CN107753469B - Ndga类似物在制备抗氧化药物中的应用 - Google Patents

Ndga类似物在制备抗氧化药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属药物化学领域，具体涉及特定的NDGA类似物在制备抗氧化药物及在抗缺血性中风治疗药物中的应用，这些NDGA类似物能够保护H2O2诱导的PC12细胞损伤，抑制MDA、ROS的产生，也能明显激活激活Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路，体内实验能明显减少大鼠MCAO模型的梗死面积和改善神经得分。

Description

NDGA类似物在制备抗氧化药物中的应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及特定的NDGA类似物在制备抗氧化药物及预防或治疗由氧化应激造成的各种器官缺血性疾病中的应用，这些NDGA类似物通过直接清除活性氧自由基和激活抗氧化信号通路间接清除氧自由基的双机制抗氧化，起到显著的体外和体内抗氧化作用。
背景技术
氧化应激与多种疾病的发生密切相关，抗氧化药物能够对相关疾病起到良好的治疗作用。活性天然产物由于其毒副作用较小，以天然产物为先导至今仍然是新药发现的重要途径。去甲二氢愈创木酸(Nordihydroguaiaretic acid，NDGA)是从Larrea tridentate灌木中分离得到的一种天然产物，具有抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性。研究表明，NDGA既可以直接清除氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，又可以通过激活细胞内Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信号通路起到抗氧化活性。
已有部分研究以NDGA为先导设计合成多种类型的衍生物，并研究其药理学活性，以期寻找到高效低毒的药物。例如，中国专利申请201380007997.7号公开了NDGA的衍生物能够与索拉非尼联用来治疗各种肿瘤疾病。但是未见NDGA衍生物抗氧化活性研究的中国专利，也未见本发明的同时具有直接清除活性氧自由基和激活抗氧化信号通路间接清除氧自由基的双机制抗氧化。
本发明人经过长期和艰苦的研究实践，合成了一系列NDGA类似物，并研究了其在神经元样大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12的潜在抗氧化机制。我们的研究发现3a化合物对大鼠中短暂的大脑中动脉栓塞(middle cerebralartery occlusion，MACO)脑损伤有改善作用，因而，3a有望成为很好的脑缺血再灌注的抗氧化治疗药物。
发明内容
本发明目的在于提供一种NDGA类似物在制备抗氧化药物及在预防或治疗由氧化应激造成的各种器官缺血性疾病中的应用。
本发明的另一目的是提供一种用于治疗氧化应激损伤疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的所述的NDGA类似物中的任何一种或多种或其可药用盐及其药用辅料。
具体而言，本发明3个NDGA类似物(3a、3f和3g)，及其它对照化合物结构如下
Figure BDA0001431968520000021
其中，3a的分子式为C19H16O5，化学名称为：(2Z,5E)-2,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)cyclopen tanone。3b的分子式为C20H18O5，化学名称为：(2Z,6E)-2,6-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)cyclohexanone。3c的分子式为C17H14O5，化学名称为：(1E,4E)-1,5-bis(3,4-dihydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one。3d的分子式为C22H23NO5，化学名称为：(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-1-propylpiperidin-4-one。3e的分子式为C20H19NO5，化学名称为：(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-1-methylpiperi din-4-one。3f的分子式为C19H17NO5，化学名称为：(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)piperidin-4-one。3g的分子式为C19H16O6，化学名称为：(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)dihydro-2H-pyran-4(3H)-one。3h的分子式为C19H16O5S，化学名称为：(3Z,5Z)-3,5-bis(3,4-di hydroxybenzylidene)dihydro-2H-thiopyran-4(3H)-one(3h)。3i的分子式为C27H25NO5，化学名称为：(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-1-phenethylpiperidin-4-one。3j的分子式为C27H23NO7，化学名称为：(3E,5E)-benzyl3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-4-oxopiperidine-1-carboxylate。3k的分子式为C22H21NO，化学名称为：(3E,5E)-ethyl3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-4-oxopiperidine-1-carboxylate。3l的分子式为C26H23NO5，化学名称为：(3E,5E)-1-benzyl-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)pip eridin-4-one。3m的分子式为C22H21NO5，化学名称为：(3E,5E)-1-cycl opropyl-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)piperidin-4-one。A1的分子式为C23H24NO5，化学名称为：(2E,5E)-2,5-bis(3,4-dimethoxy benzylidene)cyclo pentanone。
试验结果表明，同其它化合物(包括3b、3c、3d、3e、3h、3i、3k、3l、3m、A1和NDGA)相比，化合物3a、3f和3g具有好的抗氧化活性。当用上述化合物分别孵育PC12细胞24h，再用双氧水损伤PC12细胞，本发明所示的3个活性化合物3a、3f和3g具有很好的细胞保护作用，其中3a和3g活性明显强于对照化合物NDGA，其它对照化合物均无活性。综上所述，本发明的化合物3a、3f和3g好的抗氧化活性。
同时，细胞毒性试验结果表明：本发明的化合物3a、3f和3g具有低的细胞毒性。细胞毒性试验显示，在药物孵育72h实验中，对照化合物NDGA表现出了较强的细胞毒性，而3个活性化合物毒性均明显低于NDGA，其中3a和3f没有表现出明显的细胞毒性，因此，本发明的化合物3a、3f和3g具有更低的细胞毒性。
为了验证化合物的直接清除自由基的抗氧化作用，用上述化合物进行了自由基DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl)清除实验的抗氧化活性研究。结果表明，本发明所述3个活性类似物具有很好的清除自由基DPPH的能力，其活性与对照化合物3b、3c、3d、3e、3h、3i、3k、3l、3m和NDGA相当，而对照化合物A1活性很弱。因此，本发明所述活性化合物具有直接清除自由基的作用。
为了验证本发明所述活性化合物激活抗氧化信号通路间接清除自由基的抗氧化作用，通过West Blotting实验发现，3a能够明显诱导PC12细胞中Keap1/Nrf2/ARE信号通路蛋白HO-1蛋白的表达；当3a和HO-1蛋白抑制剂Znpp联合使用时，细胞的生存率降低，即3a对双氧水诱导的PC12细胞损伤的保护作用明显下降，这说明了3a至少部分是通过增加HO-1蛋白的表达来起到保护作用。因此，化合物3a提前24h孵育后所表现出更优秀的细胞保护作用，除了直接清除ROS起作用之外，很可能还与激活Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路有关。
此外，体外试验结果显示本发明的化合物3a能有效抑制双氧水诱导的PC12细胞中丙二醛(MDA)的生成和ROS的聚集，且呈良好的量效关系。
最后大鼠中脑动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)显示，化合物3a能有效降低大鼠脑缺血再灌注损伤导致的脑梗死面积以及改善神经得分，在相同给药剂量下，3a的治疗效果优于临床药物依达拉奉，化合物3a在生物体内也具有抗氧化活性。
综合以上体外和体内实验，3a、3f和3g具有开发为抗氧化药物的前景。
本发明所述NDGA类似物可以应用于制备急性和慢性氧化应激损伤造成的各种疾病的预防或治疗药物。以上急性和慢性氧化应激损伤造成的各种疾病的病因至少部分是由氧化应激引起。所述急性氧化应激损伤所造成的疾病包括但不限于以下疾病：各种器官缺血性损伤疾病如脑中风中脑缺血损伤、心梗中心肌缺血损伤、肝缺血损伤、肾缺血损伤；各种缺血性再灌注损伤，如脑中风中脑缺血再灌注损伤、心梗中心肌缺血再灌注、肝缺血性再灌注损伤、肾缺血性再灌注损伤。所述慢性氧化应激损伤所造成的疾病包括但不限于以下疾病：与慢性氧化应激损伤相关的神经性病变，如帕金森、阿尔茨海默病(老年痴呆症)。
本发明还提供了一种用于治疗氧化应激相关疾病的药物组合物，其含有治疗有效量的活性成分和药用辅料，所述的活性成分至少含有以上所述3个NDGA类似物中的任何一种或多种或其可药用盐。作为优选，所述的活性成分同时含有所述3个NDGA类似物中的任何一种或多种或其可药用盐与现已上市的器官缺血性治疗药物，通过联合使用可以使该药物组合物对缺血损伤或缺血再灌注损伤相关疾病具有更好的效果。
本文中所用“药用辅料”指药学领域常规的药物载体，例如：粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；稀释剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇等，填充剂如淀粉、蔗糖等；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮和干淀粉等；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如聚山梨酯、脂肪酸山梨坦和脂肪酸甘油酯等；着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等；润滑剂如氢化植物油、滑石粉和聚乙二醇等。包衣材料如丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等；另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述药物的制剂形式包括注片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、滴剂、滴丸剂及纳米制剂等。本发明可以组合物的形式通过经胃肠道给药，注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药和腔道给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。
下面将结合实施例及说明书附图详细说明本发明。
附图说明
图1 实施例1得到的NDGA类似物对DPPH的清除能力。方法：用乙醇制备NDGA类似物溶液(20mg/mL)。也用乙醇制备DPPH·溶液(0.15mM)。80μL NDGA类似物溶液加入120μL的DPPH·溶液(0.15mM)(Ai)。对照组为80μLNDGA类似物溶液加入到120μL乙醇溶液(Aj)。空白组为80μL乙醇溶液加入120μL DPPH·溶液(Ac)。这些混合物在25℃下孵育30min，然后在517nm测量吸光度。实验重复三次，计算平均值和偏差。DPPH的清除能力计算：％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。
图2 NDGA类似物对H2O2诱导的PC12细胞损伤模型(A)的保护作用以及在PC12细胞中三种活性化合物的细胞毒性(B)。对H2O2诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用的检测方法：PC12细胞(5×10 3个细胞/孔)接种在96孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。加入化合物24h后，再加入H2O2(400μM)损伤。24h后细胞用MTT溶液(5mg/mL)在37℃中处理4h。最后甲瓒晶体溶解于120μLDMSO中，在490nm测量OD值。细胞存活率为给药组与DMSO对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值。三种活性化合物的细胞毒性的检测方法：方法基本同前，细胞同样接种于96孔板，培养过夜，再加入化合物，作用72h后MTT法检测细胞生存率。(##P<0.01，#P<0.05vs DMSO组，**P<0.01，*P<0.05vs H2O2组)
图3 活性化合物3a对H2O2诱导的PC12细胞损伤的量效关系(A，B)，对H2O2诱导的MDA的表达(C，D)以及对H2O2诱导的ROS的生成(E，F)。3a对H2O2诱导的PC12细胞损伤的量效关系检测方法：方法基本同前，PC12细胞用3a(2.5，5，7.5μM)预处理1h和24h，再用H2O2(400μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。3a对H2O2诱导的MDA的表达检测方法：细胞用3a(2.5，5，7.5μM)作用1h或24h。然后用700μM H2O2作用16h。通过在4℃下，1600×g离心10min收集上清液。根据MDA说明书检测上清液中MDA含量。3a对H2O2诱导ROS的生成：细胞用3a(5μM)、NDGA(5μM)和TBHQ(5μM)作用1h或24h。再用H2O2作用3h，然后，加入1μL DCFH-DA(10mM)在37℃孵育30min。接着细胞用酶消化并用PBS冲洗，并重悬于500mL PBS中。通过流式仪检测ROS含量。所有实验均进行三次重复。(###P<0.001，##P<0.01，#P<0.005vs DMSO组，**P<0.01，*P<0.05vs H2O2组)
图4 活性化合物3a诱导抗氧化蛋白HO-1的表达(A)，HO-1的抑制剂(ZnPP)拮抗3a对H2O2诱导的PC12细胞的保护作用(B)。HO-1的表达检测方法：PC12细胞分别用3a(2.5，5，10μM)，NDGA(10μM)作用24h，用western blot检测HO-1的水平，GAPDH为内参。柱状图代表western blot中蛋白条带的光密度比值，以DMSO组值为1，每个柱条为三次实验的平均值和误差值(*P<0.05，**P<0.01，vs DMSO group)。HO-1的抑制剂拮抗3a对H2O2诱导的PC12细胞的保护作用检测方法：PC12细胞铺板96孔板过夜，ZnPP(15μM)作用1h后，加3a(5μM)作用24h，再用H2O2(400μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。三次重复实验得到相同结论。(#P<0.1，*P<0.05)
图5 活性化合物3a能够减少大脑中动脉栓塞模型(MCAO)梗死面积(A，B)，改善神经得分(C)。
方法：雄性SD大鼠(250-280g)在造模前2h侧脑室给药(15mg/kg)。给药2h后，用10％水和氯醛麻醉(0.35mL/100kg，腹腔注射)。颈部用75％酒精消毒，在颈部正中位置做1.5mm切口，然后分离右颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。用动脉夹暂时夹闭右颈总动脉和颈内动脉。在颈外动脉切开一个小切口，插入拴线，直到感到阻力为止(约1.8cm)。固定拴线并缝合切口。栓塞2h后，退出拴线进行再灌注72h。神经得分和TTC染色方法如下：神经得分使用Longa方法：0：正常，无神经功能缺损。1：由侧前爪不能完全伸展，轻度神经缺损。2：行走时，大鼠向右侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损。3：行走时，大鼠身体向右侧(瘫痪侧)倾倒，重度神经功能缺损。4：不能自发行走，有意识丧失。TTC染色方法如下：大脑迅速从大鼠中取出，-20℃冻存20min，冠状切片切5片，置TTC溶液中，37℃下30min。用数码相机拍摄TTC染色的脑切片。用Image-Pro plus计算大鼠梗死面积。(###P<0.001vssham组,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05vs溶剂组)
具体实施方式
本发明在以下的实施例中进一步说明。这些实施例只是为了说明本发明的目的，而不是用来限制本发明的范围。
实施例1化合物的合成
将3，4-二羟基苯甲醛(10mmoL)和适当的酮(5mmoL)用乙醇溶解后,室温下搅拌,并向溶液中通入HCl(气体)作为催化剂。其中4-哌啶酮盐酸盐水合物(1f)和3,4-二羟基苯甲醛用乙醇:水(10：1)的混合溶剂溶解。通过薄层色谱法监测反应的进行,反应完后，将粗混合物冷却并倒入冰水(20mL)中，析出沉淀，抽滤，真空干燥后，经硅胶柱色谱纯化，得到所需产物3a-3m，这些化合物及其理化性质如下所述：
有效化合物3a：(2Z,5E)-2,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)cyclopentano ne(3a):Green powder,53.6％yield,mp>300℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.563(s,2H,3-OH×2),9.211(s,2H,4-OH×2),7.238(s,2H,Ar-CH＝C×2),7.113(d,J＝1.8Hz,2H,Ar-H2×2),7.006(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6×2),6.834(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H5×2),3.001(s,4H,CH2-O-CH2).LC-MS m/z:325.10(M+H)+,calcd for C19H16O5:324.10.
对比化合物3b:(2Z,6E)-2,6-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)cyclohexano ne(3b):Orange powder,45.7％yield,mp 242.7-243.8℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.438(s,2H,3-OH×2),9.131(s,2H,4-OH×2),7.446(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.980(d,J＝1.8Hz,2H,Ar-H2×2),6.873(dd,J＝1.8Hz,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6×2),6.799(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H5×2),2.845(t,J＝4.8Hz,4H,CH2-C-CH2),1.725(t,J＝4.8Hz,2H,C-CH2-C).LC-M S m/z:339.18(M+H)+,calcd for C20H18O5:338.12.
对比化合物3c:(1E,4E)-1,5-bis(3,4-dihydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one(3c):Green powder,58.9％yield,mp242.7-245.4℃.1H-NMR(600M Hz,d-DMSO),δ:9.646(s,2H,3-OH×2),9.171(s,2H,4-OH×2),7.568(d,J＝16.2Hz,2H,Ar-CH＝C×2),7.155(d,J＝1.8Hz,2H,Ar-H2×2),7.083(dd,J＝1.8Hz,J＝1.8Hz,2H,CO-CH＝C×2),7.002(d,J＝15.6Hz,2H,Ar-H5×2),6.800(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6×2).LC-MS m/z:299.11(M+H)+,calcdfor C17H14O5:298.08.
对比化合物3d:(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-1-propylpiperidin-4-one(3d):Yellow powder,58.9％yield,mp 232.2-233.8℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.877(s,2H,3-OH×2),9.439(s,2H,4-OH×2),7.719(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.942(s,2H,Ar-H2×2),6.902(d,J＝18.6Hz,4H,Ar-H5×2,Ar-H6×2),4.576(d,J＝37.2Hz,4H,CH2-N-CH2),3.513-3.479(m,2H,N-CH2),1.698(d,J＝7.2Hz,2H,N-C-CH2),0.895(t,J＝14.4Hz,3H,CH3).LC-MS m/z:382.17(M+H)+,calcd for C22H23NO5:381.16.
对比化合物3e:(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-1-methylpip eridin-4-one(3e):Drown powder,51.3％yield,mp>300℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.886(s,2H,3-OH×2),9.403(s,2H,4-OH×2),7.708(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.965(d,J＝1.2Hz,2H,Ar-H2×2),6.900-6.879(m,4H,Ar-H5×2,Ar-H6×2),4.609(d,J＝44.4Hz,4H,CH2-N-CH2),3.009(s,3H,CH3).LC-MS m/z:354.17(M+H)+,calcd for C20H19NO5:353.13.
有效化合物3f:(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)piperidin-4-one(3f):Yellow-green powder,49.7％yield,mp>300℃.1H-NMR(600M Hz,d-DMSO),δ:9.832(s,2H,3-OH×2),9.687(d,J＝19.8Hz,1H,NH),9.425(s,2H,4-OH×2),7.690(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.937(s,2H,Ar-H2×2),6.901(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6×2),6.872(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H5×2),4.428(s,4H,CH2×2).LC-MS m/z:340.04(M+H)+,calcd forC19H17NO5:339.11.
有效化合物3g:(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)dihydro-2H-pyran-4(3H)-one(3g):Green powder,50.8％yield,mp 262.4-264.7℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.563(s,2H,3-OH×2),9.241(s,2H,4-OH×2),7.461(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.807(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H6×2),6.805(s,2H,Ar-H2×2),6.756(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H5×2),4.836(s,4H,CH2-O-CH2).LC-MS m/z:341.10(M+H)+,calcd for C19H16O6:340.19.
对比化合物3h:(3Z,5Z)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylide ne)dihydro-2H-thiopyran-4(3H)-one(3h):Drown powder,43.9％yield,mp 223.3-224.6℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:7.436(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.941(d,J＝1.8Hz,2H,Ar-H2×2),6.857(dd,J＝8.4Hz,J＝1.8Hz,2H,Ar-H6×2),6.808(d,J＝7.8Hz,2H,Ar-H5×2),3.946(s,4H,CH2-S-CH2).LC-MS m/z:356.98(M+H)+,calcd for C19H16O5S:356.07.
对比化合物3i:(3E,5E)-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-1-phenethylpip eridin-4-one(3i):Green powder,58.7％yield,mp150.8-152.8℃.1H-N MR(600MHz,d-DMSO),δ:9.886(s,2H,3-OH×2),9.462(s,2H,4-O H×2),7.719(s,2H,Ar-CH＝C×2),7.327(t,J＝4.8Hz,4H,Ar-H6’,Ar-H2’,Ar-H3’,Ar-H5’),7.262-7.239(m,1H,Ar-H4’),7.021(s,2H,Ar-H2×2),6.904-6.871(m,4H,Ar-H5×2,Ar-H6×2),4.657(d,J＝4.8Hz,4H,CH2-N-C H2),3.587(s,2H,CH2×2),3.099(t,J＝16.2Hz,2H,CH2).LC-MS m/z:444.17(M+H)+,calcd for C27H25NO5:443.17.
对比化合物3j:(3E,5E)-benzyl3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-4-oxopiperidine-1-carb oxylate(3j):Green powder,50.8％yield,mp250.4-251.5℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.646(s,4H,3-OH×2),9.285(s,2H,4-OH×2),7.541(s,2H,Ar-CH＝C×2),7.242(d,J＝1.8Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.231(t,J＝5.4Hz,1H,Ar-H4’),7.079(t,J＝7.2Hz,2H,Ar-H3’,Ar-H5’),6.974(s,2H,Ar-H2×2),6.857(d,J＝7.8Hz,4H,Ar-H5×2,Ar-H6×2),5.017(s,2H,CH2),4.795(d,J＝30.6Hz,4H,CH2-N-CH2).LC-MS m/z:474.25(M+H)+,calcd for C27H23NO7:473.15.
对比化合物3k:(3E,5E)-ethyl3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)-4-oxopiperidine-1-carboxylate(3k):Orange powder,43.9％yield,mp280.5-283.6℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.640(s,2H,3-OH×2),9.276(s,2H,4-OH×2),7.510(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.939(s,2H,Ar-H2×2),6.881-6.843(m,4H,Ar-H5×2,Ar-H6×2),4.734(s,4H,CH2-N-CH2),4.002-3.966(m,2H,CH2),1.050(t,J＝13.8Hz,3H,CH3).LC-MS m/z:412.06(M+H)+,calcd for C22H21NO7:411.13.
对比化合物3l:(3E,5E)-1-benzyl-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylidene)piperi din-4-one(3l):Yellow-green powder,50.8％yield,mp158.4-160.2℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.868(s,2H,3-OH×2),9.408(s,2H,4-OH×2),7.737(s,2H,Ar-CH＝C×2),7.554(d,J＝6.6Hz,2H,Ar-H2’,Ar-H6’),7.386-7.344(m,3H,Ar-H3’,Ar-H4’,Ar-H5’),6.9005(d,J＝2.4Hz,2H,Ar-H2×2),6.868(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6×2),6.816(dd,J＝1.8Hz,J＝1.8Hz,2H,Ar-H5×2),4.512(s,6H,CH2×3).LC-MS m/z:430.17(M+H)+,calcdfor C26H23NO5:429.16.
对比化合物3m:(3E,5E)-1-cyclopropyl-3,5-bis(3,4-dihydroxybenzylide ne)piperidin-4-one(3m):Orange powder,50.8％yield,mp247.0-249.3℃.1H-NMR(600MHz,d-DMSO),δ:9.884(s,2H,3-OH×2),9.456(s,2H,4-OH×2),7.716(s,2H,Ar-CH＝C×2),6.967(s,2H,Ar-H2’×2),6.921-6.891(m,4H,Ar-H5’×2,Ar-H6’×2),4.605(s,4H,CH2-N-CH2),1.190(t,J＝15.6Hz,1H,CH),0.483(d,J＝3.0Hz,4H,CH2×2).LC-MS m/z:380.16(M+H)+,calcd for C22H21NO5:379.14.
对比化合物A1:(2E,5E)-2,5-bis(3,4-dimethoxybenzylidene)cyclopentan one(A1)：Yellow powder,70.3％yield,mp159.2-160.5℃.1H-NMR(C DCl3),δ:7.556(s,2H,Ar-CH＝C×2),7.245(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H6×2),7.148(s,2H,Ar-H2×2),6.954(d,J＝8.4Hz,2H,Ar-H5×2),3.951(s,12H,OCH3×4),3.126(s,4H,CH2CH2).ESI-MS m/z:381.13[M+1]+,calcd for C23H24O5:380.16.
实施例2化合物对DPPH的清除能力
采用化合物对DPPH·自由基的清除能力初步测试化合物的体外抗氧化活性，具体方法如下：用乙醇制备NDGA类似物溶液(20mg/mL)。也用乙醇制备DPPH·溶液(0.15mM)。80μL NDGA类似物溶液加入120μL的DPPH·溶液(0.15mM)(Ai)。对照组为80μL NDGA类似物溶液加入到120μL乙醇溶液(Aj)。空白组为80μL乙醇溶液加入120μL DPPH·溶液(Ac)。这些混合物在25℃下孵育30min，然后在517nm测量吸光度。实验重复三次。DPPH的清除能力计算：％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100。测试时用阳性药NDGA做对照。化合物对DPPH的清除能力见图1。可以发现3a-3m所有化合物都能够通过化学方式有效清除DPPH自由基，并显示出类似于NDGA的自由基清除活性，而A1没有表现出明显的活性。
实施例3化合物对H2O2诱导的PC12细胞损伤模型的保护作用以及在PC12细胞中三种活性化合物的细胞毒性
对H2O2诱导PC12细胞损伤的保护作用方法：PC12细胞(5×10 3个细胞/孔)接种在96孔板中，用DMEM培养液培养于37℃培养箱，并使其过夜。加入化合物24h后，再加入H2O2(400μM)损伤24h。24h后细胞用MTT溶液(5mg/mL)在37℃中处理4h。最后甲瓒晶体溶解于120μL DMSO中，在490nm测量OD值。细胞存活率为DMSO对照组的OD值的百分比。每个化合物重复测试3次，计算平均值和误差值，实验数据见图2A。
化合物的细胞毒性检测方法：方法基本同前，细胞同样接种于96孔板，培养过夜，再加入化合物，作用72h后MTT法检测细胞生存率。实验数据见图2B。
化合物3a-3m预孵育24h，只有3a、3f、3g对H2O2诱导的PC12细胞氧化损伤具有良好的保护作用，其中3a和3g的活性明显优于对照化合物NDGA，其它对照化合物均未表现出活性。通过MTT法测定了3a、3f和3g对PC12细胞的细胞毒性。当PC12细胞用药物孵育后，先导物NDGA表现出了一定的细胞毒性，而3个活性化合物毒性均明显低于NDGA，并且3a和3f没有表现出明显的细胞毒性。
实施例4活性化合物3a对H2O2诱导的PC12细胞损伤的量效关系，抑制H2O2诱导的MDA、ROS的生成。
3a对H2O2诱导的PC12细胞损伤的量效关系检测方法：方法基本同前，PC12细胞用3a(2.5，5，7.5μM)预处理1h和24h，再用H2O2(400μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。丙二醛(MDA)是由ROS引起的多不饱和脂肪酸过氧化物的副产物，被认为是氧化应激的重要生物标志物。PC12细胞用3a预处理1h或24h，以剂量依赖的方式显着降低MDA。具体方法：细胞分别用3a(2.5、5和7.5μM)作用1h或24h。然后用700μM H2O2刺激16h。根据MDA说明书检测上清液中MDA含量。三次重复实验得到相同结论。同时，H2O2刺激PC12细胞可以促进ROS产生，于是检查了3a是否可以预防PC12细胞中ROS的积累。具体方法：细胞用3a(5μM)、NDGA(5μM)和TBHQ(5μM)作用1h或24h。再用H2O2作用3h，然后，加入1μL DCFH-DA(10mM)在37℃孵育30min。通过流式仪检测ROS含量。活性结果见图3，用3a预处理1h或24h的细胞显着降低了MDA的生成，ROS的积累。此外，通过化合物3a预防PC12细胞中的ROS积累可能解释其对氧化损伤的细胞保护作用。总之，化合物3a可以显著保护PC12细胞免受H2O2诱导的细胞损伤。
实施例5活性化合物3a诱导抗氧化蛋白HO-1的表达，HO-1的抑制剂(ZnPP)能够拮抗3a对H2O2诱导的PC12细胞的保护作用。
用western blot检测抗氧化蛋白HO-1的水平。实验方法步骤：PC12细胞分别用3a(2.5、5和10μM)，NDGA(10μM)作用24h，蛋白质通过10％SDS-PAGE分离，然后转移PVDF膜上，再用5％脱脂乳液封闭。HO-1(1：300)，GADPH(1：1000)的抗体孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1：1000)室温下孵育1h。最后通过Image J软件检测靶蛋白。
ZnPP是HO-1的抑制剂，具有有效拮抗HO-1所产生的效果。实验方法步骤：PC12细胞铺板96孔板过夜，ZnPP(15μM)作用1h后，加3a(5μM)作用24h，再用H2O2(400μM)刺激24h，用MTT法检测细胞生存率。三次重复实验得到相同结果。
HO-1为Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路所调控的关键蛋白。由图4可知，western blot结果表明3a能够明显增加抗氧化蛋白HO-1的表达，且呈剂量依赖性。抑制剂实验也表明，HO-1的抑制剂能够部分拮抗3a对H2O2诱导的PC12细胞损伤的保护作用。
综上所述，3a能通过激活Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路，起到较好的抗氧化作用。
实施例6活性化合物3a能够减少大脑中动脉栓塞模型(MCAO)梗死面积，改善神经得分。
缺血性脑血管病占脑血管病的80-85％，其中大脑中动脉是常见的出血和梗塞发生部位。目前，缺血性脑卒中的治疗一般先用溶栓治疗，这常常导致第二次脑损伤，即脑缺血再灌注损伤。氧化应激被认为是与脑缺血再灌注损伤发病机制相关的一系列机制中最重要的原因。因为氧化应激可以加速活性氧(ROS)的产生，这极大地加剧了缺血性脑损伤。另一方面，由于缺血组织中的抗氧化防御系统中断，ROS的过量生成不能在缺血状态下被中和。因此，外源性补充具有ROS清除活性的抗氧化剂将是脑缺血再灌注损伤的潜在疗法。中动脉栓塞模型(MCAO)是经典的脑缺血再灌注损伤模型。检测方法：雄性SD大鼠造模前2h侧脑室给药(15mg/kg)。给药2h后，颈部做一个切口，然后分离右颈总动脉(CCA)，颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。然后有颈外动脉插入拴线至颈内动脉，直至大脑总动脉。栓塞2h后，退出拴线进行再灌注72h。神经得分使用Longa方法。TTC染色方法如下：大脑迅速从大鼠中取出，-20℃冻存20min，冠状切片切5片，置TTC溶液中，37℃下30min。用数码相机拍摄TTC染色的脑切片。用Image-Pro plus计算大鼠梗死面积。实验结果见图5，3a能够有效的减少梗死面积，改善神经得分，在相同给药剂量(15mg/kg)下，3a的效果明显优于临床药物依达拉奉。

Claims (2)

1.一种NDGA类似物在制备抗氧化药物中的应用，其特征在于，所述的NDGA类似物为以下化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述抗氧化药物用于预防或者治疗由氧化应激损伤导致的缺血性脑中风中急性脑缺血再灌注损伤。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗氧化药物具有能够同时直接清除ROS和激活细胞内Keap1/Nrf2/ARE抗氧化通路间接清除ROS的抗氧化活性。
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