WO2023032938A1 - デジタルアッセイ方法及びデジタルアッセイキット - Google Patents

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WO2023032938A1
WO2023032938A1 PCT/JP2022/032474 JP2022032474W WO2023032938A1 WO 2023032938 A1 WO2023032938 A1 WO 2023032938A1 JP 2022032474 W JP2022032474 W JP 2022032474W WO 2023032938 A1 WO2023032938 A1 WO 2023032938A1
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adhesive
substrate
styrene
substance
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PCT/JP2022/032474
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博行 野地
和仁 田端
秀幸 柳沼
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国立大学法人 東京大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present disclosure relates to digital assay methods and digital assay kits for determining the concentration of substances in solutions. More specifically, the present invention relates to a digital assay method including a procedure of forming a large number of extremely small volume reactors on a substrate using a substrate having a chamber array region in which a large number of extremely small volume chambers are arranged and an adhesive tape.
  • the principle of measurement is that substances are introduced one molecule at a time.
  • the substance is an enzyme
  • the fluorescence signal from the reactor generated by the enzyme reaction is binary "0" and "1”.
  • the absolute concentration of the enzyme can be determined by counting the number of "1" signals.
  • Patent Document 1 discloses, as a technology applicable to digital bioassay, "A method for detecting microscopic substances contained in a plurality of receptacles formed separately from each other, comprising: (1) the receptacles formed (2) introducing the solvent containing the minute substance into the space between the lower layer portion and the upper layer portion facing the surface of the lower layer portion on which the receptacle is formed; and (3) optically, electrically and/or magnetically dissipating the minute material present in the droplet by introducing a solvent droplet containing the minute material into the receptacle. and a method of actively detecting.” is disclosed. This technique is characterized by the use of gas when forming droplets containing minute substances in a receptacle to form a reactor.
  • the main purpose of this disclosure is to provide technology that can be used to make the operation of digital assays easier and simpler.
  • a digital assay method for determining the concentration of a substance in a solution comprising: (1) A procedure of providing a substrate having a chamber array region in which 10,000 to 10 billion chambers with a volume of 1 attoliter to 100 femtoliter are arranged; recessed from the surface of the substrate; (2) introducing a solution containing a substance onto the chamber array region of the substrate; (3) covering the chamber array region of the substrate with an adhesive tape comprising a substrate layer and an adhesive layer, and then pressing the adhesive layer of the adhesive tape onto the surface of the substrate; a procedure of discharging the excess solution on the chamber array area outside the chamber array area and liquid-tightly sealing the solution inside each of the chambers to form a reactor; (4) detecting the presence or absence of the substance inside each of the reactors based on the fluorescence from the fluorescent substance caused by the presence of the substance; (5) determining the concentration of said substance in said solution based on the number of reactor
  • the rubber-based pressure-sensitive adhesive composition is Styrene-isoprene-styrene block copolymer (SIS) adhesive composition, Styrene-butadiene-styrene copolymer (SBS) adhesive composition, Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer (SEPS) adhesive composition, Styrene-ethylene-butylene-styrene block copolymer (SEBS) adhesive composition, ethylene-propylene copolymer (EPM) adhesive composition, Isobutylene polymer (polyisobutylene, PIB) adhesive composition, and The method of [2], wherein any one or more selected from the group consisting of isobutylene-isoprene copolymer (butyl rubber, IIR) adhesive compositions.
  • SIS Styrene-isoprene-styrene block copolymer
  • SBS Styrene-butadiene-styrene copo
  • the rubber-based pressure-sensitive adhesive composition is Styrene-isoprene-styrene block copolymer (SIS) adhesive composition, Styrene-butadiene-styrene copolymer (SBS) adhesive composition, Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer (SEPS) adhesive composition, Styrene-ethylene/butylene-styrene block copolymer (SEBS) adhesive composition, and isobutylene polymer (polyisobutylene, PIB) adhesive composition,
  • SIS Styrene-isoprene-styrene block copolymer
  • SBS Styrene-butadiene-styrene copolymer
  • SEPS Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer
  • SEBS Styrene-ethylene/butylene-styrene block copolymer
  • PIB isobutylene polymer
  • the surface of the substrate is made of a fluororesin film and is hydrophobic, and the chamber provided recessed from the surface includes a hydrophobic partition made of the fluororesin film, and the fluororesin and a hydrophilic bottom surface that does not have a coating.
  • the chamber has a diameter of 0.05-1000 ⁇ m, a depth of 0.001-1000 ⁇ m, and an arrangement interval of 5-10 ⁇ m.
  • a digital assay kit for determining the concentration of a substance in solution comprising: (A) A substrate having a chamber array region in which 10,000 to 10 billion chambers with a volume of 1 attoliter to 100 femtoliter are arranged; wherein the substrate has optical transparency, and the chamber is the surface of the substrate.
  • an adhesive tape that is attached to the chamber array region of the substrate and includes a base layer and an adhesive layer; wherein the adhesive layer of the adhesive tape is a rubber adhesive and/or silicone; consisting of a system adhesive; and kit, including [10] The kit of [9], wherein the pressure-sensitive adhesive layer of the pressure-sensitive adhesive tape comprises a rubber-based pressure-sensitive adhesive composition and/or a silicone-based pressure-sensitive adhesive composition.
  • the rubber-based pressure-sensitive adhesive composition is Styrene-isoprene-styrene block copolymer (SIS) adhesive composition, Styrene-butadiene-styrene copolymer (SBS) adhesive composition, Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer (SEPS) adhesive composition, Styrene-ethylene-butylene-styrene block copolymer (SEBS) adhesive composition, ethylene-propylene copolymer (EPM) adhesive composition, Isobutylene polymer (polyisobutylene, PIB) adhesive composition, and The kit of [10], which is any one or more selected from the group consisting of isobutylene-isoprene copolymer (butyl rubber, IIR) adhesive compositions.
  • SIS Styrene-isoprene-styrene block copolymer
  • SBS Styrene-butadiene-styrene copo
  • the rubber-based pressure-sensitive adhesive composition is Styrene-isoprene-styrene block copolymer (SIS) adhesive composition, Styrene-butadiene-styrene copolymer (SBS) adhesive composition, Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer (SEPS) adhesive composition, Styrene-ethylene/butylene-styrene block copolymer (SEBS) adhesive composition, and isobutylene polymer (polyisobutylene, PIB) adhesive composition,
  • SIS Styrene-isoprene-styrene block copolymer
  • SBS Styrene-butadiene-styrene copolymer
  • SEPS Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer
  • SEBS Styrene-ethylene/butylene-styrene block copolymer
  • PIB isobutylene polymer
  • the surface of the substrate is made of a fluororesin film and is hydrophobic, and the chamber recessed from the surface includes a hydrophobic partition wall made of the fluororesin film, and the fluororesin
  • the kit of any one of [9]-[15], wherein the chamber has a diameter of 0.05-1000 ⁇ m, a depth of 0.001-1000 ⁇ m, and an arrangement interval of 5-10 ⁇ m.
  • the present disclosure provides technologies that can be used to make the operation of digital assays simpler and easier.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining the procedure of the digital assay method; 1 shows the results of a single-molecule detection test of ⁇ -galactosidase ( ⁇ gal) using an adhesive tape having an adhesive layer formed of a rubber-, silicone-, acrylic-, or urethane-based adhesive composition. 1 shows the results of a single-molecule detection test of ⁇ -galactosidase ( ⁇ gal) using an adhesive tape having an adhesive layer formed from a rubber-based adhesive composition.
  • a digital assay method is a method for determining the concentration of a substance in a solution (hereinafter referred to as "substance of interest”) and includes the following procedures.
  • Substrate provision procedure (2) Solution introduction procedure (3) Sealing procedure (4) Detection procedure (5) Concentration determination procedure
  • a substrate (hereinafter referred to as “chamber array chip”) having a chamber array region in which 10,000 to 10 billion chambers with a volume of 1 attoliter to 100 femtoliter are arranged is provided.
  • FIG. A chamber array chip 1 has a chamber array region 3 in which a large number of chambers 2 are arranged.
  • the size and shape of the chamber array chip 1 are not particularly limited. An example is a rectangle with a width of 32 mm, a depth of 24 mm, and a thickness of 2 mm.
  • the size of the chamber array chip 1 may be 1-100 mm wide, 1-100 mm deep, and 0.1-10 mm thick.
  • the shape of the chamber array chip 1 may be rectangular, square, circular, elliptical, and the like.
  • the size of the chamber array region 3 should be smaller than that of the chamber array chip 1, and the shape is not particularly limited either.
  • the size of the chamber array region 3 may be 0.1-30 mm wide and 0.1-30 mm deep.
  • the shape of the chamber array region 3 may be rectangular, square, circular, elliptical, and the like.
  • the size and shape of the chamber 2 are also not particularly limited, but as an example, it is cylindrical or substantially cylindrical with a diameter (d) of 4 ⁇ m and a depth (h) of 3 ⁇ m.
  • the size of chamber 2 may be diameter (d) 0.05-1000 ⁇ m and depth (h) 0.001-1000 ⁇ m.
  • the size and shape of the chamber 2 are preferably cylindrical or prismatic from the viewpoint of ease of molding.
  • the volume of chamber 2 is 1 attoliter-50 nanoliters, preferably 10 femtoliters-100 femtoliters.
  • the number and interval (pitch) of the chambers 2 arranged in the chamber array region 3 can be set as appropriate. The number of arrangement is, for example, 10,000 to 10,000,000,000, preferably 100,000 to 10,000,000.
  • the interval (pitch) between the chambers 2 is, for example, 0.05-30 ⁇ m, preferably 5-10 ⁇ m.
  • the chamber array chip 1 can be formed using known techniques such as wet etching or dry etching for glass substrates, or nanoimprinting, injection molding or cutting for plastic substrates.
  • Chamber array chip 1 is preferably obtained by patterning chambers 2 on substrate 11 by a conventional photolithography method. Specifically, for example, a fluororesin film 12 is formed on a substrate 11 made of glass by spin coating and baking, and a photoresist film (not shown) is formed on the fluororesin film 12 . After irradiating the photoresist film with ultraviolet rays through a mask patterned with the shape of the chamber 2, the substrate 11 is immersed in a resist developer to remove the ultraviolet-irradiated portions of the photoresist film.
  • the fluororesin film 12 is removed from the resist-removed portion to expose the surface of the substrate 11 that will be the bottom surface 21 of the chamber 2 . Finally, the substrate 11 is washed to completely remove the resist film.
  • a large number of chambers 2 can be formed on the substrate 11 with the remaining fluororesin film 12 as the partition wall 22 and the surface of the substrate 11 as the bottom surface 21 .
  • the outermost surface 13 of the obtained chamber array chip 1 is composed of the fluororesin film 12 remaining as the partition wall 22 and is hydrophobic.
  • the chamber 2 is recessed from the outermost surface 13, and the bottom surface 21 of the chamber 2 is the surface of the substrate 11 made of glass and has hydrophilicity.
  • the outermost surface 13 of the chamber array chip 1 is preferably made hydrophilic by subjecting the fluororesin film 12 forming it to a hydrophilic treatment.
  • Hydrophilic treatment can be performed by coating the fluororesin film 12 with hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone and polyvinyl alcohol, or by modifying the functional groups of the fluororesin film 12 to be hydrophilic by plasma treatment.
  • the chamber array chip 1 having the outermost surface 13 made hydrophilic can also be obtained by using a film of a hydrophilic polymer instead of the fluororesin for forming the pattern of the chambers 2 .
  • the substrate 11 is made of a material having optical transparency, such as glass or various plastics (PP, PC, PS, COC, COP, PDMS, PMMA, PET, PVC, etc.). Since the material of the substrate 11 has little autofluorescence and little wavelength dispersion, it is preferable to select a material with little optical error.
  • a material having optical transparency such as glass or various plastics (PP, PC, PS, COC, COP, PDMS, PMMA, PET, PVC, etc.). Since the material of the substrate 11 has little autofluorescence and little wavelength dispersion, it is preferable to select a material with little optical error.
  • fluorine resins such as CYTOP (registered trademark), TEFLON (registered trademark) AF2400, and TEFLON (registered trademark) AF1600 can be used as the fluorine resin for forming the fluorine resin film 12 .
  • CYTOP® is preferred because of its ease of microfabrication.
  • a solution S containing a target substance 4 is introduced onto the chamber array region 3 of the chamber array chip 1 (see FIG. 3(A)).
  • a solution S containing the target substance 4 (hereinafter referred to as “sample solution S”) may contain probes 5 that generate fluorescent substances due to the presence of the target substance 4 .
  • the sample liquid S may be introduced by dropping the sample liquid S onto the chamber array region 3, for example.
  • the dropped sample liquid S can be introduced into each of the chambers 2 .
  • the outermost surface 13 of the chamber array chip 1 is hydrophobic
  • the dropped sample liquid S may be carried on the hydrophobic outermost surface 13 and form droplets as shown in FIG. 3(A). be. In this case, this procedure does not require that the sample liquid S is completely introduced into the chamber 2 .
  • the target substance 4 may be a substance having a size that can be accommodated in the chamber 2, and may be nucleic acids, proteins, sugars, lipids, amino acids, peptides, chemical substances, complexes thereof, or the like.
  • the target substance 4 may be a marker for various diseases, and in this case, the target substance 4 may be viruses, bacteria, cells, or the like.
  • the disease marker may be contained in a biological sample, which may be, for example, blood, plasma, serum, urine, tears, saliva, nose or throat swabs, and the like.
  • the probe 5 may be any substance that can generate a fluorescent substance due to the presence of the target substance 4, and may be a cell (reporter cell).
  • Reporter cells include cell lines modified to express fluorescent/luminescent proteins such as GFP and luciferase by activating transcription promoters in the presence of proteins such as antibodies and growth factors, and specific chemical substances (such as arsenic).
  • Escherichia coli modified to express fluorescent/luminescent proteins in the presence of toxins such as ions, metabolites such as mevalonic acid, fucose and vanillin, sugars, etc. is known.
  • a nucleic acid may be DNA or RNA, and DNA and RNA may be biologically derived or artificially synthesized, and may be circular or linear.
  • Probes 5 that can be used in combination with nucleic acids include fluorescently labeled oligo DNA nucleotides and RNA aptamers. Proteins may be enzymes, antibodies, cell surface proteins, other cell-derived proteins, virus-derived proteins, artificial proteins, and the like. Probes 5 that can be used in combination with proteins include fluorescently labeled antibodies, reporter cell lines, RNA aptamers, and the like. The enzyme may in particular be an enzyme present on the surface of the virus.
  • Probes 5 that can be used in combination with enzymes include Fluorojec assay substrates, in which an enzyme-cleavable substrate and a fluorescent substance are combined.
  • the target substance 4 is an influenza virus
  • the Fluorescein-D-Galactopyranoside FDG Fluorescein-D-Galactopyranoside
  • Sugars may be natural or artificial sugar chains or monosaccharides.
  • Probes 5 that can be used in combination with sugars include fluorescently labeled antibodies, lectins, reporter cell lines, RNA aptamers, and the like. Lipids may be exosomes, liposomes, micelles, lipid molecules, or the like. Probes 5 that can be used in combination with lipids include fluorescently labeled antibodies, reporter cell lines and RNA aptamers. Amino acids and peptides may have a structure in which one or more (generally 50 or less) amino acids are linked. Probes 5 that can be used in combination with amino acids and peptides include fluorescently labeled antibodies, reporter cell lines, RNA aptamers, and the like.
  • the target substance 4 may be held by a carrier.
  • Microbeads are widely used as carriers. "Microbead” is used synonymously with “particle” and is common practice in the art. Although the shape of the microbeads is not particularly limited, they are usually spherical.
  • the material of the microbeads is also not particularly limited, and may be glass, silica gel, polystyrene, polypropylene, membrane, magnetic material, or the like.
  • Specific materials include cellulose, cellulose derivatives, acrylic resins, glass, silica gel, polystyrene, gelatin, polyvinylpyrrolidone, copolymers of vinyl and acrylamide, polystyrene crosslinked with divinylbenzene, polyacrylamide, latex gel, polystyrene dextran. , rubber, silicon, plastic, nitrocellulose, cellulose, natural sponge, silica gel, glass, metal plastic, cellulose, cross-linked dextrans (SephadexTM) and agarose gels (SepharoseTM), and the like.
  • the beads may be porous.
  • the fluorescent substance may be any known in the art, for example, the following are exemplified. 4-methylumbelliferone; 6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxyfluorescein succinimidyl ester; 5-(and-6)-carboxyeosine; 5-carboxyfluorescein; Carboxyfluorescein; 5-(and 6-)-Carboxyfluorescein; 5-Carboxyfluorescein-bis-(5-carboxymethoxy-2-nitrobenzyl) ether, -alanine-carboxamide or succinimidyl ester; 6-Carboxyfluorescein succinimidyl ester; 5-(and-6)-carboxyfluorescein succinimidyl ester; 5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluorescein; 2',7'-difluoro fluorescein; eosin-5-isothiocyanate; erythrosine
  • a target substance 4 is dissolved in water or a buffer solution.
  • the buffer solution is not particularly limited, but MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic acid), MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid), ADA (N-(2-Acetamido) iminodiacetic acid), PIPES (Piperazine-1,4 -bis(2-ethanesulfonic acid)), ACES (N-(2-Acetamide)-2-aminoethanesulfonic acid), BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid), TES (N-Tris (hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid), HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethane), DEA (Diethanolamine) and the like can be used.
  • the chamber array region 3 onto which the sample liquid S has been dropped is covered with an adhesive tape 6 (see FIG. 3B).
  • the adhesive tape 6 comprises a substrate layer 61 and an adhesive layer 62 , but the adhesive layer 62 of the adhesive tape 6 should not come into contact with the outermost surface 13 of the chamber array chip 1 during this coating.
  • the sample liquid S spreads in the space formed between the adhesive layer 62 of the adhesive tape 6 and the outermost surface 13 of the chamber array chip 1 (horizontal direction in the figure) so as to be crushed by the adhesive tape 6, and the sample A portion of the liquid S is introduced into the chamber 2 and the interior of the chamber 2 is filled with the sample liquid S. A part of the surplus sample liquid S that did not enter the inside of the chamber 2 is pushed out of the chamber array region 3 .
  • introduction of the sample solution S into the chamber 2 can be promoted.
  • the cooling temperature may be lower than room temperature, for example, 0-10°C, preferably 2-5°C. Cooling of the chamber array chip 1 can be performed, for example, by placing the chamber array chip 1 on an aluminum block placed on ice. In order to accelerate the introduction of the sample liquid S into the chamber 2, the chamber array chip 1 may be vibrated or placed under negative pressure to remove air from the chamber 2. FIG. Also, by adding a surfactant to the sample liquid S, introduction of the sample liquid S into the chamber 2 can be promoted. These measures for accelerating the introduction of the sample solution S can also be performed in the solution introduction procedure.
  • the adhesive layer 62 of the adhesive tape 6 is pressure-bonded to the outermost surface 13 of the chamber array chip 1 (see FIG. 3(C)).
  • the surplus sample solution S that did not enter the interior of the chamber 2 is completely discharged outside the chamber array region 3, and the sample solution S is liquid-tightly sealed inside each of the chambers 2 to function as a reactor. do.
  • the pressure-bonding of the adhesive tape 6 can be performed, for example, by placing the chamber array chip 1 on a stable flat workbench and reciprocating a roller while applying an appropriate pressing force onto the adhesive tape 6 .
  • the concentration of the target substance 4 in the sample liquid S is low, either one molecule of the target substance 4 or no target substance 4 is introduced into each chamber 2 .
  • the concentration range of the target substance 4 to be measured is usually in the range of 1zM-1mM.
  • the probe 5 is contained in the sample liquid S, the probe 5 is introduced into all the chambers 2 by one molecule or two or more molecules, so that the concentration of the probe 5 is sufficiently high compared to the concentration of the target substance 4 in the sample. It is preferably contained in the liquid S.
  • the adhesive tape 6 one having optical transparency is preferably used. However, depending on the configuration of the optical detection system used in the detection procedure, optical transparency may not be essential. Specifically, when both irradiation with excitation light and detection of fluorescence are performed from below the chamber array chip 1, or when probes 5 capable of emitting light without requiring irradiation with excitation light are used, the probes 5 below the chamber array chip 1 are used.
  • the adhesive tape 6 may be optically opaque if detection is to be performed from the .
  • the adhesive tape 6 can be obtained by applying a solution of the adhesive composition to the substrate layer 61 and volatilizing the solvent to form the adhesive layer 62 . Dissolving the adhesive composition in a solvent, applying the adhesive composition solution to the substrate layer 61, and drying may be performed by conventionally known techniques. A solvent (for example, toluene) can also be selected appropriately.
  • the thickness of the substrate layer is not particularly limited, but is, for example, 1-100 ⁇ m, preferably 2-50 ⁇ m, more preferably 4-25 ⁇ m.
  • the thickness of the adhesive layer is, for example, more than 2 ⁇ m and 1000 ⁇ m or less, preferably 5-50 ⁇ m, more preferably 5-20 ⁇ m.
  • the thickness is less than 2 ⁇ m, the elasticity of the adhesive layer 62 cannot absorb slight unevenness due to dirt on the outermost surface 13 of the chamber array chip 1, and the success rate of the assay is significantly reduced. If the thickness exceeds 1000 ⁇ m, it becomes difficult to form the adhesive layer 62 with a uniform thickness, and the pressure-sensitive adhesive layer is often compressed unevenly when pressure-bonded, resulting in incomplete sealing of the chamber 2 locally. areas are more likely to occur.
  • Base material layer As the material of the base material layer 61, a film made of, for example, polyester, PP, polyimide, PET, cellophane, PVC, polyolefin, or the like can be used as a material having optical transparency.
  • the light-impermeable material for example, paper, non-woven fabric, foam such as urethane foam, metal foil, and the like can be used.
  • the adhesive composition for forming the adhesive layer 62 is not particularly limited, and may be appropriately selected from conventional general-purpose ones such as rubber, silicone, acrylic, and urethane. Alternatively, a silicone-based pressure-sensitive adhesive composition is preferred, and a rubber-based pressure-sensitive adhesive composition is more preferred.
  • rubber adhesive compositions examples include styrene-isoprene-styrene block copolymer (SIS) adhesive compositions, styrene-butadiene-styrene copolymer (SBS) adhesive compositions, and styrene-ethylene propylene-styrene.
  • SIS styrene-isoprene-styrene block copolymer
  • SBS styrene-butadiene-styrene copolymer
  • styrene-ethylene propylene-styrene styrene-ethylene propylene-styrene
  • SEPS Block copolymer
  • SEBS styrene-ethylene-butylene-styrene block copolymer
  • EPM ethylene-propylene copolymer
  • isobutylene polymer poly isobutylene, PIB
  • isobutylene-isoprene copolymer butyl rubber, IIR
  • Preferred rubber-based adhesive compositions are SIS adhesive compositions, SBS adhesive compositions, SEPS adhesive compositions, SEBS adhesive compositions, and PIB adhesive compositions.
  • the adhesive composition that forms the adhesive layer one or a combination of two or more of the above-described adhesive compositions may be used.
  • the "SIS adhesive composition” means that the main polymer contained in the composition is SIS, and the content (mass ratio) of the main polymer in the solid component is at least 30% or more, preferably means a composition containing 40% or more.
  • the SIS adhesive composition may contain components other than the main polymer, for example, polymers other than the main polymer, tackifiers, viscosity modifiers, plasticizers, cross-linking agents, fillers, anti-aging agents, antioxidants agents, antifoaming agents, and the like.
  • SBS adhesive compositions SEPS adhesive compositions, SEBS adhesive compositions, EPM adhesive compositions, PIB adhesive compositions, and IIR adhesive compositions.
  • the SIS, SBS, SEPS, SEBS, EPM, PIB, and IIR main polymers are available as commercial products. Examples of commercially available products are as follows.
  • tackifiers can be used as appropriate, and for example, aliphatic hydrocarbon resins, aromatic hydrocarbon resins, terpene-based resins, rosin-based resins, and the like can be used. Examples of commercially available tackifiers are given below.
  • ENEOS Holdings Co., Ltd. Hydrogenated Hydrocarbon Resin T-REZ H Series, Cat.No.: HA085 Yasuhara Chemical Co., Ltd., Aromatic Terpene Resin YS Resin TO Series, Cat.No.: TO125 Yasuhara Chemical Co., Ltd., Terpene Resin YS Resin PX Series, Cat.No.: PX1150N
  • Viscosity modifiers, plasticizers, cross-linking agents, fillers, anti-aging agents, antioxidants, and antifoaming agents can also be appropriately used in the conventional general-purpose ones, and examples thereof include the following.
  • Paraffin wax as a viscosity modifier Plasticizers such as liquid paraffin, dibutyl phthalate and diisononyl adipate
  • Cross-linking agents such as isocyanate cross-linking agents
  • Fillers such as calcium carbonate, silica, talc and cellulose powder
  • Anti-aging agents Ditertiary butyl hydroxytoluene and N,N'-diphenyl-p-phenylenediamine, etc., antioxidants such as Irganox1010 (BASF Japan Ltd.) and ANTAGE HP-400 (Kawaguchi Chemical Industry Co., Ltd.), etc., and silicone as an antifoaming agent oils etc.
  • a “silicone-based pressure-sensitive adhesive composition” is a pressure-sensitive adhesive composition containing a silicone polymer as the main polymer, and the content (mass ratio) of the silicone polymer in the solid component in the composition is 30% or more, preferably 40%. % or more.
  • Silicone adhesives include addition reaction silicone adhesives, peroxide curing silicone adhesives, condensation silicone adhesives, and the like. Examples of commercially available silicone pressure-sensitive adhesives are shown below.
  • the silicone pressure-sensitive adhesive composition may contain components other than the silicone polymer, for example, a polymer other than the silicone polymer, a catalyst, a cross-linking agent, an antifoaming agent, a filler, a diluent, a resin modifier, and the like. You can stay.
  • a platinum-based catalyst liquid for example, the product name "CAT-PL-50T” manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • CAT-PL-50T the product name "CAT-PL-50T” manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.
  • cross-linking agent conventional general-purpose ones are appropriately used, such as benzoyl peroxide.
  • diluents and resin modifiers can also be used as appropriate, and examples include the following.
  • organic solvents such as toluene as diluents, silicone oil, silicone resin and various silane coupling agents as resin modifiers.
  • the concentration of the target substance 4 in the sample liquid S is low, either one molecule of the target substance 4 or no target substance 4 is introduced into each chamber 2 (see FIG. 3(B)). Therefore, by optically detecting the fluorescence caused by the presence of the target substance 4 from each chamber 2, the fluorescence signal can be binarized into "0" and "1". In the next concentration determination procedure, the absolute concentration of the target substance 4 in the sample liquid S is determined by counting the number of times the "1" signal is generated.
  • the target substance 4 is an influenza virus and the probe 5 is FDG (Fluorescein-D-Galactopyranoside)
  • FDG Fluorescein-D-Galactopyranoside
  • fluorescein is produced by an enzymatic reaction between the neuraminidase of the influenza virus and FDG. liberate.
  • fluorescein is not liberated in chamber 2 into which influenza virus has not been introduced. Therefore, by optically detecting the fluorescence of fluorescein from each chamber 2, the fluorescence signal can be binarized into "0" and "1".
  • concentration of the target substance 4 in the solution is determined based on the number of chambers (reactors) 2 in which the presence of the target substance 4 is detected.
  • the volume of the chamber 2 is V (unit: liter), and the ratio of the number of chambers 2 in which the presence of the target substance 4 is detected to the total number of chambers 2 is ⁇ .
  • the molar concentration C (unit: M) of the target substance 4 can be obtained by the following formula.
  • N is Avogadro's number.
  • C ⁇ /(N ⁇ V)
  • ⁇ ranges from 0 to 1, but in order to determine the concentration of the target substance 4, ⁇ is preferably 0.5 or less, preferably 0.1 or less.
  • adhesive composition IS07 SIS polymer (Nippon Zeon Co., Ltd., Quintac, Cat.No.: 3421), tackifier (Yasuhara Chemical Co., Ltd., aromatic terpene resin YS resin TO series, Cat.No.: TO125) and toluene in a mass ratio of 1:1 : 13, followed by rotating stirring for 72 hours to completely mix and dissolve to obtain a solution of adhesive composition IS07.
  • Adhesive composition IS09 SIS polymer (Nippon Zeon Co., Ltd., Quintac, Cat.No.: 3421), tackifier (Yasuhara Chemical Co., Ltd., terpene resin YS resin PX series, Cat.No.: PX1150N) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13 and completely mixed and dissolved by rotary stirring for 72 hours to obtain a solution of the adhesive composition IS09.
  • Adhesive composition BS02 SBS polymer Kraton Polymer Japan Co., Ltd., Kraton D SBS, Cat.No.: D1155
  • tackifier HA085
  • toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13, and then rotated for 72 hours to completely mix. Dissolved to obtain a solution of adhesive composition BS02.
  • adhesive composition BS03 SBS polymer (Asahi Kasei Co., Ltd., styrene thermoplastic elastomer (SBS) Tufprene, grade A), tackifier (HA085) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13, and then rotated and stirred for 72 hours to completely mix. Dissolved to obtain a solution of adhesive composition BS03.
  • adhesive composition BS05 SBS polymer (Asahi Kasei Co., Ltd.), tackifier (HA085) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13 and completely mixed and dissolved by rotary stirring for 72 hours to obtain an adhesive composition BS05.
  • SEPS Styrene-ethylene/propylene-styrene block copolymer
  • Adhesive composition EP03 SEPS polymer (Kuraray Co., Ltd., Septon, Cat.No.: 2063), tackifier (HA085) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13, and then rotated for 72 hours to completely mix and dissolve, resulting in adhesion. A solution of agent composition EP03 was obtained.
  • Adhesive composition EP02 SEBS polymer Kuraray Co., Ltd., Septon, Cat.No.: 8004
  • tackifier HA085
  • toluene was mixed in a mass ratio of 1:1:13, and then rotated for 72 hours to completely mix and dissolve.
  • a solution of agent composition EP02 was obtained.
  • Adhesive composition EPG01 Ethylene-propylene copolymer (JSR Corporation, JSR EP, grade EP331), tackifier (HA085) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13, and then rotated for 72 hours to completely mix and dissolve. A solution of adhesive composition EPG01 was obtained.
  • Adhesive composition IB01 Polyisobutylene (ENEOS Holdings Co., Ltd., Tetrax, grade 6T), tackifier (HA085) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13, and then rotated for 72 hours to completely mix and dissolve. A solution of substance IB01 was obtained.
  • Adhesive composition BT01 Butyl rubber (JSR Corporation, JSR BUTYL, grade 065), tackifier (HA085) and toluene were mixed at a mass ratio of 1:1:13, and the mixture was completely mixed and dissolved by rotating for 72 hours to obtain adhesive composition BT01.
  • Adhesive composition SC11 Silicone adhesive main agent (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Cat.No.: KR-3700), platinum catalyst (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Cat.No.: CAT-PL-50T) and toluene in a mass ratio of 100:0.3:400 and mixed with rotary stirring for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition SC11.
  • Adhesive composition SC12 Silicone adhesive main agent (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Cat.No.: X-40-3237), platinum catalyst (Cat.No.: CAT-PL-50T) and cross-linking agent KS-3802 (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Cat. No.: X-92-122) and toluene were mixed at a mass ratio of 100:1:0.5:200 and mixed by rotating for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition SC12.
  • Adhesive composition SC13 Silicone adhesive main agent Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Cat.No.: KR-100
  • benzoyl peroxide TCI Co., Ltd., Cat.No.: B3152
  • toluene toluene
  • Adhesive composition SC14 Silicone adhesive main agent Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., Cat.No.: KR-130
  • benzoyl peroxide TCI Co., Ltd., Cat.No.: B3152
  • toluene toluene
  • Adhesive composition AC05 Acrylic solution resin (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Nisetsu, Cat.No.: PE-121), isocyanate cross-linking agent (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Cat.No.: CK-101) and toluene at a mass ratio of 100: The mixture was mixed at 3:100 and rotated for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC05.
  • Adhesive composition AC06 Acrylic solution resin (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Nisetsu, Cat.No.: KP-1282), isocyanate cross-linking agent (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Cat.No.: CK-101) and toluene at a mass ratio of 100: The mixture was mixed at 2:200 and rotated for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC06.
  • Adhesive composition AC07 Acrylic solution resin (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Nisetsu, Cat.No.: KP-1405), isocyanate cross-linking agent (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Cat.No.: CK-102) and toluene at a mass ratio of 100: The mixture was mixed at 1:200 and rotated for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC07.
  • Adhesive composition AC08 Acrylic solution resin (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Nisetsu, Cat.No.: KP-2369), isocyanate cross-linking agent (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Cat.No.: CK-131) and toluene at a mass ratio of 100: The mixture was mixed at 2:100 and rotated for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC08.
  • Adhesive composition AC09 Acrylic solution resin (Toyochem Co., Ltd., Olivine, Cat.No.: BPS-5213K), isocyanate cross-linking agent (Nippon Carbide Industry Co., Ltd., Cat.No.: BHS8515 and toluene mixed at a mass ratio of 100:2:100 Then, they were mixed by rotary stirring for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC09.
  • Adhesive composition AC10 Acrylic solution resin (Toyochem Co., Ltd., Olivine, Cat.No.: BPS-5296), tolylene diisocyanate-based cross-linking agent (Toyochem Co., Ltd., Cat.No.: BHS-8515) and toluene in a mass ratio of 100:2: The mixture was mixed at 100 and rotated and mixed for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC10.
  • Adhesive composition AC11 Acrylic solution resin (Olibain, Cat.No.: KP-5160, Toyochem Co., Ltd.) and toluene were mixed at a mass ratio of 100:100, and the mixture was rotated and stirred for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC11. rice field.
  • Adhesive composition AC12 Acrylic solution resin (Toyochem Co., Ltd., Olivine, Cat.No.: BPS-5375), tolylene diisocyanate-based cross-linking agent (Toyochem Co., Ltd., Cat.No.: BHS-8515) and toluene in a mass ratio of 100:1.7: The mixture was mixed at 200 and rotated for 30 minutes to obtain a solution of adhesive composition AC12.
  • Adhesive composition UR01 Urethane-based solution resin (TOYOCHEM Co., Ltd., Cyabine, Cat.No.: SH-101) and isocyanate-based cross-linking agent (TOYOCHEM Co., Ltd., Cat.No.: T-501B) were mixed at a mass ratio of 100:4, and 30 The mixture was stirred by rotating for 1 minute to obtain a solution of the pressure-sensitive adhesive composition UR01.
  • adhesive composition UR02 Urethane-based solution resin (TOYOCHEM Co., Ltd., Cyabine, Cat.No.: SH-205), isocyanate-based cross-linking agent (TOYOCHEM Co., Ltd., Cat.No.: T-501B) and toluene were mixed at a mass ratio of 100:3. , and mixed by rotary stirring for 30 minutes to obtain a solution of the pressure-sensitive adhesive composition UR02.
  • Rubber adhesives are heated at 140°C for 60 minutes, acrylic adhesives and urethane adhesives are heated at 140°C for 10 minutes, and silicone adhesives are heated at 140°C for 10 minutes or 90 minutes. °C for 5 minutes, followed by 200°C for 5 minutes.
  • the thickness of the adhesive layer of the adhesive tape thus obtained was about 5-50 ⁇ m.
  • a chamber array chip was prepared by the following procedure.
  • a glass substrate (Matsunami Glass Co., cover glass, 24 mm x 32 mm, thickness 0.17 mm) is spin-coated with fluororesin (Asahi Glass Co., Ltd., CYTOP, Cat No.: CTL-816AP) to form a fluororesin film. bottom.
  • the spin coating conditions were 2000 rpm and 30 seconds.
  • the glass substrate on which the fluororesin film was formed was baked at 180° C. for 1 hour to adhere the fluororesin film and the glass substrate. Spin coating and baking were repeated four times in total to form a fluororesin film with a thickness of about 3 ⁇ m on the glass substrate.
  • a positive type photoresist (AZ Electronic Materials, AZP4903) was spin-coated on the fluorine resin film to form a photoresist film.
  • the spin coating conditions were 4000 rpm and 60 seconds.
  • the glass substrate with the photoresist film formed thereon was baked at 110° C. for 1 hour to adhere the photoresist film and the fluorine resin film.
  • a chamber-shaped pattern was formed by photolithography.
  • the photoresist film was irradiated with ultraviolet rays through a mask patterned with a chamber shape.
  • the glass substrate was immersed in a resist developer to remove the ultraviolet-irradiated portion of the photoresist film.
  • the substrate was set in a dry etching device (RIE-10NR, SAMCO Co., Ltd.) and dry-etched using O 2 plasma to remove the fluorine resin film from the resist-removed portion and expose the bottom glass.
  • the glass substrate was washed with acetone and ethanol to completely remove the photoresist film, thereby obtaining a chamber array chip with patterned chamber shapes.
  • approximately 5.7 million chambers with a diameter of 4 ⁇ m and a height of 3 ⁇ m are formed at a repeating pitch of 9 ⁇ m in a chamber array area of 20 ⁇ 20 mm.
  • Alexa Fluor 647 As a fluorescent dye, Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific Inc., Alexa Fluor 647 C2 Maleimide, Cat No.: A20347) was dissolved in water to make a 200 ⁇ M stock solution.
  • a digital assay reaction was prepared by mixing 16.7 ⁇ L of assay buffer, 2 ⁇ L of ⁇ gal stock solution, 0.8 ⁇ L of FDG stock solution, and 0.5 ⁇ L of fluorescent dye stock solution at the time of use. The final concentration of ⁇ gal was 1 pM.
  • the digital counting chamber array chip was set on a fluorescence microscope and observed.
  • the main parts of the experimental microscope used for observation are the main body (Olympus Corporation, inverted research microscope IX83), the excitation LED light source unit (EXCELITAS TECHNOLOGIES, Xcite XYLIS), and the high-sensitivity sCMOS camera (ANDOR, Neo ), 20x objective lens (Olympus Corporation, UplanSApo 20x/0.75).
  • Fluorescein (excitation peak wavelength 490 nm, fluorescence peak wavelength 525 nm) had an exposure time of 150 ms using microscope settings for GFP observation, Alexa Fluor 647 (excitation peak wavelength 651 nm, fluorescence peak wavelength 671 nm) The settings for Cy5 observation were used with an exposure time of 50 ms.
  • the image was opened with image analysis free software ImageJ/Fiji (National Institutes of Health, USA), and the number of bright spots photographed was counted.
  • ImageJ/Fiji National Institutes of Health, USA
  • the number of bright spots was counted.
  • each chamber with fluorescence was visually determined as to whether it was a bright spot due to the generation and accumulation of fluorescein in the chamber or a bright spot due to the autofluorescence of air bubbles or dust.
  • the captured image of Alexa Fluor 647 was mainly used as an aid in determining whether or not there were bubbles.
  • the number of bright spots due to the production and accumulation of fluorescein due to the ⁇ gal reaction was counted and used as a measurement value. Measurements were made on 2-6 test circles for each adhesive tape (one data point per test circle).
  • test groups rubber-based adhesive group and silicone-based adhesive group
  • silicone-based adhesive group using pressure-sensitive adhesive tapes having an adhesive layer formed with a rubber-based and silicone-based pressure-sensitive adhesive composition
  • the results are shown in FIG.
  • test groups rubber-based adhesive group and silicone-based adhesive group
  • silicone-based adhesive group using pressure-sensitive adhesive tapes having an adhesive layer formed with a rubber-based and silicone-based pressure-sensitive adhesive composition
  • the number of bright spots detected was greater in the rubber adhesive group than in the silicone adhesive group.
  • the average number of bright spots in the rubber adhesive group ranged from 13 to 131.
  • the average number of bright spots in the entire rubber-based pressure-sensitive adhesive group was 74.
  • the average number of bright spots in the silicone pressure-sensitive adhesive group ranged from 7.5 to 68.
  • the average number of bright spots in the entire silicone pressure-sensitive adhesive group was 39.
  • test groups (acrylic pressure-sensitive adhesive group and urethane pressure-sensitive adhesive group) using pressure-sensitive adhesive tapes having pressure-sensitive adhesive layers formed from acrylic and urethane pressure-sensitive adhesive compositions
  • the average number of bright spots in the acrylic adhesive group ranged from 0 to 3.
  • the average number of bright spots in the entire acrylic pressure-sensitive adhesive group was 0.8. No bright spots were detected in the urethane adhesive group.
  • the digital assay reaction solution was incompletely enclosed in the chamber, or the fluorescein generated and accumulated in the reactor due to the ⁇ gal reaction leaked into the adhesive tape adhesive layer. was thought to be the cause.
  • Test Example 2 Examination of rubber adhesive
  • the results are shown in FIG.
  • the SIS group (IS03, IS07, IS09), SBS group (BS02, BS03, BS05), SEPS group (EP01, EP03), SEBS group (EP02) and PIB group (IB01) all had 52 or more bright spots. there were.
  • the number of bright spots in the EPM group (EPG01) and the IIR group (BT01) ranged from 10 to 119, and sometimes fell below 52.
  • the SIS group, SBS group, SEPS group, SEBS group, and PIB group in particular were able to detect a single molecule of ⁇ gal. The number of bright spots was particularly large in the SBS group, SEPS group and SEBS group.
  • Chamber array chip 11 Substrate 12: Fluororesin film 13: Outermost surface 2: Chamber 21: Bottom surface 22: Partition wall 3: Chamber array region 4: Target substance 5: Probe 6: Adhesive tape 61: Base material layer 62: Adhesive Agent layer S: sample liquid

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Abstract

デジタルアッセイの操作をより簡便かつ簡易にするために利用可能な技術として、溶液中の物質の濃度を決定するデジタルアッセイ方法であって、（１）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板を提供する手順；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、（２）前記基板の前記チャンバーアレイ領域上に物質を含む溶液を導入する手順と、（３）前記基板の前記チャンバーアレイ領域を、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープで被覆し、続いて該粘着テープの前記粘着剤層を基板表面に圧着させることにより、前記チャンバーアレイ領域上の余剰の前記溶液を該チャンバーアレイ領域外へ排するとともに、前記チャンバーのそれぞれの内部に前記溶液を液密に封止してリアクタとする手順と、（４）前記リアクタのそれぞれの内部の前記物質の存在の有無を、前記物質の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する手順と、（５）前記物質の存在が検出されたリアクタの数に基づいて前記溶液中の前記物質の濃度を決定する手順と、を含む、方法を提供する。

Description

デジタルアッセイ方法及びデジタルアッセイキット
　本開示は、溶液中の物質の濃度を決定するためのデジタルアッセイ方法及びデジタルアッセイキットに関する。より詳しくは、極小容積のチャンバーが多数配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板と粘着テープとを用いて基板上に極小容積のリアクタを多数形成する手順を含むデジタルアッセイ方法等に関する。
　溶液中の物質の絶対濃度を決定するための技術としてデジタルバイオアッセイがある。デジタルバイオアッセイは、溶液中の物質の濃度が低くかつ多数のリアクタのそれぞれの容積が小さいという条件下で溶液を各リアクタに導入すると、大部分のリアクタには物質は導入されず、残りのリアクタに物質が１分子ずつ導入されることを測定原理とする。例えば物質が酵素である場合、酵素との反応によって蛍光を発するフルオロジェックアッセイ基質を酵素とともにリアクタに導入することで、酵素反応によって生じるリアクタからの蛍光信号を「０」と「１」に二値化できる。そして、この「１」の信号の回数を数え上げることで酵素の絶対濃度を決定できる。
　特許文献１には、デジタルバイオアッセイに応用可能な技術として、「互いに隔てられて形成された複数のレセプタクル内に収容された微小物質を検出する方法であって、（１）前記レセプタクルが形成されている下層部と、当該下層部における当該レセプタクルが形成されている面に対向する上層部と、の間の空間に、前記微小物質を含む溶媒を導入する手順と、（２）上記空間にガスを導入して、前記レセプタクル内に、前記微小物質を包含する、溶媒の液滴を形成する手順と、（３）前記液滴内に存在する前記微小物質を光学的、電気的及び／又は磁気的に検出する手順と、を含む、方法。」が開示されている。この技術は、レセプタクル内に微小物質を包含する液滴を形成させてリアクタとするに際してガスを用いることを特徴とするものである。
国際公開２０１８／１８１４８８号
　本開示は、デジタルアッセイの操作をより簡便かつ簡易にするために利用可能な技術を提供することを主な目的とする。
　上記の課題を解決するために、本開示は、以下の［１］－［１６］を提供する。
［１］　溶液中の物質の濃度を決定するデジタルアッセイ方法であって、
（１）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板を提供する手順；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
（２）前記基板の前記チャンバーアレイ領域上に物質を含む溶液を導入する手順と、
（３）前記基板の前記チャンバーアレイ領域を、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープで被覆し、続いて該粘着テープの前記粘着剤層を基板表面に圧着させることにより、前記チャンバーアレイ領域上の余剰の前記溶液を該チャンバーアレイ領域外へ排するとともに、前記チャンバーのそれぞれの内部に前記溶液を液密に封止してリアクタとする手順と、
（４）前記リアクタのそれぞれの内部の前記物質の存在の有無を、前記物質の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する手順と、
（５）前記物質の存在が検出されたリアクタの数に基づいて前記溶液中の前記物質の濃度を決定する手順と、
を含む、方法。
［２］　前記粘着テープの前記粘着剤層が、ゴム系粘着剤組成物及び／又はシリコーン系粘着剤組成物からなる、［１］の方法。
［３］　前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［２］の方法。
［４］　前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［３］の方法。
［５］　前記粘着剤層の厚みが、２μｍを超え１０００μｍ以下である、［１］－［４］のいずれかの方法。
［６］　前記基板の前記表面はフッ素樹脂皮膜により構成されて疎水性を有し、該表面から陥凹して設けられる前記チャンバーは、該フッ素樹脂皮膜からなる疎水性の隔壁と、該フッ素樹脂皮膜を有さない親水性の底面と、から区画される、［１］－［５］のいずれかの方法。
［７］　前記基板の前記表面が親水化されている、［１］－［５］のいずれかの方法。
［８］　前記チャンバーの直径が０．０５－１０００μｍ、深さが０．００１－１０００μｍであり、配設間隔が５－１０μｍである、［１］－［６］のいずれかの方法。
［９］　溶液中の物質の濃度を決定するためのデジタルアッセイキットであって、
（Ａ）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
（Ｂ）前記基板の前記チャンバーアレイ領域に貼付される、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープ；ここで前記粘着テープの前記粘着剤層は、ゴム系粘着剤及び／又はシリコーン系粘着剤からなる；と、
を含む、キット。
［１０］　前記粘着テープの前記粘着剤層が、ゴム系粘着剤組成物及び／又はシリコーン系粘着剤組成物からなる、［９］のキット。
［１１］　前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［１０］のキット。
［１２］　前記ゴム系粘着剤組成物が、
スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、及び、
イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、
からなる群より選択されるいずれか１以上である、［１１］のキット。
［１３］　前記粘着剤層の厚みが、２μｍを超え１０００μｍ以下である、［９］－［１２］のいずれかのキット。
［１４］　前記基板の前記表面はフッ素樹脂皮膜により構成されて疎水性を有し、該表面から陥凹して設けられる前記チャンバーは、該フッ素樹脂皮膜からなる疎水性の隔壁と、該フッ素樹脂皮膜を有さない親水性の底面と、から区画される、［９］－［１３］のいずれかのキット。
［１５］　前記基板の前記表面が親水化されている、［９］－［１３］のいずれかのキット。
［１６］　前記チャンバーの直径が０．０５－１０００μｍ、深さが０．００１－１０００μｍであり、配設間隔が５－１０μｍである、［９］－［１５］のいずれかのキット。
　本開示により、デジタルアッセイの操作をより簡便かつ簡易にするために利用可能な技術が提供される。
チャンバーアレイチップを説明するための図である。 チャンバーアレイチップを説明するための図である。 デジタルアッセイ方法の手順を説明するための図である。 ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系の粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いたβ-ガラクトシダーゼ（βgal）の一分子検出試験の結果を示す。 ゴム系粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いたβ-ガラクトシダーゼ（βgal）の一分子検出試験の結果を示す。
　以下、本開示を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本開示の範囲が狭く解釈されることはない。
　本開示に係るデジタルアッセイ方法は、溶液中の物質（以下、「対象物質」と称する）の濃度を決定する方法であって、以下の手順を含む。
（１）基板提供手順
（２）溶液導入手順
（３）封入手順
（４）検出手順
（５）濃度決定手順
１．基板提供手順
　本手順では、容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板（以下、「チャンバーアレイチップ」と称する）を提供する。
　図１及び図２にチャンバーアレイチップを示す。
　チャンバーアレイチップ１は、チャンバー２が多数配列されたチャンバーアレイ領域３を有する。
　チャンバーアレイチップ１のサイズや形状は、特に限定されない。一例として幅３２ｍｍ、奥行２４ｍｍの矩形で、厚さ２ｍｍである。チャンバーアレイチップ１のサイズは、幅１－１００ｍｍ、奥行１－１００mｍで、厚さ０．１－１０ｍｍであってよい。チャンバーアレイチップ１の形状は、矩形、正方形、円形及び楕円形などであってよい。
　チャンバーアレイ領域３のサイズは、チャンバーアレイチップ１よりも小さければよく、形状も特に限定されないが、上記の例において幅２０ｍｍ、奥行２０ｍｍの矩形である。チャンバーアレイ領域３のサイズは、幅０．１－３０ｍｍ、奥行０．１－３０ｍｍであってよい。チャンバーアレイ領域３の形状は、矩形、正方形、円形及び楕円形などであってよい。
　チャンバー２のサイズや形状も、特に限定されないが、一例として直径（ｄ）４μｍ、深さ（ｈ）３μｍの円柱形又は略円柱形である。チャンバー２のサイズは、直径（ｄ）０．０５－１０００μｍ、深さ（ｈ）０．００１－１０００μｍであってよい。チャンバー２のサイズや形状は、成形のしやすさの観点から、円柱形あるいは角柱形であることが好ましい。チャンバー２の容積は、１アトリットル－５０ナノリットルであり、好ましくは１０フェムトリットル－１００フェムトリットルである。チャンバーアレイ領域３におけるチャンバー２の配設数及び間隔（ピッチ）は、適宜設定され得る。配設数は、例えば１万個－１００億個であり、好ましくは１０万－１０００万個である。チャンバー２同士の間隔（ピッチ）は、例えば０．０５－３０μｍであり、好ましくは５－１０μｍである。
　チャンバーアレイチップ１は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチング、又はプラスチック製基板のナノインプリントや射出成型、切削加工などの公知の技術を用いて成形できる。
　チャンバーアレイチップ１は、好適には、汎用のフォトリソグラフィー法によって基板１１上にチャンバー２をパターン形成することによって得られる。具体的には、例えばガラス製の基板１１上にスピンコートとベーク処理によってフッ素樹脂皮膜１２を形成し、さらにフッ素樹脂皮膜１２上にフォトレジスト皮膜（不図示）を形成する。チャンバー２の形状がパターニングされたマスクを介してフォトレジスト皮膜に紫外線を照射した後、基板１１をレジスト用現像液に浸漬し、フォトレジスト皮膜のうち紫外線照射された部分を除去する。ドライエッチングによりレジスト除去部分のフッ素樹脂皮膜１２を除去して、チャンバー２の底面２１となる基板１１の表面を露出させる。最後に、基板１１を洗浄してレジスト皮膜を完全に除去する。以上の工程によって、基板１１上に、残存したフッ素樹脂皮膜１２を隔壁２２とし、基板１１の表面を底面２１とするチャンバー２を多数形成できる。得られたチャンバーアレイチップ１の最表面１３は、隔壁２２として残存したフッ素樹脂皮膜１２により構成され、疎水性を有する。チャンバー２は、最表面１３から陥凹して設けられ、チャンバー２の底面２１は、ガラス製の基板１１の表面であって親水性を有する。
　チャンバーアレイチップ１の最表面１３は、それを構成するフッ素樹脂皮膜１２に対して親水処理を行うことにより、親水化されていることが好ましい。親水処理は、例えばポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコールなどの親水性ポリマーをフッ素樹脂皮膜１２にコーティングしたり、プラズマ処理でフッ素樹脂皮膜１２の官能基を親水性のものに改質したりすることによって行い得る。
　また、チャンバー２のパターン形成に、フッ素樹脂に替えて親水性のポリマーの皮膜を用いることによっても、最表面１３が親水化されたチャンバーアレイチップ１を得ることができる。
　基板１１は、光透過性を有する材質とされ、例えばガラスや各種プラスチック（ＰＰ、ＰＣ、ＰＳ、ＣＯＣ、ＣＯＰ、ＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、ＰＥＴ、ＰＶＣ等）とされる。基板１１の材質は、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいため、光学誤差の少ない材質を選択することが好ましい。
　フッ素樹脂皮膜１２を形成するためのフッ素樹脂には、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００などの市販のものを利用できる。微細加工が容易であるという理由で、ＣＹＴＯＰ（登録商標）が好ましい。
２．溶液導入手順
　本手順では、チャンバーアレイチップ１のチャンバーアレイ領域３上に対象物質を含む溶液を導入する。
　図３を参照して説明する。
　チャンバーアレイチップ１のチャンバーアレイ領域３上に対象物質４を含む溶液Ｓを導入する（図３（Ａ）参照）。対象物質４を含む溶液Ｓ（以下、「サンプル液Ｓ」と称する）は、対象物質４の存在に起因して蛍光物質を生じさせるプローブ５を含んでいてもよい。サンプル液Ｓの導入は、例えばチャンバーアレイ領域３上にサンプル液Ｓを滴下することによって行えばよい。
　チャンバーアレイチップ１の最表面１３が親水化されている場合、滴下されたサンプル液Ｓはチャンバー２のそれぞれの内部にまで導入され得る。
　一方、チャンバーアレイチップ１の最表面１３が疎水性を有する場合、図３（Ａ）に示すように滴下されたサンプル液Ｓが疎水性の最表面１３に担持されて液滴状となる場合がある。この場合、本手順では、サンプル液Ｓがチャンバー２の内部にまで完全に導入されることは要さない。
［対象物質］
　対象物質４は、チャンバー２内に収容され得る大きさの物質であればよく、核酸、タンパク質、糖、脂質、アミノ酸、ペプチド、化学物質又はこれらの複合体等であってよい。
　対象物質４は各種疾患のマーカーとなるものであってもよく、この場合において対象物質４は特にウイルスやバクテリア、細胞等であってよい。
　疾患のマーカーは生体試料に含まれるものであってよく、生体試料は、例えば血液、血漿、血清、尿、涙液、唾液、鼻又は喉の拭い液などであってよい。
　プローブ５は、対象物質４の存在に起因して蛍光物質を生じさせ得る物質であればよく、細胞（レポーター細胞）であってもよい。レポーター細胞及としては、抗体や成長因子などのタンパク質の存在下で転写プロモーターが活性化しGFPやルシフェラーゼなどの蛍光・発光タンパク質を発現するように改変された細胞株や、特定化学物質（一例としてヒ素イオンなどの毒素や、メバロン酸、フコース及びバニリン等の代謝産物や糖など）の存在下で蛍光・発光タンパク質を発現するように改変された大腸菌などが公知である。
　核酸は、DNA又はRNAであってよく、DNA及びRNAは生物由来でも人工合成されたものでもよく、環状でも直鎖でも良い。核酸との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された、オリゴDNAヌクレオチド及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
　タンパク質は、酵素、抗体、細胞表面タンパク質、その他細胞由来タンパク質、ウイルス由来タンパク質、又は人工タンパク質などであってよい。タンパク質との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。酵素は特にウイルスの表面に存在する酵素であってよい。酵素との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、酵素によって切断される基質と蛍光物質とを結合させたフルオロジェックアッセイ基質が挙げられる。具体的には、例えば対象物質４がインフルエンザウイルスである場合、フルオロジェックアッセイ基質５には、インフルエンザウイルスが表面に有するノイラミニダーゼと反応して切断されて蛍光物質を遊離させるFDG（Fluorescein-D-Galactopyranoside）を用いることができる。
　糖は、天然もしくは人工の糖鎖もしくは単糖であってよい。糖との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体やレクチン、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
　脂質は、エキソソーム、リポソーム、ミセル、又は脂質分子などであってよい。脂質との組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
　アミノ酸及びペプチドは、アミノ酸が一つまたは複数（一般的には50以下）つながった構造をもったものであってよい。アミノ酸及びペプチドとの組み合わせで用いられ得るプローブ５としては、蛍光標識された抗体、レポーター細胞系及びRNAアプタマーなどが挙げられる。
　対象物質４は、担体に保持されていてもよい。担体としては、マイクロビーズが汎用されている。「マイクロビーズ」は、「粒子」と同義に用いられ、当技術分野において慣用技術である。マイクロビーズの形状は、特に限定されないが、通常球形とされる。マイクロビーズの材料も、特に限定されず、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、メンブレン及び磁性体などであってよい。具体的な材料として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、ジビニルベンゼンン等と架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレンデキストラン、ゴム、ケイ素、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然スポンジ、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標））およびアガロースゲル（セファロース（商標））などが挙げられる。ビーズは、多孔性であってもよい。
　蛍光物質は、当該分野において既知の任意のものであってよく、例えば以下が例示される。４－メチルウンベリフェロン；６－カルボキシ－４'，５'－ジクロロ－２'，７'－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシエオシン；５－カルボキシフルオレセイン；６－カルボキシフルオレセイン；５－（および６－）－カルボキシフルオレセイン；５－カルボキシフルオレセイン－ビス－（５－カルボキシメトキシ－２－ニトロベンジル）エーテル、－アラニン－カルボキシアミドもしくはスクシンイミジルエステル；５－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－（４，６－ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン；２'，７'－ジフルオロフルオレセイン；エオシン－５－イソチオシアナート；エリスロシン－５－イソチオシアナート；６－（フルオレセイン－５－カルボキシアミド）ヘキサン酸もしくはスクシンイミジルエステル；６－（フルオレセイン－５－（および－６）－カルボキシアミド）ヘキサン酸もしくはスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－EXスクシンイミジルエステル；フルオレセイン－５－イソチオシアナート；フルオレセイン－６－イソチオシアナート；Oregon Green（登録商標）488カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；Oregon Green488イソチオシアナート；Oregon Green488－Xスクシンイミジルエステル；Oregon Green500カルボン酸；Oregon Green500カルボン酸、スクシンイミジルエステルもしくはトリエチルアンモニウム塩；Oregon Green514カルボン酸；Oregon Green514カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；Rhodamine Green（登録商標）カルボン酸、スクシンイミジルエステルもしくは塩酸塩；Rhodamine Greenカルボン酸、トリフルオロアセタミドもしくはスクシンイミジルエステル；Rhodamine Green－Xスクシンイミジルエステルもしくは塩酸塩；Rhodol Green（登録商標）カルボン酸、N,O－ビス－（トリフルオロアセチル）もしくはスクシンイミジルエステル；ビス－（４－）カルボキシピペリジニル）スルホンローダミンもしくはジ（スクシンイミジルエステル）；５－（および－６）－カルボキシナフトフルオレセイン、５－（および－６）－カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；５－カルボキシローダミン ６G 塩酸塩；６－カルボキシローダミン ６G 塩酸塩；５－カルボキシローダミン ６G スクシンイミジルエステル；６－カルボキシローダミン ６G スクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシローダミン ６G スクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－２'，４'，５'，７'－テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステルもしくはビス－（ジイソプロピルエチルアンモニウム）塩；５－カルボキシテトラメチルローダミン；６－カルボキシテトラメチルローダミン；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミン；５－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－X－ローダミン；５－カルボキシ－X－ローダミンスクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－X－ローダミンスクシンイミジルエステル；５－（および－６）－カルボキシ－X－ローダミンスクシンイミジルエステル；５－カルボキシ－X－ローダミントリエチルアンモニウム塩；Lissamine（商標）ローダミンB塩化スルホニル；マラカイトグリーンイソチオシアナート；NANOGOLD（登録商標）モノ（スルホスクシンイミジルエステル）；QSY（登録商標）21カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；QSY７カルボン酸もしくはスクシンイミジルエステル；Rhodamine Red（商標）－Xスクシンイミジルエステル；６－（テトラメチルローダミン－５－（および－６）－カルボキシアミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル；テトラメチルローダミン－５－イソチオシアナート；テトラメチルローダミン－６－イソチオシアナート；テトラメチルローダミン－５－（および－６）－イソチオシアナート；Texas Red（登録商標）スルホニル；Texas Red塩化スルホニル；Texas Red－X STPエステルもしくはナトリウム塩；Texas Red－X スクシンイミジルエステル；ならびにX－ローダミン－５－（および－６）－イソチオシアナートなど、及びこれらの組み合わせ。
［溶液］
　対象物質４は、水又は緩衝液に溶解されている。
　緩衝液は、特に限定されないが、ＭＯＰＳ（3-(N-morpholino) propanesulfonic acid）、ＭＥＳ（2-Morpholinoethanesulfonic acid）、ＡＤＡ（N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid）、ＰＩＰＥＳ（Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)）、ＡＣＥＳ（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＢＥＳ（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid）、ＴＥＳ（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid）、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）、Ｔｒｉｓ（Tris(hydroxymethyl)aminomethane）、ＤＥＡ（Diethanolamine）等が用いられ得る。
３．封入手順
　本手順では、チャンバーアレイチップ１のチャンバーアレイ領域３を、粘着テープ６で被覆し、続いて粘着テープ６をチャンバーアレイチップ１の最表面１３に圧着させることにより、チャンバーアレイ領域３上の余剰のサンプル液Ｓをチャンバーアレイ領域３外へ排するとともに、チャンバー２のそれぞれの内部にサンプル液Ｓを液密に封止してリアクタとする。
　図３を参照して説明する。
　まず、サンプル液Ｓを滴下したチャンバーアレイ領域３を粘着テープ６で被覆する（図３（Ｂ）参照）。粘着テープ６は基材層６１と粘着剤層６２とを含んでなるが、この被覆時には粘着テープ６の粘着剤層６２はチャンバーアレイチップ１の最表面１３には接触させないようにする。サンプル液Ｓは、粘着テープ６に押し潰されるようにして粘着テープ６の粘着剤層６２とチャンバーアレイチップ１の最表面１３との間に形成される空間に広がり（図中左右方向）、サンプル液Ｓの一部がチャンバー２の内部に導入されてチャンバー２の内部がサンプル液Ｓによって充満される。チャンバー２の内部に入りきらなかった余剰のサンプル液Ｓの一部はチャンバーアレイ領域３外に押し出される。
　この際、チャンバーアレイチップ１を冷却することで、チャンバー２の内部へサンプル液Ｓが導入されることを促進できる。冷却の温度は、室温より低ければよいが、例えば０－１０℃、好ましくは２－５℃である。チャンバーアレイチップ１の冷却は、例えばチャンバーアレイチップ１を氷の上に置いたアルミブロックの上に静置することによって行うことができる。
　チャンバー２の内部へのサンプル液Ｓの導入促進のため、チャンバーアレイチップ１に振動を加えたり、陰圧下に置いてチャンバー２内の空気を脱気したりしてもよい。また、サンプル液Ｓに界面活性剤を添加することによっても、チャンバー２の内部へのサンプル液Ｓの導入を促進できる。なお、サンプル液Ｓの導入促進のためのこれらの処置は、溶液導入手順において行うこともできる。
　次に、粘着テープ６の粘着剤層６２をチャンバーアレイチップ１の最表面１３に圧着させる（図３（Ｃ）参照）。これにより、チャンバー２の内部に入りきらなかった余剰のサンプル液Ｓを完全にチャンバーアレイ領域３外に排出するとともに、チャンバー２のそれぞれの内部にサンプル液Ｓを液密に封止してリアクタとする。粘着テープ６の圧着は、例えばチャンバーアレイチップ１を安定した平らな作業台に置き、粘着テープ６上に適当な押圧力を加えつつローラーを往復させることにより行うことができる。
　サンプル液Ｓ中の対象物質４の濃度が低い場合、各チャンバー２には、対象物質４が１分子導入されるか全く導入されないかのどちらかとなる。
　測定される対象物質４の濃度範囲は、通常１ｚＭ－１ｍＭの範囲である。
　一方で、プローブ５がサンプル液Ｓに含まれる場合、プローブ５は、全てのチャンバー２に１分子あるいは２分子以上導入されるように、対象物質４の濃度に比して十分に高い濃度でサンプル液Ｓ中に含まれることが好ましい。
［粘着テープ］
　粘着テープ６には、好ましくは光透過性を有するものが用いられる。ただし、検出手順で用いる光学検出系の構成によっては光透過性は必須とはならない。具体的には、励起光の照射と蛍光の検出をいずれもチャンバーアレイチップ１の下方から行う場合や、励起光の照射を要せずに発光し得るプローブ５を用いてチャンバーアレイチップ１の下方から検出を行う場合には、粘着テープ６は光不透過性であってよい。
　粘着テープ６は、基材層６１に粘着剤組成物の溶液を塗布し、溶媒を揮発させて粘着剤層６２を形成させることにより得ることができる。粘着剤組成物の溶媒への溶解、基材層６１への粘着剤組成物溶液の塗布及び乾燥は、従来公知の手法により行えばよい。溶媒（例えばトルエン）も適宜選択可能である。
　基材層の厚みは、特に限定されないが、例えば１－１００μｍ、好ましくは２－５０μｍ、より好ましくは４－２５μｍである。
　粘着剤層の厚みは、例えば２μｍを超え１０００μｍ以下であり、好ましくは５－５０μｍ、より好ましくは５－２０μｍである。２μｍ以下であるとチャンバーアレイチップ１の最表面１３の汚れなどによるわずかな凹凸を粘着剤層６２の弾性で吸収できず、著しくアッセイ成功率が低下する。１０００μｍを超えると粘着剤層６２の厚みを均一に形成するのが難しくなるほか、圧着した際に粘着剤層の圧縮が不均一になることが多く、局所的にチャンバー２の封止が不完全な領域が発生しやすくなる。
［基材層］
　基材層６１の材質は、光透過性がある材質として、例えばポリエステル、ＰＰ、ポリイミド、ＰＥＴ、セロファン、ＰＶＣ、ポリオレフィンなどからなるフィルムが用いられ得る。また、光不透過性の材質としては、例えば紙、不織布、ウレタンフォーム等の発泡体、金属箔などが用いられ得る。
［粘着剤層］
　粘着剤層６２を形成するための粘着剤組成物は、特に限定されず、ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系などの従来汎用のものから適宜選択され得るが、ゴム系粘着剤組成物又はシリコーン系粘着剤組成物が好ましく、ゴム系粘着剤組成物がより好ましい。
　ゴム系粘着剤組成物としては、スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物が挙げられる。
　ゴム系粘着剤組成物としては、SIS粘着剤組成物、SBS粘着剤組成物、SEPS粘着剤組成物、SEBS粘着剤組成物、及びPIB粘着剤組成物が好ましい。
　粘着剤層を形成する粘着剤組成物には、上述の粘着剤組成物のうち１つ、又は２以上を組み合わせて用いてよい。
　ここで、「SIS粘着剤組成物」とは、組成物に含まれる主ポリマーをSISとするものであって、当該主ポリマーを固形成分中の含有率（質量比）で少なくとも30%以上、好ましくは40％以上含有する組成物を意味する。SIS粘着剤組成物は、主ポリマー以外の成分を含んでいてもよく、例えば、主ポリマー以外のポリマー、粘着付与剤、粘度調整剤、可塑剤、架橋剤、充填剤、老化防止剤、酸化防止剤、消泡剤などを含んでいてもよい。SBS粘着剤組成物、SEPS粘着剤組成物、SEBS粘着剤組成物、EPM粘着剤組成物、PIB粘着剤組成物、及びIIR粘着剤組成物についても同様である。
　SIS、SBS、SEPS、SEBS、EPM、PIB、及びIIRの各主ポリマーは、市販製品を利用できる。商業的に入手可能なものとしてそれぞれ以下が例示される。
〔SISポリマー〕
　クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SIS、Cat.No.: DX401
　日本ゼオン株式会社、Quintac、Cat.No.: 3421
〔SBSポリマー〕
　クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SBS、Cat.No.: D1155
　旭化成株式会社、スチレン系熱可塑性エラストマー(SBS)タフプレン、グレードA
〔SEPSポリマー〕
　株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2002
　株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2063
〔SEBSポリマー〕
　株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 8004
〔EPMポリマー〕
　JSR株式会社、JSR EP、グレードEP331
〔PIBポリマー〕
　ENEOSホールディングス株式会社、テトラックス、グレード6T
〔IIRポリマー〕
　JSR株式会社、JSR BUTYL、グレード065
　粘着付与剤にも、従来汎用のものを適宜用いることができるが、例えば、脂肪族系炭化水素樹脂、芳香族系炭化水素樹脂、テルペン系樹脂、ロジン系樹脂などが用いられ得る。商業的に入手可能な粘着付与剤としてそれぞれ以下が例示される。
　ENEOSホールディングス株式会社、水添炭化水素樹脂T-REZ Hシリーズ、Cat.No.: HA085
　ヤスハラケミカル株式会社、芳香族テルペン樹脂YSレジンTOシリーズ、 Cat.No.: TO125
　ヤスハラケミカル株式会社、テルペン樹脂YSレジンPXシリーズ、 Cat.No.: PX1150N
　粘度調整剤、可塑剤、架橋剤、充填剤、老化防止剤、酸化防止剤及び消泡剤にも、従来汎用のものを適宜用いることができるが、例えば、それぞれ以下が挙げられる。
　粘度調整剤としてパラフィンワックスなど、可塑剤として流動パラフィン、フタル酸ジブチル及びアジピン酸ジイソノニルなど、架橋剤としてイソシアネート系架橋剤など、充填剤として炭酸カルシウム、シリカ、タルク及びセルロース粉など、老化防止剤としてジターシャリーブチルヒドロキシトルエン及びN,N'-ジフェニル-p-フェニレンジアミンなど、酸化防止剤としてIrganox1010（BASFジャパン株式会社）及びANTAGE HP-400（川口化学工業株式会社）など、及び消泡剤としてシリコーンオイル類など。
　「シリコーン系粘着剤組成物」とは、シリコーンポリマーを主ポリマーとする粘着剤組成物であって、組成物中にシリコーンポリマーを固形成分中の含有率（質量比）30%以上、好ましくは40％以上含有する組成物を意味する。
　シリコーン系粘着剤としては、付加反応型シリコーン系粘着剤、過酸化物硬化型シリコーン系粘着剤、及び縮合型シリコーン系粘着剤などが挙げられる。
　商業的に入手可能なシリコーン系粘着剤としてそれぞれ以下が例示される。
〔シリコーンポリマー〕
　信越化学株式会社、Cat.No.: KR-3700
　信越化学株式会社、Cat.No.: X-40-3237
　信越化学株式会社、Cat.No.: KR-100
　信越化学株式会社、Cat.No.: KR-130
　シリコーン系粘着剤組成物は、シリコーンポリマー以外の成分を含んでいてもよく、例えば、シリコーンポリマー以外のポリマー、触媒、架橋剤、消泡剤、充填剤、希釈剤、樹脂改質剤などを含んでいてもよい。
　触媒には、従来汎用のものが適宜用いられるが、例えば白金系の触媒液（例えば製品名「ＣＡＴ―ＰＬ―５０Ｔ」、信越化学工業社製）などが用いられる。
　架橋剤にも、従来汎用のものが適宜用いられるが、例えばベンゾイルパーオキサイドなどが用いられる。
　希釈剤及び樹脂改質剤にも、従来汎用のものを適宜用いることができ、例えば、それぞれ以下が挙げられる。希釈剤としてトルエンなどの各種有機溶剤、樹脂改質剤としてシリコーンオイル、シリコーンレジン及び各種シランカップリング剤など。
４．検出手順
　本手順では、チャンバー２のそれぞれの内部の対象物質４の存在の有無を、対象物質４の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する。
　サンプル液Ｓ中の対象物質４の濃度が低い場合、各チャンバー２には、対象物質４が１分子導入されるか全く導入されないかのどちらかとなる（図３（Ｂ）参照）。したがって、各チャンバー２から対象物質４の存在に起因して生じる蛍光を光学的に検出することによって、蛍光信号を「０」と「１」に二値化できる。次の濃度決定手順では、この「１」の信号の回数を数え上げることでサンプル液Ｓ中の対象物質４の絶対濃度を決定する。
　上述の対象物質４がインフルエンザウイルスであり、プローブ５がFDG（Fluorescein-D-Galactopyranoside）である場合、インフルエンザウイルスが導入されたチャンバー２では、インフルエンザウイルスが有するノイラミニダーゼとFDGとの酵素反応によりフルオレセインが遊離する。一方、インフルエンザウイルスが導入されていないチャンバー２ではフルオレセインの遊離は生じない。
　したがって、各チャンバー２からのフルオレセインの蛍光を光学的に検出することによって、蛍光信号を「０」と「１」に二値化できる。
５．濃度決定手順
　対象物質４の存在が検出されたチャンバー（リアクタ）２の数に基づいて溶液中の対象物質４の濃度を決定する。
　具体的には、チャンバー２の容積をＶ（単位：リットル）とし、チャンバー２の総数に対する対象物質４の存在が検出されたチャンバー２の数の割合をλとする。λが十分に小さい場合、以下の計算式により対象物質４のモル濃度Ｃ（単位：Ｍ）を求めることができる。ただし、Ｎはアボガドロ数である。
　Ｃ＝λ／（Ｎ×Ｖ）
　λは理論上０以上１以下であるが、対象物質４の濃度決定のためには、λは０．５以下、望ましくは０．１以下であることが望ましい。
［試験例１：ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系の粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いたバイオアッセイ］
（１）粘着テープの作成
（１－１）粘着剤組成物溶液の調製
　ゴム系、シリコーン系、アクリル系及びウレタン系の粘着剤組成物の溶液を以下の手順により調製した。
［ゴム系粘着剤組成物］
〔スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物IS03
　SISポリマー（クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SIS、Cat.No.: DX401）、粘着付与剤（ENEOSホールディングス株式会社、水添炭化水素樹脂T-REZ Hシリーズ、Cat.No.: HA085。以下「HA085」と称する）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IS03の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物IS07
　SISポリマー（日本ゼオン株式会社、Quintac、Cat.No.: 3421）、粘着付与剤（ヤスハラケミカル株式会社、芳香族テルペン樹脂YSレジンTOシリーズ、 Cat.No.: TO125）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IS07の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物IS09　SISポリマー（日本ゼオン株式会社、Quintac、Cat.No.: 3421）、粘着付与剤（ヤスハラケミカル株式会社、テルペン樹脂YSレジンPXシリーズ、 Cat.No.: PX1150N）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IS09の溶液を得た。
〔スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物BS02
　SBSポリマー（クレイトンポリマージャパン株式会社、クレイトンD SBS、Cat.No.: D1155）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BS02の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物BS03
　SBSポリマー（旭化成株式会社、スチレン系熱可塑性エラストマー (SBS)タフプレン、グレードA）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BS03の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物BS05
　SBSポリマー（旭化成株式会社）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BS05を得た。
〔スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤〕
（ｉ）粘着剤組成物EP01
　SEPSポリマー（株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2002）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EP01の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物EP03
　SEPSポリマー（株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 2063）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EP03の溶液を得た。
〔スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物EP02
　SEBSポリマー（株式会社クラレ、セプトン、Cat.No.: 8004）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EP02の溶液を得た。
〔エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物EPG01
　エチレン・プロピレン共重合体（JSR株式会社、JSR EP、グレードEP331）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物EPG01の溶液を得た。
〔イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物IB01
　ポリイソブチレン（ENEOSホールディングス株式会社、テトラックス、グレード6T）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物IB01の溶液を得た。
〔イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物〕
（ｉ）粘着剤組成物BT01
　ブチルゴム（JSR株式会社、JSR BUTYL、グレード065）、粘着付与剤（HA085）とトルエンを質量比1：1：13で混合し、72時間回転攪拌を行い完全に混合溶解し、粘着剤組成物BT01の溶液を得た。
［シリコーン系粘着剤組成物］
（ｉ）粘着剤組成物SC11
　シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: KR-3700）、白金触媒（信越化学株式会社、Cat.No.: CAT-PL-50T）とトルエンを質量比100：0.3：400で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC11の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物SC12
　シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: X-40-3237）、白金触媒（Cat.No.: CAT-PL-50T）と架橋剤KS-3802（信越化学株式会社、Cat.No.: X-92-122） とトルエンを質量比100：1：0.5：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC12の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物SC13
　シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: KR-100）、過酸化ベンゾイル（株式会社TCI、Cat.No.: B3152）とトルエンを質量比100：2：400で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC13の溶液を得た。
（ｉｖ）粘着剤組成物SC14
　シリコーン系粘着剤主剤（信越化学株式会社、Cat.No.: KR-130）、過酸化ベンゾイル（株式会社TCI、Cat.No.: B3152）とトルエンを質量比100：2：400で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物SC14の溶液を得た。
［アクリル系粘着剤組成物］
（ｉ）粘着剤組成物AC05
　アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: PE-121）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-101）とトルエンを質量比100：3：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC05の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物AC06
　アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: KP-1282）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-101）とトルエンを質量比100：2：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC06の溶液を得た。
（ｉｉｉ）粘着剤組成物AC07
　アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: KP-1405）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-102）とトルエンを質量比100：1：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC07の溶液を得た。
（ｉｖ）粘着剤組成物AC08
　アクリル系溶液樹脂（日本カーバイド工業株式会社、ニッセツ、Cat.No.: KP-2369）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: CK-131）とトルエンを質量比100：2：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC08の溶液を得た。
（ｖ）粘着剤組成物AC09
　アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: BPS-5213K）、イソシアネート系架橋剤（日本カーバイド工業株式会社、Cat.No.: BHS8515とトルエンを質量比100：2：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC09の溶液を得た。
（ｖｉ）粘着剤組成物AC10
　アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: BPS-5296）、トリレンジイソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: BHS-8515）とトルエンを質量比100：2：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC10の溶液を得た。
（ｖｉｉ）粘着剤組成物AC11
　アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: KP-5160）とトルエンを質量比100：100で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC11の溶液を得た。
（ｖｉｉｉ）粘着剤組成物AC12
　アクリル系溶液樹脂（トーヨーケム株式会社、オリバイン、Cat.No.: BPS-5375）、トリレンジイソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: BHS-8515）とトルエンを質量比100：1.7：200で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物AC12の溶液を得た。
［ウレタン系粘着剤組成物］
（ｉ）粘着剤組成物UR01
　ウレタン系溶液樹脂（トーヨーケム 株式会社、サイアバイン、Cat.No.: SH-101）、イソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: T-501B）を質量比100：4で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物UR01の溶液を得た。
（ｉｉ）粘着剤組成物UR02
　ウレタン系溶液樹脂（トーヨーケム 株式会社、サイアバイン、Cat.No.: SH-205）、イソシアネート系架橋剤（トーヨーケム 株式会社、Cat.No.: T-501B）とトルエンを質量比100：3で混合し、30分回転攪拌を行い混合し、粘着剤組成物UR02の溶液を得た。
（１－２）基材層への粘着剤層の積層
　基材層には、厚さ25μmのポリイミドフィルム（東レ・デュポン、Cat. No.：100H-A4）を約10 cm四方に切断して用いた。
　ホットプレート上に基材層を置き、上述の各粘着剤組成物の溶液を基材層中央に約0.5 mL滴下した。室温で約30分静置して溶媒を揮発させたのちに、ホットプレートの温度を上昇させ、加熱処理を行った。加熱温度と時間は粘着剤によって異なり、ゴム系粘着剤が140℃で60分、アクリル系粘着剤とウレタン系粘着剤が140℃で10分、シリコーン系粘着剤は140℃で10分、又は90℃で5分ののち200℃で5分とした。このようにして得られた粘着テープの粘着剤層の厚みは5-50μm程度であった。
（２）チャンバーアレイチップの作成
　チャンバーアレイチップを以下の手順により作成した。
　ガラス基板（松浪硝子株式会社、カバーグラス、24 mm x 32 mm、厚さ0.17 mm）にフッ素樹脂（旭硝子株式会社、CYTOP、Cat No.: CTL-816AP）をスピンコートし、フッ素樹脂皮膜を形成した。スピンコートの条件は2000 rpm、30秒とした。
　フッ素樹脂皮膜を形成したガラス基板を180℃で1時間ベーク処理を行い、フッ素樹脂皮膜とガラス基板とを密着させた。スピンコートとベーク処理を合計4回繰り返して、厚さ約3 μmのフッ素樹脂皮膜をガラス基板上に形成した。
　フッ素樹脂皮膜の上に、ポジティブタイプのフォトレジスト（AZ Electronic Materials、AZP4903）をスピンコートし、フォトレジスト皮膜を形成した。スピンコートの条件は4000 rpm、60秒とした。
　フォトレジスト皮膜を形成したガラス基板を110℃で1時間ベーク処理を行い、フォトレジスト皮膜とフッ素樹脂皮膜とを密着させた。
　次に、フォトリソグラフィーによるチャンバー形状のパターン形成を行なった。チャンバー形状がパターニングされたマスクを介してフォトレジスト皮膜に紫外線を照射した。ガラス基板をレジスト用現像液に浸漬し、フォトレジスト皮膜のうち紫外線照射された部分を除去した。
　基板をドライエッチング装置（SAMCO株式会社、RIE-10NR）にセットし、O2プラズマを用いてドライエッチングすることにより、レジスト除去部分のフッ素樹脂皮膜を除去して底面のガラスを露出させた。
　ガラス基板をアセトン及びエタノールで洗浄してフォトレジスト皮膜を完全に除去し、チャンバー形状がパターニングされたチャンバーアレイチップを得た。
　得られたチャンバーアレイチップには、20 x 20 mmのチャンバーアレイ領域に、直径4 μm、高さ3 μmのチャンバーが繰り返しピッチ9 μmで約５７０万個形成されている。
（３）デジタルアッセイ
　チャンバーアレイチップと種々の粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープとを用いて以下の手順によりβ-ガラクトシダーゼ（βgal）の一分子検出を行った。
（３－１）デジタルアッセイ反応液の調製
　βgal酵素（メルク株式会社、Cat No.: 10745731001）をアッセイ用バッファー（1M MOPS （pH 7.0）、4 mM CaCl2）で希釈し、10 pMのストック溶液を作成した。
　βgalのフルオロジェックアッセイ基質として、FDG（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、Fluorescein-D-Galactopyranoside、Cat No.：F1179）をDMSO（富士フィルム和光純薬株式会社、ジメチルスルホキシド、Cat. no.：049-07213）で溶解して25 mM ストック溶液を作成した。
　蛍光色素として、Alexa Fluor 647（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、Alexa Fluor 647 C2 Maleimide、Cat No.：A20347）を水で溶解して200 μMのストック溶液を作成した。
　デジタルアッセイ反応液は、アッセイ用バッファー 16.7 μL、βgalストック溶液 2 μL、FDGストック溶液 0.8 μL、蛍光色素ストック溶液0.5 μLを用時に混合して調製した。βgalの最終濃度は1 pMであった。
（３－２）チャンバーへのデジタルアッセイ反応液の導入
　デジタルアッセイ反応液を、チャンバーアレイチップのチャンバーアレイ領域上に滴下した。チャチャンバーアレイの表面はフッ素膜樹脂からなり疎水的であるため、滴下したデジタルアッセイ反応液は広がらずに液滴となって残留する。
　粘着テープを10 x 20 mm程度の大きさにカットしたものでチャンバーアレイ領域を被覆した。この際、粘着テープの粘着剤層とチャンバーアレイチップの表面は接触させないようにする。デジタルアッセイ反応液の液滴は、粘着テープによって押し潰されて広がる。
　この状態で、チャンバーアレイチップを氷の上に置いたアルミブロックの上に1分程度置く。この処理により、チャンバーアレイチップのチャンバー内にデジタルアッセイ反応液が導入されることを促進できる。
（３－３）チャンバーの封止
　チャンバーアレイチップを安定した平らな作業台に置き、粘着テープ上に10-20kg程度の力を加えつつローラーを5-10回程度往復させて、粘着テープの粘着剤層をチャンバーアレイチップの表面に圧着させる。これにより、チャンバーのそれぞれが液密に封止されてリアクタとして構成される。また、このとき、チャンバーアレイ領域上の余剰のデジタルアッセイ反応液がチャンバーアレイ領域外へ排出される。
（３－４）デジタルカウンティング
　チャンバーアレイチップを蛍光顕微鏡にセットして観察した。観察に用いた実験用の顕微鏡の主要な部品は、本体（オリンパス株式会社、倒立型リサーチ顕微鏡IX83）、励起用LED光源ユニット（EXCELITAS TECHNOLOGIES社、Xcite XYLIS）、高感度sCMOSカメラ（ANDOR社、Neo）、20倍対物レンズ（オリンパス株式会社、UplanSApo 20x/0.75）などである。
　チャンバーの封止から10分後に、明視野とフルオレセインとAlexa Fluor 647の蛍光画像を取得した。
　フルオレセイン（励起ピーク波長490 nm、蛍光ピーク波長525 nm）は顕微鏡のGFP観察用の設定を使用して露光時間を150ミリ秒、Alexa Fluor 647（励起ピーク波長651 nm、蛍光ピーク波長671 nm）はCy5観察用の設定を使用して露光時間を50 ミリ秒とした。
　画像を画像解析用のフリーソフトウェアImageJ/Fiji（アメリカ国立衛生研究所）で開き、撮影された輝点数を計測した。
　画像の中央に、画像内の距離で直径527 μmの試験円（撮影した長方形の画像の短辺の3/4に相当する）を描き、その範囲内におさまった約3070-3080個のチャンバーについて輝点数を計測した。
　フルオレセインの撮影画像を観察して、蛍光がある一つ一つのチャンバーについて、チャンバー内のフルオレセインでの生成・蓄積による輝点か、気泡やゴミの自家蛍光による輝点かどうかを目視で判定した。Alexa Fluor 647の撮影画像は、主として気泡か否かの判定の補助として用いた。
　このようにして、試験円（約3070-3080個）のチャンバーのうち、何個にβgal反応によるフルオレセインの生成・蓄積による輝点があるかを数え、計測値とした。計測値は、各粘着テープについて２―６つの試験円で行った（一つの試験円につき一つのデータポイント）。
　結果を図４に示す。
　ゴム系及びシリコーン系粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いた試験群（ゴム系粘着剤群及びシリコーン粘着剤群）では、βgalの一分子検出が可能であった。検出された輝点数は、シリコーン粘着剤群に比してゴム系粘着剤群でより多かった。
　ゴム系粘着剤群での輝点数の平均は１３－１３１個の範囲であった。ゴム系粘着剤群全体での輝点数の平均は７４個であった。シリコーン系粘着剤群での輝点数の平均は７．５－６８個の範囲であった。シリコーン系粘着剤群全体での輝点数の平均は３９個であった。
　一方、アクリル系及びウレタン系粘着剤組成物により粘着剤層を形成した粘着テープを用いた試験群（アクリル系粘着剤群及びウレタン系粘着剤群）では、輝点はほとんど検出できなかった。
　アクリル系粘着剤群での輝点数の平均は０－３個の範囲であった。アクリル系粘着剤群全体での輝点数の平均は０．８個であった。ウレタン系粘着剤群では輝点は全く検出できなかった。
　アクリル系粘着剤群及びウレタン系粘着剤群では、デジタルアッセイ反応液のチャンバーへの封入が不完全であること、あるいはβgal反応によりリアクタ内に生成・蓄積したフルオレセインの粘着テープ粘着剤層への漏出が生じていることが要因と考えられた。
［試験例２：ゴム系粘着剤の検討］
　試験例１の結果をゴム系粘着剤組成物について再解析した。
　結果を図５に示す。
　SIS群（IS03, IS07, IS09）、SBS群（BS02, BS03, BS05）、SEPS群（EP01, EP03）、SEBS群（EP02）及びPIB群（IB01）の輝点数は、いずれも５２個以上であった。
　一方、EPM群（EPG01）及びIIR群（BT01）の輝点数は、１０－１１９個の範囲であり、５２個を下回る場合があった。
　ゴム系粘着剤群のうち、特にSIS群、SBS群、SEPS群、SEBS群、及びPIB群で良好なβgalの一分子検出が可能であった。輝点数はSBS群、SEPS群及びSEBS群で特に多かった。
１：チャンバーアレイチップ
１１：基板
１２：フッ素樹脂皮膜
１３：最表面
２：チャンバー
２１：底面
２２：隔壁
３：チャンバーアレイ領域
４：対象物質
５：プローブ
６：粘着テープ
６１：基材層
６２：粘着剤層
Ｓ：サンプル液

Claims (5)

  1. 　溶液中の物質の濃度を決定するデジタルアッセイ方法であって、
    （１）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板を提供する手順；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
    （２）前記基板の前記チャンバーアレイ領域上に物質を含む溶液を導入する手順と、
    （３）前記基板の前記チャンバーアレイ領域を、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープで被覆し、続いて該粘着テープの前記粘着剤層を基板表面に圧着させることにより、前記チャンバーアレイ領域上の余剰の前記溶液を該チャンバーアレイ領域外へ排するとともに、前記チャンバーのそれぞれの内部に前記溶液を液密に封止してリアクタとする手順と、
    （４）前記リアクタのそれぞれの内部の前記物質の存在の有無を、前記物質の存在に起因して生じる蛍光物質からの蛍光に基づいて検出する手順と、
    （５）前記物質の存在が検出されたリアクタの数に基づいて前記溶液中の前記物質の濃度を決定する手順と、
    を含む、方法。
  2. 　前記粘着テープの前記粘着剤層が、ゴム系粘着剤組成物及び／又はシリコーン系粘着剤組成物からなる、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ゴム系粘着剤組成物が、
    スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
    スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
    スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
    スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、エチレン－プロピレン共重合体（EPM）粘着剤組成物、
    イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、及び、
    イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム、IIR）粘着剤組成物
    からなる群より選択されるいずれか１以上である、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記ゴム系粘着剤組成物が、
    スチレン－イソプレン－スチレン・ブロック共重合体（SIS）粘着剤組成物、
    スチレン－ブタジエン－スチレン共重合体（SBS）粘着剤組成物、
    スチレン－エチレン・プロピレン－スチレンブロック共重合体（SEPS）粘着剤組成物、
    スチレン－エチレン・ブチレン－スチレンブロック共重合体（SEBS）粘着剤組成物、及び、
    イソブチレン重合体（ポリイソブチレン、PIB）粘着剤組成物、
    からなる群より選択されるいずれか１以上である、請求項３に記載の方法。
  5. 　溶液中の物質の濃度を決定するためのデジタルアッセイキットであって、
    （Ａ）容積１アトリットル－１００フェムトリットルのチャンバーが１万個－１００億個配列されたチャンバーアレイ領域を有する基板；ここで前記基板は光透過性を有し、前記チャンバーは前記基板の表面から陥凹して設けられ；と、
    （Ｂ）前記基板の前記チャンバーアレイ領域に貼付される、基材層と粘着剤層とを含んでなる粘着テープ；ここで前記粘着テープの前記粘着剤層は、ゴム系粘着剤及び／又はシリコーン系粘着剤からなる；と、
    を含む、キット。
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