CN101407456B - 千年健中具有β-分泌酶抑制作用的有效成分 - Google Patents

Abstract

本发明公开千年健中具有β-分泌酶抑制作用的有效成分，具体而言，涉及一类新的2-取代-6-羟基苯甲酸化合物，包括2-(11′Z-十七碳烯)-6-羟基苯甲酸(1)，2-(6′Z，9′Z，12′Z-十七碳三烯)-6-羟基苯甲酸(2)，2-(9′Z，12′Z-十七碳二烯)-6-羟基苯甲酸(3)，2-(12′-苯十二烷基)-6-羟基苯甲酸(4)，及其制备方法和含有其的药物组合物，本发明的化合物均具有显著的β-分泌酶(β-secretase)抑制作用，由于抑制β-分泌酶，减少β淀粉样蛋白(β-Amyloid，Aβ)的产生，因此这类化合物能用于制备治疗抗老年痴呆症药物。

Description

千年健中具有β-分泌酶抑制作用的有效成分

技术领域

本发明涉及一类新的2-取代-6-羟基苯甲酸化合物，其制备方法和含有其的药物组合物，及其制备治疗抗老年痴呆症药物的应用，属于医药技术领域。 

背景技术

老年痴呆病，即阿尔兹海默症(Alzheimer‘s disease，AD)，是一种中枢神经系统退变性疾病，临床表现为认知障碍、记忆逐渐减退、最终丧失思考能力、运动障碍以及生活不能自理。随着世界人口的老龄化，阿尔兹海默症成为越来越严重的危害人类健康的疾病之一。多年来临床用于治疗老年痴呆症的主要药物是胆碱酯酶抑制剂，这类药物通过作用于胆碱能神经系统，起缓解症状的作用，但不能阻止疾病的发生和发展。尽管目前关于AD的发病机制并不十分确定，但普遍认为β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)的非正常堆积是老年痴呆病的重要成因。β-分泌酶是与老年痴呆病的发生和进行密切相关的一个新靶点。它是将淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)裂解成Aβ的过程中的关键限速酶；动物体内实验证明，β-分泌酶抑制剂可以大大降低Aβ的水平，并改善与AD类似的发病症状。现已报道的β-分泌酶抑制剂：绝大多数是多肽和拟肽类化合物，仅有少数是合成的小分子杂环化合物。从天然产物中发现的抑制剂在2003年11月才有第一次报道，即儿茶酚类化合物(-)EGCG(对β-分泌酶抑制作用的IC₅₀在10^-6M水平)。迄今为止，从天然产物中发现β-分泌酶抑制剂的报告仅有3篇，除(-)EGCG外，还发现hispidin和鞣质类化合物tellimagrandin II具有β-分泌酶抑制作用(IC₅₀ 10^-5～10^-6 M)。  

千年健是天南星科(Araceae)千年健属(Homalomena)植物千年健(H.occulta Schott)的干燥根茎，主产于我国云南的东部和南部、广西的南部，为传统中药。其药性苦、辛、温；归肝、肾经；有祛风湿、强筋骨、止痛的功效。可治跌打损伤、骨折、外伤出血、四肢麻木、筋脉拘挛、风湿腰腿痛、类风湿性关节炎、胃痛、肠胃炎等。虽然已有不少文献对千年健的化学成分进行报道，但大多数文献集中于千年健挥发油的化学成分研究，因中医临床主要取其挥发油用于治疗风寒湿痹、腰膝冷痛、下肢拘挛麻木、筋骨无力等症。迄今为止未见千年健中的化学成分具有β-分泌酶抑制活性的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的2-取代-6-羟基苯甲酸化合物。 

本发明的另一目的在于提供一种制备32-取代-6-羟基苯甲酸化合物的方法。 

本发明的再一目的在于提供一种含有一个或多个这种化合物的药物组合物。 

本发明的又一目的在于提供一种该类化合物在制备预防和/或治疗老年痴呆症的药物中的应用。 

为了完成本发明之目的，可采用如下技术方案： 

本发明的2-取代-6-羟基苯甲酸化合物，其中，2-取代基选自烷基、烯基和苯基取代烷基；优选的2-取代基选自C_10-24烷基、C_10-24烯基和苯基取代C_10-24烷基；更优选的2-取代基为(11′Z)-十七烯基、(6′Z，9′Z，12′Z)-十七三烯基、(9′Z，12′Z)-十七二烯基和12′-苯基十二烷基。 

本申请的发明人在研究中首次发现千年健(Homalomena occulta schott)提取物具有较好的抑制β-分泌酶的活性(10^-5μg/ml)。通过活性追踪的方法对千年健的β-分泌酶抑制活性进行的研究结果表明，千年健酚酸酯类化合物2-(11′Z-十七碳烯)-6-羟基苯甲酸(1)，2-(6′Z，9′Z，12′Z-十七碳三烯)-6-羟基苯甲酸(2)，2-(9′Z，12′Z-十七碳二烯)-6-羟基苯甲酸(3)，2-(12′-苯十二烷基)-6-羟基苯甲酸(4)为千年健中具有β-分泌酶抑制作用的主要活性成份，其中，化合物1和2为新化合物。 

从千年健中分离得到的化合物1-4的结构式如下： 

本发明还公开了上述千年健中有效成分的制备方法、检测方法和含量测定方法，其特征在于： 

a.千年健中的有效成分的制备方法：95％乙醇溶液回流提取三次，减压浓缩得95％乙醇粗提物，将粗提物溶于适量的水中，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，其中石油醚萃取物经过多次正相、反相、凝胶柱层析，最后用HPLC纯化，得到有效成分酚酸酯类化合物。本发明方法的优点：可以除去大量蛋白质、氨基酸、糖类、有机酸等杂质， 

b.千年健有效成分的薄层检测方法：薄层板为Merck C-18反相硅胶板，展开剂为乙腈和0.1％三氟乙酸的两相溶剂系统，在254nm的紫外灯下，有效成分具有明显的暗斑。 

c.千年健中的有效成分的含量测定方法：分析柱为反相C-18柱(5μ，4.6×150mm，Dima-ZY1104 ODS C-18)，流动相为乙腈加0.1％三氟乙酸，流速1ml/min，检测波长210nm，用外标法确定有效成分的含量。 

本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。 

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。 

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。 

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。其缓释制剂包括缓释包衣微丸剂、缓释骨架片剂、缓释脉冲 释放片剂、缓释渗透泵片剂、缓释包衣片剂等口服缓释、控释剂型。其中应用的缓释包衣技术包括PH依赖型缓释包衣技术、溶蚀延迟包衣技术、基于结肠酶降解缓释包衣技术等。 

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。 

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。 

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。 

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。 

本发明的化合物在制备工艺和制剂中还可以加入抗氧化剂，防止千年健中有效成分的分解和变化，抗氧化剂包括各种水溶性抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂，及其混合使用。水溶性的抗氧化剂包括：维生素C(Vc)、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦 亚硫酸盐、硫代硫酸钠、甲醛合亚硫酸氢钠、硫脲、半胱氨酸、蛋氨酸、硫代乙酸、硫代甘油等；脂溶性抗氧化剂包括：叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二丁甲苯酚(BHT)、培酸丙酯(PG)、生育酚(Ve)、卵磷脂等，抗氧化剂的加入量为制剂总量的0.01％-95％。 

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。 

因此本发明的药物组合物可以是片剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释剂等口服制剂和注射水针剂、粉针剂、冻干剂等注射制剂。 

千年健中的有效成分不仅具有良好的β-分泌酶抑制活性，还具有抗氧化活性，可对抗Aβ聚合过程中产生的游离基对神经细胞的损伤。因此，上述有效成分及其衍生物和有效组分有可能从减少Aβ生成和保护神经细胞两个机理对抗老年痴呆症。 

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。 

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。 

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。 

具体实施方式

实施例1.有效成分的制备 

干燥的千年健(H.occulta)根茎粉末4kg，以95％乙醇回流提取三次，合并提取液，浓缩得浸膏280g，将该浸膏悬浮于适量的水中，用石油醚、氯仿、乙酸乙酯 和正丁醇依次萃取，得石油醚萃取物HO-1(70g)。HO-1经硅胶柱层析，以石油醚：丙酮(75∶25)作为流动相，分为HO-1-1，HO-1-2(35g)，HO-1-3(8g)，HO-1-4四个部分。HO-1-2经硅胶柱层析，以环己烷∶乙酸乙酯(95∶5；90∶10；80∶20)作为流动相，得到HO-1-2-1～5五个流份。HO-1-3经硅胶柱层析，以环己烷∶乙酸乙酯(95∶5)作为流动相，得到HO-1-3-1～4四个流份。将HO-1-2-5(14.5g)和HO-1-3-4(5.7g)合并后经过多次结晶和硅胶柱层析除去该部位的主要成分硬脂肪酸后得活性部位HO-1-C(2.0g)。HO-1-C依次经正相硅胶柱层析(环己烷∶乙酸乙酯，95∶5)、反相硅胶柱层析(甲醇∶水，80∶20；85∶15；90∶10；100∶0)、薄层制备(环己烷∶乙酸乙酯，85∶15)，凝胶柱层析(石油醚∶氯仿∶甲醇，5∶5∶1)，最后用HPLC(流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈)纯化，得到有效成分酚酸酯类化合物1(15mg)，2(10mg)，3(10mg)，4(10mg)。 

化合物1 

白色无定型粉末，分子式C₂₄H₃₈O₃，UVλ_max ^CHCl3 238，302nm；EI-MS(％rel.intens.)：m/z374(44)，356(30)，338(31)，299(10)，246(10)，161(55)，152(67)，147(93)，108(100)，91(55)；ESIMS m/z 397.6[M+Na]⁺；HR-EI-MS：m/z 374.2795[M]⁺ (calc.for C₂₄H₃₈O₃，374.2921)；299.2007(calc.for C₂₀H₂₇O₂，299.2011)；247.1689(calc.for C₁₆H₂₃O₂，247.1698)；¹H NMR(CD₃COCD₃，400MHz)δ(ppm)：0.87(3H，t，J＝7.2Hz，H-17′)，1.29(20H，br)，1.60(2H，q，J＝7.2Hz，H-2′)，2.02(2H，q，J＝5.6Hz，H-10′，13′)，2.97(2H，t，J＝7.6Hz，H-1′)，5.34(2H，m)，6.77(2H，d，J＝8.0Hz)，7.32(1H，t，J＝8.0Hz)；¹³C NMR(CD₃COCD₃，100MHz)δ(ppm)：173.6(COOH)，163.6(C-6)，147.2(C-2)，134.8(C-4)，130.5(CH＝CH)，122.9(C-3)，116.0(C-1)，113.1(C-5)，36.8(C-1′)，32.9(C-2′)，32.6-29.4，29.2(C-10′，11′)，23.3(C-16′)，14.3(C-17′)。 

化合物2 

白色无定型粉末，分子式C₂₄H₃₄O₃，UVλ_max ^CHCl3 243，305nm；EI-MS(％rel.intens.)：m/z370(10)，338(7)，327(7)，309(10)，175(40)，151(10)，147(20)，108(100)，107(75)，91(40)，79(60)；HR-ESI-MS：m/z369.2414[M-H]^-(calc.for C₂₄H₃₃O₃，369.2430)；327.1937(the fragment ion at m/z327 in Figure 5)(calc.for C₂₁H₂₇O₃，327.1960)；ESIMS m/z370.2[M+Na]⁺；¹H NMR(CD₃COCD₃，500MHz)δ(ppm)：0.91(3H，t，J＝7.5Hz，H-17′)，1.57(2H，br，H-2′)，2.95(2H，t，J＝7.5Hz，H-1′)，5.31(6H，m)，6.74(2H，d，J＝7.5Hz)，7.28(1H，t，J＝7.5Hz)；¹³C NMR(CD₃COCD₃，125MHz)δ(ppm)：173.6(COOH)，163.6(C-6)，147.1(C-2)，134.5(C-4)，132.4(CH＝CH)，130.9(CH＝CH)，128.9(CH＝CH)，128.9(CH＝CH)，128.5(CH＝CH)，128.0(CH＝CH)，122.9(C-3)，115.8(C-1)，113.1(C-5)，36.7(C-1′)，32.9(C-2′)，30.5-29.3，27.8(C-14′)，26.2(C-8′)，26.0(C-11′)，21.1(C-16′)，14.5(C-17′)。 

化合物3 

白色无定型粉末，分子式C₂₄H₃₆O₃，ESIMS m/z372.0[M]⁺；¹H NMR(CD₃COCD₃，400MHz)δ(ppm)：0.87(3H，t，J＝5.6Hz)，1.60(2H，m)，2.78(1H，t，J＝5.6Hz)，2.97(2H，t，J＝6.0Hz)，5.34(4H，m)，6.78(2H，d，J＝8.0Hz)，7.32(1H，t，J＝8.0Hz)；¹³C NMR(CD₃COCD₃，100MHz)δ(ppm)：173.4(COOH)，163.3(C-6)，147.1(C-2)，134.8(C-4)，130.7(CH＝CH)，128.7(CH＝CH)，122.9(C-3)，115.9(C-1)，113.3(C-5)，27.8(C-8′，14′)，26.7(C-11′)。 

化合物4 

白色无定型粉末，分子式C₂₅H₃₄O₃，ESIMS m/z381.8[M-H]^-；¹H NMR (CD₃COCD₃，500MHz)δ(ppm)：1.31(m)，1.36(m)，1.60(2H，m)，2.05(3H，m)，2.96(1H，t，J＝8.0Hz)，2.59(1H，t，J＝8.0Hz)，6.78(2H，d，J＝7.5Hz)，7.32(1H，t，J＝8.0Hz)，7.12～7.26(5H，m)；¹³C NMR(CD₃COCD₃，125MHz)δ(ppm)：173.4(COOH)，163.3(C-2)，147.1(C-1)，134.7(C-4)，122.9(C-5)，115.9(C-3)，113.3(C-6)，143.7，2×129.1，2×129.0，126.3(C-12′位连接的苯环上的6个碳)。 

药理实验 

实验例1.BACE-1的体外抑制活性的测定： 

利用荧光共振能量转移法(FRET)测定化合物对BACE-1的体外抑制活性。 

具体地说就是4μM荧光肽底物Mca-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Lys(Dnp)-Arg-Arg-NH₂，2μg/ml重组人BACE-l(R&D公司)以及不同浓度的待测化合物加入50mM乙酸钠缓冲液(pH4.0)中，使终体积为100μl。 

设定荧光酶标仪(SpectraMAX Gemini XS型，Molecular Devices公司)激发和发射波长分别为320nm和405nm，读取反应起始及25℃保温60min后的荧光强度。抑制率按照下列公式计算： 

抑制率(％)＝[1-(F_S-F_S0)/(F_C-F_C0)]×100％ 

其中F_S0和F_S分别为待测化合物反应起始和保温60min后的荧光强度，F_C0和F_C分别为阴性对照反应起始和保温60min后的荧光强度。利用软件Prism 3.0作抑制率对待测化合物浓度的非线性拟合曲线，计算上述化合物的IC₅₀值分别为： 

表1.化合物1-4对β-分泌酶的抑制活性(IC₅₀value)。 

化合物	IC50(μg/mL)	IC50(μM)
			1    2    3    4	2.33±0.35  2.95±0.14  2.40±0.24  2.83±0.23	6.23±0.94  7.93±0.38  6.28±0.63  7.65±0.62

Claims (2)

1.2-取代-6-羟基苯甲酸化合物在制备预防和\或治疗老年痴呆症的药物中的应用，其中，2-取代基选自C_10-24烷基、C_10-24烯基和苯基取代C_10-24烷基。

2.根据权利要求1的2-取代-6-羟基苯甲酸化合物在制备预防和\或治疗老年痴呆症的药物中的应用，其特征在于，2-取代基为(11′Z)-十七烯基，(6′Z，9′Z，12′Z)-十七三烯基，(9′Z，12′Z)-十七二烯基和12′-苯基十二烷基。