钟。接下来，将混合物直接进行制备型LC-MS.3B将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(2.17mg，40％)。基于LC-MS的纯度为97％。
LRMS(m/z):2282[M-8]8-,2607[M-7]7-
LC-MS r.t.(min):4.415A
树枝化基元(NEM)4合成(图18)
向双(2-((S)-2,6-双(3-巯基丙酰胺基)己酰胺基)乙基)氨基甲酸苄酯(1.69mg,2.00μmol)和N-乙基马来酰亚胺(1.05mg,8.40μmol)的中加入20mM NH4HCO3/乙腈(3:1,v/v,2.00mL)的混合物并将反应混合物在室温下搅拌。2小时后，将反应混合物冻干过夜。通过使用制备型LC-MS3A纯化所得残余物，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(1.53mg，57％)。基于LC-MS的纯度为98％。
LRMS(m/z):1346[M+1]1+
LC-MS r.t.(min):1.433A
实施例6
SO1861-三功能连接子-BNAoligo合成与肿瘤样本基因沉默分析(图16)
材料与方法
三功能连接子
三功能连接子(DBCO、TCO、马来酰亚胺)由Bio-Synthesis Inc.(Lewisville,Texas)订购。
HSP27BNA oligo
HSP27BNA(-硫醇)oligos(序列5'-GGCacagccagtgGCG-3')(Zhang等人,2011)由Bio-synthesis Inc.(Lewisville,Texas)订购。
中间体1：
SO1861-叠氮化物
向SO1861(60mg,0.032mmol))和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰肼(39.3mg,0.129mmol)加入甲醇(超干，1.00mL)和TFA(9.86μl，0.129mmol)，并将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC.1与产物对应的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z):2150[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.103B
中间体2：
SO1861-三功能连接子
SO1861-叠氮化物(45mg，0.021mmol)和三功能连接子(26.5mg，0.022mmol)溶解在DMF(2.50mL)中，将所得混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，将反应混合物进行制备型LC-MS.3C将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z):1677[M-2]2-
LC-MS r.t.(min):2.546A
中间体3：
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
对1-(4-甲酰苯甲酰氨基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰胺(28.0mg,0.048mmol)和EMCH.TFA(24.5mg,0.072mmol)加入甲醇(超干，2.00mL)和TFA(11.1μL,0.145mmol)，并将反应混合物在50℃搅拌。30分钟后，真空蒸发反应混合物，所得残留物通过MP-LC.1纯化。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈亮紫色蓬松固体状的标题化合物(33.4mg，88％)。基于LC-MS的纯度为92％。
LRMS(m/z):394[M+2]2+,789[M+1]1+
LC-MS r.t.(min):1.287A
中间体4：
甲基四嗪-BNA寡核苷酸
将BNA寡二硫化物(70.0mg,0.012mmol)溶解在20mM NH4HCO3(20.0mL)中至HSP27。接下来，加入TCEP(14.3mg，0.050mmol)并将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。使用截留分子量为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000g×30min)。接下来，将20mM NH4HCO3与2.5mM TCEP(20.0mL)的溶液加入到残余溶液中，并在上述相同条件下再次过滤所得混合物。残留物溶液用20mM NH4HCO3(30.0mL)稀释并将所得混合物加入(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(14.8mg，18.8μmol)的乙腈(10.0mL)溶液。将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，将反应混合物冷冻并冻干过周末，产生呈粉红色蓬松固体状的粗标题产物。向粗产物中加入20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液，所得悬浮液通过0.45μm注射器式过滤器过滤。使用离心过滤器以与上述相同的条件过滤滤液。接下来，再次将20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液加入到残余溶液中，并通过使用具有上述相同条件的离心过滤器再次过滤所得混合物。用20mM NH4HCO3(20.0mL)稀释残余溶液并将所得混合物冻干过夜以产生呈粉红色蓬松固体状的标题产物(90.0mg,115％)。基于LC-MS的纯度为91％。
LRMS(m/z):1631[M-4]4-,2174[M-3]3-
LC-MS r.t.(min):0.737B
中间体5：
SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸
将甲基四嗪-BNA寡核苷酸(90.0mg，0.014mmol)和SO1861-三功能连接子(48.6mg，0.014mmol)溶解在水/乙腈(4:1，v/v，12.0mL)的混合物中。将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。15分钟后，将混合物进行制备型LC-MS.4A将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(82.0mg，60％)。基于LC-MS的纯度为92％(2个峰的m/z值对应于标题化合物)。
LRMS(m/z):1641[M-6]6-,1970[M-5]5-
LC-MS r.t.(min):3.24和3.406B
中间体1：
SO1861-叠氮化物
向SO1861(60mg,0.032mmol))和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰肼(39.3mg,0.129mmol)加入甲醇(超干，1.00mL)和TFA(9.86μl，0.129mmol)，并将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC.1与产物对应的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为100％。
LRMS(m/z):2150[M-1]1-
LC-MS r.t.(min):1.103B
中间体2：
SO1861-三功能连接子
SO1861-叠氮化物(45mg，0.021mmol)和三功能连接子(26.5mg，0.022mmol)溶解在DMF(2.50mL)中，将所得混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，将反应混合物进行制备型LC-MS.3C将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(58.4mg，84％)。基于LC-MS的纯度为89％。
LRMS(m/z):1677[M-2]2-
LC-MS r.t.(min):2.546A
中间体3：
(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-dioxo-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺
对1-(4-甲酰苯甲酰氨基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧十五烷-15-酰胺(28.0mg,0.048mmol)和EMCH.TFA(24.5mg,0.072mmol)加入甲醇(超干，2.00mL)和TFA(11.1μL,0.145mmol)，并将反应混合物在50℃搅拌。30分钟后，真空蒸发反应混合物，所得残留物通过MP-LC.1纯化。将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈亮紫色蓬松固体状的标题化合物(33.4mg，88％)。基于LC-MS的纯度为92％。
LRMS(m/z):394[M+2]2+,789[M+1]1+
LC-MS r.t.(min):1.287A
中间体4：
甲基四嗪-BNA寡核苷酸
将BNA寡二硫化物(70.0mg,0.012mmol)溶解在20mM NH4HCO3(20.0mL)中至HSP27。接下来，加入TCEP(14.3mg，0.050mmol)并将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。使用截留分子量为3000Da的离心过滤器过滤反应混合物(5000g×30min)。接下来，将20mM NH4HCO3与2.5mM TCEP(20.0mL)的溶液加入到残余溶液中，并在上述相同条件下再次过滤所得混合物。残留物溶液用20mM NH4HCO3(30.0mL)稀释并将所得混合物加入(E)-1-(4-((2-(6-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基)亚肼基)甲基)苯甲酰胺基)-N-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(14.8mg，18.8μmol)的乙腈(10.0mL)溶液。将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。30分钟后，将反应混合物冷冻并冻干过周末，产生呈粉红色蓬松固体状的粗标题产物。向粗产物中加入20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液，所得悬浮液通过0.45μm注射器式过滤器过滤。使用离心过滤器以与上述相同的条件过滤滤液。接下来，再次将20mM NH4HCO3(20.0mL)溶液加入到残余溶液中，并通过使用具有上述相同条件的离心过滤器再次过滤所得混合物。用20mM NH4HCO3(20.0mL)稀释残余溶液并将所得混合物冻干过夜以产生呈粉红色蓬松固体状的标题产物(90.0mg,115％)。基于LC-MS的纯度为91％。
LRMS(m/z):1631[M-4]4-,2174[M-3]3-
LC-MS r.t.(min):0.737B
中间体5：
SO1861-三功能连接子-BNA寡核苷酸
将甲基四嗪-BNA寡核苷酸(90.0mg，0.014mmol)和SO1861-三功能连接子(48.6mg，0.014mmol)溶解在水/乙腈(4:1，v/v，12.0mL)的混合物中。将反应混合物振摇1分钟并在室温静置。15分钟后，将混合物进行制备型LC-MS.4A将对应于产物的级分立即合并在一起，冷冻并冻干过夜，得到呈白色蓬松固体状的标题化合物(82.0mg，60％)。基于LC-MS的纯度为92％(2个峰的m/z值对应于标题化合物)。
LRMS(m/z):1641[M-6]6-,1970[M-5]5-
LC-MS r.t.(min):3.24和3.406B
肿瘤样本的RNA分离和基因表达分析
根据制造商的说明，使用TriZol(Thermo Fisher)从肿瘤中分离总RNA。分离的RNA重新悬浮在无核酸酶水(NFW)中。检查RNA样品在凝胶上的RNA完整性。为了制备cDNA，首先将100ng总RNA与随机六聚体(Qiagen；终浓度2μM)混合，在NFW中的最终体积为12.5μl中，在70℃变性5分钟，然后立即在冰上冷却。接下来，加入7.5μl cDNA合成混合物，包括4μl 5xRT缓冲液(Promega)、0.4μl 25mM dNTPs(Promega)、1μl 200U/μL MMLV RT-酶(Promega)、0.5μL 40U/μL RNAse抑制剂(Promega)和1.6μL NFW。使用以下cDNA合成方案：1)10分钟25℃2)60分钟37℃3)5分钟85℃4)∞4℃
对于单个qPCR反应，制备了以下混合物：1μL cDNA、0.05μL正向引物(250μM)、0.05μL反向引物(250μM)、8.9μl LNFW、10μl SYBR Green(Bio-Rad)。使用以下qPCR方案：1个循环：5分钟95℃，40个循环：15s 95℃+30s 60℃。
HSP27基因表达使用2-(Ct HSP27–GEOMEAN(Ct ref1 ；Ct ref2 ；Ct ref3 ；Ct ref4 ))计算，其中ref1、ref2、ref3和ref4是用于肿瘤分析的参考基因IMMT、EIF2S2、GUSB和UBC。根据GeNORM分析在测试的九个参考基因中选择两个参考基因，为该肿瘤样本选择最理想和最稳定的参考基因。为此，将qPCR结果导入Qbase+软件程序，通过该程序计算两个质量指标：标准化参考基因表达水平的变异系数(V)；以及geNorm稳定性M值(M)1。M<0.2和V<0.15的参考基因被认为非常稳定。基于此分析，IMMT和EIF2S2被选为最稳定的参考基因。然而，UBC和GUSB也被加入到参考基因组中，以进一步提高归一化的准确性。每个样品在CFX96实时qPCR机器(Bio-Rad)上进行技术分析，一式三份。
在qPCR中使用的引物如下表B1所示。
表格B1.引物
基因 引物 序列(5′-3′)
UBC 正向 CAGCCGGGATTTGGGTCG
反向 CACGAAGATCTGCATTGTCAAGT
GUSB 正向 TGCGTAGGGACAAGAACCAC
反向 GGGAGGGGTCCAAGGATTTG
IMMT 正向 AACCCACACCTGCACTTTCA
反向 TTTTCCTGTTGTGCAAGGCG
EIF2S2 正向 CCACAAGTCGTCCGAGTAGG
反向 GGAGATGTTTGGGCTGACGA
HSP27 正向
反向
实施例7
抗体-(SO1861-L-三功能连接子-L-HSP27)(Cys)
抗体树枝化基元
抗体皂草素
T-DM1
材料和方法
曲妥珠单抗(Tras,
Figure BDA0003222052890001211
Roche)、西妥昔单抗(Cet,
Figure BDA0003222052890001212
MerckKGaA)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,98％,Sigma-Aldrich)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman试剂，99％，Sigma-Aldrich)、ZebaTMSpin脱盐柱(2mL，Thermo-Fisher)、NuPAGETM4-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Thermo-Fisher)、NuPAGETMMES SDS电泳缓冲液(Thermo-Fisher)、NovexTMSharp预染蛋白质标准品(Thermo-Fisher)、PageBlueTM蛋白质染色溶液(Thermo-Fischer)、PierceTMBCA蛋白质测定试剂盒(Thermo-Fisher)、N-乙基马来酰亚胺(NEM，98％，Sigma-Aldrich)、1,4-二硫苏糖醇(DTT，98％，Sigma-Aldrich)、SephadexG25(GE Healthcare)、异丙醇(IPA，99.6％，VWR)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris,99％,Sigma-Aldrich)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCL,Sigma-Aldrich)、L-组氨酸(99％,Sigma-Aldrich)、D-(+)-海藻糖脱水物(99％,Sigma-Aldrich)、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(TWEEN 20,Sigma-Aldrich)、DPBS-Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(Thermo-Fisher)、盐酸胍(99％，Sigma-Aldrich)、乙二胺四乙酸二钠盐二水合物(EDTA-Na2，99％，Sigma-Aldrich)、无菌过滤器0.2μm(Sartorius)、琥珀酰亚胺-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐(SMCC，Thermo-Fisher)、石竹素-Cys(Dia-Cys，具有单个C端半胱氨酸功能的石竹素突变体，Proteogenix)、Vivaspin T4和T15浓缩器(Sartorius)、Superdex 200PG(GEHealthcare)、四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP、Thermo-Fisher)、HSP27寡核苷酸(生物合成)。
方法
UV-Vis
吸光度测量在Perkin Elmer Lambda 25UV-Vis或Thermo NanoDrop ND-2000分光光度计上进行，光谱范围为200-750nm。
使用Thermo Nanodrop 2000或Lambda 25光谱仪使用以下参数确定浓度：
曲妥珠单抗OD280＝1.5(mg/ml)-1cm-1
西妥昔单抗OD280＝1.4(mg/ml)-1cm-1
HSP27寡核苷酸OD260＝153,000M-1cm-1；Rz260:280＝1.819
Dia-Cys OD280＝0.57(mg/ml)-1cm-1
PEG4-SPDP(PDT)OD343＝8,080M-1cm-1
SAMSA-荧光素OD495＝64,500M-1cm-1；Rz280:495＝0.232
Ellmans(TNB)OD412＝14,150M-1cm-1
尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(SEC)在AKTA纯化器上进行。使用Biosep SEC-S3000柱或SephadexG50M柱(10x 40cm)通过SEC分析样品，用TBS/异丙醇溶液(85:15v/v)洗脱。样品纯度通过抗体样品峰相对于痕量聚集峰的积分确定。
Ellman测定
抗体-树枝化基元(-L-SO1861)4(Cys和Lys)
使用DAR4合成曲妥珠单抗-(L-d(SO1861)4)4和西妥昔单抗-(L-d(SO1861)4)4(FBR706 STB22/9-10)
曲妥珠单抗和西妥昔单抗在下文中称为“Ab”。Ab经由不稳定的(L)四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子与树枝状SO1861-EMCH[d(SO1861)4-EMCH]缀合。以西妥昔单抗-L-(d(SO1861)4)4示例性描述了该过程：
将西妥昔单抗脱盐到DPBS pH 7.5缓冲液中，然后标准化为2.50mg/ml。向一等分Ab(9.19mg，61nmol)中加入一等分新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(5.0mg/ml，6.70摩尔当量，411nmol)，短暂涡旋混合物，然后在20℃下通过辊混合培养60分钟。培养后，加入甘氨酸(20mg/ml，7.7μl)淬灭反应，然后通过加入TCEP(5.0mg/ml，4.0摩尔当量/SPDP，1.64μmol)原位还原SPDP部分。将该混合物在20℃下通过辊混合而辊混合15分钟。使用zeba旋转脱盐柱通过凝胶过滤将所得Ab-SH纯化至TBS pH 7.5。Ab-SH通过UV-vis分析和Ellman测定(SH与Ab的比率＝5.4)进行表征。向大量Ab-SH(7.41mg,1.93mg/ml,49nmol)中加入一等分新鲜制备的d(SO1861)4-EMCH DMSO溶液(10mg/ml，8.0摩尔当量/Ab，0.4μmol，3.16mg,0.32ml)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃培养过夜。除缀合反应外，在缀合前取出两份脱盐Ab-SH(0.25mg，1.67nmol)，并在20℃下与NEM(8.0摩尔当量/Ab，13.3nmol，6.7μl 0.25mg/ml溶液)或TBS pH 7.5缓冲液(6.7μl)反应过夜，分别作为阳性对照和阴性对照。培养18小时后(在加入NEM之前)，将粗制缀合物混合物短暂离心，取出100μl等分试样用于UV-vis分析，并与阳性对照和阴性对照一起通过Ellman测定进行表征以获得d(SO1861)4掺入。向大量Ab–d(SO1861)4混合物中加入一等分新鲜制备的NEM溶液(2.5mg/ml，5.0摩尔当量，0.25μmol)，混合物通过1.6×30cm Sephadex G50柱纯化，用DPBS pH 7.5洗脱得到纯化的西妥昔单抗-(L-d(SO1861)4)4缀合物。将产物过滤至0.2μm以澄清，然后小心浓缩至约3mg/ml使用vivaspin T15浓缩器(3,000g，5分钟间隔，5℃)，以得到最终的西妥昔单抗-(L-d(SO1861)4)4缀合物。产量：4.41mg，48％(1.64mg/ml)。d(SO1861)4与Ab的比率＝4.4(参见表B2)。
表B2.
Figure BDA0003222052890001241
抗体-L-HSP27BNA(Cys)
曲妥珠单抗-(L-HSP27)4、西妥昔单抗-(L-HSP27)4、具有DAR4的PEG4-SPDP和经由具有DAR2的PEG4-SPDP合成的西妥昔单抗-(L-HSP27)2
曲妥珠单抗、西妥昔单抗、曲妥珠单抗-L-SO1861、西妥昔单抗-L-SO1861在下文中称为“Ab”。Ab经由不稳定的(L)四(乙二醇)琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(PEG4-SPDP)连接子与HSP27缀合。
HSP27(2.7mg,470nmol,6.10mg/ml)与TCEP(10摩尔当量,4.7μmol,1.34mg,50mg/ml)在20℃通过辊混合反应30分钟。之后，oligo-SH通过PD10 G25脱盐柱纯化，洗脱到TBSpH 7.5中并立即使用。获得Oligo-SH(2.48mg，90％，1.24mg/ml，SH与寡核苷酸比＝0.8)
曲妥珠单抗-(L-SO1861)4(1.3mg,8.7nmol,2.50mg/ml)与在DMSO(1mg/ml)中新鲜制备的PEG4-SPDP溶液(9.26摩尔当量,80.3nmol,45μg)在20℃下通过辊混合反应60分钟。之后，将反应用甘氨酸(15.1μl 2mg/ml新鲜制备的TBS pH 7.5溶液)淬灭，然后经由zeba脱盐柱脱盐，用TBS pH 7.5洗脱。取出所得Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP)的等分试样并通过UV-Vis分析进行测试。使用TCEP释放吡啶基-2-硫酮(PDT)并通过UV-vis分析在343nm(SPDP与Ab比率：4)确定SPDP掺入。剩余的Tras-(L-SO1861)-(L-PEG4-SPDP)与一等分新鲜制备的HSP27寡核苷酸(oligo-SH)(8摩尔当量，54.8nmol，0.32mg，1.24mg/ml)反应并在20℃下通过辊混合培养过夜。17小时后，通过UV-vis分析来分析缀合物以通过在343nm处置换吡啶基-2-硫酮(PDT)来确定HSP27的掺入。使用1.6×33cm Sephadex G50柱纯化粗缀合物，用DPBS pH 7.5洗脱。得到的曲妥珠单抗-(L-SO1861)4-(L-HSP27)4作为单一级分获得。产量：0.47mg，45％(0.49mg/ml)，HSP27与Ab的比率＝3.5(见表B3)。所有产量：需要STB17/1-8
表格B3.总结的反应条件和结果
Figure BDA0003222052890001251
实施例8
材料和方法
在我们目前的工作中，我们研究了一个模型支架，该支架由四个分子臂组成，用于经由希夫碱(亚胺)结合皂苷，一个分子臂用于点击化学。聚合物结构(图19)是从IrisBiotech GmbH(Marktredwitz，德国)购买的第一代五价聚乙二醇基树枝状聚合物(即重复支化循环的次数)。皂苷(在本例中为SA1641)是从来自默克(德国达姆施塔特)的称为皂素集的霞草属物种的皂苷复合粗提取物中纯化的。将粉末状粗提取物(2.5g)在水(100mL)中用氢氧化钠(0.2g)水解。将溶液在40℃搅拌20小时，然后补充冰醋酸直至达到pH 5.0。为了去除单宁，将溶液在分液漏斗中与30mL丁醇一起振摇。回收水相并重复丁醇萃取两次。丁醇相补充有无水硫酸钠，过滤并合并。蒸发丁醇，将剩余的皂苷粉末溶解在20％甲醇中，最终浓度为30mg/mL。短时间超声处理后，通过高效液相色谱(HPLC)分离不同的皂苷。管(不包括色谱柱)用温水(40℃)以1.5mL/min的流速冲洗，然后包括Eurospher RP-C18柱(5μm，250×8mm)和异丙醇(100％)。将皂苷加到柱上并用甲醇梯度洗脱(30分钟内以1.5mL/min的速度从20％甲醇到70％甲醇，在补充有0.01％三氟乙酸的水中，然后用70％甲醇再洗脱60分钟)(Sama等人，2018)。通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析级分的等分试样的SA1641含量。合并含有纯SA1641的级分并蒸发甲醇。使用干冰将水溶液在旋转圆底烧瓶中冷冻成薄膜。在–80℃下储存16小时后，将样品冻干。为了制备本发明中定义的支架，将聚合结构(0.2mM)和SA1641(3.2mM)溶解在水(约pH 8)中，等体积混合并在26℃振摇24小时。然后以参考SA1641的4倍摩尔过量加入氰基硼氢化钠(NaCNBH3；0.1M)，并将样品再培养24小时。然后通过超高效液相色谱(UPLC)/ESI-MS验证结构。将样品上样到RP-C4柱上，并用甲醇梯度(在15分钟内将25％甲醇在补充有0.01％三氟乙酸的水中增至80％甲醇，然后再加入80％甲醇10分钟)洗脱。使用LockSprayTM分析级分，LockSprayTM是一种离子源，专为使用WatersCorporation的LC飞行时间(LC-TOF)质谱仪通过电喷雾电离进行精确质量测量而设计。
结果
图20的插图显示了从使用同位素模式计算器enviPat Web 2.0计算得到的理论上预期的质谱图。该模式考虑了分子的电荷和同位素的自然存在，这就是对单一物质预期不止一次窥视的原因。UPLC/ESI-MS获得的实验数据(图20)显示在m/z 758–760处的峰几乎完全相同，强度与预测的相同，从而证明SA1641与聚合结构成功偶联。
实施例9
材料和方法
作为药物活性物质的示例，我们使用了靶向毒素石竹素-表皮生长因子(石竹素-EGF)。将质粒His-石竹素-EGF-pET11d(Weng等人，2009)(100ng)加入到20μL大肠杆菌RosettaTM2(DE3)pLysS感受态细胞(Novagen,San Diego,CA,USA)。通过热休克(冰上30分钟，42℃下90秒和冰上1分钟)转化细胞。此后，加入300μL溶菌肉汤(LB)，悬浮液在37℃下培养1小时，同时以200rpm振摇。在含有50μg/mL氨苄青霉素的预热溶菌肉汤琼脂板上接种100μl细菌悬浮液，并将板在37℃培养过夜。用板上的菌落接种含有50μg/mL氨苄青霉素的溶菌肉汤(3mL)，并将细菌在37℃和200rpm下培养8小时。将悬浮液(50μL)加入到500mL含有50μg/mL氨苄青霉素的溶菌肉汤中，并在37℃和200rpm培养过夜。随后，体积扩大到2.0L，细菌在相同条件下生长，直到波长600nm处的光密度达到0.9。此后，通过加入终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达。蛋白质表达在37℃和200rpm持续3小时。最后，将细菌悬浮液在5,000×g和4℃离心5分钟，重新悬浮在20mL PBS(137mMNaCl、2.7mM KCl、8.1mM Na2HPO4、1.47mM KH2PO4)中，并在–20℃储存直至使用。为了纯化，将细菌悬浮液解冻并通过超声裂解。将裂解物离心(15,800×g，4℃，30分钟)并加入咪唑至终浓度为20mM。在20mM咪唑的存在下，将上清液与2mL的Ni-次氮基三乙酸琼脂糖在4℃连续振摇培养30分钟。随后，将材料倒入20mL柱中，并在洗涤缓冲液中用10mL洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)和10mL浓度增加的咪唑部分洗脱石竹素-EGF(31mM、65mM、125mM和250mM)洗涤3次。洗脱液级分(2mL)在4℃用2.0L PBS透析过夜。通过
Figure BDA0003222052890001271
Ultra-15(10kDa)浓缩脱盐石竹素-EGF，并定量蛋白质浓度。
为了将合适的点击化学基团引入石竹素-EGF，将8倍摩尔过量的炔烃-PEG5-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二甲亚砜中，并加入9体积的石竹素-EGF(1mg在0.2M NaH2PO4/Na2HPO4中，pH 8)。在室温培养4小时后，使用PD10柱(GE-Healthcare，弗莱堡，德国)分离未结合的炔烃。具有聚合结构的点击化学是通过铜(I)催化的炔烃-叠氮化物环加成反应进行的。将炔-石竹素-EGF(0.02mM)、树枝状聚合物(0.05mM)、CuSO4(0.1mM)、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(0.5mM)和抗坏血酸钠(5mM)在室温下在0.1M NaH2PO4/Na2HPO4，pH 8中温和搅拌培养1小时。然后使用PD10柱分离低分子量物质。
为了测试本发明的功效，我们用HER14细胞进行了活力测定。这些细胞是用人类表皮生长因子受体稳定转染的成纤维细胞，因此是靶向毒素石竹素-EGF的靶细胞。将HER14细胞(2,000个细胞/100μL/孔)接种到96孔细胞培养板的孔中，并在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中在37℃、5％CO2和98％湿度培养24小时。然后将不同的测试物质(参见结果和图21)以25μL的体积一式三份加入，并补充另外25μL的培养基。培养72小时后，每孔加入30μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(0.5mg/mL水溶液)并培养2小时。此后，小心除去培养基并用含有10％(v/v)异丙醇、5％(w/v)十二烷基硫酸钠和400mM HCl的水溶液代替，并培养5分钟。在酶标仪(Spectra MAX 340PC,MolecularDevices,Sunnyvale,CA,USA)中以570nM对溶解的甲瓒进行光度定量。未处理的细胞归一化为1，所有样品均指未处理的对照。通过未配对的两样本t检验确定显著性。
结果
聚合结构，在示例中为五聚体树枝状聚合物(五聚体)，在不存在或存在SA1641的情况下对靶细胞没有任何细胞毒性作用(图21，第2和第3栏)。在没有支架的情况下，靶向毒素(石竹素-EGF)在浓度为0.1nM时表现出最大毒性的一半(第4栏)。在SA1641存在情况下，相同浓度导致所有细胞死亡，表明SA1641作为内体逃逸增强剂的一般能力(第5栏)。聚合结构的存在不影响在存在或不存在SA1641的情况下的石竹素-EGF的毒性(第6栏和第7栏)，表明支架不影响石竹素-EGF的毒性。为了经由点击化学将模型聚合结构偶联到示例性药物活性物质石竹素-EGF，该物质必须先与炔基偶联。药物活性物质的制造商可以在合成过程中将点击位置直接引入物质中他选择的位置，在该位置物质的活性不受影响。当炔烃修饰的药物活性物质点击聚合结构时没有额外的活性损失，表明聚合结构本身无毒。
实施例10
材料
使用购买的以下化学品：甲醇(MeOH，LiChrosolv，默克)、N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼(EMCH，95％，TCI Chemicals)、三氟乙酸(TFA，99.8％，Carl Roth)、2-巯基乙醇(98％，Sigma-Aldrich)、聚(酰胺胺)(PAMAM树枝状聚合物，乙二胺核心，第5.0代溶液，Sigma-Aldrich)、花青3羧酸(Cy3-COOH，95％，Lumiprobe)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐、N-[(二甲氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲胺六氟磷酸盐N-氧化物(HATU，97％，Sigma-Aldrich)、牛血清白蛋白级分V(BSA，Carl Roth)、二甲亚砜(DMSO，99％，Carl Roth)、2-亚氨基硫烷盐酸盐(98％，Sigma-Aldrich)、罗丹明b(RhodB，95％，默克)、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS，Gibco)、盐酸(HCl，37％，默克)、NHS-PEG13-DBCO(点击化学工具)、Alexa FluorTM4885-TFP(Thermo-Fischer)、叠氮基-PEG3-SS-NHS(Conju-Probe),氰基硼氢化钠(NaCNBH3,95％,Sigma-Aldrich)、过硫酸铵(APS,98％,Sigma-Aldrich)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TMEDA,99％,Sigma-Aldrich)、定制肽SESDDAMFCDAMDESDSK(95％,PeptideSynthetics)、叠氮基-dPEG12-NHS(95％,Quanta Biodesign)、PFd-G4-叠氮化物-NH-BOC树枝化基元(G4-树枝化基元,95％,Polymer Factory)、Cyanin5-DBCO(Cy5-DBCO，95％，Lumiprobe)、氯仿(CHCl3，99.5％，Sigma)、Amicon Ultra 0.5mL离心过滤器(3kDa MWCO，Sigma)、mPEG-SCM(mPEG2k-NHS，95.6％，Creative PEG Works)、Amicon Ultra 15mL离心过滤器(10kDa MWCO，Sigma)。
方法
MALDI-TOF-MS
MALDI-TOF光谱记录在MALDI-质谱仪(Bruker Ultrafex III)上。通常，将纳摩尔至微摩尔范围内溶解在MilliQ水中的样品点在靶标(MTP 384靶标板抛光钢T F，BrukerDaltons)上，使用super-DHB(99％，Fluka)或芥子酸(SA，99％，Sigma-Aldrich)作为基质溶解在乙腈(MADLI-TOF-MS测试，Sigma)/0.1％TFA(7:3v/v)中，经由干液滴法。PepMix(肽校准标准，Bruker Daltons)或ProteMass(蛋白质校准标准，Sigma-Aldrich)用作校准标准。RP模式是指反射器正模式。RN模式是指反射器负模式。LP模式是指线性正模式。
H-NMR
1H NMR分析使用Bruker 400MHz NMR光谱仪进行。在测量前24小时进行样品制备，其中2mg样品已溶解在0.8mL甲醇-D4(99％，Deutero)中。
UV-Vis
UV-Vis测量在NanoDrop ND-1000分光光度计上进行，在光谱范围200-750nm中进行。
尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱(SEC)使用来自GE Healthcare的Sephadex G 25Superfine和预装PD10柱(GE Healthcare，Sephadex G 25M)进行。在进行色谱分析之前，通过在相应的洗脱液中溶胀来活化该材料。
透析
再生纤维素膜：MWCO＝1和2kDa(Spectra/Por)，以及MWCO＝12–14kDa(Carl Roth)用于进行透析。通常，使用1L溶剂进行透析24小时，该溶剂在该过程的前6小时后更换。
冻干
在α1-2LD plus(Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH)上进行冷冻干燥。通常，样品用液氮冷冻，然后放入高真空的冷冻干燥机中。
SO1861-EMCH合成
将来自Saponaria officinalis L的SO1861(59mg,31.7μmol)和EMCH(301mg,888μmol)置于带有搅拌器的圆烧瓶中，并溶解在13mL甲醇中。将TFA(400μL,cat.)加入到溶液中，并将反应混合物在RCT B磁力搅拌器(IKA Labortechnik)上以800rpm和室温搅拌3小时。搅拌3小时后，将混合物用MilliQ水或PBS稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por 7)用MilliQ水或PBS彻底透析24小时。透析后，将溶液冻干，得到白色粉末。产量62.4毫克(95％)。干燥的等分试样进一步用于经由1H NMR和MALDI-TOF-MS进行表征。
1H NMR(400MHz，甲醇-D4)(图22的A，SO1861)：δ＝0.50–5.50(m，皂苷三萜和糖骨架质子)，9.43(1H，s，皂苷的醛质子，Ha)。
1H NMR(400MHz，甲醇-D4)(图22的B.SO1861-EMCH，PBS处理)：δ＝0.50–5.50(m，皂苷三萜和糖骨架质子)，6.79(2H，s，马来酰亚胺质子，Hc),7.62-7.68(1H,m,腙质子,Hb)。
MALDI-TOF-MS(RP模式)(图23的A)：m/z 2124Da([M+K]+，皂苷-EMCH)，m/z 2109Da([M+K]+，SO1861-EMCH),m/z 2094Da([M+Na]+,SO1861-EMCH)
MALDI-TOF-MS(RN模式)(图28的C)：m/z 2275Da([MH]-，皂苷-EMCH缀合物)，2244Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2222Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2178Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2144Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2122Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物),2092Da([M-H]-,皂苷-EMCH缀合物),2070Da([M-H]-,SO1861-EMCH),2038Da([M-H]-,SO1832-EMCH),1936Da([M-H]-,SO1730-EMCH),1861Da([M-H]-,SO1861)。
SO1861-EMCH-巯基乙醇
向SO1861-EMCH(0.1mg,48nmol)中加入200μL巯基乙醇(18mg,230μmol)，并将溶液在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇1小时。振摇1小时后，将溶液用甲醇稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por 7)对甲醇彻底透析4小时。透析后，取出等分试样并经由MALDI-TOF-MS进行分析。
MALDI-TOF-MS(图23的B)(RP模式)：m/z 2193Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)，m/z 2185Da([M+K]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)，m/z 2170Da([M+Na]+，SO1861-EMCH-巯基乙醇)。
BSA-SO1861合成
将溶解在47μL PBS中的2-亚氨基硫烷(231μg，1.1μmol)加入到200μL PBS中的BSA-RhodB溶液(10mg，0.15μmol)中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇40分钟。振摇40分钟后，将反应混合物立即通过Sephadex G25超细尺寸排阻柱(16mL柱体积)并将溶解在100μL PBS中的SO1861-EMCH(1mg，0.5μmol)加入收集的BSA-SH级分。将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，BSA-SO1861经由MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：未确定。
MALDI-TOF-MS(图15的A)(LP模式)：m/z 74.2kDa([M+H]+，BSA-SO1861，附接4个SO1861)，72.2kDa([M+H]+，BSA-SO1861，附接3个SO1861)，70.2kDa([M+H]+，附接了2个SO1861的BSA-SO1861)，37.0kDa([M+H]+，附接了4个SO1861的BSA-SO1861)，35.9kDa([M+H]+，附接了3个SO1861的BSA-SO1861)，34.7kDa([M+H]+，附接了2个SO1861的BSA-SO1861)。
Cy3-PAMAM
将溶解在甲醇(30mg,1.04μmol)中的720μL PAMAM放入250mL圆烧瓶中，并经由旋转蒸发仪(20mbar,60℃)除去甲醇。剩余的PAMAM溶解在9mL DMSO中。将溶于0.5mL DMSO的HATU(7.6mg,20μmol)加入到DMSO中的Cy3-COOH(0.6mg,1.2μmol)溶液中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇1小时。振摇1小时后，将HATU-Cy3溶液加入到搅拌的PAMAM溶液中，并将反应混合物在室温搅拌12小时。搅拌12小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为2kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por 6)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，经由旋转蒸发器(20mbar，60℃)减少缀合物溶液的体积，浓缩的缀合物溶液通过Sephadex G25超细尺寸排阻柱(16mL柱体积)。收集第一级分并冻干以获得粘稠的粉红色PAMAM-Cy3缀合物。PAMAM-Cy3缀合物的形成通过薄层色谱法(甲醇/水，v/v1:1)和Sephadex G 25超细柱上出现更快的条带进行色谱确认。产量21.3mg(63％)。通过紫外-可见分光光度法测定的染料/PAMAM摩尔比为0.43。
MALDI-TOF-MS(图33的A)(LP模式):m/z 28.0kDa([M+H]+,Cy3-PAMAM)。
Cy3-PAMAM-SO1861合成
Cy3-PAMAM-(SO1861)5的过程被描述为示例性的。将溶解在250μL MilliQ水中的2-亚氨基硫烷(1mg，6.7μmol)加入到PAMAM-Cy3溶液(0.5mg，17nmol)的125μL MilliQ水中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇40分钟。振摇40分钟后，将反应混合物立即通过Sephadex G25超细尺寸排阻柱(16mL柱体积)并将溶解在40μLMilliQ水中的SO1861-EMCH(176μg，85nmol)加入到收集的Cy3-PAMAM-SH级分。将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，Carl Roth)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，Cy3-PAMAM-SO1861溶液经由MWCO为3kDa的AmiconUltra 15过滤器以4000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：0.5mg(75％)。
MALDI-TOF-MS谱如图33的B至图33的D和图34中所示。Cy3-PAMAM-(SO1861)6的MALDI-TOF-MS(图33的B)(LP模式)：m/z 38.4kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-SO1861)，17.9kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-SO1861)。
Cy3-PAMAM-(SO1861)5、Cy3-PAMAM-(SO1861)13、Cy3-PAMAM-(SO1861)51和Cy3-PAMAM-(SO1861)27的合成已经由上述方法进行，但在起始材料2-亚氨基硫烷和SO1861-EMCH的进料当量上不同。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表1中突出显示。
表1.Cy3-PAMAM-SO1861合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001331
Figure BDA0003222052890001341
Cy3-PAMAM-NC-SO1861合成
Cy3-PAMAM(0.5mg,18nmol)、SO1861(2.3mg,1.24μmol)和HATU(64.6mg,170μmol)分别溶解在200μL DMSO中。将SO1861和HATU溶液在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温混合并振摇20分钟。振摇20分钟后，将Cy3-PAMAM溶液加入到振摇的SO1861-HATU溶液中，并将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，Carl Roth)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，Cy3-PAMAM-NC-SO1861溶液经由MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17缀合物作为溶液储存在冰箱中，并取等分试样进行分析。产量：0.77mg(69％)。
MALDI-TOF-MS(图35)(LP模式)：m/z 62.3kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)，35.7kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)。
G4-树枝化基元染料标记和脱保护
PFd-G4-叠氮化物-NH-BOC(G4-树枝化基元)(9.75mg,2.11μmol)放入2mL反应管(Eppendorf)并溶解在200μL DMSO中。将100μL Cy5-DBCO的DMSO溶液(1.72μmol*mL-1,170nmol)加入到G4-树枝化基元溶液中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上在室温和800rpm下振摇12小时。振摇12小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por 7)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，将溶液冻干，得到蓝色粉末。将冻干所得的粗产物用于脱保护步骤。
将部分Cy5标记的冻干G4-树枝化基元溶解在50mL带有搅拌器的圆烧瓶中的12mLCHCl3中。加入12mL TFA并将反应混合物在RCT B磁力搅拌器(IKA Labortechnik)上以800rpm和室温搅拌3小时。搅拌3小时后，在旋转蒸发器(Heidolph WB 2000)上减压(50℃,30mbar)除去溶剂。蒸发后，将批次溶解在MilliQ水中并通过PD10尺寸排阻柱。G4-树枝化基元缀合物的形成通过薄层色谱法(甲醇/水，v/v 1:1)和PD10柱上出现更快的条带进行色谱确认。将所得的尺寸排阻色谱级分冻干，得到蓝色粉末。
产量5.7mg(93％)。通过紫外-可见分光光度法测定的染料/G4-树枝化基元摩尔比为0.012。
MALDI-TOF-MS(图32的B)(RP模式)：m/z 3956Da([M+Na]+，Cy5-G4-树枝化基元+PF6-反离子)，3820Da([M+Na]+，Cy5-G4-树枝化基元-PF6-抗衡离子)，3617Da([M+H]+，G4-树枝化基元杂质)，3017([M+H]+，G4-树枝化基元)。
G4-树枝化基元-SO1861合成
对于最低的G4-树枝化基元与SO1861-EMCH的比率，过程被描述为示例性的。将溶解在300μL MilliQ水中的2-亚氨基硫烷(2.65mg，19.2μmol)加入到在252μL MilliQ水中的部分Cy5标记的G4-树枝化基元溶液(0.577mg，192nmol)中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇40分钟。振摇40分钟后，将反应混合物立即通过PD10尺寸排阻柱，并将溶解在100μL MilliQ水中的SO1861-EMCH(1.19mg，575nmol)加入到收集的G4-树枝化基元-SH级分中。将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，使用Amicon Ultra离心过滤器(3kDa MWCO)经由离心过滤浓缩反应混合物。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：90nmol(47％)。
MALDI-TOF-MS谱如在图33中所示。G4-树枝化基元-SO1861的MALDI-TOF-MS(图33的C)(LP模式)：m/z 10.19kDa([M+H]+，Cy5-G4-树枝化基元-[SO1861]3),9.27kDa([M+H]+,G4-树枝化基元-[SO1861]3),7.92kDa([M+H]+,Cy5-G4-树枝化基元-[SO1861]2),7.14kDa([M+H]+,G4-树枝化基元-[SO1861]2),5.86kDa([M+H]+,Cy5-G4-树枝化基元-[SO1861]1),5.07kDa([M+H]+,G4-树枝化基元-[SO1861]1)。
其他G4-树枝化基元-(SO1861)n缀合物的合成已经由上述方法进行，但在起始材料SO1861-EMCH的进料当量上不同。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表2中突出显示。
表2.G4-树枝化基元-SO1861合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001361
PAMAM硫醇化
过程被描述为最高PAMAM与2-亚氨基硫烷比率的示例。向溶解在30μL甲醇中的PAMAM(333μg，12.8nmol)溶液中加入溶解在128μL MilliQ水中的2-亚氨基硫烷(0.53mg，3.84μmol)。将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，使用Amicon Ultra离心过滤器(3kDa MWCO)在15℃和13500rpm下经由离心过滤将反应混合物用MilliQ水洗涤4次。洗涤后将样品冻干以获得白色固体。产量未确定。
MALDI-TOF-MS谱如在图51中所示。PAMAM-(SH)108的MALDI-TOF-MS(图51的C)(LP模式)：m/z 41.5kDa([M+H]+，PAMAM-[SH]108)。
其他PAMAM-亚氨基硫烷缀合物的合成已经由上述方法进行，但在起始材料2-亚氨基硫烷的进料当量上不同。对于最低的2-亚氨基硫烷进料反应，已使用Cy3-PAMAM。
起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表3中突出显示。
表3.PAMAM-SH合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001371
PAMAM聚乙二醇化
对于最低的PAMAM与mPEG2k的比率，过程被描述为示例性的。向溶解在10μL DMSO中的PAMAM(333μg,12.8nmol)溶液中加入溶解在13μL DMSO中的mPEG2k-NHS(0.268mg,128nmol)。将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为2kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por 6)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，使用Amicon Ultra 15mL离心过滤器(10kDa MWCO)经由离心过滤将批次浓缩。浓缩的批次通过PD10尺寸排阻柱，然后冷冻干燥以获得白色蓬松粉末。产量未确定。
MALDI-TOF-MS谱如在图52中所示。PAMAM-(mPEG2k)3的MALDI-TOF-MS(图52的C)(LP模式)：m/z 33.46kDa([M+H]+，PAMAM-[mPEG2k]3)。
其他PAMAM-mPEG2k缀合物的合成已经由上述方法进行，但在起始材料mPEG2k-NHS的进料当量上不同。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表4中突出显示。
表4.PAMAM-mPEG2k合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001372
Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO合成
Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10的过程被描述为示例性的。将Cy3-PAMAM-(SO1861)27(0.41mg,4.71nmol)冷冻并溶解在100μL DMSO中。将溶解在DMSO中的DBCO-PEG13-NHS酯(0.197mg,188nmol)加入到Cy3-PAMAM-SO1861溶液中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇。振摇3小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，Carl Roth)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO溶液经由MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：0.1mg(22％)。
MALDI-TOF-MS(图36的D)(LP模式)：m/z 92.5kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO)，53.0kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO)。
Cy3-PAMAM-(SO1861)5-(DBCO)38和Cy3-PAMAM-(SO1861)27-(DBCO)10的合成已经由上述方法进行。起始材料的相应进料当量和缀合物的相应质量在表5中突出显示。
表5.Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001381
Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO合成
将Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17(0.3mg,4.8nmol)冷冻并溶解在100μL DMSO中。将溶解在DMSO中的DBCO-PEG13-NHS酯(0.202mg,194nmol)加入到Cy3-PAMAM-NC-SO1861溶液中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇。振摇3小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，Carl Roth)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO溶液经由MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：0.1mg(22％)。质谱表明每个PAMAM分子有30个DBCO部分的缀合。
MALDI-TOF-MS(图36的B)(LP模式)：m/z 93.2kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO)，49.6kDa([M+H]2+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO)。
EGF石竹素和石竹素表达
质粒-DNA(His-石竹素-EGF-pET11d或His-石竹素-pET11d)[20]被转化到具有化学活性的大肠杆菌NiCo21(DE3)(New England
Figure BDA0003222052890001391
Inc.)中并在3mL溶菌肉汤中在37℃下以200rpm生长5小时辅以50μg/mL氨苄青霉素。这些细菌用于接种500mL溶菌肉汤，辅以50μg/mL氨苄青霉素，在37℃下过夜培养。随后，培养体积扩大到2L，细菌生长直到光密度(A600)为0.9。通过加入终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达。细胞在37℃和200rpm下进一步生长3小时。离心(5分钟，5,000g，4℃)后，将细胞沉淀重新悬浮在20mL磷酸盐缓冲盐水(含Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4)中，并在–20℃下储存。解冻后，通过超声波设备(Branson Sonifier 250，G.Heinemann)释放蛋白质。将溶液离心(15,800×g，30分钟，4℃)并调节至20mM咪唑浓度。该构建体含有N-端His-标签，并通过镍氮基三乙酸色谱法(Ni-NTA Agarose,Qiagen,Hilden,Germany)纯化。用咪唑(20-250mM)洗脱后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(12％)分析洗脱液。在4℃下用2L几丁质结合结构域缓冲液(20mM三(羟甲基)-氨基甲烷/HCl、500mM NaCl、1mM EDTA、0.1％Tween-20，pH 8.0)透析含有石竹素-EGF或石竹素的级分。通过几丁质柱亲和层析进一步纯化用于除去对Ni-NTA琼脂糖具有结合活性的细菌蛋白质。用几丁质结合结构域缓冲液洗脱后，通过SDS-PAGE(12％)分析级分。在4℃下用5L PBS透析含有石竹素-EGF或石竹素的级分。通过Amicon离心过滤设备(10kDa，Millipore，Eschborn，Germany)浓缩纯化的蛋白质。通过二辛可宁酸测定(Pierce，Rockford，USA)测定蛋白质浓度。
石竹素-EGF-Alexa488合成
将PBS中的石竹素-EGF(240μg，6.7nmol)溶液放入MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器中，并在4,000rpm和4℃下离心30分钟3次。每个循环后，Amicon过滤器重新填充pH 9的0.1M碳酸钠缓冲液。第三次离心循环后，经由离心将体积减少至0.5mL。将石竹素-EGF碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶解在10μL DMSO中的Alexa FluorTM488 5-TFP(50μg，56nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇80分钟。振摇后，将混合物通过Sephadex G25 M尺寸排阻柱(GE Healthcare，PD10柱)。将石竹素-EGF-Alexa488缀合物储存在冰箱中pH 9的0.1M碳酸钠缓冲液溶液中，并取等分试样进行分析。产量：210μg(85％)。
MALDI-TOF-MS(图37的D)(LP模式)：m/z 36.8kDa([M+H]+，石竹素-EGF-Alexa488)，m/z 33.6kDa([M+H]+、石竹素-EGF-Alexa488)、18.8kDa([M+H]2+、石竹素-EGF-Alexa488)、16.6kDa([M+H]2+、石竹素-EGF-Alexa488)。
石竹素-Alexa488合成
将PBS中的石竹素(184μg，6.2nmol)溶液放入MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器中，并在4,000rpm和4℃下离心30分钟3次。每个循环后，Amicon过滤器重新填充pH 9的0.1M碳酸钠缓冲液。第三次离心循环后，经由离心将体积减少至0.5mL。将石竹素碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶解在3.5μL DMSO中的Alexa FluorTM488 5-TFP(16.7μg，19nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇80分钟。振摇后，将混合物通过Sephadex G25 M尺寸排阻柱(GE Healthcare，PD10柱)。将石竹素-Alexa488缀合物储存在冰箱中pH 9的0.1M碳酸钠缓冲液溶液中，并取等分试样进行分析。产量：未确定。
MALDI-TOF-MS(图38的D)(LP模式)：m/z 30.7kDa([M+H]+，石竹素-Alexa488)。
石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3,以及石竹素-EGF-Alexa488-PEG12-N3合成
石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3的过程被描述为示例性的。将石竹素-EGF-Alexa488(70μg，1.9nmol)碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶于9μL DMSO的叠氮基-PEG3-S-S-NHS(120μg，272nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和15℃振摇12小时。振摇后，将反应混合物用PBS稀释，并通过使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器在4,000rpm和4℃下经由离心过滤用PBS洗涤。
产量：54μg(70％)。
MALDI-TOF-MS(图37的E)(LP模式)：m/z 40.8kDa([M+H]+、石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3)，m/z 37.5kDa([M+H]+、石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3)。
石竹素-EGF-Alexa488-S-S-PEG-N3和石竹素-EGF-Alexa488-PEG12-N3的合成已经由上述方法进行，但所使用的叠氮基-PEG连接子有所不同。在表6中突出显示了相应的叠氮基-PEG连接子、它们的进料当量和相应的缀合物质量。
表6.石竹素-EGF-Alexa488-PEG-N3合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001411
石竹素-Alexa488-S-S-PEG-N3
将石竹素-Alexa488(24.5μg，0.8nmol)碳酸钠溶液放入2mL反应管中，并将溶于9μL DMSO的叠氮基-PEG3-S-S-NHS(34μg，78nmol)加入蛋白质溶液中。将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和15℃振摇12小时。振摇后，将反应混合物用PBS稀释，并通过使用MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器在4,000rpm和4℃下经由离心过滤用PBS洗涤。
产量：10.3μg(39％)。
MALDI-TOF-MS(图38的E)(LP模式)：m/z 32.9kDa([M+H]+，石竹素-Alexa488-S-S-PEG-N3)。
Cy3-PAMAM-皂苷-毒素缀合物合成
Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO的过程被描述为示例性的。将MilliQ水中的Cy3-PAMAM-(SO1861)27-DBCO(17μg，0.184nmol)溶液与在1.5mL反应管中的PBS中的石竹素-EGF-Alexa488-SS-PEG3-N3(3.6μg，0.089nmol)溶液混合，并将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和15℃振摇2小时。振摇后，取出小等分试样，在Molecular
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VersaDocTMMP 4000成像系统(Bio-Rad)上经由SDS-PAGE和荧光成像进行分析(图39)。
Cy3-PAMAM-(SO1861)5-S-S-石竹素-EGF-Alexa488、Cy3-PAMAM-(SO1861)27-S-S-石竹素-EGF-Alexa488、Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-石竹素-EGF-Alexa488、Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-S-S-石竹素-Alexa488和Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)17-石竹素-EGF-Alexa488的合成已经由上述方法进行，但在使用的PAMAM-皂苷-DBCO批次、使用的叠氮基毒素批次及其进料当量方面有所不同。起始材料的相应进料当量在表7中突出显示。
表7.Cy3-PAMAM-皂苷-毒素合成的反应参数
Figure BDA0003222052890001421
经由还原胺化合成Cy3-PAMAM-NC-SO1861
将Cy3-PAMAM(0.19mg，13nmol)和SO1861(0.73mg，0.39μmol)分别溶解在200μL0.1M醋酸盐缓冲液中，pH为5。将SO1861和Cy3-PAMAM溶液混合并在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇20分钟。振摇20分钟后，将NaCNBH3(5mg，81μmol)加入到振摇反应溶液中，并将反应混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温振摇12小时。振摇12小时后，将反应混合物用MilliQ水稀释，并使用MWCO为12-14kDa的再生纤维素膜管(ZelluTrans，Carl Roth)对MilliQ水彻底透析24小时。透析后，Cy3-PAMAM-NC-SO1861溶液经由MWCO为3kDa的Amicon Ultra 15过滤器以4,000rpm(15℃)使用离心过滤浓缩。将缀合物作为溶液储存在冰箱中并取出等分试样用于分析。产量：未确定。
MALDI-TOF-MS(图40的B、图40的C)(LP模式)：m/z 88.7kDa([M+H]+，Cy3-PAMAM-NC-SO1861)，49.2kDa([M+H]2+、Cy3-PAMAM-NC-SO1861)。
Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)30和Cy3-PAMAM-NC-(SO1861)10的合成已经由上述方法进行，但在将还原剂NaCNBH3加入到反应批次之后的时间不同。NaCNBH3加入的相应时间和缀合物的相应质量在表8中突出显示。
表8.经由还原胺化合成Cy3-PAMAM-NC-SO1861的反应参数。
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聚(SO1861)合成
SO1861-EMCH(0.13mg，63nmol)溶解在30μL脱气MilliQ水中。将溶解在4μL脱气MilliQ水中的APS(0.2μg，0.8nmol)加入到SO1861-EMCH溶液中，并将该溶液置于ThermoMixer C(Eppendorf)中，温度为60℃。然后，将TMEDA(cat，0.5μL)加入到混合物中，并将混合物在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和60℃振摇2小时。2小时后，取出小等分试样用于经由质谱分析。
MALDI-TOF-MS(图42的C)(LP模式)：m/z 18.2kDa([M+H]+、聚(SO1861)9)、16.0kDa([M+H]+、聚(SO1861)8)、14.2kDa([M+H]+、聚(SO1861)7)、12.2kDa([M+H]+、聚(SO1861)6)、10.2kDa([M+H]+、聚(SO1861)5)、8.2kDa([M+H]+、聚(SO1861)4)、6.2kDa([M+H]+、聚(SO1861)3)。
SO1861-EMCH肽偶联
将序列为SESDDAMFCDAMDESDSK(0.6mg,0.3μmol)和SO1861-EMCH(0.8mg,0.39μmol)的定制肽分别溶解在200μL PBS中。SO1861-EMCH和肽溶液在ThermoMixer C(Eppendorf)上以800rpm和室温混合并振摇12小时。振摇后取出小等分试样进行分析。产量：未确定。
MALDI-TOF-MS(图45的B)(RN模式)：m/z 4.05kDa([M+H]-、肽-SO1861)、3.92kDa([M+H]-、肽-SO1730)、1.98kDa([M+H]-、肽)、1.86kDa([M+H]-、SO1861)。
结果
考虑到可用于与SO1861分子发生缀合反应的化学基团，已经确定了四个化学基团。糖残基的醇和二醇、三萜骨架上的醛基、糖残基之一(葡糖醛酸)上的羧酸以及三萜骨架上的烯烃基团，如在图24中突出显示的。
鉴于每个确定的化学基团的优缺点(表9)，醛基和醇基最适合可逆缀合反应，而烯烃和羧酸(葡糖醛酸)是最适合不可逆/稳定缀合反应的基团。然而，SO1861分子结构中的醛基最适合醇类的可逆缀合反应。一方面，因为结构中只有一种醛可以进行化学选择性反应。另一方面，因为醛可以与各种化学基团(诸如胺、酰肼和羟胺)进行可逆缀合反应，形成酸可裂解的部分，如亚胺、腙和肟。这个因素使得可以自由选择所需的可逆缀合反应的化学基团。相反，醇类也是经由形成缩醛和缩酮进行可逆缀合反应的良好候选者，但缺乏化学选择性，因为它们大量存在于糖苷结构上。
对于不可逆和稳定键的形成，羧酸是最合适的，因为它可以用肽化学中使用的常用工具形成酰胺和酯(例如，经由碳二亚胺介导的酰胺形成与胺反应)。
表9.可用于皂苷缀合反应的功能基团
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因此，为了研发增强内体逃逸的皂苷(例如SO1861)，已经建立了一种方法，该方法允许使用SO1861上存在的最合适的化学基团生成不可裂解和可裂解的“即用缀合”皂苷(图25)。
为了制备不可裂解的“即用缀合”皂苷，SO1861的羧基经由肽偶联化学中使用的试剂活化以生成活性酯(例如1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐，HATU)。所得SO1861的活性酯能够与胺反应形成稳定的酰胺键合缀合物(图25的A)。
为了制备可裂解的“准备缀合”皂苷，SO1861的醛基与EMCH(ε-马来酰亚胺己酸酰肼)连接子反应。EMCH的酰肼基团与SO1861的醛形成酸可裂解的腙键。同时，EMCH连接子呈现具有硫醇(巯基)反应性的马来酰亚胺基团，因此可与硫醇缀合(图25的B)。
SO1861-EMCH的马来酰亚胺基团在6.5-7.5的pH进行时，会与硫醇和带有硫醇的聚合结构发生快速且特异性的迈克尔加成反应(图25的B)。此外，SO1861和EMCH之间的酸敏感腙键可用于在酸性环境中从支架中释放皂苷(图26)。因此，EMCH连接子满足了对pH可裂解策略和与聚合结构的缀合策略的需要。
关于与聚合结构缀合的理想EMCH间隔长度，计算机模拟(PerkinElmer,ChemBio3D,Ver.13.0.0.3015)显示SO1861-EMCH上的马来酰亚胺基团位于分子的外围，因此应该可用于含硫醇的聚合结构(图27)。
为了合成SO1861-EMCH，已研发出一种策略，允许将SO1861上的醛基转化为EMCH(图28的A)。SO1861-EMCH缀合物被分离出来并经由核磁共振光谱(参见材料和方法部分，图22的B)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)成功表征，如在图28的B和图28的C，以及图23的A中所示。
为了测试腙键的pH依赖性水解，将SO1861-EMCH溶解在pH为3的HCl溶液中，并在两个不同的时间点记录MALDI-TOF-MS谱(图29)。如在图29的A和图29的B中所示，在图29的B中可以看到对应于SO1861-EMCH的m/z 2070Da峰的明显下降趋势。由于SO1861是在水解过程中生成的，因此记录到在m/z 1861Da处的峰增加，伴随着在m/z 2070Da处的下降趋势。这些结果表明腙键对水解反应灵敏，即使它附接在SO1861上也会被裂解。
为了将SO1861-EMCH与聚合结构缀合，聚合结构的可访问胺在试剂2-亚氨基硫醇的帮助下转化为硫醇。聚合结构上生成的游离硫醇然后作为硫醇-烯迈克尔型加成到SO1861-EMCH的马来酰亚胺基团的亲核试剂(图30)。这种研发的方法适用于SO1861-EMCH与任何可获得的获得可访问胺基团的聚合结构的缀合，并允许进一步根据聚合结构分别控制缀合SO1861分子的数量。
通过使用蛋白质的胺(多氨基酸支架示例)、牛血清白蛋白(BSA)，获得了“即用型缀合皂苷”与聚合结构缀合的概念的第一个证明。缀合后，质谱在m/z～70、～72和～74kDa处获得BSA-SO1861的相应峰(图31的A)。与m/z 66kDa的BSA检测质量相比(图31的B)，获得的BSA-SO1861质量对应于BSA-SO1861缀合物的混合物，每个BSA由2个、3个和4个SO1861分子组成。
通过使用含胺的第5代(G5)树枝状聚合物聚(酰胺胺)(PAMAM与共价偶联红色荧光染料(Cy3))，获得了“即用型缀合皂苷”与聚合结构缀合的概念的下一个证据。PAMAM-Cy3用作与SO1861-EMCH和SO1861-HATU缀合的聚合结构，并用作SO1861与聚合结构缀合的模型(图32)。
Cy3-PAMAM的所有可访问胺基团都使用3倍过量的2-亚氨基硫戊环/Cy3-PAMAM胺转化为硫醇，然后与SO1861-EMCH反应。三个不同的进料当量(5、20和57)的SO1861-EMCH用于三个反应批次。反应后，Cy3-PAMAM-SO1861缀合物在MALDI-TOF-MS上记录的质量显示相应质量随着SO1861-EMCH进料的增加而增加(图33)。三种不同的进料对应于Cy3-PAMAM-SO1861缀合物获得的m/z 38.4kDa、m/z 53.9kDa和m/z 133.8kDa的质量，对应于每个PAMAM树枝状聚合物附接的6个、13个和51个SO1861分子，如在图33的B至图33的D中所示。
在另一个反应中，只有一定数量的PAMAM胺在与SO1861-EMCH反应之前转化为硫醇。这里，分别使用了两种不同的2-亚氨基硫烷进料当量(8和32)和两种不同的SO1861-EMCH进料当量(5和30)。反应后，Cy3-PAMAM-SO1861缀合物在MALDI-TOF-MS上的各自光谱显示在m/z 37.7kDa(SO1861-EMCH的5个进料当量)和m/z 87.0kDa(SO1861-EMCH的30个进料当量)处的峰如在图34中所示。在m/z 37.7kDa和m/z 87.0kDa处获得的质量对应于Cy3-PAMAM-SO1861缀合物，其中附接了5个和30个SO1861分子，并证明使用这种方法几乎所有的SO1861-EMCH进料都被缀合。
为了生成不可pH裂解的皂苷缀合物，SO1861的羧酸用HATU活化，然后与Cy3-PAMAM的胺反应，形成结合在Cy3-PAMAM和SO1861之间的pH稳定酰胺。经由MALDI-TOF-MS检测得到的缀合物的质量，质量为m/z 62.3kDa，对应于Cy3-PAMAM-NC-SO1861(NC＝不可裂解)缀合物，每个PAMAM附接有17.5个SO1861分子(图32的B，图35)。
接下来，经由所谓的菌株促进的炔烃-叠氮化物环加成(SPAAC，点击化学)皂苷缀合的支架缀合到连接点，以便可能与靶向治疗剂(例如靶向毒素)缀合以获得功能化支架。对于该反应，将Cy3-PAMAM-SO1861(图36的C、D)和Cy3-PAMAM-NC-SO1861(图36的B)与异双功能NHS-PEG13-DBCO连接子缀合，该连接子在缀合物表面生成菌株炔(图36的A)。连接子的NHS(N羟基琥珀酰亚胺)部分与PAMAM-皂苷缀合物的剩余胺反应，在支架和连接子之间形成酰胺键。在缀合物上得到的DBCO(二苯并环辛炔)部分能够与相应的叠氮化物对靶向治疗进行SPAAC。
石竹素-EGF作为模型靶向毒素，而石竹素作为非靶向毒素。两种毒素均使用AlexaFluorTM488染料的四氟苯酯(TFP)衍生物进行标记。然后将染料标记的蛋白质与异双功能NHS-SS-PEG3-叠氮化物连接子缀合，以获得SPAAC与PAMAM-皂苷缀合物的相应化学部分。Maldi-TOF-MS测量结果表明，每个石竹素-EGF分子都附接了一个Alexa FluorTM488染料和9个NHS-SS-PEG3-叠氮化物分子(图37、图38)。此外，Alexa FluorTM488标记的石竹素-EGF与缺乏二硫键的异双功能NHS-PEG12-叠氮化物连接子缀合，并因此会生成不可毒素裂解的构建体。
Cy3-PAMAM-NC-SO1861-DBCO和Cy3-PAMAM-SO1861-DBCO缀合物与AlexaFluorTM488标记的叠氮基毒素反应以进行菌株促进的炔烃-叠氮环加成反应。经由凝胶电泳和仅附着在PAMAM聚合物上的Cy3的荧光信号的共定位和仅附着在聚丙烯酰胺凝胶上的毒素上的Alexa FluorTM488来指示反应试剂之间的缀合(凝胶电泳后)(图39)。
作为PAMAM树枝状聚合物的替代聚合结构，具有16个功能性氨基端基团和焦点处的叠氮基的G4-树枝化基元(PFd-G4-叠氮-NH-BOC，Polymer Factory)用于与SO1861的缀合(图46)。使用树枝化基元而不是树枝状聚合物的优势在于树枝化基元结构所展示的焦点。该焦点允许直接缀合到靶向毒素，而无需使用正交点击功能对其进行后修饰(图47)。如在图47中所示，树枝化基元经历了与PAMAM树枝状聚合物所述相同的方法。简言之，在部分染料标记和脱保护后(图48)，使用硫醇化试剂2-亚氨基硫烷将树枝化基元的氨基转化为硫醇，然后与SO1861-EMCH缀合。对于与SO1861-EMCH的缀合，使用了SO1861-EMCH的三种不同进料当量。树枝化基元-SO1861缀合物经由MALDI-TOF-MS进行分析。正如预期的那样，当使用3和10的低SO1861-EMCH进料当量时，获得了每个树枝化基元分子1个和2个SO1861分子的缀合种类(图49的B、图49的C)。当使用每个树枝化基元分子22个SO1861-EMCH分子的进料当量时，获得了每个树枝化基元分子高达9个SO1861分子的更高的树枝化基元-SO1861缀合种类(图49的A)。在进一步的实验中，皂苷功能化的树枝化基元将在其焦点上与靶向毒素缀合，以产生功能化的支架，并将进行生物学评估。
前面的示例表明，已经研发出一种方法，该方法允许将确定量的SO1861分子或其他内体逃逸增强剂分子与聚合结构缀合，以增强治疗物质(诸如靶向毒素)的细胞质递送。
为了进一步测试SO1861与聚合结构的其他缀合方法，使用了还原胺化途径。为此，SO1861的醛基直接与PAMAM胺缀合，形成亚胺键。通过添加还原剂氰基硼氢化钠在SO1861和PAMAM之间形成pH稳定的胺键，在亚胺键形成之后进行还原胺化步骤(图40的A)。类似于EMCH和HATU方法，该方法允许控制每个聚合物的缀合皂苷数量，如图40的B、图40的C所示。这里，产生了PAMAM-皂苷缀合物，每个PAMAM获得了10个(图40的B)和30个(图40的C)SO1861分子。
在所讨论的聚合物和蛋白质方法中研发SO1861支架的另一种方法是聚(SO1861)方法。这种方法的想法是生成仅由SO1861分子组成的聚合物，具有释放SO1861的pH敏感可裂解键。此外，聚(SO1861)应该能够对毒素和生物聚合物进行缀合反应。这种方法的主要目标是使其尽可能简单和具有成本效益。由于已经研发了生成酸可裂解SO1861的方案(SO1861-EMCH方法)，看看是否有可能通过简单地加入聚合引发剂来聚合SO1861-EMCH，而无需进一步修饰SO1861或识别SO1861分子上的其他聚合位点，这将会很有趣。过去，有几篇论文讨论了通过使用自由基引发剂来聚合马来酰亚胺基团，这些引发剂会攻击马来酰亚胺基团的双键，从而沿着马来酰亚胺基团的双键引发自由基聚合(29-31)。由于SO1861-EMCH在其结构中显示了一个马来酰亚胺基团，该基团可能被探索用于自由基聚合反应，以生成具有酸裂解功能的聚(SO1861)。如果聚合反应具有合理的反应时间，则生成的SO1861聚合物可以用自由基淬灭剂淬灭，自由基淬灭剂不仅可以淬灭反应，还可以生成用于毒素或生物聚合物缀合的官能团。这种反应方案如在图41中所示。这里，过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)的系统以示例方式显示为自由基生成剂，氨基丙硫醇用作模型自由基猝灭剂。使用氨基丙硫醇作为猝灭剂示例，可以将生成的胺基团具体地进一步修饰为可点击的基团或用于将聚(SO1861)直接缀合到毒素上。
在自由基聚合中，反应条件对聚合物特性和反应结果有巨大影响。例如，温度、单体浓度和引发剂浓度对形成聚合物起着主要作用，并且必须根据所需的聚合物特性进行微调。由于自由基聚合通常在50℃以上的温度进行，因此第一个反应是在60℃的温度下进行的。看看SO1861-EMCH聚合是否可以被自发引发以及APS和TMEDA是否会对聚合度产生影响，这很有趣。因此，使用相同的SO1861-EMCH浓度进行了三个反应，但它们的APS/TMEDA组成不同。在第一个反应中，仅将SO1861-EMCH加热至60℃并保持3小时，而第二个反应包含SO1861-EMCH和APS，第三个反应包含SO1861-EMCH、APS和TMEDA。(对于这些实验，使用了相同数量和浓度的起始材料，这些起始材料在材料和方法部分“聚(SO1861)合成”中提到)。如图42的A至图42的C所示，已经由MALDI-TOF-MS分析了批次。有趣的是，已经表明SO1861-EMCH在加热到60℃时开始自发形成由2个、3个、4个、5个和6个SO1861分子组成的寡聚物(图42的A)。在相同温度下加入11-3当量APS对这一趋势没有影响(图42的B)。然而，当使用APS/TMEDA的引发剂系统时，最多可以检测到9个SO1861分子的SO1861寡聚物，其分子量为18.2kDa(图42的C)。此外，与图42的A和图42的B中的峰相比，获得的寡聚物的峰似乎要大得多，表明该反应消耗了更高的SO1861-EMCH。
为了进一步微调反应条件，将测试其他引发剂，诸如偶氮引发剂，如2,2'-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]和偶氮双异丁腈，以及其他聚合技术，诸如对照自由基聚合(原子转移自由基聚合、可逆加成-断裂链转移等)。此外，可以考虑另一种酰肼连接子作为EMCH的替代物，其获得比马来酰亚胺基团更适合自由基聚合的官能团(诸如丙烯酸或丙烯醇残基)。
另一种研发SO1861支架的方法是DNA方法。这种方法的想法是利用所谓的DNA折纸的概念(Kolb等人，2004；Bird等人，1988)。DNA折纸作为聚合或组装的聚合结构将皂苷与其缀合，可以提供几个固有的优势，包括稳定性、可扩展性以及对所得DNA皂苷支架的最终尺寸和形状的精确控制。由于这些DNA纳米载体由天然DNA组成，因此它们具有生物相容性，对活细胞没有毒性，并且可以减轻货物从内部细胞隔室中的释放。这种结构的多价性可以进一步允许微调靶向能力和各种有效载荷(诸如荧光团和毒素)的高容量。因此，在这种方法中，鉴定出分别在3'和5'末端提供化学官能团的DNA链，并且只能在序列的某些所需区域进行杂交，从而可以控制构建体的最终形状。化学基团应用于偶联皂苷，例如通过已经研发的SO1861-EMCH与3'和5'DNA链之一上的硫醇基团之间的硫醇-烯反应。互补的DNA链可以提供一个点击功能组，其可用于与靶向毒素偶联。该概念如在图43中所示。
通过使用特定的肽序列而不是能够结合和释放皂苷并且可以被聚合形成大的聚(肽)样结构的DNA链，可以想象类似的方法。在这种方法中，已鉴定并购买了长度与SO1861-EMCH分子的计算大小相符的肽序列，在序列中间提供半胱氨酸残基，并在N-端和C端都获得一个胺基团。半胱氨酸残基可用于经由SO1861-EMCH的马来酰亚胺基团和半胱氨酸残基的硫醇基团的硫醇-烯反应缀合SO1861-EMCH。两个胺基团可用于聚合肽-SO1861缀合物与合适的交联剂，如在图44所示。
缀合研究表明SO1861-EMCH与定制肽(序列：SESDDAMFCDAMDESDSK)的缀合是成功的。经由MALDI-TOF-MS分析在序列中间带有马来酰亚胺反应性半胱氨酸的肽及其与SO1861-EMCH的缀合(图45)。MALDI-TOF-MS谱显示了肽-SO1861缀合物的预期峰在m/z4053Da处和一个额外的峰在m/z 3821Da处，它是SO1730的相应皂苷-EMCH的肽-SO1861缀合物。由于SO1861-EMCH已略微过量使用(1.3当量)并且反应后未检测到SO1861-EMCH峰，因此可以假设缀合是定量的。为了开始肽-SO1861的第一次聚合反应，酒石酸二琥珀酰亚胺酯将用作胺反应性交联剂。
实施例4
细胞活力测定
将HeLa细胞以5,000c/w接种于96孔板中，在辅以10％胎牛血清(PAN-BiotechGmbH)和1％青霉素/链霉素(PAN-Biotech GmbH)的DMEM(PAN-Biotech GmbH)中，浓度为100μL/孔，并在37℃和5％CO2下培养过夜。第二天，在DMEM中制备PAMAM、PAMAM-缀合物、G4-树枝化基元(在示例3中制备)或氯喹(Sigma Aldrich)样品的20倍浓缩储备液。从细胞培养板中取出培养基，以160μL培养基代替，然后加入10μL样品/孔(来自20倍浓缩储备液)，并在37℃培养45分钟。在此培养期间，制备了SO1861浓度曲线。SO1861主料在50℃加热10分钟，同时以1,250rpm振摇。随后进行15秒的超声处理，并在50℃下短暂重新加热1分钟，同时以1,250rpm的速度振摇。随后在PBS中制备SO1861的系列稀释液。SO1861浓度曲线制备为10倍浓缩储备液，每孔加入20μL。在37℃下培养15分钟后，每孔加入在DMEM中稀释至30pM的10μL石竹素-EGF(在示例2中制备)或含有等量PBS的DMEM，以获得1.5pM的最终石竹素-EGF浓度以及指定的SO1861和不同的聚合结构或氯喹浓度，最终体积为200μL/孔。
处理后，细胞在37℃下培养72小时，然后根据制造商的说明(CellTiter
Figure BDA0003222052890001521
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega)通过MTS测定确定细胞活力。简言之，将MTS溶液在补充有10％FBS的不含酚红的DMEM(PAN-Biotech GmbH)中稀释20倍。细胞用200μL/PBS孔洗一次，然后每孔加入100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下培养约20-30分钟。随后，在Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪(Thermo Scientific)上测量在492nm处的OD。为了量化，在计算处理/未处理细胞的细胞活力百分比之前，从所有其他孔中减去“仅培养基”孔的背景信号，方法是将处理孔的背景校正信号除以未处理孔的背景校正信号(×100)。
FACS分析
将HeLa细胞以500,000c/板的速度接种在辅以10％胎牛血清(PAN-Biotech GmbH)和1％青霉素/链霉素(PAN-Biotech GmbH)的DMEM(PAN-Biotech GmbH)中，在10cm培养皿中培养48小时(5％CO2，37℃)，直至达到90％的汇合度。接下来，细胞被胰蛋白酶消化(TryplEExpress，Gibco Thermo Scientific)成单细胞。将0.75x 106细胞转移到15mL falcon管中并离心(1,400rpm，3分钟)。弃去上清液，同时让细胞沉淀浸没。通过在涡旋振荡器上轻轻敲击falcon管使沉淀分离，并用4mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤细胞。洗涤后，将细胞重新悬浮在3mL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中，并在3个圆底FACS管(1mL/管)上等分。细胞再次离心并重新悬浮于200μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)或200μL抗体溶液中；在195μL冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)中含有5μL抗体。APC小鼠IgG1，κ同种型Ctrl FC(#400122，Biolegend)用作同种型对照，APC抗人EGFR(#352906，Biolegend)用于染色EGFR受体。样品在管辊混合器上在4℃下培养30分钟。然后，将细胞用冷PBS(不含Mg2+和Ca2+，2％FBS)洗涤3次，并在室温下使用PBS中的2％PFA溶液固定20分钟。细胞用冷PBS洗涤2次，并重新悬浮在250-350μL冷PBS中用于FACS分析。用BD FACSCanto II流式细胞术系统(BDBiosciences)和FlowJo软件分析样品。
结果
之前已经描述了含胺的聚合结构(诸如PAMAM和PEI(聚乙烯亚胺))中的氨基能够经由其固有的H+缓冲能力阻止核内体的酸化。由于SO1861的内体逃逸增强特性仅在低核内体pH值(<pH5)下暴露，因此支架或功能化支架不应含有能够干扰内体酸化从而阻断SO1861活性的化学基团。
测试了G5 PAMAM(128个伯胺以及大约126个叔胺)和G4-树枝化基元(16个伯胺)的含胺聚合结构，以确定这些分子是否抑制SO1861的内体逃逸增强能力。在HeLa细胞上进行PAMAM(天然或硫醇化)或树枝化基元(天然)结合石竹素-EGF和各种SO1861浓度的联合给药实验。使用氯喹作为抑制内体酸化的对照。
HeLa细胞显示出足够的EGFR细胞表面水平(图50的A)。据观察，“天然”PAMAM和氯喹均抑制SO1861介导的靶向毒素的内体逃逸以及Hela细胞中随后的细胞杀伤(图50的B)。500nM的PAMAM抑制甚至与内体酸化抑制剂氯喹同等程度，而667nM的树枝化基元根本没有效果。为了进一步解决“天然”PAMAM的抑制活性是否是由于PAMAM中氨基的可用性，PAMAM的伯氨基通过与2-亚氨基硫烷反应而部分硫醇化(图51)，导致128个中的16个(图51的C)、65/128个(图51的D)和108/128个(图51的E)阻断伯胺。据观察，65个和108个伯胺的硫醇化克服了SO1861介导的内体逃逸的抑制，而多达16个胺基团的硫醇化仍显示出SO1861介导的靶向毒素内体逃逸的抑制效果(图50的C)。PAMAM的伯氨基也通过与mPEG2k-NHS的反应部分聚乙二醇化(图52)，导致128个中的3个(图52的C)、8/128个(图52的D)和18/128个(图52的E))阻断伯胺。通过聚乙二醇化仅阻断3个伯胺已经足以逆转对SO1861介导的内体逃逸的抑制(图51的D)。聚乙二醇化的屏蔽效果很可能超出了转化的少量胺，因为已知聚乙二醇化会引入一个水化层，如果达到足够的水平，其可以屏蔽整个分子。
这些结果表明，聚合结构(诸如PMAMA)上存在一定数量的游离氨基可以阻断内体酸化，从而抑制SO1861或其他糖苷的内体逃逸活性。当氨基的数量较少时，如G4-树枝化基元所示，或者如果氨基已被屏蔽，诸如硫醇化或聚乙二醇化，抑制效果就会逆转。
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Claims (31)

1.支架，其适用于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合，所述支架包括聚合结构或寡聚结构，并且所述生物活性分子中的至少一种与所述聚合结构或寡聚结构共价结合，其中所述支架进一步包括用于将所述支架与所述载体分子共价偶联的第一化学基团。
2.如权利要求1所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子的分子量小于或等于3,000道尔顿，优选小于或等于2,500道尔顿，更优选小于或等于2,300道尔顿，最优选小于或等于2,000道尔顿，诸如1,700道尔顿至1,950道尔顿。
3.如权利要求1或2所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子是两亲分子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的支架，其中当多于一种生物活性分子与所述支架所包括的所述聚合结构或寡聚结构共价结合时，所述至少一种生物活性分子是单一特定分子或不同分子的混合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子是糖苷，优选双糖链三萜或三萜皂苷，更优选双糖链三萜皂苷，最优选属于12,13-脱氢齐墩果烷类型的双糖链三萜皂苷，其在C-23位置处具有醛官能团，并且任选地在所述皂苷的C-3β-OH基团处的碳水化合物取代基中包括葡糖醛酸官能团。
6.如权利要求1-5中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子是可以从霞草属(Gypsophila)物种和/或皂属(Saponaria)物种和/或麦仙翁属(Agrostemma)物种和/或皂树属(Quillaja)物种例如皂皮树(Quillaja saponaria)中分离的皂苷，或为单一特定皂苷或为两种或更多种不同皂苷，诸如表A1或方案I中的一种或多种皂苷、SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、皂树皂苷、皂素集、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832，或其任何立体异构体和/或其任何组合的混合物，优选所述皂苷是SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21和/或具有皂皮酸糖苷核、在C-3β-OH基团处的Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA碳水化合物取代基和在C-28-OH基团处的Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc碳水化合物取代基的皂苷，和/或为3-O-β-D-吡喃半乳糖-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-d吡喃葡萄糖醛酸皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4-OAc-β-D-吡喃喹啉-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选皂苷是SO1861和/或QS-21。
7.如权利要求1-6中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子是双链节皂苷，其分子量至少为1,500道尔顿，并且包括在C-23位置处含有醛基和任选在C-16位置处含有羟基的齐墩果型三萜，所述双链节皂苷在C-3位置处具有第一支链碳水化合物侧链，所述第一支链碳水化合物侧链任选地包含葡糖醛酸，其中所述皂苷含有酯基，在C-28位置处具有第二支链碳水化合物侧链，所述第二支链碳水化合物链优选包括至少四个碳水化合物单元，任选地包含至少一个乙酰基残基诸如两个乙酰基残基和/或任选地包括脱氧碳水化合物和/或任选地包括奎诺糖和/或任选地包括葡萄糖和/或任选地包括4-甲氧基肉桂酸和/或任选地包括5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸和/或任选地包括5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3,5-二羟基-6-甲基-辛酸，其经由酯键与碳水化合物结合，或其中所述至少一种皂苷是QS-21或QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS-18、QS1861、质子化QS1861(QS1862)、Quil-A中的任何一种或多种。
8.如权利要求1-7中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子经由不可裂解的键或经由可裂解的键与所述聚合结构或寡聚结构共价结合，其中优选地，所述可裂解的键在酸性条件、还原条件、酶促条件或光诱导条件下发生裂解，更优选地，所述可裂解的键是在酸性条件下发生裂解的腙键或酰肼键，和/或是对蛋白水解敏感的键，例如通过组织蛋白酶B进行蛋白水解，和/或是在还原条件下易裂解的键，诸如二硫键。
9.如权利要求1-8中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子经由可裂解的键与所述聚合结构或寡聚结构共价结合，其中所述可裂解的键在哺乳动物细胞，优选人类细胞的内体和/或溶酶体中存在的酸性条件下，优选在pH4.0至6.5，更优选在pH≤5.5下，在活体内发生裂解。
10.如权利要求1-9中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子经由亚胺键、腙键、酰肼键、肟键、1,3-二氧戊环键、二硫键、硫醚键、酰胺键、肽键或酯键，优选经由至少一个连接子，与所述支架的所述聚合结构或寡聚结构共价结合。
11.如权利要求5-10中任一项所述的支架，其中所述至少一种皂苷的在C-23位置处的所述醛官能团参与与所述支架的所述聚合结构或寡聚结构的所述共价结合，和/或，如果存在，所述至少一种皂苷的在所述C-3β-OH基团处的所述碳水化合物取代基中的所述葡糖醛酸官能团经由直接结合或经由至少一个连接子，参与与所述支架的所述聚合结构或寡聚结构的所述共价结合。
12.如权利要求5-11中任一项所述的支架，其中所述至少一种皂苷的在C-23位置处的所述醛官能团与连接子N-ε-马来酰亚胺己酸酰肼共价偶联，所述连接子经由硫醚键共价偶联至所述支架的所述聚合结构或寡聚结构中的巯基，诸如半胱氨酸的巯基。
13.如权利要求5-12中任一项所述的支架，其中所述至少一种皂苷的在所述C-3β-OH基团处的所述碳水化合物取代基中的所述葡糖醛酸官能团与连接子1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化六氟磷酸盐共价偶联，所述连接子经由酰胺键共价偶联至所述支架的所述聚合结构或寡聚结构中的胺基，诸如赖氨酸的胺基或蛋白质分子的氨基端。
14.如权利要求1-13中任一项所述的支架，其中用于将所述支架与所述载体分子共价偶联的所述化学基团是点击化学基团。
15.如权利要求14所述的支架，其中所述点击化学基团是四嗪、叠氮化物、烯烃或炔烃，或任何这些基团的环状衍生物，优选叠氮化物。
16.如权利要求1-15中任一项所述的支架，其中所述支架是三功能连接子，所述连接子包括：第二化学基团，其共价结合至少一种生物活性分子，第三化学基团，其用于与分子共价结合，以及包括所述第一化学基团，其用于与所述载体共价结合，优选地所述三功能连接子是方案II和结构B的所述三功能连接子。
17.如权利要求1-16中任一项所述的支架，其中所述至少一种生物活性分子是限定数量的糖苷分子或限定范围的糖苷分子，优选1-128个或至少2个、3个、4个、5个、6个、8个、10个、16个、32个、64个或128个糖苷分子，或其中的任意数量的糖苷分子，诸如7个、9个或12个糖苷分子。
18.如权利要求1-17中任一项所述的支架，其中所述聚合结构或寡聚结构包括线性、支化和/或环状聚合物、寡聚物、树枝状聚合物、树枝化基元、树枝化聚合物、树枝化寡聚物、DNA、多肽、聚赖氨酸、聚乙二醇，或这些聚合结构或寡聚结构的组装体，所述组装体优选通过共价交联建立。
19.如权利要求1-18中任一项所述的支架，其中所述载体分子包括或由以下任一种组成：蛋白质分子、蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸、脂质、脂肪、脂肪酸、纳米颗粒、碳水化合物或其组合的任何共价结合的缀合物或共价结合的复合物。
20.如权利要求1-19中任一项所述的支架，其中所述载体分子包括或由以下组成：免疫球蛋白、免疫球蛋白的至少一个结合结构域和/或免疫球蛋白的至少一个结合片段，诸如抗体、IgG、包括或由以下组成的分子：Vhh结构域或Vh结构域、Fab、scFv、Fv、dAb、F(ab)2、Fcab片段，或包括或由以下组成：至少一种非蛋白质配体和/或至少一种用于结合细胞表面分子的蛋白质配体诸如EGF或细胞因子。
21.如权利要求1-20中任一项所述的支架，其中所述载体分子包括至少一个结合结构域和/或至少一个结合片段或由其组成，所述至少一个结合结构域和/或至少一个结合片段用于结合细胞表面受体，诸如选自以下的肿瘤细胞特异性细胞表面受体：CD71、CA125、EpCAM(17-1A)、CD52、CEA、CD44v6、FAP、EGF-IR、整合素、syndecan-1、血管整合素α-Vβ-3、HER2、EGFR、CD20、CD22、叶酸受体1、CD146、CD56、CD19、CD138、CD27L受体、PSMA、CanAg、整合素-αV、CA6、CD33、间皮素、Cripto、CD3、CD30、CD239、CD70、CD123、CD352、DLL3、CD25、肝素A4、MUC1、Trop2、CEACAM5、CEACAM6、HER3、CD74、PTK7、Notch3、FGF2、C4.4A、FLT3、CD38、FGFR3、CD7、PD-L1、CTLA4、CD52、PDGFRA、VEGFR1、VEGFR2，优选地选自CD71、EGFR、HER2。
22.如权利要求1-21中任一项所述的支架，其中所述载体分子包括或由以下任一种组成：西妥昔单抗、达雷妥尤单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕尼单抗、布伦妥昔单抗、伊妥珠单抗、莫西妥单抗、波妥珠单抗、奥比妥珠单抗、IgG型的OKT-9抗CD71单克隆抗体、帕妥珠单抗、利妥珠单抗、奥法木单抗、赫赛汀、阿仑单抗、匹那珠单抗、OKT-10抗CD38单克隆抗体、表A2或表A3或表A4的抗体，优选西妥昔单抗或曲妥珠单抗或OKT-9，或其至少一种肿瘤细胞受体结合片段和/或其至少一种肿瘤细胞受体结合结构域，诸如其至少一种肿瘤细胞特异性受体结合片段和/或其至少一种肿瘤细胞特异性受体结合结构域。
23.如权利要求1-22中任一项所述的支架，其中所述支架适合与所述载体分子形成共价键，当所述载体分子包括至少一个半胱氨酸和/或赖氨酸时，所述共价键优选涉及所述载体分子的半胱氨酸侧链和/或所述载体分子的赖氨酸侧链。
24.如权利要求1-23中任一项所述的支架，其中所述载体分子包括至少一种效应分子或由至少一种效应分子组成，或其中当从属于权利要求20-23中任一项时，所述载体进一步包括至少一种效应分子，其中所述效应分子是活性药物物质中的至少一种，诸如有效载荷、毒素、药物、多肽、寡核苷酸、核酸、异种核酸、酶诸如脲酶和Cre-重组酶、蛋白质毒素、或核糖体失活蛋白中的任何一种或多种。
25.如权利要求24所述的支架，其中所述蛋白质毒素包括以下任何一种或多种或由以下任何一种或多种组成：选自表A5的蛋白质毒素和/或病毒毒素诸如凋亡素；细菌毒素，诸如志贺毒素、志贺样毒素、铜绿假单胞菌外毒素(PE)或PE的外毒素A、全长或截短的白喉毒素(DT)、霍乱毒素；真菌毒素，诸如α-肉毒素；植物毒素，包括核糖体失活蛋白和2型核糖体失活蛋白的A链，诸如石竹素，例如石竹素-30或石竹素-32、皂草素，例如皂草素-S3或皂草素-S6、布加宁或布加宁的去免疫衍生物布加宁、志贺样毒素A、商陆抗病毒蛋白、蓖麻毒素、蓖麻毒素A链、莫德霉素、莫德霉素A链、相思豆毒素、相思豆毒素A链、沃尔肯辛、沃尔肯辛A链、黏蛋白、黏蛋白A链；或者动物或人类毒素，诸如青蛙核糖核酸酶，或来自人类的颗粒酶B或血管生成素，或其任何片段或衍生物；优选所述蛋白质毒素为石竹素和/或皂草素。
26.如权利要求24或25所述的支架，其中所述寡核苷酸、所述异种核酸或所述核酸包括以下任何一种或多种或由以下任何一种或多种组成：载体、基因、细胞自杀诱导转基因、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、反义寡核苷酸(ASO、AON)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、DNA适配体、RNA适配体、mRNA、小环DNA、肽核酸(PNA)、氨基磷酸吗啉代寡聚物(PMO)、锁核酸(LNA)、桥接核酸(BNA)、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯核酸(FANA)、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-O,4'-氨基亚乙基桥接核酸、3'-氟己糖醇核酸(FHNA)、质粒、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)，或其衍生物，优选BNA，例如用于沉默HSP27蛋白质表达的BNA。
27.如权利要求24-26中任一项所述的支架，其中所述效应分子包括至少一种有效载荷或由至少一种有效载荷组成，所述至少一种有效载荷优选选自以下任何一种或多种：靶向毒素核糖体、靶向毒素延伸因子、靶向微管蛋白的毒素、靶向DNA的毒素和靶向RNA的毒素，更优选地选自以下任何一种或多种：丹宁、pasudotox、美登木素衍生物DM1、美登木素衍生物DM4、单甲基耳他汀E(MMAE，维多丁)、单甲基耳他汀F(MMAF、马服丁)、加利车霉素，N乙酰基-γ加利车霉素，吡咯并苯并二氮杂(PBD)二聚体、苯二氮卓类、CC-1065类似物、多霉素、多柔比星、紫杉醇、顺铂、环磷酰胺、依托泊苷、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶(5-FU)、米托蒽醌、微管溶素、吲哚并苯二氮卓、AZ13599185、隐霉素、根瘤菌素、甲氨蝶呤、蒽环类、喜树碱类似物、SN-38、DX-8951f、甲磺酸依沙康、截短形式的铜绿假单胞菌外毒素(PE38)、多霉素衍生物、鹅膏菌素、α-鹅膏菌素、剪接抑制素、泰兰他汀、奥佐霉素、替西林、安伯他汀269和索拉维坦，或其衍生物。
28.如权利要求1-23中任一项所述的支架，其中所述载体分子包括效应分子和单克隆抗体的共价连接组合或由其组成，所述共价连接组合优选选自表A2和表A3的吉妥珠单抗奥佐霉素、布伦妥昔单抗维多丁、曲妥珠单抗丹宁、伊妥珠单抗奥佐霉素、莫西妥单抗pasudotox、波妥珠单抗维多丁以及抗体药物缀合物。
29.用于制备适合于将至少一种生物活性分子与载体分子共价结合的支架的方法，所述方法包括：
a)提供聚合结构或寡聚结构，其包括用于将所述聚合结构或所述寡聚结构与所述载体分子共价偶联的第一化学基团并且包括与所述第一化学基团不同的第二化学基团中的至少一个，其中每个第二化学基团用于将所述至少一种生物活性分子之一共价偶联至所述寡聚结构或所述聚合结构；以及
b)经由所述第二化学基团将至少一种生物活性分子共价偶联至所述聚合结构或所述寡聚结构，其中优选地，所述生物活性分子是权利要求2-13或17中任一项所述的生物活性分子，更优选为SO1861和/或GE1741和/或SA1641和/或QS-21，
从而，提供所述支架。
30.用于制备与载体分子共价结合的支架的方法，所述支架包括至少一种共价结合的生物活性分子，所述方法包括：
a)提供包括至少一种生物活性分子的支架，所述生物活性分子与所述支架中的聚合结构或寡聚结构共价结合，优选提供权利要求1-28中任一项所述的支架或通过权利要求29所述的方法可获得的支架或由权利要求29所述的方法获得的支架；以及
b)将a)的支架与权利要求18-28中任一项所述的载体分子共价偶联，
从而，提供与载体分子共价结合的支架，所述支架包括至少一种共价结合的生物活性分子。
31.如权利要求5-28中任一项所述的支架或从属于权利要求5-28中任一项的权利要求30所述的方法，其中当任一所述效应分子与所述支架共价结合并且与哺乳动物细胞接触时，或当所述效应分子在所述支架存在下与哺乳动物细胞接触时，所述支架能够增加权利要求24-28中任一项所述的效应分子的内体逃逸和/或溶酶体逃逸。
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