JP2023034431A - デジタルアッセイ方法及びデジタルアッセイキット - Google Patents

Abstract

【課題】デジタルアッセイの操作をより簡便かつ簡易にするために利用可能な技術の提供する。【解決手段】溶液中の物質の濃度を決定するデジタルアッセイ方法であって、（１）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板を提供する手順と、（２）基板の前記チャンバーアレイ領域上に物質を含む溶液を導入する手順と、（３）リアクタのそれぞれの内部の物質の存在の有無を、物質の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する手順と、（４）物質の存在が検出されたリアクタの数に基づいて溶液中の前記物質の濃度を決定する手順と、を含む方法。【選択図】図３

Description

本開示は、溶液中の物質の濃度を決定するためのデジタルアッセイ方法及びデジタルアッセイキットに関する。より詳しくは、極小容積のチャンバーが多数配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板と粘着テープとを用いて基板上に極小容積のリアクタを多数形成する手順を含むデジタルアッセイ方法等に関する。

溶液中の物質の絶対濃度を決定するための技術としてデジタルバイオアッセイがある。デジタルバイオアッセイは、溶液中の物質の濃度が低くかつ多数のリアクタのそれぞれの容積が小さいという条件下で溶液を各リアクタに導入すると、大部分のリアクタには物質は導入されず、残りのリアクタに物質が１分子ずつ導入されることを測定原理とする。例えば物質が酵素である場合、酵素との反応によって蛍光を発するフルオロジェックアッセイ基質を酵素とともにリアクタに導入することで、酵素反応によって生じるリアクタからの蛍光信号を「０」と「１」に二値化できる。そして、この「１」の信号の回数を数え上げることで酵素の絶対濃度を決定できる。

特許文献１には、デジタルバイオアッセイに応用可能な技術として、「互いに隔てられて形成された複数のレセプタクル内に収容された微小物質を検出する方法であって、（１）前記レセプタクルが形成されている下層部と、当該下層部における当該レセプタクルが形成されている面に対向する上層部と、の間の空間に、前記微小物質を含む溶媒を導入する手順と、（２）上記空間にガスを導入して、前記レセプタクル内に、前記微小物質を包含する、溶媒の液滴を形成する手順と、（３）前記液滴内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する手順と、を含む、方法。」が開示されている。この技術は、レセプタクル内に微小物質を包含する液滴を形成させてリアクタとするに際してガスを用いることを特徴とするものである。

国際公開２０１８／１８１４８８号

本開示は、デジタルアッセイの操作をより簡便かつ簡易にするために利用可能な技術を提供することを主な目的とする。

上記の課題を解決するために、本開示は、以下の［１］－［１６］を提供する。
［１］ 溶液中の物質の濃度を決定するデジタルアッセイ方法であって、
（１）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板を提供する手順；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
（２）前記基板の前記チャンバーアレイ領域上に物質を含む溶液を導入する手順と、
（３）前記基板の前記チャンバーアレイ領域を、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープで被覆し、続いて該粘着テープの前記粘着剤層を基板表面に圧着させることにより、前記チャンバーアレイ領域上の余剰の前記溶液を該チャンバーアレイ領域外へ排するとともに、前記チャンバーのそれぞれの内部に前記溶液を液密に封止してリアクタとする手順と、
（４）前記リアクタのそれぞれの内部の前記物質の存在の有無を、前記物質の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する手順と、
（５）前記物質の存在が検出されたリアクタの数に基づいて前記溶液中の前記物質の濃度を決定する手順と、
を含む、方法。
［２］ 前記粘着テープの前記粘着剤層が、ゴム系粘着剤組成物及び／又はシリコーン系粘着剤組成物からなる、［１］の方法。
［３］ 前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［２］の方法。
［４］ 前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［３］の方法。
［５］ 前記粘着剤層の厚みが、２μｍを超え１０００μｍ以下である、［１］－［４］のいずれかの方法。
［６］ 前記基板の前記表面はフッ素樹脂皮膜により構成されて疎水性を有し、該表面から陥凹して設けられる前記チャンバーは、該フッ素樹脂皮膜からなる疎水性の隔壁と、該フッ素樹脂皮膜を有さない親水性の底面と、から区画される、［１］－［５］のいずれかの方法。
［７］ 前記基板の前記表面が親水化されている、［１］－［５］のいずれかの方法。
［８］ 前記チャンバーの直径が０．０５－１０００μｍ、深さが０．００１－１０００μｍであり、配設間隔が５－１０μｍである、［１］－［６］のいずれかの方法。

［９］ 溶液中の物質の濃度を決定するためのデジタルアッセイキットであって、
（Ａ）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
（Ｂ）前記基板の前記チャンバーアレイ領域に貼付される、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープ；ここで前記粘着テープの前記粘着剤層は、ゴム系粘着剤及び／又はシリコーン系粘着剤からなる；と、
を含む、キット。
［１０］ 前記粘着テープの前記粘着剤層が、ゴム系粘着剤組成物及び／又はシリコーン系粘着剤組成物からなる、［９］のキット。
［１１］ 前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［１０］のキット。
［１２］ 前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［１１］のキット。
［１３］ 前記粘着剤層の厚みが、２μｍを超え１０００μｍ以下である、［９］－［１２］のいずれかのキット。
［１４］ 前記基板の前記表面はフッ素樹脂皮膜により構成されて疎水性を有し、該表面から陥凹して設けられる前記チャンバーは、該フッ素樹脂皮膜からなる疎水性の隔壁と、該フッ素樹脂皮膜を有さない親水性の底面と、から区画される、［９］－［１３］のいずれかのキット。
［１５］ 前記基板の前記表面が親水化されている、［９］－［１３］のいずれかのキット。
［１６］ 前記チャンバーの直径が０．０５－１０００μｍ、深さが０．００１－１０００μｍであり、配設間隔が５－１０μｍである、［９］－［１５］のいずれかのキット。

本開示により、デジタルアッセイの操作をより簡便かつ簡易にするために利用可能な技術が提供される。

チャンバーアレイチップを説明するための図である。 チャンバーアレイチップを説明するための図である。 デジタルアッセイ方法の手順を説明するための図である。 ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系の粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いたβ-ガラクトシダーゼ（βgal）の一分子検出試験の結果を示す。 ゴム系粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いたβ-ガラクトシダーゼ（βgal）の一分子検出試験の結果を示す。

以下、本開示を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。

本開示に係るデジタルアッセイ方法は、溶液中の物質（以下、「対象物質」と称する）の濃度を決定する方法であって、以下の手順を含む。
（１）基板提供手順
（２）溶液導入手順
（３）封入手順
（４）検出手順
（５）濃度決定手順

１．基板提供手順
本手順では、容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板（以下、「チャンバーアレイチップ」と称する）を提供する。

図１及び図２にチャンバーアレイチップを示す。
チャンバーアレイチップ１は、チャンバー２が多数配列されたチャンバーアレイ領域３を有する。
チャンバーアレイチップ１のサイズや形状は、特に限定されない。一例として幅３２ｍｍ、奥行２４ｍｍの矩形で、厚さ２ｍｍである。チャンバーアレイチップ１のサイズは、幅１－１００ｍｍ、奥行１－１００mｍで、厚さ０．１－１０ｍｍであってよい。チャンバーアレイチップ１の形状は、矩形、正方形、円形及び楕円形などであってよい。
チャンバーアレイ領域３のサイズは、チャンバーアレイチップ１よりも小さければよく、形状も特に限定されないが、上記の例において幅２０ｍｍ、奥行２０ｍｍの矩形である。チャンバーアレイ領域３のサイズは、幅０．１－３０ｍｍ、奥行０．１－３０ｍｍであってよい。チャンバーアレイ領域３の形状は、矩形、正方形、円形及び楕円形などであってよい。

チャンバー２のサイズや形状も、特に限定されないが、一例として直径（ｄ）４μｍ、深さ（ｈ）３μｍの円柱形又は略円柱形である。チャンバー２のサイズは、直径（ｄ）０．０５－１０００μｍ、深さ（ｈ）０．００１－１０００μｍであってよい。チャンバー２のサイズや形状は、成形のしやすさの観点から、円柱形あるいは角柱形であることが好ましい。チャンバー２の容積は、１アトリットル－５０ナノリットルであり、好ましくは１０フェムトリットル－１００フェムトリットルである。チャンバーアレイ領域３におけるチャンバー２の配設数及び間隔（ピッチ）は、適宜設定され得る。配設数は、例えば１万個－１００億個であり、好ましくは１０万－１０００万個である。チャンバー２同士の間隔（ピッチ）は、例えば０．０５－３０μｍであり、好ましくは５－１０μｍである。

チャンバーアレイチップ１は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチング、又はプラスチック製基板のナノインプリントや射出成型、切削加工などの公知の技術を用いて成形できる。
チャンバーアレイチップ１は、好適には、汎用のフォトリソグラフィー法によって基板１１上にチャンバー２をパターン形成することによって得られる。具体的には、例えばガラス製の基板１１上にスピンコートとベーク処理によってフッ素樹脂皮膜１２を形成し、さらにフッ素樹脂皮膜１２上にフォトレジスト皮膜（不図示）を形成する。チャンバー２の形状がパターニングされたマスクを介してフォトレジスト皮膜に紫外線を照射した後、基板１１をレジスト用現像液に浸漬し、フォトレジスト皮膜のうち紫外線照射された部分を除去する。ドライエッチングによりレジスト除去部分のフッ素樹脂皮膜１２を除去して、チャンバー２の底面２１となる基板１１の表面を露出させる。最後に、基板１１を洗浄してレジスト皮膜を完全に除去する。以上の工程によって、基板１１上に、残存したフッ素樹脂皮膜１２を隔壁２２とし、基板１１の表面を底面２１とするチャンバー２を多数形成できる。得られたチャンバーアレイチップ１の最表面１３は、隔壁２２として残存したフッ素樹脂皮膜１２により構成され、疎水性を有する。チャンバー２は、最表面１３から陥凹して設けられ、チャンバー２の底面２１は、ガラス製の基板１１の表面であって親水性を有する。
チャンバーアレイチップ１の最表面１３は、それを構成するフッ素樹脂皮膜１２に対して親水処理を行うことにより、親水化されていることが好ましい。親水処理は、例えばポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコールなどの親水性ポリマーをフッ素樹脂皮膜１２にコーティングしたり、プラズマ処理でフッ素樹脂皮膜１２の官能基を親水性のものに改質したりすることによって行い得る。
また、チャンバー２のパターン形成に、フッ素樹脂に替えて親水性のポリマーの皮膜を用いることによっても、最表面１３が親水化されたチャンバーアレイチップ１を得ることができる。

基板１１は、光透過性を有する材質とされ、例えばガラスや各種プラスチック（ＰＰ、ＰＣ、ＰＳ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、ＰＥＴ、ＰＶＣ等）とされる。基板１１の材質は、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいため、光学誤差の少ない材質を選択することが好ましい。

フッ素樹脂皮膜１２を形成するためのフッ素樹脂には、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００などの市販のものを利用できる。微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が好ましい。

２．溶液導入手順
本手順では、チャンバーアレイチップ１のチャンバーアレイ領域３上に対象物質を含む溶液を導入する。

図３を参照して説明する。
チャンバーアレイチップ１のチャンバーアレイ領域３上に対象物質４を含む溶液Ｓを導入する（図３（Ａ）参照）。対象物質４を含む溶液Ｓ（以下、「サンプル液Ｓ」と称する）は、対象物質４の存在に起因して蛍光物質を生じさせるプローブ５を含んでいてもよい。サンプル液Ｓの導入は、例えばチャンバーアレイ領域３上にサンプル液Ｓを滴下することによって行えばよい。
チャンバーアレイチップ１の最表面１３が親水化されている場合、滴下されたサンプル液Ｓはチャンバー２のそれぞれの内部にまで導入され得る。
一方、チャンバーアレイチップ１の最表面１３が疎水性を有する場合、図３（Ａ）に示すように滴下されたサンプル液Ｓが疎水性の最表面１３に担持されて液滴状となる場合がある。この場合、本手順では、サンプル液Ｓがチャンバー２の内部にまで完全に導入されることは要さない。

［対象物質］
対象物質４は、チャンバー２内に収容され得る大きさの物質であればよく、核酸、タンパク質、糖、脂質、アミノ酸、ペプチド、化学物質又はこれらの複合体等であってよい。
対象物質４は各種疾患のマーカーとなるものであってもよく、この場合において対象物質４は特にウイルスやバクテリア、細胞等であってよい。
疾患のマーカーは生体試料に含まれるものであってよく、生体試料は、例えば血液、血漿、血清、尿、涙液、唾液、鼻又は喉の拭い液などであってよい。

プローブ５は、対象物質４の存在に起因して蛍光物質を生じさせ得る物質であればよく、細胞（レポーター細胞）であってもよい。レポーター細胞及としては、抗体や成長因子などのタンパク質の存在下で転写プロモーターが活性化しGFPやルシフェラーゼなどの蛍光・発光タンパク質を発現するように改変された細胞株や、特定化学物質（一例としてヒ素イオンなどの毒素や、メバロン酸、フコース及びバニリン等の代謝産物や糖など）の存在下で蛍光・発光タンパク質を発現するように改変された大腸菌などが公知である。

核酸は、DNA又はRNAであってよく、DNA及びRNAは生物由来でも人工合成されたものでもよく、環状でも直鎖でも良い。核酸との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された、オリゴDNAヌクレオチド及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
タンパク質は、酵素、抗体、細胞表面タンパク質、その他細胞由来タンパク質、ウイルス由来タンパク質、又は人工タンパク質などであってよい。タンパク質との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。酵素は特にウイルスの表面に存在する酵素であってよい。酵素との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、酵素によって切断される基質と蛍光物質とを結合させたフルオロジェックアッセイ基質が挙げられる。具体的には、例えば対象物質４がインフルエンザウイルスである場合、フルオロジェックアッセイ基質５には、インフルエンザウイルスが表面に有するノイラミニダーゼと反応して切断されて蛍光物質を遊離させるFDG（Fluorescein-D-Galactopyranoside）を用いることができる。
糖は、天然もしくは人工の糖鎖もしくは単糖であってよい。糖との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体やレクチン、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
脂質は、エキソソーム、リポソーム、ミセル、又は脂質分子などであってよい。脂質との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
アミノ酸及びペプチドは、アミノ酸が一つまたは複数（一般的には50以下）つながった構造をもったものであってよい。アミノ酸及びペプチドとの組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。

対象物質４は、担体に保持されていてもよい。担体としては、マイクロビーズが汎用されている。「マイクロビーズ」は、「粒子」と同義に用いられ、当技術分野において慣用技術である。マイクロビーズの形状は、特に限定されないが、通常球形とされる。マイクロビーズの材料も、特に限定されず、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレン及び磁性体などであってよい。具体的な材料として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、ジビニルベンゼンン等と架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレンデキストラン、ゴム、ケイ素、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然スポンジ、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標））およびアガロースゲル（セファロース（商標））などが挙げられる。ビーズは、多孔性であってもよい。

蛍光物質は、当該分野において既知の任意のものであってよく、例えば以下が例示される。４－メチルウンベリフェロン；６－カルボキシ－４'，５'－ジクロロ－２'，７'－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシエオシン；５－カルボキシフルオレセイン；６－カルボキシフルオレセイン；５－（および６－）－カルボキシフルオレセイン；５－カルボキシフルオレセイン－ビス－（５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル）エーテル、－アラニン－カルボキシアミドもしくはスクシンイミジルエステル；５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（４，６－ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン；２'，７'－ジフルオロフルオレセイン；エオシン－５－イソチオシアナート；エリスロシン－５－イソチオシアナート；６－（フルオレセイン－５－カルボキシアミド）ヘキサン酸もしくはスクシンイミジルエステル；６－（フルオレセイン－５－（および－６）－カルボキシアミド）ヘキサン酸もしくはスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－EXスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－イソチオシアナート；フルオレセイン－６－イソチオシアナート；Oregon Green（登録商標）488カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；Oregon Green488イソチオシアナート；Oregon Green488－Xスクシンイミジルエステル；Oregon Green500カルボン酸；Oregon Green500カルボン酸、スクシンイミジルエステルもしくはトリエチルアンモニウム塩；Oregon Green514カルボン酸；Oregon Green514カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；Rhodamine Green（登録商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステルもしくは塩酸塩；Rhodamine Greenカルボン酸、トリフルオロアセタミドもしくはスクシンイミジルエステル；Rhodamine Green－Xスクシンイミジルエステルもしくは塩酸塩；Rhodol Green（登録商標）カルボン酸、N,O－ビス－（トリフルオロアセチル）もしくはスクシンイミジルエステル；ビス－（４－）カルボキシピペリジニル）スルホンローダミンもしくはジ（スクシンイミジルエステル）；５－（および－６）－カルボキシナフトフルオレセイン、５－（および－６）－カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－カルボキシローダミン ６G 塩酸塩；６－カルボキシローダミン ６G 塩酸塩；５－カルボキシローダミン ６G スクシンイミジルエステル；６－カルボキシローダミン ６G スクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシローダミン ６G スクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－２'，４'，５'，７'－テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステルもしくはビス－（ジイソプロピルエチルアンモニウム）塩；５－カルボキシテトラメチルローダミン；６－カルボキシテトラメチルローダミン；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン；５－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－X－ローダミン；５－カルボキシ－X－ローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－X－ローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシ－X－ローダミンスクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－X－ローダミントリエチルアンモニウム塩；Lissamine（商標）ローダミンB塩化スルホニル；マラカイトグリーンイソチオシアナート；NANOGOLD（登録商標）モノ（スルホスクシンイミジルエステル）；QSY（登録商標）21カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；QSY７カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；Rhodamine Red（商標）－Xスクシンイミジルエステル；６－（テトラメチルローダミン－５－（および－６）－カルボキシアミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル；テトラメチルローダミン－５－イソチオシアナート；テトラメチルローダミン－６－イソチオシアナート；テトラメチルローダミン－５－（および－６）－イソチオシアナート；Texas Red（登録商標）スルホニル；Texas Red塩化スルホニル；Texas Red－X STPエステルもしくはナトリウム塩；Texas Red－X スクシンイミジルエステル；ならびにX－ローダミン－５－（および－６）－イソチオシアナートなど、及びこれらの組み合わせ。

［溶液］
対象物質４は、水又は緩衝液に溶解されている。
緩衝液は、特に限定されないが、ＭＯＰＳ（3-(N-morpholino) propanesulfonic acid）、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、Ｔｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）、ＤＥＡ（Diethanolamine）等が用いられ得る。

３．封入手順
本手順では、チャンバーアレイチップ１のチャンバーアレイ領域３を、粘着テープ６で被覆し、続いて粘着テープ６をチャンバーアレイチップ１の最表面１３に圧着させることにより、チャンバーアレイ領域３上の余剰のサンプル液Ｓをチャンバーアレイ領域３外へ排するとともに、チャンバー２のそれぞれの内部にサンプル液Ｓを液密に封止してリアクタとする。

図３を参照して説明する。
まず、サンプル液Ｓを滴下したチャンバーアレイ領域３を粘着テープ６で被覆する（図３（Ｂ）参照）。粘着テープ６は基材層６１と粘着剤層６２とを含んでなるが、この被覆時には粘着テープ６の粘着剤層６２はチャンバーアレイチップ１の最表面１３には接触させないようにする。サンプル液Ｓは、粘着テープ６に押し潰されるようにして粘着テープ６の粘着剤層６２とチャンバーアレイチップ１の最表面１３との間に形成される空間に広がり（図中左右方向）、サンプル液Ｓの一部がチャンバー２の内部に導入されてチャンバー２の内部がサンプル液Ｓによって充満される。チャンバー２の内部に入りきらなかった余剰のサンプル液Ｓの一部はチャンバーアレイ領域３外に押し出される。

この際、チャンバーアレイチップ１を冷却することで、チャンバー２の内部へサンプル液Ｓが導入されることを促進できる。冷却の温度は、室温より低ければよいが、例えば０－１０℃、好ましくは２－５℃である。チャンバーアレイチップ１の冷却は、例えばチャンバーアレイチップ１を氷の上に置いたアルミブロックの上に静置することによって行うことができる。
チャンバー２の内部へのサンプル液Ｓの導入促進のため、チャンバーアレイチップ１に振動を加えたり、陰圧下に置いてチャンバー２内の空気を脱気したりしてもよい。また、サンプル液Ｓに界面活性剤を添加することによっても、チャンバー２の内部へのサンプル液Ｓの導入を促進できる。なお、サンプル液Ｓの導入促進のためのこれらの処置は、溶液導入手順において行うこともできる。

次に、粘着テープ６の粘着剤層６２をチャンバーアレイチップ１の最表面１３に圧着させる（図３（Ｃ）参照）。これにより、チャンバー２の内部に入りきらなかった余剰のサンプル液Ｓを完全にチャンバーアレイ領域３外に排出するとともに、チャンバー２のそれぞれの内部にサンプル液Ｓを液密に封止してリアクタとする。粘着テープ６の圧着は、例えばチャンバーアレイチップ１を安定した平らな作業台に置き、粘着テープ６上に適当な押圧力を加えつつローラーを往復させることにより行うことができる。

サンプル液Ｓ中の対象物質４の濃度が低い場合、各チャンバー２には、対象物質４が１分子導入されるか全く導入されないかのどちらかとなる。
測定される対象物質４の濃度範囲は、通常１ｚＭ－１ｍＭの範囲である。
一方で、プローブ５がサンプル液Ｓに含まれる場合、プローブ５は、全てのチャンバー２に１分子あるいは２分子以上導入されるように、対象物質４の濃度に比して十分に高い濃度でサンプル液Ｓ中に含まれることが好ましい。

［粘着テープ］
粘着テープ６には、好ましくは光透過性を有するものが用いられる。ただし、検出手順で用いる光学検出系の構成によっては光透過性は必須とはならない。具体的には、励起光の照射と蛍光の検出をいずれもチャンバーアレイチップ１の下方から行う場合や、励起光の照射を要せずに発光し得るプローブ５を用いてチャンバーアレイチップ１の下方から検出を行う場合には、粘着テープ６は光不透過性であってよい。

粘着テープ６は、基材層６１に粘着剤組成物の溶液を塗布し、溶媒を揮発させて粘着剤層６２を形成させることにより得ることができる。粘着剤組成物の溶媒への溶解、基材層６１への粘着剤組成物溶液の塗布及び乾燥は、従来公知の手法により行えばよい。溶媒（例えばトルエン）も適宜選択可能である。
基材層の厚みは、特に限定されないが、例えば１－１００μｍ、好ましくは２－５０μｍ、より好ましくは４－２５μｍである。
粘着剤層の厚みは、例えば２μｍを超え１０００μｍ以下であり、好ましくは５－５０μｍ、より好ましくは５－２０μｍである。２μｍ以下であるとチャンバーアレイチップ１の最表面１３の汚れなどによるわずかな凹凸を粘着剤層６２の弾性で吸収できず、著しくアッセイ成功率が低下する。１０００μｍを超えると粘着剤層６２の厚みを均一に形成するのが難しくなるほか、圧着した際に粘着剤層の圧縮が不均一になることが多く、局所的にチャンバー２の封止が不完全な領域が発生しやすくなる。

［基材層］
基材層６１の材質は、光透過性がある材質として、例えばポリエステル、ＰＰ、ポリイミド、ＰＥＴ、セロファン、ＰＶＣ、ポリオレフィンなどからなるフィルムが用いられ得る。また、光不透過性の材質としては、例えば紙、不織布、ウレタンフォーム等の発泡体、金属箔などが用いられ得る。

［粘着剤層］
粘着剤層６２を形成するための粘着剤組成物は、特に限定されず、ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系などの従来汎用のものから適宜選択され得るが、ゴム系粘着剤組成物又はシリコーン系粘着剤組成物が好ましく、ゴム系粘着剤組成物がより好ましい。

ゴム系粘着剤組成物としては、スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物が挙げられる。
ゴム系粘着剤組成物としては、SIS粘着剤組成物、SBS粘着剤組成物、SEPS粘着剤組成物、SEBS粘着剤組成物、及びPIB粘着剤組成物が好ましい。

粘着剤層を形成する粘着剤組成物には、上述の粘着剤組成物のうち１つ、又は２以上を組み合わせて用いてよい。

ここで、「SIS粘着剤組成物」とは、組成物に含まれる主ポリマーをSISとするものであって、当該主ポリマーを固形成分中の含有率（質量比）で少なくとも30%以上、好ましくは40％以上含有する組成物を意味する。SIS粘着剤組成物は、主ポリマー以外の成分を含んでいてもよく、例えば、主ポリマー以外のポリマー、粘着付与剤、粘度調整剤、可塑剤、架橋剤、充填剤、老化防止剤、酸化防止剤、消泡剤などを含んでいてもよい。SBS粘着剤組成物、SEPS粘着剤組成物、SEBS粘着剤組成物、EPM粘着剤組成物、PIB粘着剤組成物、及びIIR粘着剤組成物についても同様である。

SIS、SBS、SEPS、SEBS、EPM、PIB、及びIIRの各主ポリマーは、市販製品を利用できる。商業的に入手可能なものとしてそれぞれ以下が例示される。
〔SISポリマー〕
クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SIS、Cat.No.: DX401
日本ゼオン株式会社、Quintac、Cat.No.: 3421
〔SBSポリマー〕
クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SBS、Cat.No.: D1155
旭化成株式会社、スチレン系熱可塑性エラストマー(SBS)タフプレン、グレードA
〔SEPSポリマー〕
株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2002
株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2063
〔SEBSポリマー〕
株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 8004
〔EPMポリマー〕
JSR株式会社、JSR EP、グレードEP331
〔PIBポリマー〕
ENEOSホールディングス株式会社、テトラックス、グレード6T
〔IIRポリマー〕
JSR株式会社、JSR BUTYL、グレード065

粘着付与剤にも、従来汎用のものを適宜用いることができるが、例えば、脂肪族系炭化水素樹脂、芳香族系炭化水素樹脂、テルペン系樹脂、ロジン系樹脂などが用いられ得る。商業的に入手可能な粘着付与剤としてそれぞれ以下が例示される。
ENEOSホールディングス株式会社、水添炭化水素樹脂T-REZ Hシリーズ、Cat.No.: HA085
ヤスハラケミカル株式会社、芳香族テルペン樹脂YSレジンTOシリーズ、 Cat.No.: TO125
ヤスハラケミカル株式会社、テルペン樹脂YSレジンPXシリーズ、 Cat.No.: PX1150N

粘度調整剤、可塑剤、架橋剤、充填剤、老化防止剤、酸化防止剤及び消泡剤にも、従来汎用のものを適宜用いることができるが、例えば、それぞれ以下が挙げられる。
粘度調整剤としてパラフィンワックスなど、可塑剤として流動パラフィン、フタル酸ジブチル及びアジピン酸ジイソノニルなど、架橋剤としてイソシアネート系架橋剤など、充填剤として炭酸カルシウム、シリカ、タルク及びセルロース粉など、老化防止剤としてジターシャリーブチルヒドロキシトルエン及びN,N'-ジフェニル-p-フェニレンジアミンなど、酸化防止剤としてIrganox1010（BASFジャパン株式会社）及びANTAGE HP-400（川口化学工業株式会社）など、及び消泡剤としてシリコーンオイル類など。

「シリコーン系粘着剤組成物」とは、シリコーンポリマーを主ポリマーとする粘着剤組成物であって、組成物中にシリコーンポリマーを固形成分中の含有率（質量比）30%以上、好ましくは40％以上含有する組成物を意味する。
シリコーン系粘着剤としては、付加反応型シリコーン系粘着剤、過酸化物硬化型シリコーン系粘着剤、及び縮合型シリコーン系粘着剤などが挙げられる。
商業的に入手可能なシリコーン系粘着剤としてそれぞれ以下が例示される。
〔シリコーンポリマー〕
信越化学株式会社、Cat.No.: KR-3700
信越化学株式会社、Cat.No.: X-40-3237
信越化学株式会社、Cat.No.: KR-100
信越化学株式会社、Cat.No.: KR-130

シリコーン系粘着剤組成物は、シリコーンポリマー以外の成分を含んでいてもよく、例えば、シリコーンポリマー以外のポリマー、触媒、架橋剤、消泡剤、充填剤、希釈剤、樹脂改質剤などを含んでいてもよい。

触媒には、従来汎用のものが適宜用いられるが、例えば白金系の触媒液（例えば製品名「ＣＡＴ―ＰＬ―５０Ｔ」、信越化学工業社製）などが用いられる。

架橋剤にも、従来汎用のものが適宜用いられるが、例えばベンゾイルパーオキサイドなどが用いられる。

希釈剤及び樹脂改質剤にも、従来汎用のものを適宜用いることができ、例えば、それぞれ以下が挙げられる。希釈剤としてトルエンなどの各種有機溶剤、樹脂改質剤としてシリコーンオイル、シリコーンレジン及び各種シランカップリング剤など。

４．検出手順
本手順では、チャンバー２のそれぞれの内部の対象物質４の存在の有無を、対象物質４の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する。

サンプル液Ｓ中の対象物質４の濃度が低い場合、各チャンバー２には、対象物質４が１分子導入されるか全く導入されないかのどちらかとなる（図３（Ｂ）参照）。したがって、各チャンバー２から対象物質４の存在に起因して生じる蛍光を光学的に検出することによって、蛍光信号を「０」と「１」に二値化できる。次の濃度決定手順では、この「１」の信号の回数を数え上げることでサンプル液Ｓ中の対象物質４の絶対濃度を決定する。

上述の対象物質４がインフルエンザウイルスであり、プローブ５がFDG（Fluorescein-D-Galactopyranoside）である場合、インフルエンザウイルスが導入されたチャンバー２では、インフルエンザウイルスが有するノイラミニダーゼとFDGとの酵素反応によりフルオレセインが遊離する。一方、インフルエンザウイルスが導入されていないチャンバー２ではフルオレセインの遊離は生じない。
したがって、各チャンバー２からのフルオレセインの蛍光を光学的に検出することによって、蛍光信号を「０」と「１」に二値化できる。

５．濃度決定手順
対象物質４の存在が検出されたチャンバー（リアクタ）２の数に基づいて溶液中の対象物質４の濃度を決定する。

具体的には、チャンバー２の容積をＶ（単位：リットル）とし、チャンバー２の総数に対する対象物質４の存在が検出されたチャンバー２の数の割合をλとする。λが十分に小さい場合、以下の計算式により対象物質４のモル濃度Ｃ（単位：Ｍ）を求めることができる。ただし、Ｎはアボガドロ数である。
Ｃ＝λ／（Ｎ×Ｖ）
λは理論上０以上１以下であるが、対象物質４の濃度決定のためには、λは０．５以下、望ましくは０．１以下であることが望ましい。

［試験例１：ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系の粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いたバイオアッセイ］
（１）粘着テープの作成
（１－１）粘着剤組成物溶液の調製
ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系の粘着剤組成物の溶液を以下の手順により調製した。
［ゴム系粘着剤組成物］
〔スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物IS03
SISポリマー（クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SIS、Cat.No.: DX401）、粘着付与剤（ENEOSホールディングス株式会社、水添炭化水素樹脂T-REZ Hシリーズ、Cat.No.: HA085。以下「HA085」と称する）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IS03の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物IS07
SISポリマー（日本ゼオン株式会社、Quintac、Cat.No.: 3421）、粘着付与剤（ヤスハラケミカル株式会社、芳香族テルペン樹脂YSレジンTOシリーズ、 Cat.No.: TO125）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IS07の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物IS09
SISポリマー（日本ゼオン株式会社、Quintac、Cat.No.: 3421）、粘着付与剤（ヤスハラケミカル株式会社、テルペン樹脂YSレジンPXシリーズ、 Cat.No.: PX1150N）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IS09の溶液を得た。

〔スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物BS02
SBSポリマー（クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SBS、Cat.No.: D1155）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BS02の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物BS03
SBSポリマー（旭化成株式会社、スチレン系熱可塑性エラストマー (SBS)タフプレン、グレードA）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BS03の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物BS05
SBSポリマー（旭化成株式会社）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BS05を得た。

〔スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤〕
（ｉ）粘着剤組成物EP01
SEPSポリマー（株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2002）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EP01の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物EP03
SEPSポリマー（株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2063）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EP03の溶液を得た。

〔スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物EP02
SEBSポリマー（株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 8004）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EP02の溶液を得た。

〔エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物EPG01
エチレン・プロピレン共重合体（JSR株式会社、JSR EP、グレードEP331）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EPG01の溶液を得た。

〔イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物IB01
ポリイソブチレン（ENEOSホールディングス株式会社、テトラックス、グレード6T）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IB01の溶液を得た。

〔イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物BT01
ブチルゴム（JSR株式会社、JSR BUTYL、グレード065）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BT01の溶液を得た。

［シリコーン系粘着剤組成物］
（ｉ）粘着剤組成物SC11
シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: KR-3700）、白金触媒（信越化学株式会社、Cat.No.: CAT-PL-50T）とトルエンを質量比100：0.3：400で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC11の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物SC12
シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: X-40-3237）、白金触媒（Cat.No.: CAT-PL-50T）と架橋剤KS-3802（信越化学株式会社、Cat.No.: X-92-122） とトルエンを質量比100：1：0.5：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC12の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物SC13
シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: KR-100）、過酸化ベンゾイル（株式会社TCI、Cat.No.: B3152）とトルエンを質量比100：2：400で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC13の溶液を得た。
（ｉｖ）粘着剤組成物SC14
シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: KR-130）、過酸化ベンゾイル（株式会社TCI、Cat.No.: B3152）とトルエンを質量比100：2：400で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC14の溶液を得た。

［アクリル系粘着剤組成物］
（ｉ）粘着剤組成物AC05
アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: PE-121）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-101）とトルエンを質量比100：3：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC05の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物AC06
アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: KP-1282）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-101）とトルエンを質量比100：2：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC06の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物AC07
アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: KP-1405）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-102）とトルエンを質量比100：1：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC07の溶液を得た。
（ｉｖ）粘着剤組成物AC08
アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: KP-2369）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-131）とトルエンを質量比100：2：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC08の溶液を得た。
（ｖ）粘着剤組成物AC09
アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: BPS-5213K）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: BHS8515とトルエンを質量比100：2：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC09の溶液を得た。
（ｖｉ）粘着剤組成物AC10
アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: BPS-5296）、トリレンジイソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: BHS-8515）とトルエンを質量比100：2：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC10の溶液を得た。
（ｖｉｉ）粘着剤組成物AC11
アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: KP-5160）とトルエンを質量比100：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC11の溶液を得た。
（ｖｉｉｉ）粘着剤組成物AC12
アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: BPS-5375）、トリレンジイソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: BHS-8515）とトルエンを質量比100：1.7：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC12の溶液を得た。

［ウレタン系粘着剤組成物］
（ｉ）粘着剤組成物UR01
ウレタン系溶液樹脂（トーヨーケム 株式会社、サイアバイン、Cat.No.: SH-101）、イソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: T-501B）を質量比100：4で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物UR01の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物UR02
ウレタン系溶液樹脂（トーヨーケム 株式会社、サイアバイン、Cat.No.: SH-205）、イソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: T-501B）とトルエンを質量比100：3で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物UR02の溶液を得た。

（１－２）基材層への粘着剤層の積層
基材層には、厚さ25μmのポリイミドフィルム（東レ・デュポン、Cat. No.：100H-A4）を約10 cm四方に切断して用いた。
ホットプレート上に基材層を置き、上述の各粘着剤組成物の溶液を基材層中央に約0.5 mL滴下した。室温で約30分静置して溶媒を揮発させたのちに、ホットプレートの温度を上昇させ、加熱処理を行った。加熱温度と時間は粘着剤によって異なり、ゴム系粘着剤が140℃で60分、アクリル系粘着剤とウレタン系粘着剤が140℃で10分、シリコーン系粘着剤は140℃で10分、又は90℃で5分ののち200℃で5分とした。このようにして得られた粘着テープの粘着剤層の厚みは5-50μm程度であった。

（２）チャンバーアレイチップの作成
チャンバーアレイチップを以下の手順により作成した。
ガラス基板（松浪硝子株式会社、カバーグラス、24 mm x 32 mm、厚さ0.17 mm）にフッ素樹脂（旭硝子株式会社、CYTOP、Cat No.: CTL-816AP）をスピンコートし、フッ素樹脂皮膜を形成した。スピンコートの条件は2000 rpm、30秒とした。
フッ素樹脂皮膜を形成したガラス基板を180℃で1時間ベーク処理を行い、フッ素樹脂皮膜とガラス基板とを密着させた。スピンコートとベーク処理を合計4回繰り返して、厚さ約3 μmのフッ素樹脂皮膜をガラス基板上に形成した。
フッ素樹脂皮膜の上に、ポジティブタイプのフォトレジスト（AZ Electronic Materials、AZP4903）をスピンコートし、フォトレジスト皮膜を形成した。スピンコートの条件は4000 rpm、60秒とした。
フォトレジスト皮膜を形成したガラス基板を110℃で1時間ベーク処理を行い、フォトレジスト皮膜とフッ素樹脂皮膜とを密着させた。

次に、フォトリソグラフィーによるチャンバー形状のパターン形成を行なった。チャンバー形状がパターニングされたマスクを介してフォトレジスト皮膜に紫外線を照射した。ガラス基板をレジスト用現像液に浸漬し、フォトレジスト皮膜のうち紫外線照射された部分を除去した。
基板をドライエッチング装置（SAMCO株式会社、RIE-10NR）にセットし、O₂プラズマを用いてドライエッチングすることにより、レジスト除去部分のフッ素樹脂皮膜を除去して底面のガラスを露出させた。
ガラス基板をアセトン及びエタノールで洗浄してフォトレジスト皮膜を完全に除去し、チャンバー形状がパターニングされたチャンバーアレイチップを得た。
得られたチャンバーアレイチップには、20 x 20 mmのチャンバーアレイ領域に、直径4 μm、高さ3 μmのチャンバーが繰り返しピッチ9 μmで約５７０万個形成されている。

（３）デジタルアッセイ
チャンバーアレイチップと種々の粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープとを用いて以下の手順によりβ-ガラクトシダーゼ（βgal）の一分子検出を行った。

（３－１）デジタルアッセイ反応液の調製
βgal酵素（メルク株式会社、Cat No.: 10745731001）をアッセイ用バッファー（1M MOPS （pH 7.0）、4 mM CaCl₂）で希釈し、10 pMのストック溶液を作成した。
βgalのフルオロジェックアッセイ基質として、FDG（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、Fluorescein-D-Galactopyranoside、Cat No.：F1179）をDMSO（富士フィルム和光純薬株式会社、ジメチルスルホキシド、Cat. no.：049-07213）で溶解して25 mM ストック溶液を作成した。
蛍光色素として、Alexa Fluor 647（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、Alexa Fluor 647 C2 Maleimide、Cat No.：A20347）を水で溶解して200 μMのストック溶液を作成した。
デジタルアッセイ反応液は、アッセイ用バッファー 16.7 μL、βgalストック溶液 2 μL、FDGストック溶液 0.8 μL、蛍光色素ストック溶液0.5 μLを用時に混合して調製した。βgalの最終濃度は1 pMであった。

（３－２）チャンバーへのデジタルアッセイ反応液の導入
デジタルアッセイ反応液を、チャンバーアレイチップのチャンバーアレイ領域上に滴下した。チャチャンバーアレイの表面はフッ素膜樹脂からなり疎水的であるため、滴下したデジタルアッセイ反応液は広がらずに液滴となって残留する。
粘着テープを10 x 20 mm程度の大きさにカットしたものでチャンバーアレイ領域を被覆した。この際、粘着テープの粘着剤層とチャンバーアレイチップの表面は接触させないようにする。デジタルアッセイ反応液の液滴は、粘着テープによって押し潰されて広がる。
この状態で、チャンバーアレイチップを氷の上に置いたアルミブロックの上に1分程度置く。この処理により、チャンバーアレイチップのチャンバー内にデジタルアッセイ反応液が導入されることを促進できる。

（３－３）チャンバーの封止
チャンバーアレイチップを安定した平らな作業台に置き、粘着テープ上に10-20kg程度の力を加えつつローラーを5-10回程度往復させて、粘着テープの粘着剤層をチャンバーアレイチップの表面に圧着させる。これにより、チャンバーのそれぞれが液密に封止されてリアクタとして構成される。また、このとき、チャンバーアレイ領域上の余剰のデジタルアッセイ反応液がチャンバーアレイ領域外へ排出される。

（３－４）デジタルカウンティング
チャンバーアレイチップを蛍光顕微鏡にセットして観察した。観察に用いた実験用の顕微鏡の主要な部品は、本体（オリンパス株式会社、倒立型リサーチ顕微鏡IX83）、励起用LED光源ユニット（EXCELITAS TECHNOLOGIES社、Xcite XYLIS）、高感度sCMOSカメラ（ANDOR社、Neo）、20倍対物レンズ（オリンパス株式会社、UplanSApo 20x/0.75）などである。

チャンバーの封止から10分後に、明視野とフルオレセインとAlexa Fluor 647の蛍光画像を取得した。
フルオレセイン（励起ピーク波長490 nm、蛍光ピーク波長525 nm）は顕微鏡のGFP観察用の設定を使用して露光時間を150ミリ秒、Alexa Fluor 647（励起ピーク波長651 nm、蛍光ピーク波長671 nm）はCy5観察用の設定を使用して露光時間を50 ミリ秒とした。

画像を画像解析用のフリーソフトウェアImageJ/Fiji（アメリカ国立衛生研究所）で開き、撮影された輝点数を計測した。
画像の中央に、画像内の距離で直径527 μmの試験円（撮影した長方形の画像の短辺の3/4に相当する）を描き、その範囲内におさまった約3070-3080個のチャンバーについて輝点数を計測した。
フルオレセインの撮影画像を観察して、蛍光がある一つ一つのチャンバーについて、チャンバー内のフルオレセインでの生成・蓄積による輝点か、気泡やゴミの自家蛍光による輝点かどうかを目視で判定した。Alexa Fluor 647の撮影画像は、主として気泡か否かの判定の補助として用いた。
このようにして、試験円（約3070-3080個）のチャンバーのうち、何個にβgal反応によるフルオレセインの生成・蓄積による輝点があるかを数え、計測値とした。計測値は、各粘着テープについて２―６つの試験円で行った（一つの試験円につき一つのデータポイント）。

結果を図４に示す。
ゴム系及びシリコーン系粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いた試験群（ゴム系粘着剤群及びシリコーン粘着剤群）では、βgalの一分子検出が可能であった。検出された輝点数は、シリコーン粘着剤群に比してゴム系粘着剤群でより多かった。
ゴム系粘着剤群での輝点数の平均は１３－１３１個の範囲であった。ゴム系粘着剤群全体での輝点数の平均は７４個であった。シリコーン系粘着剤群での輝点数の平均は７．５－６８個の範囲であった。シリコーン系粘着剤群全体での輝点数の平均は３９個であった。

一方、アクリル系及びウレタン系粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いた試験群（アクリル系粘着剤群及びウレタン系粘着剤群）では、輝点はほとんど検出できなかった。
アクリル系粘着剤群での輝点数の平均は０－３個の範囲であった。アクリル系粘着剤群全体での輝点数の平均は０．８個であった。ウレタン系粘着剤群では輝点は全く検出できなかった。
アクリル系粘着剤群及びウレタン系粘着剤群では、デジタルアッセイ反応液のチャンバーへの封入が不完全であること、あるいはβgal反応によりリアクタ内に生成・蓄積したフルオレセインの粘着テープ粘着剤層への漏出が生じていることが要因と考えられた。

［試験例２：ゴム系粘着剤の検討］
試験例１の結果をゴム系粘着剤組成物について再解析した。

結果を図５に示す。
SIS群（IS03, IS07, IS09）、SBS群（BS02, BS03, BS05）、SEPS群（EP01, EP03）、SEBS群（EP02）及びPIB群（IB01）の輝点数は、いずれも５２個以上であった。
一方、EPM群（EPG01）及びIIR群（BT01）の輝点数は、１０－１１９個の範囲であり、５２個を下回る場合があった。
ゴム系粘着剤群のうち、特にSIS群、SBS群、SEPS群、SEBS群、及びPIB群で良好なβgalの一分子検出が可能であった。輝点数はSBS群、SEPS群及びSEBS群で特に多かった。

１：チャンバーアレイチップ
１１：基板
１２：フッ素樹脂皮膜
１３：最表面
２：チャンバー
２１：底面
２２：隔壁
３：チャンバーアレイ領域
４：対象物質
５：プローブ
６：粘着テープ
６１：基材層
６２：粘着剤層
Ｓ：サンプル液

Claims (5)

1. 溶液中の物質の濃度を決定するデジタルアッセイ方法であって、
   （１）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板を提供する手順；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
   （２）前記基板の前記チャンバーアレイ領域上に物質を含む溶液を導入する手順と、
   （３）前記基板の前記チャンバーアレイ領域を、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープで被覆し、続いて該粘着テープの前記粘着剤層を基板表面に圧着させることにより、前記チャンバーアレイ領域上の余剰の前記溶液を該チャンバーアレイ領域外へ排するとともに、前記チャンバーのそれぞれの内部に前記溶液を液密に封止してリアクタとする手順と、
   （４）前記リアクタのそれぞれの内部の前記物質の存在の有無を、前記物質の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する手順と、
   （５）前記物質の存在が検出されたリアクタの数に基づいて前記溶液中の前記物質の濃度を決定する手順と、
   を含む、方法。
2. 前記粘着テープの前記粘着剤層が、ゴム系粘着剤組成物及び／又はシリコーン系粘着剤組成物からなる、請求項１に記載の方法。
3. 前記ゴム系粘着剤組成物が、
   スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
   スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
   スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
   スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、
   イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、
   イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物
   からなる群より選択されるいずれか１以上である、請求項２に記載の方法。
4. 前記ゴム系粘着剤組成物が、
   スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
   スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
   スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
   スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、及び、
   イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、
   からなる群より選択されるいずれか１以上である、請求項３に記載の方法。
5. 溶液中の物質の濃度を決定するためのデジタルアッセイキットであって、
   （Ａ）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
   （Ｂ）前記基板の前記チャンバーアレイ領域に貼付される、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープ；ここで前記粘着テープの前記粘着剤層は、ゴム系粘着剤及び／又はシリコーン系粘着剤からなる；と、
   を含む、キット。

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