ES2929539T3 - Sal formada por ácido 2-(1-aciloxipentil) benzoico mediante un aminoácido básico o aminoguanidina, método de preparación y usos de la misma - Google Patents

Sal formada por ácido 2-(1-aciloxipentil) benzoico mediante un aminoácido básico o aminoguanidina, método de preparación y usos de la misma Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona una sal de ácido 2-(1-aciloxipentil) benzoico formada por aminoácido básico o aminoguanidina, un método de preparación de la misma, una preparación farmacéutica que contiene la sal y los usos de la preparación farmacéutica en la preparación de fármacos para prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares. e isquemia cerebral, trastornos antitrombóticos al tiempo que mejora los trastornos de la circulación cardíaco-cerebral. El compuesto descrito allí tiene excelente solubilidad en agua, estabilidad en solución de agua y propiedades farmacocinéticas, al mismo tiempo que muestra resistencia reforzada a la agregación de plaquetas, acción antitrombótica, isquemia anti-cerebral y efecto neuroprotector. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sal formada por ácido 2-(1 -aciloxipentil) benzoico mediante un aminoácido básico o aminoguanidina, método de preparación y usos de la misma
Campo técnico
La presente descripción pertenece a los campos de la química farmacéutica y la farmacoterapéutica, y se refiere específicamente a las sales formadas por ácido 2-(1 -aciloxi-n-pentil) benzoico y un aminoácido básico o aminoguanidina, un método de preparación de las mismas, composiciones farmacéuticas que contienen el compuesto salino, y aplicación médica de las mismas, especialmente la aplicación en la preparación de fármacos para prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares isquémicas, resistir la trombosis y mejorar las afecciones de la circulación cardio-cerebral.
Antecedentes de la técnica
La 3-N-butilftalida (NBP), abreviada como butilftalida, y que tiene un nombre químico racémico (R/S)-3-N-butil-1(3H)-isobenzofuranona, es un fármaco de desarrollo propio y comercializado para tratar accidentes cerebrovasculares isquémicos leves y moderados en China. Aunque la NBP tiene cierta actividad biológica en la agregación antiplaquetaria, la antitrombosis, la reducción del volumen del infarto cerebral, la protección de la función mitocondrial, y la mejora de la microcirculación cerebral, la eficacia general de un solo fármaco no es alta, y la NBP a menudo se combina con otros fármacos en la práctica clínica. Además, la NBP es una sustancia aceitosa con un alto punto de ebullición, requiere de destilación a alta temperatura y alto vacío de forma reiterada para producir un producto farmacéutico cualificado, y es difícil de producir en masa. Debido a la solubilidad en agua extremadamente baja de la NBP, una inyección se debe encapsular con hidroxipropil-p-ciclodextrina y prepararse después con cloruro de sodio y agua para inyección. Por lo tanto, el proceso de producción es relativamente complicado y el costo es mayor en comparación con las inyecciones de uso común. Para mejorar la actividad y/o aumentar la solubilidad en agua de la NBP, la gente ha modificado y transformado la estructura de la NBP.
Las Patente chinas ZL 98125618.x y ZL 9910 9673.8 describen el proceso de preparación de (R)- y (S)-NBP y las actividades de agregación antiplaquetaria y antitrombótica de los mismos, en donde la actividad de (S)-NBP es mejor que la de (R)-NBP y NBP.
La Patente china ZL 01109795.7 describe un método de formación de la sal de un compuesto de anillo abierto de NBP, específicamente ácido (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoico con potasio, sodio, calcio, magnesio, zinc, anilina, bencilamina, morfolina o dietilamina, y la aplicación de la misma, en donde la sal de potasio ((R/S)-PHPB, PHPB para abreviar) tiene una alta solubilidad en agua, se puede convertir en NBP en el organismo para ejercer la actividad contra la isquemia cerebral, y tiene una biodisponibilidad mejor que la NBP (Acta Pharmacol. Sin., 2018, 39, 275-285).
La Patente china ZL 200410048268.9 describe un proceso y actividad de sales formadas por ácido (S)-2-(1 -hidroxin-pentil) benzoico con iones metálicos monovalentes de litio, sodio y potasio, o iones metálicos divalentes de magnesio, calcio y zinc, o bases orgánicas de bencilamina, terc-butilamina, N,N'-dibenciletilendiamina, en donde el potasio de (S)-2-(1 -hidroxi-n-pentil) benzoato ((S)-PHPB) tiene mejor actividad contra la isquemia cerebral que (R)-PHPB y (S)-NBP.
La Patente china ZL 201110115922.3 describe un método de preparación y una aplicación médica de homólogos tio y seleno de NBP, en donde los homólogos tio tienen una mejor actividad contra la isquemia cerebral y antioxidante que NBP.
Actualmente PHPB y (S)-NBP han entrado en estudios clínicos de fase M-IM y fase I-II respectivamente, para el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico.
ZL Min et al. describen en Chinese Chemical Letters 19(8), 915-917(2008) la preparación de ácidos 2-(1-aciloxipentil) benzoico.
La Patente europea EP1508561 A1 describe benzoatos de 2-(a-hidroxipentilo) y su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades, tales como isquemia cardíaca, isquemia cerebral, oclusiones arteriales del corazón y del cerebro.
El solicitante diseñó y sintetizó previamente L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato (AHPB) (Gao Yang, tesis doctoral de la Universidad Farmacéutica de China, 2016). Los estudios han demostrado que la AHPB tiene una excelente solubilidad en agua, y una mejor actividad contra la agregación plaquetaria, la isquemia cerebral y de protección nerviosa que la NBP equimolar, pero tiene una estabilidad química deficiente.
Compendio de la descripción
Objetivo de la descripción: En vista de la técnica anterior, la descripción proporciona un compuesto I obtenido mediante reacción del ácido 2-(1 -aciloxi-n-pentil) benzoico con un aminoácido básico o aminoguanidina, y proporciona un método de preparación del nuevo compuesto I, una composición farmacéutica que contiene estos compuestos, y la aplicación farmacéutica de los mismos.
Solución técnica: En la presente solicitud se describe un compuesto de fórmula general I,
Figure imgf000003_0001
R1 es un alquilo C1-C8 , arilo o heteroarilo; y
H2N-R2 es un aminoácido básico o aminoguanidina,
en donde el centro quiral del resto ácido 2-(1 -aciloxi-n-pentil) benzoico representado por * es de una configuración (R)-, (S)- o (R/S)-..
Preferiblemente, R1 es metilo, etilo, n-propilo o fenilo.
Preferiblemente, el aminoácido básico es L-arginina, L-lisina o L-histidina.
Más preferiblemente, el compuesto de fórmula general I se selecciona de los siguientes compuestos:
L-arginina (R/S)-2-(1 -acetoxi-n-pentil) benzoato
Figure imgf000003_0002
Figure imgf000004_0001
L-arginina (fl)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000005_0001
La descripción describe además un método de preparación del compuesto de fórmula general I, que incluye las siguientes etapas:
Figure imgf000005_0002
(1) a baja temperatura y en presencia de una base orgánica, añadir gota a gota anhídrido de ácido o cloruro de acilo a una disolución de disolvente orgánico de un compuesto II, y acidificar la disolución de reacción después de la reacción para precipitar un compuesto sólido blanco III; y
(2) disolver en alcohol el compuesto III obtenido en la etapa (1), añadir H2N-R2 para formar una sal, y después de la reacción, filtrar y recristalizar el precipitado con alcohol para obtener un compuesto I.
Además, en la etapa (1), la temperatura de reacción es de -30 a -5°C; la base orgánica es 4-dimetilaminopiridina, dietilamina, trietilamina o piridina; el disolvente orgánico es sólo uno o una combinación de dos de éter dietílico, tetrahidrofurano, diclorometano, triclorometano o acetona; el ácido es ácido clorhídrico concentrado o diluido, ácido sulfúrico o ácido nítrico; y la disolución de reacción se acidifica a pH 2-6.
En la etapa (2), la temperatura de reacción es de -5 a 30°C, el alcohol es etanol, metanol, propanol o isopropanol, y el aminoácido básico es L-arginina, L-lisina o L-histidina.
La descripción describe una composición farmacéutica, que incluye el compuesto I y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
La aplicación del compuesto I en la preparación de fármacos para prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares isquémicas, resistir la trombosis y mejorar las afecciones de la circulación cardio-cerebral también está dentro del alcance de protección de la descripción.
Los expertos en la técnica pueden preparar diversas formas de dosificación de la composición farmacéutica de la descripción según los métodos de producción convencionales en el campo farmacéutico. Por ejemplo, el ingrediente activo se mezcla con uno o más vehículos (también llamados excipientes), y después se prepara en la forma de dosificación deseada, que incluyen comprimidos, cápsulas, y gránulos. El ingrediente activo también se puede convertir en inyección intravenosa o inyección intravenosa liofilizada según el método de inyección de producción convencional.
El compuesto y la composición farmacéutica de la descripción se pueden emplear para preparar fármacos para prevenir y tratar enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares isquémicas, resistir la trombosis y mejorar las afecciones de la circulación cardio-cerebral, tales como infarto de miocardio, angina de pecho, arritmia, enfermedad cardiaca coronaria, infarto cerebral y accidente cerebrovascular.
Efectos beneficiosos: El compuesto de la descripción tiene las siguientes excelentes propiedades: (1) excelente solubilidad en agua y estabilidad en disolución acuosa, lo cual es conveniente para que la industria farmacéutica procese una inyección intravenosa o una inyección intravenosa liofilizada adecuada para la medicación de pacientes con accidente cerebrovascular isquémico; (2) liberación de dos tipos de fragmentos activos que pueden actuar sinérgicamente en el organismo, y una mejora significativa del efecto del tratamiento contra el accidente cerebrovascular isquémico mediante (R/S)-, (R)- o (S)-NBP y cierto aminoácido básico o aminoguanidina actuando sinérgicamente en el organismo; (3) isquemia anticerebral significativa y actividad neuroprotectora; (4) excelentes propiedades farmacocinéticas; y (5) mayor seguridad. Los detalles son los siguientes:
El compuesto I de la descripción es un compuesto sólido con buena solubilidad en agua y estabilidad en disolución acuosa, y puede liberar en el organismo el correspondiente ácido 2-(1 -aciloxi-n-pentil) benzoico y un aminoácido básico o aminoguanidina. El ácido 2-(1 -aciloxi-n-pentil) benzoico se puede hidrolizar aún más mediante la esterasa para eliminar el grupo acilo, generando (R/S)-, (R)- y ácido (S)-2-(1 -hidroxi-n-pentil) benzoico respectivamente, que se ciclan a los correspondientes (R/S)-, (R)- y (S)-NBP, respectivamente, para ejercer un efecto anti-isquemia cerebral; y el aminoácido básico o aminoguanidina también tiene efectos normales y farmacológicos extremadamente importantes. La L-arginina se puede ser metabolizad en el organismo mediante la óxido nítrico (NO) sintasa (NOS) en NO beneficioso para el sistema cardiovascular (Proc. Nutr. Soc., 2018, 77, 112-123). La suplementación dietética de L-arginina puede reducir la reactividad plaquetaria en pacientes con colesterol alto (J Am Coll Cardiol, 1997, 29, 479-485) y prevenir la aterosclerosis (J Clin Invest, 1992, 90, 1168-1172). La L-arginina puede ingresar al cerebro desde la sangre periférica a través del transportador de aminoácidos catiónicos (CAT1) en la barrera hematoencefálica (BHE), que es muy importante para el desarrollo cerebral (Microvasc. Res., 2018, 117, 16-21). Además, la administración oral o por goteo intravenoso de L-arginina en pacientes con encefalopatía mitocondrial tipo MELAS puede aumentar la microcirculación del flujo sanguíneo cerebral, reducir la lesión por isquemia cerebral focal aguda, y reducir significativamente la frecuencia y la gravedad de los síntomas del accidente cerebrovascular (Neurology, 2005, 64, 710-712). La inyección directa de L-arginina en el ventrículo cerebral de ratas con AD puede producir una importante actividad neuroprotectora y anti-apoptótica (Transí. Neurosci., 2018, 9, 43­ 53). L-lisina y L-histidina son aminoácidos esenciales para el cuerpo humano, y juegan un papel importante en la transmisión de señales nerviosas y el suministro de energía. La aminoguanidina tiene actividad anti-isquémica cerebral (Neurosciences, 2012, 17, 121-126), neuroprotectora (Neurochem. Int., 2010, 56, 634-641) y anti­ envejecimiento (J. Proteomics., 2017, 156, 104-112). Por lo tanto, (R/S)-, (R)- o (S)-NBP actúa sinérgicamente en el organismo con uno de los aminoácidos básicos o aminoguanidina mencionados anteriormente para mejorar el efecto terapéutico. Los resultados de los estudios in vivo e in vitro indican que el compuesto de la descripción tiene una importante actividad anti-agregante plaquetaria, anti-trombótica, anti-isquémica cerebral y neuroprotectora, en donde la sal formada por el ácido del isómero (S) es mejor que la sal formada por el ácido del isómero (R) o el ácido del racemato (R/S), y es significativamente mejor que (S)-NBP y PHPB. Los compuestos de la descripción también tienen excelentes propiedades farmacocinéticas. Además, los compuestos de la descripción tienen una toxicidad aguda para ratones significativamente menor por inyección intravenosa que la de NBP y PHPB, una tasa de inhibición del canal de potasio hERG en células CHO-hERG más baja que la de (S)-NBP, y un resultado negativo de la prueba de mutación inversa bacteriana (prueba de Ames).
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un espectrograma de análisis de estabilidad de la disolución de muestra del compuesto hs en H2O.
La Figura 2 es un espectrograma de análisis de estabilidad de la disolución de muestra del compuesto lis CH3OH. La Figura 3 muestra los efectos de los compuestos de ensayo sobre la trombosis de derivación arteriovenosa en ratas.
La Figura 4 muestra los efectos de los compuestos sobre el volumen del infarto, el edema cerebral y los defectos nerviosos en ratas MCAO (oclusión de la arteria cerebral media, de sus siglas en inglés).
La Figura 5 muestra los efectos del compuesto AHPB sobre el volumen del infarto, edema cerebral y defectos nerviosos en ratas MCAO.
La Figura 6 muestra la curva fármaco-tiempo de cada metabolito en plasma de rata después de la inyección intravenosa de lis.
La Figura 7 muestra la curva fármaco-tiempo, histograma de concentración de fármaco, de cada metabolito en tejido cerebral de rata después de la inyección intravenosa de lis.
Descripción detallada de la invención
La presente solicitud se describirá en detalle a continuación junto con ejemplos específicos.
Fuente material:
La (S)-butilftalida ((S)-NBP) se prepara en referencia al método de la Patente china ZL 98125618.x.
El (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio (PHPB) se prepara en referencia al método de la Patente china ZL 01109795.7.
Los ácidos (R/S)-, (R)- y (S)-2-(1 -hidroxi-n-pentil) benzoico se preparan en referencia al método de la Patente china ZL 200410048268.9.
La aspirina, la L-arginina, y la edaravona se adquirieron de Saen Chemical Technology Co., Ltd.
El clopidogrel se adquirió de Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.
Ejemplo 1: Preparación de L-arginina (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (I1)
En condiciones de -30 a -5°C, se añadieron 21,8 mL (157,8 mmol) de trietilamina y 0,6 g (5,2 mol) de DMAP a una disolución de 10,9 g (52,6 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoico (II) en éter dietílico (300 mL), después se añadieron gota a gota lentamente 11,1 mL (157,8 mmol) de cloruro de acetilo, y la disolución mixta se agitó durante 5 horas. Después de la reacción, se añadieron aproximadamente 35 mL de ácido clorhídrico al 10% para acidificar la disolución de reacción a pH 2-3. La disolución de reacción se agitó durante 2 horas. La capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró, se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía en columna [éter de petróleo: acetato de etilo (v:v) = 10:1] para obtener 9,96 g de cristales blancos en forma de aguja de ácido (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico con un rendimiento del 76%; p.f.: 65-66°C; EM (m/z): 249 [M1-H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCla): 5 (ppm): 0,97 (t, 3H, CH3, J = 6,9 Hz), 1,38-1,52 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,84­ 1,99 (m, 2H, CHCH2 CH2), 2,17 (s, 3H, CHOCOCH3), 6,69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,38­ 7,44 (m, 1H, ArH), 7,56-7,65 (m, 2H, ArH), 8,09-8,12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCla): 5 (ppm):174,4, 131,2, 128,8, 128,3, 127,2, 74,9, 61,1, 54,4, 40,5, 27,6, 27,2, 23,9, 21,7, 13,3.
En condiciones de -5 a 30°C, se disolvieron 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 6,9 g (39,8 mmol) de L-arginina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 9,4 g de un sólido pulverulento blanco I1 con un rendimiento del 56%; p.f.: 178-1792C; [a]20D = 5,2° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 175 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,80 (t, 3H, CH3, J = 6,0 Hz), 1,10-1,30 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,54-1,72 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,81-1,88 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 2,06 (s, 3H, CHOCOCH3), 3,18 (t, 2H, NHCH2CH2, J = 6,9 Hz), 3,70 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,10 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,29­ 7,43 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 177,5, 174,3, 173,8, 138,1, 136,8, 128,7, 127,7, 126,9, 125,8, 74,9, 54,4, 40,6, 35,2, 27,6, 27,2, 24,5, 23,9, 21,7, 20,7, 13,3.
Ejemplo 2: Preparación de L-arginina (R/S)-2-(1-propioniloxi-n-pentil) benzoato (I2)
En condiciones de -30 a -5°C, se añadieron 21,8 mL (157,8 mmol) de trietilamina y 0,6 g (5,2 mol) de DMAP a una disolución de 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoico (II) en éter dietílico (300 mL), después se añadieron gota a gota lentamente 13,1 mL (157,8 mmol) de cloruro de propionilo, y la disolución mixta se agitó durante 5 horas. Después de la reacción, se añadieron aproximadamente 35 mL de ácido clorhídrico al 10% para acidificar la disolución de reacción a pH 2-3. La disolución de reacción se agitó durante 2 horas. La capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró, se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía en columna [éter de petróleo: acetato de etilo (v:v) = 10:1] para obtener 9,0 g de ácido (R/S)-2-(1propioniloxi-n-pentil) benzoico oleoso con un rendimiento del 65%; EM (m/z): 263 [M1-H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCI3): 5 (ppm): 0,96 (t, 3H, CH2CH2CH3, J = 6,9 Hz), 1,21 (t, 3H, COCH2CH3, J = 7,8 Hz), 1,32-1,51 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,80-1,98 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,43 (q, 2H, COCH2CH3, J = 7,5 Hz), 6,68 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,33-7,44 (m, 1H, ArH), 7,52-7,64 (m, 2H, ArH), 8,03-8,10 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCla): 5 (ppm): 172,8, 171,3, 143,8, 133,5, 130,6, 126,7, 125,7, 72,3, 36,0, 25,9, 27,4, 21,7, 17,9, 13,4, 13,1.
En condiciones de -5 a 30°C, el producto oleoso se disolvió en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 5,9 g (33,9 mol) de L-arginina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 7,8 g de un sólido pulverulento blanco I2 con un rendimiento del 52%; p.f.: 169-171 °C; [a]20D = 5,5° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 263 [M1-H]-, 175 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,81 (t, 3H, CH2CH2CH3, J = 6,0 Hz), 1,06 (t, 3H, COCH2CH3, J = 7,5 Hz), 1,18-1,37 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,53-1,73 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,83­ 1,91 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 2,38 (q, 2H, COCH2CH3, J = 7,5 Hz), 3,19 (t, 2H, NHCH2CH2, J = 6,9 Hz), 3,72 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,18 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,30-7,43 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 179,9, 179,8, 176,9, 159,4, 140,9, 139,1, 131,5, 130,2, 129,6, 128,2, 77,2, 56,9, 43,1,38,0, 30,3, 20,1,29,9, 26,5, 24,3, 15,9, 11,1.
Ejemplo 3: Preparación de L-arginina (R/S)-2-(1-N-butiriloxi-n-pentil) benzoato (I3)
En condiciones de -30 a -5°C, se añadieron 21,8 mL (157,8 mmol) de trietilamina y 0,6 g (5,2 mol) de DMAP a una disolución de 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoico (II) en éter dietílico (300 mL), después se añadieron gota a gota lentamente 15,9 mL (157,8 mmol) de cloruro de n-butirilo, y la disolución mixta se agitó durante 5 horas. Después de la reacción, se añadieron aproximadamente 35 mL de ácido clorhídrico al 10% para acidificar la disolución de reacción a pH 2-3. La disolución de reacción se agitó durante 2 horas. La capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró, se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía en columna [éter de petróleo: acetato de etilo (v:v) = 10:1] para obtener 8,4 g de ácido (R/S)-2-(1-N-butiriloxi-n-pentil) benzoico oleoso con un rendimiento del 58%; EM (m/z): 277 [M1-H]-; 1H NMR (300 m Hz, CDCl3): 5 (ppm): 0,89-1,06 (m, 6H, 2xCHa), 1,33-1,51 (m, 4H, CH2CH2CH2CH3), 1,7-1,78 (m, 2H, COCH2CH2CH3), 1,85-1,98 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,41 (t, 2H, COCH2CH2, J = 7,5 Hz), 6,70 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,35-7,45 (m, 1H, ArH), 7,55-7,64 (m, 2H, ArH), 8,06-8,11 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCla): 5 (ppm): 173,6, 171.4, 143,9, 132,5, 130,1, 128,1, 126,9, 125,5, 72,4, 36,1,33,9, 21,5, 21,3, 21,7, 13,4, 8,5.
En condiciones de -5 a 30°C, el producto oleoso se disolvió en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 5,2 g (29,9 mol) de L-arginina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 7,3 g de un sólido pulverulento blanco I3 con un rendimiento del 54%; p.f.: 152-153°C; [a]20D = 4,6° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 277 [M1-H]-, 175 [M2 H]+; 1 H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,71-0,84 (m, 6H, 2xCH3), 1,18-1,36 (m, 4H, CH2CH2CH2CH3), 1,5-1,58 (m, 2H, COCH2CH2CH3), 1,63-1,73 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,73-1,95 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 2,26 (t, 2H, CHOCOCH2CH2, J = 7,2 Hz), 3,19 (t, 2H, NHCH2CH2, J = 6,6 Hz), 3,74 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,34 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,23-7,49 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 176,1, 175,2, 174,3, 156,9, 138,3, 131,5, 129,1, 127,8, 127,4, 125,3, 74,3, 54.4, 40,5, 36,3, 35,8, 27,6, 27,4, 24,1,21,9, 18,2, 13,4, 13,1.
Ejemplo 4: Preparación de L-arginina (R/S)-2-(1-benzoiloxi-n-pentil) benzoato (I4)
En condiciones de -30 a -5°C, se añadieron 21,8 mL (157,8 mmol) de trietilamina y 0,6 g (5,2 mmol) de DMAP a una disolución de 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoico (II) en éter dietílico (300 mL), después se añadieron gota a gota lentamente 21,1 mL (157,8 mmol) de cloruro de benzoilo y la disolución mixta se agitó durante 5 horas. Después de la reacción, se añadieron aproximadamente 35 mL de ácido clorhídrico al 10% para acidificar la disolución de reacción a pH 2-3. La disolución de reacción se agitó durante 2 horas. La capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró, se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía en columna [éter de petróleo: acetato de etilo (v:v) = 10:1] para obtener 10,0 g de ácido (R/S)-2-(1-benzoiloxi-n-pentil) benzoico oleoso con un rendimiento del 61%; EM (m/z): 311[M1-H]-; 1 H NMR (300 MHz, CDCh): 5 (ppm): 0,99 (t, 3H, CH3, J =7,2Hz), 1,33-1,63 (m, 4H, CH2CH2CH2CH3), 2,03-2,12 (m, 2H, CHCH2CH2), 6,94 (dd, 1H, CHaCHOCOAr, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 7,40-7,45 (m, 1H, ArH), 7,45-7,72 (m, 5H, ArH), 8,13-8,22 (m, 3H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCh): 5 (ppm): 171,4, 165,8, 143,8, 133,2, 132,1, 132,5, 130,8, 129,7, 129,1, 126,9, 126,8, 125,5, 73,8, 73,3, 36,2, 27,6, 22,0, 21,8, 13,4.
En condiciones de -5 a 30°C, el producto oleoso se disolvió en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 5,5 g (31,6 mmol) de L-arginina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 8,8 g de un sólido pulverulento blanco I4 con un rendimiento del 58%; p.f.: 113-115°C; [a]20D = 3,8° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 311[M1-H]-, 175 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz,D2O): 5 (ppm): 0,83 (t, 3H, CH3, J =7,2 Hz), 1,22-1,42 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,56-1,72 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,72-2,07 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 3,12 (t, 2H, NHCH2CH2), 3,38 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 7,00 (dd, 1H, CH2CHOCOAr, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 7,15-7,24 (m, 1H, ArH), 7,29-7,39 (m, 2H, ArH), 7,43-7,47 (m, 1H, ArH), 7,51-7,56 (m, 1H, ArH), 7,63-7,68 (m, 1H, ArH), 7,72-7,75 (m, 1H, ArH), 7,89-7,91 (m, 1H, ArH), 8,00-8,08 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 174,4, 133,8, 131,1, 129,5, 128,9, 128,8, 128,7, 128,3, 127,7, 127,0, 125,7, 114,7, 105,3, 84,1, 80,1, 75,4, 54.4, 40,5, 35,6, 27,6, 27,3, 23,9, 21,7, 15,1, 13,3.
Ejemplo 5: Preparación de L-lisina (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (I5)
En condiciones de -5 a 30°C, se disolvieron 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico (preparado mediante el método del Ejemplo 1) en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 5,7 g (39,0 mmol) de L-lisina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 7,6 g de un sólido pulverulento amarillo claro I5 con un rendimiento del 49%; p.f.: 122-124°C; [a]20D = 4,8° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 147 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 ppm: 0,93 (s, 6H, 2xCH3), 1,28-1,48 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,47-1,67 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,71-1,86 (m, 2H, CH2CHCOOH), 1,86-2,03 (m, 4H, NH2CH2CH2CH2), 2,18 (s, 3H, CHOCOCH3), 3,09 (m, 2H, NH2CH2CH2CH2), 3,82 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,28 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,35-7,60 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 177,1, 176,3, 141,0, 139,1, 131,5, 130,3, 129,0, 128,4, 77,5, 57,1,41,1,37,9, 32,4, 29,8, 29,0, 24,4, 24,1,23,3, 19,5 ,15,9.
Ejemplo 6: Preparación de L-histidina (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (I6)
En condiciones de -5 a 30°C, se disolvieron 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico (preparado mediante el método del Ejemplo 1) en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 6,1 g (39,3 mmol) de L-histidina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 8,4 g de un sólido pulverulento blanco I6 con un rendimiento del 53%; p.f.: 137-139°C; [a]20D = 2,4° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 156 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz,D2O): 5 ppm: 0,88 (s, 6H, 2xCH3), 1,21-1,43 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,81-2,00 (m, 2H, CHCH2), 2,14 (s, 3H, CHOCOCH3), 3,25-3,36 (m, 2H, CH2CHCOOH), 4,05 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,19 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1= 8,1 Hz, J2= 6,6 Hz), 7,28-7,35 (m, 1H, ArH), 7,38 (s, 1H, NHCH=C), 7,41-7,53 (m, 3H, ArH), 8,42 (s, 1H, NHCH=N); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 177,3, 173,8, 172,8, 138,3, 136,9, 134,7, 128,9, 127,7, 126,9, 125,8, 117,5, 101,2, 74,9, 53,9, 35,2, 27,2, 26,5, 21,7, 20,7, 13,3.
Ejemplo 7: Preparación de aminoguanidina (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (I7)
Se disolvieron 5,3 g de bicarbonato de aminoguanidina (39,8 mol) en 50 mL de agua. Bajo agitación, la disolución se calentó lentamente hasta 60°C. Después de enfriar, en condiciones de -5 a 30°C, se añadió una disolución de 9,96 g (39,8 mmol) de ácido (R/S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico (preparado mediante el método del Ejemplo 1) en etanol absoluto (25 mL). La disolución de reacción se concentró hasta sequedad bajo presión reducida y se recristalizó con etanol al 95% para obtener 6,5 g de un sólido pulverulento blanco I7 con un rendimiento del 43%; p.f.: 109-111 °C; EM (m/z): 249 [M1-H]-, 75 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 ppm: 0,97 (t, 3H, CH3, J = 6,9 Hz), 1,38-1,52 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,84-1,99 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,17 (s, 3H, CHOCOCH3), 6,69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,38-7,44 (m, 1H, ArH), 7,56-7,65 (m, 2H, ArH), 8,09-8,12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 174,4, 158,1, 131,2, 128,8, 128,3, 127,2, 74,9, 61,1,54,4, 40,5, 27,6, 27,2, 23,9, 21,7, 13,3.
Ejemplo 8: Preparación de L-arginina (R)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (I1r)
En condiciones de -30 a -5°C, se añadieron 5,7 mL de (72,0 mmol) de piridina a una disolución de (R)-2-(1-hidroxi-npentil) benzoico (5,0 g, 24,0 mmol) en diclorometano (150 mL), después se añadieron gota a gota lentamente 7,2 mL de anhídrido acético (72,0 mmol) y la disolución se agitó durante 5 horas. Después de la reacción, se añadieron aproximadamente 20 mL de ácido clorhídrico al 10% para acidificar la disolución de reacción a pH 2-3. La disolución de reacción se agitó durante 2 horas. La capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró, se concentró a presión reducida, y se sometió a cromatografía en columna [éter de petróleo: acetato de etilo (v:v) = 10:1] para obtener 4,8 g de cristales blancos en forma de aguja de ácido (R)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico con un rendimiento del 81%; p.f.: 65-66°C; [a]20D = 38,2° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]- ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5 (ppm): 0,97 (t, 3H, CH3, J = 6,9 Hz), 1,38-1,52 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,84-1,99 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,17 (s, 3H, CHOCOCH3), 6,69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,38-7,44 (m, 1H, ArH), 7,56-7,65 (m, 2H, ArH), 8,09-8,12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCh): 5 (ppm): 174,4, 131,2, 128,8, 128,3, 127,2, 74,9, 61,1, 54,4, 40,5, 27,6, 27,2, 23,9, 21,7, 13,3.
En condiciones de -5 a 30°C, se disolvieron 4,8 g (19,2 mmol) de ácido (R)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico en 25 mL de etanol absoluto. Con agitación, se añadieron 3,3 g (19,2 mmol) de L-arginina para formar una sal. El precipitado se filtró y recristalizó con etanol al 95% para obtener 4,6 g de un sólido pulverulento blanco I1r con un rendimiento del 57%; p.f.: 178-179°C; [a]20D = 32,8° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 175 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,75 (t, 3H, CH3, J = 6,0 Hz), 1,10-1,30 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,48-1,66 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,74­ 1,82 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 2,01 (s, 3H, COCH3), 3,13 (t, 2H, NHCH2CH2, J = 6,6 Hz), 3,62 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,05 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,21-7,38 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 177,5, 174,3, 173,8, 138,1, 136,8, 128,7, 127,7, 126,9, 125,8, 74,9, 54,4, 40,6, 35,2, 27,6, 27,2, 24,5, 23,9, 21,7, 20,7, 13,3.
Ejemplo 9: Preparación de aminoguanidina (R)-2-(1--acetoxi-n-pentil) benzoato (I7r)
Se disolvieron 2,6 g de bicarbonato de aminoguanidina (19,2 mmol) en 15 mL de agua. Bajo agitación, la disolución se calentó lentamente hasta 60°C. Después de enfriar, en condiciones de -5 a 30°C, se añadió una disolución de 4,8 g (19,2 mmol) de ácido (R)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico (preparado mediante el método del Ejemplo 8) en 25 mL de etanol absoluto. La disolución de reacción se concentró a sequedad bajo presión reducida y se recristalizó con etanol al 95% para obtener 1,9 g de un sólido pulverulento blanco Í7r con un rendimiento del 43%; p.f.: 109-111 °C;
[a]20D = 28,9° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 75 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,97 (t, 3H, CH3, J = 6,9 Hz), 1,38-1,52 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,84-1,99 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,17 (s, 3H, CHOCOCH3), 6,69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,38-7,44 (m, 1H, ArH), 7,56-7,65 (m, 2H, ArH), 8,09-8,12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 174,4, 158,1, 131,2, 128,8, 128,3, 127,2, 74,9, 61,1, 54,4, 40,5, 27,6, 27,2, 23,9, 21,7, 13,3.
Ejemplo 10: Preparación de L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í1s)
Se prepararon ácido (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico y L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í1s) mediante un método similar al método para preparar L-arginina (R)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í1r) en el Ejemplo 8.
Ácido (S)-2-(1 -acetoxi-n-pentil) benzoico: p.f.: 65-66°C; [a]20D = -37,1° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): 5 (ppm): 0,97 (t, 3H, CH3, J = 6,9 Hz), 1,38-1,52 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,84-1,99 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,17 (s, 3H, CHOCOCH3), 6,69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,38-7,44 (m, 1H, ArH), 7,56-7,65 (m, 2H, ArH), 8,09-8,12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCh): 5 (ppm): 174,4, 131,2, 128,8, 128,3, 127,2, 74,9, 61,1,54,4, 40,5, 27,6, 27,2, 23,9, 21,7, 13,3.
L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í1s): rendimiento 57%, p.f.: 178-179°C; [a]20D = -25,2° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 175 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,76 (t, 3H, CH3, J = 6,0 Hz), 1,13­ 1,33 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,52-1,65 (m, 2H, CHCH2CH2), 1,76-1,83 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 2,01 (s, 3H, COCH3), 3,14 (t, 2H, NHCH2CH2, J = 6,9 Hz), 3,64 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 6,05 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 6,6 Hz), 7,24-7,38 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 177,5, 174,3, 173.8, 138,1, 136,8, 128,7, 127,7, 126,9, 125,8, 74,9, 54,4, 40,6, 35,2, 27,6, 27,2, 24,5, 23,9, 21,7, 20,7, 13,3.
Ejemplo 11: Preparación de aminoguanidina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í7s)
Se preparó aminoguanidina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í7s) con un rendimiento del 43% mediante un método similar al método para preparar aminoguanidina (R)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (Í7r) en el Ejemplo 9; p.f.: 109-111=0; [a]20D = -30,2° (c = 1,00, CH3OH); EM (m/z): 249 [M1-H]-, 75 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): 5 (ppm): 0,97 (t, 3H, CH3, J = 6,9 Hz), 1,38-1,52 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,84-1,99 (m, 2H, CHCH2CH2), 2,17 (s, 3H, CHOCOCH3), 6,69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,38-7,44 (m, 1H, ArH), 7,56-7,65 (m, 2H, ArH), 8,09-8,12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): 5 (ppm): 174,4, 158,1, 131,2, 128,8, 128,3, 127,2, 74,9, 61,1, 54,4, 40,5, 27,6, 27,2, 23,9, 21,7, 13,3.
Ejemplo 12: Preparación de L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato (AHPB)
En condiciones de -30 a -5°C, se añadió gota a gota lentamente una disolución de 1,9 g (10,3 mmol) de arginina en agua (20 ml) a una disolución de ácido (R/S)-2-((1-hidroxi-n-pentil) benzoico (2,2 g, 10,5 mmol) en etanol (20 ml), y la reacción se llevó a cabo con agitación durante 2 horas. La disolución de reacción se concentró hasta sequedad a presión reducida presión, y se añadió una cantidad adecuada de acetona. El sólido blanco precipitado se filtró y se secó al vacío para obtener 3,2 g de AHPB. El sólido es capaz de absorber la humedad muy fácilmente, y el rendimiento es del 79%; EM (m/z ): 207 [M1 -H]-, 175 [M2 H]+; 1H NMR (300 MHz, MeOD): 50,89 (t, 3H, CH3, J = 7,0 Hz), 1,30-1,36 (m, 4H, CH2CH2CH3), 1,74-1,81 (m, 4H, CH2CH2CHCOOH), 1,82-1,92 (m, 2H, CHCH2CH2), 3,21 (t, 2H, NHCH2CH2), 3,57 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7,5 Hz, J2 = 6,0 Hz), 4,86 (dd, 1H, CH2CHOH, J1 = 8,1 Hz, J2 = 4,5 Hz), 7,21-7,32 (m, 1H, ArH), 7,33-7,38 (m, 2H, ArH), 7,57-7,64 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, MeOD): 5177,1, 160.9, 145,7, 141,9, 132,2, 132,1, 132,0, 130,3, 130,2, 129,9, 57,6, 43,9, 40,6, 31,8, 31,6, 27,8, 25,7, 16,5.
Ejemplo 13: Ensayo de solubilidad
Método de ensayo: se pesaron 10 mg de una muestra de ensayo (el sólido se molió en un polvo fino) y se agregaron a una determinada cantidad de disolvente a 25 ± 2°C (la temperatura de un baño de agua se controla a 25°C), y la disolución se agitó vigorosamente durante 30 segundos cada 5 minutos. La disolución se observó a los 30 minutos. Cuando no había partículas o gotas de soluto visibles, la muestra de ensayo se consideraba completamente disuelta.
Resultado del ensayo:
Tabla 1. Solubilidad saturada de los compuestos en agua*
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
* lis: L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato; PHPB: (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio; (S)-NBP: (S)-butilftalida.
Conclusión: La solubilidad en agua del compuesto hs es equivalente al de PHPB, y es significativamente mejor que S-NBP.
Ejemplo 14: Estabilidad preliminar
Método del ensayo:
2018.06.25 se pesaron con precisión 10 mg de la muestra hs y se añadió a un tubo colorimétrico, y se diluyó con un disolvente (agua/metanol) a 10 mL para preparar una disolución madre con una concentración de 1 mg/mL. Para cada ensayo de la muestra, la disolución madre se tomó y se diluyó de forma reciente.
2018.06.29 se pipetearon 200pL de la disolución madre, se añadieron 3800 pL de una fase móvil en la proporción inicial, y se prepararon 10 pL de una muestra de ensayo con una concentración de 50 pg/mL para inyección y análisis.
2018.07.02 se pipetearon 200 pL de la disolución madre, se añadieron 3800 pL de una fase móvil en la proporción inicial, y se prepararon 10 pL de una muestra de ensayo con una concentración de 50 pg/mL para inyección y análisis.
2018.07.07 se pipetearon 200 pL de la disolución madre, se añadieron 3800 pL de una fase móvil en la proporción inicial, y se prepararon 10 pL de una muestra de ensayo con una concentración de 50 pg/mL para inyección y análisis.
Resultado del ensayo:
Los espectrogramas de análisis de estabilidad del compuesto l1s en 2018.06.29, 2018.07.02, y 2018.07.07 se muestran en la Figura 1 y en la Figura 2, en donde la Figura 1 muestra la estabilidad de la disolución de la muestra en H2O, y la Figura 2 muestra la estabilidad de la disolución de la muestra en CH3OH. Conclusión: El compuesto 11 s era básicamente estable en agua y metanol durante el período de ensayo (2018.06.29, 2018.07.02, y 2018.07.07).
Ejemplo 15: Actividad de agregación antiplaquetaria in vitro
Animales de ensayo: conejos blancos de raza neozelandesa, mitad machos y mitad hembras, de 1,8 a 2,2 kg, adquiridos en Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., y criados en una sala de animales SPF limpia e higiénica con temperatura interior controlada a 25 ± 2°C y una humedad relativa del 60-75%. Los animales se emplearon para los experimentos después de 1 semana.
Método del ensayo:
Preparación de plasma rico en plaquetas (PRP) y plasma pobre en plaquetas (PPP)
Los conejos en ayunas durante 12-18 horas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal con una disolución de uretano al 20%. Se separó la arteria carótida común, y se insertó un tubo de polietileno en la arteria carótida común para recoger sangre. La sangre se inyectó en un tubo de centrífuga siliconado que contenía 1/10 en volumen de una disolución de citrato de sodio al 3,8%. La sangre se mezcló suavemente con el anticoagulante de manera uniforme, y se centrifugó a 1000 rpm durante 15 minutos. La suspensión beige superior se pipeteó para obtener el plasma rico en plaquetas (PRP). El plasma restante se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos, y el sobrenadante se pipeteó para preparar el plasma pobre en plaquetas (PPP). El PRP se ajustó con el PPP para hacer el recuento de plaquetas a 1 x 108/mL.
Determinación de la tasa de agregación plaquetaria por turbidimetría a 37°C
Se añadieron 260 pL de plasma rico en plaquetas (PRP) a un tubo turbidimétrico. A continuación se añadieron por separado 10 pL de los compuestos de ensayo con diferentes concentraciones, los fármacos de control positivo o disolución salina normal, y el plasma se incubó a 37°C durante 5 minutos. Después se añadieron secuencialmente 30 mL de inductores. La concentración final de un inductor ADP es 10 |uM, y la concentración final de un inductor AA es 1 mM. Se determinó la tasa de agregación máxima en 5 minutos mediante un agregómetro, y se calculó la tasa
de inhibición de los fármacos sobre la agregación de plaquetas. Tasa de inhibición de la agregación plaquetaria
(IRPA, de sus siglas en inglés) = (tasa de agregación plaquetaria del grupo control - tasa de agregación plaquetaria
del grupo experimental)/tasa de agregación plaquetaria del grupo control x 100%.
Resultado del ensayo:
Tabla 2. Actividad inhibidora de los compuestos de la descripción sobre la agregación plaquetaria inducida por ADP
y AA en conejos*
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A P: Aspirina; R -, R-, y -NBP: R -, R-, y -butiltalida respectivamente; L-Arg: L-arginina; , y (S)-a Pb : ácido (R/S)-, (R)-, y (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico respectivamente; AHPB: L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato; PHPB: (R/S)-2-(1 -hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio; I1, Ir, y Í1s: L-arginina (R/S)-, (R)-, y
(S)-2-(1 -acetoxi-n-pentil) benzoato respectivamente; compuestos I2-I7, I7r, y I7s: véanse los Ejemplos 2-11.
Ejemplo 16: Actividad antitrombótica
1. Efecto sobre el tiempo de sangrado en ratones después de cortar la cola
Animales de ensayo:
Ratones SPF Kunming, con un peso de 18-22 g, adquiridos en Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.,
Ltd., con un número de certificado de SCXK (Beijing) 2010-0002, criados en una sala de animales SPF con temperatura interior controlada a 23 ± 2°C, y se les permite comer y beber libremente. El horario diurno y nocturno
era de 12 horas/12 horas.
Método del ensayo:
48 ratones Kunming, con un peso de 18-22 g, mitad machos y mitad hembras, se dividieron aleatoriamente en 8 grupos: grupo de control negativo, grupo ASP, grupo clopidogrel, grupo ASP clopidogrel, grupo hs , grupo hs aspirina, grupo hs clopidogrel, y grupo hs aspirina clopidogrel. El nivel de dosis de administración de los grupos
de fármaco positivo y los grupos de fármaco de ensayo era de 5 mg/kg, y se administró la misma cantidad de disolución salina normal al grupo de control negativo. A todos los ratones se les administró durante 14 días consecutivos por vía oral una vez al día. Una hora después de la última dosis, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1-2% y se cortaron las colas en 5 mm. Las puntas de las colas se absorbieron secas con papel filtro
cada 30 segundos hasta que el sangrado se detuvo de forma natural. El tiempo de sangrado se define como el intervalo entre el inicio y la finalización del sangrado.
Resultado del ensayo:
Tabla 3. Resultado de sangrado*
Comp. Tiempo de sangrado (min)
Grupo de control 14,28 ± 0,50
Aspirina 22,52 ± 1,31
Clopidogrel 25,28 ± 0,48
Comp. Tiempo de sangrado (min)
Aspirina clopidogrel 27,36 ± 1,36
I1s 25,31 ± 1,01
11 s aspirina 27,85 ± 1,25
11 s clopidogrel 29,69 ± 1,33
11 s aspirina clopidogrel 29,77 ± 1,18
* lis: L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato.
Conclusión: El tiempo de sangrado de los ratones bajo la acción del compuesto hs es equivalente a la del fármaco positivo clopidogrel, y más prolongado que el de la aspirina, lo que sugiere que hs tiene un mejor efecto anticoagulante que la aspirina.
2. Efecto sobre la trombosis del bypass arteriovenoso en ratas
Animales de ensayo:
Ratas SD macho, con un peso de 250-280 g, adquiridas en Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., criadas en un entorno de reproducción SPF con temperatura interior controlada a 23 ± 2°C, y se les permitió comer y beber libremente. El número total de animales es 64.
Grupos de ensayo:
Grupo modelo: inyectado con el mismo volumen de disolución salina normal (que contiene DMSO al 1%) a través de la vena de la cola, y administrado de forma continua durante 7 días. El ensayo se inició 2 horas después de la última dosis (n = 8).
Grupos de fármacos de ensayo: Grupo de aspirina, grupo S-NBP(S-butilftalida), grupo Edaravona, grupo PHPB ((fí/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio), grupo I1, grupo I1 r, y grupo hs . La dosis de todos los fármacos era de 10 mg/kg/día. Los fármacos se formularon en disoluciones salinas normales que contienen DMSO al 1%, y se inyectaron a través de la vena de la cola durante 7 días consecutivos. El ensayo se inició 2 horas después de la última dosis (n = 8).
Método del ensayo:
A las ratas se les inyectó por vía intraperitoneal una disolución de pentobarbital sódico al 3% (30 mg/kg).
Después de la anestesia, las ratas se inmovilizaron en posición supina, y se realizó una incisión cervical media para separar la arteria carótida común derecha y la vena yugular externa izquierda. Se colocó una sutura de 6 cm de largo en el medio de un tubo de polietileno (es necesario pesar la sutura antes de colocarla en el tubo), y el tubo de polietileno se llenó con disolución salina con heparina (50 U/mL). El tubo de polietileno se insertó en los vasos sanguíneos separados para hacer que la arteria y la vena formaran un bucle. Después de 15 minutos de circulación del flujo sanguíneo, se retiró la sutura, y se recogió y pesó inmediatamente la sutura con trombo. A continuación, después de secar la sutura a temperatura ambiente durante 24 horas, se determinó el peso seco. El peso total menos el peso de la sutura era el peso húmedo del trombo, y el peso seco menos el peso de la sutura era el peso seco del trombo. Tasa de inhibición de la trombosis (%) = (peso húmedo/peso seco del trombo en el grupo modelo -peso húmedo/peso seco del trombo en el grupo de administración) -f peso húmedo/peso seco del trombo en el grupo modelo x 100 %
Resultado del ensayo:
Véanse la Figura 3 y la Tabla 4. En la Figura 3: (A) Peso húmedo del trombo; (B) Peso seco del trombo; los datos se expresan como media ± DE (n = 8), *P<0,05, **P<0,01; comparado con el grupo hs: #P<0,05, ## P<0,01.
Tabla 4. Efectos de los compuestos de ensayo sobre la trombosis del bypass arteriovenoso en ratas 0
Comp. Número de Peso húmedo del Tasa de inhibición Peso seco del Tasa de inhibición animales trombo (%) trombo (%) Grupo 8 36,21 ± 1,16 10,04 ± 0,62
modelo
Aspirina 8 21,46 ± 1,76**## 40,74## 6,06 ± 0,46**## 39,67##
S-NBP 8 24,18 ± 1,02**## 33,24## 7,44 ± 0,37**## 25,95## Edaravona 8 24,95 ± 1,20**## 31,12## 8,23 ± 0,53**## 18,05## PHPB 8 30,64 ± 10,21** 15,39 8,90 ± 0,45** 11,32
Comp. Número de Peso húmedo del Tasa de inhibición Peso seco del Tasa de inhibición animales trombo (%) trombo (%) 11 s 8 20,23 ± 1,25** 44,14 5,52 ± 0,44** 45,02
Í1 8 25,81 ± 2,20** 28,72 7,64 ± 0,40** 23,94
11 r 8 29,56 ± 1,84** 18,37 8,51 ± 0,18** 15,23 *P<0,05, **P<0,01, # P<0,05, ## P<0,01.
eS-NBP: S-butilftalida; PHPB: (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio; I1, Ir, y Í1si (R/S)-, (R)-, y L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato respectivamente.
Conclusión: Comparado con el grupo modelo, 10 mg/kg de aspirina, S-NBP, Edaravona, PHPB, Í1s, I1 y Í1r puede reducir significativamente el peso húmedo y seco del trombo en ratas (p<0,01, p<0,01, p<0,01, p<0,01, p<0,01, p<0,01, p<0,01). El efecto inhibitorio del compuesto Í1s sobre la trombosis en ratas es significativamente más fuerte que la misma dosis de aspirina, S-NBP y Edaravona (p<0,01, p<0,01, p<0,01).
Ejemplo 17: Efectos sobre infarto cerebral, edema cerebral y función nerviosa de ratas con isquemia cerebral focal Animales de ensayo:
Ratas SPF SD, con un peso de 200-220 g, mitad machos y mitad hembras, adquiridas en Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., criadas en un entorno de reproducción SPF con temperatura interior controlada a 23 ± 2°C, y se les permitió comer y beber libremente. El número total de animales era de 88.
Grupos de ensayo:
Grupo de operación simulada: volumen igual de disolución salina normal (que contiene DMSO al 1%) (iv. 3 días), TTC, edema cerebral y puntuación de la función neurológica (n = 8);
Grupo modelo: igual volumen de disolución salina normal (que contiene DMSO al 1 %) (iv. 3 días, administración 2 horas después de la reperfusión), TTC, edema cerebral y puntuación de la función neurológica (n = 8);
Grupo S-NBP (S-butilftalida), grupo Edaravona y grupo PHPB (R/S-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio): 10 mg/kg/día (iv. 3 días, administración 2 horas después de la reperfusión), TTC, edema cerebral y puntuación de función neurológica (n = 8);
Grupos I1, Ir, Í1s, y Í7s: 10 mg/kg/día (iv. 3 días, administración 2 horas después de la reperfusión), TTC, edema cerebral y puntuación de la función neurológica (n = 8);
Grupo de administración combinada equimolar de ácido S-APB (S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico) Arg (arginina): (S-APB 5,89 mg/kg Arg 4,10 mg/kg)/día (iv. 3 días, administración 2 horas después de la reperfusión), TTC, edema cerebral y puntuación de la función neurológica (n = 8);
Grupo de administración combinada equimolar de S-APB AGH (clorhidrato de aminoguanidina): (S-APB 7,72 mg/kg AGH 3,41 mg/kg)/día (iv. 3 días, administración 2 horas después de la reperfusión), TTC, edema cerebral y puntuación de la función neurológica (n = 8).
Método del ensayo:
Las arterias cerebrales medias de las ratas se bloquearon mediante un método de sutura ocluida, y se reperfundieron después de 2 horas. 2 horas después de la perfusión, las ratas se inyectaron en la vena de la cola con S-NBP, Edaravona, PHPB, I1, Í1r, Í1s, Í7s, combinación equimolar de S-APB y arginina, combinación equimolar de S-APB y clorhidrato de aminoguanidina, y un volumen igual de disolución salina normal (que contiene DMSO al 1%) Todos los fármacos se formularon en disoluciones salinas normales que contienen DMSO al 1% para la administración, y la duración de la administración se controló en aproximadamente 1 minuto. Los fármacos se administraron por primera vez a las 2 horas de la reperfusión, y se administraron una vez cada 24 horas hasta un total de 3 veces. 2 horas después de la última administración, en primer lugar se obtuvieron las puntuaciones de los defectos neurológicos y a continuación se sacrificaron las ratas de cada grupo. Se extrajeron y pesaron los cerebros completos (peso húmedo), se tiñeron con TTC, y se secaron para determinar los efectos de los compuestos sobre el infarto cerebral y el edema cerebral.
Puntuación de los defectos neurológicos
2 horas después de la última administración, los defectos neurológicos de los animales se clasificaron y puntuaron mediante el método de Longa. Los criterios son los siguientes: 0 puntos: no se observan signos neurológicos; 1 punto: cuando el animal se suspende con la cola levantada, la operación de la extremidad anterior contralateral del animal muestra flexión de muñeca y codo, rotación interna del hombro, abducción del codo, y acercamiento a la pared torácica; 2 puntos: cuando el animal se coloca sobre una superficie lisa y el hombro del lado de la operación se empuja hacia el lado opuesto, la resistencia disminuye; 3 puntos: cuando el animal camina libremente, el animal gira o gira hacia el lado opuesto de la operación; y 4 puntos: el animal presenta parálisis flácida, y no se observan movimientos espontáneos de las extremidades.
Tinción TTC
Después de completar el examen neuroconductual, se hicieron cuatro incisiones coronales en todo el cerebro de las ratas en el quiasma óptico y en posiciones anteroposteriores de 2 mm del quiasma óptico. Después de cortar los cerebros completos en cinco cortes, los cortes de cerebro se colocaron rápidamente en 5 ml de disolución tampón de fosfato que contiene TTC al 2%, y se incubaron a 37°C en la oscuridad. En el proceso de incubación, los cortes de cerebro se giraron una vez cada 5 minutos. Después de 10 minutos de incubación, se extrajeron los cortes de cerebro y se tomaron fotografías con una cámara digital (Olympus C-4000, Japón).Después, el área pálida (área de infarto) y el área no pálida (área normal) se separaron empleando pinzas oftálmicas, y el porcentaje de infarto se calculó con Image pro-plus 6.0 de la siguiente manera:
Porcentaje del infarto (%) = peso del área pálida / (peso del área pálida peso del área no pálida) x 100;
Tasa de inhibición del área del infarto (%) = (porcentaje del infarto del grupo modelo (%) - porcentaje del infarto del grupo de administración (%) / porcentaje del infarto del grupo modelo (%) x 100.
El tejido cerebral teñido se secó en un horno a 105°C, y se pesó (peso seco) después de 24 horas. La fórmula de cálculo del contenido de agua cerebral es como sigue:
Contenido de agua del tejido cerebral (%) = (peso húmedo del tejido cerebral - peso seco del tejido cerebral) / peso húmedo del tejido cerebral x 100%;
Tasa de edema cerebral (%) = contenido de agua del tejido cerebral de cada grupo (%) - contenido de agua del tejido cerebral del grupo de operación simulado (%) / contenido de agua del tejido cerebral del grupo de operación simulado (%) x 100%;
Tasa de inhibición del edema cerebral (%) = (tasa del edema cerebral del grupo modelo (%) - tasa del edema cerebral del grupo de administración (%) / tasa del edema cerebral del grupo modelo (%) x 100%.
Resultado del ensayo:
Los efectos de los compuestos sobre el volumen del infarto, el edema cerebral y los defectos nerviosos de ratas MCAO se muestran en la Figura 4, Tabla 5 y Tabla 6. En la Figura 4: (A) tinción TTC y análisis de imágenes cerebrales; B) datos de volumen de infarto; (C) contenido de agua cerebral; y (D) evaluación del defecto nervioso. Excepto ppara el valor medio para la puntuación de defectos neurológicos (n = 8), otros datos se expresan como media ± DE. *P<0,05, **P<0,01; #P<0,05, ##P<0,01.
Tabla 5. Efectos de los compuestos sobre el volumen del infarto cerebral*
Comp. Volumen del infarto (%) Tasa de inhibición del volumen del infarto (%) Grupo de operación simulada 0 /
Grupo modelo 41,85 ± 2,43 /
S-NBP 14,18 ± 2,69 66,12
Edaravona 14,29 ± 2,58 65,85
PHPB 20,23 ± 3,02 51,66
I1s 9,12 ± 1,18 78,21
I1 16,11 ± 2,74 61,50
I1r 20,14 ± 2,95 51,89
I7s 24,83 ± 2,02 40,67
S-APB Arg 24,93 ± 2,2 40,43
S-APB AGH 25,27 ± 1,80 39,61
* S-NBP: S-butilftalida; PHPB: R/S-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio; I1, Ir, y I1s: L-arginina R/S-, R-, y S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato respectivamente; I7S: aminoguanidina S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato; S-APB: ácido S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico; Arg: L-arginina; AGH: clorhidrato de aminoguanidina.
Tabla 6. Efectos de los compuestos sobre el edema cerebral*
Comp. Edema cerebral (%) Tasa de inhibición del edema cerebral (%)
Grupo de operación simulada 0 /
Grupo modelo 16,04 ± 2,82 0
S-NBP 4,45 ± 4,58 72,28
edaravona 4,49 ± 4,84 72,01
PHPB 10,71 ± 3,55 33,23
11 s 0,18 ± 3,96 98,85
I1 4,97 ± 3,30 69,00
11 r 10,72 ± 4,19 33,20
l7s 12,34 ± 4,57 23,07
S-APB Arg 11,54 ± 4,57 28,05
S-APB AGH 12,90 ± 4,86 19,58
* S-NBP: S-butilftalida; PHPB: R/S-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato de potasio; Ii, Ir, y lis: L-arginina R/S-, R-, y S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato respectivamente; l7s: aminoguanidina S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato; S-APB: ácido S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico; Arg: L-arginina; AGH: clorhidrato de aminoguanidina.
Conclusión: L-arginina S-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (hs) tiene los efectos inhibitorios más significativos sobre el infarto cerebral y el edema cerebral en ratas y efectos de mejora neurológica significativos en ratas con isquemia cerebral focal 2 horas después de la reperfusión, es mejor que la dosis equimolar de S-APB y L-arginina en combinación, y es mejor que la misma dosis de S-NBP, PHPB y Edaravona.
El método para ensayar los efectos de la L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato (AHPB) sobre el infarto cerebral, el edema cerebral y la función neurológica de ratas con isquemia cerebral focal es el mismo que el anterior, y los resultados son los siguientes:
El efecto del compuesto AHPB sobre el volumen del infarto, el edema cerebral y los defectos nerviosos en ratas MCAO se muestra en la Figura 5, la Tabla 7 y la Tabla 8. En la Figura 5: (A) tinción TTC y análisis de imágenes cerebrales; B) datos de volumen del infarto; (C) contenido de agua cerebral; (D) evaluación del defecto nervioso 12 horas después de la reperfusión; (E) evaluación del defecto nervioso 24 horas después de la reperfusión. Excepto por el valor medio para la puntuación de los defectos neurológicos (n = 8), otros datos se expresan como media ± DE. *P<0,05, **P<0,01.
Tabla 7. Efecto de la L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato (AHPB) sobre el volumen del infarto*
Método de administración Comp. (dosis) Volumen del Tasa de inhibición del volumen infarto (%) del infarto (%)
/ Grupo de operación 0 /
simulada
Al inicio de la reperfusión, Grupo modelo 49,19 ± 11,16 /
administración iv NBP (5 mg/kg) 28,55 ± 8,25 41,96
AHPB (5 mg/kg) 29,98 ± 4,99 39,06
AHPB (10 mg/kg) 19,83 ± 3,95 59,69
AHPB (20 mg/kg) 17,71 ± 4,65 64,00
2 horas después del inicio de la Grupo modelo 49,61 ± 9,14 /
reperfusión, administración iv NBP (5 mg/kg) 36,50 ± 7,58 26,43
AHPB (5 mg/kg) 37,54 ± 6,94 24,34
AHPB (10 mg/kg) 25,70 ± 4,75 48,19
AHPB (20 mg/kg) 23,56 ± 5,29 52,51
* NBP: butilftalida; AHPB: L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato.
Tabla 8. Efecto de la L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato (AHPB) sobre el edema cerebral* Método de administración Comp. (dosis) Edema Tasa de inhibición del edema cerebral (%) cerebral (%)
/ Grupo de operación 0 /
simulada
Al inicio de la reperfusión, administración iv Grupo modelo 9,71 ± 1,39 /
NBP (5 mg/kg) 5,80 ± 1,83 40,21
AHPB (5 mg/kg) 5,94 ± 2,45 38,82
AHPB (10 mg/kg) 2,01 ± 2,91 79,34
AHPB (20 mg/kg) 2,08 ± 4,58 78,57
2 horas después del inicio de la reperfusión, Grupo modelo 9,44 ± 4,17 /
administración iv NBP (5 mg/kg) 6,72 ± 4,05 28,80
AHPB (5 mg/kg) 6,50 ± 1,86 31,12
AHPB (10 mg/kg) 3,03 ± 2,87 67,94
AHPB (20 mg/kg) 1,64 ± 3,36 82,57
* NBP: butilftalida; AHPB: L-arginina (R/S)-2-(1-hidroxi-n-pentil) benzoato.
Conclusión: Al mismo tiempo de la reperfusión o 2 horas después de la perfusión, la inyección intravenosa de dosis bajas (5 mg/kg) de AHPB no tiene una diferencia significativa sobre los efectos de mejorar el infarto cerebral, el edema cerebral y la función neurológica en ratas con isquemia cerebral focal en comparación con NBP (5 mg/kg), mientras que las dosis medias y altas (10, 20 mg/kg) de AHPB son mejores que NBP (5 mg/kg) para mejorar el infarto cerebral y el edema cerebral, y son equivalentes a NBP (5 mg/kg) en la mejora de la función neurológica. Ejemplo 18: Farmacocinética
Animales de ensayo:
12 ratas macho SD limpias, proporcionadas por Qinglongshan Animal Breeding Farm en el distrito de Jiangning, Nanjing. El número de licencia de producción es SCXK (Jiangsu)2017-0001. El peso corporal de las ratas oscila de 180 a 220 g. Las ratas se emplearon después de criarse en el laboratorio de un centro de experimentación animal durante 2 días después de la compra, en ayunas durante 12 horas antes de la administración y 6 horas después de la administración, y se les permitió beber libremente durante el período de ensayo.
Método del ensayo:
Las ratas se inyectaron con L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (hs) (25 mg/kg) en las venas de la cola, y se extrajo sangre del fondo del plexo venoso de las ratas en varios momentos. La concentración de los fármacos y metabolitos originales en la sangre de la rata se determinó mediante LC-MS/MS, y se empleó el programa informático profesional de farmacocinética WinNonlin y un método de momento estadístico para el cálculo para obtener los parámetros farmacocinéticos correspondientes.
Resultado del ensayo:
1. El compuesto I1s se metabolizó rápidamente en el organismo en el correspondiente ácido carboxílico y L-arginina. Se detectaron en el plasma el metabolito activo ácido (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoico (abreviado como metabolito M2), ácido (S)-2-(1 -hidroxi-n-pentil) benzoico (el producto de desacetilación de M2) (M3) y ('S)-NBP (M4), 2 minutos después de la administración, en donde M2 y M4 eran los metabolitos principales, y la concentración del metabolito intermedio M3 era relativamente baja.
2. Después de la inyección intravenosa, la concentración plasmática primero disminuyó rápidamente con el tiempo, lo que podría estar relacionado con la rápida distribución del fármaco en el organismo. Posteriormente, la concentración plasmática descendió de forma lenta relativamente y entró en una fase de eliminación. En combinación con la curva de tiempo-semilogaritmo de la concentración plasmática, el fármaco se ajusta básicamente a las características de un modelo de dos compartimentos (véase la Figura 6).
3. Según los parámetros farmacocinéticos, las vidas medias (t1/2) de los principales metabolitos activos M2 y M4 en plasma eran de aproximadamente 3 horas (véase la Tabla 9), y eran más prolongadas que las vidas medias de NBP (44 minutos) y PHPB (45 minutos) (Acta Pharmacol Sin., 2018, 39, 275-285).
4. Según los parámetros farmacocinéticos, los volúmenes aparentes de distribución Vz y las tasas de eliminación CL de M2, M3, y M4 eran relativamente grandes, lo que sugiere que se distribuyeron ampliamente en el organismo y se podrían distribuir rápidamente desde el plasma hasta el tejido periférico o el tejido cerebral (véase la Tabla 9).
Tabla 9. Parámetros farmacocinéticos de cada metabolito en ratas tras la administración de hs
M2 M3 M4
Parámetro Unidad
1 2 3 1 2 3 1 2 3 t1/2 h 2,71 3,34 3,87 5,13 5,79 16,57 2,99 3,43 3,39 Cmáx ng/ml 51434,8 53513,2 52069,2 736,7 876,5 569,2 69795,2 65700,2 52513,6 AUC(0-t) h*ng/ml 31712,4 28614,9 28503,7 517,6 577,8 492,6 40061,1 34160,8 32828,9 ABC(0-m) h*ng/ml 31765,4 28748,5 28703,5 624,1 673,9 858,7 40153,8 34287,8 32988,3 Vz ml/kg 3075,2 4184,2 4858,4 296272,1 310110,9 695865,2 2683,8 3610,5 3704,0 Cl ml/h/kg 787,02 869,61 870,97 40054,77 37097,53 29113,43 622,61 729,12 757,84
5. Los metabolitos activos M2, M3, y M4 se pudieron detectar en el tejido cerebral. La concentración de M4 en el cerebro es mayor que la de las dosis equimolares de NBP y PHPB (Acta Pharmacol Sin., 2018, 39, 275-285), y el M2, M3, y M4 se eliminaron rápidamente con el tiempo, lo que indica que M2, M3, y M4 podían atravesar la barrera hematoencefálica, eran beneficiosos para desempeñar un papel en el tejido cerebral, y no se acumularían en el cerebro durante un tiempo prolongado como para causar toxicidad (véanse la Tabla 10 y la Figura 7).
Tabla 10. Datos de concentración de cada metabolito en el tejido cerebral de rata después de la inyección intravenosa de hs
Concentración en tejido cerebral (ng/g)
Tiempo M2 M3 M4
1 2 3 Media 1 2 3 Media 1 2 3 Media 0,5 326,26 296,3 322,22 314,95 76,81 118,09 137,0 110,64 633,25 556,35 627,76 605,79
6 1
1 375,34* 39,11 58,82 48,96 35,51 39,47 32,78 35,92 388,42* 131,66 119,84 125,75 6 26,11 46,98 46,66 39,92 31,14 31,33 32,14 31,54 51,78 27,06 30,85 36,56 Conclusión: El compuesto L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (hs) tiene excelentes propiedades farmacocinéticas.
Ejemplo 19: Actividad inhibidora de la ciclooxigenasa (COX)
Instrumentos de ensayo:
Limpiador ultrasónico SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.; gabinete de almacenamiento de medicamentos YC-300L, Zhongke Meiling Cryogenics Co., Ltd.; horno de secado por aire comprimido GZX-9140MBE, Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd., fábrica de equipos médicos; medidor de agua ultrapura con bomba Direct-Q, Millopore Corporation; balanza electrónica BS224: Beijing Sartorius Instrument & System Co., Ltd.; agitador magnético 78-1, Changzhou Guohua Electric Co., Ltd.; centrífuga de alta velocidad y baja temperatura 3K15, Sigma Corporation; lector de microplacas multifuncional de placa de pocillos Berthold LB941, Berthold Corporation.
Método del ensayo:
Se determinó el porcentaje de inhibición de cada muestra sobre COX-1 y COX-2. La fórmula de cálculo es la siguiente: Tasa de inhibición (%) = (UFR 100% control de actividad enzimática - UFR de la muestra) / (UFR 100% control de actividad enzimática - UFR control en blanco) x 100%, en donde UFR es la unidad de fluorescencia relativa. Para que un inhibidor sea efectivo, el valor de la CI50 se determinó después de ensayar el efecto de la dosis del inhibidor.
Resultado del ensayo:
Tabla 11. Valores de la CI50 de compuestos que inhiben la actividad de COX-1 y COX-2
Comp. CI50 (pM)
COX-1 COX-2
Aspirina 24,27 ± 2,15 1132 ± 76,51
11 s 56,41 ± 3,79 1279 ± 102,5
Conclusión: La actividad del compuesto hs en la inhibición de la COX-1 es significativamente menor que la de la aspirina, lo que sugiere que el compuesto hs tiene menos reacciones adversas del tracto gastrointestinal que la aspirina. La actividad del compuesto I1s en la inhibición de la COX-2 es similar a la de la aspirina, lo que sugiere que tanto el compuesto I1s como la aspirina tienen efectos inhibidores considerables sobre la inflamación mediada por COX-2.
Ejemplo 20: Ensayo preliminar de seguridad
1. Ensayo de toxicidad aguda
Animales de ensayo:
Ratones ICR, proporcionados por Shanghai Lingchang Biotech Co., Ltd. La licencia de producción de animales de laboratorio es SCXK (Shanghai) 2013-0018, el número de certificado es 2013001834483, y la licencia de uso de animales de laboratorio es SYXK (Jiangsu) 2017-0015. Los ratones tienen 5-6 semanas de edad, pesan 18-22 g, hembras; y el número de animales es 50.
Método del ensayo:
Sobre la base del experimento preliminar, el gradiente de concentración en la ensayo de toxicidad aguda de hs se estableció en: 1500, 1300, 1100, 900, 700 mg/kg; y la concentración de fármaco correspondiente era: 150, 130, 110, 90, 70 mg/mL. El fármaco de ensayo se preparó en disoluciones de fármaco de la concentración correspondiente para administración isométrica única (inyección en la vena de la cola), se registraron varios síntomas de envenenamiento y muerte en ratones, y los animales muertos se sometieron a autopsia. El período de observación es de 14 días.
Resultado del ensayo:
Después de que a los ratones se les inyectara una dosis más alta de hs en la vena de la cola, los ratones tuvieron convulsiones y disminución de la actividad, y algunos ratones murieron después de 24 horas. Se disecaron los ratones muertos de cada grupo, y había congestión en el área precordial, y no había anormalidades obvias en los otros órganos. Los cambios de peso corporal de cada grupo de muestra se muestran en la Tabla 12, y la distribución de muertes y los resultados del cálculo del valor DL50 (método Bliss) se muestran en la Tabla 13.
Tabla 12. El efecto de la inyección intravenosa del compuesto hs sobre el peso corporal (M ± DE)
Figure imgf000019_0001
Tabla 13. Muerte y valor DL50 de la inyección intravenosa del compuesto lis
Figure imgf000020_0001
Conclusión: El valor DL50 de la administración intravenosa del compuesto L-arginina (S)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato (lis) es 1119,5038 mg/kg.
2.Ensayo del efecto sobre el canal de potasio hERG
Empleando la tecnología de detección automática de abrazaderas de parche, se investigaron los efectos del compuesto l1s y ('S)-NBP sobre el canal de potasio hERG de células CHO-hERG a diferentes concentraciones de administración. Los resultados muestran que la CI50 de l1s y (S)-NBP son ambos superiores a 40 pM, pero la tasa de inhibición (37,56%) de hs a la concentración máxima es inferior a la de (S)-NBP (41,45%), lo que sugiere que la toxicidad de hs para el corazón puede ser inferior a la de (S)-NBP.
3. Ensayo de mutación inversa bacteriana
Se realizó el ensayo de mutación inversa microbiana (prueba de Ames) en el compuesto hs para determinar si 11 s tiene mutagenicidad potencial. Las bacterias de ensayo son las cepas TA97, TA98, TA100 y TA102 deficientes en histidina de Salmonella typhimurium, y el intervalo de dosis de la muestra de ensayo es 0,1-1000 pg/placa. El ensayo se realizó en condiciones paralelas con y sin una mezcla de enzima de hepatomicrosoma de mamífero (S9), y los resultados eran todos negativos.
Ejemplo 21: Método de preparación de la composición farmacéutica
1. Comprimidos
Figure imgf000020_0002
Método de preparación: Los ingredientes activos, el almidón, la celulosa microcristalina y la carboximetilcelulosa sódica se mezclaron uniformemente según las proporciones. La mezcla se humedeció con agua y se convirtió en gránulos. Los gránulos se secaron y dimensionaron. Se añadió estearato de magnesio, y después de mezclar, la mezcla se prensó para obtener comprimidos del producto.
2. Cápsulas
Figure imgf000020_0003
Método de preparación: según una fórmula, los ingredientes activos y los agentes auxiliares se mezclaron, granularon y tamizaron, y la mezcla obtenida se introdujo en cápsulas duras solubles en el estómago según la cantidad cuantitativa para obtener cápsulas del producto.
3. Inyección intravenosa
Figure imgf000021_0001
Método de preparación: Se disolvió (S)-2-(1-aciloxi-n-pentil) benzoato soluble en agua en una cantidad adecuada de agua para inyección. Se añadió una cantidad adecuada de cloruro de sodio para inyección. El embotellado y la esterilización se realizaron en condiciones asépticas para obtener el líquido de inyección intravenosa del producto.
4. Inyección intravenosa liofilizada
Figure imgf000021_0002
Método de preparación: Se disolvió (S)-2-(1-aciloxi-n-pentil) benzoato soluble en agua en una cantidad adecuada de agua para inyección y manitol. Después de la filtración, el embotellado y la liofilización, se obtuvo una inyección intravenosa liofilizada. Cuando está en uso, la inyección intravenosa liofilizada se diluye con una disolución salina normal al 0,9% o una inyección de dextrosa al 5% para inyección intravenosa o goteo intravenoso.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula general I,
Figure imgf000022_0001
R1 es un alquilo C1-C8, arilo o heteroarilo; y
H2N-R2 es un aminoácido básico o aminoguanidina.
2. El compuesto de fórmula general I según la reivindicación 1, en donde el centro quiral del resto ácido 2-(1 -aciloxin-pentil) benzoico representado por * es de una configuración (R)-, (S)- o (R/S)-.
3. El compuesto de fórmula general I según la reivindicación 1 o 2, en donde R1 es metilo, etilo, n-propilo o fenilo.
4. El compuesto de fórmula general I según la reivindicación 1 o 2, en donde el aminoácido básico es L-arginina, L-lisina o L-histidina.
5. El compuesto de fórmula general I según la reivindicación 1 o 2, seleccionado de los siguientes compuestos: L-arginina (R/S)-2-(1 -acetoxi-n-pentil) benzoato
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
aminoguanidina (ñyS)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato
Figure imgf000023_0002
L-arginina (fl)-2-(1-acetoxi-n-pentil) benzoato
Figure imgf000023_0003
Figure imgf000024_0001
6. Un método de preparación del compuesto de fórmula general I según la reivindicación 1, que comprende las siguientes etapas:
Figure imgf000024_0002
(1) a baja temperatura y en presencia de una base orgánica, añadir gota a gota anhídrido de ácido o cloruro de acilo a una disolución de disolvente orgánico de un compuesto II, y acidificar la disolución de reacción después de la reacción para precipitar un compuesto sólido blanco III; y
(2) disolver el compuesto III obtenido en la etapa (1) en alcohol, añadir H2N-R2 para formar una sal, y después de la reacción, filtrar y recristalizar el precipitado con alcohol para obtener un compuesto I.
7. El método de preparación según la reivindicación 6, en donde en la etapa (1), la temperatura de reacción es de -30 a -5°C; la base orgánica es 4-dimetilaminopiridina, dietilamina, trietilamina o piridina; el disolvente orgánico es uno o una combinación de dos de éter dietílico, tetrahidrofurano, diclorometano, triclorometano o acetona; el ácido es ácido clorhídrico concentrado o diluido, ácido sulfúrico o ácido nítrico; y la disolución de reacción se acidifica a pH 2-6.
8. El método de preparación según la reivindicación 6, en donde en la etapa (2), la temperatura de reacción es de -5 a 30°C, y el alcohol es etanol, metanol, propanol o isopropanol.
9. Una composición farmacéutica, que comprende el compuesto I según la reivindicación 1 y un vehículo aceptable farmacéuticamente.
10. El compuesto I según la reivindicación 1 para su uso para prevenir o tratar enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares isquémicas, resistir a la trombosis y mejorar los trastornos de la circulación cardio-cerebral.
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