KR102563378B1 - 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산 및 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘이 형성하는 염, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산(2-(1-acyloxy-n-pentyl)benzoic acid)과 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘(aminoguanidine)이 형성하는 염, 이의 제조 방법, 이러한 염의 약제학적 제제, 및 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료, 항혈전, 심뇌혈관 순환장애 개선 약물 제조에서 이의 응용을 제공한다. 본 발명의 화합물은 우수한 수용성, 수용액 안정성 및 약동학적 특성뿐만 아니라 강력한 항혈소판 응집, 항혈전, 항뇌허혈(anti-cerebral ischemia) 및 신경 보호의 활성을 갖는다.

Description

2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산 및 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘이 형성하는 염, 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 약물화학 및 약물치료학 분야에 속하는 것으로, 더욱 상세하게는 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산(2-(1-acyloxy-n-pentyl)benzoic acid)과 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘이 형성하는 염, 이의 제조 방법, 이러한 염류 화합물을 포함하는 약학 조성물 및 이의 의약 용도에 관한 것이며, 특히 허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료, 항혈전 및 심뇌혈관 순환장애 개선 약물 제조에의 응용에 관한 것이다.
3-n-부틸프탈라이드(3-N-butylphthalide, NBP)는 부틸프탈라이드라고 부르며 화학명칭은 라세믹(R/S)-3-n-부틸-1(3H)-이소벤조푸라논 (racemic(R/S)-3-n-butyl-1(3H)-isobenzofuranone)이다. 이는 중국에서 자체 개발하여 시중에서 판매되고 있는 경도, 중도 허혈성 뇌졸중 치료 약물이다. NBP는 정확한 항혈소판 응집, 항혈전, 뇌경색 부피 감소, 미토콘드리아 기능 보호, 뇌 미세 순환 개선 등 다양한 생물 활성을 가지고 있으나, 단일 약품으로 전체 치료 효과가 우수하지 않아 임상적으로 종종 다른 약물과 함께 사용된다. 또한 NBP는 끓는점이 높은 유상물이므로, 여러 차례 고온, 고진공증류(High Vacuum Distillation)를 거쳐야만 합격 의약품을 획득할 수 있으므로 대량 생산이 비교적 어렵다. NBP는 수용성이 매우 떨어지기 때문에, 주사제제는 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린(hydroxypropyl-β-cyclodextrin)으로 코팅한 후 염화나트륨 및 주사용 물을 첨가해 제제화해야 한다. 따라서 생산 공정에서 자주 사용되는 주사제가 상대적으로 복잡하며 비용이 비교적 높다. NBP의 활성 개선 및/또는 그 수용성의 향상을 위하여, 사람들은 구조를 개질 및 개선하였다.
중국 특허 ZL98125618.x와 ZL 9910 9673.8은 (R)- 및 (S)-NBP의 제조 공정 및 이의 항혈소판 응집, 항혈전 활성을 개시하였다. 여기에서 (S)-NBP의 활성은 (R)-NBP 및 NBP보다 우수하다.
중국 특허 ZL01109795.7은 NBP 개환 화합물, 즉 (R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산과 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 아연, 아닐린(aniline), 벤질아민(benzylamine), 모르폴린(morpholine) 또는 디에틸아민(diethylamine)이 염을 형성하는 방법 및 이의 용도를 개시하였다. 여기에서 칼륨염((R/S)-PHPB, PHPB라고 칭함)은 비교적 높은 수용성을 가지며, 생체 내에서 NBP로 전환될 수 있고, 항뇌허혈 활성을 발휘하며, 생체이용률은 NBP보다 우수하다(Acta Pharmacol.Sin., 2018, 39, 275-285).
중국 특허 ZL200410048268.9는 (S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산의 1가 금속 이온 리튬, 나트륨, 칼륨 또는 2가 금속 이온 마그네슘, 칼슘, 아연 또는 유기 염기 벤질아민, tert-부틸아민(tert-butylamine), N,N'-디벤질에틸렌디아민 (N,N'-dibenzylethylenediamine)염의 공정 및 이의 활성을 개시하였다. 여기에서 (S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산 칼륨염((S)-PHPB)의 항뇌허혈 활성은 (R)-PHPB 및 (S)-NBP보다 우수하다.
중국 특허 ZL 201110115922.3은 NBP의 티오(thio), 셀레노(seleno) 동족체의 제조 방법 및 의약 용도를 개시하였으며, 여기에서 티오 동족체의 항뇌허혈과 항산화 활성은 NBP보다 우수하다.
현재, PHPB 및 (S)-NBP는 이미 II-III기 및 I-II기 임상 연구에 각각 진입했으며 허혈성 뇌졸중을 치료한다.
출원인은 앞서 L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(AHPB)을 설계 및 합성하였다(가오양(高洋), 중국약과대학 석사졸업논문, 2016). 연구에 따르면, AHPB는 수용성이 뛰어나고 이의 항혈소판 응집, 항뇌허혈 및 신경 보호의 활성은 등몰(equimolar)의 NBP보다 우수하나, 화학적 안정성이 떨어진다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 단점을 보완하기 위해 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산과 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘 반응으로 수득한 화합물 I을 제공하며, 상기 신규 화합물 I의 제조 방법, 이러한 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 이의 제약 용도를 제공하는 데에 있다.
본 발명에 따른 식 I로 표시되는 화합물은 하기와 같다.
여기에서,
R1은 C1-C8 알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고,
H2N-R2는 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘이다.
여기에서 별표 *는 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산 부분의 키랄 중심을 나타내며, (R)-, (S)- 또는 (R/S)- 구성일 수 있다.
바람직하게는, 상기 R1은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 페닐이다.
바람직하게는, 상기 염기성 아미노산은 L-아르기닌(L-arginine), L-라이신(L-lysine) 또는 L-히스티딘(L-histidine)이다.
더욱 바람직하게는, 상기 식 I 화합물은 하기 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
L-아르기닌(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(R/S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
L-아르기닌(R/S)-2-(1-프로피오닐옥시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(R/S)-2-(1-propionyloxy-n-pentyl)benzoate)
L-아르기닌(R/S)-2-(1-n-부티릴옥시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(R/S)-2-(1-n-butyryloxy-n-pentyl)benzoate)
L-아르기닌(R/S)-2-(1-벤조일옥시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(R/S)-2-(1-benzoyloxy-n-pentyl)benzoate)
L-라이신(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-lysine(R/S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
L-히스티딘(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-histidine(R/S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
아미노구아니딘(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(aminoguanidine(R/S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
L-아르기닌(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(R)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
아미노구아니딘(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(aminoguanidine(R)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
아미노구아니딘(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(aminoguanidine(S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate)
본 발명은 식 I 화합물의 제조 방법을 더 개시하며, 여기에는 하기 단계가 포함된다.
(1) 저온 및 유기 염기의 존재 하에서, 화합물 II의 유기 용매 용액에 무수물 또는 염화 아실을 점적하고, 반응이 종료되면 산화하여 백색 고체 화합물 III을 석출한다.
(2) 단계 (1)로부터 수득된 화합물 III을 알코올에 용해시킨 다음, H2N-R2를 첨가하여 염을 형성하고, 반응 후 석출된 침전물을 여과하며, 알코올 재결정을 거쳐 화합물 I을 수득한다.
더 나아가, 단계 (1)에 있어서, 반응 온도는 -30 내지 -5℃이고, 유기 염기는 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine), 디에틸아민(diethylamine), 트리에틸아민(triethylamine) 또는 피리딘(pyridine)이고, 유기 용매는 디에틸에테르(diethyl ether), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 디클로로메탄(dichloromethane), 트리클로로메탄(trichloromethane) 또는 아세톤(acetone) 중 하나 또는 둘의 조합이고, 산은 진하거나 묽은 염산, 황산 또는 질산이고, pH 2 내지 6으로 산화된다.
단계 (2)에 있어서, 반응 온도는 -5 내지 30℃이고, 알코올은 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 이소프로판올이다. 염기성 아미노산은 L-아르기닌, L-라이신 또는 L-히스티딘이다.
본 발명은 상기 화합물 I 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 개시한다.
허혈성 심혈관 질환 예방 또는 치료, 항혈전 및 심뇌혈관 순환장애 개선 약물 제조에서 상기 화합물 I의 응용도 본 발명의 보호 범위 내에 속한다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 각종 제형은 당업자가 약학 분야의 일반적인 생산 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분을 하나 이상의 담체(부형제로 칭하기도 함)와 혼합한 다음, 이를 정제, 캡슐, 과립제를 포함하여 원하는 제형으로 제조하며, 주사제의 일반적인 생산 방법에 따라 정맥 주사제 또는 정맥 주사 동결건조제로 제조할 수도 있다.
본 발명의 화합물 및 약학 조성물은 허혈성 심혈관 질환 예방과 치료, 항혈전 및 심뇌혈관 순환장애 질환 개선 약물 제조에 사용될 수 있으며, 상기 질환에는 심근경색, 협심증, 부정맥, 관상동맥 심장 질환, 뇌경색 및 뇌졸중이 있다.
본 발명의 화합물은 (1) 제약 산업에서 허혈성 뇌졸중 환자에게 적합한 약의 정맥 주사제 또는 정맥 주사 동결건조제를 가공하기가 용이한 우수한 수용성과 수용액 안정성, (2) 체내에서 상승 작용이 가능한 2가지 활성 단편 방출, (R/S)-, (R)- 또는 (S)-NBP와 특정 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘의 체내 상승 작용, 항허혈성 뇌졸중을 현저하게 강화하는 치료 효과, (3) 현저한 항뇌허혈 및 신경 보호 활성, (4) 우수한 약동학적 특성, 및 (5) 비교적 높은 안전성 등 우수한 성능을 갖는다. 구체적인 설명은 하기와 같다.
본 발명의 화합물 I은 고체 화합물이며, 수용성과 수용액 안정성이 우수하고, 체내에서 상응하는 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산과 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘을 방출할 수 있다. 상기 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산은 에스테레이스(esterase)에 의해 가수분해되어 아실(acyl)을 제거하고, 각각 (R/S)-, (R)- 및 (S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산을 생성하며, 다시 상응하는 (R/S)-, (R)- 및 (S)-NBP를 고리화하고, 항뇌허혈 효과를 발휘할 수 있다. 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘도 매우 중요한 생리적, 약리적 작용을 나타낸다. L-아르기닌은 체내 일산화질소(NO) 합성 효소(NOS) 대사에 의해 심혈관에 유익한 NO로 전환되며(Proc. Nutr. Soc., 2018, 77, 112-123), 식이 섭취로 L-아르기닌을 보충하면 콜레스테롤이 높은 환자의 혈소판 반응 활성을 낮출 수 있고(J Am Coll Cardiol, 1997, 29, 479-485), 죽상동맥경화증을 방지할 수 있다(J Clin Invest, 1992, 90, 1168-1172). L-아르기닌은 혈뇌장벽(BBB) 상의 양이온 아미노산 운반체(CAT1)를 통해 말초 혈액으로부터 뇌로 진입할 수 있으므로, 대뇌 발육에 상당히 중요하다(Microvasc. Res., 2018, 117, 16-21). 또한 MELAS형 미토콘드리아 뇌질환 환자에 L-아르기닌을 정맥 점적 또는 경구 투여하면 뇌혈류 미세 순환이 증가하고 국소 뇌허혈 급성 손상이 감소하며 중풍 증상의 빈도와 심각성 정도가 현저하게 떨어진다(Neurology, 2005, 64, 710-712). 직접 AD 래트 뇌실에 L-아르기닌을 주사하면 현저한 신경 보호 및 항세포사멸 활성이 나타날 수 있다(Transl.Neurosci., 2018, 9, 43-53). L-라이신과 L-히스티딘은 인체 필수 아미노산이며, 신경 신호 전달과 에너지 공급 측면에서 중요한 역할을 한다. 아미노구아니딘은 항뇌허혈(Neurosciences, 2012, 17, 121-126), 신경 보호(Neurochem. Int., 2010, 56, 634-641) 및 항노화(J. Proteomics, 2017, 156, 104-112)의 활성을 갖는다. 따라서 (R/S)-, (R)- 또는 (S)-NBP는 체내에서 상기 특정 염기성 아미노산 또는 아미노구아니딘과 상승 작용을 일으켜 치료 효과를 강화시킬 수 있다. 체내외 연구 결과에 따르면, 본 발명의 화합물은 현저한 항혈소판 응집, 항혈전, 항뇌허혈 및 신경 보호의 활성을 갖는다. 여기에서 (S)-이성질체의 산이 형성하는 염은 (R)-이성질체의 산 또는 (R/S)-라세미체의 산이 형성하는 염보다 우수하며, (S)-NBP 및 PHPB보다 현저하게 우수하다. 본 발명의 화합물은 우수한 약동학적 특성을 더 갖는다. 또한 본 발명의 화합물은 마우스 정맥 주사에 대한 급성 독성이 NBP 및 PHPB보다 현저하게 적다. CHO-hERG 세포 hERG 칼륨 채널의 억제율은 (S)-NBP보다 낮다. 미생물 회복 돌연변이 시험(Ames 시험)의 결과는 음성이다.
도 1은 H2O에서 화합물 I1s 샘플 용액의 안정성 분석 스펙트럼이다.
도 2는 CH3OH에서 화합물 I1s 샘플 용액의 안정성 분석 스펙트럼이다.
도 3은 피험 화합물이 래트 동정맥 우회 혈전에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 4는 화합물이 MCAO 래트의 경색 부피, 뇌부종 및 신경 결손에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 5는 화합물 AHPB가 MCAO 래트의 경색 부피, 뇌부종 및 신경 결손에 미치는 영향을 도시한 것이다.
도 6은 I1s 정맥 주사 후 래트 혈장 중 각 대사산물의 시간-농도 곡선이다.
도 7은 I1s 정맥 주사 후 래트 뇌조직 중 각 대사산물의 시간-농도 곡선에서 약물 농도 막대 그래프이다.
이하에서는 구체적인 실시예를 참고하여 본 출원을 상세하게 설명한다.
물질 유래:
(S)-부틸프탈라이드((S)-NBP)((S)-butylphthalide((S)-NBP))는 중국 특허 ZL98125618.x 방법을 참조하여 제조한다.
칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(PHPB)은 중국 특허 ZL01109795.7 방법을 참조하여 제조한다.
(R/S)-, (R)- 및 (S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산은 중국 특허 ZL200410048268.9 방법을 참조하여 제조한다.
아스피린(Aspirin), L-아르기닌, 에다라본(Edaravone)은 Saen Chemical Technology()에서 구매한다.
클로피도그렐(Clopidogrel)은 Shanghai Yuanye Bio-Technology()에서 구매한다.
실시예 1: L-아르기닌(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1)의 제조
-30 내지 -5℃의 조건에서 10.9g(52.6mmol) (R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(II)이 함유된 디에틸에테르(300mL) 용액에 21.8ml(157.8mmol) 트리에틸아민, 0.6g(5.2mol) DMAP를 순차적으로 첨가한 다음, 11.1mL(157.8 mmol) 아세틸 클로라이드를 천천히 점적하고 5시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 약 35ml의 10% 염산을 첨가하고, pH 2 내지 3까지 산화하여 2시간 동안 교반하며, 유기층을 분리하여 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하여 감압 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피[석유 에테르:에틸 아세테이트(v:v)=10:1]로 9.96g의 백색 침상 결정의 (R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산을 수득하였으며, 수율은 76%이다. m.p.: 65-66℃; MS (m/z): 249 [M1- H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.97 (t, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.38-1.52 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.84-1.99 (m, 2H, CHCH 2 CH2), 2.17 (s, 3H, CHOCOCH 3), 6.69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.38-7.44 (m, 1H, ArH) , 7.56-7.65 (m, 2H, ArH) , 8.09-8.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm):174.4, 131.2, 128.8, 128.3, 127.2, 74.9, 61.1, 54.4, 40.5, 27.6, 27.2, 23.9, 21.7, 13.3.
-5 내지 30℃의 조건 하에서 9.96g(39.8mmol)(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고 교반하여 6.9g(39.8mmol) L-아르기닌을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 9.4g 백색 분말 고체 I1를 수득하였으며, 수율은 56%이다. m.p.: 178-179℃; [α]20 D = +5.2° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.80 (t, 3H, CH3, J = 6.0 Hz), 1.10-1.30 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.54-1.72 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.81-1.88 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 2.06 (s, 3H, CHOCOCH 3), 3.18 (t, 2H, NHCH 2CH2, J = 6.9 Hz), 3.70 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.10 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.29-7.43 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 177.5, 174.3, 173.8, 138.1, 136.8, 128.7, 127.7, 126.9, 125.8, 74.9, 54.4, 40.6, 35.2, 27.6, 27.2, 24.5, 23.9, 21.7, 20.7, 13.3.
실시예 2: L-아르기닌(R/S)-2-(1-프로피오닐옥시-n-펜틸)벤조산(I2)의 제조
-30 내지 -5℃의 조건에서 9.96g(39.8mmol) (R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(II)이 함유된 디에틸에테르(300mL) 용액에 21.8ml(157.8mmol) 트리에틸아민, 0.6g(5.2mmol) DMAP를 순차적으로 첨가한 다음, 13.1mL(157.8mmol) 프로피오닐 클로라이드를 천천히 점적하고 5시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 약 35ml의 10% 염산을 첨가하고, pH 2 내지 3까지 산화하여 2시간 동안 교반하며, 유기층을 분리하여 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하여 감압 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피[석유 에테르:에틸 아세테이트(v:v)=10:1]로 9.0g 유상의 (R/S)-2-(1-프로피오닐옥시-n-펜틸)벤조산을 수득하였으며, 수율은 65%이다. MS (m/z): 263 [M1- H]-; 1H NMR (300MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.96 (t, 3H, CH2CH2CH 3, J = 6.9 Hz), 1.21 (t, 3H, COCH2CH 3, J = 7.8 Hz), 1.32-1.51 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.80-1.98 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.43 (q, 2H, COCH 2CH3, J = 7.5 Hz), 6.68 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.33-7.44 (m, 1H, ArH) , 7.52-7.64 (m, 2H, ArH), 8.03-8.10 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm): 172.8, 171.3, 143.8, 133.5, 130.6, 126.7, 125.7, 72.3, 36.0, 25.9, 27.4, 21.7, 17.9, 13.4, 13.1.
-5 내지 30℃의 조건 하에서 상기 유상 생성물을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고, 교반하며 5.9g(33.9mol) L-아르기닌을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 7.8g의 백색 분말 고체 I2를 수득하였으며, 수율은 52%이다. m.p.: 169-171℃; [α]20 D = +5.5° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 263 [M1- H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.81 (t, 3H, CH2CH2CH 3, J = 6.0 Hz), 1.06 (t, 3H, COCH2CH 3, J = 7.5 Hz), 1.18-1.37 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.53-1.73 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.83-1.91 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 2.38 (q, 2H, COCH 2CH3, J = 7.5 Hz), 3.19 (t, 2H, NHCH 2CH2, J = 6.9 Hz), 3.72 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.18 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.30-7.43 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 179.9, 179.8, 176.9, 159.4, 140.9, 139.1, 131.5, 130.2, 129.6, 128.2, 77.2, 56.9, 43.1, 38.0, 30.3, 20.1, 29.9, 26.5, 24.3, 15.9, 11.1.
실시예 3: L-아르기닌(R/S)-2-(1-n-부티릴옥시-n-펜틸)벤조산(I3)의 제조
-30 내지 -5℃의 조건에서 9.96g(39.8mmol) (R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(II)이 함유된 디에틸에테르(300mL) 용액에 21.8ml(157.8mmol) 트리에틸아민, 0.6g(5.2mmol) DMAP를 순차적으로 첨가한 다음, 15.9mL(157.8mmol) n-부티릴 클로라이드를 천천히 점적하고 5시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 약 35ml의 10% 염산을 첨가하고, pH 2 내지 3까지 산화하여 2시간 동안 교반하며, 유기층을 분리하여 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하여 감압 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피[석유 에테르:에틸 아세테이트(v:v)=10:1]로 8.4g 유상의 (R/S)-2-(1-n-부티릴옥시-n-펜틸)벤조산을 수득하였으며, 수율은 58%이다. MS (m/z): 277 [M1-H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.89-1.06 (m, 6H, 2ХCH3), 1.33-1.51 (m, 4H, CH2CH 2CH 2CH3), 1.7-1.78 (m, 2H, COCH2CH 2CH3), 1.85-1.98 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.41 (t, 2H, COCH 2CH2, J = 7.5 Hz), 6.70 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.35-7.45 (m, 1H, ArH), 7.55-7.64 (m, 2H, ArH) , 8.06-8.11 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm): 173.6, 171.4, 143.9, 132.5, 130.1, 128.1, 126.9, 125.5, 72.4, 36.1, 33.9, 21.5, 21.3, 21.7, 13.4, 8.5.
-5 내지 30℃의 조건 하에서 상기 유상 생성물을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고, 교반하며 5.2g(29.9mol) L-아르기닌을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 7.3g의 백색 분말 고체 I3을 수득하였으며, 수율은 54%이다. m.p.:152-153℃; [α]20 D = +4.6° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 277 [M1-H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.71-0.84 (m, 6H, 2ХCH3), 1.18-1.36 (m, 4H, CH2CH 2CH 2CH3), 1.5-1.58 (m, 2H, COCH2CH 2CH3), 1.63-1.73 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.73-1.95 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 2.26 (t, 2H, CHOCOCH 2CH2, J = 7.2 Hz), 3.19 (t, 2H, NHCH 2CH2, J = 6.6 Hz), 3.74 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.34 (dd, 1H, CH2CHOCOCH2, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.23-7.49 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 176.1, 175.2, 174.3, 156.9, 138.3, 131.5, 129.1, 127.8, 127.4, 125.3, 74.3, 54.4, 40.5, 36.3, 35.8, 27.6, 27.4, 24.1, 21.9, 18.2, 13.4, 13.1.
실시예 4: L-아르기닌(R/S)-2-(1-벤조일옥시-n-펜틸)벤조산(I4)의 제조
-30 내지 -5℃의 조건에서 9.96g(39.8mmol) (R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(II)이 함유된 디에틸에테르(300mL) 용액에 21.8ml(157.8mmol) 트리에틸아민, 0.6g(5.2mmol) DMAP를 각각 첨가한 다음, 21.1mL(157.8mmol) 벤조일 클로라이드를 천천히 점적하고 5시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 약 35ml의 10% 염산을 첨가하고, pH 2 내지 3까지 산화하여 2시간 동안 교반하며, 유기층을 분리하여 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하여 감압 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피[석유 에테르:에틸 아세테이트(v:v)=10:1]로 10.0g 유상의 (R/S)-2-(1-벤조일옥시-n-펜틸)벤조산을 수득하였으며, 수율은 61%이다. MS (m/z): 311[M1-H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.99 (t, 3H, CH3, J =7.2Hz), 1.33-1.63 (m, 4H, CH2CH 2CH 2CH3), 2.03-2.12 (m, 2H, CHCH 2CH2), 6.94 (dd, 1H, CH2CHOCOAr, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 7.40-7.45 (m, 1H, ArH) , 7.45-7.72 (m, 5H, ArH) , 8.13-8.22 (m, 3H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm): 171.4, 165.8, 143.8, 133.2, 132.1, 132.5, 130.8, 129.7, 129.1, 126.9, 126.8, 125.5, 73.8, 73.3, 36.2, 27.6, 22.0, 21.8, 13.4.
-5 내지 30℃의 조건 하에서 상기 유상 생성물을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고, 교반하며 5.5g(31.6mmol) L-아르기닌을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 8.8g의 백색 분말 고체 I4를 수득하였으며, 수율은 58%이다. m.p.: 113-115℃; [α]20 D = +3.8° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 311[M1-H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz,D2O): δ (ppm): 0.83 (t, 3H, CH3, J =7.2 Hz), 1.22-1.42 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.56-1.72 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.72-2.07 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 3.12 (t, 2H, NHCH 2CH2), 3.38 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 7.00 (dd, 1H, CH2CHOCOAr, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 7.15-7.24 (m, 1H, ArH), 7.29-7.39 (m, 2H, ArH), 7.43-7.47 (m, 1H, ArH), 7.51-7.56 (m, 1H, ArH), 7.63-7.68 (m, 1H, ArH), 7.72-7.75 (m, 1H, ArH), 7.89-7.91 (m, 1H, ArH), 8.00-8.08 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 174.4, 133.8, 131.1, 129.5, 128.9, 128.8, 128.7, 128.3, 127.7, 127.0, 125.7, 114.7, 105.3, 84.1, 80.1, 75.4, 54.4, 40.5, 35.6, 27.6, 27.3, 23.9, 21.7, 15.1, 13.3.
실시예 5: L-라이신(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I5)의 제조
-5 내지 30℃의 조건 하에서 9.96g(39.8mmol) (R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(실시예 1의 제조 방법에 따라 수득)을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고 교반하여 5.7g(39.0mmol) L-라이신을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 7.6g 담황색 분말상 고체 I5를 수득하였으며, 수율은 49%이다. m.p.: 122-124℃; [α]20 D = +4.8° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1-H]-, 147 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm: 0.93 (s, 6H, 2ХCH3), 1.28-1.48 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.47-1.67 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.71-1.86 (m, 2H, CH 2CHCOOH), 1.86-2.03 (m, 4H, NH2CH2CH 2CH 2), 2.18 (s, 3H, CHOCOCH 3), 3.09 (m, 2H, NH2CH 2CH2CH2), 3.82 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.28 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.35-7.60 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 177.1, 176.3, 141.0, 139.1, 131.5, 130.3, 129.0, 128.4, 77.5, 57.1, 41.1, 37.9, 32.4, 29.8, 29.0, 24.4, 24.1, 23.3, 19.5, 15.9.
실시예 6: L-히스티딘(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I6)의 제조
-5 내지 30℃의 조건 하에서 9.96g(39.8mmol) (R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(실시예 1의 제조 방법에 따라 수득)을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고 교반하여 6.1g(39.3mmol) L-히스티딘을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 8.4g 백색 분말 고체 I6을 수득하였으며, 수율은 53%이다. m.p.: 137-139℃; [α]20 D = +2.4° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-, 156 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz,D2O): δ ppm: 0.88 (s, 6H, 2ХCH3), 1.21-1.43 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.81-2.00 (m, 2H, CHCH 2), 2.14 (s, 3H, CHOCOCH 3), 3.25-3.36 (m, 2H, CH 2CHCOOH), 4.05 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.19 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1= 8.1 Hz, J2= 6.6 Hz), 7.28-7.35 (m, 1H, ArH), 7.38 (s, 1H, NHCH=C), 7.41-7.53 (m, 3H, ArH), 8.42 (s, 1H, NHCH=N); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 177.3, 173.8, 172.8, 138.3, 136.9, 134.7, 128.9, 127.7, 126.9, 125.8, 117.5, 101.2, 74.9, 53.9, 35.2, 27.2, 26.5, 21.7, 20.7, 13.3.
실시예 7: 아미노구아니딘(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I7)의 제조
5.3g(39.8mol) 아미노구아니딘 중탄산염을 물 50ml에 용해시키고, 교반하며 60℃까지 서서히 가열하고, 냉각한 후 다시 -5 내지 30℃의 조건 하에서 9.96g(39.8mmol) (R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(실시예 1의 제조 방법에 따라 수득)의 무수 에탄올(25mL) 용액에 첨가하며, 반응액을 감압 농축하여 건조시키고, 95% 에탄올로 재결정시켜 6.5g의 백색 분말상 고체 I7을 수득하였으며, 수율은 43%이다. m.p.: 109-111℃; MS (m/z): 249 [M1- H]-, 75 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ ppm: 0.97 (t, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.38-1.52 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.84-1.99 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.17 (s, 3H, CHOCOCH 3), 6.69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.38-7.44 (m, 1H, ArH) , 7.56-7.65 (m, 2H, ArH) , 8.09-8.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 174.4, 158.1, 131.2, 128.8, 128.3, 127.2, 74.9, 61.1, 54.4, 40.5, 27.6, 27.2, 23.9, 21.7, 13.3.
실시예 8: L-아르기닌(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1r)의 제조
-30 내지 -5℃의 조건 하에서 (R)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(5.0g, 24.0mmol)의 디클로로메탄(150mL) 용액에 5.7mL(72.0mmol) 피리딘을 첨가한 다음, 7.2mL(72.0mmol) 아세트산 무수물을 천천히 점적하고 5시간 동안 교반한다. 반응이 완료되면 약 20ml의 10% 염산을 첨가하고, pH 2 내지 3까지 산화하여 2시간 동안 교반하며, 유기층을 분리하여 무수 Na2SO4로 건조시키고 여과하여 감압 농축시킨다. 칼럼 크로마토그래피[석유 에테르:에틸 아세테이트(v:v)=10:1]로 4.8g의 백색 침상 결정의 (R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산을 수득하였으며, 수율은 81%이다. m.p.: 65-66℃; [α]20 D = + 38.2° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-; 1H NMR (300MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.97 (t, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.38-1.52 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.84-1.99 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.17 (s, 3H, CHOCOCH 3), 6.69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.38-7.44 (m, 1H, ArH), 7.56-7.65 (m, 2H, ArH), 8.09-8.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm): 174.4, 131.2, 128.8, 128.3, 127.2, 74.9, 61.1, 54.4, 40.5, 27.6, 27.2, 23.9, 21.7, 13.3.
-5 내지 30℃의 조건 하에서 4.8g(19.2mmol)(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산을 무수 에탄올 25ml에 용해시키고 교반하여 3.3g(19.2mmol) L-아르기닌을 첨가하여 염을 형성하고, 석출된 침전물을 여과하며, 95% 에탄올로 재결정하여 4.6g 백색 분말상 고체 I1r을 수득하였으며, 수율은 57%이다. m.p.: 178-179℃; [α]20 D = +32.8° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.75 (t, 3H, CH3, J = 6.0 Hz), 1.10-1.30 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.48-1.66 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.74-1.82 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 2.01 (s, 3H, COCH3), 3.13 (t, 2H, NHCH 2CH2, J = 6.6 Hz), 3.62 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.05 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.21-7.38 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 177.5, 174.3, 173.8, 138.1, 136.8, 128.7, 127.7, 126.9, 125.8, 74.9, 54.4, 40.6, 35.2, 27.6, 27.2, 24.5, 23.9, 21.7, 20.7, 13.3.
실시예 9: 아미노구아니딘(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I7r)의 제조
2.6g(19.2mol) 아미노구아니딘 중탄산염을 물 15ml에 용해시키고, 교반하며 60℃까지 서서히 가열하고, 냉각한 후 다시 -5 내지 30℃의 조건 하에서 4.8g(19.2mmol) (R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(실시예 8의 제조 방법에 따라 수득)의 무수 에탄올(25mL) 용액에 첨가하며, 반응액을 감압 농축하여 건조시키고, 95% 에탄올로 재결정시켜 1.9g의 백색 분말상 고체 I7r을 수득하였으며, 수율은 43%이다. m.p.: 109-111℃; [α]20 D = +28.9° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-, 75 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.97 (t, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.38-1.52 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.84-1.99 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.17 (s, 3H, CHOCOCH 3), 6.69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.38-7.44 (m, 1H, ArH), 7.56-7.65 (m, 2H, ArH), 8.09-8.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 174.4, 158.1, 131.2, 128.8, 128.3, 127.2, 74.9, 61.1, 54.4, 40.5, 27.6, 27.2, 23.9, 21.7, 13.3.
실시예 10: L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s)의 제조
실시예 8의 L-아르기닌(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)(I1r)과 유사한 제조 방법에 따라 (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산 및 L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s)를 제조한다.
(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산: m.p.: 65-66℃; [α]20 D = -37.1° (c = 1.00, CH3OH); MS(m/z): 249 [M1- H]-; 1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.97 (t, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.38-1.52 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.84-1.99 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.17 (s, 3H, CHOCOCH 3), 6.69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.38-7.44 (m, 1H, ArH) , 7.56-7.65 (m, 2H, ArH), 8.09-8.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ (ppm): 174.4, 131.2, 128.8, 128.3, 127.2, 74.9, 61.1, 54.4, 40.5, 27.6, 27.2, 23.9, 21.7, 13.3.
L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s): 수율은 57%이다. m.p.: 178-179℃; [α]20 D = -25.2° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.76 (t, 3H, CH3, J = 6.0Hz), 1.13-1.33 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.52-1.65 (m, 2H, CHCH 2CH2), 1.76-1.83 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 2.01 (s, 3H, COCH 3), 3.14 (t, 2H, NHCH 2CH2, J = 6.9Hz), 3.64 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 6.05 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 6.6 Hz), 7.24-7.38 (m, 4H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 177.5, 174.3, 173.8, 138.1, 136.8, 128.7, 127.7, 126.9, 125.8, 74.9, 54.4, 40.6, 35.2, 27.6, 27.2, 24.5, 23.9, 21.7, 20.7, 13.3.
실시예 11: 아미노구아니딘(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I7s)의 제조
실시예 9의 아미노구아니딘(R)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)(I7r)과 유사한 제조 방법에 따라 아미노구아니딘(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I7s)를 제조하였으며, 수율은 43%이다. m.p.: 109-111℃; [α]20 D = -30.2° (c = 1.00, CH3OH); MS (m/z): 249 [M1- H]-, 75 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, D2O): δ (ppm): 0.97 (t, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.38-1.52 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.84-1.99 (m, 2H, CHCH 2CH2), 2.17 (s, 3H, CHOCOCH 3), 6.69 (dd, 1H, CH2CHOCOCH3, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.38-7.44 (m, 1H, ArH), 7.56-7.65 (m, 2H, ArH), 8.09-8.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, D2O): δ (ppm): 174.4, 158.1, 131.2, 128.8, 128.3, 127.2, 74.9, 61.1, 54.4, 40.5, 27.6, 27.2, 23.9, 21.7, 13.3.
실시예 12: L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(AHPB)의 제조
-30 내지 -5℃의 조건 하에서 1.9g(10.3mmol) 아르기닌 수용액(20mL)을 (R/S)-2-((1-히드록실-n-펜틸)벤조산(2.2g, 10.5mmol) 에탄올(20mL) 용액에 천천히 점적하고, 2시간 동안 교반한다. 반응액을 감압 농축하여 건조시키고 적절한 양의 아세톤을 첨가하며, 석출된 백색 고체를 여과하고 진공 건조하여 AHPB 3.2g을 수득하였다. 상기 고체는 습기를 매우 잘 흡수하며 수율은 79%이다. MS (m/z): 207 [M1 - H]-, 175 [M2 + H]+; 1H NMR (300 MHz, MeOD): δ 0.89 (t, 3H, CH3, J =7.0 HZ), 1.30-1.36 (m, 4H, CH 2CH 2CH3), 1.74-1.81 (m, 4H, CH 2CH 2CHCOOH), 1.82-1.92 (m, 2H, CHCH 2CH2), 3.21 (t, 2H, NHCH 2CH2), 3.57 (dd, 1H, CH2CHCOOH, J1 = 7.5 Hz, J2 = 6.0 Hz), 4.86 (dd, 1H, CH2CHOH, J1 = 8.1 Hz, J2 = 4.5 Hz), 7.21-7.32 (m, 1H, ArH), 7.33-7.38 (m, 2H, ArH), 7.57-7.64 (m, 1H, ArH); 13C NMR (75 MHz, MeOD): δ 177.1, 160.9, 145.7, 141.9, 132.2, 132.1, 132.0, 130.3, 130.2, 129.9, 57.6, 43.9, 40.6, 31.8, 31.6, 27.8, 25.7, 16.5.
실시예 13: 용해도 측정
시험 방법: 시료(고체를 미세 분말로 연마) 10mg을 칭량하고, 25±2℃(25℃ 수욕 조절 온도)에서 정량의 용매에 첨가하며, 5분마다 30초간 강하게 흔든다. 30분 이내에 용해 상태를 관찰하며, 용질 입자나 액적이 보이지 않으면 완전히 용해된 것으로 간주한다.
시험 결과:
표 1. 수중에서 화합물의 포화 용해도*
* I1s: L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, PHPB: 칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산, (S)-NBP: (S)-부틸프탈라이드.
결론: 화합물 I1s 수용성은 PHPB와 같고, S-NBP보다 현저하게 우수하다.
실시예 14: 1차 안정성
시험 방법:
2018.06.25 - I1s 샘플 10mg을 정밀하게 칭량하여 비색관에 넣고, 용매(물/메탄올) 부피를 10mL로 만들어 농도가 1mg/mL인 저장액으로 제제화한다. 매회 샘플 측정은 모두 저장액을 취하여 새롭게 희석하여 샘플을 측정한다.
2018.06.29 - 저장액 200μL를 취하고, 초기 비율 유동상 3800μL를 첨가하여 농도가 50μg/ml인 시료 10μL로 제제화하여 샘플 분석에 사용한다.
2018.07.02 - 저장액 200μL를 취하고, 초기 비율 유동상 3800μL를 첨가하여 농도가 50μg/ml인 시료 10μL로 제제화하여 샘플 분석에 사용한다.
2018.07.07 - 저장액 200μL를 취하고, 초기 비율 유동상 3800μL를 첨가하여 농도가 50μg/ml인 시료 10μL로 제제화하여 샘플 분석에 사용한다.
시험 결과:
2018.06.29, 2018.07.02, 2018.07.07 기간 동안 화합물 I1s의 안정성 분석 스펙트럼은 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같다. 여기에서 도 1은 H2O 샘플 용액의 안정성이고, 도 2는 CH3OH 샘플 용액의 안정성이다.
결론: 화합물 I1s는 시험 기간(2018.06.29, 2018.07.02, 2018.07.07)에 물 및 메탄올에서 기본적으로 안정적이다.
실시예 15: 체외 항혈소판 응집 활성
시험 동물: 뉴질랜드종 흰 토끼로 암수가 각각 절반이며, 1.8 내지 2.2kg이고 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology()에서 구매하였다. 깨끗하고 위생적인 SPF레벨 동물실에서 실내 온도 25±2℃, 상대 습도 60 내지 75%의 조건에서 1주일 동안 사육한 후 실험에 사용하였다.
시험 방법:
혈소판이 풍부한 혈장(PRP) 및 혈소판이 부족한 혈장(PPP) 제조
12 내지 18시간 금식시킨 토끼를 취하여 20% 우레탄 용액을 복강 주사하여 마취시키고, 총경동맥을 분리하여 폴리에틸렌(polyethylene) 튜브를 삽입해 채혈하고, 1/10 용량을 3.8% 구연산나트륨 용액이 함유된 실리콘화 원심분리관에 주입한다. 혈액을 항응고제와 가볍게 흔들어 혼합하고, 분당 1000rpm으로 15분간 원심 분리를 수행하였다. 상층의 베이지색 현탁액을 흡수하여 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)을 수득한다. 나머지 혈장은 다시 분당 3000rpm으로 15분 동안 원심 분리하고 상청액을 취하여 혈소판이 부족한 혈장(PPP)을 제조한다. PPP로 PRP를 조절하여 혈소판 수를 1×108/ml로 만든다.
비탁법을 채택해 37℃ 조건 하에서 혈소판 응집률 측정
혈소판이 풍부한 혈장(PRP) 260μL를 비탁관에 취한 다음, 각각 10μL의 농도가 상이한 측정할 화합물, 양성 대조약 또는 생리식염수를 첨가한다. 37℃ 조건에서 5분 동안 배양한 다음, 유도제 30μL를 순차적으로 첨가한다. 유도제 ADP 최종 온도는 10μM이고, 유도제 AA 최종 농도는 1mM이다. 혈소판 응집기를 이용해 5분 이내의 최대 응집률을 측정하여 약물 대 혈소판 응집의 억제율을 계산한다. 혈소판 응집 억제율(IRPA)=(대조군 혈소판 응집률-실험군 혈소판 응집율)/대조군 혈소판 응집율×100%.
시험 결과:
표 2. 본 발명의 화합물의 ADP, AA에 의해 유도된 토끼 혈소판 응집에 대한 억제 활성*
* ASP: 아스피린, (R/S)-, (R)-, (S)-NBP는 각각 (R/S)-, (R)-, (S)-부틸프탈라이드, L-아르기닌: (R/S)-, (R)-, (S)-APB는 각각 (R/S)-, (R)-, (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, AHPB: L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산, PHPB: 칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산, I1, Ir, I1s는 각각 L-아르기닌(R/S)-, (R)-, (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, 화합물 I2 내지 I7, I7r, I7s는 실시예 2 내지 11 참고.
실시예 16: 항혈전 활성
1. 마우스 꼬리 전단 후 출혈 시간에 대한 영향
시험 동물:
SPF 레벨 쿤밍(昆明) 마우스이며, 체중은 18 내지 22g이고 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology()에서 구매하였다. 합격 증서는 SCXK(경(京))2010-0002이며, SPF 레벨 동물실에서 실내 온도를 23±2℃로 조절하여 자유롭게 사료와 물을 섭취하도록 사용하였다. 주야 시간은 12시간/12시간이다.
시험 방법:
체중 18 내지 22g의 암수가 각각 절반인 쿤밍 마우스 48마리를 음성 대조군, ASP, 클로피도그렐, ASP+클로피도그렐, I1s, I1s+아스피린, I1s+클로피도그렐, I1s+아스피린+클로피도그렐의 8개 그룹으로 나눈다. 양성 약물군 및 피험 약물군의 약물 용량 수준은 5mg/kg이며, 음성 대조군은 동일한 양의 생리식염수를 투여한다. 모든 마우스에 연속 14일 동안 일일 1회 투여한다. 마지막 1회 투여 1시간 후 1 내지 2% 이소플루란(isoflurane)으로 마우스를 마치하고 꼬리부를 5mm 전단한다. 꼬리부 끝을 30초 간격으로 여과지를 이용해 출혈이 자연 정지될 때까지 흡수 건조시킨다. 출혈 시간은 혈류 시작과 종료의 간격으로 정의한다.
시험 결과:
표 3. 출혈 결과*
* I1s: L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산
결론: 화합물 I1s 작용 후 마우스 출혈 시간은 양성 약물 클로피도그렐과 동일하고, 아스피린보다 길었다. 이는 I1s 항혈액응고 작용이 아스피린보다 우수함을 의미한다.
2. 래트 동정맥 우회 혈전에 대한 영향
시험 동물:
체중이 250 내지 280g인 수컷 SD 래트로 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology에서 구매하였다. SPF 레벨 사육 환경에서 실내 온도를 23±2℃로 조절하여 자유롭게 사료와 물을 섭취하도록 사육하였다. 동물은 총 64마리이다.
시험군 분류:
모델군: 동일한 부피의 생리식염수(1% DMSO 함유)를 연속 7일 동안 꼬리 정맥 주사하며, 마지막 투여 2시간 후 시험을 시작하였다(n=8).
피험 약물군: 아스피린군, S-NBP(S-부틸프탈라이드)군, 에다라본군, PHPB(칼륨((R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산)군 및 I1, I1r과 1s군이다. 모든 약물 용량은 일일 10mg/kg이며, 1% DMSO가 함유된 생리식염수 용액을 제조하여 연속 7일 동안 꼬리 정맥 주사하고, 마지막 투여 2시간 후 시험을 시작하였다(n=8).
시험 방법:
마우스에 3% 펜토바이탈 나트륨(pentobarbital sodium) 용액(30mg/kg)을 복강 주사하여 마취시킨 후, 앙와위로 고정하고 목 정중앙을 절개하여 우총경동맥과 좌총경동맥으로 분리한다. 폴리에틸렌 튜브의 중간 구간에 길이가 6cm인 와이어를 놓고(튜브 캐비티에 넣기 전에 와이어는 먼저 칭량해야 함), 헤파린(heparin) 생리식염수(50U/mL)로 폴리에틸렌 튜브를 채운다. 폴리에틸렌 튜브를 분리된 혈관 내에 삽입하여, 동정맥에 루프를 형성한다. 혈류를 15분 개방한 후 와이어를 제거하고, 혈전이 있는 와이어를 수집하여 즉시 칭량한다. 이어서 와이어를 실온에서 24시간 동안 건조시켜 건중량을 확정하고, 총량에서 와이어 중량을 제하면 혈전 습중량이며, 건조 후 중량에서 와이어 중량을 제하면 혈전 건중량이다. 혈전 억제율(%)=(모델군 혈전 습/건중량-투약군 혈전 습/건중량)÷모델군 혈전 습/건중량x100%
시험 결과:
도 3 및 표 4를 참고한다. 도 3에서 (A)는 혈전의 습중량, (B)는 혈전의 건중량이며, 데이터는 평균값±SD(n=8)을 나타내고, *P<0.05, **P<0.01이다. I1s군과 비교하여 #P<0.05, ##P<0.01이다.
표 4. 피험 화합물이 래트 동정맥 우회 혈전에 미치는 영향⊙
*P<0.05, **P<0.01, #P<0.05, ##P<0.01.
⊙S-NBP: S-부틸프탈라이드, PHPB: 칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산; I1, Ir, I1s는 각각 L-아르기닌(R/S)-, (R)-, (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산.
결론: 모델군과 비교하여, 10mg/kg의 아스피린, S-NBP, 에다라본, PHPB 및 I1s, I1 및 I1r은 모두 래트 혈전 습중량과 건중량을 현저하게 감소시켰으며(p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.01，p<0.01), 화합물 I1s의 래트 혈전 형성에 대한 억제 작용은 동일 용량의 아스피린, S-NBP 및 에다라본보다 현저하게 강하였다(p<0.01，p<0.01，p<0.01).
실시예 17: 국소 뇌허혈 래트 뇌경색, 뇌부종 및 신경 기능에 대한 영향
시험 동물:
체중이 200 내지 220g이고 암수가 각각 절반인 SPF 레벨 SD 래트는 Beijing Vital River Laboratory Animal Technology에서 구매하였다. SPF 레벨 사육 환경에서 실내 온도를 23±2℃로 조절하여 자유롭게 사료와 물을 섭취하도록 사육하였다. 동물은 총 88마리이다.
시험군 분류:
모의 수술군: 동일한 부피의 생리식염수(1% DMSO 함유)(iv.3day), TTC, 뇌부종 및 신경 기능 점수(n=8).
모델군: 동일한 부피의 생리식염수(1% DMSO 함유)(iv.3day, 재관류 후 2시간 투여), TTC, 뇌부종 및 신경 기능 점수(n=8).
S-NBP(S-부틸프탈라이드)군, 에다라본군, PHPB(칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산)군, 10mg/kg/day(iv.3day, 재관류 후 2시간 투여), TTC, 뇌부종 및 신경 기능 점수(n=8).
I1, Ir, I1s, I7s군: 10mg/kg/day(iv.3day, 재관류 후 2시간 투여), TTC, 뇌부종 및 신경 기능 점수(n=8).
등몰의 S-APB (S-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산)+Arg(아르기닌) 공동 투여군: (S-APB 5.89mg/kg+Arg 4.10mg/kg)/day(iv.3day, 재관류 후 2시간 투여), TTC, 뇌부종 및 신경 기능 점수(n=8).
등몰의 S-APB+AGH(아미노구아니딘 염산염) 공동 투여군: (S-APB 7.72mg/kg+AGH 3.41mg/kg)/day(iv.3day, 재관류 후 2시간 투여), TTC, 뇌부종 및 신경 기능 점수(n=8).
시험 방법:
봉합사 폐색 방법(suture-occluded method)으로 먼저 래트 대뇌 동맥을 차단하고, 2시간 후 재관류하며, 관류 2시간 후 래트에 각각 S-NBP, 에다라본, PHPB, I1, I1r, I1s, I7s, 등몰의 S-APB과 아르기닌 조합, 등몰의 S-APB와 아미노구아니딘 염산염 조합 및 동일 부피의 생리식염수(1% DMSO 함유)를 꼬리 정맥 주사한다. 모든 약물은 1% DMSO를 함유한 생리식염수 용액으로 만들어 투여하며, 투여 지속 시간은 대략 1분으로 조절한다. 재관류 2시간 후 처음 투약하며, 24시간마다 1회로 총 3회 투여한다. 마지막 투여 2시간 후, 먼저 신경 기능 결함 점수를 매긴 다음 각 군의 래트를 죽이고 전체 뇌를 꺼내어 칭량(습중량), TTC 염색, 건조를 수행하고, 화합물이 뇌경색, 뇌부종에 미치는 영향을 측정하였다.
신경 기능 결함 점수
마지막 투여 2시간 후, Longa's 방법을 이용하여 동물의 신경 기능 결함에 대한 점수를 매긴다. 기준 다음과 같다. 즉 신경 증상이 관찰되지 않으면 0점, 꼬리를 공중에 들어 올렸을 때 동물의 수술 반대쪽 앞다리에서 발목과 무릎에 굴곡이 나타나고 어깨가 안으로 회전하며 발목이 밖으로 외전되고 흉벽에 밀착되면 1점, 동물을 매끄러운 평면에 올려놓고 수술측 어깨를 밀어 반대쪽으로 이동시켰을 때 저항이 감소하면 2점, 동물이 자유롭게 행진할 때 수술 반대쪽으로 분회하거나 회전하면 3점, 이완성 마비로 다리가 움직이지 못하면 4점이다.
TTC 염색
신경 행위학적 검출이 완료된 후, 래트의 전체 뇌를 교차하여 앞뒤로 각각 2mm 지점에서 관상(coronal)으로 4번 절개하여 5개 절편으로 자른 후 신속하게 뇌 절편을 2% TTC가 함유된 5ml 인산완충용액에 넣는다. 37℃의 차광 상태에서 배양하며, 배양 과정에서 5분마다 한 번씩 뒤집는다. 10분 배양 후 뇌 절편을 꺼내고 디지털카메라(Olympus C-4000, Japan)로 사진을 찍은 후, 안과 포셉(ophthalmic forcep)으로 희미한 영역(경색 영역)과 희미하지 않은 영역(정상 영역)을 분리하고, Image pro-plus 6.0을 통해 경색 백분율을 계산하며 이는 하기와 같다.
경색 백분율(%)=희미한 영역 중량/(희미한 영역 중량+희미하지 않은 영역 중량)×100%
경색 면적 억제율(%)=(모델군 경색 백분율(%)-투여군 경색 백분율(%))/모델군 경색 백분율(%)×100%.
염색된 뇌 조직을 105℃의 오븐에서 건조시키고 24시간 후 중량(건중량)을 측정하였다. 뇌 함수량 계산 공식은 하기와 같다.
뇌 조직 함수량(%)=(1-뇌 조직 건중량/뇌 조직 습중량)×100%
뇌부종률(%)=각 뇌 조직 함수량(%)-모의 수술군 뇌 조직 함수량(%)/모의 수술군 뇌 조직 함수량(%)×100%
뇌부종 억제율(%)=투여군 뇌부종률(%)-모델군 뇌부종률(%)/모델군 뇌부종률(%)×100%
시험 결과:
MCAO 래트의 경색 부피, 뇌부종 및 신경 기능 결손에 대한 화합물의 영향은 도 4, 표 5 및 표 6에 도시된 바와 같다. 도 4에서 (A)는 TTC 염색 및 뇌 이미징 분석이고, (B)는 경색 부피 데이터이고, (C)는 뇌 함수량이고, (D)는 신경 결손 평가이다. 신경 결손 점수가 중앙값(n=8)인 것 이외에, 기타 데이터는 평균값±SD로 표시된다. *P<0.05, **P<0.01; #P<0.05, ##P<0.01.
표 5. 화합물의 뇌경색 부피에 대한 영향*
* S-NBP: S-부틸프탈라이드, PHPB: 칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산, I1, Ir, I1s는 각각 L-아르기닌(R/S)-, (R)-, (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, I7s: 아미노구아니딘(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, S-APB: (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, Arg: L-아르기닌, AGH: 아미노구아니딘 염산염.
표 6. 화합물의 뇌부종에 대한 영향*
* S-NBP: S-부틸프탈라이드, PHPB: 칼륨(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산, I1, Ir, I1s는 각각 L-아르기닌(R/S)-, (R)-, (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, I7s: 아미노구아니딘(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, S-APB: (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산, Arg: L-아르기닌, AGH: 아미노구아니딘 염산염.
결론: 국소 뇌허혈 재관류 2시간 후의 래트 뇌경색, 뇌부종에 대한 L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s)의 억제 작용 및 신경 기능 개선 작용이 가장 현저하였으며, 이는 등몰 용량의 S-APB와 L-아르기닌 조합 투여보다 우수하였고, 동일 용량의 S-NBP, PHPB 및 에다라본보다도 우수하였다.
국소 뇌허혈 래트 뇌경색, 뇌부종 및 신경 기능에 대한 L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(AHPB)의 영향을 시험하는 방법은 상기와 같으며, 그 결과는 하기와 같다.
MCAO 래트의 경색 부피, 뇌부종 및 신경 기능 결손에 대한 화합물 AHPB의 영향은 도 5, 표 7 및 표 8에 도시된 바와 같다. 도 5에서 (A)는 TTC 염색 및 뇌 이미징 분석이고, (B)는 경색 부피 데이터이고, (C)는 뇌 함수량이고, (D)는 재관류 12시간 후 신경 결손 평가이고, (E)는 재관류 24시간 후 신경 결손 평가이다. 신경 결손 점수가 중앙값(n=8)인 것 이외에, 기타 데이터는 평균값±SD로 표시된다. *P<0.05, **P<0.01.
표 7. L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(AHPB)의 뇌경색 부피에 대한 영향*
* NBP: 부틸프탈라이드, AHPB: L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산.
표 8. L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(AHPB)의 뇌부종에 대한 영향*
* NBP: 부틸프탈라이드, AHPB: L-아르기닌(R/S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산.
결론: 재관류와 동시에 또는 재관류 2시간 후 저용량(5mg/kg)의 AHPB 정맥 주사의 국소 뇌허혈 래트 뇌경색, 뇌부종 및 신경 기능에 대한 개선은 NBP(5mg/kg)와 현저한 차이가 없었다. 중/고용량((10, 20mg/kg) AHPB의 뇌경색, 뇌부종에 대한 개선은 NBP(5mg/kg)보다 우수하고, 신경 기능에 대한 개선은 NBP(5mg/kg)와 동일하였다.
실시예 18: 약동학
시험 동물:
청결 레벨 SD 수컷 래트 12마리는 난징시 장닝구 청룽산동물번식장()에서 제공하였으며, 생산 허가증 번호는 SCXK(수(*?*)) 2017-0001이다. 체중 범위는 180 내지 220g이며 구입 후 실험동물센터실험실에서 2일간 사육한 후 사용하였다. 투약 전 12시간 및 투약 후 6시간 이내에 금식시켰으며 시험 기간 동안 자유롭게 물을 섭취시켰다.
시험 방법:
래트에 L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s)(25mg/kg)을 꼬리 정맥 주사하고, 각 시점에서 래트 안저(fundus) 정맥총에서 채혈하였다. LC-MS/MS를 이용해 래트 혈중 기존 약물과 대사산물의 농도를 측정하고, WinNonlin 약동학 전문 소프트웨어를 이용하여 통계학적 모멘트 방법으로 계산하여 상응하는 약동학 파라미터를 구한다.
시험 결과:
1. 화합물 I1s는 체내에서 빠르게 상응하는 카르복실산 및 L-아르기닌으로 대사되었다. 투약 2분 후 혈장에서 활성 대사산물 (S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(대사산물 M2로 칭함), (S)-2-(1-히드록실-n-펜틸)벤조산(M2의 탈아세틸화 생성물)(M3) 및 (S)-NBP(M4)가 검출되었으며, 여기에서 M2와 M4는 그 주요 대사산물이고, 중간 대사산물 M3의 농도는 상대적으로 비교적 낮았다.
2. 정맥 주사 후의 혈중 약물 농도는 먼저 시간에 따라 급격히 낮아졌다. 이는 약물이 체내에서 빠르게 분산되는 것과 관련이 있을 수 있다. 이후 혈중 약물 농도 하락이 상대적으로 느려지며 제거 단계에 진입하였다. 다시 혈중 약물 농도 반대수-시간 곡선에서 알 수 있듯이, 상기 약물은 기본적으로 두 구획 모델(two compartment model) 특성에 부합한다(도 6 참고).
3. 약동학 파라미터에서 알 수 있듯이, 혈장 중의 주요 활성 대사산물 M2와 M4의 반감기(t1/2)는 모두 약 3시간이며(표 9 참고), NBP(44분) 및 PHPB(45분)의 반감기보다 길다(Acta Pharmacol Sin., 2018, 39, 275-285).
4. 약동학 파라미터에서 알 수 있듯이, M2, M3, M4의 겉보기 분포 용적(Vz)와 제거율(CL)이 모두 비교적 크다. 이는 이들이 체내에서 광범위하게 분포하여 빠르게 혈장으로부터 말초 조직 또는 뇌 조직 등 부위로 분포될 수 있음을 나타낸다(표 9 참고).
표 9. I1s 투여 후 각 대사산물의 래트 체내에서의 약동학 파라미터
5. 활성 대사산물 M2, M3, M4는 모두 뇌 조직 중에서 검출될 수 있다. 여기에서 M4의 뇌에서는 농도가 등몰 용량의 NBP 및 PHPB를 투여한 뇌에서의 농도보다 높았으며(Acta Pharmacol Sin., 2018, 39, 275-285), 시간에 따라 빠르게 제거되었다. 이는 이들이 혈뇌장벽을 투과할 수 있어 뇌 조직에서 효과를 나타내는 데 유리하며, 뇌에서 장시간 축적되어 독성을 일으키지 않을 수 있음을 의미한다(표 10 및 도 7 참고).
표 10. I1s 정맥 주사 후 래트 뇌 조직 중 각 대사산물 농도 데이터
결론: 화합물 L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s)은 우수한 약동학적 특성을 갖는다.
실시예 19: 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase, COX)에 대한 억제 활성
시험기구:
SB-5200DT 초음파 클리너는 Ningbo Scientz Biotechnology()에서 구매하였다. YC-300L 약품 보관 캐비닛은 Zhongke Meiling Cryogenics()에서 구매하였다. GZX-9140MBE 열풍 건조 오븐은 Shanghai Boxun Industrial()에서 구매하였다. Direct-Q with pump 초순수기는 Millopore사에서 구매하였다. BS224 전자저울은 Beijing Sartorius Instrument & System()에서 구매하였다. 78-1 마그네틱 믹서는 Changzhou Guohua Electric()에서 구매하였다. 3K15 저온 고속 원심 분리기는 Sigma사에서 구매하였다. Berthold LB941 마이크로웰 다기능 마이크로플레이트 리더는 Berthold사에서 구매하였다.
시험 방법:
COX-1 및 COX-2 억제에 대한 각 샘플의 백분율을 측정하였다. 계산 공식은 다음과 같다. 억제율(%)=(RFU 100% 효소 활성 대조-RFU 샘플)/(RFU 100% 효소 활성 대조-RFU 블랭크 대조)×100%. 여기에서 RFU는 상대 형광값(Relative Fluorescence Unit)이다. 유효한 억제제의 검출 및 발견에 있어서, 해당 억제제의 용량 효과 검출을 통해 다시 그 IC50값을 확정한다.
시험 결과:
표 11. 화합물의 COX-1 및 COX-2 활성 억제의 IC50값
결론: 화합물 I1s가 COX-1를 억제하는 활성은 아스피린보다 현저하게 작으며, 이는 위장 부작용이 아스피린보다 적음을 의미한다. 화합물 I1s가 COX-2를 억제하는 활성은 아스피린에 가까우며, 이는 COX-2에 의해 매개된 염증에 대해 이 둘이 상당한 억제 작용을 가지고 있음을 의미한다.
실시예 20: 1차 안전성 시험
1. 급성 독성 시험
시험 동물:
ICR 마우스는 Shanghai Lingchang Biotech()에서 제공하였으며, 실험 동물 생산 허가증은 SCXK(호()) 2013-0018, 합격 증서 일련번호는 2013001834483, 실험 동물 사용 허가증은 SYXK(수()) 2017-0015이다. 일령은 5-6W이고, 체중은 18 내지 22g이며, 성별은 수컷이고 동물 수는 50마리이다.
시험 방법:
사전 실험을 기반으로 I1s의 급성 독성 시험 농도 구배를 1500, 1300, 1100, 900, 700mg/kg로 설정한다. 약물 농도는 이에 상응하여 150, 130, 110, 90, 70mg/ml로 설정한다. 피험 약품을 상응하는 농도의 약물 용액으로 제조하여 동일한 용적으로 1회 투여 하며(꼬리 정맥 주사), 마우스의 각종 중독 증상 및 사망 상황을 기록하고, 사망 동물은 검시한다. 관찰 기간은 14일이다.
시험 결과:
I1s를 비교적 높은 용량으로 꼬리 정맥 주사한 후 마우스가 발작하고 활동이 감소하였으며, 24시간 후에는 일부 동물이 사망하였다. 각 군에서 사망한 마우스를 해부한 결과 전흉부에 어혈이 보였으나, 나머지 장기에서는 현저한 이상이 없었다. 각 샘플군 동물 체중 변화는 표 12와 같고, 사망 분포 및 LD50값(Bliss법) 계산 결과는 표 13과 같다.
표 12. 화합물 I1s 정맥 주사의 체중에 대한 영향(M±SD)
표 13. 화합물 I1s 정맥 주사 사망 상황 및 LD50값
결론: 화합물 L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(I1s) 정맥 투여의 LD50값은 1119.5038mg/kg이다.
2. hERG 칼륨 채널에 대한 작용 테스트
자동 패치 클램프 검출 기술을 이용하여, 상이한 투여 농도 하에서 화합물 I1s 및 (S)-NBP의 CHO-hERG 세포 hERG 칼륨 채널에 대한 영향을 관찰하였다. 결과에 따르면, I1s와 (S)-NBP의 IC50은 모두 40μM보다 크지만, I1s는 최대 농도의 억제율(37.56%)이 (S)-NBP(41.45%)보다 낮았다. 이는 I1s가 심장에 대한 독성이 (S)-NBP보다 낮을 수 있음을 의미한다.
3. 미생물 역돌연변이 시험
화합물 I1s에 대해 미생물 역돌연변이 시험(Ames 시험)을 수행하여, 잠재적인 변이유발성이 있는지 측정하였다. 시험균은 쥐장티푸스균(Salmonella typhimurium) 히스티딘 결함형 TA97, TA98, TA100 및 TA102 균주이며, 피험품의 용량 범위는 0.1 내지 1000μg/dish이고, 각각 포유 동물 간 마이크로좀(S9) 첨가 혼합물과 S9 미첨가 혼합물의 병렬 조건 하에서 시험하였다. 시험 결과는 모두 음성이었다.
실시예 21: 약학 조성물의 제조 방법
1. 정제
제조 방법: 배합비에 따라 활성 성분, 전분, 미정질 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로스나트륨을 균일하게 혼합하고, 물로 적시고 과립을 제조하며 건조시켜 크기를 안정화하고 스테아린산 마그네슘을 첨가하며 균일하게 혼합한 후 혼합물을 가압하여 본 정제를 수득한다.
2. 캡슐제
제조 방법: 배합비에 따라 활성 성분을 보조제와 균일하게 혼합한 후 과립으로 제조하고 체질한다. 수득한 혼합물은 정량으로 위 용해성 경질 캡슐에 주입하여 본 캡슐제를 수득한다.
3. 정맥 주사제
제조 방법: 수용성 (S)-2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산을 적정량의 주사용 물에 용해시키고, 적정량의 주사용 염화나트륨을 첨가하며, 무균 조건에서 병에 주입하여 멸균함으로써 본 정맥 주사액을 수득한다.
4. 정맥 주사 동결건조제
제조 방법: 수용성 (S)-2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산을 적정량의 주사용 물과 마니톨에 용해시키고 여과하여 병에 담은 후 동결 건조함으로써 본 정맥 주사 동결건조제를 수득한다. 사용 시 0.9%의 생리식염수 또는 5%의 포도당 주사액을 이용하여 희석시킨 후 정맥 주사 또는 정맥 점적을 수행한다.

Claims (11)

  1. 식 I1로 표시되는 L-아르기닌(R/S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(R/S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate) 또는 식 I1S로 표시되는 L-아르기닌(S)-2-(1-아세톡시-n-펜틸)벤조산(L-arginine(S)-2-(1-acetoxy-n-pentyl)benzoate) 인 화합물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 하기 단계,

    (1) -30 ℃ 내지 -5 ℃ 및 유기 염기의 존재 하에서, 화합물 II의 유기 용매 용액에 무수물 또는 염화 아실을 점적하고, 반응이 종료되면 산화하여 백색 고체 화합물 III을 석출하는 단계; 및
    (2) 단계 (1)로부터 수득된 화합물 III을 알코올에 용해시킨 다음, L-아르기닌을 첨가하여 염을 형성하고, 반응 후 석출된 침전물을 여과하며, 알코올 재결정을 거쳐 화합물 I을 수득하는 단계;를 포함하고,
    상기 별표 *는 2-(1-아실옥시-n-펜틸)벤조산 부분의 키랄 중심을 나타내며, (S)- 또는 (R/S)- 구성일 수 있는 것을 특징으로 하는 제1항에 따른 화합물의 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (1)의 유기 염기는 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine), 디에틸아민(diethylamine), 트리에틸아민(triethylamine) 또는 피리딘(pyridine)이고, 유기 용매는 디에틸에테르(diethyl ether), 테트라히드로푸란(tetrahydrofuran), 디클로로메탄(dichloromethane), 트리클로로메탄(trichloromethane) 또는 아세톤(acetone) 중 하나 또는 둘의 조합이고, 산은 진하거나 묽은 염산, 황산 또는 질산이고, pH 2 내지 6으로 산화되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (2)의 알코올은 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 이소프로판올인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 약학 조성물에 있어서,
    제1항의 상기 화합물 I1 또는 I1s 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 심혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 약학 조성물에 있어서,
    제1항의 상기 화합물 I1s 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항혈전 순환장애 개선용 약학 조성물.
  11. 약학 조성물에 있어서,
    제1항의 상기 화합물 I1 또는 I1s 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 심뇌혈관 순환장애 개선용 약학 조성물.
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