ES2886945T3 - Detección ultrasensible de moléculas o partículas usando perlas - Google Patents

Abstract

Método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido, que comprende: exponer una pluralidad de perlas, cada una de las cuales incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito, a una disolución que contiene o se sospecha que contiene al menos un tipo de moléculas o partículas de analito; inmovilizar moléculas o partículas de analito con respecto a la pluralidad de perlas de manera que una fracción estadísticamente significativa de las perlas se asocia con una única molécula o partícula de analito y una fracción estadísticamente significativa de las perlas estén libres de cualquier molécula o partícula de analito; aislar individualmente al menos una parte de las perlas sometidas a la etapa de inmovilización del resto de dicha parte de las perlas; abordar individualmente al menos una parte de las perlas y determinar el número de dichas perlas asociadas con una molécula o partícula de analito, en el caso de detección directa, examinando y/o detectando una molécula o un resto que está comprendido en la molécula o partícula del analito o, en el caso de detección indirecta, examinando y/o detectando una molécula o un resto que está comprendido en un agente de marcaje que se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor por exposición a la molécula o partícula de analito; y determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de perlas sometidas a la etapa de abordar que se determina que están asociadas con una molécula o partícula de analito; en el que cada una de las perlas está contenida dentro de una gota de líquido que es inmiscible dentro de un fluido en el que la gota está suspendida durante al menos la etapa de abordar; y en el que la etapa de abordar individualmente al menos una parte de las perlas comprende alimentar las gotas de líquido en una columna de manera que pasen por un sistema de detección óptica en una sola fila.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección ultrasensible de moléculas o partículas usando perlas

Campo de la invención

Se describen métodos para detectar moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido y determinar una medida de la concentración de las moléculas o partículas en la muestra de fluido.

Antecedentes de la invención

Métodos y sistemas que son capaces de detectar de manera rápida y exacta y, en determinados casos, cuantificar una molécula de analito diana en una muestra son los pilares de las mediciones analíticas modernas. Tales sistemas y/o métodos se emplean en muchas áreas tales como investigación académica e industrial, evaluación medioambiental, seguridad de los alimentos, diagnóstico médico y detección de agentes de guerra química, biológica y/o radiológica. Las características ventajosas de tales técnicas pueden incluir especificidad, velocidad y sensibilidad.

Las técnicas más actuales para cuantificar niveles bajos de moléculas de analito en una muestra usan procedimientos de amplificación para aumentar el número de moléculas indicadoras con el fin de ser capaces de proporcionar una señal medible. Por ejemplo, estos procedimientos conocidos incluyen ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) para amplificar la señal en ensayos basados en anticuerpos, así como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar cadenas de ADN diana en ensayos basados en ADN. Una técnica de amplificación de diana proteica más sensible pero indirecta, denominada inmuno-PCR (véase Sano, T.; Smith, C. L.; Cantor, C. R. Science 1992, 258, 120-122) usa marcadores oligonucleotídicos, que posteriormente pueden amplificarse usando PCR y detectarse usando un ensayo de hibridación de ADN (véase Nam, J. M.; Thaxton, C. S.; Mirkin, C. A. Science 2003; 301, 1884-1886; Niemeyer, C. M.; Adler, M.; Pignataro, B.; Lenhert, S.; Gao, S.; Chi, L. F.; Fuchs, H.; Blohm, D. Nucleic Acids Research 1999, 27,4553-4561; y Zhou, H.; Fisher, R. J.; Papas, T. S. Nucleic Acids Research 1993, 21, 6038­ 6039). Aunque el método de inmuno-PCR permite la detección de proteínas a nivel ultra-bajo, es un procedimiento de ensayo complejo y puede ser propenso a la generación de señales de falsos positivos (véase Niemeyer, C. M.; Adler, M.; Wacker, R. Trends in Biotechnology 2005, 23, 208-216).

El documento WO 2009/029073 A1 describe un método para medir la concentración de un analito o analitos en una disolución. Los métodos descritos en ese documento pueden llevarse a cabo usando varios formatos de ensayo diferentes, incluyendo en recipientes de reacción definidos, al menos en parte, por los extremos distales de cadenas de fibra óptica.

Rissin y Walt describen un inmunoensayo basado en una matriz de fibra óptica de obtención de imágenes duplicadas para la detección de inmunoglobulina A (IgA) y lactoferrina y el cálculo de la concentración usando la intensidad de la señal medida y las curvas de calibración (Analytica Chimica Acta, 2006, 564 (1), págs. 34-39).

Rissin y Walt (J. Am. Chem. Soc. 2006, 128 (19), págs. 6286-6287) también describen matrices de femtolitros que contienen 24.000 cámaras de reacción individuales que se usan en un ensayo de unión de prueba de concepto en el que un agente de señalización enzimática (P-galactosidasa) se captura en las cámaras de reacción y cataliza una reacción en pocillos que contienen el agente de señalización para producir una señal fluorescente detectable para la detección. Se divulga que la lectura lineal entre el porcentaje de cámaras que producen una señal fluorescente y la concentración molar inicial del agente de señalización enzimática sugiere que la técnica “debería facilitar el desarrollo adicional de esta tecnología para la detección de analitos específicos de interés” tales como ADN y antígenos. (Id. en 6287).

Una característica de los métodos y/o sistemas conocidos típicos para detectar o cuantificar concentraciones bajas de un analito particular en disolución es que se basan en respuestas de conjunto en las que muchas moléculas de analito dan lugar a una señal medida. La mayoría de los esquemas de detección requieren que estén presentes un gran número de moléculas en el conjunto para que la señal agregada esté por encima del umbral de detección. Este requisito limita la sensibilidad de la mayoría de las técnicas de detección y el intervalo dinámico (es decir, el intervalo de concentraciones que pueden detectarse). Muchos de los métodos y técnicas conocidos presentan además problemas de unión no específica, que es la unión de moléculas o partículas de analito que van a detectarse o especies indicadoras de manera no específica a sitios distintos de los previstos. Esto conduce a un aumento en la señal de fondo y, por tanto, limita la concentración más baja que puede detectarse de manera exacta o reproducible.

Por consiguiente, se necesitan métodos mejorados para detectar y, opcionalmente, cuantificar moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido, especialmente en muestras en las que tales moléculas o partículas están presentes a una concentración muy baja.

Sumario de la invención

Aunque en el presente documento se describen diversos sistemas, métodos, artículos y kits debe entenderse que la invención para la que se busca protección es la definida por las reivindicaciones adjuntas.

Es decir, la invención se refiere a un método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido, que comprende:

exponer una pluralidad de perlas, cada una de las cuales incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito, a una disolución que contiene o se sospecha que contiene el al menos un tipo de moléculas o partículas de analito;

inmovilizar moléculas o partículas de analito con respecto a la pluralidad de perlas de manera que una fracción estadísticamente significativa de las perlas se asocia con una única molécula o partícula de analito y una fracción estadísticamente significativa de las perlas estén libres de cualquier molécula o partícula de analito;

aislar individualmente al menos una parte de las perlas sometidas a la etapa de inmovilización del resto de dicha parte de las perlas;

abordar individualmente al menos una parte de las perlas y determinar el número de dichas perlas asociadas con una molécula o partícula de analito, en el caso de detección directa, examinando y/o detectando una molécula o un resto que está comprendido en la molécula o partícula de analito o, en el caso de detección indirecta, examinando y/o detectando una molécula o un resto que está comprendido en un agente de marcaje que se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor mediante exposición a la molécula o partícula de analito; y

determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de perlas sometidas a la etapa de abordar que se determinó que estaban asociadas con una molécula o partícula de analito,

en el que cada una de las perlas está contenida dentro de una gota de líquido que es inmiscible dentro de un fluido en el que la gota está suspendida durante al menos la etapa de abordar; y

en el que la etapa de abordar individualmente al menos una parte de las perlas comprende alimentar las gotas de líquido en una columna de manera que pasen por un sistema de detección óptica en una sola fila.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras adjuntas son esquemáticas y no se pretende que estén dibujadas a escala. Con los propósitos de claridad, no se marcan todos los componentes en todas las figuras, ni se muestran todos los componentes de cada realización cuando no se necesita la ilustración para permitir que los expertos habituales en la técnica entiendan la divulgación general, incluyendo la invención actualmente reivindicada.

La figura 1 es un diagrama de flujo esquemático que representa una realización de las etapas (A-D) para realizar un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 2 es un diagrama de flujo esquemático que representa una realización de las etapas (A-D) para realizar un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 3 es un diagrama esquemático que representa una realización de una parte de un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 4A es un diagrama de flujo esquemático que representa una realización de las etapas (A-C) para realizar un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 4B es un diagrama de flujo esquemático que representa una realización de las etapas (A-D) para realizar un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 4C es un diagrama esquemático que representa una realización para realizar un método a modo de ejemplo de la presente invención;

la figura 5 es un diagrama de flujo esquemático que representa una realización de las etapas (A-C) para realizar un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 6 es un diagrama de flujo esquemático que representa una realización de un método (etapas A-D) para la formación de una pluralidad de recipientes de reacción mediante acoplamiento de un sustrato y un componente de sellado y que representa ejemplos del tamaño (E, F) de un componente de sellado con respecto a un sustrato; la figura 7 representa una configuración experimental para la detección usando luz, según una realización tal como se describe en el presente documento;

la figura 8 muestra una matriz de fibra óptica que se ha sellado con un componente de sellado, según una realización; la figura 9A muestra un diagrama esquemático que representa un método de detección indirecta de una molécula de analito asociada con un objeto de captura, según algunas realizaciones;

la figura 9B muestra un diagrama esquemático que representa un método de detección indirecta de una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura usando un ligando de unión, según algunas realizaciones; las figuras 10A y 10B muestran diagramas esquemáticos que representan algunas realizaciones de las etapas para reticular un ligando de unión y una molécula de analito, según algunos métodos de la presente invención;

las figuras 11A y 11B muestran ejemplos de un sistema que emplea un sistema de detección óptica de la presente invención según algunas realizaciones;

la figura 12 es un diagrama de bloques esquemático que muestra un sistema que emplea un conjunto de fibra óptica con un sistema de detección óptica según una realización de la invención;

la figura 13 muestra un gráfico de una curva de calibración esquemática que puede usarse para determinar la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido, según algunas realizaciones de la presente invención;

la figura 14 muestra representaciones gráficas de la fracción de objetos de captura que se determina que está asociada con una molécula de analito que comprende A) PSA, B) TNF-alfa o C) ADN, frente a la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 15 muestra una representación gráfica del logaritmo de la fracción de objetos de captura que se determina que está asociada con una molécula de analito frente al logaritmo de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 16 muestra un gráfico del número de recipientes de reacción que comprenden una perla frente al número total de perlas proporcionadas a los recipientes de reacción, según una realización;

las figuras 17A-17C muestran imágenes de perlas contenidas en matrices que comprenden una pluralidad de recipientes de reacción;

la figura 18A muestra una imagen de fluorescencia de una matriz que contiene perlas,

la figura 18B muestra un aumento de la imagen de la figura 18A;

las figuras 19A y 19B muestran gráficos del número de recipientes de reacción que se determina que contienen una molécula de analito frente a la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido, según determinadas realizaciones;

la figura 19C muestra un gráfico de la lectura de fluorescencia total frente a la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 20 muestra una representación gráfica del % de ruido de Poisson frente a la varianza experimental a lo largo de tres medidas a partir de los datos experimentales mostrados en la figura 19B;

la figura 21 muestra una representación gráfica de la fracción de objetos de captura que se determina que está asociada con una molécula de analito frente a la concentración de ligando de unión proporcionada, a dos concentraciones de moléculas de analito, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 22 muestra una representación gráfica de la fracción de objetos de captura que se determina que está asociada con una molécula de analito frente a la concentración de ligando de unión por objeto de captura proporcionada, a dos concentraciones de moléculas de analito, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 23 muestra una representación gráfica de la fracción de objetos de captura que se determina que está asociada con una molécula de analito frente a la concentración de ligando de unión proporcionada, a dos concentraciones de moléculas de analito, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 24 muestra una representación gráfica de la quimioluminiscencia total frente a la concentración de ligando de unión proporcionada, según una realización a modo de ejemplo;

las figuras 25A y 25B muestran diagramas esquemáticos que representan una realización de las etapas para realizar un método tal como se describe en el presente documento;

la figura 25C muestra una imagen de perlas contenidas en una pluralidad de recipientes de reacción, según una realización;

la figura 25D muestra una imagen de fluorescencia de una matriz que comprende una pluralidad de perlas, algunas de las cuales se asocian con una molécula de analito tras llevar a cabo un método tal como se describe en el presente documento, según una realización;

la figura 26 muestra una representación gráfica de la densidad óptica frente a la concentración de TNF-alfa, según una realización a modo de ejemplo;

la figura 27 muestra una representación gráfica de la concentración de PSA determinada para una pluralidad de sujetos humanos;

la figura 28 muestra un histograma de la intensidad de fluorescencia promedio de recipientes de reacción en un método de ensayo, según una realización;

la figura 29A muestra una imagen de fluorescencia tomada a una primera longitud de onda de una parte de una matriz de recipientes de reacción que contienen perlas;

la figura 29B es una imagen de fluorescencia tomada a la primera longitud de onda de una parte de una matriz de recipientes de reacción que contienen perlas, en la que las perlas están asociadas con entidades fluorescentes;

la figura 29C es una imagen de fluorescencia de una parte de la matriz de la figura 29B tomada a una segunda longitud de onda;

la figura 29D muestra una representación gráfica de (i) perlas y (ii) perlas asociadas con entidades fluorescentes, a concentraciones variables de moléculas de analito;

las figuras 30A y 30B muestran representaciones gráficas de disociación de inmunocomplejos a lo largo del tiempo, según algunas realizaciones;

la figura 31 muestra una representación gráfica de moléculas de analito promedio por perla frente a la concentración de moléculas de analito, según algunas realizaciones.

Descripción detallada

Diversas realizaciones de esta divulgación se refieren sistemas, métodos, artículos y kits. Estos proporcionan contexto y antecedentes para la presente invención, que se define por las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito (tales como, por ejemplo, células, orgánulos celulares y otros materiales particulados biológicos o no biológicos) y similares, en una muestra. Debe entenderse que, aunque gran parte de la siguiente discusión se refiere a moléculas de analito, esto es únicamente a modo de ejemplo, y pueden detectarse y/o cuantificarse otros materiales, por ejemplo, analitos en forma particulada. En el presente documento se describen algunas moléculas y partículas de analito a modo de ejemplo.

Los métodos de la presente invención pueden ayudar, en determinados casos, a reducir los efectos negativos de la unión no específica sobre la sensibilidad de la detección en comparación con sistemas y métodos convencionales típicos para realizar ensayos similares. La unión no específica es la unión o asociación de una manera no específica de un componente de un ensayo con otro componente del ensayo con el que no es deseable que interaccione. Por ejemplo, la asociación, unión o inmovilización de un ligando de unión con un sustrato o material de ensayo en contraposición a una molécula o partícula de analito con la que tiene especificidad de unión. La unión no específica puede conducir a señales de falsos positivos. La unión no específica puede no solo afectar a la exactitud de la medida del ensayo, sino que también puede limitar el nivel más bajo de detección. Por tanto, determinados métodos de la presente invención que proporcionan mejoras en el nivel de unión no específica pueden permitir la detección y/o cuantificación de moléculas de analito en una muestra a un límite de detección más bajo en comparación con tecnologías convencionales típicas. Además, determinadas realizaciones de los métodos de la presente invención también pueden permitir la detección y/o cuantificación de moléculas de analito en determinadas muestras en las que tales moléculas de analito anteriormente no se habían detectado y/o no se habían cuantificado debido a la concentración muy baja a la que están presentes.

Determinados métodos de la presente divulgación pueden ser útiles para caracterizar moléculas de analito en una muestra y por tanto, se describen en el presente documento aunque no forman parte de la invención reivindicada. En algunos casos, los métodos pueden ser útiles para detectar y/o cuantificar moléculas de analito en una muestra de fluido que se sospecha que contiene al menos un tipo de molécula de analito, ya que, tal como se explica en más detalle a continuación, los ensayos pueden diseñarse de modo que el número (o fracción equivalente) de ubicaciones examinadas (por ejemplo, pocilios, sitios de reacción, zonas en una superficie, etc.) que contienen un objeto de captura (por ejemplo, perla, superficie, etc. que proporciona una superficie de captura) que comprende una molécula de analito (o, más generalmente, el número o la fracción de objetos de captura examinados de una población examinada total que comprenden una molécula de analito) puede correlacionarse con la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido. Por tanto, determinadas realizaciones de la presente divulgación pueden proporcionar una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido basándose al menos en parte en el número o la fracción de ubicaciones, por ejemplo, en un sustrato, que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito. En algunos casos, este número/fracción puede relacionarse con el número total de ubicaciones que comprenden un objeto de captura (por ejemplo, con o sin una molécula de analito o agente de marcaje asociado) y/o con el número total de ubicaciones examinadas. A continuación, se comentan métodos y cálculos específicos de cómo cuantificar moléculas de analito en una muestra de fluido.

En determinadas realizaciones, un método para la detección y/o cuantificación de moléculas de analito (o partículas) en una muestra comprende inmovilizar una pluralidad de moléculas de analito con respecto a una pluralidad de objetos de captura que incluyen, cada uno, una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito (o partícula). Por ejemplo, los objetos de captura pueden comprender una pluralidad de perlas que comprenden una pluralidad de componentes de captura (por ejemplo, un anticuerpo que tiene afinidad específica por una molécula de analito de interés, etc.). Al menos algunos de los objetos de captura (por ejemplo, al menos algunos asociados con al menos una molécula de analito) pueden separarse/segregarse espacialmente en una pluralidad de ubicaciones, y al menos algunas de las ubicaciones pueden abordarse/examinarse. Una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede determinarse basándose en la información recibida al abordar las ubicaciones. En algunos casos, una medida de la concentración puede basarse al menos en parte en el número de ubicaciones que se determina que contienen un objeto de captura que es o estaba asociado con al menos una molécula de analito. En otros casos y/o en condiciones diferentes, una medida de la concentración puede basarse al menos en parte en un nivel de intensidad de al menos una señal indicativa de la presencia de una pluralidad de moléculas de analito y/u objetos de captura asociados con una molécula de analito en una o más de las ubicaciones abordadas.

En algunas realizaciones, también puede determinarse el número/la fracción de ubicaciones que contienen un objeto de captura pero no contienen una molécula de analito y/o también puede determinarse el número/la fracción de ubicaciones que no contienen ningún objeto de captura. En tales realizaciones, una medida de la concentración de molécula de analito en la muestra de fluido puede basarse al menos en parte en la razón del número de ubicaciones que se determina que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito con respecto al número total de ubicaciones que se determina que contienen un objeto de captura no asociado con una molécula de analito y/o una medida de la concentración de molécula de analito en la muestra de fluido puede basarse al menos en parte en la razón del número de ubicaciones que se determina que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito con respecto al número de ubicaciones que se determina que no contienen ningún objeto de captura. En aún otras realizaciones, una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede basarse al menos en parte en la razón del número de ubicaciones que se determina que contienen un objeto de captura y una molécula de analito con respecto al número total de ubicaciones abordadas y/o analizadas.

En determinadas realizaciones, al menos algunos de la pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, al menos algunos asociados con al menos una molécula de analito) se separan espacialmente en una pluralidad de ubicaciones, por ejemplo, una pluralidad de recipientes de reacción en un formato de matriz. La pluralidad de recipientes de reacción puede formarse en, sobre y/o por cualquier material adecuado, y, en algunos casos, los recipientes de reacción pueden sellarse o pueden formarse con el acoplamiento de un sustrato con un componente de sellado, tal como se comenta en más detalle a continuación. En determinadas realizaciones, especialmente cuando se desea la cuantificación de los objetos de captura asociados con al menos una molécula de analito, el reparto de los objetos de captura puede realizarse de modo que al menos algunos (por ejemplo, una fracción estadísticamente significativa) de los recipientes de reacción comprenden al menos uno o, en determinados casos, únicamente un objeto de captura asociado con al menos una molécula de analito y al menos algunos (por ejemplo, una fracción estadísticamente significativa) de los recipientes de reacción comprenden un objeto de captura no asociado con ninguna molécula de analito. Los objetos de captura asociados con al menos una molécula de analito pueden cuantificarse en determinadas realizaciones, permitiendo así la detección y/o cuantificación de moléculas de analito en la muestra de fluido mediante técnicas descritas en más detalle en el presente documento.

En la figura 1 se ilustra una realización a modo de ejemplo de un método de ensayo. Se proporciona una pluralidad de objetos 2 de captura (etapa (A)). En este ejemplo particular, la pluralidad de objetos de captura comprende una pluralidad de perlas. Se exponen las perlas a una muestra de fluido que contiene una pluralidad de moléculas 3 de analito (por ejemplo, se incuban perlas 2 con moléculas 3 de analito). Al menos algunas de las moléculas de analito se inmovilizan con respecto a una perla. En este ejemplo, las moléculas de analito se proporcionan de una manera (por ejemplo, a una concentración) de modo que una fracción estadísticamente significativa de las perlas se asocia con una única molécula de analito y una fracción estadísticamente significativa de las perlas no se asocia con ninguna molécula de analito. Por ejemplo, tal como se muestra en la etapa (B), la molécula 4 de analito se inmoviliza con respecto a la perla 5, formando así un complejo 6, mientras que algunas perlas 7 no se asocian con ninguna molécula de analito. Debe entenderse que, en algunas realizaciones, más de una molécula de analito puede asociarse con al menos algunas de las perlas, tal como se describe en el presente documento. Entonces pueden separarse/segregarse espacialmente al menos algunas de la pluralidad de perlas (por ejemplo, las asociadas con una única molécula de analito o no asociadas con ninguna molécula de analito) en una pluralidad de ubicaciones. Tal como se muestra en la etapa (C), la pluralidad de ubicaciones se ilustra como un sustrato 8 que comprende una pluralidad de pocillos/recipientes 9 de reacción. En este ejemplo, cada recipiente de reacción comprende o bien ninguna o bien una perla. Entonces pueden abordarse al menos algunos de los recipientes de reacción (por ejemplo, de manera óptica o mediante otros medios de detección) para determinar el número de ubicaciones que contienen una molécula de analito. Por ejemplo, tal como se muestra en la etapa (D), se examina de manera óptica la pluralidad de recipientes de reacción usando una fuente 15 de luz, en la que cada recipiente de reacción se expone a radiación electromagnética (representada por las flechas 10) a partir de la fuente 15 de luz. La luz emitida (representada por las flechas 11) a partir de cada recipiente de reacción se determina (y/o registra) por un detector 15 (en este ejemplo, alojado en el mismo sistema que la fuente 15 de luz). El número de recipientes de reacción que contienen una molécula de analito (por ejemplo, recipientes 12 de reacción) se determina basándose en la luz detectada a partir de los recipientes de reacción. En algunos casos, también puede determinarse el número de recipientes de reacción que contienen una perla no asociada con una molécula de analito (por ejemplo, el recipiente 13 de reacción), el número de pocillos que no contienen una perla (por ejemplo, el recipiente 14 de reacción) y/o el número total de pocillos abordados. Entonces puede(n) usarse tal(es) determinación/determinaciones para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido.

Una fracción estadísticamente significativa de objetos de captura que contienen al menos una molécula de analito (o ninguna molécula de analito) podrá normalmente detectarse y cuantificarse de manera reproducible usando un sistema de detección particular y normalmente estará por encima del ruido de fondo (por ejemplo, unión no específica) que se determina cuando se lleva a cabo el ensayo con una muestra que no contiene ninguna molécula de analito, dividido entre el número total de objetos (o ubicaciones) abordados. Una “fracción estadísticamente significativa” tal como se usa en el presente documento para las presentes realizaciones, puede estimarse según la ecuación 1:

(Ec. 1)

donde n es el número de acontecimientos determinados para una categoría de acontecimientos seleccionada. Es decir, se produce una fracción estadísticamente significativa cuando el número de acontecimientos es mayor que tres veces la raíz cuadrada del número de acontecimientos. Por ejemplo, para determinar una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no asociada con ninguna molécula o partícula de analito, n es el número de objetos de captura detectados que no están asociados con ninguna molécula o partícula de analito. Como otro ejemplo, para determinar una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura asociada con al menos una molécula de analito, n es el número de objetos de captura detectados que se determina que están asociados con una molécula de analito.

En algunas realizaciones, la fracción estadísticamente significativa de objetos de captura (por ejemplo, perlas) asociada con al menos una molécula de analito (o una única molécula de analito en algunos casos en los que la razón de mezclado de objetos de captura con respecto a moléculas de analito conducirá, estadísticamente, únicamente a ninguna o a una molécula de analito asociada con cada objeto de captura) con respecto al número total de objetos de captura (por ejemplo, perlas) es de menos de aproximadamente 1:2, menos de aproximadamente 1:3, menos de aproximadamente 1:4, es menos de aproximadamente 2:5, menos de aproximadamente 1:5, menos de aproximadamente 1:10, menos de aproximadamente 1:20, menos de aproximadamente 1:100, menos de aproximadamente 1:200 o menos de aproximadamente 1:500. Por tanto, en tales realizaciones, la fracción de objetos de captura (por ejemplo, perlas) no asociada con ninguna molécula de analito con respecto al número total de objetos de captura (por ejemplo, perlas) es de al menos aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1 o similares.

En algunas realizaciones, el porcentaje de objetos de captura (por ejemplo, perlas) asociados con al menos una molécula de analito (o una única molécula de analito en algunos casos en los que la razón de mezclado de objetos de captura con respecto a moléculas de analito conducirá, estadísticamente, únicamente a ninguna o a una molécula de analito asociada con cada objeto de captura) es de menos de aproximadamente el 50 %, menos de aproximadamente el 40 %, menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 2 %, menos de aproximadamente el 1 %, menos de aproximadamente el 0,5 %, menos de aproximadamente el 0,01 % o similares, del número total de objetos de captura. En algunas realizaciones, el porcentaje de objetos de captura (por ejemplo, perlas) no asociados con una molécula de analito con respecto al número total de objetos de captura (por ejemplo, perlas) es de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o similares, del número total de objetos de captura.

En algunas realizaciones, antes de separar espacialmente la pluralidad de objetos de captura, los objetos de captura pueden exponerse a una pluralidad de ligandos de unión que tienen afinidad por al menos un tipo de molécula de analito (o partícula). Un “ ligando de unión”, tal como se usa en el presente documento, es cualquier molécula, partícula o similar que se une específicamente a, o se asocia específicamente de otro modo con, una molécula de analito para ayudar en la detección de la molécula de analito. Los ligandos de unión pueden ser particularmente útiles en realizaciones en las que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con respecto a más de una molécula de analito (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más, moléculas de analito). En algunos casos, el ligando de unión puede proporcionarse de una manera (por ejemplo, a un nivel de concentración) de modo que una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito se asocia con al menos un ligando de unión (o en algunos casos, un único ligando de unión) y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura (por ejemplo, objetos de captura o bien asociados con al menos una molécula de analito o bien no asociados con ninguna molécula de analito) no se asocia con ningún ligando de unión.

Una fracción estadísticamente significativa de las ubicaciones que contienen un objeto de captura (por ejemplo, perla) asociado con al menos una molécula de analito y un único ligando de unión es mayor que o igual al número mínimo de ubicaciones que puede determinarse de manera reproducible que contienen un objeto de captura (por ejemplo, perla) asociado con un único ligando de unión con un sistema de detección particular (es decir, se obtienen resultados sustancialmente similares para múltiples muestras de fluido esencialmente idénticas que comprenden los objetos de captura asociados con una molécula de analito y/o ligando de unión) y que está por encima del ruido de fondo (por ejemplo, unión no específica) que se determina cuando se lleva a cabo el ensayo con una muestra que no contiene ninguna molécula de analito y/o ligando de unión, dividido entre el número total de ubicaciones. La fracción estadísticamente significativa de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con al menos una molécula de analito y un único ligando de unión puede determinarse según la ecuación 1. La razón del número de objetos de captura con respecto a moléculas de analito y/o ligandos de unión que pueden proporcionarse de modo que sustancialmente todos los objetos de captura estén asociados con ninguna o con una única molécula de analito puede calcularse usando un ajuste de distribución de Poisson, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la fracción estadísticamente significativa de objetos de captura (por ejemplo, perlas) asociada con al menos una molécula de analito y al menos un ligando de unión con respecto al número total de objetos de captura (por ejemplo, perlas) es de menos de aproximadamente 1:2, menos de aproximadamente 1:3, menos de aproximadamente 1:4, es de menos de aproximadamente 2:5, menos de aproximadamente 1:5, menos de aproximadamente 1:10, menos de aproximadamente 1:20, menos de aproximadamente 1:100, menos de aproximadamente 1:200 o menos de aproximadamente 1:500. En algunos casos, la fracción estadísticamente significativa de objetos de captura (por ejemplo, perlas) no asociada con ningún ligando de unión con respecto al número total de objetos de captura es de al menos aproximadamente 1:100, aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 100:1 o similares.

En algunas realizaciones, el porcentaje de objetos de captura (por ejemplo, perlas) asociado con al menos una molécula de analito y al menos un ligando de unión con respecto al número total de objetos de captura (por ejemplo, perlas) es de menos de aproximadamente el 50 %, menos de aproximadamente el 40 %, menos de aproximadamente el 30 %, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 10 %, menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 2 %, menos de aproximadamente el 1 %, menos de aproximadamente el 0,5 %, menos de aproximadamente el 0,01 % o menos. En algunas realizaciones, el porcentaje de objetos de captura (por ejemplo, perlas) no asociado con ningún ligando de unión con respecto al número total de objetos de captura es de al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 % o más.

En la figura 2 se ilustra un ejemplo de una realización en la que un objeto de captura está asociado con más de una molécula de analito. Se proporciona una pluralidad de objetos 20 de captura (etapa (A)). En este ejemplo, la pluralidad de objetos de captura comprende una pluralidad de perlas. Se expone la pluralidad de perlas a una muestra de fluido que contiene una pluralidad de moléculas 21 de analito (por ejemplo, se incuban las perlas 20 con moléculas 21 de analito). Al menos algunas de las moléculas de analito se inmovilizan con respecto a una perla. Por ejemplo, tal como se muestra en la etapa (B), la molécula 22 de analito se inmoviliza con respecto a la perla 24, formando así un complejo 26. También se ilustra un complejo 30 que comprende una perla inmovilizada con respecto a tres moléculas de analito y un complejo 32 que comprende una perla inmovilizada con respecto a dos moléculas de analito. Adicionalmente, en algunos casos, algunas de las perlas pueden no asociarse con ninguna molécula de analito (por ejemplo, la perla 28). Se expone la pluralidad de perlas de la etapa (B) a una pluralidad de ligandos 31 de unión. Tal como se muestra en la etapa (C), un ligando de unión se asocia con algunas de las moléculas de analito inmovilizadas con respecto a una perla. Por ejemplo, el complejo 40 comprende una perla 34, una molécula 36 de analito y un ligando 38 de unión. Los ligandos de unión se proporcionan de una manera tal que una fracción estadísticamente significativa de las perlas que comprenden al menos una molécula de analito se asocia con al menos un ligando de unión (por ejemplo, uno, dos, tres, etc.) y una fracción estadísticamente significativa (es decir, según se determina mediante la ecuación 1 anterior) de las perlas que comprenden al menos una molécula de analito no se asocia con ningún ligando de unión. Entonces, al menos una parte de la pluralidad de perlas de la etapa (C) se separa espacialmente en una pluralidad de ubicaciones. Tal como se muestra en la etapa (D), en este ejemplo, las ubicaciones comprenden una pluralidad de recipientes 41 de reacción sobre un sustrato 42. Puede exponerse la pluralidad de recipientes de reacción a la pluralidad de perlas de la etapa (C) de manera que cada recipiente de reacción contiene ninguna o una perla. Entonces puede analizarse el sustrato para determinar el número de recipientes de reacción que contienen un ligando de unión (por ejemplo, recipientes 43 de reacción), en el que en el número puede relacionarse con una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido. En algunos casos, también puede determinarse el número de recipientes de reacción que contienen una perla y que no contienen un ligando de unión (por ejemplo, recipiente 44 de reacción), el número de recipientes de reacción que no contienen una perla (por ejemplo, recipiente 45 de reacción) y/o el número total de recipientes de reacción abordados/analizados. Entonces puede(n) usarse tal(es) determinación/determinaciones para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido.

Los métodos a modo de ejemplo anteriores pueden realizarse usando varios formatos de ensayo diferentes, condiciones de reacción diferentes y/o sistemas de detección en diferentes realizaciones de la invención, varios ejemplos de los cuales se describen a continuación. Debe entenderse que, aunque parte de la discusión en el presente documento se centra en una pluralidad de ubicaciones que comprenden una pluralidad de pocillos/recipientes de reacción en un sustrato, esto se proporciona para fondo. La invención reivindicada es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un método en el que moléculas o partículas de analito se inmovilizan con respecto a una pluralidad de perlas, que están contenidas en gotas de líquido.

Formatos de ensayo a modo de ejemplo

Los ensayos tal como se describen en el presente documento pueden llevarse a cabo según una variedad muy amplia de protocolos y formatos básicos. El formato particular elegido puede basarse en la naturaleza de las moléculas de analito, la naturaleza de la muestra de fluido que contiene las moléculas de analito y la disponibilidad y propiedades de parejas de unión del analito, así como otros factores. Anteriormente se comentaron varios formatos básicos a modo de ejemplo en el contexto de la discusión de las figuras 1-2.

Tal como se describió anteriormente, un formato/protocolo de ensayo básico comprende exponer una pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, perlas, como en el caso de la presente invención) configurados para capturar una molécula o partícula de analito a una muestra que contiene o se sospecha que contiene tales moléculas de analito (o partículas). Al menos algunas de las moléculas de analito pueden inmovilizarse con respecto a un objeto de captura. La pluralidad de objetos de captura puede incluir, cada uno, una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito. Entonces pueden segregarse espacialmente al menos una parte de los objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones (por ejemplo, recipientes de reacción/pocillos). Basándose al menos en parte en una determinación del número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura que comprende al menos una molécula de analito, puede determinarse una medida de la concentración de moléculas de analito. Ahora se comentarán diversos otros aspectos de este formato de ensayo básico, incluyendo numerosas consideraciones referentes a los materiales, concentraciones, disoluciones, etapas y similares.

En determinadas realizaciones, se expone una pluralidad de objetos de captura a una muestra que contiene o se sospecha que contiene al menos un tipo de moléculas de analito, en el que la pluralidad de objetos de captura comprende una superficie de unión que tiene afinidad por el al menos un tipo de molécula de analito. En algunos casos, la superficie de unión puede comprender una pluralidad de componentes de captura. Un “componente de captura”, tal como se usa en el presente documento, es cualquier molécula, otra entidad química/biológica o modificación de soporte sólido dispuesta sobre un soporte sólido que puede usarse para fijarse, unirse o capturar de otro modo específicamente una molécula o partícula diana (por ejemplo, una molécula de analito), de modo que la molécula/partícula diana se inmoviliza con respecto al componente de captura y el soporte. La inmovilización, tal como se describe en el presente documento, puede provocarse por la asociación de una molécula de analito con un componente de captura sobre la superficie del objeto de captura. Tal como se usa en el presente documento, “ inmovilizado” significa capturado, fijado, unido o adherido de modo que se previene la disociación o pérdida de la molécula/partícula diana, pero no requiere la inmovilidad absoluta con respecto a ninguno del componente de captura o el objeto.

El número de moléculas de analito que se inmovilizan con respecto a un objeto de captura puede depender de la razón del número total de moléculas de analito en la muestra frente a al menos uno del número total, tamaño y/o densidad de superficie de componentes de captura de objetos de captura proporcionados. En algunas realizaciones, el número de moléculas o partículas inmovilizadas con respecto a un único objeto de captura puede seguir una distribución de Poisson convencional. En algunos casos, un número estadísticamente significativo de los objetos de captura se asocia con una única molécula de analito y un número estadísticamente significativo de objetos de captura no se asocia con ninguna molécula de analito. El número total de objetos de captura proporcionados puede ser de entre aproximadamente 10000 y aproximadamente 10000000, entre aproximadamente 50000 y aproximadamente 5 000000, o entre aproximadamente 100000 y aproximadamente 1000000. En algunos casos, el número total de objetos de captura proporcionados es de al menos aproximadamente 10000, al menos aproximadamente 50000, al menos aproximadamente 100000, al menos aproximadamente 1000000, al menos aproximadamente 5000000 o al menos aproximadamente 10000000. En algunos casos, la razón del número de moléculas de analito en la muestra de fluido con respecto a objetos de captura proporcionados es de entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1:10000 000, entre aproximadamente 8:1 y aproximadamente 1:10000000, entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 2:1, entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:10 o menos de aproximadamente 1:10 (por ejemplo, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:30, etc.). La razón de moléculas de analito en la muestra de fluido con respecto a objetos de captura proporcionados puede afectar a las etapas de ensayo y/o análisis llevados a cabo para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido, tal como se describe en el presente documento en la sección de cuantificación.

En algunos casos, sustancialmente todas las moléculas de analito proporcionadas en la muestra pueden inmovilizarse con respecto a un objeto de captura. Es decir, más de aproximadamente el 90 %, más de aproximadamente el 95 %, más de aproximadamente el 97 %, más de aproximadamente el 98 % o más de aproximadamente el 99 % de las moléculas de analito en la muestra pueden inmovilizarse con respecto a un objeto de captura. Sin embargo, en algunos casos solo una fracción de las moléculas de analito en la muestra puede inmovilizarse con respecto a un objeto de captura. Es decir, en algunos casos, entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 90 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 90 %, entre aproximadamente el 20 % y aproximadamente el 80 % o entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 70 % de las moléculas de analito proporcionadas en la muestra se inmovilizan con respecto a un objeto de captura. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 % o aproximadamente el 90 % o aproximadamente el 95 % de las moléculas de analito se inmovilizan con respecto a un objeto de captura.

En algunos formatos del ensayo, tras la inmovilización, la pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, al menos algunos de los cuales están asociados con al menos una molécula de analito) puede exponerse a una pluralidad de ligandos de unión. Al menos algunas de las moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un objeto de captura pueden asociarse con un ligando de unión. El número de ligandos de unión que se asocian con un objeto de captura (por ejemplo, a través de una molécula de analito) puede depender de la razón del número total de moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un único objeto de captura frente al número total de ligandos de unión expuestos a los objetos de captura. Por ejemplo, en realizaciones en las que sustancialmente todos los objetos de captura se asocian o bien con ninguna o bien con una molécula de analito, pueden seleccionarse condiciones de modo que sustancialmente todas las moléculas de analito se asocian con un único ligando de unión, por tanto, cada objeto de captura asociado con una única molécula de analito se asocia con un único ligando de unión (por ejemplo, a través de la molécula de analito). Por tanto, puede determinarse el número de ubicaciones (por ejemplo, recipientes de reacción) que contienen una única molécula de analito determinando el número de ubicaciones (por ejemplo, recipientes de reacción) que comprenden un ligando de unión. En tales realizaciones (por ejemplo, en las que ninguna o al menos una molécula de analito se asocian con cada objeto de captura), la razón de ligandos de unión proporcionados (por ejemplo, en una etapa de mezclado) con respecto al número total de moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un objeto de captura puede ser de aproximadamente 20:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 2:1 o aproximadamente 1:1.

Sin embargo, en algunas realizaciones un único objeto de captura puede asociarse con ninguna, una o más de una (por ejemplo, dos, tres, cuatro, etc.) molécula de analito. En tales realizaciones, el ligando de unión puede proporcionarse a una concentración de modo que una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito se asocia con tan solo un único ligando de unión y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito no se asocia con ningún ligando de unión. Sin embargo, en otras realizaciones los ligandos de unión pueden proporcionarse a una concentración de modo que una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito se asocia con al menos un ligando de unión (por ejemplo, una, dos, tres, etc.) y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito no se asocia con ningún ligando de unión. Entonces puede determinarse la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido, o bien con un análisis basado al menos en parte en el número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con un ligando de unión (por ejemplo, relacionando la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido con el número de ubicaciones que comprenden un ligando de unión) y/o un análisis basado al menos en parte en una lectura de intensidad de una señal indicativa del número de ligandos de unión en las ubicaciones abordadas (por ejemplo, en realizaciones en las que al menos algunos de los objetos de captura comprenden más de una molécula de analito y/o más de un ligando de unión, tal como se describe en el presente documento). En tales realizaciones (por ejemplo, en las que puede inmovilizarse más de una molécula de analito con respecto a cada objeto de captura), la razón del número de ligandos de unión proporcionados en disolución con respecto al número de moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un objeto de captura puede ser de aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1 o similares. En algunos casos, la razón del número de ligandos de unión proporcionados en disolución puede calcularse basándose en el número de objetos de captura proporcionados. En algunos casos, la razón de ligandos de unión proporcionados con respecto al número de objetos de captura es de aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:1 o similares. En otros casos, la razón el número de objetos de captura con respecto al número de ligandos de unión proporcionados es de aproximadamente 1:50, aproximadamente 1:40, aproximadamente 1:30, aproximadamente 1:20, aproximadamente 1:10, aproximadamente 1:5, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:2 o similares. En algunas realizaciones, la determinación de cuantificación puede comprender un ajuste de distribución de Poisson, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la concentración de ligando de unión usada en un ensayo puede seleccionarse para minimizar determinados acontecimientos que pueden producirse cuando está presente un exceso de ligando de unión, por ejemplo, unión no específica del ligando de unión. En algunos casos, si la concentración de ligando de unión es demasiado alta, puede producirse un aumento en las lecturas de fondo debido a interacciones no específicas (por ejemplo, con los objetos de captura, recipientes de reacción, etc.). En algunos casos, la concentración de ligando de unión puede seleccionarse (o estimarse, en el caso de una concentración desconocida de molécula de analito) de modo que solo una fracción de las moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un objeto de captura se asocia con un ligando de unión (por ejemplo, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 % o más). Esto puede ser especialmente útil en realizaciones en las que el porcentaje de objetos de captura que se asocian con al menos una molécula de analito es relativamente alto (por ejemplo, más de aproximadamente el 20 %, más de aproximadamente el 30 %, más de aproximadamente el 40 %, más de aproximadamente el 50 %, más de aproximadamente el 60 %, más de aproximadamente el 70 %, más de aproximadamente el 80 %, más de aproximadamente el 90 % o más). Al proporcionar el ligando de unión a una concentración inferior, en algunos casos, no todas las moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un objeto de captura se asociarán con un ligando de unión, lo que puede ser ventajoso para la cuantificación, por ejemplo, cuando se requiere la presencia de un ligando de unión para la detección, y especialmente cuando se usa una técnica de lectura digital/binaria. Por ejemplo, si el porcentaje de objetos de captura asociados con una molécula de analito es de aproximadamente el 50 % o más, puede proporcionarse un número reducido de ligandos de unión de modo que menos de la totalidad de las moléculas de analito inmovilizadas se asocian con un ligando de unión. En otros casos, el porcentaje de ligandos de unión que se asocian con una molécula de analito puede reducirse disminuyendo el tiempo de incubación con la molécula de analito (por ejemplo, se limita el tiempo de exposición de modo que solo una fracción de las moléculas de analito inmovilizadas se asocian con una molécula de analito).

El número total de moléculas de analito/ligandos de unión/objetos de captura/etc. en una disolución puede determinarse usando cálculos con conocimiento de la concentración de las moléculas de analito/ligandos de unión/objetos de captura/etc. en disolución. Por ejemplo, el número total de ligandos de unión en una disolución puede determinarse según la ecuación 2:

n.° de ligandos de unión = Na x [ligando de unión] x volumen (Ec. 2)

donde Na es el número de Avogadro (6,022 x 1023 mol-1), [ligando de unión] es la concentración del ligando de unión en disolución en moles por litro, y volumen es el volumen total de disolución en litros empleado. Pueden llevarse a cabo cálculos similares para otros componentes (por ejemplo, moléculas de analito (por ejemplo, en una muestra de calibración), objetos de captura, etc.).

Tras la inmovilización de una pluralidad de moléculas de analito con respecto a una pluralidad de objetos de captura y, en algunos casos, la asociación de un ligando de unión a al menos algunas de las moléculas de analito inmovilizadas, al menos una parte de los objetos de captura pueden segregarse espacialmente en una pluralidad de ubicaciones. El porcentaje de objetos de captura que se segregan espacialmente en la pluralidad de ubicaciones puede variar dependiendo de numerosos factores incluyendo, pero sin limitarse a, la razón del número de objetos de captura frente al número total de ubicaciones, el método de segregar espacialmente los objetos de captura y/o el periodo de tiempo en el que los objetos de captura se exponen a las ubicaciones. En algunos casos, al menos aproximadamente el 0,5 %, al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 2 %, al menos aproximadamente el 5%, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos más del 90 % o más, de los objetos de captura se segregan espacialmente en la pluralidad de ubicaciones. En algunos casos, entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 50%, entre aproximadamente el 0,1% y aproximadamente el 30 %, entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 20 %, entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 10 %, entre aproximadamente el 0,5 % y aproximadamente el 5 %, entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 70 % o aproximadamente el 90 % de los objetos de captura se segregan espacialmente en la pluralidad de ubicaciones. Tras segregar espacialmente al menos una parte de los objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones, puede abordarse al menos una parte de las ubicaciones. El número de ubicaciones abordadas puede ser de aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 % o más, del número total de ubicaciones.

La parte de ubicaciones puede abordarse para determinar el número de ubicaciones que contienen una molécula de analito, o en algunos casos, un ligando de unión. En algunos casos, también puede determinarse el número de ubicaciones que contienen un objeto de captura no asociado con una molécula de analito (o un ligando de unión), el número de ubicaciones que contienen y/o que no contienen un objeto de captura, y/o el número total de ubicaciones analizadas/determinadas. Puede determinarse una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido al menos en parte en el número de ubicaciones que se determina que contienen una molécula de analito (o ligando de unión). En algunos casos la medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede basarse al menos en parte en la razón del número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito con respecto al número total de ubicaciones abordadas o el número total de ubicaciones abordadas que contienen un objeto de captura. En otros casos, una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede basarse al menos en parte en la razón del número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito con respecto al número de ubicaciones que contienen un objeto de captura no asociado con una molécula de analito. A continuación, se comentan en más detalle métodos y cálculos específicos que pueden usarse para determinar la medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido.

Las razones, porcentajes y otros parámetros descritos en el presente documento con respecto a la suma/cantidad/razón de un primer componente con respecto a un segundo componente (por ejemplo, moléculas de analito/objetos de captura, ligandos de unión/objetos de captura, ligandos de unión/moléculas de analito, objetos de captura/ubicaciones, agentes de marcaje precursores/ligandos de unión, etc.) pueden ajustarse según se desee para proporcionar una razón deseada de moléculas de analito/ligandos de unión capturados por objeto de captura, y/o pueden controlarse o determinarse usando únicamente experimentación de rutina, cálculos (en algunos casos, incluyendo tener en cuenta distribuciones de Poisson), pruebas de examen, etc., dadas las enseñanzas y directrices proporcionadas por la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, si se conoce el número de objetos de captura proporcionados (por ejemplo, según se determina usando una fórmula similar a la proporcionada en la ecuación 1), el número de ligandos de unión que se necesita proporcionar puede determinarse basándose en la razón deseada de objetos de captura con respecto a ligandos de unión y, por tanto, puede determinarse la cantidad de moles de ligando de unión que debe proporcionarse. Como otro ejemplo, en el caso de una concentración desconocida de moléculas de analito, si un primer método de ensayo indica que un número significativo de objetos de captura comprenden más de una molécula de analito (por ejemplo, se determina que todas o que un número significativo de ubicaciones contienen una molécula de analito o hay menos de un número estadísticamente significativo de perlas que se determina que están libres de moléculas de analito), puede diluirse la muestra de fluido y/o puede aumentarse el número de objetos de captura de modo que puede reducirse el número de objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito.

Ahora se comentarán en detalle otros aspectos del ensayo. Debe entenderse que pueden llevarse a cabo ninguna, algunas o todas de las siguientes etapas al menos una vez durante determinados formatos de ensayo a modo de ejemplo descritos en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de etapas adicionales no descritas que pueden realizarse incluyen, pero no se limitan a, lavar y/o exponer a ligandos de unión, agentes de marcaje precursores y/o agentes de marcaje, etc. adicionales.

En algunas realizaciones, la pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, al menos algunos de los cuales están asociados con al menos una molécula de analito) puede exponerse a al menos un componente de reacción adicional antes de, de manera simultánea con y/o después de separar espacialmente al menos algunos de la pluralidad de objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones. En algunos casos, los objetos de captura pueden exponerse a una pluralidad de ligandos de unión. En determinadas realizaciones, un ligando de unión puede estar adaptado para detectarse directamente (por ejemplo, el ligando de unión comprende un resto o molécula detectable) o puede estar adaptado para detectarse indirectamente (por ejemplo, incluyendo un componente que puede convertir un agente de marcaje precursor en un agente de marcaje), tal como se comenta a continuación. Puede emplearse más de un tipo de unión en cualquier método de ensayo dado, por ejemplo, un primer tipo de ligando de unión y un segundo tipo de ligando de unión. En un ejemplo, el primer tipo de ligando de unión es capaz de asociarse con un primer tipo de molécula de analito y el segundo tipo de ligando de unión es capaz de asociarse con el primer ligando de unión. En otro ejemplo, tanto un primer tipo de ligando de unión como un segundo tipo de ligando de unión pueden asociarse con epítopos iguales o diferentes de una única molécula de analito, tal como se describe a continuación.

Determinados ligandos de unión pueden comprender un componente que es capaz de facilitar la detección, o bien directa o bien indirectamente. Un componente puede estar adaptado para detectarse directamente en realizaciones en las que el componente comprende una propiedad medible (por ejemplo, una emisión de fluorescencia, un color, etc.). Un componente puede facilitar la detección indirecta, por ejemplo, convirtiendo un agente de marcaje precursor en un agente de marcaje (por ejemplo, un agente que se detecta en un ensayo). Un “agente de marcaje precursor” es cualquier molécula, partícula o similares, que puede convertirse en un agente de marcaje tras la exposición a un agente de conversión adecuado (por ejemplo, un componente enzimático). Un “agente de marcaje” es cualquier molécula, partícula o similar, que facilita la detección, actuando como entidad detectada, usando una técnica de detección elegida.

En algunas realizaciones, al menos un ligando de unión comprende un componente enzimático. En algunas realizaciones, la molécula de analito puede comprender un componente enzimático. El componente enzimático puede convertir un agente de marcaje precursor (por ejemplo, un sustrato enzimático) en un agente de marcaje (por ejemplo, un producto detectable). Entonces puede determinarse una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido basándose al menos en parte en la determinación del número de ubicaciones que contienen un agente de marcaje (por ejemplo, relacionando el número de ubicaciones que contienen un agente de marcaje con el número de ubicaciones que contienen una molécula de analito). Los ejemplos no limitativos de enzimas o componentes enzimáticos incluyen peroxidasa del rábano, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina. Otros ejemplos no limitativos de sistemas o métodos para la detección incluyen realizaciones en las que se reproducen precursores de ácido nucleico en múltiples copias o se convierten en un ácido nucleico que puede detectarse fácilmente, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), ligación, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), etc. Tales sistemas y métodos los conocerán los expertos habituales en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en “DNA Amplification: Current Technologies and Applications”, Vadim Demidov et al., 2004.

Como ejemplo de un método de ensayo que comprende el uso de un agente de marcaje precursor, tal como se muestra en la figura 3, se proporciona un sustrato 100 que comprende una pluralidad de ubicaciones, en el que las ubicaciones comprenden recipientes de reacción. En el recipiente 101 de reacción (por ejemplo, ubicación), se inmoviliza una molécula 102 de analito con respecto a una perla 103 (por ejemplo, objeto de captura). Se asocia un ligando 104 de unión con la molécula 102 de analito. El ligando 104 de unión comprende un componente enzimático (no mostrado). Se convierte un agente 106 de marcaje precursor en un agente 108 de marcaje (tras la exposición al componente enzimático). Se detecta el agente 108 de marcaje usando métodos descritos en el presente documento. En cambio, el recipiente 111 de reacción contiene una molécula 112 de analito inmovilizada con respecto a una perla 110. En este recipiente de reacción, la molécula 112 de analito no se asocia con un ligando de unión que comprende un componente enzimático. Por tanto, el agente 114 de marcaje precursor no se convierte en un agente de marcaje en el recipiente de reacción. Por tanto, este recipiente de reacción dará una señal diferente en comparación con el recipiente 101 de reacción en el que el agente de marcaje precursor se convirtió en un agente de marcaje. En algunos casos, también puede haber recipientes de reacción que contienen una perla no asociada con una molécula de analito, por ejemplo, el recipiente 121 de reacción contiene una perla 116. Adicionalmente, algunos de los recipientes de reacción pueden no comprender ninguna perla, por ejemplo, el recipiente 123 de reacción. Los recipientes 121 y 123 de reacción pueden dar señales diferentes en comparación con el recipiente 101 de reacción ya que no habrá ningún agente de marcaje presente. Sin embargo, los recipientes 121 y 123 de reacción pueden contener agente 117 de marcaje precursor. Puede haber más de un agente de marcaje precursor presente en cualquier recipiente de reacción dado.

En determinadas realizaciones, pueden emplearse agentes de marcaje precursores solubilizados o en suspensión, en los que los agentes de marcaje precursores se convierten en agentes de marcaje que son insolubles en el líquido y/o que se inmovilizan dentro/cerca de la ubicación (por ejemplo, dentro del recipiente de reacción en el que se forma el agente de marcaje). Tales agentes de marcaje precursores y agentes de marcaje y su uso se describen en la solicitud de patente estadounidense de titularidad conjunta con n.° de serie 12/236.484, titulada “High Sensitivity Determination of the Concentration of Analyte molecules in a Fluid Sample”, de Duffy, et al., presentada el 23 de septiembre de 2008.

En algunas realizaciones, durante el ensayo, puede llevarse a cabo al menos una etapa de lavado. En un caso, puede lavarse una pluralidad de objetos de captura tras exponer los objetos de captura a una o más disoluciones que comprenden moléculas de analito, ligandos de unión, agentes de marcaje precursores o similares. Por ejemplo, tras la inmovilización de las moléculas de analito con respecto a una pluralidad de objetos de captura, puede someterse la pluralidad de objetos de captura a una etapa de lavado eliminando así cualquier molécula de analito no inmovilizada de manera específica con respecto a un objeto de captura. En determinadas realizaciones, la disolución de lavado se selecciona de manera que no provoca ningún cambio apreciable en la configuración de los objetos de captura y/o moléculas de analito y/o no altera ninguna interacción de unión específica entre al menos dos componentes del ensayo (por ejemplo, un componente de captura y una molécula de analito). En otros casos, la disolución de lavado puede ser una disolución que se selecciona para interaccionar químicamente con uno o más componentes de ensayo. Tal como entenderán los expertos habituales en la técnica, puede realizarse una etapa de lavado en cualquier punto de tiempo apropiado durante los métodos.

En algunas realizaciones, pueden llevarse a cabo métodos de ensayo que no comprenden el uso de una pluralidad de objetos de captura que comprenden una superficie de unión para al menos un tipo de molécula de analito y/o una pluralidad de ubicaciones en las que pueden separarse espacialmente los objetos de captura. Por ejemplo, un ensayo según la invención en determinadas realizaciones puede usar cualquier método adecuado que es capaz de aislar moléculas de analito y/u objetos de captura individuales asociados con una o más moléculas de analito de modo que pueden abordarse individualmente para la detección. Por ejemplo, un método de ensayo puede comprender proporcionar una pluralidad de objetos de captura que, cada uno, o bien se asocian con una única molécula de analito o bien están libres de cualquier molécula de analito. Al menos una parte de los objetos de captura pueden abordarse individualmente para determinar el número de los objetos de captura asociados con una molécula o partícula de analito. Basándose al menos en parte en el número de objetos de captura que se determina que están asociados con una molécula de analito, puede determinarse una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido.

La figura 4A ilustra una realización en la que moléculas de analito individuales se segregan espacialmente en una pluralidad de gotas. En la figura 4A, se proporciona pluralidad de moléculas 70 de analito, tal como se muestra en la etapa (A). En este ejemplo, las moléculas 70 de analito pueden detectarse ópticamente (por ejemplo, las moléculas de analito pueden detectarse directamente usando interrogación óptica). Al menos algunas de la pluralidad de moléculas 70 de analito están contenidas dentro de gotas 72 líquidas (por ejemplo, usando técnicas de microfluidos) que comprenden fluido 71, tal como se muestra en la etapa (B). Adicionalmente, pueden estar presentes algunas gotas que no contienen ninguna molécula de analito (por ejemplo, gotas 74 que comprenden fluido 71). Se rodea sustancialmente la pluralidad de gotas 75 por fluido 73 que es sustancialmente inmiscible con el fluido 71. La pluralidad de gotas 75 puede interrogarse de manera óptica alimentando gotas a una columna 74 de modo que cada gota pasa por un sistema de detección óptica (por ejemplo, que comprende una fuente 76 de luz y un detector 78) en una sola fila, tal como se muestra en la etapa (C). Puede determinarse que cada gota contiene una molécula de analito cuando hay un cambio en la señal óptica (por ejemplo, un cambio en la señal óptica debido a la presencia de una molécula de analito en la gota).

Como otro ejemplo, tal como se ilustra en la figura 4B, se proporciona una pluralidad de moléculas 80 de analito, tal como se muestra en la etapa (A). En este ejemplo, las moléculas 70 de analito no pueden detectarse ópticamente y deben detectarse indirectamente (tal como se describe en el presente documento). Se expone la pluralidad de moléculas 80 de analito a una pluralidad de ligandos 82 de unión, de modo que al menos un ligando de unión se asocia con una parte significativa de las moléculas de analito, tal como se muestra en la etapa (B), para formar un complejo 83, tal como se muestra en la etapa (B). En este ejemplo, cada ligando 82 de unión comprende un componente 84 enzimático. Al menos una parte de los complejos 83 pueden estar contenidos en gotas 85 (por ejemplo, usando técnicas de microfluidos), tal como se muestra en la etapa (C), que comprenden líquido 79. Adicionalmente, pueden estar presentes algunas gotas que no contienen ningún complejo (por ejemplo, gotas 86 que comprenden fluido 79). Se rodea sustancialmente la pluralidad de gotas 91 por fluido 87 que es sustancialmente inmiscible con el fluido 79. Las gotas 85 y 86 pueden comprender adicionalmente agente 86 de marcaje precursor, que se convierte en agente 88 de marcaje tras la exposición al componente 84 enzimático, tal como se indica mediante la flecha 87. Puede interrogarse de manera óptica la pluralidad de gotas 91 alimentando la pluralidad de gotas a una columna 89 de modo que cada gota pasa por un sistema de detección óptica (por ejemplo, que comprende una fuente 90 de luz y un detector 92) en una sola fila, tal como se muestra en la etapa (D). Puede determinarse que cada gota contiene una molécula de analito cuando hay un cambio en la señal óptica (por ejemplo, un cambio en la señal óptica debido a la presencia de un agente de marcaje en la gota).

Como aún otro ejemplo, la figura 4C ilustra una realización de la presente invención en la que moléculas 282 de analito individuales se asocian con respecto a objetos 280 a través de componentes 274 de captura. Adicionalmente, en este ejemplo, las moléculas de analito inmovilizadas se asocian con ligando 284 de unión. Pueden interrogarse de manera óptica las gotas alimentando las gotas a una columna 287 de modo que cada gota pasa por el sistema de detección óptica (por ejemplo, que comprende una fuente 286 de luz y un detector 288) en una sola fila. Puede determinarse que cada gota contiene un ligando de unión cuando hay un cambio en la señal óptica (por ejemplo, un cambio en la señal óptica debido a la presencia de un ligando de unión en la gota).

Las siguientes secciones proporcionan información adicional referente a etapas de método, materiales y parámetros que pueden usarse para poner en práctica los métodos de ensayo descritos anteriormente.

Objetos de captura y ubicaciones espaciales para la segregación de objetos de captura

En algunas realizaciones, el método y los sistemas de la presente invención utilizan una pluralidad de objetos de captura que incluyen cada uno una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito. La pluralidad de objetos de captura puede configurarse para ser capaces de segregarse espacialmente unos con respecto a otros, es decir, los objetos de captura pueden proporcionarse en una forma de modo que los objetos de captura son capaces de separarse espacialmente en una pluralidad de ubicaciones. Por ejemplo, la pluralidad de objetos de captura puede comprender una pluralidad de perlas (que pueden ser de cualquier forma, por ejemplo, de tipo esfera, discos, anillos, de tipo cubo, etc.) como es el caso de la presente invención, una dispersión o suspensión de materiales particulados (por ejemplo, una pluralidad de partículas en suspensión en un fluido), nanotubos o similares. En algunas realizaciones, la pluralidad de objetos de captura es insoluble o sustancialmente insoluble en el/los disolvente(s) o disolución/disoluciones utilizado(s) en el ensayo. En algunos casos, los objetos de captura son macizos o sustancialmente macizos (por ejemplo, están esencialmente libres de poros); sin embargo, en algunos casos, la pluralidad de objetos de captura puede ser porosos o sustancialmente porosos, huecos, parcialmente huecos, etc. La pluralidad de objetos de captura puede no ser absorbentes, sustancialmente no absorbentes, sustancialmente absorbentes o absorbentes. En algunos casos, los objetos de captura pueden comprender un material magnético, que, tal como se describe en el presente documento, puede facilitar un determinado aspecto del ensayo (por ejemplo, etapa de lavado). En algunos casos, una superficie de objeto de captura puede comprender también una capa protectora o de pasivación que puede reducir o minimizar los acontecimientos de unión no específica (por ejemplo, moléculas de analito, ligandos de unión, etc.).

En algunas realizaciones, los objetos de captura incluyen, cada uno, una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito de interés. La parte del objeto de captura que comprende una superficie de unión puede seleccionarse o configurarse basándose en la forma/características físicas y propiedades de los objetos de captura (por ejemplo, tamaño, forma) y el formato del ensayo. En algunas realizaciones, sustancialmente todas las superficies exteriores de los objetos de captura forman las superficies de unión. Una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula de analito puede formarse mediante la asociación de una pluralidad de componentes de captura con un objeto de captura. En algunos casos, una molécula de analito puede asociarse con un componente de captura (por ejemplo, inmovilizarse con respecto al mismo) mediante formación de al menos un enlace químico y/o adsorción física o combinación de los mismos. Los ejemplos no limitativos de tipos de enlace químicos incluyen enlaces iónicos, enlaces covalentes (por ejemplo, carbono-carbono, carbono-oxígeno, oxígenosilicio, azufre-azufre, fósforo-nitrógeno, carbono-nitrógeno, metal-oxígeno u otros enlaces covalentes), enlaces de hidrógeno (por ejemplo, entre grupos funcionales hidroxilo, amina, carboxilo, tiol y/o similares), enlaces dativos (por ejemplo, complejación o quelación entre iones de metales y ligandos monodentados o multidentados), interacciones de Van der Waals o similares. A continuación, se comentan en más detalle componentes de captura que son útiles o posiblemente útiles para poner en práctica determinados aspectos y realizaciones de la invención. Al menos algunas de las moléculas de analito, tras la exposición a la pluralidad de objetos de captura que comprenden una pluralidad de componentes de captura, se inmovilizan con respecto a un componente de captura. En determinadas realizaciones, sustancialmente todas de la pluralidad de moléculas de analito en la muestra de fluido sometida a prueba se inmovilizan con respecto a los componentes de captura (y, por tanto, los objetos de captura).

Sin desear limitarse a ninguna teoría, una etapa de captura en la que una pluralidad de objetos de captura que tienen un gran área superficial para la unión se expone a una muestra de fluido que contiene las moléculas o partículas de analito de modo que las moléculas/partículas de analito se inmovilizan con respecto a los objetos de captura puede facilitar un aumento de la velocidad y/o eficacia del ensayo para la detección y cuantificación de la concentración del analito en la muestra en comparación con ensayos en los que se segregan las propias moléculas de analito para la detección sin exponerse a, ni inmovilizarse con respecto a, un objeto de captura. Este aumento en la velocidad de unión y eficacia puede potenciarse adicionalmente si se agita (por ejemplo, se remueve) la disolución en la que se incuban la pluralidad de moléculas de analito y objetos de captura para la captura para aumentar la frecuencia de colisiones y la tasa de transferencia de masa entre la pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, pluralidad de perlas) y las moléculas de analito (por ejemplo, en comparación con un sustrato que comprende una superficie estacionaria (por ejemplo, una placa de microtitulación)).

La pluralidad de objetos de captura para la captura de analitos puede ser de cualquier tamaño o forma adecuados. Los ejemplos no limitativos de formas adecuadas incluyen esferas, cubos, elipsoides, tubos, láminas y similares. En determinadas realizaciones, el diámetro promedio (si es sustancialmente esférico) o dimensión máxima en sección transversal promedio (para otras formas) de un objeto de captura puede ser de más de aproximadamente 0,1 um (micrómetro), más de aproximadamente 1 um, más de aproximadamente 10 um, más de aproximadamente 100 um, más de aproximadamente 1 mm o similares. En otras realizaciones, el diámetro promedio de un objeto de captura o la dimensión máxima de un objeto de captura en una dimensión puede ser de entre aproximadamente 0,1 um y aproximadamente 100 um, entre aproximadamente 1 um y aproximadamente 100 um, entre aproximadamente 10 um y aproximadamente 100 um, entre aproximadamente 0,1 um y aproximadamente 1 mm, entre aproximadamente 1 um y aproximadamente 10 mm, entre aproximadamente 0,1 um y aproximadamente 10 um o similares. El “diámetro promedio” o “dimensión máxima en sección transversal promedio” de una pluralidad de objetos de captura, tal como se usa en el presente documento, es el promedio aritmético de los diámetros/dimensiones máximas en sección transversal de los objetos de captura. Los expertos habituales en la técnica serán capaces de determinar el diámetro/dimensión máxima en sección transversal promedio de una población de objetos de captura, por ejemplo, usando dispersión de luz láser, microscopía, análisis granulométrico u otras técnicas conocidas. Por ejemplo, en algunos casos, puede usarse un contador de Coulter para determinar el diámetro promedio de una pluralidad de perlas.

Los objetos de captura para la captura de analitos pueden fabricarse de uno o más materiales adecuados, por ejemplo, materiales de plástico o polímeros sintéticos (por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliestireno, poliamida, poliuretano, polímeros fenólicos o nitrocelulosa, etc.), polímeros derivados de manera natural (caucho de látex, polisacáridos, polipéptidos, etc.), materiales compuestos, cerámicas, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales o compuestos metálicos (por ejemplo, que comprenden oro, plata, acero, aluminio, cobre, etc.), vidrios inorgánicos, sílice y una variedad de otros materiales adecuados. Los ejemplos no limitativos de configuraciones posiblemente adecuadas incluyen perlas (por ejemplo, perlas magnéticas), tubos (por ejemplo, nanotubos), placas, discos, tiras reactivas o similares.

En algunos casos, los objetos de captura pueden seleccionarse de modo que el propio objeto de captura puede detectarse por el sistema. Esto puede ser útil en realizaciones en las que debe determinarse la fracción o el porcentaje de objetos de captura asociados con una molécula de analito (por ejemplo, cuando se usa el número total de objetos de captura interrogados y detectados para determinar la fracción de objetos de captura asociados con una molécula de analito). Por ejemplo, un objeto de captura puede caracterizarse como que tiene un espectro de emisión o absorción que puede aprovecharse para la detección de modo que pueden interrogarse objetos de captura para determinar qué ubicación espacial contiene un objeto de captura. Las propiedades del espectro de emisión (por ejemplo, longitud(es) de onda, intensidad, etc.) pueden seleccionarse de modo que la emisión producida por los objetos de captura no altera y/o interfiere sustancialmente con ninguna otra emisión procedente de componentes usados en el ensayo (por ejemplo, la emisión de cualquier etiqueta usada para determinar la presencia o ausencia de una molécula de analito). En algunos casos, pueden asociarse moléculas de colorante con un objeto de captura usando los ligandos de unión presentes sobre la superficie del objeto de captura (por ejemplo, una molécula de colorante puede asociarse mediante un enlace o interacción con un componente de captura). En algunos casos, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50000 o entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 50000 o entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 20000 o entre aproximadamente 10000 y aproximadamente 20000 o entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 10000 o entre aproximadamente 10000 y aproximadamente 30000 o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10000 moléculas de colorante (por ejemplo, moléculas de colorante fluorescentes) se asocian con cada objeto de captura. Véase, por ejemplo, el ejemplo 21. En algunos casos, pueden asociarse en primer lugar moléculas de colorante con el objeto de captura, antes de unir los ligandos de unión al objeto de captura. Este enfoque reduce las probabilidades de que la afinidad de los ligandos de unión se vea reducida por la unión de moléculas de colorante. En algunos casos, se unen moléculas de colorante a una proteína “de bloqueo” inerte (por ejemplo, albúmina sérica bovina) y se usa la proteína inerte marcada con colorante para bloquear las perlas tras unir los ligandos de unión al objeto de captura. Debe entenderse que, en algunos casos, los objetos de captura pueden detectarse y cuantificarse usando luz blanca (por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, usando obtención de imágenes por campo brillante, campo oscuro y/o contraste de fases).

En algunas realizaciones, pueden emplearse más de un tipo de objeto de captura para la captura de analitos. En algunos casos, cada tipo de objeto de captura puede incluir una superficie con especificidad de unión diferente. En estas realizaciones, puede cuantificarse y/o detectarse más de un tipo de molécula de analito en un único método de ensayo multiplexado. Por ejemplo, la pluralidad de objetos de captura para la captura de analitos puede comprender una pluralidad de un primer tipo de objeto de captura que comprende una superficie de unión que tiene una afinidad por un primer tipo de molécula de analito y una pluralidad de un segundo tipo de objetos de captura que comprenden una superficie de unión que tiene una afinidad por un segundo tipo de molécula de analito. Tras la exposición a una muestra que contiene el primer tipo de molécula de analito y el segundo tipo de molécula de analito, el primer tipo de molécula de analito se inmoviliza con respecto al primer tipo de objeto de captura y el segundo tipo de molécula de analito se inmoviliza con respecto al segundo tipo de objeto de captura. El primer tipo de objeto de captura y el segundo tipo de objeto de captura pueden codificarse para poder distinguirse uno de otro (por ejemplo, para facilitar la diferenciación tras la detección) incluyendo una propiedad detectable diferente. Por ejemplo, cada tipo de objeto de captura puede tener una emisión de fluorescencia diferente, una reflectividad espectral, forma, una absorción espectral o una absorción o emisión de FTIR. En una realización particular, cada tipo de objeto de captura puede comprender uno o más compuestos colorantes (por ejemplo, colorantes fluorescentes) pero a niveles de concentración variables, de modo que cada tipo de objeto de captura tiene una señal distintiva (por ejemplo, basándose en la intensidad de la emisión fluorescente). Tras segregar espacialmente los objetos de captura tras la etapa de captura en una pluralidad de ubicaciones para la detección, una ubicación que comprende un primer tipo de objeto de captura asociado con un primer tipo de molécula de analito puede distinguirse de una ubicación que comprende un segundo tipo de objeto de captura asociado con un segundo tipo de molécula de analito mediante la detección de la propiedad diferente. Puede determinarse el número de ubicaciones que comprenden cada tipo de objeto de captura y/o el número de objetos de captura asociados con una molécula de analito, permitiendo una determinación de una medida de la concentración tanto del primer tipo de molécula de analito como del segundo tipo de moléculas de analito en la muestra de fluido basándose al menos en parte en estos números.

Por ejemplo, tal como se ilustra en la figura 5, en la etapa (A) se proporciona una pluralidad de un primer tipo de objeto 132 de captura que comprende un primer tipo de componente 134 de captura y una pluralidad de un segundo tipo de objeto 136 de captura que comprende un segundo tipo de componente 138 de captura. Se expone la pluralidad de objetos de captura a una muestra de fluido que comprende una pluralidad de un primer tipo de molécula 140 de analito y un segundo tipo de molécula 142 de analito. Tal como se muestra en la etapa (B), al menos algunas del primer tipo de molécula 140 de analito pueden asociarse con un objeto 132 de captura del primer tipo a través del componente 134 de captura y al menos algunas del segundo tipo de molécula 142 de analito pueden asociarse con un objeto 136 de captura del segundo tipo a través del componente 138 de captura. Algunos del primer tipo de objetos de captura y el segundo tipo de objetos de captura pueden no asociarse con ninguno del primer tipo o el segundo tipo de moléculas de analito. Al menos algunos de la pluralidad de objetos de captura de la etapa (B) pueden segregarse espacialmente en una pluralidad de ubicaciones (representadas por recipientes 142 de reacción formados en un sustrato 146, tal como se muestra en la etapa (C)). Algunos de los recipientes de reacción pueden no comprender ningún objeto de captura. Entonces puede analizarse la pluralidad de recipientes de reacción (por ejemplo, tal como se ilustra en la figura 1, etapa (D)) para determinar el número de recipientes de reacción que contienen un primer tipo de objeto de captura asociado con un primer tipo de molécula de analito (por ejemplo, el recipiente 144 de reacción) y el número de recipientes de reacción que contienen un segundo tipo de objeto de captura asociado con un segundo tipo de molécula de analito (por ejemplo, el recipiente 145 de reacción). Adicionalmente, también puede determinarse el número de ubicaciones que contienen un primer tipo de objeto de captura o un segundo tipo de objeto de captura no asociado con ninguna molécula de analito. Puede determinarse una medida de la concentración del primer tipo (o segundo tipo) de molécula de analito al menos en parte basándose en el número del primer tipo (o segundo tipo) de molécula de analito detectada. Alternativamente, una medida de la concentración de cualquiera del primer tipo (o el segundo tipo) de molécula de analito en la muestra de fluido puede basarse en la razón del número de recipientes de reacción que comprenden el primer tipo (o segundo tipo) de objeto de captura asociado con un primer tipo (o segundo tipo) de molécula de analito con respecto al número de recipientes de reacción que comprenden el primer tipo (o segundo tipo) de objetos de captura no asociados con ninguna molécula de analito. Pueden llevarse a cabo métodos adicionales para determinar la concentración de los tipos primero y/o segundo de moléculas de analito en la muestra de fluido usando métodos similares a los descritos en el presente documento para muestras que comprenden un único tipo de molécula de analito. Usando la detección óptica, el primer tipo de objeto de captura puede tener una longitud de onda máxima de emisión a una primera longitud de onda y el segundo tipo de objeto de captura puede tener una longitud de onda máxima de emisión a una segunda longitud de onda y, por tanto, permitir distinguir los recipientes de reacción que contienen un primer tipo de objeto de captura de los recipientes de reacción que contienen un segundo tipo de objeto de captura.

Alternativamente, o en combinación, con el uso objetos de captura codificados para el multiplexado, tal como se describió anteriormente, en algunos ensayos multiplexados pueden emplearse tipos de objeto de captura similares que, en determinados casos, pueden incluir, cada uno, componentes de captura específicos para múltiples tipos de analitos. En determinados ensayos de este tipo, un primer tipo de ligando de unión, por ejemplo, que tiene afinidad por un primer tipo de molécula de analito, y un segundo, tercer, etc. tipo de ligando de unión que tiene afinidad por un segundo, tercer, etc., tipo de tipo de molécula de analito respectivamente y configurados para poder distinguirse de manera detectable unos de otros (por ejemplo, mediante el uso de marcadores detectables, componentes enzimáticos y/o agentes de marcaje, etc. diferentes) pueden usarse junto con el ensayo, y la detección/cuantificación de los diferentes tipos de ligandos de unión puede correlacionarse con la presencia/concentración de diferentes tipos de moléculas de analito en la muestra de fluido.

Con el propósito de la presente invención, la pluralidad de objetos de captura para la captura de analitos comprende una pluralidad de perlas. Las perlas pueden comprender, cada una, una pluralidad de componentes de captura mediante los cuales puede inmovilizarse una pluralidad de moléculas de analito. La pluralidad de componentes de captura puede estar presente sobre la superficie de las perlas. En algunas realizaciones, las perlas pueden ser perlas magnéticas. La propiedad magnética de las perlas puede ayudar a separar las perlas de una disolución (por ejemplo, que comprende una pluralidad de moléculas de analito no unidas) y/o durante etapa(s) de lavado (por ejemplo, para eliminar un exceso de muestra de fluido, agentes de marcaje, etc.). Hay perlas posiblemente adecuadas, incluyendo perlas magnéticas, disponibles de varios proveedores comerciales. Tal como se indicó anteriormente, hay muchos otros ejemplos de objetos de captura posiblemente adecuados para la captura de analitos incluyendo nanotubos (por ejemplo, nanotubos de carbono), gotas de microfluidos (por ejemplo, gotas de un primer fluido sustancialmente rodeado por un segundo fluido), etc.

Los expertos habituales en la técnica conocerán métodos y técnicas para exponer una pluralidad de objetos de captura a una muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene una molécula o partícula de analito para una captura de analitos inicial. Por ejemplo, la pluralidad de objetos de captura puede añadirse (por ejemplo, como sólido, como disolución) directamente a una muestra de fluido. Como otro ejemplo, la muestra de fluido puede añadirse a la pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, en disolución, como sólido). En algunos casos, las disoluciones pueden agitarse (por ejemplo, removerse, sacudirse, etc.).

Tras la inmovilización de las moléculas de analito con respecto a una pluralidad de objetos de captura, los objetos de captura pueden someterse a al menos una etapa de lavado. La etapa de lavado puede ayudar en la eliminación de moléculas no unidas (por ejemplo, moléculas de analito u otros componentes de reacción) de la disolución. Por ejemplo, haciendo referencia a la figura 1, tras la inmovilización de moléculas 4 de analito con perlas 6, tal como se muestra en la etapa (B), puede realizarse una etapa de lavado para eliminar cualquier molécula de analito no unida no inmovilizada con respecto a una molécula de analito. Como otro ejemplo, haciendo referencia a la figura 2, tras la asociación de ligandos 31 de unión con moléculas 36 de analito, tal como se muestra en la etapa (C), puede realizarse una etapa de lavado para eliminar cualquier ligando de unión no unido. La etapa de lavado puede realizarse usando cualquier técnica adecuada conocida por los expertos habituales en la técnica, por ejemplo, mediante incubación de los objetos de captura con una disolución de lavado seguido por centrifugación de la disolución que comprende los objetos de captura y decantación del líquido, o usando técnicas de filtración. En realizaciones en las que la pluralidad de objetos de captura comprende una pluralidad de perlas magnéticas, las perlas pueden aislarse de la disolución a granel con ayuda de un imán.

La pluralidad de objetos de captura tras la etapa de captura (por ejemplo, al menos algunos asociados con al menos una molécula de analito) puede exponerse a uno o más reactivos adicionales, antes de segregar espacialmente la pluralidad de objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones para la detección. Por ejemplo, tal como se indicó anteriormente, los objetos de captura pueden exponerse a una pluralidad de ligandos de unión, al menos algunos de los cuales pueden asociarse con una molécula de analito inmovilizada. Los objetos de captura pueden exponerse a más de un tipo de ligando de unión (por ejemplo, un primer tipo de ligando de unión y un segundo, tercer, etc. tipo de un ligando de unión), tal como se indicó anteriormente. La asociación de un ligando de unión con una molécula de analito inmovilizada puede ayudar en la detección de las moléculas de analito, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, además de una pluralidad de objetos de captura para la captura de analitos, también puede proporcionarse y/o emplearse una pluralidad de objetos de control. Un(os) objeto(s) de control puede(n) ser útil(es) para una variedad de propósitos incluyendo, pero sin limitarse a, identificación de la orientación de la pluralidad de ubicaciones (por ejemplo, en el caso en el que la pluralidad de ubicaciones está formada como una matriz de sitios de reacción, recipientes de reacción, etc.), para ayudar a determinar la calidad del ensayo y/o para ayudar a calibrar el sistema de detección (por ejemplo, sistema de interrogación óptica), tal como se describe a continuación. Debe entenderse que puede estar presente más de un tipo de objeto de control en cualquier formato de ensayo (por ejemplo, un primer tipo de objeto de control para determinar la calidad del ensayo y un segundo tipo de objeto de control para actuar como marcador de ubicación) o un único tipo de objeto de control puede tener más de una de las funciones anteriormente descritas.

En algunos casos, los objetos de control usados para identificar la orientación de la pluralidad de ubicaciones (por ejemplo, recipientes de reacción, sitios, etc.) en una matriz (por ejemplo, funcionan como marcador(es) de ubicación para una matriz). Por ejemplo, un objeto de control puede distribuirse de manera aleatoria o específica sobre una matriz, y puede proporcionar una o más ubicaciones de referencia para determinar la orientación/posición de la matriz. Una característica de este tipo puede ser útil cuando se comparan múltiples imágenes de una parte de la matriz a diferentes intervalos de tiempo. Es decir, pueden usarse las posiciones de objetos de control en la matriz para registrar las imágenes. En algunos casos, los objetos de control pueden usarse para proporcionar ubicaciones de referencia en realizaciones en las que se combina una pluralidad de imágenes de pequeñas regiones solapantes para formar una imagen más grande.

La presencia de objetos de control en un ensayo puede proporcionar información referente a la calidad del ensayo. Por ejemplo, si se encuentra que una ubicación contiene un objeto de control que comprende un componente enzimático pero no hay ningún agente de marcaje presente (por ejemplo, cuyo producto estaría presente tras la exposición de un objeto de control que comprende un componente enzimático a un agente de marcaje precursor), esto da una indicación de que algún aspecto del ensayo puede no estar funcionando de manera apropiada. Por ejemplo, la calidad de los reactivos puede verse comprometida (por ejemplo, la concentración de agente de marcaje precursor es demasiado baja, descomposición del agente de marcaje precursor, etc.) y/o quizás no todas las ubicaciones se expusieron al agente de marcaje precursor.

En algunas realizaciones, los objetos de control pueden usarse para la calibración del sistema de detección. Por ejemplo, los objetos de control pueden emitir una señal óptica que puede usarse para la calibración de un sistema de detección óptica. En algunas realizaciones, los objetos de control pueden caracterizarse y doparse con una característica particular (por ejemplo, fluorescencia, color, absorbancia, etc.) que puede actuar como comprobación de control de calidad para el rendimiento del sistema de detección.

En algunos casos, los objetos de control pueden usarse para estandarizar o normalizar el sistema para compensar variaciones del rendimiento y/o características de diferentes componentes del sistema en diferentes ensayos, a lo largo del transcurso del tiempo, etc. (por ejemplo, sistema de detección, matrices, reactivos, etc.) entre diferentes partes de una matriz usada en una prueba y/o entre dos matrices diferentes. Por ejemplo, la configuración experimental, parámetros y/o variaciones pueden conducir a cambios en la intensidad de una señal (por ejemplo, señal de fluorescencia) producida a partir de una única matriz en diferentes puntos de tiempo, o entre al menos dos matrices en puntos de tiempo simultáneos o diferentes. Además, en una única matriz, diferentes partes de la matriz pueden producir diferentes señales de fondo. Tales variaciones pueden conducir a cambios en las señales de calibración (por ejemplo, determinación de una señal de perla promedio) entre matrices, partes de una matriz o en múltiples momentos, lo que puede conducir a determinaciones imprecisas en algunos casos. Los ejemplos no limitativos de parámetros que pueden provocar variación incluyen concentración de agente de marcaje, temperatura, enfoque, intensidad de luz de detección, profundidad y/o tamaño de las ubicaciones en una matriz, etc. Para compensar los efectos de algunas o todas de tales variaciones, en algunas realizaciones, puede usarse una pluralidad de objetos de control. En determinados casos, tales objetos de control están esencialmente libres de asociación con moléculas o partículas de analito. En determinadas realizaciones, menos de aproximadamente el 20%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 1 %, etc. de los objetos de control están asociados con moléculas o partículas de analito. Los objetos de control pueden ser distinguibles de los objetos de captura (por ejemplo, cada uno puede producir una señal distinguible) y el sistema puede configurarse de modo que cualquier molécula de analito asociada con un objeto de control no se tiene en cuenta en la determinación de la concentración de las moléculas de analito. Las señales de los objetos de control pueden usarse para normalizar los valores de interrogación entre diferentes matrices o en zonas de una única matriz. Por ejemplo, dado que las señales de los objetos de control deben ser aproximadamente iguales entre matrices y/o por una única matriz, las señales de objetos de control pueden normalizarse a un valor apropiado y las señales de los objetos que no son de control (por ejemplo, los objetos de captura asociados con una molécula de analito) pueden ajustarse en consecuencia.

El objeto de control puede proporcionarse con la pluralidad de objetos de captura para la captura de analitos antes de la exposición a una muestra de fluido que contiene moléculas de analito, o puede añadirse en otro punto en el ensayo (por ejemplo, tras la exposición a la pluralidad de moléculas de analito y/o ligandos de unión, y/o antes de segregar espacialmente la pluralidad de objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones). Los objetos de control pueden ser distinguibles de los objetos de captura usando técnicas conocidas por los expertos habituales en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los objetos de control pueden comprender una única propiedad (por ejemplo, están codificados) en comparación con los objetos de captura que comprenden una superficie de unión para las moléculas de analito. Por ejemplo, el objeto de control puede tener una emisión de fluorescencia, una reflectividad espectral, forma, una absorción espectral o una emisión o absorción de FTIR diferente, en comparación con los objetos de captura. El porcentaje de objetos de control con respecto al número total de objetos (por ejemplo, objetos de captura y objetos de control) en el ensayo puede ser de aproximadamente el 0,0001 %, aproximadamente el 0,0005 %, aproximadamente el 0,001 %, aproximadamente el 0,005 %, aproximadamente el 0,01 %, aproximadamente el 0,05 %, aproximadamente el 0,1 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 5 % o similares.

En algunas realizaciones, los objetos de control están configurados como controles de unión negativos y pueden ser de una forma y tamaño similares a los objetos de captura usados para inmovilizar moléculas de analito, sin embargo, los objetos de control pueden carecer de una superficie de unión para las moléculas de analito (por ejemplo, una pluralidad de componentes de captura). Por ejemplo, los objetos de control pueden comprender una pluralidad de perlas, y los objetos de captura para inmovilizar las moléculas de analito pueden comprender perlas iguales o similares, que comprenden adicionalmente al menos una superficie que comprende una pluralidad de componentes de captura.

En una realización, los objetos de control pueden comprender un control positivo e incluyen un componente enzimático. Un agente de marcaje precursor puede convertirse en un agente de marcaje tras la exposición al componente enzimático. En algunos casos, el componente enzimático puede ser el mismo que el componente enzimático que está usándose para detectar las moléculas de analito en una muestra de fluido (por ejemplo, comprendido en otro componente del ensayo, por ejemplo, un componente enzimático comprendido en un ligando de unión, una molécula de analito, etc.). En tales realizaciones, el objeto de control puede ser distinguible de los objetos de captura de modo que los recipientes de reacción que tienen una señal positiva pueden analizarse para determinar si el recipiente de reacción comprende un objeto de control (por ejemplo, que tiene una primera señal detectable) o un objeto de captura (por ejemplo, que tiene una segunda señal detectable distinguible de la primera señal detectable). En otros casos, el componente enzimático puede ser diferente de un componente enzimático que está usándose para detectar las moléculas de analito en una muestra de fluido (por ejemplo, comprendido en otro componente del ensayo, por ejemplo, un componente enzimático comprendido en un ligando de unión, una molécula de analito, etc.). En esta realización, el objeto de control puede ser distinguible o no de los objetos de captura. Pueden proporcionarse tanto un primer tipo como un segundo tipo de agente de marcaje precursor a los recipientes de reacción, y el primer tipo de agente de marcaje precursor puede convertirse en un primer tipo de agente de marcaje tras la exposición al componente enzimático asociado con las perlas de control y el segundo tipo de agente de marcaje precursor puede convertirse en un segundo tipo de agente de marcaje tras la exposición al otro componente enzimático (por ejemplo, comprendido en el ligando de unión/molécula de analito/etc.). Los recipientes de reacción que contienen el primer tipo de agente de marcaje corresponden a los recipientes de reacción que contienen un objeto de control y los recipientes de reacción que contienen un segundo tipo de agente de marcaje corresponden a los recipientes de reacción que contienen un ligando de unión/molécula de analito/etc. Puede observarse la pluralidad de ubicaciones que contienen una perla de control para analizar, por ejemplo, la eficacia de la reacción de conversión enzimática.

Puede usarse una variedad de métodos para preparar los objetos de control, por ejemplo, métodos similares descritos en el presente documento para los objetos de captura (por ejemplo, perlas que comprenden una pluralidad de componentes de captura). En algunos casos, algunos de los objetos de control pueden comprender un componente enzimático. Los objetos de control pueden prepararse de modo que 1) la mayoría de los objetos de control comprenden cada uno al menos un componente enzimático (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, etc.) o 2) algunos de los objetos de control comprenden un único componente enzimático y el resto de los objetos de control no comprenden ningún componente enzimático. En el primer caso, durante la formación de los objetos de control, la razón de componentes enzimáticos proporcionados en disolución con respecto a los objetos puede ser de más de 1:1, más de aproximadamente 2:1, más de aproximadamente 5:1, más de aproximadamente 10:1 o similares. En tales casos, se esperaría que, tras repartir los objetos de control sobre un sustrato, cada ubicación que comprende un objeto de control daría una señal positiva tras la exposición a un agente de marcaje precursor. En el segundo caso, durante la formación de los objetos de control, la razón de componentes enzimáticos proporcionados en disolución con respecto a objetos puede ser de menos de aproximadamente 1:5, menos de aproximadamente 1:10, menos de aproximadamente 1:20, menos de aproximadamente 1:50 o similares. En tales casos, se esperaría que la razón del número de ubicaciones que comprenden un objeto de control y que dan una señal positiva con respecto al número de ubicaciones que comprenden un objeto de control que no dan una señal positiva sería aproximadamente similar a la razón de componentes enzimáticos con respecto a objetos durante la formación de los objetos de control y/o puede seguir una distribución de Poisson.

Tal como se describió anteriormente, tras la inmovilización de una pluralidad de moléculas de analito con respecto a la pluralidad de objetos de captura en la etapa de captura de analitos, al menos una parte de los objetos de captura pueden segregarse espacialmente en una pluralidad de ubicaciones, por ejemplo, sobre un sustrato. Por ejemplo, cada uno de los objetos de captura de la parte de objetos de captura que se segregan espacialmente puede colocarse en y/o asociarse con una ubicación (por ejemplo, un punto, región, pocillo, etc. sobre la superficie y/o en el cuerpo de un sustrato) que es espacialmente distinta de las ubicaciones en las que se ubican cada uno de los demás objetos de captura, de modo que los objetos de captura y las ubicaciones pueden resolverse individualmente mediante un sistema de detección analítico empleado para abordar las ubicaciones. Como ejemplo, cada uno de una parte de los objetos de captura puede segregarse espacialmente en una matriz de recipientes de reacción sobre un sustrato, de modo que estadísticamente solo ningún o un objeto de captura se ubica en al menos algunos de los recipientes de reacción y en determinados casos esencialmente en cada recipiente de reacción. Cada ubicación puede abordarse individualmente con respecto a las demás ubicaciones. Adicionalmente, las ubicaciones pueden disponerse de modo que puede abordarse una pluralidad de ubicaciones de manera sustancialmente simultánea, tal como se describe en el presente documento, mientras todavía se permite la capacidad de resolver ubicaciones y objetos de captura individuales.

Debe entenderse que, aunque gran parte de la discusión en el presente documento se centra en ubicaciones que contienen un único objeto de captura, esto no es de ningún modo limitativo, y en algunas realizaciones, más de un objeto de captura pueden estar contenidos en una única ubicación. En tales realizaciones, la razón de objetos de captura con respecto a moléculas de analito puede ser tal que, tras la segregación espacial de la pluralidad de objetos de captura en la pluralidad de ubicaciones, una fracción estadísticamente significativa de las ubicaciones no contiene ninguna molécula de analito y una fracción estadísticamente significativa de ubicaciones contiene al menos una molécula de analito. Es decir, aunque una única ubicación puede contener una pluralidad de objetos de captura, en algunos casos, ninguno de los objetos de captura se asocia con ninguna molécula de analito y solo un único de los objetos de captura en una ubicación abordada se asocia con al menos una molécula de analito.

Tal como se indicó anteriormente, en algunas realizaciones, la pluralidad de ubicaciones comprende una pluralidad de recipientes de reacción/pocillos sobre un sustrato. Los recipientes de reacción, en determinadas realizaciones, pueden configurarse para recibir y contener solo un único objeto de captura usado para la captura de analitos. La pluralidad de objetos de captura puede repartirse a través de una pluralidad de tales recipientes de reacción (por ejemplo, configurados como una matriz de recipientes de reacción sobre un sustrato), en algunos casos, para facilitar la determinación de una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido mediante medios comentados en más detalle a continuación y en los ejemplos.

En algunas realizaciones, la pluralidad de recipientes de reacción puede sellarse, por ejemplo, tras la introducción de los objetos de captura usados para la captura de analitos, por ejemplo, mediante el acoplamiento del segundo sustrato y un componente de sellado. El sellado de los recipientes de reacción puede realizarse de modo que el contenido de cada recipiente de reacción no puede escapar del recipiente de reacción durante el resto del ensayo. En algunos casos, los recipientes de reacción pueden sellarse tras la adición de los objetos de captura y, opcionalmente, un agente de marcaje precursor para facilitar la detección de las moléculas de analito. Para realizaciones que emplean agentes de marcaje precursores, sellando el contenido en algunos o en cada recipiente de reacción, puede avanzar una reacción para producir los agentes de marcaje detectables dentro de los recipientes de reacción sellados, produciendo así una cantidad detectable de agentes de marcaje que se retienen en el recipiente de reacción con propósitos de detección.

La pluralidad de ubicaciones que comprenden una pluralidad de recipientes de reacción puede formarse usando una variedad de métodos y/o materiales. En algunos casos, la pluralidad de recipientes de reacción se forma como una matriz de depresiones sobre una primera superficie. Sin embargo, en otros casos la pluralidad de recipientes de reacción puede formarse acoplando un componente de sellado que comprende una pluralidad de depresiones con un sustrato que puede o bien tener una superficie uniforme o bien incluir depresiones alineadas con las del componente de sellado. Cualquiera de los componentes del dispositivo, por ejemplo, el sustrato o el componente de sellado, puede fabricarse a partir de un material flexible, por ejemplo, un material de polímero elastomérico, para ayudar en el sellado. Las superficies pueden ser o hacerse que sean hidrófobas o contener regiones hidrófobas para minimizar fugas de muestras acuosas de los micropocillos.

En algunos casos, el componente de sellado puede ser capaz de entrar en contacto con la superficie exterior de una matriz de micropocillos (por ejemplo, el revestimiento de un haz de fibra óptica tal como se describe en más detalle a continuación) de modo que cada recipiente de reacción se sella o aísla de modo que el contenido de cada recipiente de reacción no puede escapar del recipiente de reacción. Según una realización, el componente de sellado puede ser una junta de elastómero de silicona que puede colocarse contra una matriz de micropocillos con la aplicación de presión sustancialmente uniforme a través de todo el sustrato. En algunos casos, los recipientes de reacción pueden sellarse tras la adición de la pluralidad de objetos de captura usados para la captura de analitos y, opcionalmente, cualquier molécula de agente de marcaje precursor que puede usarse para facilitar la detección de la molécula de analito.

En la figura 6 se representa un ejemplo de la formación de una pluralidad de recipientes de reacción que contienen disolución de ensayo sobre/en un sustrato. La figura 6, panel (A), muestra una superficie que comprende una pluralidad de micropocillos 139, que se han expuesto a una disolución 141 de ensayo (por ejemplo, una disolución que contiene los objetos de captura usados para la captura de analitos y/u objetos de control obtenidos tras la realización de la(s) etapa(s) de captura de analitos y cualquier etapa de lavado), y un componente 143 de sellado. El componente 143 de sellado en este ejemplo comprende una superficie de fondo sustancialmente plana. El acoplamiento del sustrato 139 con el componente 143 de sellado forma una pluralidad de recipientes 145 de reacción sellados. Las zonas entre los recipientes 148 de reacción pueden modificarse para ayudar en la formación de un sello estanco entre los recipientes de reacción.

En la figura 6, panel (B), se muestra una segunda realización en la que se acopla un componente 162 de sellado que comprende una pluralidad de micropocillos 163 con una superficie 158 sustancialmente plana que se ha expuesto a disolución 162 de ensayo, formando así una pluralidad de recipientes 164 de reacción.

En una tercera realización, tal como se muestra en la figura 6, panel (C), se acopla una superficie 166 de sustrato que comprende una pluralidad de micropocillos 167 con un componente 170 de sellado que también comprende una pluralidad de micropocillos 171. En esta realización, los micropocillos en el sustrato y los micropocillos en los componentes de sellado están sustancialmente alineados de modo que cada recipiente 172 de reacción formado comprende una parte del micropocillo del componente de sellado y una parte de un micropocillo del sustrato. En la figura 6, panel (D), los micropocillos no están alineados de modo que cada recipiente de reacción comprende o bien un micropocillo del componente 173 de sellado o bien un micropocillo del sustrato 175.

El componente de sellado puede ser esencialmente del mismo tamaño que el sustrato o puede ser de tamaño diferente. En algunos casos, el componente de sellado es aproximadamente del mismo tamaño que el sustrato y se acopla sustancialmente con toda la superficie del sustrato. En otros casos, tal como se representa en la figura 6, panel (E), el componente 176 de sellado es más pequeño que el sustrato 174 y el componente de sellado solo se acopla con una parte 178 del sustrato. En aún otra realización, tal como se representa en la figura 6, panel (F), el componente 182 de sellado es más grande que el sustrato 180 y solo una parte 184 del componente de sellado se acopla con el sustrato 180.

En algunas realizaciones, todos los recipientes de reacción pueden tener aproximadamente el mismo volumen. En otras realizaciones, los recipientes de reacción pueden tener volúmenes diferentes. El volumen de cada recipiente de reacción individual puede seleccionarse para que sea apropiado para facilitar cualquier protocolo de ensayo particular. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones en las que es deseable limitar el número de objetos de captura usados para la captura de analitos contenidos en cada recipiente a un número pequeño, el volumen de los recipientes de reacción puede oscilar entre attolitros o menos y nanolitros o más dependiendo de la naturaleza de los objetos de captura, los equipos y la técnica de detección empleados, el número y densidad de los pocillos sobre el sustrato y la concentración prevista de objetos de captura en el fluido aplicado al sustrato que contiene los pocillos. En una realización, el tamaño del recipiente de reacción puede seleccionarse de tal manera que solo un único objeto de captura usado para la captura de analitos puede contenerse totalmente dentro del recipiente de reacción. Según una realización, los recipientes de reacción pueden tener un volumen de entre aproximadamente 1 femtolitro y aproximadamente 1 picolitro, entre aproximadamente 1 femtolitro y aproximadamente 100 femtolitros, entre aproximadamente 10 attolitros y aproximadamente 100 picolitros, entre aproximadamente 1 picolitro y aproximadamente 100 picolitros, entre aproximadamente 1 femtolitro y aproximadamente 1 picolitro o entre aproximadamente 30 femtolitros y aproximadamente 60 femtolitros. En algunos casos, los recipientes de reacción tienen un volumen de menos de aproximadamente 1 picolitro, menos de aproximadamente 500 femtolitros, menos de aproximadamente 100 femtolitros, menos de aproximadamente 50 femtolitros o menos de aproximadamente 1 femtolitro. En algunos casos, los recipientes de reacción tienen un volumen de aproximadamente 10 femtolitros, aproximadamente 20 femtolitros, aproximadamente 30 femtolitros, aproximadamente 40 femtolitros, aproximadamente 50 femtolitros, aproximadamente 60 femtolitros, aproximadamente 70 femtolitros, aproximadamente 80 femtolitros, aproximadamente 90 femtolitros o aproximadamente 100 femtolitros.

En realizaciones en las que la pluralidad de objetos de captura usados para la captura de analitos comprende una pluralidad de perlas y la pluralidad de ubicaciones comprende una pluralidad de recipientes de reacción que tienen una forma que es esencialmente la de un cilindro circular, el tamaño de los recipientes de reacción puede basarse en el tamaño de las perlas y puede diseñarse para garantizar que el número de pocillos que contienen más de una única perla es mínimo. En algunos casos, el diámetro de pocillo máximo permisible puede calcularse según la ecuación 3:

2 * Radio de perla =^ J(3* Radio de perla2 - Profundidad de pocilio2 2 * Profundidad de pocillo * Radio de perla) (Ec.3)

y/o la profundidad de pocillo máxima permisible puede calcularse según la ecuación 4:

Radio de perla /^(4 * Radio de perla * Diámetro de pocillo - Diámetro de pocillo2) (Ec. 4)

La profundidad de pocillo mínima permisible y el diámetro de pocillo mínimo permisible para garantizar que una única perla puede estar contenida en el pocillo, en la mayoría de las realizaciones, no será menor que el diámetro promedio de la perla. Tener un recipiente de reacción de tamaño apropiado que permita que esté presente no más de una única perla en un recipiente de reacción puede proporcionar una mejor capacidad para resolver perlas individuales permitiendo más exactitud con respecto a la determinación de una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido mediante los medios descritos en más detalle a continuación y en los ejemplos. Por ejemplo, si los recipientes de reacción son demasiado grandes, más de una perla puede ser capaz de acomodarse en el recipiente de reacción, lo que puede conducir a un aumento en el número de recipientes de reacción que contienen múltiples moléculas de analito, lo que puede introducir imprecisión en una determinación de concentración usando un modelo de algoritmo/estadístico basándose en la detección de una única molécula (véase a continuación). Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable tener más de una perla acomodada en un recipiente de reacción. Por otro lado, si el recipiente de reacción es demasiado pequeño, una perla puede no ser capaz de acomodarse en el recipiente de reacción, impidiendo de ese modo el sellado apropiado del recipiente de reacción (por ejemplo, en realizaciones en las que el recipiente de reacción se sella) y/o puede conducir a dificultades para abordar ubicaciones individuales (por ejemplo, en realizaciones en las que se produce un agente de marcaje para la detección, el agente de marcaje puede dispersarse del recipiente de reacción en el que se produce). En tales casos, puede haber falsos positivos (por ejemplo, un recipiente de reacción que no contiene una molécula de analito puede determinarse que contiene una molécula de analito basándose en el agente de marcaje que ha difundido de la ubicación en la que se produjo), lo que puede conducir a una determinación imprecisa de una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido.

En algunas realizaciones, la profundidad promedio de los recipientes de reacción es de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 1,7 veces, entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,5 veces, entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,3 veces, o entre aproximadamente 1,1 veces y aproximadamente 1,4 veces el diámetro promedio de las perlas. En algunas realizaciones, el diámetro promedio de los recipientes de reacción es de entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,9 veces, entre aproximadamente 1,2 veces y aproximadamente 1,7 veces, entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,5 veces, o entre aproximadamente 1,3 veces y aproximadamente 1,6 veces el diámetro promedio de las perlas. En una realización particular, la profundidad promedio de los recipientes de reacción es de entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,5 veces el diámetro promedio de las perlas y el diámetro promedio de los recipientes de reacción es de entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,9 veces el diámetro promedio de las perlas.

El número total de ubicaciones y/o densidad de las ubicaciones empleadas en un ensayo (por ejemplo, el número/densidad de recipientes de reacción en una matriz) puede depender de la composición y el uso final de la matriz. Por ejemplo, el número de recipientes de reacción empleados puede depender del número de objetos de captura empleados, el intervalo de concentración sospechado del ensayo, el método de detección, el tamaño de los objetos de captura, el tipo de entidad de detección (por ejemplo, agente de marcaje libre en disolución, agente de marcaje precipitante, etc.). Pueden prepararse matrices que contienen desde aproximadamente 2 hasta muchos miles de millones de recipientes de reacción (o número total de recipientes de reacción) utilizando una variedad de técnicas y materiales. El aumento del número de recipientes de reacción en la matriz puede usarse para aumentar el intervalo dinámico de un ensayo o para permitir que múltiples muestras o múltiples tipos de moléculas de analito se sometan a ensayo en paralelo. La matriz puede comprender entre mil y un millón de recipientes de reacción por muestra que va a analizarse. En algunos casos, la matriz comprende más de un millón de recipientes de reacción. En algunas realizaciones, la matriz comprende entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 50000, entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 1000000, entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 10000, entre aproximadamente 10000 y aproximadamente 100000, entre aproximadamente 100000 y aproximadamente 1 000000, entre aproximadamente 100000 y aproximadamente 500000, entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 100000, entre aproximadamente 50000 y aproximadamente 100000, entre aproximadamente 20 000 y aproximadamente 80000, entre aproximadamente 30000 y aproximadamente 70000, entre aproximadamente 40 000 y aproximadamente 60000 o similares, recipientes de reacción. En algunas realizaciones, la matriz comprende aproximadamente 10000, aproximadamente 20000, aproximadamente 50 000, aproximadamente 100000, aproximadamente 150000, aproximadamente 200000, aproximadamente 300000, aproximadamente 500000, aproximadamente 1000000 o más, recipientes de reacción.

La matriz de recipientes de reacción puede estar dispuesta sobre una superficie sustancialmente plana o en una disposición tridimensional no plana. Los recipientes de reacción pueden estar organizados en un patrón regular o pueden estar distribuidos aleatoriamente. En una realización específica, la matriz es un patrón regular de sitios sobre una superficie sustancialmente plana que permite que los sitios se aborden en el plano de coordenadas X-Y.

En algunas realizaciones, los recipientes de reacción se forman en un material sólido. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, el número de materiales potencialmente adecuados en los que pueden formarse los recipientes de reacción es muy grande, e incluye, pero no se limitan a, vidrio (incluyendo vidrio modificado y/o funcionalizado), plástico (incluyendo compuestos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, copolímero de olefina cíclica (COC), polímero de olefina cíclica (COP), Teflon®, polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, etc.), elastómeros (tales como poli(dimetilsiloxano) y poliuretanos), materiales compuestos, cerámica, materiales de sílice o a base de sílice (incluyendo silicio y silicio modificado), carbono, metales, haces de fibra óptica o similares. En general, el material de sustrato puede seleccionarse para permitir la detección óptica sin autofluorescencia apreciable. En determinadas realizaciones, los recipientes de reacción pueden estar formados de un material flexible.

Un recipiente de reacción en una superficie (por ejemplo, sustrato o componente de sellado) puede formarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, fotolitrografía, técnicas de estampación, técnicas de moldeo, técnicas de grabado o similares. Tal como apreciarán los expertos habituales en la técnica, la técnica usada puede depender de la composición y forma del material de soporte y el tamaño y número de recipientes de reacción.

En una realización particular, se forma una matriz de recipientes de reacción creando micropocillos en un extremo de un haz de fibra óptica y utilizando una superficie conforme plana como componente de sellado. En determinadas de tales realizaciones, una matriz de recipientes de reacción en el extremo de un haz de fibra óptica puede formarse tal como sigue. En primer lugar, se graba una matriz de micropocillos en el extremo de un haz de fibra óptica pulido. Los expertos habituales en la técnica conocen técnicas y materiales para formar y grabar un haz de fibra óptica. Por ejemplo, el diámetro de las fibras ópticas, la presencia, el tamaño y la composición de las regiones de núcleo y revestimiento de la fibra, y la profundidad y especificidad del grabado pueden variarse mediante la técnica de grabado elegida de modo que puedan formarse micropocillos del volumen deseado. En determinadas realizaciones, el proceso de grabado crea micropocillos grabando preferentemente el material de núcleo de las fibras de vidrio individuales en el haz de modo que cada pocillo esté aproximadamente alineado con una única fibra y aislado de los pocillos adyacentes por el material de revestimiento. Posibles ventajas del formato de matriz de fibra óptica son que pueden producirse de miles a millones de recipientes de reacción sin procedimientos de microfabricación complicados y que puede proporcionar la capacidad de observar y abordar ópticamente muchos recipientes de reacción simultáneamente.

Cada micropocillo puede estar alineado con una fibra óptica en el haz de modo que el haz de fibra óptica puede portar tanto luz de excitación como de emisión a y desde los pocillos, permitiendo una interrogación remota del contenido del pocillo. Además, una matriz de fibras ópticas puede proporcionar la capacidad de excitación simultánea o no simultánea de moléculas en recipientes adyacentes, sin “diafonía” de señales entre las fibras. Es decir, la luz de excitación transmitida en una fibra no escapa a una fibra vecina.

Alternativamente, las estructuras equivalentes de una pluralidad de recipientes de reacción pueden fabricarse usando otros métodos y materiales que no utilizan los extremos de un haz de fibra óptica como sustrato. Por ejemplo, la matriz puede ser un sustrato dispuesto en puntos, impreso o fabricado de manera fotolitográfica producido mediante técnicas conocidas en la técnica; véanse por ejemplo los documentos WO95/25116; WO95/35505; PCT US98/09163; las patentes estadounidenses n.os 5700637, 5807522, 5445934, 6406845 y 6482593. En algunos casos, la matriz puede producirse usando técnicas de moldeo, estampado en relieve y/o grabado tal como conocerán los expertos habituales en la técnica.

En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona un sistema equipado con una plataforma mecánica que aplica un componente de sellado a un sustrato. La plataforma puede estar colocada por debajo de una platina en el sistema. Tras haberse añadido los componentes de reacción elegidos a una matriz de recipientes de reacción, el componente de sellado puede acoplarse con la matriz. Por ejemplo, el componente de sellado puede intercalarse entre una superficie plana (tal como, por ejemplo, un portaobjetos de microscopio) y la matriz de recipientes de reacción usando presión uniforme aplicada por la plataforma mecánica.

En la figura 7 se ilustra una realización no limitativa. Se coloca un componente 300 de sellado sobre la parte superior de la plataforma 302 mecánica. La disolución 304 de ensayo se coloca sobre la parte superior del componente 300 de sellado. La plataforma mecánica se mueve hacia arriba hacia la matriz 306 (por ejemplo, matriz de fibra óptica) de modo que se aplica una presión uniforme. Tal como se muestra en la figura 8, el componente 300 de sellado forma un sello estanco con la matriz 306. En otros casos, puede aplicarse una presión variable al componente de sellado para formar un sello estanco entre el componente de sellado y la matriz. El sistema también puede comprender componentes 312 adicionales que pueden utilizarse para analizar la matriz (por ejemplo, microscopio, ordenador, etc.) tal como se comenta más en el presente documento.

La pluralidad de objetos de captura usados para la captura de analitos puede estar separada espacialmente en la pluralidad de recipientes de reacción usando cualquiera de una amplia variedad de técnicas conocidas por los expertos habituales en la técnica. En algunos casos, la pluralidad de recipientes de reacción puede exponerse a una disolución que contiene la pluralidad de objetos de captura. En algunos casos, puede aplicarse fuerza a la disolución y/u objetos de captura, ayudando de ese modo en la separación espacial de los objetos de captura de la fase de fluido y/o la deposición de los objetos de captura en los recipientes. Por ejemplo, tras la aplicación de una disolución de ensayo que contiene los objetos de captura a un sustrato que contiene los recipientes de reacción, el sustrato y la disolución pueden centrifugarse para ayudar en la deposición de los objetos de captura en los recipientes de reacción. En realizaciones en las que los objetos de captura (por ejemplo, perlas) son magnéticos, puede usarse un imán para ayudar en la contención de los objetos de captura en los recipientes de reacción. En algunos casos, cuando la pluralidad de recipientes de reacción se forma en el extremo de un haz de fibra óptica (u otra superficie plana), puede colocarse un material (por ejemplo, tubos) alrededor de los bordes de la superficie de la matriz que comprende la pluralidad de recipientes de reacción para formar un depósito para mantener la disolución en su sitio mientras que los objetos de captura se sedimentan en los recipientes de reacción o se colocan en los recipientes de reacción (por ejemplo, mientras se centrifugan). Tras la colocación de los objetos de captura en al menos algunos de los recipientes de reacción, el material circundante puede eliminarse y la superficie de la matriz puede lavarse y/o limpiarse para eliminar cualquier exceso de disolución/objetos de captura.

En algunas realizaciones, el sustrato no incluye pocillos o recipientes de reacción que forman la pluralidad de recipientes de reacción, sino que usa/proporciona otros medios para segregar espacialmente la pluralidad de objetos de captura usados para la captura de analitos. En algunos casos, puede emplearse una superficie sustancialmente plana estampada, en la que las zonas con patrón forman una pluralidad de ubicaciones. En algunos casos, las zonas con patrón pueden comprender superficies sustancialmente hidrófilas que están rodeadas sustancialmente por superficies sustancialmente hidrófobas. Una pluralidad de objetos de captura (por ejemplo, perlas) puede estar rodeada sustancialmente por un medio sustancialmente hidrófilo (por ejemplo, que comprende agua), y las perlas pueden exponerse a la superficie de patrón de modo que las perlas se asocian en las zonas con patrón (por ejemplo, las ubicaciones), segregando de ese modo espacialmente la pluralidad de perlas. Por ejemplo, en una realización de este tipo, un sustrato puede ser o incluir un gel u otro material capaz de proporcionar una barrera suficiente al transporte de masa (por ejemplo, barrera convectiva y/o de difusión) para impedir que los objetos de captura usados para la captura de analitos y/o agente de marcaje precursor y/o agente de marcaje se desplacen de una ubicación sobre o en el material a otra ubicación para provocar interferencia o diafonía entre ubicaciones espaciales que contienen diferentes objetos de captura durante el intervalo de tiempo requerido para abordar las ubicaciones y completar el ensayo. Por ejemplo, en una realización, una pluralidad de objetos de captura se separa espacialmente dispersando los objetos de captura sobre y/o en un material de hidrogel. En algunos casos, un agente de marcaje precursor puede estar ya presente en el hidrogel, facilitando de ese modo el desarrollo de una concentración local del agente de marcaje (por ejemplo, tras la exposición a un ligando de unión o molécula de analito que porta un componente enzimático). Como todavía aún otra realización, los objetos de captura pueden estar confinados en uno o más capilares. En algunos casos, la pluralidad de objetos de captura puede adsorberse o localizarse sobre un sustrato fibroso o poroso, por ejemplo, papel de filtro. En algunas realizaciones, los objetos de captura pueden segregarse espacialmente sobre una superficie uniforme (por ejemplo, una superficie plana), y los objetos de captura pueden detectarse usando agentes de marcaje precursores que se convierten en agentes de marcaje precipitantes o sustancialmente insolubles que permanecen localizados en o cerca de la ubicación de donde se localiza el objeto de captura correspondiente. El uso de tales agentes de marcaje precipitantes o sustancialmente insolubles se describe en el presente documento.

Artículos y kits

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un artículo o kit para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido. El artículo o kit puede comprender una pluralidad de perlas y un sustrato que comprende una pluralidad de recipientes de reacción. Los recipientes de reacción pueden estar configurados para recibir y contener los objetos de captura. La pluralidad de perlas en una determinada realización tiene un diámetro promedio de entre aproximadamente 0,1 micrómetro y aproximadamente 100 micrómetros y el tamaño de los recipientes de reacción puede seleccionarse de modo que solo o bien cero o bien una perla sea capaz de estar contenida en un único recipiente de reacción. En algunos casos, la profundidad promedio de los recipientes de reacción es de entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,5 veces el diámetro promedio de las perlas y el diámetro promedio de los recipientes de reacción es de entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,9 veces el diámetro promedio de las perlas. En determinadas realizaciones, las perlas pueden tener un diámetro promedio de entre aproximadamente 1 micrómetro y aproximadamente 10 micrómetros, entre aproximadamente 1 micrómetro y aproximadamente 5 micrómetros, o cualquier intervalo de tamaños descrito en el presente documento.

La pluralidad de perlas proporcionadas puede tener una variedad de propiedades y parámetros, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, las perlas pueden ser magnéticas. La pluralidad de perlas puede comprender una superficie de unión (por ejemplo, una pluralidad de componentes de captura) que tiene una afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito.

La pluralidad de recipientes de reacción puede formarse en cualquier sustrato adecuado, tal como se describe en el presente documento. En una realización particular, la pluralidad de recipientes de reacción se forma en el extremo de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica puede prepararse (por ejemplo, grabarse) según métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica y/o métodos descritos en el presente documento. En otras realizaciones, la pluralidad de recipientes de reacción se forma en una placa o material sustancialmente plano similar (por ejemplo, usando litografía u otras técnicas conocidas). En el presente documento se describen materiales adecuados a modo de ejemplo.

La profundidad promedio de la pluralidad de recipientes de reacción puede ser de entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 1,5 veces, o entre aproximadamente 1,1 y aproximadamente 1,3 veces el diámetro promedio de las perlas, o cualquier intervalo descrito en el presente documento. El diámetro promedio de la pluralidad de recipientes de reacción puede ser de entre aproximadamente 1,0 veces y aproximadamente 1,9 veces, o entre aproximadamente 1,3 veces y aproximadamente 1,8 veces el diámetro promedio de las perlas, o cualquier intervalo descrito en el presente documento. La profundidad promedio y/o el diámetro promedio de la pluralidad de recipientes de reacción puede elegirse de modo que no más de una perla sea capaz de estar contenida en un recipiente de reacción. En el presente documento se describen métodos para calcular las profundidades máximas y los diámetros máximos para facilitar la carga de perlas individuales. El volumen promedio de la pluralidad de recipientes de reacción puede ser de entre aproximadamente 10 attolitros y aproximadamente 100 picolitros, entre aproximadamente 1 femtolitro y aproximadamente 1 picolitro, o cualquier intervalo deseado. El sustrato puede comprender cualquier número de recipientes de reacción, por ejemplo, entre aproximadamente 1000 y aproximadamente 1000000 recipientes de reacción, entre aproximadamente 10000 y aproximadamente 100000 recipientes de reacción, o entre aproximadamente 100000 y aproximadamente 300000 recipientes de reacción, o cualquier otro intervalo deseado.

El artículo o kit puede comprender cualquier número de componentes adicionales, algunos de los cuales se describen en detalle en el presente documento. En algunos casos, el artículo o kit puede comprender además un componente de sellado configurado para sellar la pluralidad de recipientes de reacción. En determinadas realizaciones, la pluralidad de recipientes de reacción puede formarse tras el acoplamiento de al menos una parte de un componente de sellado y al menos una parte del segundo sustrato, tal como se muestra en las figuras 7A-7F y tal como se comenta en más detalle en el presente documento. Como otro ejemplo, el kit también puede proporcionar disoluciones para llevar a cabo un método de ensayo tal como se describe en el presente documento. Los ejemplos no limitativos de disoluciones incluyen disoluciones que contienen uno o más tipos de ligandos de unión y agentes de marcaje precursores. En algunos casos, el artículo o kit puede comprender al menos un tipo de perla de control.

En algunas realizaciones, el kit puede incluir opcionalmente instrucciones para el uso de la pluralidad de perlas y la pluralidad de recipientes de reacción (y cualquier componente adicional proporcionado). Es decir, el kit puede incluir una descripción de uso de las perlas y recipientes de reacción, por ejemplo, para su uso con un sistema para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito (o partículas) en una muestra de fluido. Tal como se usa en el presente documento, “instrucciones” puede definir un componente de instrucción y/o promoción, y normalmente implica instrucciones escritas sobre o asociadas con los envases. Las instrucciones también pueden incluir cualquier instrucción oral u electrónica proporcionada de cualquier manera de modo que un usuario del kit reconocerá claramente que las instrucciones van a estar asociadas con el kit. Adicionalmente, el kit puede incluir otros componentes dependiendo de la aplicación específica, tal como se describe en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento “promovido” incluye todos los métodos de realizar negocios, incluyendo métodos de educación, instrucción hospitalaria y clínica, investigación científica, descubrimiento o desarrollo de fármacos, investigación académica, actividad de la industria farmacéutica, incluyendo ventas de productos farmacéuticos, y cualquier publicidad u otra actividad promocional, incluyendo comunicación escrita, oral y electrónica de cualquier forma.

Componentes de captura

En algunas realizaciones de la presente invención, la superficie de los objetos de captura puede proporcionar una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito. En algunas realizaciones, la superficie de unión puede comprender al menos un tipo de componente de captura. Generalmente, el componente de captura permite la unión de una molécula, partícula o complejo a un soporte sólido (es decir, una superficie de un objeto de captura) con los propósitos de inmovilización, detección, cuantificación y/u otro análisis de la molécula, partícula o complejo. En la presente invención las moléculas o partículas de analito se inmovilizan con respecto a una pluralidad de perlas (es decir, componentes de captura).

Tal como apreciarán los expertos en la técnica, para los métodos descritos en el presente documento la composición del componente de captura dependerá de la composición de la molécula de analito. Se conocen componentes de captura para una amplia variedad de moléculas diana o pueden encontrarse o desarrollarse fácilmente usando técnicas conocidas. Por ejemplo, cuando la molécula diana es una proteína, los componentes de captura pueden comprender proteínas, particularmente anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno (Fab), fragmentos Fab', fragmentos de pepsina, fragmentos F(ab')2, anticuerpos monoclonales o policlonales de longitud completa, fragmentos de tipo anticuerpo, etc.), otras proteínas, tales como proteínas receptoras, proteína A, proteína C, etc., o moléculas pequeñas. En algunos casos, los componentes de captura para proteínas comprenden péptidos. Por ejemplo, cuando la molécula diana es una enzima, los componentes de captura adecuados pueden incluir sustratos enzimáticos y/o inhibidores enzimáticos. En algunos casos, cuando el analito diana es una especie fosforilada, el componente de captura puede comprender un agente de unión a fosfato. Por ejemplo, el agente de unión a fosfato puede comprender medios de afinidad a iones metálicos tales como los descritos en la patente estadounidense n.° 7070921 y la solicitud de patente estadounidense n.° 20060121544. Además, cuando la molécula diana es un ácido nucleico monocatenario, el componente de captura puede ser un ácido nucleico complementario. De manera similar, la molécula diana puede ser una proteína de unión a ácido nucleico y el componente de captura puede ser un ácido nucleico monocatenario o bicatenario; alternativamente, el componente de captura puede ser una proteína de unión a ácido nucleico cuando la molécula diana es un ácido nucleico monocatenario o bicatenario. Alternativamente, tal como se describe generalmente en las patentes estadounidenses 5270 163, 5475096, 5 567588, 5595877, 5637459, 5683867, 5705337, y patentes relacionadas, pueden desarrollarse “aptámeros” de ácido nucleico para capturar prácticamente cualquier molécula diana. Además, por ejemplo, cuando la molécula diana es un hidrato de carbono, los componentes de captura potencialmente adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos, lectinas y selectinas. Tal como apreciarán los expertos habituales en la técnica, cualquier molécula que pueda asociarse específicamente con una molécula diana de interés puede usarse potencialmente como componente de captura.

Para determinadas realizaciones, los pares de molécula de analito diana/componente de captura adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos/antígenos, receptores/ligandos, proteínas/ácido nucleico, ácidos nucleicos/ácidos nucleicos, enzimas/sustratos y/o inhibidores, hidratos de carbono (incluyendo glicoproteínas y glicolípidos)/lectinas y/o selectinas, proteínas/proteínas, proteínas/moléculas pequeñas; moléculas pequeñas/moléculas pequeñas, etc. Según una realización, los componentes de captura son porciones (particularmente las porciones extracelulares) de receptores de superficie celular que se sabe que se multimerizan, tales como el receptor de hormona del crecimiento, transportadores de glucosa (particularmente receptor GLUT 4) y receptores de células T y las moléculas de analito diana son uno o más ligandos diana de receptor.

En una realización particular, el componente de captura puede unirse a la superficie de un objeto de captura por medio de una unión, que puede comprender cualquier resto, funcionalización o modificación de la superficie de unión y/o componente de captura que facilite la unión del componente de captura a la superficie. La unión entre el componente de captura y la superficie puede comprender uno o más enlaces químicos o físicos (por ejemplo, unión no específica por medio de fuerzas de van der Waals, enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones hidrófobas/hidrófilas; etc.) y/o ligadores químicos que proporcionan tal(es) enlace(s). En determinadas realizaciones, el componente de captura comprende un componente diluyente de captura. En tales realizaciones, el componente de captura comprende una primera parte que se une a la molécula de analito y una segunda parte que puede usarse para la unión a la superficie de unión.

En determinadas realizaciones, una superficie de objeto de captura puede comprender también una capa protectora o de pasivación que puede reducir o minimizar la unión no específica de componentes que no son de captura (por ejemplo, moléculas de analito, ligandos de unión) a la superficie de unión durante el ensayo que puede conducir a señales de falsos positivos durante la detección o a pérdida de señal. Los ejemplos de materiales que pueden utilizarse en determinadas realizaciones para formar capas de pasivación incluyen, pero no se limitan a: polímeros, tales como poli(etilenglicol), que repelen la unión no específica de proteínas; proteínas que se producen de manera natural con esta propiedad, tales como albúmina sérica y caseína; tensioactivos, por ejemplo, tensioactivos zwitteriónicos, tales como sulfobetaínas; lípidos de cadena larga que se producen de manera natural; y ácidos nucleicos, tales como ADN de esperma de salmón.

El método de unión del componente de captura a una superficie de objeto de captura depende del tipo de unión empleada y puede lograrse potencialmente mediante una amplia variedad de técnicas/químicas de acoplamiento adecuadas conocidas por los expertos habituales en la técnica. El medio de unión particular seleccionado dependerá de las características materiales de la superficie de objeto de captura y la naturaleza del componente de captura. En determinadas realizaciones, los componentes de captura pueden unirse a la superficie de objeto de captura a través del uso de grupos funcionales reactivos en cada uno. Según una realización, los grupos funcionales son funcionalidades químicas. Es decir, la superficie de unión puede derivatizarse de modo que esté presente una funcionalidad química en la superficie de unión que puede reaccionar con una funcionalidad química en el componente de captura dando como resultado la unión. Los ejemplos de grupos funcionales para la unión que pueden ser útiles incluyen, pero no se limitan a, grupos amino, grupos carboxilo, grupos epóxido, grupos maleimida, grupos oxo y grupos tiol. Los grupos funcionales pueden unirse, o bien directamente o bien a través del uso de un ligador, cuya combinación se denomina algunas veces en el presente documento “agente de reticulación”. Se conocen en la técnica agentes de reticulación; por ejemplo, agentes de reticulación homo o heterobifuncionales tal como se conocen bien (por ejemplo, véase el catálogo de Pierce Chemical Company de 1994, sección técnica sobre agentes de reticulación, páginas 155­ 200, o “Bioconjugate Techniques” de Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996). Los ejemplos no limitativos de agentes de reticulación incluyen grupos alquilo (incluyendo grupos alquilo sustituidos y grupos alquilo que contienen restos de heteroátomo), ésteres, grupos amida, amina, epoxi y etilenglicol y derivados. Un agente de reticulación también puede comprender un grupo sulfona, que forma una sulfonamida.

Según una realización, el grupo funcional es un grupo funcional activado por luz. Es decir, el grupo funcional puede activarse mediante luz para unir el componente de captura a la superficie de objeto de captura. Un ejemplo es la tecnología PhotoLink™ disponible de SurModics, Inc. en Eden Prairie, MN.

En algunos casos, el objeto de captura puede comprender superficies recubiertas con estreptavidina y el componente de captura puede estar biotinilado. La exposición del componente de captura a las superficies recubiertas con estreptavidina puede provocar la asociación del componente de captura con la superficie mediante interacción entre el componente de biotina y la estreptavidina.

En determinadas realizaciones, la unión del componente de captura a la superficie de unión puede efectuarse sin modificar covalentemente la superficie de unión de un objeto de captura. Por ejemplo, la funcionalidad de unión puede añadirse a la superficie de unión usando un ligador que tiene tanto un grupo funcional reactivo con el componente de captura como un grupo que tiene afinidad de unión por la superficie de unión. En determinadas realizaciones, un ligador comprende una proteína capaz de unirse o pegarse a la superficie de unión; por ejemplo, en una realización de este tipo, el ligador es albúmina sérica con grupos amina libres sobre su superficie. Entonces puede añadirse un segundo ligador (agente de reticulación) para unir los grupos amina de la albúmina al componente de captura (por ejemplo, a grupos carboxilo).

Según una realización en la que se usa un agente de reticulación químico para unir los componentes de captura al objeto de captura, la molécula de analito puede capturarse sobre la superficie de unión de un objeto de captura usando un componente de captura unido por medio de reticulación química de la siguiente manera. En primer lugar, la superficie de unión se derivativa con un grupo funcional, tal como, un grupo amina. A continuación, se ponen en contacto un agente de reticulación y el componente de captura con la superficie de unión de modo que un extremo del agente de reticulación se une al grupo amina y el componente de captura se une al otro extremo del agente de reticulación. De este modo, pueden unirse componentes de captura que comprenden proteínas, lectinas, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas pequeñas, hidratos de carbono.

Una realización utiliza componentes de captura proteínicos. Tal como se conoce en la técnica, puede usarse cualquiera de varias técnicas para unir un componente de captura proteínico a una amplia variedad de superficies sólidas. “Proteína” o “proteínico” en este contexto incluye proteínas, polipéptidos, péptidos, incluyendo, por ejemplo, enzimas, y anticuerpos. Se conocen una amplia variedad de técnicas para añadir restos reactivos a proteínas, por ejemplo, el método explicado resumidamente en la patente estadounidense n.° 5620850. Se conoce la unión de proteínas a superficies, por ejemplo, véase Heller, Acc. Chem. Res. 23:128 (1990), y muchas otras referencias similares.

En algunas realizaciones, el componente de captura (o ligando de unión) puede comprender fragmentos Fab'. El uso de fragmentos Fab' en contraposición a anticuerpos completos puede ayudar a reducir la unión no específica entre el componente de captura y el ligando de unión. En algunos casos, la región Fc de un componente de captura (o ligando de unión) puede eliminarse (por ejemplo, proteolíticamente). En algunos casos, puede usarse una enzima para eliminar la región Fc (por ejemplo, pepsina, que puede producir fragmentos F(ab')2 y papaína, que puede producir fragmentos Fab). En algunos casos, el componente de captura puede unirse a una superficie de unión usando aminas o puede modificarse con biotina (por ejemplo, usando NHS-biotina) para facilitar la unión a una superficie de objeto de captura recubierta con avidina o estreptavidina. Los fragmentos F(ab')2 pueden someterse a un tratamiento de reducción química (por ejemplo, mediante exposición a 2-mercaptoetilamina) para, en algunos casos, formar dos fragmentos Fab' que llevan tiol. Estos fragmentos que llevan tiol pueden unirse entonces por medio de reacción con un aceptor de Michael tal como maleimida. Por ejemplo, los fragmentos Fab' pueden tratarse entonces con un reactivo (por ejemplo, maleimida-biotina) para unirse a al menos un resto de biotina (es decir, biotinilado) para facilitar la unión a superficies recubiertas con estreptavidina tal como se describió anteriormente.

Determinadas realizaciones utilizan ácidos nucleicos como componente de captura, por ejemplo, para cuando la molécula de analito es un ácido nucleico o una proteína de unión a ácido nucleico, o cuando se desea que el componente de captura sirva como aptámero para la unión a una proteína, tal como se conoce bien en la técnica.

Según una realización, cada superficie de unión de un objeto de captura comprende una pluralidad de componentes de captura. La pluralidad de componentes de captura, en algunos casos, puede distribuirse aleatoriamente sobre la superficie de unión como un “césped”. Alternativamente, los componentes de captura pueden estar segregados espacialmente en región/regiones distinta(s) y distribuidos de cualquier modo deseado.

La unión entre el componente de captura y la molécula de analito, en determinadas realizaciones, es específica, por ejemplo, como cuando el componente de captura y la molécula de analito son partes complementarias de un par de unión. En determinadas de tales realizaciones, el componente de captura se une tanto específica como directamente a la molécula de analito. Por “unirse específicamente” o “especificidad de unión”, quiere decirse que el componente de captura se une a la molécula de analito con especificidad suficiente como para diferenciar entre la molécula de analito y otros componentes o contaminantes de la muestra de prueba. Por ejemplo, el componente de captura, según una realización, puede ser un anticuerpo que se une específicamente a alguna parte de una molécula de analito (por ejemplo, un antígeno). El anticuerpo, según una realización, puede ser cualquier anticuerpo capaz de unirse específicamente a una molécula de analito de interés. Por ejemplo, los anticuerpos apropiados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (denominados algunas veces miméticos de anticuerpo), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (denominados algunas veces “conjugados de anticuerpos”), y fragmentos de cada uno, respectivamente. Como otro ejemplo, la molécula de analito puede ser un anticuerpo y el componente de captura puede ser un antígeno.

Según una realización en la que una partícula de analito es una célula biológica (por ejemplo, célula de mamífero, ave, reptil, otro vertebrado, insecto, levadura, bacteriana, etc.), el componente de captura puede ser un ligando que tienen afinidad específica por un antígeno de superficie celular (por ejemplo, un receptor de superficie celular). En una realización, el componente de captura es un receptor de molécula de adhesión o una parte del mismo, que tiene especificidad de unión por una molécula de adhesión celular expresada sobre la superficie de un tipo de célula diana. En uso, el receptor de molécula de adhesión se une con una molécula de adhesión en la superficie extracelular de la célula diana, inmovilizando o capturando de ese modo la célula. En una realización en la que la partícula de analito es una célula, el componente de captura es fibronectina, que tiene especificidad por, por ejemplo, partículas de analito que comprenden células neurales.

En algunas realizaciones, tal como apreciarán los expertos habituales en la técnica, es posible detectar moléculas de analito usando componentes de captura para los que la unión a moléculas de analito no es altamente específica. Por ejemplo, tales sistemas/métodos pueden usar diferentes componentes de captura tales como, por ejemplo, un panel de diferentes ligandos de unión, y la detección de cualquier molécula de analito particular se determina por medio de una “firma” de unión a este panel de ligandos de unión, similar a la manera en la que funcionan las “narices electrónicas”. Esto puede encontrar utilidad particular en la detección de determinados analitos de molécula pequeña. En algunas realizaciones, la afinidad de unión entre moléculas de analito y componentes de captura debe ser suficiente como para permanecer unidos en las condiciones del ensayo, incluyendo etapas de lavado para eliminar moléculas o partículas que no están unidas específicamente. En algunos casos, por ejemplo, en la detección de determinadas biomoléculas, la constante de unión de la molécula de analito con su componente de captura complementario puede ser de entre al menos aproximadamente 104 y aproximadamente 106 M-1, al menos aproximadamente 105 y aproximadamente 109 M-1, al menos aproximadamente 107 y aproximadamente 109 M-1, mayor de aproximadamente 109 M-1 o similares. Por ejemplo, afinidades típicas para anticuerpos IgG por sus antígenos están en el intervalo de 105-1010 M-1. La afinidad de la biotina por la estreptavidina es de 1015 M-1.

En determinadas realizaciones, el componente de captura se elige para que sea capaz de unirse a una pareja de unión correspondiente asociada con o unida a la molécula de analito. Por ejemplo, el componente de captura según una realización es un agente de reticulación químico tal como se describió anteriormente capaz de unirse a proteínas generalmente. Según una realización, cada molécula proteica en una muestra de fluido comprende una molécula de analito que se une a un agente de reticulación químico de este tipo. En otro ejemplo, el componente de captura comprende estreptavidina, que se une con alta afinidad a biotina, y por tanto captura cualquier molécula de analito a la que se le haya unido biotina. Alternativamente, el componente de captura puede ser biotina, y puede unirse estreptavidina a o asociarse con las moléculas de analito de modo que las moléculas de analito pueden capturase mediante la biotina.

Según una realización, las superficies de unión de un objeto de captura pueden funcionalizarse con componentes de captura de la siguiente manera. En primer lugar, la superficie de un objeto de captura se prepara para la unión del/de los componente(s) de captura modificándose para formar o unirse directamente a los componentes de captura, o puede añadirse un ligador a la superficie de unión del objeto de captura de modo que el/los componente(s) de captura se una(n) a la superficie de unión del objeto de captura por medio del ligador. En una realización, las superficies de unión del objeto de captura se derivatizan con una funcionalidad química tal como se describió anteriormente. A continuación, puede añadirse el componente de captura, que se une a y se inmoviliza mediante la funcionalidad química.

Analitos diana a modo de ejemplo

Tal como apreciarán los expertos en la técnica, puede detectarse un gran número de moléculas y partículas de analito y, opcionalmente, cuantificarse usando métodos de la presente invención; básicamente, cualquier molécula de analito que sea capaz de hacerse que quede inmovilizada con respecto a un objeto de captura (por ejemplo, por medio de una superficie de unión que comprende una pluralidad de componentes de captura) puede investigarse potencialmente usando la invención u otros métodos descritos en el presente documento. A continuación, se mencionan determinadas dianas más específicas de posible interés que pueden comprender una molécula de analito. La lista a continuación es a modo de ejemplo y no limitativa.

En algunas realizaciones, la molécula de analito puede ser una enzima. Los ejemplos no limitativos de enzimas incluyen una oxidorreductasa, transferasa, cinasa, hidrolasa, liasa, isomerasa, ligasa, y similares. Los ejemplos adicionales de enzimas incluyen, pero no se limitan a, polimerasas, catepsinas, calpaínas, amino-transferasas tales como, por ejemplo, AST y ALT, proteasas tales como, por ejemplo, caspasas, nucleótido ciclasas, transferasas, lipasas, enzimas asociadas con ataques cardiacos, y similares. Cuando se usa un sistema/método de la presente invención para detectar la presencia de agentes virales o bacterianos, las enzimas diana apropiadas incluyen polimerasas virales o bacterianas y otras de tales enzimas, incluyendo proteasas virales o bacterianas o similares.

En otras realizaciones, la molécula de analito puede comprender un componente enzimático. Por ejemplo, la partícula de analito puede ser una célula que tiene una enzima o componente enzimático presente sobre su superficie extracelular. Alternativamente, la partícula de analito es una célula que no tiene ningún componente enzimático sobre su superficie. Una célula de este tipo se identifica normalmente usando un método de ensayo indirecto descrito a continuación. Ejemplos no limitativos de componentes enzimáticos son peroxidasa del rábano, beta-galactosidasa y fosfatasa alcalina.

En aún otras realizaciones, la molécula de analito puede ser una biomolécula. Los ejemplos no limitativos de biomoléculas incluyen hormonas, anticuerpos, citocinas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, receptores y antígenos de membrana celular lipídica (receptores neurales, hormonales, de nutrientes y de superficie celular) o sus ligandos, o combinaciones de los mismos. Las realizaciones no limitativas de proteínas incluyen péptidos, polipéptidos, fragmentos proteicos, complejos proteicos, proteínas de fusión, proteínas recombinantes, fosfoproteínas, glicoproteínas, lipoproteínas o similares. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, hay un gran número de posibles moléculas de analito proteínicas que pueden detectarse o evaluarse para parejas de unión usando la presente invención. Además de enzimas, tal como se comentó anteriormente, las moléculas de analito proteicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, inmunoglobulinas, hormonas, factores de crecimiento, citocinas (muchas de las cuales sirven como ligandos para receptores celulares), marcadores de cáncer, etc. Los ejemplos no limitativos de biomoléculas incluyen PSA y TNF-alfa.

En determinadas realizaciones, la molécula de analito puede ser una proteína modificada postraduccionalmente (por ejemplo, fosforilación, metilación, glicosilación) y el componente de captura puede ser un anticuerpo específico para una modificación postraduccional. Las proteínas modificadas pueden capturarse con componentes de captura que comprenden una multiplicidad de anticuerpos específico y entonces las proteínas capturadas pueden unirse además a un ligando de unión que comprende un anticuerpo secundario con especificidad por una modificación postraduccional. Alternativamente, las proteínas modificadas pueden capturarse con componentes de captura que comprenden un anticuerpo específico para una modificación postraduccional y luego las proteínas capturadas pueden unirse además a ligandos de unión que comprenden anticuerpos específicos para cada proteína modificada.

En otra realización, la molécula de analito es un ácido nucleico. Un ácido nucleico puede capturarse con un fragmento de ácido nucleico complementario (por ejemplo, un oligonucleótido) y luego opcionalmente marcarse posteriormente con un ligando de unión que comprende un oligonucleótido complementario diferente.

Las moléculas y partículas de analito adecuadas incluyen, pero no se limitan a moléculas pequeñas (incluyendo compuestos orgánicos y compuestos inorgánicos), contaminantes ambientales (incluyendo pesticidas, insecticidas, toxinas, etc.), moléculas terapéuticas (incluyendo fármacos terapéuticos y usados indebidamente, antibióticos, etc.), biomoléculas (incluyendo hormonas, citocinas, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, receptores y antígenos de membrana celular (receptores neurales, hormonales, de nutrientes y de superficie celular) o sus ligandos, etc.), células completas (incluyendo células procariotas (tales como bacterias patógenas) y eucariotas, incluyendo células tumorales de mamífero), virus (incluyendo retrovirus, virus del herpes, adenovirus, lentivirus, etc.), esporas, etc.

La muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene una molécula de analito puede derivarse de cualquier fuente adecuada. En algunos casos, la muestra puede comprender un líquido, sólido particulado fluente, suspensión fluida de partículas sólidas, fluido supercrítico y/o gas. En algunos casos, la molécula de analito puede separarse o purificarse de su fuente antes de la determinación; sin embargo, en determinadas realizaciones, puede someterse a prueba directamente una muestra no tratada que contiene la molécula de analito. La fuente de la molécula de analito puede ser sintética (por ejemplo, producida en un laboratorio), el entorno (por ejemplo, aire, suelo, etc.), un mamífero, un animal, una planta, o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo particular, la fuente de una molécula de analito es una sustancia corporal humana (por ejemplo, sangre, suero, plasma, orina, saliva, tejido, órgano o similares). El volumen de la muestra de fluido analizado puede ser potencialmente cualquier cantidad dentro de un amplio intervalo de volúmenes, dependiendo de varios factores tales como, por ejemplo, el número de objetos de captura usados/disponibles, el número de ubicaciones usadas/disponibles, etc. En unas cuantas realizaciones a modo de ejemplo particulares, el volumen de muestra puede ser de aproximadamente 0,01 ul, aproximadamente 0,1 ul, aproximadamente 1 ul, aproximadamente 5 ul, aproximadamente 10 ul, aproximadamente 100 ul, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 5 ml, aproximadamente 10 ml o similares. En algunos casos, el volumen de la muestra de fluido es de entre aproximadamente 0,01 ul y aproximadamente 10 ml, entre aproximadamente 0,01 ul y aproximadamente 1 ml, entre aproximadamente 0,01 ul y aproximadamente 100 ul, o entre aproximadamente 0,1 ul y aproximadamente 10 ul.

En algunos casos, la muestra de fluido puede diluirse antes de su uso en un ensayo. Por ejemplo, en realizaciones en las que la fuente de una molécula de analito es un fluido corporal humano (por ejemplo, sangre, suero), el fluido puede diluirse con un disolvente apropiado (por ejemplo, un tampón tal como tampón PBS). Una muestra de fluido puede diluirse aproximadamente 1 vez, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 10 veces, o más, antes de su uso. La muestra puede añadirse a una disolución que comprende la pluralidad de objetos de captura, o la pluralidad de objetos de captura pueden añadirse directamente a o como una disolución a la muestra.

Ligandos de unión y agentes de marcaje precursores/agente de marcaje

Pueden seleccionarse ligandos de unión de cualquier molécula, partícula adecuada o similares, tal como se comenta a continuación, capaz de asociarse con una molécula de analito y/o de asociarse con otro ligando de unión. Determinados ligandos de unión pueden comprender una entidad que es capaz de facilitar la detección, o bien directamente (por ejemplo, por medio de un resto detectable) o bien indirectamente. Un componente puede facilitar la detección indirecta, por ejemplo, convirtiendo una molécula de agente de marcaje precursor en una molécula de agente de marcaje (por ejemplo, un agente que se detecta en un ensayo). En algunas realizaciones, el ligando de unión puede comprender un componente enzimático (por ejemplo, peroxidasa del rábano, beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc.). Un primer tipo de ligando de unión puede usarse o no conjuntamente con ligandos de unión adicionales (por ejemplo, segundo tipo, etc.), tal como se comenta en el presente documento.

En algunas realizaciones, la pluralidad de objetos de captura, al menos alguno de los cuales comprende al menos una molécula de analito, puede exponerse a una pluralidad de ligandos de unión de modo que un ligando de unión se asocia con al menos alguno de la pluralidad de moléculas de analito. En realizaciones en las que una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura se asocia con una única molécula de analito y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ninguna molécula de analito (por ejemplo, cuando el número de moléculas de analito es de menos del número total de objetos de captura), un ligando de unión puede asociarse con sustancialmente todas las moléculas de analito inmovilizadas con respecto a un objeto de captura. En algunos casos, más de aproximadamente el 80 %, más de aproximadamente el 85 %, más de aproximadamente el 90 %, más de aproximadamente el 95 %, más de aproximadamente el 97 %, más de aproximadamente el 98 %, más de aproximadamente el 99 % o más, moléculas de analito pueden quedar asociadas con un ligando de unión.

En otras realizaciones, cuando sustancialmente todos los objetos de captura comprenden al menos una molécula de analito (por ejemplo, en realizaciones en las que el número de moléculas de analito es aproximadamente igual a o mayor que el número de objetos de captura proporcionados), los objetos de captura pueden exponerse al ligando de unión de modo que una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura se asocian con al menos un ligando de unión (o en determinadas realizaciones sustancialmente solo un único ligando de unión) y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ningún ligando de unión. En algunos casos, los objetos de captura pueden exponerse a los ligandos de unión de modo que al menos algunos de los objetos de captura se asocian con al menos un ligando de unión y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ningún ligando de unión. Puede realizarse una prueba de examen para determinar una cantidad apropiada de ligando de unión para su uso para lograr un grado deseado de carga de ligando de unión (por ejemplo, para facilitar la selección de una cantidad apropiada de ligando de unión para su uso para una situación particular) con patrones de calibración que contienen una concentración conocida de molécula de analito y cantidades variables de ligando de unión usando un análisis de Poisson. En determinadas realizaciones, se determina si el analito está esencialmente marcado completamente o solo parcialmente marcado con ligando de unión. El porcentaje de moléculas de analito activas (es decir, las asociadas con ligando de unión) detectado puede convertirse en el porcentaje de moléculas de analito asociadas con cero, uno, dos, etc. ligandos de unión usando ajuste de distribución de Poisson tal como se describe en otra parte en el presente documento.

En algunas realizaciones, puede usarse más de un tipo de ligando de unión. En algunas realizaciones, puede proporcionarse un primer tipo de ligando de unión y un segundo tipo de ligando de unión. En algunos casos, pueden proporcionarse al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos ocho, al menos diez o más, tipos de ligandos de unión. Cuando una pluralidad de objetos de captura, algunos de los cuales están asociados con al menos una molécula de analito, se expone a una pluralidad de tipos de ligando de unión, al menos alguna de la pluralidad de moléculas de analito inmovilizadas puede asociarse con al menos uno de cada tipo de ligando de unión. Los ligandos de unión pueden seleccionarse de modo que interaccionan entre sí en una variedad de diferentes maneras. En un primer ejemplo, el primer tipo de ligando de unión puede ser capaz de asociarse con una molécula de analito y el segundo tipo de ligando de unión puede ser capaz de asociarse con el primer tipo de ligando de unión. En tales realizaciones, el primer tipo de ligando de unión puede comprender un primer componente que ayuda en la asociación de la molécula de analito y un segundo componente que ayuda en la asociación del segundo tipo de ligando de unión con el primer tipo de ligando de unión. En una realización particular, el segundo componente es biotina y el segundo tipo de ligando de unión comprende una enzima o un componente enzimático que se asocia con la biotina.

Como otro ejemplo, tanto el primer tipo de ligando de unión como el segundo tipo de ligando de unión pueden asociarse directamente con una molécula de analito. Sin querer restringirse a la teoría o cualquier mecanismo particular, la asociación de tanto el primer tipo como el segundo tipo de ligando de unión puede proporcionar especificidad y fiabilidad adicionales en la realización de un ensayo, identificando solo ubicaciones que se determina que contienen tanto el primer tipo de ligando de unión y/o el segundo tipo de ligando de unión (por ejemplo, a través de detección o bien directa o bien indirecta) como que contienen una molécula de analito. Tales métodos de ensayo pueden reducir el número de falsos positivos provocados por la unión no específica ya que las ubicaciones que se encuentra que tienen solo un único tipo de ligando de unión (por ejemplo, solo el primer tipo de agente de marcaje o el segundo tipo de agente de marcaje) no se considerarían o contarían como una ubicación que comprende una molécula de analito. El primer tipo de ligando de unión puede comprender un primer tipo de componente enzimático y el segundo tipo de ligando de unión puede comprender un segundo tipo de componente enzimático que difiere del primer tipo de componente enzimático. Un objeto de captura que comprende una molécula de analito, el primer tipo de ligando de unión y el segundo tipo de ligando de unión puede exponerse a un primer tipo de agente de marcaje precursor que se convierte en un primer tipo de agente de marcaje (por ejemplo, que comprende una primera propiedad medible) tras la exposición al primer tipo de componente enzimático y un segundo tipo de agente de marcaje precursor que se convierte en un segundo tipo de agente de marcaje (por ejemplo, que comprende una propiedad medible que puede distinguirse de la primera propiedad medible) tras la exposición al segundo tipo de componente enzimático. Por tanto, solo las ubicaciones que se determina que contienen el primer tipo de agente de marcaje y el segundo tipo de agente de marcaje se determina que contienen una molécula de analito. Como otro ejemplo, el primer tipo de ligando de unión y el segundo tipo de ligando de unión pueden incorporar cada uno un componente (por ejemplo, tal como una etiqueta de ADN) y un tercer tipo de ligando de unión puede comprender dos componentes complementarios a los componentes del primer tipo y segundo tipo de ligandos de unión (por ejemplo, dos tipos de etiquetas de ADN complementarias), en el que el tercer tipo de ligando de unión también comprende una molécula o resto para la detección directa o indirecta (por ejemplo, se requiere que la presencia del tercer tipo de ligando de unión en un recipiente de reacción determine la presencia o ausencia de una molécula de analito en una ubicación). Cuando tanto el primer tipo de ligandos de unión como el segundo tipo de ligandos de unión están presentes en sustancialmente proximidad estrecha entre sí (por ejemplo, por medio de asociación con una molécula de analito), puede producirse la asociación del tercer tipo de ligando de unión, permitiendo así la detección de la molécula de analito. Se describe más información con respecto al uso de más de un tipo de ligando de unión de una manera que puede reducir determinados efectos negativos asociados con la unión no específica en la solicitud de patente estadounidense de propiedad común con número de serie 12/731 135, titulada “Ultra-Sensitive Detection of Molecules using Dual Detection Methods” de Duffy et al., presentada el 24 de marzo de 2010, y la solicitud de patente internacional n.° (PCT/US2011/026657), titulada “Ultra-Sensitive Detection of Molecules using Dual Detection Methods” de Duffy et al., presentada el 1 de marzo de 2011.

Detección

La pluralidad de objetos de captura, algunos de los cuales comprenden al menos una molécula de analito y/o al menos un ligando de unión, puede detectarse y/o cuantificarse, y la detección y/o cuantificación pueden estar relacionadas con la presencia y, opcionalmente, la cantidad y/o concentración de moléculas/partículas de analito en la muestra que está sometiéndose a prueba. En algunas realizaciones, la pluralidad de objetos de captura puede detectarse y/o cuantificarse segregando espacialmente la pluralidad de objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones. En algunas realizaciones, la pluralidad de ubicaciones comprende una pluralidad de recipientes de reacción (por ejemplo, en una matriz). En algunos casos, un detector puede estar configurado para detectar los objetos de captura en o a una pluralidad de ubicaciones (por ejemplo, una matriz de recipientes de reacción). En algunas realizaciones, los objetos de captura pueden ser capaces de producir o hacerse que produzcan una señal detectable, por ejemplo, emisión de fluorescencia, lo que puede ayudar en la detección de los objetos de captura. En algunos casos, los objetos de captura pueden detectarse usando técnicas de dispersión, tal como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, el número de objetos de captura segregados espacialmente puede ser sustancialmente igual al número de objetos de captura expuestos a una muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene moléculas de analito. En algunas realizaciones, sin embargo, el número de objetos de captura segregados espacialmente en una pluralidad de ubicaciones puede ser sustancialmente menor del número de objetos de captura expuestos a una muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene moléculas de analito. En algunos casos, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 % o más, de los objetos de captura expuestos a una muestra de fluido están segregados espacialmente en una pluralidad de ubicaciones. En algunos casos, entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 99 %, entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 90 %, entre aproximadamente el 20 % y aproximadamente el 80 %, entre aproximadamente el 30 % y aproximadamente el 70 %, entre aproximadamente el 50 % y aproximadamente el 90 %, entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 50 %, entre aproximadamente el 5 % y aproximadamente el 40 %, o entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 30 % de los objetos de captura expuestos a una muestra de fluido están segregados espacialmente en una pluralidad de ubicaciones.

Las moléculas de analito (o ligandos de unión) que están segregados espacialmente pueden detectarse y/o cuantificarse directa o indirectamente. En el caso de detección directa, las moléculas de analito pueden comprender una molécula o un resto que puede interrogarse y/o detectarse directamente, por ejemplo, una entidad fluorescente (por ejemplo, un resto fluorescente, una perla fluorescente, un anticuerpo fluorescente, etc.), una nanopartícula de metal o nanoagrupación (por ejemplo, una nanoagrupación o nanopartícula de oro, nanoagrupación o nanopartícula de plata), un punto cuántico (por ejemplo, punto cuántico de CdSe, punto cuántico de CdTe, etc.), e isótopos radiactivos. En realizaciones en las que el ensayo comprende el uso de uno o más tipos de ligandos de unión, los ligandos de unión pueden comprender molécula(s) o resto(s) que puede(n) interrogarse y/o detectarse directamente. Una ubicación que comprende una molécula de analito de este tipo o ligando de unión que comprende un resto que puede interrogarse y/o detectarse directamente puede hacerse que emita una señal tras la interrogación de la ubicación.

En algunas realizaciones, pueden emplearse métodos de detección no enzimáticos. Los expertos habituales en la técnica conocerán métodos de detección no enzimáticos. Los ejemplos no limitativos incluyen dispersión de Raman, métodos de resonancia por radiación electromagnética (por ejemplo, modos de galería susurrante), espectroscopía (por ejemplo, espectroscopías infrarroja, atómica), absorbancia, transducción piezoeléctrica (por ejemplo, microbalanza de cristal de cuarzo (QCM)), dicroísmo circular, microscopías electrónicas (por ejemplo, microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía fotoelectrónica de rayos x (XPS)), microscopías de sonda de barrido (por ejemplo, microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía de barrido por tunelaje (STM)), dispersión de luz; resonancia de plasmón superficial (SPR), detección de ondas evanescentes, interferometría óptica y otros métodos basados en la medición de cambios en el índice de refracción, métodos de transducción eléctrica, tales como conducción y capacitancia; efectos de transducción magnética (por ejemplo, efecto magnetorresistivo), calorimetría (por ejemplo, calorimetría diferencial de barrido (DSC)), difracción; resonancia magnética nuclear (NMR), resonancia paramagnética electrónica (EPR), espectrometría de masas (por ejemplo, ionización y desorción por láser asistida por matriz (MALDI)), tecnologías de fluorescencia (por ejemplo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), fluorescencia de resolución temporal (TRF), polarización de fluorescencia (FP)) y canalización de oxígeno luminiscente (LOCI).

En algunas realizaciones, la pluralidad de moléculas de analito (o ligandos de unión) se detecta indirectamente. El enfoque indirecto puede incluir, por ejemplo, exponer una molécula de analito, o un ligando de unión asociado con una molécula de analito, a un agente de marcaje precursor, en el que el agente de marcaje precursor se convierte en un agente de marcaje tras la exposición a la molécula de analito o el ligando de unión asociado con una molécula de analito. El agente de mareaje puede comprender una molécula o un resto que puede interrogarse y/o detectarse. La presencia o ausencia de una molécula de analito o ligando de unión en una ubicación puede determinarse entonces determinando la presencia o ausencia de un agente de marcaje a/en la ubicación. Por ejemplo, la molécula de analito puede comprender un componente enzimático y la molécula de agente de marcaje precursor puede ser una molécula de agente de marcaje precursor cromogénica, flurogénica o quimioluminiscente que se convierte en un producto cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente (cada uno un ejemplo de un agente de marcaje) tras la exposición al agente de conversión. En este caso, el agente de marcaje precursor puede ser una etiqueta enzimática, por ejemplo, un agente de marcaje precursor enzimático cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente, que, tras el contacto con el componente enzimático, se convierte en un agente de marcaje, que es detectable. En algunos casos, el agente de marcaje precursor cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente se proporciona en una cantidad suficiente para entrar en contacto con cada ubicación. En algunas realizaciones, un agente de marcaje precursor electroquimioluminiscente se convierte en un agente de marcaje electroquimioluminiscente. En algunos casos, el componente enzimático puede comprender beta-galactosidasa, peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina.

Tal como entenderán los expertos habituales en la técnica, puede seleccionarse una variedad de agentes de marcaje precursores enzimáticos cromogénicos, fluorogénicos o quimioluminiscentes apropiados para su conversión mediante muchas enzimas diferentes. Por tanto, cualquier agente de marcaje precursor enzimático cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente conocido capaz de producir un agente de marcaje en una reacción con una enzima particular puede usarse potencialmente en la presente invención como agente de marcaje precursor en realizaciones en las que la molécula de analito o un ligando de unión asociado con una molécula de analito comprende un componente enzimático. Por ejemplo, muchos agentes de marcaje precursores cromogénicos, fluorogénicos o quimioluminiscentes adecuados para su uso como molécula de agente de marcaje precursor enzimático se divulgan en The Handbook -A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, décima ed., capítulo 10.

En otra realización, la molécula de analito puede ser una proteína y el ligando de unión puede comprender un componente que es capaz de unirse a tanto la molécula de analito como a un componente enzimático. La exposición de la molécula de agente de marcaje precursor al componente enzimático unido al ligando de unión puede convertir la molécula de agente de marcaje precursor en una molécula de agente de marcaje cromogénica, fluorogénica o quimioluminiscente que puede detectarse.

Dos ejemplos no limitativos de detección indirecta de una molécula de analito se ilustran en las figuras 9A y 9B. En la figura 9A, se proporciona una ubicación 150 (en esta realización, representada por un recipiente de reacción) que comprende el objeto 152 de captura (en esta realización, representado por una perla). La molécula 154 de analito se inmoviliza con respecto al objeto 152 de captura por medio del componente 156 de captura. El recipiente de reacción se expone al agente 158 de marcaje precursor, que tras la exposición a la molécula 154 de analito, se convierte en la molécula 160 de agente de marcaje, tal como se indica mediante la flecha 159. Como otro ejemplo, en la figura 9B, se proporciona la ubicación 170 (en esta realización, representada por un recipiente de reacción) que comprende el objeto 172 de captura (en esta realización, representado por una perla). La molécula 174 de analito se inmoviliza con respecto al objeto 172 de captura por medio del componente 176 de captura, y el ligando 177 de unión se asocia con la molécula 174 de analito. El recipiente de reacción se expone al agente 158 de marcaje precursor, que tras la exposición al ligando 177 de unión, se convierte en una molécula 180 de agente de marcaje, tal como se indica mediante la flecha 179.

En algunas realizaciones, una pluralidad de ubicaciones puede abordarse y/o una pluralidad de objetos de captura y/o especies/moléculas/partículas de interés pueden detectarse de manera sustancialmente simultánea. “De manera sustancialmente simultánea” cuando se usa en este contexto, se refiere a abordar/detectar las ubicaciones/objetos de captura/especies/moléculas/partículas de interés a aproximadamente el mismo tiempo de modo que se solapan los periodos de tiempo durante los que al menos dos ubicaciones/objetos de captura/especies/moléculas/partículas de interés se abordan/detectan, en contraposición a abordarse/detectarse secuencialmente, en donde no se solaparían. Abordar/detectar simultáneamente puede lograrse usando diversas técnicas, incluyendo técnicas ópticas (por ejemplo, detector de CCD). Segregar espacialmente objetos de captura/especies/moléculas/partículas en una pluralidad de ubicaciones diferenciadas, resolubles, según algunas realizaciones facilita sustancialmente la detección simultánea permitiendo que se aborden múltiples ubicaciones de manera sustancialmente simultánea. Por ejemplo, para realizaciones en las que especies/moléculas/partículas individuales están asociadas con objetos de captura que están segregados espacialmente con respecto a los otros objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones diferenciadas, resolubles por separado durante la detección, abordar de manera sustancialmente simultánea la pluralidad de ubicaciones diferenciadas, resolubles por separado permite que se resuelvan objetos de captura individuales, y por tanto especies/moléculas/partículas individuales (por ejemplo, moléculas de analito). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se reparten moléculas/partículas individuales de una pluralidad de moléculas/partículas a lo largo de una pluralidad de recipientes de reacción de modo que cada recipiente de reacción contiene cero o solo una especie/molécula/partícula. En algunos casos, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, al menos aproximadamente el 99,5 % de todas las especies/moléculas/partículas están separadas espacialmente con respecto a las otras especies/moléculas/partículas durante la detección. Una pluralidad de especies/moléculas/partículas puede detectarse de manera sustancialmente simultánea en el plazo de un periodo de tiempo de menos de aproximadamente 1 segundo, menos de aproximadamente 500 milisegundos, menos de aproximadamente 100 milisegundos, menos de aproximadamente 50 milisegundos, menos de aproximadamente 10 milisegundos, menos de aproximadamente 1 milisegundo, menos de aproximadamente 500 microsegundos, menos de aproximadamente 100 microsegundos, menos de aproximadamente 50 microsegundos, menos de aproximadamente 10 microsegundos, menos de aproximadamente 1 microsegundo, menos de aproximadamente 0,5 microsegundos, menos de aproximadamente 0,1 microsegundos, o menos de aproximadamente 0,01 microsegundos, menos de aproximadamente 0,001 microsegundos, o menos. En algunas realizaciones, la pluralidad de especies/moléculas/partículas puede detectarse de manera sustancialmente simultánea en el plazo de un periodo de tiempo de entre aproximadamente 100 microsegundos y aproximadamente 0,001 microsegundos, entre aproximadamente 10 microsegundos y aproximadamente 0,01 microsegundos, o menos.

En algunas realizaciones, pueden usarse técnicas para impedir o reducir la disociación de una molécula de analito de un componente de captura y/u objeto de captura, y/o para impedir o reducir la disociación de un ligando de unión de una molécula de analito y/u otro ligando de unión. Tal como conocerán los expertos habituales en la técnica, algunas interacciones de afinidad reversibles entre moléculas de analito, componentes de captura y/o ligandos de unión seleccionados (por ejemplo, entre un anticuerpo y un antígeno) están regidas por la termodinámica. Por consiguiente, en algún momento durante determinados métodos de ensayo, puede producirse algo de disociación entre una molécula de analito y un componente de captura y/o un ligando de unión, y/o entre un ligando de unión y una molécula de analito y/u otro ligando de unión. Esto puede dar como resultado un número reducido de moléculas de analito (por ejemplo, inmunocomplejos) que están detectándose que las realmente presentes. La constante de disociación de un par de componentes particular (por ejemplo, par de anticuerpo-antígeno), el lavado y/o exposición a fluido, el tiempo entre la exposición y la interrogación, y/u otros factores, pueden afectar al grado en el que un acontecimiento de disociación altera la determinación de moléculas y/o partículas de analito. Por consiguiente, pueden usarse determinadas técnicas para reducir los efectos de los procesos de disociación.

En una primera realización, la disociación puede reducirse o eliminarse retirando fluidos de las ubicaciones de ensayo (por ejemplo, pocillos) tras la segregación espacial de una pluralidad de moléculas de analito (por ejemplo, asociadas con un objeto de captura por medio de un componente de captura y/o asociadas con al menos un ligando de unión) en una pluralidad de tales ubicaciones. Es decir, todo o sustancialmente todo el fluido circundante o sustancialmente contenido en las ubicaciones puede retirarse. Por ejemplo, el fluido puede retirarse mediante secado con aire y/o a vacío. La retirada del fluido puede reducir o eliminar la disociación. Inmediatamente antes de la interrogación de las ubicaciones, puede añadirse un fluido a las ubicaciones rehidratando de ese modo los complejos para facilitar la interrogación usando un detector.

En un ejemplo específico, una pluralidad de moléculas de analito se asocia (por ejemplo, por medio de un objeto de captura) con perlas (una realización de objetos de captura). Las perlas, y por tanto las moléculas de analito, se asocian opcionalmente con al menos un ligando de unión y/o se exponen a un material (por ejemplo, un tampón) para mantener las moléculas de analito y/o ligandos de unión hidratados (por ejemplo, pueden exponerse inmunocomplejos a un tampón que contiene un determinado hidrato de carbono). Tras cargar las perlas en una pluralidad de pocillos (por ejemplo, ubicaciones), se retira la disolución en exceso (por ejemplo, tampones) mediante secado con aire y/o a vacío. En esta realización, eliminando el contacto de las perlas con disolución a granel, la disociación de las moléculas de analito y/o ligandos de unión se elimina esencialmente o se reduce sustancialmente en comparación con un sistema similar en el que el fluido no se retira. En este caso, los pocillos que comprenden las perlas pueden almacenarse (por ejemplo, durante 1 min, 2 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas o más) con nada o sustancialmente nada (por ejemplo, menos de aproximadamente el 20 %, menos de aproximadamente el 15%, menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 4 %, menos de aproximadamente el 3 %, menos de aproximadamente el 2 %, menos de aproximadamente el 1 %, menos de aproximadamente el 0,5 %, menos de aproximadamente el 0,3 %, menos de aproximadamente el 0,1 %, menos de aproximadamente el 0,01 %, o menos) de disociación de las moléculas de analito (y/o ligandos de unión). Inmediatamente antes de o cerca del momento en el que se realizan las interrogaciones de los pocillos (por ejemplo, aproximadamente 1 segundo, aproximadamente 5 segundos, aproximadamente 10 segundos, aproximadamente 30 segundos, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos o aproximadamente 5 minutos antes), puede proporcionarse una disolución a los pocillos, opcionalmente seguido por sellado (por ejemplo, antes de la interrogación). Véase, por ejemplo, el ejemplo 22.

En una segunda realización, la disociación puede reducirse o eliminarse reticulando una molécula de analito con un componente de captura, y/o reticulando un ligando de unión con una molécula de analito y/o un segundo ligando de unión. Por ejemplo, una molécula de analito que comprende un antígeno puede reticularse con un ligando de unión y/o componente de captura que comprende un anticuerpo. Los expertos habituales en la técnica conocen métodos y técnicas de reticulación que pueden emplearse. En algunos casos, tras la asociación de una molécula de analito con un componente de captura (por ejemplo, asociado con un objeto de captura) y/o la asociación de un ligando de unión con la molécula de analito y/o un segundo ligando de unión, el complejo puede exponerse a un reactivo de reticulación (por ejemplo, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (es decir, EDC), glutaraldehído, etc.), promoviendo de ese modo la reacción de reticulación deseada. El reactivo de reticulación puede seleccionarse según las propiedades de los reactivos usados para el ensayo, y pueden considerarse diversos factores incluyendo la longitud del reactivo de reticulación y/o los grupos funcionales necesarios cuando se selecciona un agente de reticulación, tal como entenderían los expertos en la técnica. El reactivo de reticulación en exceso puede retirarse opcionalmente y/o los grupos de reticulación sin reaccionar pueden extinguirse antes de la interrogación y/o antes de la exposición a un precursor de agente de marcaje u otro reactivo. El ensayo puede llevarse a cabo entonces según los métodos tal como se describe en el presente documento. Véase, por ejemplo, el ejemplo 23.

Se muestra un ejemplo no limitativo de una reacción de reticulación en la figura 10A. En esta figura, la perla 502 que comprende el componente de captura 504 (por ejemplo, anticuerpos de captura) se asocia con la molécula 506 de analito. La molécula 506 de analito se asocia también con el ligando 508 de unión. El complejo 507 se expone al reactivo 510 de reticulación y se produce una reacción tal como se indica mediante la flecha 511. El primer reactivo 512 de reticulación forma una reticulación entre la molécula 506 de analito y el componente 504 de captura y el reactivo 514 de reticulación forma una reticulación entre la molécula 506 de analito y el ligando 508 de unión.

Como otro ejemplo, el ligando de unión puede comprender un componente de reticulación capaz de formar una reticulación entre dos componentes (por ejemplo, una molécula de analito y un ligando de unión, o un componente de captura y una molécula de analito, o un primer ligando de unión y un segundo ligando de unión), tal como se muestra en la figura 10B. En esta figura, la perla 522 que comprende el componente 524 de captura (por ejemplo, anticuerpo de captura) se asocia con la molécula 526 de analito. La molécula 526 de analito también se asocia con el ligando 528 de unión que comprende el componente 530 de reticulación. Tras la exposición a un estímulo externo (por ejemplo, luz UV, estímulo químico, etc.), tal como se indica mediante la flecha 531, se forma la reticulación 532 entre la molécula 526 de analito y el ligando 524 de unión. Los ejemplos no limitativos de componentes de reticulación útiles con este propósito incluyen hexanoato de N-succinimidil-6-[4'-azido-2'-nitrofenilamino]) (es decir, SANPAH) y 6-(4,4'-azipentanamido)hexanoato de succinimidilo (es decir, LC-SDA).

Durante la etapa del método en el que se abordan las ubicaciones en las que los objetos de captura/moléculas de analito se han segregado, puede determinarse cualquiera de una variedad de parámetros. En algunas realizaciones, se determina el número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura y una molécula de analito (o ligando de unión). El número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura pero que no comprenden una molécula de analito (o ligando de unión) también puede determinarse. En algunos casos, también puede determinarse el número de ubicaciones que se abordan que no contienen un objeto de captura. En todavía aún otros casos, también puede determinarse el número total de ubicaciones abordadas. Puede hacerse una única interrogación o múltiples interrogaciones de cualquier subconjunto o de todas las ubicaciones abordadas en última instancia a cualquier tiempo dado para facilitar una o todas las determinaciones descritas anteriormente. Por ejemplo, puede completarse una primera determinación bajo un primer intervalo de longitudes de onda (por ejemplo, luz blanca) para determinar el número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura, en la que las ubicaciones no se distinguen en cuanto a si una molécula de analito (o ligando de unión) se asocia con el objeto de captura, y puede completarse una segunda determinación de las mismas o algún subconjunto de las ubicaciones bajo un segundo intervalo de longitudes de onda (por ejemplo, fluorescencia) para determinar el número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura asociado con una molécula de analito (o ligando de unión). Se describen a continuación métodos de detección a modo de ejemplo.

Métodos de detección

En algunas realizaciones, en los sistemas/métodos en los que las especies que van a detectarse se reparten a lo largo de una pluralidad de ubicaciones, las ubicaciones pueden interrogarse usando una variedad de técnicas, incluyendo técnicas conocidas por los expertos habituales en la técnica.

En una realización específica de la presente invención, las ubicaciones se interrogan ópticamente. Las ubicaciones que presentan cambios en su firma óptica pueden identificarse mediante un tren óptico y sistema de detección óptica convencionales. Dependiendo de las especies detectadas (por ejemplo, moléculas de agente de marcaje, partículas, etc.) y las longitudes de onda de funcionamiento, pueden emplearse filtros ópticos diseñados para una longitud de onda particular para la interrogación óptica de las ubicaciones.

En realizaciones en las que se usa interrogación óptica, el sistema puede comprender más de una fuente de luz y/o una pluralidad de filtros para ajustar la longitud de onda y/o intensidad de la fuente de luz. Por ejemplo, en algunos casos, una primera interrogación de las ubicaciones puede realizarse usando luz de un primer intervalo de longitudes de onda (por ejemplo, luz blanca en realizaciones en las que los objetos de captura no son fluorescentes, o un intervalo de longitud de onda en el que los objetos de captura son fluorescentes), mientras que una segunda interrogación se realiza usando luz de un segundo intervalo de longitudes de onda diferente, de modo que la pluralidad de moléculas detectables es fluorescente. A continuación, se proporciona una configuración del sistema a modo de ejemplo (véase la figura 11).

En algunas realizaciones, la señal óptica de una pluralidad de ubicaciones se captura usando una cámara CCD. Otros ejemplos no limitativos de tipos de obtención de imágenes con cámaras que pueden usarse para capturar imágenes incluyen dispositivos de inyección de carga (CID), dispositivos semiconductores de óxido de metal complementarios (CMOS), dispositivos CMOS científicos (sCMOS) y dispositivos de integración de retardo temporal (t Di), tal como conocerán los expertos habituales en la técnica. La cámara puede obtenerse de una fuente comercial. Los CID son dispositivos de obtención de imágenes de múltiples píxeles bidimensionales, en estado sólido similares a CCD, pero difieren en cómo se captura y se lee la imagen. Para ejemplos de CID, véase la patente estadounidense n.° 3521 244 y la patente estadounidense n.° 4016550. Los dispositivos CMOS son también dispositivos de obtención de imágenes en estado sólido, bidimensionales, pero difieren de las matrices de CCD convencionales en cómo se recoge y se lee la carga. Los píxeles se construyen en una plataforma de tecnología de semiconductores que fabrica transistores de CMOS permitiendo así una ganancia significativa en la señal de la electrónica de lectura sustancial y la electrónica de corrección significativa construida sobre el dispositivo. Por ejemplo, véase la patente estadounidense n.° 5883830. Los dispositivos sCMOS comprenden la tecnología de obtención de imágenes de CMOS con determinadas mejoras tecnológicas que permiten una excelente sensibilidad e intervalo dinámico. Los dispositivos de TDI emplean un dispositivo de CCD que permite que columnas de píxeles se desplacen a una columna adyacente y se permite que continúe la recogida de luz. Este tipo de dispositivo se usa normalmente de una manera tal que el desplazamiento de la columna de píxeles es síncrono con el movimiento de la imagen que está recogiéndose de modo que puede integrarse una imagen en movimiento durante un periodo de tiempo significativo y no se vuelve borrosa por el movimiento relativo de la imagen sobre la cámara. En algunas realizaciones, podría usarse un sistema de espejo de barrido acoplado con un fotodiodo o tubo fotomultiplicador (PMT) para la obtención de imágenes.

En una realización, la pluralidad de ubicaciones se forma directamente como una pluralidad de recipientes de reacción en un extremo de un haz de fibra óptica. Según una realización, la matriz de recipientes de reacción para la presente invención puede usarse conjuntamente con un sistema de detección óptica tal como el sistema descrito en la publicación estadounidense n.° 2003/0027126. Por ejemplo, según una realización, la matriz de recipientes de reacción de la presente invención se forma en un extremo de un conjunto de fibra óptica que comprende un haz de fibra óptica construido de fibras revestidas de modo que la luz no se mezcla entre las fibras.

Las figuras 11A y 11B muestran ejemplos no limitativos de un sistema según algunas realizaciones. El sistema comprende una fuente 452 de luz, un filtro 454 de excitación, un espejo 458 dicromático, un filtro 460 de emisión, un objetivo 470 y una matriz 472. La luz 453 procedente de la fuente 452 de luz pasa a través del filtro 454 de excitación. La luz se refleja en el espejo 458 dicromático, pasa a través del objetivo 470 y reluce sobre la matriz 472. En algunos casos, la luz 464 parásita puede reducirse mediante una función 468 de reducción de luz parásita, tal como un iris o apertura. La luz 47l emitida desde la matriz pasa a través del objetivo 470 y el filtro 460 de emisión. Se observa la luz 462. El sistema puede comprender componentes adicionales (por ejemplo, filtros, espejos, dispositivos de aumento adicionales, etc.) según sea necesario para aplicaciones particulares, tal como entenderían los expertos habituales en la técnica.

El sistema mostrado en la figura 11A puede comprender adicionalmente componentes que ayudan en la determinación del número de recipientes de reacción que contienen un objeto de captura (por ejemplo, usando luz blanca). Alternativamente, los componentes adicionales pueden usarse para determinar el número total de ubicaciones y/o proporcionar espacialmente información referente a la posición de las ubicaciones (por ejemplo, que contienen o no contienen un objeto de captura), lo que puede ayudar a corroborar las señales observadas bajo diferentes regímenes de luz (por ejemplo, fluorescencia, luz blanca) correspondientes con la posición de una ubicación (por ejemplo, puede crearse una máscara).

En las figuras 11A y 11B, se emite luz de excitación desde la fuente 452 y se colima para dar un rayo 453. El filtro 454 de excitación puede estar configurado para transmitir solo la banda de longitud de onda que excita el fluoróforo (por ejemplo, 575 nm /-10 nm para resorufina). La luz de excitación se refleja hacia abajo mediante el filtro 458 dicroico y excita el sustrato 472 que contiene la muestra a través de la lente 470 objetivo. La luz de la imagen se recoge mediante la lente 470 objetivo, se colima para dar un rayo 471 y se transmite a través del filtro 458 dicroico. Solo la luz de la imagen correspondiente a la banda de longitud de onda de fluorescencia (por ejemplo, 670 nm /- 30 nm para resorufina) se transmite a través del filtro 460 de emisión. El rayo 462 colimado restante contiene solo las longitudes de onda de fluorescencia emitidas que posteriormente formarán la imagen a través del sistema de cámara.

Puede usarse el mismo sistema para determinar el posicionamiento de las ubicaciones que contienen muestra (por ejemplo, recipientes de reacción). La matriz que comprende los recipientes de reacción que contienen objetos de captura puede iluminarse con una iluminación de luz blanca de “campo brillante”. La matriz puede iluminarse (por ejemplo, usando la fuente 475 de luz mostrada en la figura 11A) dirigiendo una luz blanda pseudo-colimada (por ejemplo, LED de luz blanca) sobre la superficie de la matriz desde un ángulo (por ejemplo, 01 en la figura 11A puede ser de aproximadamente 20 grados, aproximadamente 25 grados, aproximadamente 30 grados, aproximadamente 35 grados, aproximadamente 40 grados, o mayor) justo fuera de la apertura numérica del objetivo de recogida. La luz que incide en la superficie de la matriz 472 (por ejemplo, luz 476) se refleja (y se dispersa) en la superficie, se colima 471, y la recoge la lente objetivo (470). El rayo colimado forma posteriormente la imagen a través del sistema de cámara.

El mismo sistema puede usarse también para determinar qué ubicaciones contienen un objeto de captura (por ejemplo, perla). Cualquier perla particular puede estar asociada o no con una molécula de analito y/o ligando de unión. La matriz puede iluminarse (por ejemplo, usando la fuente 473 de luz tal como se muestra en la figura 11A) con una iluminación de luz blanca de “campo oscuro”. La matriz puede iluminarse apuntando una luz blanca pseudo-colimada (por ejemplo, LED 473 de luz blanca) sobre la superficie de la matriz desde un ángulo (por ejemplo, 02 en la figura 11A es de aproximadamente 65 grados, aproximadamente 70 grados, aproximadamente 75 grados, aproximadamente 80 grados, aproximadamente 85 grados) sustancialmente fuera de la apertura numérica del objetivo de recogida. La luz que incide en la superficie de la matriz 472 (por ejemplo, luz 474) se refleja (y se dispersa) en la superficie, se colima 471, y la recoge la lente 470 objetivo. El rayo colimado forma posteriormente la imagen mediante el sistema de cámara.

En algunas realizaciones, puede emplearse un sistema de detección óptica, por ejemplo, tal como se describe en la publicación estadounidense n.° 2003/0027126. En un sistema a modo de ejemplo, la luz que se devuelve desde una matriz de recipientes de reacción formada en el extremo distal de un haz de fibra óptica se altera por medio del uso de un cambiador de aumento para permitir el ajuste del tamaño de la imagen del extremo proximal o distal de la fibra. La imagen aumentada se obtura entonces y se filtra mediante una rueda de obturador. La imagen se captura entonces mediante una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD). Puede proporcionarse un ordenador que incluye y ejecuta software de procesamiento de imágenes para procesar la información de la cámara CCD y también opcionalmente puede estar configurado para controlar las ruedas del obturador y el filtro. Tal como se representa en la publicación estadounidense n.° 20030027126, el extremo proximal del haz lo reciben una platina de traslación z y un microposicionador x-y.

Por ejemplo, la figura 12 muestra un diagrama de bloques esquemático de un sistema que emplea un conjunto 400 de fibra óptica con un sistema de detección óptica. El conjunto 400 de fibra óptica comprende un haz o matriz 402 de fibra óptica que se construye a partir de fibras revestidas de modo que la luz no se mezcla entre las fibras. Se forma una matriz de recipientes 401 de reacción en/unida al extremo 412 distal del haz, estando el extremo 414 proximal conectado operativamente con una platina 416 de traslación z y un microposicionador 418 x-y. Estos dos componentes actúan conjuntamente para colocar apropiadamente el extremo 414 proximal del haz 402 para una lente 420 objetivo de microscopio. La luz recogida por la lente 420 objetivo pasa a una interconexión de fluorescencia de luz reflejada con tres deslizadores 422 cúbicos de puntero. La interconexión 422 permite que la luz dirigida desde una lámpara 424 de Xe de 75 vatios a través de la lente 420 objetivo se acople en el haz 402 de fibras. La luz de la fuente 424 se condensa mediante la lente 426 de condensación, luego se filtra y/o se obtura mediante una rueda 428 de filtro y obturador, y posteriormente pasa a través de un elemento 430 de deslizamiento de filtro ND. La luz que se devuelve desde el extremo 412 distal del haz 402 pasa a través de la interconexión 422 a un cambiador 432 de aumento que permite el ajuste del tamaño de la imagen del extremo proximal o distal de la fibra. La luz que pasa a través del cambiador 432 de aumento se obtura y se filtra entonces mediante una segunda rueda 434. La luz se recoge mediante una cámara 436 de dispositivo de carga acoplada (CCD). Un ordenador 438 ejecuta software de procesamiento de imágenes para procesar la información de la cámara 436 CCD y también controla opcionalmente otros componentes del sistema, incluyendo, pero sin limitarse a, las ruedas 428, 434 primera y segunda de obturador y filtro.

Una matriz de recipientes de reacción usada para poner en práctica algunas realizaciones de la presente divulgación puede ser solidaria con o estar unida al extremo distal del haz de fibra óptica usando una variedad procedimientos compatibles. En algunos casos, se forman micropocillos en el centro de cada fibra individual del haz de fibra óptica y los micropocillos pueden sellarse o no. Cada fibra óptica del haz de fibra óptica puede transportar luz desde el micropocillo individual formado en el centro del extremo distal de la fibra. Esta característica permite la interrogación de la firma óptica de recipientes de reacción individuales para identificar reacciones/el contenido en cada micropocillo. Por consiguiente, recogiendo la imagen del extremo del haz con la matriz de CCD, las firmas ópticas de los recipientes de reacción pueden interrogarse y/o transformarse en imágenes individualmente de manera sustancialmente simultánea.

Cuantificación

Según algunas realizaciones de la presente invención, los métodos se usan para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito (o partículas) en una muestra de fluido basándose al menos en parte en la detección y/o cuantificación de al menos alguno de una pluralidad de objetos de captura (en el caso de la invención, perlas) usados para capturar las moléculas de analito (y opcionalmente al menos un ligando de unión). En determinadas realizaciones en las que se determina la concentración, se emplea una correlación y/o calibración en relación con el número (o fracción/porcentaje) de ubicaciones que contienen un objeto de captura que comprende al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión) con respecto a la cantidad/concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido. En algunos casos, la concentración de las moléculas de analito en una muestra de fluido puede ser linealmente proporcional al número/la fracción de ubicaciones que contienen un objeto de captura que comprende al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión). En otros casos, la medida de concentración de las moléculas de analito en una muestra de fluido puede estar relacionada con el número/la fracción de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión) mediante una relación no lineal. En algunas realizaciones, una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede determinarse al menos en parte usando una curva de calibración desarrollada usando muestras que contienen concentraciones conocidas de moléculas de analito diana. Se comentan más adelante métodos para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido.

Determinadas realizaciones se distinguen por la capacidad para detectar y/o cuantificar bajos números/concentraciones de objetos de captura que comprenden al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión) y pueden ser muy adecuadas para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido que contiene concentraciones muy bajas de la molécula de analito. Esta capacidad puede facilitarse, en determinadas realizaciones, al menos en parte aislando espacialmente objetos de captura individuales, incluyendo al menos algunos que comprenden al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión), por ejemplo, repartiendo una pluralidad de tales objetos de captura a lo largo de una matriz de ubicaciones (por ejemplo, recipientes de reacción), y luego detectando su presencia en los recipientes de reacción. La presencia de un objeto de captura que comprende al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión) en un recipiente de reacción, en algunas realizaciones, puede determinarse, y el número de tales recipientes de reacción contarse de un modo binario. Es decir, en realizaciones en las que se encuentra que una ubicación (por ejemplo, un recipiente de reacción) contiene al menos un objeto de captura asociado con al menos una molécula de analito (y/o ligando de unión), la ubicación se cuenta como uno. En realizaciones en las que se encuentra que una ubicación (por ejemplo, un recipiente de reacción) contiene un objeto de captura, la ubicación se cuenta como cero. Por ejemplo, los pocillos que se cuentan como “unos” pueden determinarse detectando la presencia de una molécula o partícula detectable en un recipiente de reacción que, tal como se describió anteriormente, indica la presencia de un objeto de captura que comprende al menos una molécula de analito (y/o al menos un ligando de unión) en el pocillo.

En realizaciones en las que una muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene se pone en contacto con una pluralidad de objetos de captura de modo que cualquiera de las moléculas de analito presentes en la muestra se inmovilizan con respecto a la pluralidad de objetos de captura de modo que una fracción estadísticamente significativa (por ejemplo, tal como se describió anteriormente) de los objetos de captura se asocia con una única molécula de analito y una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura no se asocia con ninguna molécula de analito (por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1, etapa (B)), una determinación de una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede llevarse a cabo tal como sigue. En primer lugar, al menos una parte de los objetos de captura (al menos algunos de los cuales tienen una única molécula de analito inmovilizada) se segregan espacialmente en una pluralidad de ubicaciones (por ejemplo, tal como se muestra en la figura 1, etapa (C)). Se determina el número de ubicaciones que contienen una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura, o bien directamente (por ejemplo, mediante detección de la propia molécula de analito (por ejemplo, véase la figura 1, etapa (D)) o bien indirectamente (por ejemplo, mediante detección de un ligando de unión asociado con la molécula de analito, mediante detección de un agente de marcaje (por ejemplo, formado por medio de la conversión de un agente de marcaje precursor tras la exposición a una molécula de analito, véase la figura 4A), etc.). En algunas realizaciones, se determina una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido al menos en parte con la determinación del número de la pluralidad de ubicaciones que contienen una molécula de analito (por ejemplo, recipientes 12 de reacción en la figura 1, etapa (D)). En determinadas de tales realizaciones, se determina una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido al menos en parte mediante comparación de este parámetro medido con un patrón de calibración y/o usando un análisis de la distribución de Poisson y/o gaussiana del número de ubicaciones que se esperaría que contuviesen una molécula de analito.

En algunas realizaciones el número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura no asociado con una molécula de analito también puede determinarse (por ejemplo, recipiente 13 de reacción en la figura 1, etapa (D)). En tales casos, una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede determinarse basándose al menos en parte en la razón de ubicaciones que comprenden una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura, con respecto al número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura no asociado con una molécula de analito. En algunos casos, el número de ubicaciones que no comprenden un objeto de captura también puede determinarse (por ejemplo, recipiente 14 de reacción en la figura 1, etapa (D)). En tales casos, una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede determinarse basándose al menos en parte en la razón de ubicaciones que comprenden una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura con respecto al número de ubicaciones que no comprenden un objeto de captura y/o el número de ubicaciones que no comprenden una molécula de analito, ya contenga o no tal ubicación un objeto de captura (en cualquier caso anterior o en otra parte, el denominador para la razón/fracción puede incluir o no las ubicaciones positivas (“activa” o “uno”) añadidas a las ubicaciones nulas (“inactivas” o “cero”) dependiendo de la preferencia). En aún otros casos, puede determinarse el número total de ubicaciones abordadas/analizadas (por ejemplo, recipientes 12, 13 y 14 de reacción en la figura 1, etapa (D)) y una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede basarse en la razón de las ubicaciones que comprenden una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura con respecto al número total de ubicaciones abordadas/analizadas.

Debe entenderse que, en algunos métodos de ensayo, una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede llevarse a cabo usando más de un tipo de análisis (por ejemplo, un primer análisis basado en el número de ubicaciones que comprenden una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura, y un segundo análisis basado en la razón de la razón/fracción de ubicaciones que comprenden una molécula de analito inmovilizada con respecto a un componente de captura, con respecto al número total de ubicaciones que comprenden un objeto de captura, etc.). En tales realizaciones, el segundo análisis puede usarse como medida de control de calidad (por ejemplo, para confirmar que el primer análisis proporcionó un resultado razonable) y/o puede calcularse el promedio de los dos análisis.

En algunas realizaciones, la determinación de una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido que está sometiéndose a prueba puede llevarse a cabo usando un análisis similar tal como se describió anteriormente, pero determinando el número de recipientes de reacción que comprenden un ligando de unión en contraposición al número de recipientes de reacción que comprenden una molécula de analito inmovilizada con respecto a un objeto de captura. Tal como se describe en el presente documento, en algunos casos, tras la inmovilización de una pluralidad de moléculas de analito con respecto a una pluralidad de objetos de captura, la pluralidad de objetos de captura puede exponerse a al menos un tipo de ligando de unión de modo que al menos algunas de las moléculas de analito inmovilizadas se asocian con al menos un ligando de unión (por ejemplo, véase la figura 2, etapa (B). Este método de ensayo puede ser especialmente útil en realizaciones en las que se espera que más de una molécula de analito se asocie con cada objeto de captura, pero todavía puede desearse una cuantificación binaria. En algunos casos, el ligando de unión puede proporcionarse a una concentración de modo que al menos algunos de los objetos de captura que contienen al menos una molécula de analito no se asocian con ningún ligando de unión (por ejemplo, véase la figura 2, etapa (C). En tales realizaciones, el número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con un ligando de unión (por ejemplo, por medio de una molécula de analito) puede reemplazar al número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito en el análisis y los métodos descritos anteriormente.

Una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido puede determinarse usando una variedad de técnicas de calibración, y la técnica particular que da como resultado la mayor exactitud y fiabilidad puede depender del número/concentración relativos de moléculas de analito en la muestra con respecto al número/concentración de objetos de captura expuestos a la muestra (y/o, para realizaciones que usan ligandos de unión, el número/concentración relativos de ligandos de unión con respecto al número/concentración de objetos de captura expuestos entre sí durante/tras la captura de las moléculas de analito por los objetos de captura). Los ejemplos no limitativos de métodos de determinación de la concentración que pueden ser útiles en regímenes de concentración de analitos particulares incluyen los métodos de lectura binaria descritos anteriormente, y/o métodos en los que se emplea la intensidad de señal positiva relativa medida para las ubicaciones (“métodos de lectura de la intensidad”). Cualquiera o ambos de los métodos anteriores, o métodos alternativos, pueden emplear adicionalmente una comparación del parámetro medido con una curva de calibración.

Se cree actualmente que el método de determinación más exacto puede depender al menos en parte de la concentración de moléculas de analito contenida en la muestra de fluido. Por ejemplo, en realizaciones en las que la concentración de las moléculas de analito en la muestra que está sometiéndose a prueba da como resultado una fracción estadísticamente significativa de ubicaciones a las que se reparten objetos de captura que comprenden una única molécula de analito o ligando de unión y una fracción estadísticamente significativa de ubicaciones que no comprenden ninguna molécula de analito o ligando de unión (por ejemplo, en o aproximándose a un régimen en el que esencialmente ninguna ubicación comprende más de una molécula de analito o ligando de unión), un método de lectura binaria puede ser particularmente útil y, en algunos casos, puede usarse conjuntamente con una curva de calibración. En otras realizaciones, cuando un mayor número de ubicaciones comprenden más de una molécula de analito y/o más de un ligando de unión, una determinación basada al menos en parte en una lectura de la intensidad puede proporcionar una medida más exacta de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido. Una determinación de este tipo puede usarse también conjuntamente con una curva de calibración.

En determinadas realizaciones, la fracción de ubicaciones (por ejemplo, la fracción estadísticamente significativa) que comprenden al menos un objeto de captura asociado con una molécula de analito y/o ligando de unión es de menos de aproximadamente el 50 %, menos de aproximadamente el 40 %, menos de aproximadamente el 25 %, menos de aproximadamente el 10%, menos de aproximadamente el 5%, menos de aproximadamente el 1 %, menos de aproximadamente el 0,5 %, o menos de aproximadamente el 0,1 % del número total de ubicaciones que contienen un objeto de captura. En tales realizaciones, una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede determinarse usando un método de lectura binaria. En algunos casos, el porcentaje de ubicaciones que no contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito y/o ligando de unión es de al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 99 %, al menos aproximadamente el 99,5 %, al menos aproximadamente el 99,9 %, o mayor, del número total de ubicaciones.

Mientras que la discusión a continuación se centra principalmente en el uso de un sistema de lectura binaria (por ejemplo, basado en el recuento del número de ubicaciones “activas” e “ inactivas”) para la capacidad de detección de un nivel ultra bajo, esto no es de ningún modo limitativo, y los métodos y ensayos de la invención pueden emplearse también en determinadas realizaciones en lugar de o además de un protocolo de cuantificación binaria, uno basado en medición de la intensidad (es decir, un método de lectura de la intensidad) (por ejemplo, para extender el intervalo dinámico). Tal como se indica, en algunos casos, los sistemas de detección y los métodos de cuantificación pueden estar configurados de modo que el sistema puede usar cualquiera o ambos de una determinación de lectura binaria y una determinación de lectura de la intensidad, dependiendo del formato de ensayo y/o la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido. Por ejemplo, el método y/o sistema puede ser capaz de determinar un parámetro base a partir de una primera medición y decidir usar o bien una determinación de lectura binaria o bien una determinación de lectura de la intensidad dependiendo del resultado de la primera determinación, tal como se describe en más detalle a continuación y tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense de titularidad conjunta con número de serie 12/731 136, titulada “Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles” de Rissin et al., presentada el 24 de marzo de 2010, y la solicitud de patente internacional n.° (PCT/US2011/026665), titulada “Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles” de Rissin et al., presentada el 1 de marzo de 2011.

Según una realización, el método de cuantificación puede realizarse tal como sigue. Una muestra de fluido que contiene o se sospecha que contiene una molécula de analito de interés se pone en contacto con una pluralidad de objetos de captura y, opcionalmente, uno o más ligandos de unión y los objetos de captura se reparten a lo largo de una matriz de ubicaciones, tales como recipientes de reacción/pocillos (tal como se describió anteriormente). En algunas realizaciones, cuando se desea usar un método de lectura binaria para la determinación, en la etapa de poner en contacto la muestra de fluido con los objetos de captura, se seleccionan las cantidades/concentraciones relativas de la disolución que contiene muestra de fluido y objeto de captura (por ejemplo, basándose en un intervalo de concentración aproximado conocido o estimado/sospechado de moléculas de analito en la muestra) de modo que la razón de moléculas de analito en la muestra de fluido con respecto al número total de objetos de captura proporcionados a la disolución será de menos de aproximadamente 1:5, menos de aproximadamente 1:10, menos de aproximadamente 1:12, menos de aproximadamente 1:15, menos de aproximadamente 1:20, menos de aproximadamente 1:50, menos de aproximadamente 1:100, o menos. Con tales razones, se esperará estadísticamente que al menos algunos de los objetos de captura se asocien con una única molécula de analito y la mayoría del resto de los objetos de captura no se asociarán con ninguna molécula de analito. El número de objetos de captura que se asocian con múltiples moléculas de analito en tales condiciones puede ser lo suficientemente bajo como para ignorarse, de modo que el objeto de captura que se determina que comprende una molécula de analito puede suponerse que comprende una única molécula de analito. En tales condiciones, puede usarse un sistema de análisis configurado para realizar una cuantificación de lectura binaria para determinar el número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura asociado con una molécula de analito mediante cualquier método de detección tal como se describe en el presente documento. El número de ubicaciones que comprenden un objeto de captura asociado con una molécula de analito se cuenta entonces (por ejemplo, figura 1, etapa (D), el número total de recipientes de reacción que comprenden una molécula de analito es de dos, por ejemplo, recipientes 12 de reacción) y, en algunos casos, se calcula la fracción del número total de ubicaciones que contienen un objeto de captura que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito (por ejemplo, en la figura 1, el número total de recipientes de reacción que comprenden un objeto de captura es de tres, recipientes 12 y 13 de reacción; por tanto, la fracción del número total de ubicaciones que comprenden un objeto de captura asociado con una molécula de analito es de 2:3). La utilización de una respuesta de cero (sin molécula de analito detectada) o uno (una molécula de analito detectada), conjuntamente con el uso de una matriz con un gran número de ubicaciones puede permitir una determinación de concentraciones a granel de moléculas de analito en la muestra contando el número real de moléculas contenidas en el volumen de muestra repartido a lo largo de y contenido en las ubicaciones. En algunos casos, la molécula de analito puede detectarse indirectamente (por ejemplo, la lectura se logra contando el número de ubicaciones que contienen al menos una molécula de agente de marcaje, en la que el agente de marcaje se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor tras la exposición a una molécula de analito). En casos en los que se interrogan un gran número de ubicaciones (por ejemplo, al menos aproximadamente 10000 ubicaciones) de manera sustancialmente simultánea, la razón de ubicaciones que comprenden una molécula de analito asociada con un objeto de captura con respecto al número total de ubicaciones determinadas (por ejemplo, en algunos casos, las ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con o no asociado con ninguna moléculas de analito) puede ser de al menos aproximadamente 1:100, al menos aproximadamente 1:1000, al menos aproximadamente 1:10000 o menos. La utilización de una matriz con un gran número de ubicaciones (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 000, al menos aproximadamente 50000, al menos aproximadamente 100000, al menos aproximadamente 500000, etc.) puede proporcionar una señal estadísticamente significativa incluso a esta baja razón.

En algunos ensayos, puede aplicarse un ajuste de distribución de Poisson a los números y/o razones determinados mediante un método de lectura binaria para facilitar y/o mejorar la exactitud de la determinación de una concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido. Por ejemplo, en realizaciones en las que la razón de moléculas de analito en la muestra de fluido con respecto al número total de objetos de captura puestos en contacto con la muestra de fluido es de más de aproximadamente 1:10, más de aproximadamente 1:5, más de aproximadamente 1:4, más de aproximadamente 1:3 o más de aproximadamente 1:2, o entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:2, entre aproximadamente 1:5 y aproximadamente 1:2, el número de moléculas de analito inmovilizadas por captura puede ser de cero o ninguna, conteniendo una mayor proporción más de una que para el régimen descrito en el párrafo anterior. En algunos de tales casos, el rendimiento y la exactitud de las determinaciones de la concentración pueden mejorarse con respecto al uso de una suposición de que todas las ubicaciones positivan contienen solo una única molécula de analito (tal como se describió en el párrafo anterior) empleando un ajuste de distribución de Poisson para predecir el número de ubicaciones que se espera que contengan 0, 1,2, 3, 4, etc., moléculas de analito por objeto de captura.

Una distribución de Poisson describe la probabilidad de que se produzcan varios acontecimientos si se sabe el número promedio de acontecimientos. Si el número esperado de apariciones es |i, entonces la probabilidad (P^(v)) de que haya exactamente v apariciones (siendo v un número entero no negativo, v = 0, 1, 2, ...) puede determinarse mediante la ecuación 5:

(Ec. 5)

En algunas realizaciones, |i es igual a la fracción del número de ubicaciones que se determina que contienen una molécula de analito asociada con un analito con respecto al número total de objetos de captura detectados (por ejemplo, o bien asociados con o bien no asociados con ninguna molécula de analito), y v es el número de objetos de captura asociados con un determinado número de moléculas de analito (por ejemplo, el número de objetos de captura asociados con o bien 0, 1,2, 3, etc. moléculas de analito). Al determinar |i a partir de la interrogación de la matriz de ubicaciones durante un ensayo, puede determinarse la concentración de moléculas de analito en la muestra usando un ajuste de distribución de Poisson. Por ejemplo, en un ensayo que usa el modo binario de mediciones en donde los objetos de captura asociados con 1, 2, 3, 4, etc. moléculas de analito no se distinguen entre sí (por ejemplo, en donde v = 1,2, 3, 4 no se diferencian entre sí) y los pocillos (por ejemplo, ubicaciones, recipientes de reacción) se caracterizan simplemente como pocillos “activos”, entonces las apariciones de v = 0 pueden determinarse definitivamente como el número de pocillos “inactivos”. (P^(0)) puede calcularse según la ecuación 6:

(Ec. 6)

y el número de apariciones esperadas, m, puede determinarse basándose en una reorganización de la ecuación 5, tal como se proporciona en la ecuación 7:

(Ec. 7)

El número de apariciones de objetos de captura no asociados con moléculas de analito (o ligandos de unión), P^(0), es igual a 1 menos el número total de objetos de captura con todas las otras apariciones (por ejemplo, objetos de captura asociados con al menos una molécula de analito o ligando de unión), entonces |i se facilita mediante la ecuación 8:

N u m e ro d e m o léc u las d e an a lito

U - l n ( l ^{— fra cc ió n de p oc illos ‘ ac tiv o s ’)}

r = ---- N -- ú -- m --- e - r -- o --- d -- e -- o -- b -- j - e -- t - o -- s -- d -- e --- c -- a -- pt - u -- r - a ----(Ec. 8)

Reorganizando la ecuación 8, el número total de moléculas de analito en la muestra de fluido contenida en las ubicaciones interrogadas que contienen un objeto de captura puede determinarse usando la ecuación (9):

Número de moléculas de analito = -ln(1-fracción de pocilios “activos”) x número de objetos de captura (Ec. 9)

Por tanto, el número total de moléculas puede determinarse a partir de la fracción de pocillos “activos” para un número dado de pocillos que contienen objetos de captura, y una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede basarse al menos en parte en este número (así como, por ejemplo, cualquier dilución de la muestra durante el ensayo, el número y volumen de los pocillos que contienen objetos de captura interrogados, etc.). El número de objetos de captura con 1, 2, 3, 4 etc. moléculas de analito asociadas puede determinarse también calculando P^(1), P^(2), P^(3) etc. a partir de la |i determinada y la ecuación 5.

Como ejemplo no limitativo de uso de un ajuste de distribución de Poisson, en un ensayo en el que el 26 % de 50000 objetos de captura interrogados eran “activos” (es decir, contenían una o más moléculas de analito y/o ligandos de unión), entonces el número total de moléculas de analito presente se calcula como -ln(1 -0,26) * 50000 = 15056 moléculas. De estas 15056 moléculas, usando |i = -ln(1-0,26) = 0,3011 en la Ec. 5 para v = 1, se calcula que 11 141 objetos de captura tienen 1 molécula de analito, 1677 objetos de captura 2 moléculas de analito, 168 objetos de captura 3 moléculas de analito, 13 objetos de captura 4 moléculas de analito, y 1 objeto de captura 5 moléculas de analito. Puede aplicarse un análisis similar a realizaciones en las que una fracción estadísticamente significativa de los objetos de captura separados espacialmente se asocian con al menos un ligando de unión y una fracción estadísticamente significativa de objetos de captura separados espacialmente no se asocian con ningún ligando de unión.

En algunas realizaciones, en las que la razón de ubicaciones que comprenden un objeto de captura asociado con al menos una molécula de analito y/o un ligando de unión con respecto a ubicaciones que contienen un objeto de captura libre de cualquier molécula de analito/ligando de unión es alta (por ejemplo, más de aproximadamente 1:2, más de aproximadamente 1:1, más de aproximadamente 2:1, más de aproximadamente 4:1, más de aproximadamente 8:1, o mayor), la determinación de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede basarse al menos en parte en una determinación de lectura de la intensidad. En una realización de este tipo, puede determinarse la intensidad total de la matriz (por ejemplo, fluorescencia total) y una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido se basa al menos en parte en esta determinación.

En algunas realizaciones, una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido puede determinarse al menos en parte mediante comparación de un parámetro medido con un patrón de calibración. En algunos casos, puede usarse una curva de calibración, similar a tal como se describe en el presente documento, en la que la intensidad total se determina para una pluralidad de muestras que comprenden la molécula de analito a una concentración conocida usando un formato de ensayo sustancialmente similar. Por ejemplo, el número y/o la fracción de ubicaciones que comprenden un objeto de captura asociado con una molécula de analito (por ejemplo, basándose en una lectura binaria), o alternativamente, la intensidad total de la matriz, pueden compararse con una curva de calibración para determinar una medida de la concentración de la molécula de analito en la muestra de fluido. La curva de calibración puede producirse completando el ensayo con una pluralidad de muestras normalizadas de concentración conocida en condiciones similares usadas para analizar muestras de pruebas con concentraciones desconocidas. Una curva de calibración puede relacionar la fracción de los objetos de captura que se determina que están asociados con una molécula de analito y/o ligando de unión con una concentración conocida de la molécula de analito. El ensayo puede completarse entonces en una muestra que contiene la molécula de analito en una concentración desconocida, y puede compararse el número/fracción de objetos de captura que se determina que están asociados con una molécula de analito y/o ligando de unión con la curva de calibración, (o una ecuación matemática que se ajusta a la misma) para determinar una medida de la concentración de la molécula de analito en la muestra de fluido.

En una realización a modo de ejemplo para realizar una calibración, se usan cuatro muestras de fluido normalizadas que comprenden una molécula de analito en concentración variable (w, x, y z). Se lleva a cabo un ensayo (por ejemplo, inmovilizar las moléculas de analito con respecto a una pluralidad de objetos de captura, opcionalmente exponer los objetos de captura a al menos un tipo de ligando de unión, repartir al menos una parte de los objetos de captura en una pluralidad de ubicaciones diferenciadas, abordables por separados, detectar al menos una parte de los objetos de captura, etc.) para cada muestra de calibración, y se determina el número/la fracción de objetos de captura que comprenden una molécula de analito y/o ligando de unión (b, c, d, y e). Se produce una representación gráfica/ecuación/tabla de consulta, etc. que relaciona los valores b, c, d y e con las concentraciones w, x, y z, respectivamente, tal como se representa en la figura 13. El ensayo puede llevarse a cabo entonces en condiciones sustancialmente idénticas en una muestra de fluido que contiene una molécula de analito de concentración desconocida, en la que el valor resultante del número/fracción de objetos de captura que comprenden una molécula de analito y/o ligando de unión determinado para la detección de los objetos de captura es f. Este valor (f) puede representarse gráficamente en el gráfico y puede determinarse una medida de la concentración desconocida del analito diana en la muestra de fluido (t). En algunos casos, la curva de calibración puede tener un límite de detección, en el que el límite de detección es la concentración más baja de moléculas de analito en una muestra de fluido que puede determinarse con exactitud. En algunos casos, el valor de r2 de la curva de calibración puede ser de más de aproximadamente 0,5, más de aproximadamente 0,75, más de aproximadamente 0,8, más de aproximadamente 0,9, más de aproximadamente 0,95, más de aproximadamente 0,97, más de aproximadamente 0,98, más de aproximadamente 0,99, más de aproximadamente 0,9999 o aproximadamente 1. Los valores b, c, d y e pueden basarse en el número absoluto de ubicaciones/objetos de captura medidos asociados con una molécula de analito (o ligando de unión), o una razón del número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito (o ligando de unión) con respecto al número de ubicaciones que contienen un objeto de captura no asociado con ninguna molécula de analito o una razón del número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito (o ligando de unión) con respecto al número de ubicaciones que contienen un objeto de captura o una razón del número de ubicaciones que contienen un objeto de captura asociado con una molécula de analito (o ligando de unión) con respecto al número total de ubicaciones abordadas, etc. Puede usarse cualquier número de patrones de calibración para desarrollar la curva de calibración (por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, patrones de calibración).

En algunas realizaciones, la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido puede determinarse a través del uso de una curva de calibración usando un sistema de ensayo que emplea un ordenador. El ordenador puede ejecutar software que puede usar los datos recogidos para producir la curva de calibración y/o para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de prueba de fluido a partir de tal curva de calibración. Por ejemplo, puede recogerse una imagen de fluorescencia de una matriz que comprende la pluralidad de objetos de captura repartidos a lo largo de la matriz y analizarse usando software de análisis de imágenes (por ejemplo, IP Lab, BD Biosciences). El software de análisis puede calcular automáticamente el número de ubicaciones que tienen una intensidad de fluorescencia por encima de la intensidad de fondo (por ejemplo, un número que se correlaciona con el número de ubicaciones que comprenden una molécula de analito). El número de ubicaciones que comprenden una intensidad de fluorescencia por encima de la intensidad de fondo puede dividirse entre el número total de ubicaciones abordadas, por ejemplo, para determinar la fracción de ubicaciones que comprenden una molécula de analito. La fracción de ubicaciones activas puede compararse con una curva de calibración para determinar una medida de la concentración de moléculas de analito en la muestra de fluido.

En determinadas realizaciones, puede ser posible aumentar tanto el intervalo dinámico como la sensibilidad del ensayo expandiendo el número de ubicaciones en las que los objetos de captura se reparten y/o ajustando la razón de objetos de captura (por ejemplo, perlas) con respecto a moléculas de analito en la etapa de captura inicial. En determinados casos, disminuir o aumentar la razón de analito con respecto a perla puede dar como resultado un intervalo más dinámico. En algunos casos, a medida que aumenta el volumen de una muestra, la detección de pequeños números de moléculas de analito con exactitud puede, en algunos casos, volverse más difícil, por ejemplo, debido a limitaciones de equipo, restricciones de tiempo, etc. Por ejemplo, para lograr las mismas eficacias una muestra de mayor volumen (por ejemplo, 1 ml, 10 ml) tal como se logra con una muestra de menor volumen (por ejemplo, 100 |il), pueden ser necesarias más perlas (por ejemplo, 10 y 100 veces más perlas, respectivamente), y por tanto, puede ser necesario que las perlas se segreguen espacialmente en un mayor número de ubicaciones, en el que el mayor número de ubicaciones puede requerir un aumento del área de obtención de imágenes.

Para la etapa de captura, la elección de la concentración de perlas puede depender de varios factores de competencia. Por ejemplo, puede ser ventajoso si están presentes suficientes perlas para capturar la mayor parte del analito diana desde las perspectivas cinética y termodinámica. Como ilustración a modo de ejemplo, termodinámicamente, 200000 perlas en 100 |il que tienen cada una aproximadamente 80000 componentes de captura (por ejemplo, anticuerpos) unidos se corresponden con una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0,3 nM, y el equilibrio anticuerpoproteína a esa concentración puede dar lugar a una eficacia de captura relativamente alta de molécula de analito diana en determinados casos (por ejemplo, >70% ). Cinéticamente, para 200000 perlas dispersadas en 100 |il, puede estimarse que la distancia promedio entre las perlas es de aproximadamente 80 |im. Proteínas del tamaño de TNF-a y PSA (17,3 y 30 kDa, respectivamente), como moléculas de analito a modo de ejemplo, por ejemplo, tenderán a difundir normalmente 80 |im en menos de 1 min, de modo que, a lo largo de una incubación de 2 horas, la captura de tales moléculas de analito tenderá a no estar limitada cinéticamente. Además, puede ser ventajoso también proporcionar suficientes perlas cargadas sobre las matrices como para limitar el ruido de Poisson hasta una cantidad deseada o aceptable. Considerando como ejemplo una situación en la que 200000 perlas en un volumen de 10 |il se cargan sobre una matriz, normalmente pueden quedar atrapadas aproximadamente 20.000-30.000 perlas en pocillos de tamaño de femtolitro de la matriz. Para una señal de fondo típica (por ejemplo, debida a unión no específica, etc.) del 1 % de perlas activas, se esperaría que esta carga diese como resultado una señal de fondo de 200-300 perlas activas detectadas, correspondiente a un coeficiente de variación (CV) de ruido de Poisson del 6-7 %, lo que puede ser aceptable en realizaciones típicas. Sin embargo, concentraciones de perlas por encima de determinadas concentraciones pueden no ser deseables en determinados casos en los que pueden conducir a: a) aumentos en la unión no específica que pueden reducir la razón de señal con respecto a fondo; y/o b) razones indeseablemente bajas de analito con respecto a perla de modo que la fracción de perlas activas es demasiado baja, dando como resultado altos CV de ruido de Poisson. En determinadas realizaciones, considerando un equilibrio de factores tales como los comentados anteriormente, puede ser deseable proporcionar de aproximadamente 200000 a 1000000 perlas por 100 |il de muestra de prueba o, en determinados casos óptimos, para realizar determinados ensayos de la invención.

Para realizaciones del ensayo de la invención que emplean uno o más ligandos de unión para etiquetar las moléculas de analito capturadas, puede ser ventajoso, en determinados casos, ajustar las concentraciones usadas para producir un rendimiento deseable u óptimo. Por ejemplo, considerando una realización que implica una molécula de analito que es una proteína (proteína capturada) y que emplea un primer ligando de unión que comprende un anticuerpo de detección y un segundo ligando de unión que comprende un conjugado enzimático (por ejemplo SpG), las concentraciones de anticuerpo de detección y conjugado enzimático (SpG) usadas para etiquetar la proteína capturada pueden en algunos casos limitarse o minimizarse para producir una señal de fondo (por ejemplo el 1 % o menos) y ruido de Poisson aceptables. La elección de las concentraciones de anticuerpo de detección y conjugado enzimático (SpG) usadas para etiquetar la proteína capturada pueden ser factores para la mejora del rendimiento de o la optimización de determinados métodos de ensayo de la invención. En determinados casos, puede ser deseable que una única fracción de las proteínas de captura se etiquete para evitar señales de saturación producidas por el ensayo. Por ejemplo, para un ensayo particular en el que los niveles de fondo observados son equivalentes a ~1-2fM de proteína diana, de modo que la razón de analito con respecto a perla puede ser de aproximadamente 0,3-0,6, el número de perlas activas puede estar en el intervalo de aproximadamente el 25-40 % si cada proteína se etiquetó con una enzima, lo que puede ser superior a lo deseable en algunos casos. Para producir señales de fondo que pueden estar más próximas a un extremo inferior del intervalo dinámico para un ensayo de detección digital, considerando por ejemplo que en determinados casos el 1 % de las perlas activas pueden proporcionar un suelo de ruido razonable para el fondo en ensayos de detección digital de la invención, el etiquetado apropiado de la proteína capturada puede lograrse potencialmente mediante el control cinético de las etapas de etiquetado, o bien limitando o minimizando las concentraciones de ambos reactivos de etiquetado o bien usando tiempos de incubación más cortos. Por ejemplo, en una realización en la que se minimizan las concentraciones de etiqueta, el uso de un tiempo de incubación de ELISA convencional puede proporcionar resultados aceptables; por ejemplo, usando un tiempo de ensayo total de ~6 h. Este periodo de tiempo puede ser aceptable para pruebas que toleran un tiempo de cambio diario para las muestras. Tiempos de cambio más cortos de, por ejemplo, < 1 hora (por ejemplo, para aplicaciones de punto de atención), el ensayo podría realizarse con incubaciones más cortas con concentraciones más altas de etiquetas.

En algunas realizaciones, la exactitud de un método particular de determinación de la concentración con los ensayos de la invención puede verse comprometida, es decir tanto por encima como por debajo de los umbrales del intervalo dinámico para el método particular. Por ejemplo, a medida que la concentración de los objetos de captura asociados con una molécula de analito disminuye, finalmente, cuando está por debajo del límite inferior del intervalo dinámico, el número de objetos de captura asociados con una molécula de analito puede ser demasiado bajo como para observar un número suficiente de ubicaciones ocupadas para obtener una medición fiable y reproducible. En una situación de este tipo, el número de ubicaciones podría disminuirse con el fin de garantizar que al menos algunas (por ejemplo, un número estadísticamente significativo) de ellas están ocupadas por un objeto de captura asociado con una molécula de analito, y/o la muestra sometida a prueba podría concentrarse y/o el número de objetos de captura incubados con la muestra podría disminuirse, etc. para aumentar el número/la fracción de objetos de captura positivos detectados.

Por otro lado, un sistema/método de lectura binaria puede estar por encima de su umbral superior de exactitud y/o utilidad cuando, por ejemplo, la carga se aproxima a la saturación con objetos de captura “activos” de modo que sustancialmente el 100 % de las ubicaciones contienen al menos un objeto de captura asociado con una molécula de analito. En este límite, la discriminación entre dos muestras con concentraciones que se encuentran en este intervalo puede no ser viable usando un sistema/método de lectura binaria. En una situación de este tipo, para proporcionar un resultado más exacto, podría usarse un mayor número de ubicaciones, la concentración de la muestra podría reducirse, por ejemplo, a través de diluciones en serie, el número de objetos de captura incubados con la muestra podría aumentarse, etc. para disminuir el número/la fracción de objetos de captura positivos detectados, y/o podría emplearse un sistema/método de lectura de la intensidad.

En algunas realizaciones, la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido que puede determinarse de manera sustancialmente exacta es de menos de aproximadamente 5000 fM, menos de aproximadamente 3000 fM, menos de aproximadamente 2000 fM, menos de aproximadamente 1000 fM, menos de aproximadamente 500 fM, menos de aproximadamente 300 fM, menos de aproximadamente 200 fM, menos de aproximadamente 100 fM, menos de aproximadamente 50 fM, menos de aproximadamente 25 fM, menos de aproximadamente 10 fM, menos de aproximadamente 5 fM, menos de aproximadamente 2fM, menos de aproximadamente 1 fM, menos de aproximadamente 500 aM (attomolar), menos de aproximadamente 100 aM, menos de aproximadamente 10 aM, menos de aproximadamente 5 aM, menos de aproximadamente 1 aM, menos de aproximadamente 0,1 aM, menos de aproximadamente 500 zM (zeptomolar), menos de aproximadamente 100 zM, menos de aproximadamente 10 zM, menos de aproximadamente 5 zM, menos de aproximadamente 1 zM, menos de aproximadamente 0,1 zM, o menos. En algunos casos, el límite de detección (por ejemplo, la concentración más baja de una molécula de analito que puede determinarse en disolución de manera sustancialmente exacta) es de aproximadamente 100 fM, aproximadamente 50 fM, aproximadamente 25 fM, aproximadamente 10 fM, aproximadamente 5fM, aproximadamente 2fM, aproximadamente 1 fM, aproximadamente 500 aM (attomolar), aproximadamente 100 aM, aproximadamente 50 aM, aproximadamente 10 aM, aproximadamente 5 aM, aproximadamente 1 aM, aproximadamente 0,1 aM, aproximadamente 500 zM (zeptomolar), aproximadamente 100 zM, aproximadamente 50 zM, aproximadamente 10 zM, aproximadamente 5zM, aproximadamente 1 zM, aproximadamente 0,1 zM, o menos. En algunas realizaciones, la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido que puede determinarse de manera sustancialmente exacta es de entre aproximadamente 5000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 3000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 fM, entre aproximadamente 1000 fM y aproximadamente 0,1 zM, entre aproximadamente 100 fM y aproximadamente 1 zM, entre aproximadamente 100 aM y aproximadamente 0,1 zM. La concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido puede considerarse que se determina de manera sustancialmente exacta si la concentración medida de las moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido está dentro de aproximadamente el 10 % de la concentración real (por ejemplo, verdadera) de las moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido. En determinadas realizaciones, la concentración medida de las moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido puede estar dentro de aproximadamente el 5 %, dentro de aproximadamente el 4 %, dentro de aproximadamente el 3 %, dentro de aproximadamente el 2 %, dentro de aproximadamente el 1 %, dentro de aproximadamente el 0,5 %, dentro de aproximadamente el 0,4 %, dentro de aproximadamente el 0,3%, dentro de aproximadamente el 0,2% o dentro de aproximadamente el 0,1 %, de la concentración real de las moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido. En algunos casos, la medida de la concentración determinada difiere de la concentración verdadera (por ejemplo, real) en no más de aproximadamente el 20 %, no más de aproximadamente el 15 %, no más del 10 %, no más del 5 %, no más del 4 %, no más del 3 %, no más del 2 %, no más del 1 % o no más del 0,5 %. La exactitud del método de ensayo puede determinarse, en algunas realizaciones, determinando la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido de una concentración conocida usando el método de ensayo seleccionado.

En algunas realizaciones, puede emplearse más de uno de los tipos de análisis y métodos de cuantificación descritos anteriormente con el mismo sistema y en un único ensayo. Por ejemplo, en realizaciones en las que las moléculas de analito están presentes a intervalos de concentración inferiores, pueden detectarse moléculas de analito individuales, y los datos pueden analizarse usando un método de análisis digital (cuantificación binaria). En algunos casos que usan cuantificación binaria, tal como se describió anteriormente, los datos pueden procesarse usando un ajuste de distribución de Poisson. A intervalos de concentración superiores (por ejemplo, en los que puede resultar difícil o inexacto realizar cuantificación binaria), los datos pueden analizarse usando un método de análisis analógico, basado, por ejemplo, en intensidades de señal relativas medidas (determinación de lectura de la intensidad). En determinadas realizaciones, los resultados de los dos métodos de análisis (digital y analógico) pueden utilizarse ambos mediante un único sistema/protocolo de ensayo de la invención vinculando los dos métodos usando una única curva de calibración.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, a niveles de concentración bajos (por ejemplo, en el intervalo de concentración digital/binario), una medida de la concentración de moléculas de analito en una muestra de fluido puede determinarse al menos en parte contando las perlas como o bien “activas” (por ejemplo, determinando si el recipiente de reacción contiene una perla asociada con una molécula de analito) o bien “inactivas” (por ejemplo, determinando si el recipiente de reacción contiene una perla no asociada con ninguna molécula de analito). A razones bajas de moléculas de analito con respecto a perlas (por ejemplo, menos de aproximadamente 1:5, menos de aproximadamente 1:10, menos de aproximadamente 1:20, etc.), sustancialmente todas las perlas están asociadas con o bien cero o bien una única molécula de analito. En este intervalo, el porcentaje de perlas activas (por ejemplo, recipientes de reacción “activos”) aumenta linealmente con el aumento de la concentración de analito, y un método de análisis digital puede ser el más adecuado.

Sin embargo, a medida que la concentración de analito aumenta, más perlas se asociarán con más de una molécula de analito. Por tanto, a medida que la concentración de analito aumenta (pero todavía en el intervalo digital), el porcentaje de perlas activas en una población generalmente no estará relacionado linealmente con la concentración de analito a granel ya que algunas de las perlas pueden asociarse con más de una molécula de analito. En estos intervalos de concentración, los datos pueden analizarse ventajosamente usando un método de análisis digital con el ajuste de distribución de Poisson descrito anteriormente. El efecto no lineal descrito anteriormente puede explicarse usando el ajuste de distribución de Poisson a lo largo de sustancialmente el intervalo de concentración en el que sigue habiendo una fracción estadísticamente significativa de perlas no asociadas con ninguna molécula o partícula de analito en la muestra. Por ejemplo, los intervalos de porcentaje de perlas activas (es decir perlas “activas” divididas entre las perlas totales multiplicadas por el 100%) para los que un método de análisis digital puede ser capaz de determinar de manera exacta una medida de la concentración, incluyen hasta aproximadamente el 20 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 30 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 35 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 40 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 45 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 50 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 60 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 70 % de perlas activas, hasta aproximadamente el 80 % de perlas activas o más. En muchos casos cuando se funciona en los intervalos anteriores, el uso de un ajuste de distribución de Poisson mejorará la exactitud.

Por encima de un determinado porcentaje de perlas activas (es decir, cuando ya no hay una fracción estadísticamente significativa de perlas presentes en la población que no están asociadas con ninguna de las moléculas o partículas de analito, o, de manera potencialmente ventajosa para situaciones en las que puede haber una fracción estadísticamente significativa de perlas presentes en la población que no están asociadas con ninguna de las moléculas o partículas de analito pero que dan como resultado porcentajes de perlas activas por encima de un determinado nivel, por ejemplo, mayor de o sustancialmente mayor de aproximadamente el 40 %) (o porcentaje de ubicaciones activas, en realizaciones en las que no se emplean perlas)), pueden producirse potencialmente mejoras en la exactitud y/o fiabilidad en la determinación de la concentración de moléculas de analito empleando una medición de la intensidad basada en determinación y análisis analógicos en vez de o complementarios a un recuento/ajuste binario/digital de la distribución de Poisson tal como se describió anteriormente. A porcentajes de perlas activas superiores, la probabilidad de que una perla activa (por ejemplo, recipiente de reacción positivo) esté rodeada por otras perlas activas (por ejemplo, recipientes de reacción positivos) es superior y pueden crear en determinadas configuraciones de ensayo determinados problemas prácticos en el uso exclusivo del método de determinación digital/binaria. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, puede producirse en algún grado fuga de un componente detectable a un recipiente de reacción desde un recipiente de reacción adyacente. El uso de una técnica analógica, basada en el nivel de intensidad en tales situaciones puede producir potencialmente un rendimiento más favorable. En una medición de la intensidad basada en determinación y análisis analógicos, se cuantifica la asociación de múltiples moléculas de analito a concentraciones relativamente altas con perlas individuales. Puede determinarse la intensidad de al menos una señal de la pluralidad de recipientes de reacción que contienen al menos una molécula de analito. En algunos casos, la intensidad se determina como la intensidad global para los recipientes de reacción que contienen al menos una molécula de analito (por ejemplo, la intensidad de los recipientes de reacción determinada como un todo). En otros casos, puede determinarse la intensidad de cada recipiente de reacción con una señal y calcularse el promedio, dando lugar a una señal de perla promedio (ABS).

Según determinadas realizaciones, un sistema de ensayo de la invención puede incluir un vínculo entre los resultados/parámetros de los dos métodos/sistemas de análisis (es decir, digital y analógico), por ejemplo, con la ayuda de una curva de calibración, de modo que el sistema es capaz de funcionar en múltiples modos de cuantificación dependiendo de la señal referente al número/la fracción de perlas “activas” detectadas. Tales sistemas pueden tener intervalos dinámicos sustancialmente expandidos en determinados casos. Se proporciona una descripción adicional de tales sistemas que pueden combinar y usar más de un método de cuantificación para un único ensayo en la solicitud de patente estadounidense de titularidad conjunta con número de serie 12/731 136, titulada “Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles” de Rissin et al., presentada el 24 de marzo de 2010, y la solicitud de patente internacional n.° (PCT/US2011/026657), titulada “Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles” de Rissin et al., presentada el 1 de marzo de 2011.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar cómo puede determinarse la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido. Debe entenderse que la presente invención se define mediante las presentes reivindicaciones previas.

Ejemplo 1

El siguiente ejemplo describe materiales usados en los ejemplos 2-19. Se adquirieron haces de fibra óptica de Schott North America (Southbridge, MA). Se obtuvieron láminas de silicona brillantes no reforzadas de Specialty Manufacturing (Saginaw, MI). Se adquirieron ácido clorhídrico, etanol anhidro y Tween-20 de calidad para biología molecular Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). Se adquirieron perlas magnéticas activadas con tosilo de 2,8 um (micrómetros) de diámetro de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se adquirieron perlas magnéticas terminadas en carboxilo de 2,7 um de diámetro de Varian, Inc. (Lake Forest, CA). Se adquirieron anticuerpo de captura monoclonal anti-TNF-a humano, anticuerpo de detección policlonal anti-TNF-a humano y TNF-a humano recombinante de R&D systems (Mineápolis, MN). Se adquirieron anticuerpo de captura monoclonal anti-PSA y anticuerpo de detección monoclonal de BiosPacific (Emeryville, CA); se biotiniló el anticuerpo de detección usando métodos convencionales. Se adquirieron clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), N-hidroxisulfosuccinimida (NHS) y tampón de bloqueo SuperBlock® T-20 de Thermo Scientific (Rockford, IL). Se adquirió ADN de Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) y/o se pidió ADN purificado a Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Se adquirió estreptavidina-P-galactosidasa (SpG) de Invitrogen o se conjugó en el laboratorio usando protocolos convencionales. Se adquirió resorufina-p-D-galactopiranósido (RGP) de Invitrogen (Carlsbad, CA). Se adquirieron los consumibles de pulido y el pulidor de fibras de Allied High Tech Products (Rancho Dominguez, CA).

Ejemplo 2

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la preparación de perlas magnéticas de 2,8 um de diámetro funcionalizadas con anticuerpo de captura de proteínas. Se lavaron 600 ul (microlitros) de disolución madre de perlas activadas con tosilo de 2,8 um de diámetro (1,2 * 109 perlas) tres veces en tampón de recubrimiento de borato de sodio 0,1 M pH 9,5. Se disolvieron 1000 ug (microgramos) de anticuerpo de captura en 600 ul de tampón de recubrimiento de borato de sodio. Se añadieron 300 ul de sulfato de amonio 3 M a la disolución de anticuerpo. Se sedimentaron los 600 ul de disolución de perlas usando un separador magnético y se eliminó el sobrenadante. Se añadió la disolución de anticuerpo a las perlas y se permitió que la disolución se mezclara a 37 °C durante 24 horas. Tras la incubación, se eliminó el sobrenadante y se añadieron a las perlas 1000 ul de tampón PBS que contenía suero bovino al 0,5 % y Tween-20 al 0,05 %. Se bloquearon las perlas durante la noche (~8 horas) a 37 °C. Se lavaron las perlas funcionalizadas y bloqueadas tres veces con 1 ml de tampón PBS que contenía suero bovino al 0,1 % y Tween-20 al 0,05 %. Finalmente, se añadió 1 ml de PBS que contenía suero bovino al 0,1 %, Tween-20 al 0,05 % y azida de sodio al 0,02 % a las perlas funcionalizadas y bloqueadas. Se almacenaron alícuotas de 50 ul a 4 °C para su uso posterior.

Ejemplo 3

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la preparación de perlas magnéticas de 2,7 um de diámetro funcionalizadas con anticuerpo de captura de proteínas. Se lavaron dos veces 500 ul disolución madre de perlas magnéticas terminadas en carboxilo de 2,7 um de diámetro (1,15 * 109 perlas) en hidróxido de sodio 0,01 M, seguido por tres lavados en agua desionizada. Tras el lavado final, se sedimentó la disolución de perlas y se eliminó la disolución de lavado. Se añadieron 500 ul de una disolución de 50 mg/ml recién preparada de NHS en MES 25 mM, pH 6,0, al sedimento de perlas y se mezcló. Inmediatamente, se añadieron 500 ul de una disolución de 50 mg/ml recién preparada de EDC en MES 25 mM, pH 6,0, a la disolución de perlas y se mezcló. Se permitió entonces que la disolución se mezclara durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la activación, se lavaron las perlas dos veces con MES 25 mM a pH 5,0. Mientras tanto, se usaron 1000 ul de MES 25 mM a pH 5,0 para disolver 1000 ug de anticuerpo de captura. Entonces se añadió la disolución de anticuerpo a las perlas activadas y se permitió que avanzara la reacción de acoplamiento durante 3 horas a temperatura ambiente. Tras la incubación, se eliminó el sobrenadante usando el separador magnético, y se añadieron 1000 ul de Tris-HCl 100 mM (pH 7,4) y se permitió que se mezclaran a temperatura ambiente durante una hora para bloquear cualquier sitio reactivo restante. Finalmente, se almacenaron las perlas funcionalizadas en 1 ml de tampón de bloqueo SuperBlock, y se añadió azida de sodio al 0,02 % a las perlas funcionalizadas y bloqueadas. Se almacenaron alícuotas de 50 ul a 4 °C para su uso posterior.

Ejemplo 4

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la preparación de perlas magnéticas de 2,7 um de diámetro funcionalizadas con ADN. Se lavaron 120 |il de perlas magnéticas terminadas en carboxilo de 2,7 um de diámetro tres veces con NaOH 0,01 M, seguido por agua desionizada durante otras tres veces. Se añadieron 500 ul de NHS 50 mg/ml recién preparado en MES 25 mM frío (pH 6) al sedimento de perlas tras el lavado final, y se resuspendieron las perlas agitando con vórtex brevemente. Se añadieron inmediatamente 500 ul de disolución de EDC 50 mg/ml recién preparada en MES 25 mM frío (pH 6) a esta suspensión de perlas y se mezclaron durante 30 min. Tras la activación, se lavaron las perlas tres veces con MES 25 mM frío (pH 5). Se disolvió la sonda de captura de ADN con modificación de amina en el extremo 5' (5'-NH2/C12-GTT GTC AAG ATG CTA CCG TTC AGA G-3' (SEQ ID NO. 1)) en agua libre de nucleasa para preparar una disolución madre 2,6 mM. Se añadieron 60 |il de la disolución madre de ADN a 600 ul del tampón de acoplamiento que contenía fosfato de sodio 0,1 M y NaCI 0,5 M, pH 8. Se añadió la disolución de ADN resultante a las perlas lavadas y se mezclaron durante 3 horas a temperatura ambiente. Se agitó con vórtex la suspensión de perlas cada 30 min durante la reacción. Tras la incubación, se eliminó el sobrenadante del ADN y se añadió 1 ml de Tris-HCl 100 mM (pH 7,4) al sedimento y se mezcló durante 1 hora para inactivar los sitios de unión restantes en las perlas. Finalmente, se lavaron las perlas en tampón Tris-EDTA (TE) y Tween-20 al 0,05 % tres veces, y se almacenaron en tampón TE que contenía Tween-20 al 0,05 % y azida de sodio al 0,02 % a 4 °C.

Ejemplo 5

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la captura de proteínas sobre perlas magnéticas y la formación de inmunocomplejo marcado con enzima. Se incubaron disoluciones de prueba que contenían la proteína de interés con suspensiones de perlas magnéticas funcionalizadas con anticuerpo de captura (por ejemplo, véase el ejemplo 2) durante 1 h a 37 °C. Entonces se separaron las perlas y se lavaron tres veces en PBS. Se resuspendieron las perlas y se incubaron con disoluciones que contenían anticuerpos de detección durante 30 min a 37 °C. Entonces se separaron las perlas y se lavaron tres veces en PBS. Se incubaron las perlas con disoluciones que contenían SpG (por ejemplo, analito diana) durante 30 min a 37 °C, se separaron y se lavaron seis veces en PBS y Tween-20 al 0,1 %. Entonces se resuspendieron las perlas en 10 ul de PBS con el fin de cargarlas en los pocillos de las matrices de haz de fibras.

Ejemplo 6

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la captura de ADN sobre perlas magnéticas y la formación de complejo marcado con enzima (figura 14). Se incubaron perlas funcionalizadas con sonda de captura de ADN (por ejemplo, véase el ejemplo 4) que es específica para el ADN diana complementario de interés con disoluciones que contenían el ADN diana (5'-TT GAC GGC GAA GAC CTG GAT GTA TTG CTC C TCT GAA CGG TAG CAT CTT GAC AAC-3' (SEQ ID NO. 2)) (por ejemplo, analito diana) durante 2 h. Tras la incubación, se eliminó la disolución diana de ADN y se lavaron las perlas tres veces en tampón SSC 0,2x que contenía Tween-20 al 0,1 %. Entonces se resuspendieron las perlas y se mezclaron con sonda de señal biotinilada 10 nM (5'-TAC ATC CAG GTC TTC GCC GTC AA/biotina/-3' (SEQ iD NO. 3)) (por ejemplo, primer tipo de ligando de unión) que también es específica para el ADN diana durante 1 h. Entonces se lavaron las perlas tres veces en tampón SSC 0,2x que contenía Tween-20 al 0,1 % tras eliminar la sonda señal. Entonces se añadió una disolución 10 pM que contenía SpG (por ejemplo, segundo tipo de ligando de unión que comprende un componente enzimático) al sedimento de perlas, se resuspendió y se mezcló durante 1 h. Entonces se separaron las perlas y se lavaron seis veces en tampón PBS 5x que contenía Tween-20 al 0,1 %. Entonces se resuspendieron las perlas en 10 |il de PBS y se cargaron en una matriz de pocillos de femtolitro.

Ejemplo 7

El siguiente ejemplo describe la captura de ADN marcado con biotina sobre perlas magnéticas y la formación de complejo marcado con enzima, según una realización no limitativa (véase la figura 15). Se incubaron perlas funcionalizadas con sonda de captura de ADN que es específica para el ADN de interés con ADN diana-biotina 1 um (5'-biotina-C TCT GAA CGG TAG CAT CTT GAC AAC-3' (SEQ ID NO. 4)) durante la noche (16 h) en tampón TE que contenía NaCl 0,5 M y Tween-20 al 0,01 %. Tras la incubación, se eliminó la disolución diana de ADN y se lavaron las perlas tres veces en tampón PBS que contenía Tween-20 al 0,1 %. Se distribuyó la disolución madre de perlas en una placa de microtitulación dando 400000 perlas por pocillo en 100 ul. Se aspiró el tampón de los pocillos de la placa de microtitulación, se resuspendieron las perlas y se incubaron con diversas concentraciones de SpG en Superblock que contenía Tween-20 al 0,05 % durante 5 h. En algunos casos, se resuspendieron las perlas cada 30 min durante la incubación. Entonces se separaron las perlas y se lavaron seis veces con tampón PBS 5x que contenía Tween-20 al 0,1 %. Finalmente, se resuspendieron las perlas en 10 ul de PBS que contenía Tween-20 al 0,1 %. En algunas realizaciones, se separaron entonces las perlas y se lavaron seis veces con tampón PBS 5x que contenía Tween-20 al 0,1 %. Para la detección de enzima, las perlas o bien: a) se resuspendieron en 20 |il de PBS que contenía Tween-20 al 0,1 %, y se cargaron alícuotas de 10 |il en matrices de pocillos de dos femtolitros para la detección, o bien; b) se resuspendieron en 100 |il de RGP 100 |iM en PBS, se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y se leyeron en un lector de placas de fluorescencia (Infinite M200, Tecan).

Ejemplo 8

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la preparación de matrices de micropocillos. Se pulieron secuencialmente haces de fibra óptica de aproximadamente 5 cm de largo en una máquina de pulido usando películas de lapeado con diamante de 30, 9 y 1 micrómetro de tamaño. Se sometieron a grabado químico los haces de fibras pulidas en una disolución de HCl 0,025 M durante 130 segundos, y luego se sumergieron inmediatamente en agua para extinguir la reacción. Para eliminar las impurezas del grabado, se sonicaron las fibras grabadas durante 5 s y se lavaron en agua durante 5 min. Entonces se secaron las fibras a vacío y se expusieron a plasma de aire durante 5 min para limpiar y activar la superficie de vidrio. Se silanizaron las matrices durante 30 minutos en disolución al 2 % de silano para hacer las superficies hidrófobas.

Ejemplo 9

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la carga de perlas en micropocillos. Para aplicar la disolución de perlas a los pocillos grabados en un haz de fibras, se cortaron tubos de PVC transparentes (D.I. de 1/16”, D.O. de 1/8”) y termorretracción transparente (D.I. de 3/16”) en aproximadamente 1 cm de largo. Se puso en primer lugar un trozo de tubo de PVC sobre el extremo grabado y funcionalizado de un haz de fibras para crear un depósito para contener la disolución de perlas, seguido por la aplicación de la termorretracción alrededor de la superficie de contacto entre el tubo de PVC y el haz de fibras para proporcionar un sello estanco. Se pipetearon 10 ul de la disolución de perlas concentrada al depósito creado mediante el tubo de PVC. Se centrifugó entonces el haz de fibras a 3000 rpm (~1333 g) durante 10 minutos para forzar las perlas al interior de los pocillos grabados. Se retiró el conjunto de tubo de PVC/termorretracción tras la centrifugación. Se sumergió el extremo distal del haz de fibras en disolución de PBS para eliminar por lavado la disolución de perlas en exceso, seguido por limpieza de la superficie con agua desionizada.

Ejemplo 10

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la detección de perlas y perlas marcadas con enzima en matrices de micropocillos. Se usó un sistema de obtención de imágenes a medida que contiene una fuente de luz de mercurio, cubos de filtro, objetivos y una cámara CCD para adquirir imágenes de fluorescencia. Se montaron matrices de haz de fibras sobre la platina del microscopio usando un elemento de sujeción a medida. Se colocó una gota de sustrato de p-galactosidasa (RPG 100 |iM) sobre el material de junta de silicona, y se puso en contacto con el extremo distal de la matriz de fibras. La plataforma mecánica de precisión desplazó la lámina de silicona en contacto con el extremo distal de la matriz de fibra óptica grabada, creando una matriz de recipientes de reacción de femtolitro aislados. Se adquirieron imágenes de fluorescencia a 577 nm con un tiempo de exposición de 1011 ms. Se tomaron cinco fotogramas (a 30 segundos por fotograma) para cada matriz de haz de fibras. Se analizaron las imágenes fluorescentes usando software de análisis de imágenes para determinar la presencia o ausencia de actividad enzimática dentro de cada pocillo de la matriz de micropocillos. Se analizaron los datos usando un software de procesamiento de imágenes desarrollado que usa la caja de herramientas MathWorks MATLAB y MathWorks Imagen Processing. El software alineó los fotogramas de imágenes adquiridos, identificó las posiciones de recipientes de reacción, ubicó los recipientes de reacción con perlas y midió el cambio en la intensidad del recipiente de reacción a lo largo de un periodo de tiempo predefinido. Se contaron los recipientes de reacción que contienen perlas con un crecimiento de la intensidad suficiente a lo largo de todos los fotogramas de datos y se notificó el número final de recipientes de reacción activos como un porcentaje de todos los recipientes de reacción identificados.

Como con la fluorescencia, se obtuvieron imágenes de las matrices con luz blanca para identificar los pocillos que contienen perlas. Tras adquirir las imágenes de fluorescencia, se iluminó el extremo distal (sellado) de las matrices de haz de fibras con luz blanca y se obtuvieron imágenes en la cámara CCD. Debido a la dispersión de la luz por las perlas, los pocillos que contenían una perla aparecían más brillantes en la imagen que los pocillos sin perlas. Se identificaron los pocillos con perlas usando este método mediante el software.

Ejemplo 11

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la carga de perlas en una matriz de micropocillos (figura 16). Se prepararon matrices de 50000 micropocillos tal como se describió anteriormente. Se prepararon perlas de 2,8 um tal como se describió anteriormente. Se prepararon disoluciones de 10 ul que contenían diferentes números de perlas (desde 80000 hasta 2 millones de perlas) tal como se describió anteriormente. Se cargaron las perlas en las matrices de micropocillos tal como se describió anteriormente. Se obtuvieron imágenes de la matriz cargada con una disolución que comprende 2 millones de perlas usando microscopía electrónica de barrido (SEM). La SEM mostró que > 99 % de los 50000 pocillos contenían una perla, y cada uno de estos pocillos solo contenía una única perla. Se obtuvieron imágenes de las matrices cargadas con de 80000 a 200000 perlas usando microscopio de luz visible y se usó análisis de imágenes para identificar pocillos que contenían una perla. Se determinó el número de perlas por matriz a lo largo de tres matrices y se representó gráficamente como una función del número de perlas en disolución (figura 16B). A partir de la figura 16B, en esta realización, el número de perlas cargadas es una fracción de las proporcionadas en disolución y no todos los pocillos contienen una perla a estas concentraciones de carga de perlas relevantes para el ensayo. En algunos casos, la presencia de una perla en un pocillo (usando imágenes de luz blanca) puede correlacionarse con los pocillos que contienen actividad enzimática. En tales casos, la lectura puede ser ratiométrica (% de perlas activas) y normalizarse para la variación en la carga de perlas.

Ejemplo 12

Lo siguiente describe un ejemplo no limitativo de la carga de perlas como una función de la profundidad de pocillo (figura 17). En algunas realizaciones, puede suministrarse una única perla que contiene moléculas de analito individuales a un micropocillo de modo que pueden estar aisladas espacialmente y selladas. Para lograr esta situación, la profundidad y anchura de pocillo pueden controlarse cuidadosamente con parámetros optimizados para un diámetro de perla dado. Las figuras 17A-17C muestran imágenes de SEM de perlas cargadas tal como se describió anteriormente en matrices de micropocillos en las que la profundidad de pocilio se controló mediante grabado durante diferentes veces. En promedio, los pocillos se grabaron a una velocidad de aproximadamente 1,5 a 1,7 |im por minuto. Por tanto, se producen pocillos de 3,25 um de profundidad en de aproximadamente 115 a 130 s. Para una profundidad de pocillo de 2,5 um (figura 17A), se retienen muy pocas perlas en los micropocillos ya que son demasiado poco profundos y la detección de analitos individuales puede ser mala. A 3 um de profundidad (figura 17B), las imágenes de SEM muestran un buen llenado de perlas individuales en pocillos individuales, y una baja aparición de dos perlas en un pocillo; esta matriz puede sellarse bien y permitir que se interroguen grandes números de perlas individuales para detectar la presencia de un único analito. Para pocillos de 3,5 um de profundidad (figura 17C), muchos de los pocillos contienen dos perlas, así como los que contienen una. La presencia de una segunda perla por encima del plano de la matriz puede deteriorar el sellado de la matriz tal como se describió anteriormente y puede reducir la calidad del aislamiento de perlas individuales. Estos experimentos indican que una profundidad de pocillo óptima para perlas de 2,8 um de diámetro, en esta realización, es de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 3,25 um. Aunque este intervalo es óptimo, también es posible realizar las mediciones de la invención usando profundidades de pocillo de 3,6 um, es decir, el límite superior tal como indica la Ec. (4).

Ejemplo 13

El siguiente ejemplo describe la comparación de un método no limitativo de la presente divulgación frente a un lector de placas convencional para detectar enzima (véanse las figuras 18A, 18B y 19). Se prepararon perlas de biotina-ADN tal como se describió anteriormente. Entonces se incubaron estas perlas con una baja concentración de SpG de modo que las perlas contenían estadísticamente o bien cero o bien una enzima. Se cargaron estas perlas en micropocillos, se sellaron y se obtuvieron imágenes tal como se describió anteriormente; la figura 18A y 18B muestran imágenes representativas. En algunos casos, se observa un aumento en la sensibilidad a la etiqueta de enzima que proviene del aislamiento de perlas individuales en comparación con mediciones a granel tradicionales. Se prepararon perlas recubiertas con ADN, se incubaron con ADN biotinilado, y luego se incubaron con diversas concentraciones de SpG (desde 350 aM hasta 320 fM) tal como se describió anteriormente. Entonces se midieron las enzimas sobre estas perlas de dos modos. En primer lugar, se cargaron las perlas en matrices de micropocillos, se sellaron y se obtuvieron imágenes tal como se describió anteriormente. Se determinó la fracción de pocillos activos tal como se describió anteriormente y se representa gráficamente como una función de la concentración de SpG en las figuras 19A, el intervalo inferior expandido en la figura 19B. En segundo lugar, se incubaron las perlas con 100 ul de RPG en una placa de microtitulación durante una hora y se leyeron en un lector de placas de fluorescencia. La señal de fluorescencia como una función de la concentración de SpG se representa gráficamente en la figura 19C. El límite de detección inferior (LOD) del método de la invención (definido como la concentración a la que la señal se eleva por encima de tres desviaciones estándar con respecto al fondo) en este experimento fue de 384 zM. El LOD de la medición a granel en el lector de placas fue de 14,5 fM. El enfoque de matriz de una única molécula, por tanto, proporcionó un aumento de 37.760 veces en la sensibilidad a la etiqueta de enzima con respecto al lector de placas. Debe indicarse que a las concentraciones sometidas a prueba estadísticamente solo deben detectarse cero analitos o analitos individuales sobre las perlas; por ejemplo, la razón de enzimas con respecto a perlas a 350 aM fue de 21 070/400000 = 0,053.

Ejemplo 14

El siguiente ejemplo ilustra la precisión de detección en un método tal como se describe en el presente documento, en una realización no limitativa. La detección de moléculas individuales puede permitir una alta precisión. En teoría, la varianza más baja en la medición es el ruido de Poisson asociado con el recuento de pequeños números de acontecimientos. En este ejemplo no limitativo, el % de ruido de Poisson se facilita mediante \N/N, en donde N es el número de perlas activas (asociadas a enzima). La figura 20 muestra una representación gráfica del % de ruido de Poisson frente a la varianza experimental a lo largo de tres medidas (% de CV) a partir de los datos experimentales en la figura 19B. Tal como puede observarse, la imprecisión de la medición (% de CV) sigue estrechamente el ruido de Poisson, lo que sugiere que el ruido de Poisson puede limitar la precisión de los métodos en algunos casos.

Ejemplo 15

El siguiente ejemplo no limitativo describe la detección de PSA en suero (figura 21). Se prepararon perlas de 2,8 um de diámetro recubiertas con anticuerpo anti-PSA tal como se describió anteriormente. Se incubaron estas perlas con suero bovino al 25 % o suero bovino al 25 % con adiciones conocidas con PSA 50 fM. Entonces se marcaron las perlas con anticuerpo de detección anti-PSA y tres concentraciones diferentes de SpG (1, 10 o 100 pM). Entonces se cargaron las perlas en matrices de micropocillos, se sellaron y se obtuvieron imágenes tal como se describió anteriormente. Se usó análisis de imágenes para determinar la fracción de perlas que contenían una enzima. Estos datos muestran que el ensayo puede usarse para detectar bajas concentraciones de proteínas en suero realizando ELISA sobre perlas individuales y detectando etiquetas de enzima individuales. Debido a la alta eficacia de la captura de analito usando perlas en este ensayo, la concentración de etiqueta de enzima usada puede variarse para etiquetar solo una fracción de los analitos capturados sobre las perlas con el fin de optimizar la razón de señal con respecto a fondo y el intervalo dinámico de la medición. En este conjunto de datos, 1 pM de etiqueta de enzima dio una razón de señal con respecto a fondo óptima.

Ejemplo 16

El siguiente ejemplo no limitativo describe la detección de TNF-a (figura 22). Se prepararon perlas de 2,8 um de diámetro recubiertas con anticuerpo anti-TNF-a tal como se describió anteriormente. Se incubaron estas perlas con suero bovino al 25 % o suero bovino al 25 % con adiciones conocidas con TNF-a 100 fM. Entonces se marcaron las perlas con anticuerpo de detección anti-TNF-a (por ejemplo, primer ligando de unión) y dos concentraciones diferentes de SpG (1 o 100 pM) (por ejemplo, segundo ligando de unión que comprende un componente enzimático). Entonces se cargaron las perlas en matrices de micropocillos, se sellaron y se obtuvieron imágenes tal como se describió anteriormente. Se usó análisis de imágenes para determinar la fracción de perlas que contenían una enzima. Estos datos muestran que el ensayo puede usarse para detectar bajas concentraciones de TNF-a en suero realizando ELISA sobre perlas individuales y detectando etiquetas de enzima individuales. Como en el ejemplo anterior, la cantidad de etiqueta de enzima puede variarse para garantizar que la medición detecta solo etiquetas de enzima individuales sobre las perlas y optimizar la razón de señal con respecto a fondo. En este ejemplo particular, el fondo es muy bajo de modo que la razón de señal con respecto a fondo es óptima a una concentración de etiqueta de enzima de 1 pM y 100 000 perlas.

Ejemplo 17

El siguiente ejemplo no limitativo describe la detección de ADN en tampón (figura 23). Se prepararon perlas de 2,7 um de diámetro funcionalizadas con una secuencia de captura de ADN tal como se describió anteriormente. Entonces se incubaron estas perlas con diversas concentraciones de ADN diana y luego se marcaron con una secuencia de ADN de sonda de señal biotinilada tal como se describió anteriormente. Entonces se marcaron las perlas incubando con diversas concentraciones de SpG (1, 10 o 100 pM). Entonces se cargaron las perlas en matrices de micropocillos, se sellaron y se obtuvieron imágenes tal como se describió anteriormente. Se usó análisis de imágenes para determinar la fracción de perlas que contenían un enzima. Estos datos muestran que el ensayo puede usarse para detectar bajas concentraciones de ADN formando complejos de tipo sándwich en perlas individuales y detectando etiquetas de enzima individuales. Como en el caso de la detección de proteínas, la cantidad de etiqueta de enzima puede variarse para garantizar que hay estadísticamente una o cero enzimas por perla incluso en el caso en el que hay más de una molécula de ADN diana capturada. Esto permite que se optimicen el intervalo dinámico y la razón de señal con respecto a fondo de la medición de moléculas individuales. En este caso, 10 pM de SpG dieron la razón de señal con respecto a fondo óptima.

Ejemplo comparativo 18

El siguiente ejemplo no limitativo describe un método que usa detección que comprende quimioluminiscencia de fosfatasa alcalina (figura 24). Se mezclaron diferentes concentraciones de 10 ul de fosfatasa alcalina con 90 ul de una disolución que contiene el sustrato quimioluminiscente más sensible disponible (APS-5; Lumigen Inc.) en una placa de microtitulación y se incubaron durante 5 min. Entonces se leyó la placa de microtitulación en modo de quimioluminiscencia de un lector de placas. La figura 24 muestra una representación gráfica de la quimioluminiscencia como una función de concentración de fosfatasa alcalina. La concentración más baja de enzima que podía detectarse por encima del fondo fue de 100 aM y el límite de detección calculado fue de 50 aM, próximo al valor notificado de 30 aM. La detección de moléculas individuales de p-galactosidasa sobre perlas en esta invención (LOD = 220 zM) es, por tanto, más de 100 veces más sensible que la detección quimioluminiscente de fosfatasa alcalina, el sistema de etiqueta de enzima más sensible que está disponible comercialmente.

Ejemplo 19

El uso clínico de biomarcadores proteicos para la diferenciación de estados de salud y patológicos, y para monitorizar la progresión de una enfermedad, requiere la medición de bajas concentraciones de proteínas en muestras complejas. Determinados inmunoensayos actuales pueden medir proteínas a concentraciones por encima de 10'12 M, mientras que la concentración de la mayoría de las proteínas importantes en cáncer, trastornos neurológicos y las fases tempranas de una infección se cree que circulan en el intervalo de desde 10'16 hasta 10'12 M. Por ejemplo: un tumor de 1 mm3 compuesto por un millón de células que secretan cada una 5000 proteínas en 5 l de sangre circulante se traduce en ~ 2 * 10'15 M (o 2 femtomolar, fM); la infección por VIH temprana con sueros que contienen 2-3000 viriones es igual a concentraciones de antígeno p24 que oscilan entre 60 * 10 '18M (60 attomolar, aM) y 15 *10 '15M (15 femtomolar). Los intentos de desarrollar métodos de detección basados en proteínas capaces de detectar estas concentraciones se han centrado en la replicación de etiquetas de ácido nucleico sobre proteínas, o en la medición de las propiedades a granel, de conjunto de moléculas proteicas etiquetadas. Sin embargo, los métodos sensibles para detectar proteínas han quedado atrás de los de para ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), limitando el número de proteínas en el proteoma que se han detectado en sangre. El aislamiento y la detección de moléculas proteicas individuales proporcionan el método más directo para medir concentraciones extremadamente bajas de proteínas, aunque la detección sensible y precisa de moléculas proteicas individuales ha demostrado ser un reto. Lo siguiente describe un método a modo de ejemplo no limitativo para detectar miles de moléculas proteicas individuales simultáneamente usando los mismos reactivos como método de referencia para detectar proteínas, concretamente, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). El método puede detectar proteínas en suero a concentraciones attomolares y puede permitir la medición de una única molécula en la sangre.

El método hace uso de matrices de cámaras de reacción de tamaño de femtolitro (figura 25) que pueden aislar y detectar moléculas de enzima individuales. En la primera etapa, se forma un complejo de anticuerpo de tipo sándwich sobre perlas microscópicas, y los complejos unidos se etiquetan con una molécula indicadora de enzima, como en un ELISA basado en perlas convencional. Cuando se someten a ensayo muestras que contienen concentraciones extremadamente bajas de proteína, la razón de moléculas proteicas (y el complejo de etiqueta de enzima resultante) con respecto a perlas es pequeña (normalmente menos de 1:1) y, como tal, el porcentaje de perlas que contienen un inmunocomplejo etiquetado sigue una distribución de Poisson, conduciendo a inmunocomplejos individuales sobre perlas individuales. Por ejemplo, si se capturaron 50 aM de una proteína en 0,1 ml (3000 moléculas) en 200 000 perlas, entonces el 1,5 % de las perlas tendría una molécula proteica y el 98,5 % tendría cero moléculas proteicas (figura 25B). Normalmente no es posible detectar estos bajos números de proteínas usando tecnología de detección convencional (por ejemplo, un lector de placas), debido a que los fluoróforos generados por cada enzima difunden en un volumen de ensayo grande (normalmente 0,1-1 ml), y se necesitan cientos de miles de etiquetas de enzima para generar una señal de fluorescencia por encima del fondo (figura 15A). El método de este ejemplo permite la detección de concentraciones muy bajas de etiquetas de enzima confinando los fluoróforos generados por enzimas individuales en volúmenes extremadamente pequeños (~50 fl), lo que conduce a una alta concentración local de moléculas de productos fluorescentes. Para lograr esta localización en un inmunoensayo, en la segunda etapa del método las perlas del inmunoensayo se cargan en una matriz de pocillos de tamaño de femtolitro (figura 25B). La matriz cargada se sella entonces contra una junta de caucho en presencia de una gota de sustrato de enzima fluorogénico, aislando cada perla en una cámara de reacción de femtolitro. Perlas que presentan un único inmunocomplejo marcado con enzima generan una concentración localmente alta de producto fluorescente en las cámaras de reacción de 50 fl. Usando obtención de imágenes de fluorescencia convencional en un microscopio, es posible detectar moléculas de enzima individuales, y obtener imágenes de decenas a cientos de miles de inmunocomplejos de manera sustancialmente simultánea. Aislando las enzimas asociadas con cada inmunocomplejo, cada complejo puede dar lugar a una señal medible alta que puede dar como resultado una sensibilidad sustancialmente mejorada con respecto a las mediciones a granel. La concentración de proteína en la muestra de prueba, en algunos casos, se determina simplemente contando el número de pocillos que contienen tanto una perla como producto fluorescente en relación con el número total de pocillos que contienen perlas (figura 25D). La concentración se determina entonces digitalmente en vez de usar la señal analógica total.

La figura 25A muestra la captura y el etiquetado de moléculas proteicas individuales sobre perlas usando reactivos de ELISA convencionales. La figura 25B muestra la carga de perlas en matrices de micropocillos de femtolitro para el aislamiento y la detección de moléculas individuales. La figura 25C muestra una imagen de SEM de una pequeña sección de una matriz de pocillos de femtolitro tras la carga de perlas. Se cargaron perlas de 2,7 |im de diámetro en una matriz de pocillos con diámetros de 4,5 |im y profundidades de 3,25 |im. La figura 25D muestra una imagen de fluorescencia de una pequeña sección de la matriz de pocillos de femtolitro tras generarse señales a partir de moléculas individuales. Mientras que la mayoría de las cámaras de femtolitro contienen una perla a partir del ensayo, solo una fracción de esas perlas presenta actividad enzimática catalítica, indicativa de una única proteína unida. La concentración de proteína en la disolución a granel puede correlacionarse con el porcentaje o número de perlas que se han unido a una molécula proteica. El ensayo a modo de ejemplo fue capaz de proporcionar linealidad a lo largo de ~4,5 log para 50000 perlas.

La figura 15 muestra que la digitalización de complejos unidos a enzima puede aumentar la sensibilidad sustancialmente en comparación con mediciones de conjunto, a granel. La figura 15 muestra una representación gráfica log-log de la salida de señal (% de perlas activas para un ensayo que comprende el uso de objetos de captura; unidades de fluorescencia relativa (u.f.r.) para el lector de placas) como una función de la concentración de SpG. Las concentraciones de SpG para la lectura de conjunto oscilaban entre 3 fM y 300 fM, con un límite de detección de 15 x 10-15 M (15 fM; línea (i)). Para el ensayo a modo de ejemplo, las concentraciones de SpG oscilaban entre 350 zM y 7 fM, demostrando una respuesta lineal a lo largo de 4,5 log, con un límite de detección de 220 x 10-21 M (220 zM; línea (ii)). Las barras de error se basan en la desviación estándar a lo largo de tres repeticiones para ambas tecnologías. Se determinaron los LOD a partir de la señal a tres desviaciones estándar por encima del fondo. La tabla 1 proporciona información referente a la imprecisión de este ensayo a modo de ejemplo en relación con el ruido de Poisson del recuento de acontecimientos individuales. La variación intrínseca (ruido de Poisson) del recuento de perlas activas individuales se facilita mediante Vn. La comparación del coeficiente de variación asociado al ruido de Poisson (% de CV) con el % de CV para este ensayo a modo de ejemplo a lo largo de tres mediciones muestra que la imprecisión del ensayo está determinada solo por el error de recuento. Esta observación sugiere que esto ensayo, en algunos casos, puede tener una imprecisión < 20 % siempre que se detecten al menos 25 perlas activas, lo que es igual a una concentración de enzima de 4,5 aM.

Para cuantificar la sensibilidad potencial que puede lograrse singularizando moléculas etiquetadas con enzima en comparación con mediciones de conjuntos convencionales, se desarrolló un ensayo de tipo sándwich modelo para capturar moléculas de enzima sobre perlas; la población de perlas o bien se singularizó y se leyó usando métodos descritos en el presente documento, o bien se leyó como una población de conjunto en un lector de placas convencional. Se funcionalizaron perlas con moléculas de captura de ADN, y posteriormente se saturaron con moléculas diana de ADN complementario biotinilado en una hibridación de una etapa (véase la sección de métodos a continuación). Se usaron estas perlas para capturar diversas concentraciones de un conjugado enzimático, estreptavidina-p-galactosidasa (SpG), comúnmente usado como etiqueta en ELISA. Mientras que el ensayo a modo de ejemplo y las incubaciones del ensayo convencional se realizaron en condiciones sustancialmente similares, en estos ejemplos los ensayos divergían en la etapa de lectura de perlas. Para el ensayo convencional comparativo, se leyeron las perlas en 100 ul en un lector de placas de fluorescencia tras 1 h de incubación con resorufina-p-D-galactopiranósido (RGP) 100 |iM, un sustrato fluorogénico para p-galactosidasa. El límite de detección del ensayo de captura sobre el lector de placas de microtitulación fue de 15 fM de SpG (figura 15). Para la detección de una única molécula, se cargaron las perlas en las matrices de femtolitro y, tras sellar una disolución de RGP en los pocillos de la matriz, la señal generada a partir de las enzimas individuales se acumuló en las cámaras de reacción durante 2,5 min, con imágenes fluorescentes adquiridas cada 30 s. Se adquirió una imagen de luz blanca de la matriz al final del experimento. Se analizaron estas imágenes para identificar pocillos que contenían perlas (a partir de la imagen de luz blanca) y determinar cuáles de esas de perlas tenían una molécula de enzima asociada unida (a partir de imágenes fluorescentes con transcurso temporal). La figura 15 muestra una representación gráfica log-log del porcentaje de perlas que contenían una enzima como una función de la concentración de SpG a granel. El límite de detección (LOD) para el ensayo fue de 220 zeptomolar (13 moléculas en 100 |il, o 22 yoctomoles), correspondiente a una mejora en la sensibilidad con respeto al lector de placas de un factor de 68000, lo que muestra que la singularización puede dar como resultado un aumento drástico en la sensibilidad con respecto a mediciones de conjunto convencionales. La concentración de SpG detectada usando el ensayo fue un factor de 140 menor que la detección de quimioluminiscencia de fosfatasa alcalina (30 aM), el sistema de ELISA más sensible actual. La alta eficacia cinética y termodinámica que puede lograrse para el presente procedimiento (tabla 2) puede permitir la detección de números muy bajos de etiquetas de enzima e indica que la medición de una única molécula etiquetada a partir de la sangre es una posibilidad.

Tabla 2. Cálculos de la eficacia de captura de la etiqueta de enzima desde 0,35 aM hasta 7000 aM para el ensayo (figura 15).

En la tabla 2, para los experimentos, en promedio se interrogaron 50000 perlas (~12,5 %) de las 400000 incubadas con las disoluciones de enzima. La baja fracción de perlas detectadas estaba limitada por el número de recipientes de reacción usados en este ejemplo (50000 pocilios). Considerando la pérdida de perlas, el número de perlas activas observadas experimentalmente (columna A) puede usarse para estimar el número total de perlas activas de las 400 000 usadas (columna B). Tras la resta del fondo (columna C) y aplicar un ajuste de distribución de Poisson basado en la distribución de 0, 1,2, 3, 4, etc., moléculas de enzima por perla, puede determinarse el número total de moléculas capturadas sobre las perlas (columna D). La razón de este número con respecto al número total de enzimas en 100 ul al inicio del experimento (columna E; volumen * concentración * número de Avogadro) produce una eficacia de captura (columna F). La eficacia de captura y detección global de enzima usando el presente ensayo es alta (el 65-85 %) y en algunas realizaciones, puede limitarse mínimamente en este experimento mediante la difusión lenta del conjugado de SpG grande (PM ~ 515 kDa).

Se desarrolló un ensayo basado en sándwich para dos biomarcadores proteicos clínicamente relevantes, concretamente antígeno prostático específico (PSA) y factor de necrosis tumoral-a (TNF-a). Estos ensayos muestran que la alta sensibilidad de la etiqueta de enzima del ensayo de este ejemplo se traduce en ensayos altamente sensibles (< 1 fM) adecuados para detectar proteínas en sangre. También se desarrolló un ensayo para ADN para mostrar que el ensayo de este ejemplo puede usarse para detectar directamente moléculas de ácido nucleico individuales sin requerir replicación de la diana. Se realizaron todos los ensayos tal como se explica resumidamente en la figura 25A y la figura 25B, aparte del ensayo de ADN en el que se usaron una secuencia de captura y una secuencia de señal biotinilada en lugar de anticuerpos de captura y de detección, respectivamente. Las figuras 14A-14C muestran datos de los ensayos para A) PSA, B) TNF-a y C) ADN. Se realizaron adiciones conocidas de las formas humanas de las proteínas en suero bovino al 25 % para que fuesen representativas de muestras de prueba clínicas; se usó un factor de dilución de cuatro veces que puede reducir los efectos de la matriz en inmunoensayos. Se detectó ADN en tampón para que fuese representativo de técnicas de preparación de ácido nucleico purificado. Usando detección digital para detectar PSA en suero al 25 %, se logró un LOD de 46 aM (1,5 fg/ml), lo que es igual a 184 aM en suero completo. Un ensayo de PSA comercial líder (ADVIA Centaur, Siemens) notifica un lOd de 3 pM (0,1 ng/ml) en suero humano, y se han notificado ensayos ultrasensibles con LOD en el intervalo de 10-30 fM. El ensayo de molécula individual del presente ejemplo era, por tanto, más sensible que el ensayo comercial en un factor de 15000, y más sensible que otros métodos ultrasensibles en un factor de al menos 50. El límite de detección en la determinación de TNF-a fue de 148 aM (2,5 fg/ml), correspondiente a 590 aM en suero completo. El ELISA disponible comercialmente de sensibilidad más alta para TNF-a tiene un LOD de 21 fM (0,34 pg/ml) en suero (tabla 1). El ensayo del presente ejemplo, por tanto, confirió una mejora con respecto al ensayo de TNF-a más sensible de un factor de 35. El LOD del ensayo de tipo sándwich de ADN digital fue de 135 aM, correspondiente a aproximadamente 8000 copias. La capacidad de determinados ensayos para medir potencialmente concentraciones de proteínas mucho menores en comparación con técnicas convencionales surge de las señales de fondo extremadamente bajas que pueden lograrse digitalizando la detección de proteínas.

Las figuras 14A-14C muestran la detección attomolar de proteínas en suero y ADN en tampón usando detección digital. Representaciones gráficas del % de perlas activas frente a la concentración de analito para: (figura 14A) adiciones conocidas de PSA humano a suero al 25 %, (figura 14B) adiciones conocidas de TNF-a humano a suero al 25 %, y (figura 14C) ADN en tampón. La fila inferior de las representaciones gráficas muestra el extremo bajo del intervalo de concentración. Se realizaron los ensayos incubando secuencialmente perlas de captura específicas con disolución diana, detector biotinilado y conjugado de SpG. Tras la finalización del ensayo, se cargaron las perlas en matrices de pocillos de femtolitro y se interrogaron para detectar la presencia de inmunocomplejos individuales.

El fondo en los inmunoensayos de detección digital de la invención puede surgir, al menos en parte, de la unión no específica (NSB) de anticuerpo de detección y conjugado enzimático a la superficie de las perlas de captura (tabla 3). Debido a que los ensayos de la invención pueden proporcionar una sensibilidad de etiqueta mejorada con respecto a ensayos convencionales (figura 15), puede usarse significativamente menos anticuerpo de detección (~1 nM) y conjugado enzimático (1-50 pM) para detectar acontecimientos de unión en comparación con ensayos convencionales (concentraciones de reactivo de etiquetado ~10 nM). La disminución de la concentración de etiquetas puede dar como resultado una NSB sustancialmente reducida a la superficie de captura, dando como resultado señales de fondo mucho más bajas y menores LOD. Por ejemplo, en las determinaciones de TNF-a y PSA tal como se describió anteriormente, los niveles de NSB eran equivalentes a la señal producida por 1,8 fM y 1,2 fM de proteína diana, respectivamente. El ensayo de TNF-a comercial de sensibilidad más alta tiene un nivel de NSB equivalente a 85 fM de TNF -a (figura 26), un factor superior de 50. La capacidad para reducir el fondo en determinados ensayos reduciendo la concentración de reactivos de etiquetado puede traducirse en inmunoensayos con sensibilidad mejorada con respecto a ensayos convencionales.

Tabla 3. Datos de pérdida de NSB.

En la tabla 3, un experimento de pérdida que aísla las fuentes de NSB en el ensayo digital de PSA. Comparando “sin NSB de anticuerpo de detección” (sin dAb) y “sin NSB de SpG” (sin SpG) con respecto a NSB total (NSB), se determinó la contribución del anticuerpo de detección y SpG a la NSB del ensayo.

Para demostrar las mediciones de diagnóstico únicas que podían abordarse detectando moléculas individuales de una proteína en muestras clínicas humanas, se midió PSA en muestras de suero de pacientes que se habían sometido a prostatectomía radical (RP). PSA es un biomarcador sérico para cáncer de próstata usado como tanto herramienta de selección como para monitorizar la recidiva bioquímica de pacientes que se han sometido a prostatectomía radical. Tras la prostatectomía radical, se elimina la gran mayoría de PSA, y los niveles descienden por debajo del límite de detección de ensayos comerciales convencionales (3 pM o 0,1 ng/ml). La monitorización regular de estos pacientes para detectar el retorno de PSA puede detectar la recidiva de cáncer de próstata, pero pueden pasar varios años tras la cirugía para que se detecte la recidiva bioquímica mediante los inmunoanalizadores actuales. La capacidad para cuantificar de manera exacta los niveles de PSA en pacientes tras la prostatectomía a muy bajas concentraciones (< 3fM o 100fg/ml) puede proporcionar una indicación temprana de recidiva en caso de que los niveles de PSA aumenten. La figura 27 muestra los niveles de PSA medidos usando el ensayo de este ejemplo en el suero de treinta pacientes (con edades de 60-89) que se habían sometido a prostatectomía radical y cuya sangre se recogió al menos 6 semanas tras la cirugía. Los niveles de PSA en los sueros de los 30 pacientes estaban por debajo del límite de detección de ensayos comerciales. En este caso, se diluyeron muestras de suero completo 1:4 en tampón y se midieron usando el ensayo digital de PSA de este ejemplo (figura 14A). Se detectó satisfactoriamente PSA en los 30 pacientes usando el presente ensayo. Nueve de las treinta muestras se encontraban por debajo del LOD del ensayo de PSA de sensibilidad más alta anteriormente. Estos datos demuestran una posible utilidad clínica de determinados ensayos de la invención para medir proteínas en suero a concentraciones muy por debajo de la capacidad de la tecnología actual. La tabla 4 resume los resultados de pacientes.

La figura 27 muestra la detección digital de PSA en muestras de suero de pacientes que se han sometido a prostatectomía radical. Las concentraciones de PSA se determinaron usando el ensayo del presente ejemplo en muestras de suero de pacientes con RP (círculos (iv)), muestras de controles sanos (círculos (ii)) y muestras de control de PSA de Bio-Rad (círculos (i)). Las muestras de pacientes con RP se obtuvieron de SeraCare Life Sciences (Milford, MA) y todas tenían niveles de PSA indetectables tal como se midieron mediante un ensayo de diagnóstico clínico puntero (ADVIA Centaur); la línea (iv) representa el límite de detección del ensayo de PSA ADVIA Centaur (100 pg/ml o 3 pM). Las 30 muestras de pacientes estaban todas por encima del límite de detección del ensayo digital de p Sa de la invención, mostrado por la línea (v) (0,00584 pg/ml o 184 aM), con las concentraciones de PSA de pacientes más bajas medidas a 0,014 pg/ml (420 aM) usando el presente ensayo. Las muestras de pacientes con los niveles de PSA más bajos eran detectables, pero se aproximaban al LOD del ensayo dando como resultado una % de CV de dosis alta. El presente ensayo se validó para determinar la especificidad a PSA usando patrones de control (Bio-Rad) y suero de individuos sanos (ProMedDx) que se habían sometido a ensayo usando el ensayo de PSA ADVIA Centaur (véase la tabla 5).

Tabla 4. Resumen de resultados de pacientes

Tabla 5.

La tabla 5 muestra que la especificidad del presente ensayo se confirmó usando muestras de PSA de Bio-Rad (controles) y ProMedDx (suero de individuos sanos) que se habían sometido a prueba previamente en un inmunoanalizador comercial (ADVIA Centaur, Siemens). Las concentraciones de PSA de las muestras de suero sanas determinadas usando el método a modo de fueron el (24 12) % menores que las determinadas originalmente en el ADVIA Centaur. Hay dos posibles explicaciones para este sesgo sistemático entre las dos tecnologías. En primer lugar, los valores de ADVIA Centaur se obtuvieron en suero reciente, mientras que los valores del presente ensayo se obtuvieron tras haberse congelado los sueros durante periodos de tiempo prolongados y haber experimentado un ciclo de congelación-descongelación. En segundo lugar, puede haber diferencias entre los calibradores de PSA usados para generar las curvas de calibración, lo que podría dar como resultado diferencias en las concentraciones de PSA determinadas. Se usó PSA complejo de la Organización mundial de la salud (OMS) como calibradores; el PSA de calibración de ADVIA Centaur se desconoce.

Aislando y detectando inmunocomplejos individuales formados en ELISA, determinados ensayos de la invención pueden conferir mejoras en sensibilidad, precisión e intervalo dinámico con respecto a métodos de lectura convencionales y otros enfoques ultrasensibles conocidos. Aunque determinados ensayos de la invención pueden proporcionar una sensibilidad por debajo del límite detectable del patrón y formatos de lectura ultrasensible en suero, pueden estar disponibles potencialmente dos log más de sensibilidad basándose en el LOD de la etiqueta de enzima (figura 15). La capacidad para aislar e interrogar moléculas individuales en perlas individuales según determinadas realizaciones de la invención puede facilitar la distinción de acontecimientos de unión de anticuerpo-antígeno verdaderos de complejos unidos no específicamente. La identificación y diferenciación de estas dos poblaciones puede permitir la detección de una molécula de biomarcador individual en una muestra de suero humano.

Captura de proteínas sobre perlas magnéticas y formación de inmunocomplejo marcado con enzima (figuras 14 y 27). Se prepararon perlas funcionalizadas con un anticuerpo frente a la proteína diana según las instrucciones del fabricante. Se incubaron disoluciones de prueba que contenían la proteína de interés con suspensiones de 200000 perlas magnéticas durante 2 h a temperatura ambiente. Entonces se separaron las perlas y se lavaron tres veces en PBS y Tween-20 al 0,1 %. Se resuspendieron las perlas y se incubaron con disoluciones que contenían anticuerpo de detección (normalmente, 1-3 nM) durante 45 min a temperatura ambiente. Entonces se separaron las perlas y se lavaron tres veces en PBS y Tween-20 al 0,1 %. Se incubaron las perlas con disoluciones que contenían SpG (1­ 50 pM) durante 30 min a temperatura ambiente, se separaron y se lavaron seis veces en PBS y Tween-20 al 0,1 %. Entonces se resuspendieron las perlas en 10 |il de PBS y se cargaron sobre una matriz de pocillos de femtolitro.

Ejemplo 20

La figura 28 muestra un histograma de la intensidad de fluorescencia promedio de recipientes de reacción en un experimento. Se analizó un conjunto representativo de imágenes a partir del experimento para determinar poblaciones de recipientes de reacción que: (i) no contenían perlas; (ii) contenían una perla (a partir de dispersión de luz blanca) pero sin enzima (sin aumento en la intensidad de fluorescencia); y (iii) contenían una perla (a partir de dispersión de luz blanca) y una enzima (intensidad de fluorescencia creciente a lo largo de cuatro imágenes consecutivas, y un aumento global en la fluorescencia de al menos el 20 %). Específicamente, la línea (i) representa datos de recipientes de reacción vacíos, la línea (ii) representa recipientes de reacción con una perla pero sin enzima (perlas “inactivas”), y la línea (iii) representa recipientes de reacción con tanto una perla como con actividad enzimática (perlas “activas”).

Ejemplo 21

El siguiente ejemplo describe la determinación de ubicaciones de ensayo que comprenden un objeto de captura usando objetos de captura (por ejemplo, perlas) que son fluorescentes.

En algunos casos, puede ser ventajoso determinar la presencia o ausencia de perlas en una ubicación (por ejemplo, un pocillo en este ejemplo) usando métodos distintos de métodos de detección de campo oscuro. En algunos casos, los métodos de métodos de detección de campo oscuro pueden no ser ideales porque 1) la dispersión de la fuente de luz puede enviar un campo de luz no uniforme a la superficie de la matriz de perlas y, por tanto, la distribución de intensidad de la luz dispersada producida por pocillos que comprenden perlas puede ser amplia y los pocillos con perlas que están en la región de intensidad alta extrema o baja extrema de la distribución puede que no se determinen de manera exacta que contienen una perla; 2) pequeñas diferencias en la dispersión a partir de pocillos con perlas y vacíos pueden dar como resultado algoritmos de detección basados en diferencias locales, de pocillo a pocillo en la dispersión que carecen de la exactitud deseada a una ocupación de perlas altas debido a que las diferencias de pocillo a pocillo son demasiado pequeñas como para detectarse de manera constante; y 3) el uso de dispersión de campo oscuro para detectar perlas puede eliminarse usando diferentes tipos de perla en la misma matriz con los propósitos de multiplexado.

Están disponibles comercialmente microesferas de muchos colores y longitudes de onda de emisión fluorescente diferentes y se emplearon algunas en un ensayo tal como se describe en el presente documento. Se eligieron las longitudes de onda de emisión de modo que no hubiera solapamiento espectral con las longitudes de onda de lectura para detectar el colorante resorufina producido por la catálisis de una única molécula de enzima (excitación/emisión 570/590) que se usó en este ejemplo como entidad detectada. En experimentos que investigan perlas fluorescentes disponibles comercialmente (por ejemplo, perlas marcadas con FITC y marcadas con Qdot 525), la cantidad de colorante fluorescente cargado en las perlas, en algunos casos, era tan alta que la fluorescencia de las perlas se desbordaba al canal de resorufina (570/590). Es importante en algunas realizaciones tener una baja fluorescencia de fondo con respecto a las longitudes de onda de detección de las moléculas de analito porque la cantidad de producto de fluorescencia en los pocillos (por ejemplo, a partir de las moléculas de analito) puede ser relativamente pequeña.

Por consiguiente, en este ejemplo, se cargaron perlas (por ejemplo, tal como se describe a continuación) con cantidades variables de colorantes de modo que las perlas podían contarse fácilmente mediante el sistema de obtención de imágenes, mientras que se mantenía la cantidad de colorante lo suficientemente baja como para que no interfiriera con el nivel de fondo actual del sistema. En este ejemplo, cada superficie de la perla comprendía aproximadamente 100000 moléculas de anticuerpo (por ejemplo, componentes de captura), y solo una fracción muy pequeña de estos anticuerpos se usa entonces para asociar una molécula o partícula de analito. Por ejemplo, si se asocian aproximadamente 10 moléculas de analito con una perla en promedio, solo 10 moléculas de anticuerpo de captura moléculas (el 0,01 % de componentes de captura) tienen una molécula diana unida, que entonces se detectan mediante el sistema. Debido a la gran fracción de anticuerpos no usados disponibles sobre la superficie de la perla, el enfoque de etiquetado con colorante en este ejemplo empleó unión covalente de moléculas de colorante directamente a los anticuerpos sobre la superficie de la perla.

El éster de sulfodiclorofenol Alexa Fluor® 488 (éster de SDP AF-488) es una molécula de colorante reactivo de amina adquirida de Invitrogen que se usó en este ejemplo. Se incubaron perlas recubiertas con anticuerpo con diversas razones molares del éster de SDP AF-488. Se sometieron a prueba razones de anticuerpo:éster de SDP AF-488 de desde 1:27 hasta 1:800, todas las cuales dieron una señal de brillo en el canal de Alexa 488. La figura 29A muestra las perlas de anticuerpo modificadas a una razón de 1:27. Se observaron las perlas en el canal de Alexa 488, mientras que la fluorescencia del canal de resorufina de fondo de las perlas modificadas con AF-488 parece ser comparable a las perlas con anticuerpo no modificadas convencionales. Específicamente, la figura 29A muestra una imagen de una parte de la matriz convencional usando el canal de resofurina; la figura 29B una imagen de una parte de las perlas a una razón molar de 1:27 modificadas con Alexa 488 usando el canal de resofurina; y la figura 29C una imagen de una parte de las perlas a una razón molar de 1:27 modificadas con Alexa 488 usando el canal de Alexa 488.

La tabla 6 muestra las intensidades relativas de tanto las perlas modificadas con Alexa 488 como de las perlas no modificadas convencionales en ambos canales fluorescentes. Las perlas convencionales dieron una fluorescencia de fondo similar en ambos canales, y las perlas con Alexa 488 dieron una señal brillante en el canal de Alexa (~400 cuentas) mientras se mantenía una señal de fondo de resorufina que es comparable a las perlas convencionales.

Tabla 6.

Comparando la intensidad de las perlas modificadas con una curva de calibración de Alexa-488, se calculó que cada perla tenía aproximadamente 5.000 moléculas de colorante de Alexa-488 unidas. Con un número tan bajo de moléculas de colorante sobre la superficie de la perla, se realizaron experimentos para evaluar si el procedimiento de etiquetado con Alexa-488 tenía un impacto negativo sobre las perlas con anticuerpo en un ensayo de detección de proteínas. Las perlas con anticuerpo que se etiquetaron con colorante Alexa-488 se unen específicamente a proteína Tau, para una proteína relevante para la enfermedad de Alzheimer. Se compararon perlas de control y perlas con Alexa-488 con anticuerpo de captura específico para Tau en un ensayo similar al descrito en los ejemplos 3, 5, 8, 9 y 10 anteriormente, pero con anticuerpos anti-Tau. Los resultados mostrados en la figura 29D sugieren que la conjugación con Alexa-488 tiene poco o ningún impacto sobre el rendimiento de las perlas en el ensayo. Específicamente, la figura 29D muestra resultados que comparan la señal de perlas de control y perlas etiquetadas con Alexa-488 para el ensayo de Tau.

Mientras que los resultados de ensayo iniciales muestran que la conjugación con Alexa-488 tiene poco o ningún impacto negativo sobre el rendimiento de las perlas de anticuerpo usadas en el ensayo, también se determinó si el etiquetado con Alexa-488 daba como resultado una ventaja en el recuento de perlas con respecto a perlas de ensayo sin marcar. Los resultados de esta determinación se resumen en la tabla 7. Los resultados se determinaron usando dos modos de análisis de una única tira usando perlas conjugadas con Alexa-488 en el ensayo de Tau. Se analizó esta tira usando el método de campo oscuro convencional, y también el método de detección de Alexa-488. Resultados comparando el método de campo oscuro con el método de detección de fluorescencia para contar perlas revelan una mejora en el método de detección de Alexa-488 con respecto al método de campo oscuro. A lo largo de las matrices, no se contaron ninguna de 1300 a 6500 perlas usando la obtención de imágenes de campo oscuro.

Tabla 7.

Ejemplo 22

En determinadas realizaciones de los métodos de ensayo, puede haber una variación en el tiempo transcurrido entre la adición de detector anticuerpo y la interrogación de determinadas matrices o regiones de matrices frente a la interrogación de otras matrices o regiones. En determinados casos, la disociación que puede producirse a lo largo de tales intervalos de tiempo puede dar como resultado inexactitudes en determinaciones realizadas posteriormente frente determinaciones realizadas anteriormente de las concentraciones de molécula de analito. Este ejemplo investigó el efecto de las medidas para reducir la disociación sobre la exactitud de la variante de tiempo de determinaciones de ensayo. En este ejemplo, el ensayo comprendía las siguientes etapas:

1. Se formaron inmunocomplejos de moléculas de PSA etiquetadas con enzima (anticuerpo anti-PSA de captura, PSA en suero, anticuerpo de detección biotinilado anti-PSA, y SpG) sobre perlas magnéticas y se lavaron usando métodos similar similares a los descritos en los ejemplos 3 y 5. Se intercambiaron perlas magnéticas que presentan inmunocomplejos en tampón que contenía un determinado hidrato de carbono (por ejemplo, sacarosa, tehalosa, etc.), o cualquier otra especie molecular que pueda ayudar a mantener el estado de hidratación de proteínas.

2. Tras cargar las perlas en los micropocillos de matrices de haz de fibras usando métodos similares a los descritos en el ejemplo 9, se eliminó el exceso de tampón mediante secado al aire/a vacío.

3. Se almacenó el haz de fibras con perlas cargadas durante diversos periodos de tiempo.

4. Justo antes de la generación de la señal/lectura de la matriz, se sumergieron los haces de fibras secados en tampón PBS, se limpiaron con un hisopo, se sumergieron en tampón PBS de nuevo, y luego se sumergieron en una disolución que contenía RGP 100 |iM. Entonces se sellaron las matrices y se leyeron usando métodos similares a los descritos anteriormente en el ejemplo 10.

La disociación del anticuerpo de detección biotinilado de la molécula de analito capturada, en particular, puede provocar una caída de señal continua a lo largo del tiempo. En determinados casos, la disociación puede representar más del 50 % de caída de señal a lo largo del transcurso de la interrogación de una matriz o series de matrices durante la realización de un ensayo (por ejemplo, véase la figura 30A). La figura 30A muestra datos de los experimentos similares llevados a cabo a lo largo de cuatro días diferentes. En estos experimentos, se prepararon inmunocomplejos de PSA etiquetado con enzima simultáneamente sobre perlas en 64 pocillos de una placa de 96 pocillos que estaban dispuestos en columnas de 8 pocillos. Entonces se sometieron a prueba las perlas de cada columna en una tira de 8 matrices usando detección de una única molécula (ejemplo 10) a tiempos crecientes (mostrados en el eje x). Cada punto de datos en la concentración promedio de PSA determinada a partir de una columna de 8 pocillos mediante comparación con una curva de calibración que se obtuvo antes de que se sometiera a prueba la primera columna. Esta caída a lo largo del tiempo (que se manifiesta como una caída en la concentración de PSA que se determina) puede ser más pronunciada en ensayos que usan proteínas como reactivos/dianas que en ensayos que implican ácidos nucleicos (por ejemplo, ADN). La disminución de la señal se ajusta a un modelo de disociación en determinados casos.

Llevando a cabo el secado de los pocillos en el presente ejemplo, se eliminaron los efectos de la disociación y/o se redujeron en hasta el 90 % (por ejemplo, véase la figura 30B).

Los expertos habituales en la técnica serán conscientes de que, aunque los inmunoensayos tradicionales (por ejemplo, ELISA) pueden sufrir pérdida de señal debido a la disociación de las entidades de detección, en general, no requieren un tratamiento especial para la disociación de inmunocomplejo porque las placas se leen muy rápidamente. Por ejemplo, en el plazo de un minuto o así, un lector de microplacas puede generar una señal para una placa de 96 pocillos completa. La diferencia en la disociación entre el pocillo 1 y el pocillo 96 dentro de este lapso de tiempo es insignificante. Sin embargo, para ensayos como los métodos descritos en el presente documento en los que la interrogación de los sitios de ensayo puede tardar en determinados casos un periodo de tiempo más prolongado, la disociación puede afectar a la precisión y/o exactitud de los métodos. Por consiguiente, el proceso de secado de los sitios de ensayo puede evitar la pérdida de una molécula de analito y/o ligando de unión y reducir los efectos de la disociación.

En algunas realizaciones, pueden proporcionarse componentes adicionales que mantienen la configuración y/o actividad biológica nativas de las moléculas de analito (por ejemplo, proteínas) en los micropocillos y que pueden proteger a los inmunocomplejos y/o agente(s) de marcaje(s) (por ejemplo, enzima(s)) durante el proceso de secado/rehidratación. Por ejemplo, pueden usarse pruebas de examen de rutina para identificar agentes que pueden mantener un complejo de anticuerpo/antígeno/enzima intacto y/o mantener la actividad enzimática tras el secado/la rehidratación. Sin tales agentes, el secado puede desnaturalizar y/o desactivar enzimas u otros componentes del ensayo. Por ejemplo, el examen de cosmótropos no iónicos conocidos reveló que los hidratos de carbono ayudan a mantener el 90-100 % de la señal del inmunocomplejo tras el tratamiento de secado/rehidratación. Pueden usarse hidratos de carbono y otras moléculas para mantener el anticuerpo activo durante la deshidratación en el ensayo de matriz de proteínas y/o puede usarse para mantener la actividad de la proteína durante la deshidratación/liofilización.

Ejemplo 23

El siguiente ejemplo describe la reticulación de un ligando de unión a una molécula de analito para ayudar en la prevención de la disociación del ligando de unión de la molécula de analito. En este ensayo, se formaron inmunocomplejos de PSA etiquetados con enzima sobre perlas usando métodos similares a los descritos en el ejemplo 3, 5 y 22, usando concentraciones de PSA de 0, 0,1 y 1 pg/ml añadidas de manera conocida a suero. Se hizo reaccionar un conjunto de perlas con 10 mg/ml de EDC durante 10 minutos para reticular el anticuerpo de detección con otras proteínas asociadas con las perlas, por ejemplo, PSA, anticuerpo de captura y proteínas de bloqueo. No se hicieron reaccionar perlas de control con EDC. Entonces se leyeron las perlas de control usando métodos similares a los descritos anteriormente en el ejemplo 10 a t = 0 y luego 2 horas más tarde. También se leyeron las perlas reticuladas usando métodos similares a los descritos en el ejemplo 10 a aproximadamente 2 horas tras la reticulación. El resultado mostró que tras 2 horas el número de enzimas promedio por perla sobre las perlas de control se redujo debido a la disociación del anticuerpo de detección. Sin embargo, las perlas reticuladas mantuvieron la alta AEB incluso tras 2 horas. Estos datos sugieren que la reticulación del anticuerpo de detección con proteínas asociadas irreversiblemente con las perlas eliminó sustancialmente los efectos de disociación. Además, la reticulación reforzó la señal, también tal como se muestra en la figura 31 (tratadas con EDAC; (ii)) en relación con la espera de 0 horas (i) presumiblemente debido al tiempo de disociación extra que experimentan las perlas de control antes de leerse.

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   i . Método para determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en una muestra de fluido, que comprende:

   exponer una pluralidad de perlas, cada una de las cuales incluye una superficie de unión que tiene afinidad por al menos un tipo de molécula o partícula de analito, a una disolución que contiene o se sospecha que contiene al menos un tipo de moléculas o partículas de analito;

   inmovilizar moléculas o partículas de analito con respecto a la pluralidad de perlas de manera que una fracción estadísticamente significativa de las perlas se asocia con una única molécula o partícula de analito y una fracción estadísticamente significativa de las perlas estén libres de cualquier molécula o partícula de analito; aislar individualmente al menos una parte de las perlas sometidas a la etapa de inmovilización del resto de dicha parte de las perlas;

   abordar individualmente al menos una parte de las perlas y determinar el número de dichas perlas asociadas con una molécula o partícula de analito, en el caso de detección directa, examinando y/o detectando una molécula o un resto que está comprendido en la molécula o partícula del analito o, en el caso de detección indirecta, examinando y/o detectando una molécula o un resto que está comprendido en un agente de marcaje que se ha convertido a partir de un agente de marcaje precursor por exposición a la molécula o partícula de analito; y

   determinar una medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido basándose al menos en parte en el número de perlas sometidas a la etapa de abordar que se determina que están asociadas con una molécula o partícula de analito;

   en el que cada una de las perlas está contenida dentro de una gota de líquido que es inmiscible dentro de un fluido en el que la gota está suspendida durante al menos la etapa de abordar; y

   en el que la etapa de abordar individualmente al menos una parte de las perlas comprende alimentar las gotas de líquido en una columna de manera que pasen por un sistema de detección óptica en una sola fila.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que al menos una parte de las moléculas o partículas de analito están asociadas con al menos un ligando de unión.
3. 3. Método según la reivindicación 1, en el que las moléculas o partículas de analito comprenden un componente enzimático.
4. 4. Método según la reivindicación 2, en el que el ligando de unión comprende un componente enzimático.
5. 5. Método según la reivindicación 1, en el que la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido es menor de aproximadamente 50 * 10-15 M, o menos de aproximadamente 40 * 10-15 M, o menos de aproximadamente 30 * 10-15M, o menos de aproximadamente 20 * 10-15M, o menos de aproximadamente 10 * 10-15 M, o menos de aproximadamente 5 * 10-15 M, o menos de aproximadamente 1 * 10-15.
6. 6. Método según la reivindicación 1, en el que la medida de la concentración de moléculas o partículas de analito en la muestra de fluido se determina al menos en parte mediante la comparación de un parámetro medido con patrones de calibración.

   

   
7. .

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   

   Ċ

   

   

   LO Lector de placas, log (u .f.r)

   

   Q ~|................................................... I 1 ......................... I 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000

   Número de perlas añadidas a la matriz FIG. 16

   FtG. 17A

   

   FIG. 17B

   

   FG. 17C

   
8. . .

   ^Artü _{6D.Í2 ljT} ^H _{W m} ^Camaya PiCytl*

   

   

   

   

   

   FIG. 19A

   

   [E s t repta vi d i n a - p-g a la cto si das a ] (a M)

   FIG. 19B

   

   Varianza experimental (%)

   FIG. 20

   

   100 pM 10 pM 1 pM

   [ E strepta v i d ina-p-ga I actosi dasa]

   FIG, 21

   

   1 pM/ 100 pM/ 1 pM/

   00K perlas 150K perlas 150K perlas [Estreptavid ina-p-galactosidasa]M úm ero de perlas

   FIG. 22

   

   [E stre ptav i d¡ n a-p-gal actos ida sa]

   FIG. 23

   

   [Fosfatasa alcalina] (fM)

   FIG. 24

   

   

   FIG. 25C

   

   FIG. 25D

   

   

   

   FIG. 29D

   

   FIG. 30A

   Cü O

   c o ó t i­

   

   |LEJ/6d V S d

   Ċ

   

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