BR112013022933B1 - método de selagem de microesferas, método para detecção de molécula alvo, matriz, kit e dispositivo para detecção de molécula alvo - Google Patents

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Abstract

MÉTODO DE SELAGEM DE MICROESFERAS, MÉTODO PARA DETECÇÃO DE MOLÉCULA ALVO, MATRIZ, KIT E DISPOSITIVO PARA DETECÇÃO DE MOLÉCULA ALVO Esta invenção fornece uma técnica que possibilita detectar moléculas alvos de baixa concentração com elevada sensibilidade. Esta invenção inclui (i) uma etapa de introdução de um solvente hidrofílico (42) contendo microesferas (41), (41') em um espaço (30) entre (a) uma seção da camada inferior (10) incluindo uma pluralidade de receptáculos (13) cada um dos quais é capaz de armazenar apenas uma das microesferas (41), (41') e que são separados entre si por uma parede lateral (12) com uma superfície superior hidrofóbica e (b) uma seção da camada superior (20) que se defronta com uma superfície da seção da camada inferior (10) sobre a qual a superfície da pluralidade de receptáculos é fornecida; e (ii) uma etapa de introdução de um solvente hidrofóbico (43) no espaço (30), sendo a etapa (ii) realizada após a etapa (i).

Description

Campo Técnico
A presente invenção relaciona-se com um método de selagem de microesferas (isto é, um método para selar microesferas), um método para detecção de uma molécula alvo, uma matriz, um kit e um dispositivo para detecção de molécula alvo.
Princípios da Técnica
Houve conhecimento de uma análise de molécula individual como um método para conduzir várias análises por observação de biomoléculas tais como proteínas e ácidos nucleicos de maneira que as biomoléculas são individualmente identificadas. Para realizar a análise de molécula individual, existem alguns métodos conhecidos.
Literatura de Patente 1 descreve uma microcâmara para detecção de atividade enzimática da molécula individual. Essa microcâmara inclui parte de um recipiente em que uma goticula de liquido pode ser selada e que tem a capacidade de armazenar uma goticula de liquido de até 1000 fL (fentolitros). Parte do recipiente é feita de um nicho fornecido em pelo menos um de um primeiro membro e um segundo membro que são ligados entre si. De acordo com Literatura de Patente 1, uma reação enzimática é conduzida na goticula de liquido. Com tal configuração, a reação enzimática pode ser realizada com uma concentração elevada dos produtos da reação, mesmo se o número de moléculas dos produtos da reação for muito pequeno. Desse modo, é possível detectar uma atividade de uma molécula da enzima.
Literatura de Não Patente 1 descreve um método para conduzir uma análise de molécula individual mediante o uso de uma matriz em que uma gotícula de líquido é coberta com óleo, em uma ordem de fentolitro, e acessível diretamente do lado de fora. Essa matriz inclui um padrão da região hidrofílica feito de uma superfície hidrofílica em que uma região hidrofóbica com uma altura de 17 nm é fornecida.
Literatura de Não Patente 2 descreve um método para detecção de uma proteína por um Imunoensaio Absorvente Ligado a Enzima (ELISA) da molécula individual. De acordo com esse método, uma quantidade muito pequena de proteínas é capturada por esferas minúsculas cobertas com anticorpos específicos da proteína e complexos das microesferas e das proteínas são marcados porfluorescência.Então, microesferas incluindo oscomplexos são introduzidas em uma câmara de reação por força centrífuga.Em seguida, o número de microesferas que capturou as proteínas é contado.Desse modo, as proteínas são quantitativamente avaliadas.
Lista de Citação
[Literaturas de Patente] [Literatura de Patente 1] Japanese Patent Application Publication, Tokukai, No. 2004-309405 A (Data da Publicação: 4 de novembro de 2004) [Literaturas de Não Patentes] [Literatura de Não Patente 1] S. Sakakihara et al., Lab Chip, 2010, 10, 3355-3362 [Literatura de Não Patente 2] David M Rissin et al., Nature Biotechnology: doi: 10.1038/nbt.1641
Resumo da Invenção Problema Técnico
Para detectar, por exemplo, marcadores de doença de baixa concentração com o objetivo de detecção de doenças, doenças infecciosas e o equivalente, há uma demanda para o desenvolvimento de técnicas biossensiveis que tenham sensibilidades mais elevadas. Por exemplo, num caso em que um milhão de células de câncer incluidas em um tumor com um volume de 1 mm3 secretam proteinas marcadoras (100 moléculas por célula) em 5 litros de sangue, uma concentração das proteinas no sangue é de aproximadamente 30 aM. Uma técnica capaz de detectar moléculas alvos dessa concentração muito baixa é necessária.
Um possivel método para detecção de tais moléculas alvos pode ser aquela para detecção das moléculas alvos pela análise enzimática da molécula individual mencionada acima com uma sensibilidade em termos de uma única molécula. Especificamente, esse método é conduzido por (i) selagem da molécula alvo especificamente em uma goticula de liquido numa ordem de fentolitro (goticula liquida muito pequena), (ii) ligação da molécula alvo com uma substância como um anticorpo marcado por enzima e (iii) detecção de uma atividade da enzima que marca o anticorpo do modo acima mencionado. A selagem da molécula alvo especificamente em uma goticula de liquido pode ser realizada por um método que utiliza, por exemplo, uma microesfera marcada com uma substância tal como outro anticorpo para se ligar especificamente à molécula alvo. Nesse método, depois que a microesfera se liga à molécula alvo, a microesfera é selada em uma goticula de solução muito pequena.
Incidentalmente, para se detectar de modo eficiente moléculas alvos que estão contidas em uma solução somente em uma quantidade muito pequena, tal como moléculas alvos de aproximadamente 30 aM conforme descrito anteriormente, é necessário preparar um grande número de matrizes de goticula de liquido muito pequenas, tanto quanto cerca de um milhão, e induzir as matrizes a capturar as microesferas.
Todavia, de acordo com o método descrito por Literatura de Patente 2, é preciso que as microesferas sejam introduzidas em matrizes por força centrifuga intensa, sendo requeridos, por conseguinte, muito tempo e esforços.Além disso, o número de matrizes usado no método de Literatura de Não Patente 2 é de aproximadamente cinquenta mil.Assim, o método de Literatura de Não Patente 2 é muito dificil de ser aplicado ao caso que exige cerca de um milhão matrizes.Desse modo, com o método de Literatura de Não Patente 2, é dificil unir de modo eficiente um grande número de microesferas nas matrizes. Aliás, nem Literatura de Patente 1 nem Literatura de Não Patente 1 descrevem nenhum método para solucionar tal problema.
Em vista disso, a presente invenção tem um objetivo de fornecer uma técnica para selagem eficiente de grande número de microesferas em uma matriz. Solução do Problema
Para atingir o objetivo acima, um método da presente invenção para selagem de microesferas inclui (i) uma etapa de introdução de um solvente hidrofílico contendo microesferas em um espaço entre (a) uma seção da camada inferior que inclui uma pluralidade de receptáculos cada um dos quais é capaz de armazenar somente uma das microesferas e que são separados entre si por uma parede lateral com uma superfície superior hidrofóbica e (b) uma seção da camada superior que se defronta com uma superfície da seção da camada inferior sobre cuja superfície a pluralidade de receptáculos é fornecida; e (ii) uma etapa de introdução de um solvente hidrofóbico no espaço, sendo a etapa (ii) realizada após a etapa (i).
Para conseguir o objetivo acima, uma matriz da presente invenção inclui: uma seção da camada inferior fornecida com uma pluralidade de receptáculos sendo separados entre si por uma parede lateral que possui uma superfície superior hidrofóbica; e uma seção de camada superior que se defronta, através de um espaço, com uma superfície da seção da camada inferior sobre a qual a pluralidade de receptáculos é fornecida. Efeitos Vantajosos da Invenção
O uso do método para selagem de microesferas da presente invenção a torna possível para unir um grande número de microesferas em uma matriz, contribuindo desse modo para uma técnica por meio da qual moléculas alvos de baixa concentração são detectáveis com elevada sensibilidade.
Breve Descrição dos Desenhos
(a) a (e) da Figura 1 são ilustrações esquemáticas de um método para selagem de microesferas de acordo com a presente invenção e mostram projeções de seção transversal de uma matriz 1.
A Figura 2 é uma ilustração esquemática de uma modalidade de um dispositivo de detecção de uma molécula alvo de acordo com a presente invenção.
A Figura 3 mostra uma imagem de fluorescência de uma matriz em que microesferas foram seladas em um exemplo da presente invenção.
A Figura 4 é um gráfico mostrando intensidades de fluorescência observadas quando moléculas alvos foram detectadas por um método convencional. (a) a (f) da Figura 5 mostram imagens microscópicas de matrizes em que microesferas foram seladas em outro exemplo da presente invenção.
A Figura 6 mostra um gráfico ilustrando uma relação, observada em outro referido exemplo da presente invenção, entre (i) uma concentração de estreptavidina e (ii) uma proporção entre o número de microesferas com estreptavidina capturada e o número de microesferas armazenadas na matriz.
A Figura 7 é uma incidência para explicação de um método de preparação de uma lâmina padronizada hidrofilica-hidrofóbica de acordo com um exemplo da presente invenção.
A Figura 8 é uma incidência ilustrando (i) a eficiência de aprisionamento de uma microesfera encontrada em um caso envolvendo o uso de uma matriz com uma estrutura para fluxo celular (Exemplo 3) e (ii) a eficiência de aprisionamento de uma microesfera em um caso envolvendo o uso de uma matriz sem uma estrutura para fluxo celular (Exemplo Comparativo 2). Descrição de Modalidades
O que se segue descreve uma modalidade da presente invenção em detalhes.
[Método de Selagem da Microesfera]
Com referência a (a) a (e) da Figura 1, o que se segue descreve um método para selagem de microesferas de acordo com a presente modalidade, (a) a (e) da Figura 1 são ilustrações esquemáticas de um método para selagem de microesferas de acordo com a presente invenção e mostram vistas de secção transversal de uma matriz 1.
A presente modalidade trata de um caso em que microesferas 41 e 41' são seladas em uma matriz 1 incluindo uma seção da camada inferior 10 e uma seção da camada superior 20. A seção da camada inferior 10 inclui uma pluralidade de receptáculos 13 cada um dos quais é capaz de armazenar somente uma das microesferas 41 e 41' e são separados entre si por uma parede lateral 12 com uma superficie superior hidrofóbica. Além disso, a seção 20 da camada superior defronta-se com uma superficie da seção da camada inferior 10 em que a superficie dos receptáculos 13 é fornecida.
Preferivelmente, as microesferas têm um diâmetro médio de particula de 1 pm a 4 pm. Desse modo, as microesferas podem ser seladas de modo eficiente na matriz, e a matriz pode alcançar densidade elevada. Note que o termo "diâmetro médio de particula" aqui se refere a um valor obtido como resultado de mensuração das microesferas mediante observação por microscópio eletrônico ou dispersão luminosa dinâmica.
A presente modalidade descreve, mas particularmente não se limita a, um caso de uso de microesferas que capturam especificamente moléculas alvos. Na presente modalidade, as microesferas a serem seladas são uma mistura das microesferas 41, que ainda não capturaram as moléculas alvos, e as microesferas 41', que capturaram as moléculas alvos.
Por exemplo, é possivel usar, como as microesferas que capturam especificamente as moléculas alvos, microesferas que são ligadas a uma molécula para capturar especificamente a molécula alvo. A molécula para captura especifica da molécula alvo pode ser ligada a um grupo de modificação sobre uma superficie da microesfera, isto é, por meio de um agente de ligação. Por exemplo, a presente invenção pode ser configurada de modo que a molécula para capturar especificamente a molécula alvo é covalentemente ligada a um grupo amino sobre uma superficie de uma microesfera modificada pelo grupo amino por meio de um agente de ligação cruzada contendo N-hidroxissuccinimida e/ou o equivalente.
A "molécula alvo" refere-se a uma molécula que deve ser detectada (escolhida como alvo). Especificamente, a "molécula alvo" aqui se refere a uma molécula que deve molécula. Exemplos da molécula alvo abrangem (i) biomoléculas tais como uma proteína, um ácido nucleico e um açúcar e (ii) partículas virais.
A molécula para capturar especificamente a molécula alvo (daqui em diante, tal molécula é também referida como "molécula de captura do alvo") pode ser escolhida de acordo com a molécula alvo. Exemplos de molécula de captura do alvo incluem uma proteína, um anticorpo e um ácido nucleico. Preferivelmente, uma microesfera é ligada a centenas de milhares ou mais de moléculas de captura do alvo. Por exemplo, num caso em que a molécula de captura do alvo é um anticorpo, a molécula de captura do alvo tem uma constante de dissociação na ordem aproximada de nM. Entretanto, com a configuração acima mencionada, é possível induzir a reação entre as microesferas e as moléculas alvos com uma concentração suficientemente elevada de captura do alvo (por exemplo, num caso em que a concentração das microesferas é de 8 x 10° partículas/mL, a concentração das moléculas de captura do alvo é de aproximadamente 1 nM).
O método para selagem de microesferas de acordo com a presente modalidade inclui uma etapa de introdução das microesferas, uma etapa de desaeração e uma etapa de introdução do solvente hidrofóbico. Cada uma dessas etapas será descrita em detalhe adiante.
(Etapa de introdução de microesferas)
O que se segue descreve a etapa de introdução de microesferas com referência a (a) e (b) da Fig. 1.
A etapa de introdução de microesferas é uma etapa de introdução de um solvente 42 hidrofílico contendo as microesferas 41 e 41' em um espaço 30 entre a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20. 0 solvente 42 hidrofilico pode ser introduzido no espaço 30 entre a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20 ao longo de uma direção que está em paralelo com superficies da seção da camada inferior 10 e da seção da camada superior 20, as superficies da seção da camada inferior 10 e da seção da camada superior 20 defrontando-se entre si. Por exemplo, o solvente hidrofilico 42 pode ser introduzido no espaço 30 através de um orificio passante (não mostrado) fornecido em pelo menos uma da seção da camada superior 20 e da seção da camada inferior 10.
É preferivelmente usado como o solvente hidrofilico 42, por exemplo, pelo menos um selecionado do grupo que consiste em água, álcool hidrofilico, éter hidrofilico, cetona, solventes à base de nitrila, dimetilsulfóxido (DMSO) e N,N-dimetilformamida (DMF) ou uma mistura incluindo pelo menos um deles. Exemplos de álcool hidrofilico abrangem etanol, metanol, propanol e glicerina. Exemplos de éter hidrofilico abrangem tetrahidrofurano, óxido de polietileno e 1,4-dioxano. Exemplos de cetona abrangem acetona e metiletilcetona. Exemplos dos solventes à base de nitrila abrangem acetonitrila.
Além das microesferas 41 e 41', o solvente 42 hidrofilico pode ainda incluir, por exemplo, uma substância para detectar especificamente a molécula alvo capturada por qualquer uma das microesferas 41'. Tal fluorescente que libera um material fluorescente quando decomposto por determinada enzima ligada (i) à molécula alvo capturada por qualquer uma das microesferas 41' ou (ii) a uma molécula ligada especificamente à molécula alvo. Exemplos da molécula ligada especificamente à molécula alvo compreendem um anticorpo secundário e um ácido nucleico.Exemplos da determinada enzima compreendem íJ-galactosidase e peroxidase. Exemplos do substrato fluorescente compreendem fluoresceina-di-Bgalactopiranosida (FDG) e vermelho Amplex (Marca Registrada).
(Etapa de desaeração)
O que se segue descreve a etapa de desaeração com referência a (c) da Figura 1.
A etapa de desaeração é uma etapa de desaerar o espaço 30 entre a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20, que é realizada após a etapa de introdução das microesferas e antes da etapa de introdução do solvente hidrofóbico. Preferivelmente, a desaeração é realizada com o auxilio de, por exemplo, um método que permite uma pausa na matriz 1 sob pressão reduzida. Especificamente, a desaeração é realizada com o auxilio, por exemplo, de um método que permite que a matriz 1 paralise em um dessecador a vácuo de aproximadamente 0,1 atm (10,1325 kPa) durante cerca de 30 segundos.
A etapa de desaeração não é essencial para a presente invenção. Entretanto, a realização da etapa de desaeração remove o ar nos receptáculos 13, tornandoassim possivel introduzir de modo eficiente receptáculos 13 o solvente hidrofilico 42 contendo as microesferas 41 e 41'. Isto possibilita selar eficientemente as microesferas 41 e 41' nos receptáculos 13. Por conseguinte, é preferivel realizar a etapa de desaeraçâo.(Etapa de introdução do solvente hidrofóbico)O que se segue descreve a etapa de introdução do solvente hidrofóbico com referência a (d) e (e) da Figura 1.
A etapa de introdução do solvente hidrofóbico é uma etapa de introdução de um solvente hidrofóbico 43 no espaço 30 entre a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20. A etapa de introdução do solvente hidrofóbico é realizada após a etapa de introdução das microesferas e preferivelmente realizada após a etapa de desaeraçâo.
O solvente hidrofóbico 43 só precisa ser um solvente que é dificil de ser misturado com o solvente hidrofilico 42, que é usado na etapa de introdução das microesferas. É preferivelmente usado como o solvente hidrofóbico 43, por exemplo, pelo menos um selecionado do grupo que consiste em hidrocarboneto saturado, hidrocarboneto insaturado, hidrocarboneto aromático, óleo de silicone, perfluorocarbono, solventes à base de halogênios e liquido iônico hidrofóbico ou uma mistura incluindo pelo menos um deles. Exemplos de hidrocarboneto saturado compreendem alcano e cicloalcano.Exemplos de alcano compreendem decano e hexadecano.Exemplos de hidrocarboneto insaturado compreendem esqualeno. Exemplos de hidrocarboneto aromático compreendem benzeno e tolueno. Exemplos de perfluorocarbon© compreendem Fluorinert (Marca Registrada) FC40 (disponivel de SIGMA). Exemplos dos solventes à base de halogênios compreendem clorofórmio, cloreto de metileno e clorobenzeno. O liquido iônico hidrofóbico denota liquido iônico que não está dissociado pelo menos em água. Exemplos desses liquidos iônicos compreendem hexafluorofosfato de l-butil-3metilimidazólio. O liquido iônico denota um sal que está na forma de liquido em temperatura ambiente.
A realização da etapa de introdução do solvente hidrofóbico torna possivel formar de modo eficiente, nos respectivos receptáculos 13, goticulas (goticulas liquidas) cobertas com o solvente hidrofóbico 43. Além disso, a realização da etapa de introdução do solvente hidrofóbico torna possivel selar as microesferas 41 e 41' nas goticulas de modo que qualquer uma das microesferas 41 e 41' seja armazenada em cada uma das goticulas.
De acordo com a presente modalidade, as microesferas 41 e 41' são introduzidas através do espaço 30 entre a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20, portanto possibilitando selagem altamente eficiente de qualquer uma das microesferas em cada um de um grande número de receptáculos 13 que são fornecidos em uma grande área (p. ex., uma área de 1 cm2 ou maior).
A presente modalidade possibilita fornecer uma matriz para goticula da grande área incluindo um grande número de receptáculos. Por exemplo, mesmo com uma matriz que inclui um milhão ou mais de receptáculos, é possivel selar de modo eficiente as microesferas 41 e 41' nos receptáculos de modo que qualquer uma das microesferas 41 e 41' seja armazenada em cada um dos receptáculos. Assim, com a presente modalidade, é possivel detectar as moléculas alvos com elevada sensibilidade, desse modo possibilitando detectar as moléculas alvos em uma concentração muito baixa como aproximadamente 0,1 aM.
[Método para detecção da molécula alvo]
A seguir, é descrito o método para detecção da molécula alvo de acordo com a presente modalidade.
O método para detecção da molécula alvo de acordo com a presente modalidade inclui uma etapa de reação, uma etapa de selagem de microesferas e uma etapa de determinação.
A presente modalidade usa, como as microesferas, microesferas que capturam especificamente as moléculas alvos. Por exemplo, cada uma das microesferas pode ser aquela que foi ligada a uma molécula para capturar especificamente a molécula alvo. Adequadamente usadas como as microesferas, a molécula alvo e a molécula para capturar especificamente a molécula alvo podem ser qualquer uma daquelas exemplificadas nas descrições para o método de selagem de microesferas da presente modalidade.
A etapa de reação é uma etapa de reação das microesferas com as moléculas alvos. Por exemplo, a reação entre as microesferas e as moléculas alvos pode ser realizada por mistura de uma solução contendo as microesferas com uma solução contendo as moléculas alvos.
A etapa de selagem das microesferas é uma etapa de realização do método acima mencionado para selagem das microesferas mediante o uso das microesferas que reagiram com as moléculas alvos na etapa de reação. Ou seja, a etapa de selagem das microesferas é (i) uma etapa que inclui a etapa de introdução das microesferas e a etapa de introdução do solvente hidrofóbico ou (ii) uma etapa que inclui a etapa de introdução das microesferas, a etapa de desaeraçâo e a etapa de introdução do solvente hidrofóbico. Observe que as descrições da etapa de introdução das microesferas, da etapa de desaeraçâo e da etapa de introdução do solvente hidrofóbico são omitidas aqui, uma vez que tais etapas podem ser realizadas do mesmo modo que aquele descrito na seção "Método de selagem da microesfera".
A etapa de determinação é uma etapa de determinar, após a etapa de selagem de microesferas, sobre se cada um dos receptáculos 13 contém ou não qualquer uma das microesferas 41' com moléculas alvos capturadas.
Exemplos adequados do método de determinação sobre se cada um dos receptáculos 13 contém ou não qualquer uma das microesferas 41' com as moléculas alvos capturadas incluem reações de identificação molecular conhecidas tais como reação antigeno-anticorpo, reação de estreptavidina-biotina e ligação complementar de ácidos nucleicos. Por exemplo, esse método pode ser um método de detecção de um material fluorescente liberado de um substrato fluorescente quando decomposto por determinada enzima ligada (i) a uma molécula alvo ou (ii) a uma molécula ligada especificamente à molécula alvo. A detecção do material fluorescente é realizada com o auxilio, por exemplo, de um método de determinação de uma intensidade fluorescente de cada receptáculo pelo uso, por exemplo, de um microscópio fluorescente ou um sensor de imagem.
Na etapa de determinação, é preferível também determinar se cada um dos receptáculos 13 contém qualquer uma das microesferas 41 ou qualquer uma das microesferas 41'. A determinação sobre se cada um dos receptáculos 13 contém qualquer uma das microesferas 41 ou qualquer uma das microesferas 41' pode ser realizada mediante, por exemplo, observação microscópica para determinar a presença ou a ausência de qualquer uma das microesferas 41 ou qualquer uma das microesferas 41' em cada um dos receptáculos 13. Alternativamente, a determinação da presença ou da ausência de qualquer uma das microesferas 41 ou qualquer uma das microesferas 41' em cada um dos receptáculos 13 pode ser realizada por um método de detecção por dispersão luminosa das microesferas ou por um método de mensuração de um potencial elétrico com um transistor de efeito de campo (FET) .
Após a etapa de determinação, com base (i) no número de receptáculos 13 contendo as microesferas 41 ou as microesferas 41' e (ii) no número de receptáculos 13 contendo as microesferas 41' com as moléculas alvos capturadas, é possivel calcular uma proporção do número de microesferas que capturou as moléculas alvos em relação ao número total de microesferas. Dessa maneira, é possivel quantificar uma concentração das moléculas alvos.
De acordo com a presente modalidade, é possivel fornecer uma matriz de gota com grande área incluindo grande número de receptáculos; além disso, mesmo com uma matriz que inclui um milhão ou mais de receptáculos, é possivel selar de modo eficiente as microesferas 41 e 41' nos receptáculos. Assim, com a presente modalidade, é possivel detectar as moléculas alvos com elevada sensibilidade, portanto permitindo detectar as moléculas alvos em uma concentração tão baixa quanto aproximadamente 0,1 aM.
[Matriz]
A seguir, é descrita uma configuração da matriz 1 da presente modalidade com referência a (a) da Figura 1.A matriz 1 pode ser uma matriz usada no método para selar microesferas de acordo com a presente modalidade ou pode ser uma matriz usada no método para detectar a molécula alvo de acordo com a presente modalidade.
A matriz 1 inclui a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20.
A seção da camada inferior 10 inclui um membro semelhante a lâmina 11 e a parede lateral 12 com uma superficie superior hidrofóbica. A seção da camada inferior 10 inclui a pluralidade de receptáculos 13 que são separados entre si pela parede lateral 12.
Preferivelmente, o membro semelhante a lâmina 11 possui uma superficie hidrofilica. O termo "superficie hidrofilica" refere-se a uma superficie cuja afinidade por um solvente hidrofilico é maior que aquela com afinidade por um solvente hidrofóbico. O membro semelhante a lâmina 11 só precisa ser feito de um material sólido. Por exemplo, o membro semelhante a lâmina 11 pode ser feito de vidro, silicone ou uma resina de polimeros.
A parede lateral 12 é uma estrutura que é fornecida sobre uma superficie do membro semelhante a lâmina 11, preferivelmente sobre a superficie hidrofilica do membro semelhante a lâmina 11 e é configurada para separar a pluralidade de receptáculos 13 entre si. A parede lateral 12 possui uma superficie superior hidrofóbica. O termo "hidrofóbico" aqui é usado como sinônimo para "lipofilico"e denota uma natureza cuja afinidade por um solvente hidrofóbico é maior do que aquela com afinidade por um solvente hidrofilico.
Observe que a parede lateral 12 precisa ser configurada de modo que sua superficie superior, isto é, sua superficie que se defronta com a seção da camada superior 20, é hidrofóbica. Ao passo que uma superficie lateral da parede lateral 12, isto é, uma parede interna de cada um dos receptáculos 13, pode ser hidrofóbica ou hidrofilica.
Por exemplo, a parede lateral 12 pode ser feita de uma estrutura hidrofilica e uma camada hidrofóbica que é formada sobre uma superficie superior da estrutura hidrofilica.A estrutura hidrofilica pode ser feita de, por exemplo, vidro, silicone ou uma resina de polimeros. A camada hidrofóbica pode ser feita de, por exemplo, uma resina repelente de água ou uma resina de polimeros de fluorocarbono. Exemplos da resina de polímeros de fluorocarbono compreendem resina de fluorocarbono amorfa. A resina de fluorocarbono amorfa é preferivelmente usada, porque a resina de fluorocarbono amorfa é dotada de alta propriedade hidrofóbica e baixa toxicidade para uma amostra biológica.
Exemplos preferíveis da resina de fluorocarbono amorfa compreendem pelo menos um item selecionado de CYTOP (Marca Registrada), TEFLON (Marca Registrada) AF2400 e TEFLON (Marca Registrada) AF1600. Dentre eles, CYTOP (Marca Registrada) é mais preferível, uma vez que é fácil de ser microfabricado.
Alternativamente, a parede lateral 12 pode ser feita de um material hidrofóbico.Por exemplo, a parede lateral 12 pode ser feita de uma resina de polímeros de fluorocarbono ou de uma resina de polímeros de paraxileno.Exemplos da resina de polímeros de fluorocarbono compreendem uma resina de fluorocarbon© amorfa. É preferivelmente usada como a resina de fluorocarbono amorfa qualquer uma das exemplificadas acima.
A parede lateral 12 só precisa ter uma configuração tal que a pluralidade de receptáculos 13 é fornecida sobre o membro semelhante a lâmina 11. Por exemplo, a parede lateral 12 pode ser uma estrutura semelhante a lâmina cujas partes que correspondem aos receptáculos 13 são orifícios.
Uma altura (isto é, uma espessura em uma direção vertical) da parede lateral 12 medida da superfície do membro semelhante a lâmina 11 somente precisa ser projetada de modo que uma das microesferas 41 e 41' contidas em um dos receptáculos 13 não seria descarregada dai durante a última etapa descrita de introdução do solvente hidrofóbico. Por exemplo, a altura da parede lateral 12 pode ser projetada de modo que a maior parte de, preferivelmente toda a parte de, uma das microesferas 41 e 41' contidas em um dos receptáculos 13 seja posicionada mais baixa que a superficie superior da parede lateral 12.
Para armazenar eficientemente as microesfera 41 e 41' nos receptáculos 13, a altura da parede lateral 12 é preferivelmente igual ou superior ao diâmetro médio de particula das microesferas 41 e 41'. Além disso, para que somente uma das microesferas 41 e 41' seja armazenada em um dos receptáculos 13, a altura da parede lateral 12 é preferivelmente igual a ou menor que 1,5 vezes o diâmetro médio de particula das microesferas 41 e 41' .
Cada um da pluralidade de receptáculos 13 é um recesso capaz de armazenar somente uma das microesferas 41 e 41', e os receptáculos 13, em sua pluralidade, são separados entre si pela parede lateral 12. Cada um dos receptáculos 13 possui uma superficie inferior que é uma parte da superficie do membro semelhante a lâmina 11, e a superficie inferior é hidrofilica.
Os receptáculos 13 podem ter qualquer forma ou tamanho, contanto que a forma ou o tamanho permita que cada um dos receptáculos 13 armazene somente uma das microesferas 41 e 41' nele. Uma região circundada pela superficie inferior e pela superficie lateral de cada um dos receptáculos 13 pode ter a forma de, por exemplo, um cilindro circular ou uma coluna retangular.
A largura "A" de cada um dos receptáculos 13 em uma direção horizontal (p. ex., num caso em que uma seção transversal de cada receptáculo 13 quando vista na direção horizontal tem a forma de um circulo, a largura ”A" é um diâmetro do circulo; num caso em que a seção transversal de cada receptáculo 13 quando vista na direção horizontal tem a forma de um quadrado, a largura "A" é um comprimento de um lado do quadrado) somente precisa ser maior que o diâmetro médio de particula das microesferas 41 e 41' . Preferivelmente, a largura "A" é 1,5 a 2 vezes maior que o diâmetro médio de particula das microesferas 41 e 41', por exemplo. Na presente modalidade, cada um dos receptáculos 13 tem uma profundidade igual à altura da parede lateral 12. Para armazenar eficientemente as microesferas nos receptáculos, a profundidade de cada um dos receptáculos da presente invenção é preferivelmente igual ou superior ao diâmetro médio de particula das microesferas. Além disso, para que apenas uma das microesferas seja armazenada em um dos receptáculos, a profundidade de cada um dos receptáculos da presente invenção é preferivelmente igual a ou menor que 1,5 vezes o diâmetro médio de particula das microesferas.
De acordo com a presente modalidade, cada um dos receptáculos 13 tem uma superficie inferior hidrofilica e a parede lateral 12 tem a superficie superior hidrofóbica. Isto torna possivel introduzir de modo eficiente o solvente hidrofilico 42 contendo asmicroesferas 41 e 41' nos receptáculos 13 na última etapa descrita de introdução das microesferas e impedir que o solvente hidrofóbico 43 entre nos receptáculos 13 na última etapa descrita de introdução do solvente hidrofóbico. Com isto, os receptáculos 13 que armazenam as goticulas de liquido contendo as microesferas 41 e 41' podem ser hermeticamente selados com o solvente hidrofóbico de maneira eficiente.
A seção da camada superior 20 inclui um membro semelhante a lâmina 21 e uma camada hidrofóbica 22. A camada hidrofóbica 22 é fornecida sobre a superficie do membro semelhante a lâmina 21 cuja superficie se defronta com a seção da camada inferior 10. O membro semelhante a lâmina 21 é feito de, por exemplo, vidro, silicone ou uma resina de polimero. A camada hidrofóbica 22 é feita de, por exemplo, uma resina repelente de água ou uma resina de polimeros de fluorocarbono.Exemplos da resina de polimeros de fluorocarbono incluem resina de fluorocarbono amorfa.
A seção da camada superior 20 defronta-se, por meio do espaço 30, com a superficie da seção da camada inferior 10 sobre a qual a superficie dos receptáculos 13 é fornecida. Ou seja, o espaço 30 existe entre a parede lateral 12 e a camada hidrofóbica 22. O espaço 30 serve como uma via de fluxo. Desse modo, a matriz 1 é configurada para ter uma estrutura celular de fluxo.
O espaço 30 pode ser usado como a via de fluxo para permitir que um fluido escoe entre a seção da camada inferior 10 e a seção da camada superior 20 em direção paralela com as superficies da seção da camada inferior 10 e da seção da camada superior 20, as superficies da seção da camada inferior 10 e da seção da camada superior 20 defrontando-se entre si.
Uma distância entre (i) a superficie superior da parede lateral 12 e (ii) a camada hidrofóbica 22 do membro semelhante a lâmina 21, isto é, uma largura do espaço 30 na direção vertical, somente precisa se maior que o diâmetro médio de particula das microesferas 41 e 41' e é preferivelmente de 10 pm a 150 pm.
A seção da camada inferior 10 ou a seção da camada superior 20 pode ser fornecida com o orificio passante (não mostrado) através do qual o fluido é introduzido no espaço 30. Por exemplo, a seção da camada inferior 10 pode ter uma região fornecida com os receptáculos 13 e uma região fornecida sem receptáculos 13. Além disso, a seção da camada inferior 10 pode ter o orificio passante na região fornecida sem receptáculos 13; alternativamente, a seção da camada superior 20 pode ter o orificio passante em uma região que se defronta com a região da seção da camada inferior 10 fornecida sem receptáculos 13.
De acordo com a presente modalidade, um lado superior do espaço 30 corresponde à superficie da camada hidrofóbica 22 e um lado inferior do espaço 30 corresponde à superficie superior da parede lateral 12 e dos receptáculos 13. Assim, à exceção de partes do espaço 30 que correspondem às superficies inferiores dos receptáculos 13, todo o espaço 30 é dotado de uma propriedade hidrofóbica. Essa configuração torna possivel introduzir de modo eficiente o solvente hidrofilico 42 contendo as microesferas 41 e 41' nos receptáculos 13 na última etapa descrita de introdução das microesferas. Além disso, essa configuração impede que o solvente hidrofóbico 43 penetre nos receptáculos 13 na última etapa descrita de introdução do solvente hidrofóbico. Desse modo, por introdução do solvente hidrofóbico 43 no espaço 30, é possivel formar eficientemente, em cada um dos receptáculos 13, uma goticula em que qualquer uma das microesferas 41 e 41' é introduzida.
A matriz 1 da presente modalidade pode ser, por exemplo, uma matriz que inclui um milhão ou mais de receptáculos. Mesmo com a matriz tendo essa grande área, o uso do método para selagem de microesferas da presente modalidade ou do método para detecção da molécula alvo da presente modalidade torna possivel selar de modo eficiente as microesferas nos receptáculos de modo que qualquer uma das microesferas seja armazenada em cada um dos receptáculos. Portanto, de acordo com a presente modalidade, é possivel detectar as moléculas alvos com elevada sensibilidade, por conseguinte possibilitando fornecer uma matriz que permite detecção de moléculas alvos em concentração tão baixa quanto 0,1 aM.
A seguir, é descrita uma configuração de um kit da presente modalidade.
O kit da presente modalidade inclui pelo menos a matriz 1 e as microesferas 41. É preferivelmente usada como a matriz 1 a matriz 1 que possui a configuração acima descrita. Cada um dos receptáculos 13 na matriz 1 é configurado para ser capaz de armazenar somente uma das microesferas 41 incluidas nesse kit.
Cada uma das microesferas 41 incluidas nesse kit pode ser aquela que captura especificamente a molécula alvo.Por exemplo, cada uma das microesferas 41 incluidas nesse kit pode ser aquela que foi ligada a uma molécula para ligação especifica à molécula alvo. Pode ser adequadamente usada como a molécula alvo e a molécula para se ligar especificamente à molécula alvo qualquer uma daquelas mencionadas anteriormente.
Esse kit pode ainda incluir uma substância para detectar de modo especifico a molécula alvo. Pode ser preferivelmente usada como a substância para detectar de modo especifico a molécula alvo qualquer uma das mencionadas anteriormente. Além disso, o kit pode ainda incluir, por exemplo, um solvente solúvel em água e/ou um solvente hidrofóbico.
[Dispositivo de detecção da molécula alvo]
A seguir, é descrito um dispositivo de detecção de uma molécula alvo 50 da presente modalidade com referência à Figura 2.A Figura 2 é uma ilustração esquemática de uma modalidade de um dispositivo de detecção de uma molécula alvo de acordo com a presente invenção.
O dispositivo de detecção da molécula alvo 50 da presente modalidade inclui a matriz 1, um sensor de imagem 51 e uma fonte de luz 52. Preferivelmente, pode ser usada como a matriz 1 aquela com a configuração descrita acima, e, portanto, explicações da matriz 1 são omitidas aqui.
O sensor de imagem 51 é um sensor para detecção de luz emitida por cada um dos receptáculos 13 quando as microesferas que capturaram as moléculas alvos são armazenadas nos receptáculos 13. Por exemplo, o sensor de imagem 51 pode ser um sensor para detecção de fluorescência emitida por um substrato fluorescente quando decomposto por determinada enzima ligada (i) à molécula alvo ou (ii) a uma molécula ligada especificamente à molécula alvo. Pode ser usado adequadamente como o sensor de imagem 51, por exemplo, um sensor de imagem CMOS.
A fonte de luz 52 é uma fonte de lua destinada a emissão de luz para a matriz 1. Na Figura 2, a fonte de luz 52 é fornecida sobre a matriz 1. Entretanto, a presente invenção não é particularmente limitada a isto. Alternativamente, a fonte de luz 52 pode ser aquela que emite luz para a face lateral da matriz 1, por exemplo.
Entre a matriz 1 e o sensor de imagem 51, pode-se fornecer um filtro de interferência e/ou uma matriz-guia luminosa, por exemplo. Além disso, entre a fonte de luz 52 e a matriz 1, um filtro de excitação pode ser fornecido, por exemplo.
De acordo com a presente modalidade, a matriz 1 e o sensor de imagem 51 são diretamente conectados entre si. Isto torna possivel determinar facilmente, sem uso de outro dispositivo como um microscópio, se qualquer uma das microesferas que capturou as moléculas alvos está ou não armazenada em cada um dos receptáculos 13. Isto possibilita determinar facilmente e rapidamente se alvos está ou não armazenada em cada um dos receptáculos 13 e fornecer o dispositivo de detecção da molécula alvo a um preço acessivel.
O presente pedido compreende as invenções a seguir.
Um método de selagem de microesferas da presente invenção inclui: (i) uma etapa de introdução de um solvente hidrofilico contendo microesferas em um espaço entre (a) uma seção da camada inferior incluindo uma pluralidade de receptáculos cada um dos quais é capaz de armazenar apenas uma das microesferas e que são separados entre si por uma parede lateral com uma superficie superior hidrofóbica e (b) uma seção da parede superior que se defronta com uma superficie da seção da camada inferior sobre cuja superficie a pluralidade de receptáculos é fornecida; e (ii) uma etapa de introdução de um solvente hidrofóbico no espaço, sendo a etapa (ii) realizada após a etapa (i).
Preferivelmente, o método para selagem de microesferas da presente invenção inclui ainda (iii) uma etapa de desaeraçâo do espaço, sendo a etapa (iii) realizada após a etapa (i) e antes da etapa (ii).
Preferivelmente, de acordo com o método para selagem de microesferas da presente invenção, o solvente hidrofilico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em água, álcool hidrofilico, éter hidrofilico, cetona, solventes de nitrila, dimetilsulfóxido e N,Ndimetilformamida ou é uma mistura que inclui aquele referido como pelo menos um.
Preferivelmente, de acordo com o método para hidrofóbico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em hidrocarboneto saturado, hidrocarboneto insaturado, hidrocarboneto aromático, óleo de silicone, perfluorocarbono, solventes à base de halogênio e liquido iônico hidrofóbico ou é uma mistura que inclui aquele referido como pelo menos um.
Para se conseguir o objetivo precedente, um método para detecção de uma molécula alvo da presente invenção inclui: (i) uma etapa de reação das microesferas que capturam especificamente moléculas alvos com as moléculas alvos; (ii) uma etapa de realização, mediante o uso das microesferas, de qualquer um dos métodos acima mencionados para selagem de microesferas, sendo a etapa (ii) realizada após a etapa (i); e (iii) uma etapa de determinação sobre se qualquer uma das microesferas que capturou as moléculas alvos está ou não armazenada em cada um da pluralidade de receptáculos, sendo a etapa (iii) realizada após a etapa (ii).
Preferivelmente, de acordo com o método para detecção de uma molécula alvo da presente invenção, as microesferas são aquelas microesferas às quais estão ligadas moléculas especificamente aglutináveis com as moléculas alvos.
Uma matriz da presente invenção inclui: uma seção da camada inferior fornecida com uma pluralidade de receptáculos separados entre si por uma parede lateral que possui uma superficie superior hidrofóbica; e uma seção da camada superior que se defronta, por meio de um espaço, com uma superficie da seção da camada inferior sobre cuja superficie a pluralidade de receptáculos é fornecida.
Preferivelmente, de acordo com a matriz da presente invenção, cada um da pluralidade de receptáculos possui uma superficie inferior hidrofilica.
Preferivelmente, de acordo com a matriz da presente invenção, a seção da camada superior possui uma superficie hidrofóbica que se defronta com a seção da camada inferior.
Preferivelmente, de acordo com a matriz da presente invenção, com relação à seção da camada superior e à seção da camada inferior, pelo menos uma delas possui um orificio passante através do qual um fluido é introduzido no espaço.
Para se conseguir o objetivo precedente, um kit da presente invenção inclui: qualquer uma das matrizes acima mencionadas; cada um da pluralidade de receptáculos com capacidade de armazenar qualquer uma das microesferas.
Para se conseguir o objetivo precedente, o dispositivo de detecção de uma molécula alvo da presente invenção inclui: qualquer uma das matrizes acima mencionadas; e um sensor de imagem para detectar luz que é emitida de cada um da pluralidade de receptáculos num caso em que microesferas que capturaram moléculas alvos são armazenadas na pluralidade de receptáculos.
A presente invenção não é limitada à descrição das modalidades acima, mas pode ser alterada por pessoas especializadas dentro do escopo das reivindicações. As modalidades da presente invenção são descritas em mais detalhes com o auxílio dos Exemplos a seguir. Desnecessário dizer, a presente invenção não se limita a tais Exemplos. Por estar a invenção assim descrita, será evidente que ela poderá sofrer variações de diversas maneiras.
A seguir, são descritos materiais e métodos que foram usados nos Exemplos.
(Materiais)
Nos Exemplos, foi usada como molécula alvo estreptavidina (adquirida de SIGMA) marcada com figalactosidase (daqui em diante, também referida simplesmente como "estreptavidina"). Além disso, na condição das microesferas, foram usadas microesferas biotiniladas preparadas por biotinilação de microesferas ligadas a grupo amino com um diâmetro médio de partícula de 3 pm (material: poliestireno; micromer-NH2-3pm; adquirido de Micromod).
(Preparação de microesferas biotiniladas)
Pelo método a seguir, grupos amino de microesferas ligadas a grupo amino foram submetidos a reação com NHSPE04-Biotin, de modo que as microesferas ligadas a grupo amino foram biotiniladas.
Primeiramente, 750 pL de tampão A (100 mM de tampão de ácido fosfórico, pH 8.0) foram adicionados a 250 pL de microesferas ligadas a grupo amino.
Em seguida, o resultante foi submetido a centrifugação a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos, de modo que as microesferas ligadas a grupo amino foram reunidas e coletadas. Então, as microesferas ligadas a grupo amino foram suspensas em 500 pL de tampão A (suspensão A) . Depois disso, 50 JJLde NHS-PEO4-Biotin (2 pg/50 pL de DMSO) foram adicionados à suspensão A, e então as microesferas ligadas a grupo amino e NHS-PEO4-Biotin foram submetidas a reação sob agitação suave a 25°C por pelo menos 3 horas (o tubo foi submetido a rotação do tipo extremo a extremo para mistura).
Então, microesferas biotiniladas assim obtidas foram lavadas. A mistura foi submetida a centrifugação a 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos, de modo que as microesferas biotiniladas foram reunidas e coletadas. Em seguida, uma fase aquosa foi removida por uma pipeta Pipetman. Ao precipitado resultante das microesferas biotiniladas, 1 mL de tampão A foi adicionado de modo que o precipitado das microesferas biotiniladas foi suspenso. Esse processo foi repetido seis vezes, e então NHS-PEO4-Biotin que não reagiu foi removido. A seguir, o resultante foi suspenso em 500 pL de tampão A (suspensão B). A suspensão B foi preservada a 4°C.
Subsequentemente, a concentração das microesferas biotiniladas na suspensão B foi mensurada. O número de microesferas biotiniladas em determinado volume foi contado pelo uso de um hemacitômetro, sendo encontrada a concentração das microesferas biotiniladas (aproximadamente 3,0 x 108 microesferas/mL) . Para que o número de microesferas biotiniladas fosse facilmente contado, a contagem foi realizada depois que a suspensão B foi diluida pelo tampão A por aproximadamente 5 vezes, por exemplo.
Pelo método acima mencionado, as microesferas biotiniladas foram obtidas.
(Captura de estreptavidina)
Então, pelo método a seguir, estreptavidina foi capturada por emprego das microesferas biotiniladas.
Primeiramente, as microesferas biotiniladas foram diluidas (8 x 106 microesferas/500 pL). A seguir, estreptavidina marcada com B-galactosidase foi diluida pelo tampão B (100 mM de tampão de ácido fosfórico, pH 8.0, contendo 0,1% de TWEEN20 [detergente]) de modo que uma concentração de estreptavidina se tornou maior que uma concentração alvo (quantidade total: 500 pL) .
Em seguida, 500 pL das microesferas biotiniladas e 500 pL de estreptavidina assim diluida foram misturados juntos em um tubo (quantidade total: 1 mL) . O tubo foi agitado verticalmente de maneira suave, e a reação entre as microesferas biotiniladas e a estreptavidina foi realizada a 25°C por 30 minutos.
A seguir, o resultante foi submetido a centrifugação 10.000 rpm a 4°C por 10 minutos, e as microesferas após a reação (um mistura de [i] complexos de estreptavidina e as microesferas biotiniladas e [ii] microesferas biotiniladas que não reagiram) foram reunidas e coletadas. Então, uma fase aquosa foi removida por uma pipeta Pipetman. Ao precipitado de microesferas resultante, 1 mL de tampão A foi adicionado e suspenso. Esse processo foi repetido quatro vezes para lavagem, e as moléculas alvos que não reagiram foram removidas.
Em seguida, ao precipitado das microesferas após a lavagem, 15 pL de tampão C (100 mM de tampão de ácido fosfórico, pH 7.5, 1 mM de MgC12) foram adicionados para suspensão. Uma concentração final das microesferas foi aproximadamente 6,5 x 106 microesferas/15 pL de tampão C) .
(Produção da matriz)
Pelo método a seguir, uma matriz contendo a mesma estrutura celular de fluxo que a da matriz 1 mostrada em (a) a (e) da Figura 1 foi produzida.Nas descrições que se seguem, membros com as mesmas funções daquelas da matriz 1 são fornecidos com os mesmos sinais de referência.
Primeiramente, um vidro com padrão hidrofilicohidrofóbico (seção da camada inferior 10) e um vidro lateral superior (seção da camada superior 20) (altura: 24 mm x largura: 26 mm x profundidade: 5 mm, SÍO2, com um orificio passante cujo diâmetro é de 1 mm) foram produzidos.
(Preparação do vidro com padrão hidrofilicohidrofóbico)
Com referência à Figura 7, é descrito a seguir um método especifico para preparação do vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico. A Figura 7 é uma vista para explicação de um método de preparação de um vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico de acordo com um exemplo da presente invenção.
De acordo com a presente modalidade, fotolitografia e gravura a seco foram realizadas de modo que um padrão hidrofilico-hidrofóbico foi formado no vidro. Para formar o padrão hidrofilico-hidrofóbico, três etapas incluindo uma etapa de aplicação de CYTOP (Marca
Registrada), uma etapa de fotolitografia e uma etapa de gravura e remoção do revestimento foram realizadas.
Na etapa de aplicação de CYTOP (Marca Registrada), CYTOP (Marca Registrada) CTL-809 (nome do produto; disponivel de ASAHI GLASS) foi primeiramente aplicado ao vidro de 24 mm (altura) x 32 mm (largura) (nome do produto: NEO MICRO COVER GLASS Thickness No. 1; disponivel de MATSUNAMI) (membro 11 semelhante a lâmina), de modo que uma camada de resina hidrofóbica 61 foi formada.
Em seguida, na etapa de fotolitografia, um fotorrevestimento positivo 62 (nome do produto: AZ-4903; disponivel de AZ Eletronic Materials USA) foi aplicado à camada de resina hidrofóbica 61. Então, por meio de uma fotomáscara 63 com um padrão desejado, o resultante foi exposto a UV emitida de cima, de maneira que um processo de desenvolvimento alcalino foi realizado. Como resultado do processo de desenvolvimento, o fotorrevestimento 62 foi dissolvido apenas nas partes irradiadas com UV, de modo que frações da camada de resina hidrofóbica 61 cujas partes se defrontam com as partes do fotorrevestimento 62 irradiadas com UV foram expostas.
Após isto, na etapa de gravura e remoção do revestimento, o vidro foi gravado por plasma de O2 por meio de um fotorrevestimento 62' parcialmente dissolvido, e desse modo frações da camada de resina 61 foram removidas. Como resultado, uma parede lateral hidrofóbica 12 foi obtida. Finalmente, o fotorrevestimento 62' foi dissolvido por um solvente orgânico. Assim, o padrão hidrofilico-hidrofóbico foi obtido.
Procedimentos detalhados adicionais para o processo acima são descritos adiante. Os números de referência (1) a (23) na Figura 7 correspondem a (1) a (23) abaixo, respectivamente.
Etapa de aplicação de CYTOP (Marca Registrada) (isto é, preparação de camada de CYTOP [Marca Registrada] com espessura do filme de aproximadamente 3,3 pun a 3,5 pm pelos seguintes procedimentos)
(1) Primeiramente, o vidro (membro 11 semelhante a lâmina) foi lavado e CYTOP (Marca Registrada) CTL-809 foi aplicado ao vidro.
(2) Em seguida, o vidro foi imerso em 10 N de KOH por uma noite.
(3) O vidro de revestimento que foi imerso em KOH foi lavado com água desionizada dez ou mais vezes.
(4) O vidro foi seco com uma lâmina quente a 180°C.
(5) O vidro assim secado foi resfriado emtemperatura ambiente.
(6) Aproximadamente 70 pL de CYTOP (MarcaRegistrada) CTL-809 foram vertidos sobre o vidro.
(7) Revestimento por rotação foi realizado de acordo com o seguinte programa A:
[Programa A]
Inclinação: 5 segundos 500 rpm: 10 segundos Inclinação: 5 segundos 2.000 rpm: 30 segundos Inclinação: 5 segundos Fim
(8) O vidro foi seco em uma lâmina quente a 180°C por uma hora.
Mediante repetição dos procedimentos (6) a (8) por quatro vezes, uma camada de resina hidrofóbica 61 com uma profundidade de 3,3 pm a 3,5 pm foi obtida.
Etapa de fotolitografia
Em seguida, foi realizada fotolitografia.
(9) Sobre a camada de resina 61 preparada pela etapa de aplicação de CYTOP (Marca Registrada), um fotorrevestimento positivo 62 (AZ-4903) foi vertido em uma quantidade tal que o fotorrevestimento positivo 62 se disseminou sobre o vidro de modo que se obteve um diâmetro de aproximadamente 8 mm.
(10) Revestimento por rotação foi realizado de acordo com o seguinte programa B:
[Programa B]
Inclinação: 5 segundos 500 rpm: 10 segundos Inclinação: 5 segundos 4.000 rpm: 60 segundos Inclinação: 5 segundos Fim
(11) 0 fotorrevestimento que permaneceu na borda do vidro foi removido por um pedaço de gaze umedecida com EtOH a 100%.
(12) O vidro foi seco a 55°C por 3 minutos.
(13) 0 vidro foi seco a 110°C por 5 minutos.
(14) Uma fotomáscara 63 foi lavada com acetona, e então a fotomáscara 63 foi fixada em um alinhador de máscara (disponivel de SAN-EI ELECTORIC).
(15) 0 vidro a que se aplicou o f otorrevest imento foi fixado em uma mesa de amostra do alinhador de máscara, e a mesa de amostra foi erguida, de modo que o vidro e a fotomáscara 63 foram colocados em contato entre si.
(16) O vidro então colocado em contato com a fotomáscara 63 foi irradiado com UV por 35 segundos (potência: 256).
(17) O vidro foi imerso em AZ Developer (disponivel de AZ Eletronic Materials USA) por 5 minutos ou mais para desenvolvimento.
(18) O vidro foi enxaguado com MilliQ (água destilada) por aproximadamente 10 minutos.
<Etapa de gravura e remoção do revestimento>
Subsequentemente, gravura e remoção do revestimento foram realizadas.
(19) O vidro foi submetido a gravura com plasma de O2 mediante utilização de RIE-10NR (disponivel de Samco) sob determinadas condições do processo (O2: 50 sccm, pressão: 10 Pa, potência: 50 W, tempo: 30 min.).
(20) O vidro que foi submetido à gravura foi imerso em acetona e então o vidro foi submetido a ultrassom por 15 minutos.
(21) A acetona foi substituída por uma nova, e então o vidro foi submetido a ultrassom por 15 minutos.
(22) O vidro foi submetido a ultrassom em EtOH por 15 minutos.
(23) O vidro foi lavado com MilliQ (água destilada) .
No método acima descrito, grande quantidade de alvéolos (receptáculos 13) foi formada sobre o vidro. Uma região circundada pela superficie inferior e pela superficie lateral de cada um dos alvéolos foi formada em um cilindro circular. Uma seção transversal de cada alvéolo na direção horizontal foi formada em um circulo com um diâmetro de 5 pm. A altura da parede lateral, pela qual os alvéolos foram posicionados, foi de aproximadamente 3,3 pm a 3,5 pm. Além disso, uma distância "B", por meio da qual dois alvéolos adjacentes foram separados um do outro, foi de 5 pm.
(Preparação do vidro da face superior)
No método a seguir, um vidro da face superior foi preparado. Para preparar o vidro da face superior, o vidro usado tinha espessura de 5 mm e um orificio passante com diâmetro de 1 mm. Um lado desse vidro foi coberto com aproximadamente 70 pL de CYTOP (Marca Registrada) CTL-809 (nome do produto; disponivel de ASAHI GLASS). Então, revestimento com rotação foi realizado de acordo com o seguinte programa C:
[Programa C] Inclinação: 5 segundos 500 rpm: 10 segundos Inclinação: 5 segundos 2.000 rpm: 30 segundos Inclinação: 5 segundosFim
Depois disso, o vidro foi seco em uma lâmina quente a 180°C por uma hora.
No método descrito acima, um vidro da face superior possuindo um lado fornecido com uma camada hidrofóbica de uma espessura de 1 pm foi preparado.
(Ligação do vidro com padrão hidrofilicohidrofóbico com o vidro da face superior)
Em seguida, lubrificante de alto vácuo (disponivel de Dow CORNING TORAY) foi aplicado a uma porção de papel de suporte de Parafilm (disponivel de Peckiney Plastic Packaging), e então a porção do papel de suporte de Parafilm foi fixada a uma parte do vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico, permanecendo a parte sobre um lado em que o padrão hidrofilico-hidrofóbico foi formado e a parte sem o padrão hidrofilico-hidrofóbico. O vidro da face superior foi ligado ao lado do vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico sobre cujo lado o padrão hidrofilico-hidrofóbico foi formado, de maneira que o lado revestido com agente de revestimento do vidro da face superior se defrontou com o vidro de padrão hidrof ilico-hidrofóbico.
Consequentemente, um espaço foi feito entre o vidro de padrão hidrofilico-hidrofóbico e o vidro da face superior. A largura desse espaço na direção vertical, isto é, uma distância entre (i) a superficie superior da parede lateral do vidro de padrão hidrofilicohidrofóbico e (ii) o vidro da face superior, foi de aproximadamente 150 pm.
(Selagem de microesferas em goticulas)
Subsequentemente, no método a seguir, as microesferas que reagiram com estreptavidina foram seladas em goticulas.
Primeiramente, 50 mM de fluoresceina-di-fògalactopiranosida (FDG) (disponivel de Marker Gene Technology)/DMSO foram diluidos em tampão de FDG (100 mM de tampão de KPi [pH =7.5], 1 mM de MgCl2, 4 pL/mL de 2mercaptoetanol) , de modo que solução de 4 mM de FDG foi preparada. Então, 15 pL das microesferas (6,5 x 106 microesf eras/15 pL de tampão C) e 15 pL de solução de FDG foram misturados juntos, e uma solução de microesferas foi preparada.
Em seguida, 30 pL da solução de microesferas foram carregados na via de fluxo por uma extremidade amarela através do orificio passante do vidro da face superior [ver (a) e (b) da Figura 1].
Então, para remover o ar dos alvéolos, foi realizada desaeração por um minuto [ver (c) da Figura 1]. A desaeração foi realizada de maneira que se permitiu uma pausa da matriz em um dessecador por vácuo de aproximadamente 0,1 atm (10,1325 kPa) durante cerca de 30 segundos. Em seguida, a matriz foi deixada em repouso por aproximadamente 5 minutos, de modo que as microesferas foram precipitadas na parte inferior dos alvéolos.
Depois disso, 200 pL a 1.000 pL de Fluorinert (Marca Registrada) FC40 (disponivel de SIGMA) foram carregados na via de fluxo através do orificio passante do vidro da face superior [ver (d) e (e) da Figura 1].
Como resultado, uma fase aquosa foi confinada somente nos alvéolos, e goticulas foram formadas.Assim, as microesferas foram seladas nas goticulas.
[Exemplo 1]
Pelo método descrito acima, microesferas biotiniladas e 1 fM de estreptavidina foram submetidos a reação entre si, e então o resultante foi introduzido em uma matriz juntamente com FDG, de modo que as microesferas foram seladas em goticulas, respectivamente. A matriz usada no Exemplo 1 foi uma matriz de 1,0 cm x 1,0 cm compreendendo um total de 1097600 receptáculos, especificamente, incluindo uma matriz de 20 x 20 (horizontalmente e verticalmente) de submatrizes cada uma (i) com um tamanho de 512 pm x 512 pm e (ii) incluindo 2744 receptáculos. Essa matriz foi observada com um microscópio de fluorescência (1X71 [disponivel de OLYMPUS]).
A Figura 3 mostra uma imagem de fluorescência da matriz em que as microesferas foram seladas em um exemplo da presente invenção. 0 que é mostrado na Figura 3 é uma submatriz. Conforme mostrado na Figura 3, alguns pontos brilhantes foram observados na imagem de fluorescência (138 pontos brilhantes em um campo). Esses pontos brilhantes indicam posições dos receptáculos em que microesferas biotiniladas contendo estreptavidina capturada foram seladas. Isto mostra que o uso do método da presente invenção torna possivel detectar adequadamente 1 fM de estreptavidina.
[Exemplo Comparativo 1]
Em um exemplo comparativo da presente invenção, moléculas alvos foram detectadas por um método convencional de determinação de volume.
12,5 fM de estreptavidina, que é uma concentração 12,5 vezes mais elevada do que a (1 fM) do Exemplo 1, foram misturados com FDG, e o resultante foi mensurado por fluorescência com o auxilio de um espectrofotômetro de fluorescência. Além disso, um experimento controle foi realizado da mesma maneira pela utilização de 6,3 pM de estreptavidina, que é uma concentração 500 vezes mais elevada do que a deste exemplo comparativo.
A Figura 4 mostra resultados do exemplo comparativo e do experimento controle. A Figura 4 é um gráfico mostrando intensidades de fluorescência observadas quando moléculas alvos foram detectadas pelo método convencional. Na Figura 4, uma linha "a" do gráfico mostra um resultado do caso envolvendo o uso de 12,5 fM de estreptavidina, ao passo que uma linha "b" do gráfico mostra um resultado do caso envolvendo o uso de 6,3 pM de estreptavidina.
Conforme mostrado na Figura 4, no caso em que se utilizou o método convencional, foi impossivel detectar 12,5 fM de estreptavidina. Isto mostra que a concentração de 12,5 fM é menor que um limite de detecção do método convencional.
[Exemplo 2]
Em seguida, microesferas biotiniladas foram submetidas a reação com estreptavidina de cinco diferentes concent rações (1 fM, 100 aM, 10 aM, 1 aM e 0,1 aM) e então foram introduzidas em matrizes juntamente com FDG, de modo que as microesferas foram seladas em goticulas, respectivamente. Cada uma das matrizes usadas no Exemplo 2 tinha a mesma configuração daquelas usadas no Exemplo 1.Cada uma dessas matrizes foi observada em uma imagem de campo brilhante e em uma imagem de fluorescência por um microscópio.
(Resultados da detecção)
(a) a (f) da Figura 5 mostram imagens microscópicas das matrizes em que as microesferas foram seladas em outro exemplo da presente invenção. Note que cada um de (a), (c) e (e) da Figura 5 mostra uma imagem de campo brilhante de uma respectiva de submatrizes, ao passo que cada um de (b) , (d) e (f) da Figura 5 mostra uma imagem de fluorescência de uma respectiva das submatrizes mostradas em (a), (c) e (e) da Figura 5. Além disso, (a) e (b) da Figura 5 mostram os resultados obtidos no caso envolvendo o uso de 1 fM de estreptavidina; (c) e (d) da Figura 5 mostram os resultados obtidos no caso envolvendo o uso de 100 aM de estreptavidina; e (e) e (f) da Figura 5 mostram os resultados obtidos no caso envolvendo o uso de 10 aM de estreptavidina.
No caso envolvendo o uso de 1 fM de estreptavidina, um número total de microesferas seladas em uma submatriz foi 1735; entre essas microesferas, o número de microesferas com estreptavidina capturada foi 138. No caso envolvendo o uso de 100 aM de estreptavidina, um número total de microesferas seladas em uma submatriz foi 2008; entre essas microesferas, o número de microesferas com estreptavidina capturada foi 6. No caso envolvendo o uso de 10 aM de estreptavidina, um número total de microesferas seladas em uma submatriz foi 1360; entre essas microesferas, o número de microesferas com estreptavidina capturada foi 1.
(Comparação entre valor teórico e valor experimental)
Além disso, urn valor teórico e urn valor experimental de uma proporção (%) do número de microesferas (microesferas ativas) contendo estreptavidina capturada em relação ao número total de microesferas foram calculados para cada uma das concentrações de estreptavidina.
Foi calculada como o valor teórico uma proporção (%) do número de moléculas de estreptavidina em relação ao número total de microesferas usadas na reação com estreptavidina. Ao passo que foi calculado como o valor experimental uma proporção (%) do número de microesferas contendo estreptavidina capturada em relação ao número total de microesferas armazenadas na matriz.
A Figura 6 mostra um gráfico ilustrando uma relação, observada no referido outro exemplo da presente invenção, entre (i) uma concentração de estreptavidina e (ii) uma proporção do número de microesferas contendo estreptavidina capturada em relação ao número de microesferas armazenadas na matriz. Na Figura 6, uma linha "a" no gráfico mostra os valores teóricos, uma linha tracejada circular mostra o valor experimental e um circulo representado com uma linha tracejada mostra médias dos valores experimentais (N = 2 a 3) .Além disso, uma linha "b" no gráfico é uma linha pela qual médias dos valores experimentais foram aproximadas.
Conforme mostrado na Figura 6, os valores teóricos e os valores experimentais são quase os mesmo uns em relação aos outros. Isto mostra que o método do presente exemplo é dotado de elevada precisão quantitativa e é capaz de determinar exatamente uma concentração de moléculas alvos. Esses resultados mostram que o método do presente exemplo torna possivel detectar adequadamente mesmo moléculas alvos de 0,1 aM ou mais.
[Exemplo 3]
Pelo método descrito acima, uma solução de microesferas (6,5 x 106 microesferas/30 pL) foi introduzida (carregada) na matriz com estrutura celular de fluxo preparada no Exemplo 1, de modo que as microesferas foram seladas (aprisionadas) em goticulas. Então, uma eficiência de aprisionamento (isto é, uma proporção [%] do número de microesferas aprisionadas em relação ao número de microesferas carregadas) durante esse processo foi calculada.
Um resultado do cálculo é mostrado na Figura 8. A Figura 8 é uma ilustração (i) de uma eficiência de aprisionamento de microesferas encontrada em um caso envolvendo o uso da matriz com a estrutura celular de fluxo (Exemplo 3) e (ii) de uma eficiência de aprisionamento de microesferas encontrada em um caso envolvendo o uso de uma matriz sem a estrutura celular de fluxo (Exemplo Comparativo 2).
[Exemplo Comparativo 2]
Neste exemplo comparativo, a matriz que não possui a estrutura celular de fluxo (isto é, a matriz feita apenas do vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico descrito anteriormente) foi usada para selagem de microesferas (microesferas ligadas a amino de <5 = 3 pm; micromer-NH2-3 pm; disponivel de Micromod).
Pelo método descrito adiante, microesferas foram seladas no vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico usando-se uma solução de microesferas que foi diluida na mesma concentração (2,2 x 108 microesferas/mL = 6,5 x 106 microesferas/30 pL) da que foi usada no caso envolvendo o uso da matriz sem estrutura celular de fluxo (Exemplo 3) .
(1) As microesferas foram diluidas em uma concentração de 2,2 x 108 microesferas/mL com um tampão (100 mM tampão de KPi [pH =7.5], 1 mM de MgC12, 2 pL de 2-mercaptoetanol) .
(2) O vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico (preparado pelo método acima mencionado) foi fixado ao fundo de uma placa de Petri (placa de Petri de 35 mm, disponivel de Becton Dickinson) .Foi usado um adesivo Araldite AR-R30 (disponivel de NICHIBAN).
(3) Uma superficie superior do vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico foi coberta com 500 pL da solução de microesferas.
(4) O resultante foi submetido a desaeração e então incubado por 5 minutos.
(5) 2 mL de FC40 (Fluorinert [Marca Registrada] FC40, disponivel de SIGMA) foram carregados no vidro com padrão hidrofilico-hidrofóbico, de modo que as microesferas foram nele seladas.
(6) Para impedir evaporação das goticulas, foi introduzida água, de modo que uma fase oleosa foi coberta com água.
Subsequentemente, o número de microesferas confinadas nas goticulas foi contado, e então uma eficiência de aprisionamento (uma proporção [%] do número de microesferas aprisionadas em relação ao número de microesferas carregadas) foi calculada.
Resultados dos cálculos são mostrados na Figura 8. Conforme mostrado na Figura 8, a eficiência de aprisionamento encontrada no caso envolvendo o uso da matriz sem estrutura celular de fluxo foi 25 ou mais vezes maior que aquela encontrada no caso envolvendo o uso da matriz sem estrutura celular de fluxo. A razão para isto é considerada como se segue: No caso envolvendo o uso da matriz sem estrutura celular de fluxo, uma distância em que as microesferas poderiam dispersar-se em uma direção vertical foi aumentada, o que dificultou a aproximação das microesferas do substrato.
Além disso, no caso envolvendo o uso da matriz sem a estrutura celular de fluxo, a superficie total do substrato da matriz precisa ser coberta com a solução de microesferas. Isto requer uma grande quantidade de solução de microesferas (isto é, a solução de microesferas cuja quantidade é aproximadamente 16 vezes maior que aquela usada no caso envolvendo o uso da matriz sem a estrutura celular de fluxo) . Assim, o usoda matriz com estrutura celular de fluxo torna possivel realizar selagem de microesferas com uma quantidade pequena de solução de microesferas.Aplicabilidade Industrial
A presente invenção é adequadamente aplicável a ummétodo para detecção de moléculas alvos de baixa concentração, uma respectiva matriz, um respectivo dispositivo e o equivalente.
Lista de Sinais de Referência
1 Matriz 10 Seção da camada inferior 20 Seção a camada superior 12 Parede lateral 13 Receptáculo 30 Espaço 41, 41’ Microesferas 42 Solvente hidrofilico 43Solventehidrofóbico

Claims (4)

1. Método para selagem de microesferas, caracterizado por compreender: (i) uma etapa de introdução de um solvente hidrofilico contendo microesferas tendo um tamanho de particula de 1 pm a 4 pm, em um espaço dentro de uma estrutura de célula de fluxo, entre (a) uma seção da camada inferior incluindo uma pluralidade de receptáculos cada um dos quais é capaz de armazenar apenas uma das microesferas e que são separados entre si por uma parede lateral com uma superficie superior hidrofóbica e (b) uma seção da camada superior que se defronta com uma superficie da seção da camada inferior sobre a qual a superficie da pluralidade de receptáculos é fornecida; e (ii) uma etapa de introdução de um solvente hidrofóbico no espaço, para deslocar o solvente hidrofilico, a etapa (ii) ser realizada após a etapa (i) para formar, na pluralidade de receptáculos, goticulas do solvente hidrofilico dentro da pluralidade de receptáculos cobertos com o solvente hidrofóbico, em que um único grânulo é preso dentro de uma gota do solvente hidrofilico dentro de cada uma da pluralidade de receptáculos, e em que a pluralidade de receptáculos tem uma largura 1,5 a 2 vezes maior que o diâmetro médio das particulas das contas, a pluralidade de receptáculos cada um tem uma profundidade igual ou menor que 1,5 vezes o diâmetro médio das particulas dos grânulos, e uma eficiência de retenção das contas é vinte e cinco vezes ou mais superior em relação à ausência da estrutura da célula de fluxo, em que a estrutura não possui uma seção da camada superior.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopor compreender ainda: (111) uma etapa de desaeração do espaço, sendo a etapa (iii) realizada após a etapa (i) e antes da etapa (ii).
3. Método, de acordo com a reivindicações 1, caracterizadopelo fato de que: o solvente hidrofilico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em água, álcool hidrofilico, éter hidrofilico, cetona, solventes à base de nitrila, dimetilsulfóxido e N,N-dimetilformamida, ou é uma mistura incluindo aquele referido como pelo menos um.
4. Método, de acordo com a reivindicações 1, caracterizadopelo fato de que: o solvente hidrofóbico é pelo menos um selecionado do grupo que consiste em hidrocarboneto saturado, hidrocarboneto insaturado, hidrocarboneto aromático, óleo de silicone, perfluorocarbono, solventes à base de halogênios e liquido iônico hidrofóbico, ou é uma mistura incluindo aquele referido como pelo menos um.
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