CN107037157B - 一种千年健指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种千年健指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。该构建方法包括以下步骤：S1：精密称取千年健粉末，加入甲醇后超声提取，静置冷却，用甲醇补足失重，离心，取上清液蒸发干燥，残渣加甲醇复溶，涡旋，过滤，取续滤液，即为供试品溶液；S2、吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到千年健的指纹图谱。其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为285～305nm。本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好的特点，能够用于千年健药材的综合质量控制。

Description

一种千年健指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱的构建方法，特别涉及一种千年健指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
背景技术
中药指纹图谱特指某种中药材或中成药所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。中药指纹图谱作为一种综合的、可量化的质量控制手段，可提供比单一指标成分更全面的信息。目前，FDA、英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用植物学会等均接受指纹图谱的质控方法，中国药品监督管理局也颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》。在现阶段中药有效成分绝大多数没有明确的情况下，中药指纹图谱对于有效控制和评价中药材或中成药的质量具有重要的意义。中药指纹图谱技术已经成为牵动行业全面进步、带动中药现代化、推动中药走向世界的关键技术之一。
千年健为天南星科植物千年健Homalomena occulta(Lour.)Schott的干燥根茎，又名千颗针、丝棱线。产于广西、云南等地，具有祛风湿，壮筋骨之功效，临床常用于治疗风湿性关节炎，类风湿性关节炎。千年健含大量挥发油成分，2015年版中国药典一部规定用千年健中含芳樟醇的含量(不少于0.2％)来控制千年健药材的质量，但此单指标成分的质量控制不能全面的评价药材的优劣。中药指纹图谱是控制天然药物质量的有效方式之一。指纹图谱全面整体地反映了药材的内在质量，能为中药的质量评价和控制提供一个有效的参考方法。全面、系统而又特征地指纹图谱有利于全方位地控制中药质量并与国际接轨。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种符合千年健药材特点的指纹图谱构建方法。该指纹图谱构建方法前处理简单，所得图谱中各峰分离度佳，构成了千年健药材的指纹特征，可作为千年健药材的标准指纹图谱。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种千年健指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
S1、供试品溶液的制备：精密称取千年健粉末，加入甲醇后超声提取，静置冷却，用甲醇补足失重，离心，取上清液蒸发干燥，残渣加甲醇复溶，涡旋，过滤，取续滤液，所得溶液即为供试品溶液；
S2、供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到千年健的指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相A为乙腈，流动相B为磷酸水溶液，流动相中A与B的体积比随时间逐渐增加；检测波长为285～305nm；
梯度洗脱的程序是：
0～10分钟时，流动相A∶流动相B＝2.5:97.5；
10～20分钟时，流动相A∶流动相B＝2.5：97.5～3：97；
20～35分钟时，流动相A∶流动相B＝3：97～5：95；
35～40分钟时，流动相A∶流动相B＝5：95～8：92；
40～50分钟时，流动相A∶流动相B＝8：92～10∶90；
50～60分钟时，流动相A∶流动相B＝10∶90～14：86；
60～80分钟时，流动相A∶流动相B＝14：86～15：85；
80～90分钟时，流动相A∶流动相B＝15：85～20：80；
90～110分钟时，流动相A∶流动相B＝20：80～30：70；
梯度洗脱过程中，流速为0.5～1.0毫升/分钟，梯度洗脱程序中的比例均为体积比。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，步骤S1中千年健粉末全部能够通过标准药典筛三号筛。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，步骤S1中超声提取的时间为30分钟。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，步骤S1中过滤为用0.45μm有机系微孔滤膜过滤。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，高效液相色谱的色谱柱采用Phenomenex C18色谱柱，规格为250mm×4.6mm×5μm。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，高效液相色谱的检测波长为290nm。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，高效液相色谱分析的柱温为25℃～45℃。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，高效液相色谱分析的柱温为30℃。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，梯度洗脱的流动相的流速为0～10分钟流速为0.5毫升/分钟，10～110分钟流速为1毫升/分钟。
根据本发明的千年健指纹图谱构建方法的一个优选实施方案，流动相B为体积分数为0.01％的磷酸水溶液。
本发明的另一目的在于提供一种千年健的标准指纹图谱，所述千年健的标准指纹图谱有11个共有峰，其中以4号峰为参照峰，各峰相对保留时间和相对峰面积分别如下：
相对保留时间：
1号峰：0.4630～0.5203，2号峰：0.5818～0.6321；
3号峰：0.7778～0.8663，4号峰：1.0000；
5号峰：1.2414～1.3366，6号峰：2.0336～2.2459；
7号峰：2.8514～3.2557，8号峰：4.8665～5.4458；
9号峰：6.0079～7.0212，10号峰：8.9389～10.0941；
11号峰：9.0958～10.2898；
相对峰面积：
1号峰：0.7009～0.8801；2号峰：0.2832～0.4267；
3号峰：0.1334～0.1786；4号峰：1.0000；
5号峰：0.1623～0.3051；6号峰：0.4014～2.0643；
7号峰：0.1332～0.2106；8号峰：0.1088～0.1687；
9号峰：0.1616～0.2553；10号峰：1.5681～2.8527；
11号峰：0.3848～0.6889。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明提供的千年健指纹图谱的构建方法，确认了千年健药材11个共有特征指纹峰，并对其相对保留时间和相对峰面积进行了研究，保证了千年健原材料质量的稳定性。
2、本发明建立的千年健标准指纹图谱代表着千年健药材大部分药理活性，能有效地表征千年健药材的质量，为千年健药材的鉴别、质量控制提供了一定的参考依据，对千年健药材的全面质量控制具有重要的意义，也为不同厂家千年健药材的质量分析提供了新的科学依据。
3、本发明提供的千年健指纹图谱的构建方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、实用性强的特点，能够用于千年健药材的综合质量控制。
附图说明
图1为本发明实施例1中10批次千年健药材的HPLC指纹图谱。
图2为本发明实施例1中千年健药材的标准指纹图谱R。
具体实施方式
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
千年健指纹图谱的构建
1.主要仪器与试剂：Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998PDA检测器，Empower3色谱数据工作站(购自美国Waters公司)；BP211D型十万分之一电子分析天平(购自德国Sartorius公司)；优普系列纯水系统(购自成都超纯科技有限公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(购自昆山市超声仪器有限公司)；标准药典筛(购自浙江绍兴市不锈钢筛厂)；10批次不同厂家提供的千年健药材(见下表1)，均经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为天南星科植物千年健Homalomena occulta(Lour.)Schott的干燥根茎；甲醇、乙腈均为色谱纯(购自DIKMA公司)，磷酸为分析纯(购自成都科龙化工试剂厂)，试验用水为超纯水。
表1 10批不同厂家千年健药材信息表
2、实验方法
供试品溶液的制备：精密称取千年健药材粉末过三号筛2.00g，置于10mL容量瓶中，加甲醇8mL，超声提取30min，静置冷却，用甲醇补足减失的重量，离心，取上清液蒸发干燥，残渣加1mL甲醇复溶，涡旋30s后用0.45μm PVDF微孔滤膜过滤，取续滤液，所得溶液即为供试品溶液。
供试品溶液的测定：色谱条件为采用Phenomenex Gemini 110A C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：A相为乙腈，B相为体积分数为0.01％的磷酸水溶液。柱温30℃，检测波长290nm，色谱流动相洗脱梯度程序为：0～10分钟时，流动相A∶流动相B＝2.5:97.5；10～20分钟时，流动相A∶流动相B＝2.5：97.5～3：97；20～35分钟时，流动相A∶流动相B＝3：97～5：95；35～40分钟时，流动相A∶流动相B＝5：95～8：92；40～50分钟时，流动相A∶流动相B＝8：92～10∶90；50～60分钟时，流动相A∶流动相B＝10∶90～14：86；60～80分钟时，流动相A∶流动相B＝14：86～15：85；80～90分钟时，流动相A∶流动相B＝15：85～20：80；90～110分钟时，流动相A∶流动相B＝20：80～30：70；上述梯度洗脱程序的各步骤中，流速为0～10分钟流速为0.5毫升/分钟，10～110分钟流速为1毫升/分钟，上述流动相的比例均为体积比。在上述条件下精密量取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，得到千年健药材的指纹图谱。
3、方法学研究
3.1精密度试验：称取千年健药材药品(表1中编号8样品)，按上述实验方法制备供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图。试验结果表明各共有峰的相对保留时间RSD均小于2.56％，相对峰面积RSD均小于1.46％；将同一供试品连续进样6次得到的色谱图进行相似度分析，结果显示其相似度均大于0.980，表明仪器精密度良好。
3.2重复性试验：称取千年健药材药品(表1中编号8样品)6份，分别按照上述实验方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。试验结果表明各共有峰的相对保留时间RSD均小于2.26％，相对峰面积RSD均小于2.85％。将得到的色谱图导入分析软件进行相似度分析，结果显示其相似度均大于0.990，表明构建方法重复性良好。
3.3稳定性试验：取千年健药材药品(表1中编号8样品)，按上述实验方法制备供试品溶液，分别于0h、3h、6h、9h、12h、24h按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。试验结果表明各共有峰的相对保留时间RSD均小于3.00％，相对峰面积RSD均小于2.18％。将得到的色谱图导入分析软件进行相似度分析，结果显示其相似度均大于0.980，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
以上方法学考察表明：目前建立的指纹图谱操作方法可行，适合千年健药材指纹图谱的建立和分析。
千年健药材对照图谱的建立
取不同批次千年健药材共10批(样品详情见表1)，分别按照已建立的千年健指纹图谱分析方法进行分析，得到各批药材的HPLC(高效液相色谱)指纹图谱(见附图1)。
上述10批千年健药材，经专家鉴定质量合格，且为相互独立的药材样本，可作为代表性样品。因此以上述10批次样品的色谱指纹图谱为基础，使用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)进行数据处理得到共有模式指纹图谱，即为千年健标准指纹图谱R(见附图2)。
通过比较10批药材的色谱图，确定了11个共有峰。在标准指纹图谱中，以4号峰为参照峰S峰，计算10批千年健药材指纹图谱各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2和表3。
表2 10批样品共有指纹峰相对保留时间
表3 10批样品共有指纹峰相对峰面积
借助《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)对10批样品的指纹图谱数据进行分析，计算10批千年健药材和对照指纹图谱之间的相似度，除S4和S10与对照图谱的相似度分别为0.492和0.624外，其余厂家千年健样品与对照图谱的相似度均在0.887～0.988之间，其中S1、S2、S3、S7与对照图谱的相似度高达0.95以上，结果见表4。
表4各批药材与对照图谱之间的相似度
以上研究表明本发明提供的千年健指纹图谱的构建方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，有良好的实用性，能够用于千年健的综合质量控制。

Claims (9)

1.一种千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、 供试品溶液的制备：精密称取千年健粉末，加入甲醇后超声提取，静置冷却，用甲醇补足失重，离心，取上清液蒸发干燥，残渣加甲醇复溶，涡旋，过滤，取续滤液，所得溶液即为供试品溶液；
S2、 供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度洗脱进行测定，得到千年健的指纹图谱；
其中，高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相 A为乙腈，流动相 B 为磷酸水溶液，流动相中 A 与 B 的体积比随时间逐渐增加；检测波长为 285～305nm；
梯度洗脱的程序是：
0～10 分钟时，流动相 A∶流动相 B＝2.5:97.5；
10～20 分钟时，流动相 A∶流动相 B＝2.5：97.5～3：97；
20～35 分钟时，流动相 A∶流动相 B＝3：97～5：95；
35～40 分钟时，流动相 A∶流动相 B＝5：95～8：92；
40～50 分钟时，流动相 A∶流动相 B＝8：92～10∶90；
50～60 分钟时，流动相 A∶流动相 B=10∶90～14：86；
60～80 分钟时，流动相 A∶流动相 B=14：86～15：85；
80～90 分钟时，流动相 A∶流动相 B=15：85～20：80；
90～110 分钟时，流动相 A∶流动相 B=20：80～30：70；
梯度洗脱过程中，流速为 0.5～1.0 毫升/分钟，梯度洗脱程序中的比例均为体积比。
2.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤 S1 中千年健粉末全部能够通过标准药典筛三号筛。
3.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述步骤 S1 中过滤为用 0.45μm 有机系微孔滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱采用 Phenomenex C18 色谱柱，规格为 250mm×4.6 mm×5μm。
5.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测波长为 290nm。
6.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，高效液相色谱分析的柱温为 25℃～45℃。
7.根据权利要求 6 所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，柱温为 30℃。
8.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，0～10 分钟流速为0.5毫升/分钟，10～110 分钟流速为1毫升/分钟。
9.根据权利要求1所述的千年健指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述流动相 B 是体积分数为 0.01%的磷酸水溶液。
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