CN103415774A - 颗粒封入方法、检测靶分子的方法、阵列、试剂盒及靶分子检测装置 - Google Patents

颗粒封入方法、检测靶分子的方法、阵列、试剂盒及靶分子检测装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可以高灵敏度地检测低浓度的靶分子的技术。其包括：颗粒导入步骤，其是向下层部(10)与上层部(20)之间的空间(30)导入含有颗粒(40)、(41′)的亲水性溶剂(42)，该下层部(10)以被具有疏水性的上表面的侧壁(12)互相隔开的方式形成多个仅可以收容1个颗粒(41)、(41′)的收容部(13)，该上层部(20)与下层部(10)的形成收容部(13)的面相对向；疏水性溶剂导入步骤，其是在所述颗粒导入步骤后向空间(30)导入疏水性溶剂(43)。

Description

颗粒封入方法、检测靶分子的方法、阵列、试剂盒及靶分子检测装置
技术领域
本发明涉及一种颗粒封入方法、检测靶分子的方法、阵列、试剂盒及靶分子检测装置。
背景技术
作为通过在分别识别出蛋白质、核酸等活体分子的态样下观察而进行各种测定的方法，已知的有单分子测定的方法。并且已知数种用以进行该单分子测定的方法。
在专利文献1中记载了用于单分子酶活性检测的微室。该微室具有可以将液滴封入、可填充的该液滴容量为1000fL(飞升)以下的容器部。容器部通过使第1部件与第2部件贴合，由至少第1部件或第2部件具有的凹处构成。通过在该液滴中进行酶反应，即使反应生成物的分子数极少，也可以提高浓度，因此可以检测出酶单分子的活性。
在非专利文献1中记载了如下方法：用油将液滴包覆，使用可以从外部直接接近液滴的飞升级的液滴阵列，进行单分子酶分析。该阵列中，通过在亲水性表面形成高17nm的疏水性区域，而形成了亲水性区域的图案。
在非专利文献2中记载了使用单分子的酶结合免疫吸附分析法(ELISA，enzyme linked immunosorbent assay)检测蛋白质的方法。该方法中，利用由蛋白质特异性抗体包覆的微细的颗粒捕捉微量的蛋白质，并利用荧光标记颗粒与蛋白质的复合物。利用离心力将含有该复合物的颗粒导入反应室中，通过对捕捉到蛋白质的颗粒数进行计数，而对蛋白质进行定量测定。
(现有技术文献)
(专利文献)
专利文献1：日本国专利申请公开公报“特开2004-309405号公报”；2004年11月4日公开。
(非专利文献)
非专利文献1：S.Sakakihara et al.，Lab Chip，2010，10，3355-3362
非专利文献2：David M Rissin et al.，Nature Biotechnology：doi：10.1038/nbt.1641
发明内容
(本发明要解决的问题)
为了检测出低浓度的疾病标记物等，早期发现疾病、传染病等，需要生物传感技术的进一步高灵敏度化。例如，在标记蛋白质从体积1mm3的肿瘤中所含的100万个癌细胞(每个细胞各100分子)分泌到5L的血液中时，该蛋白质的血液中浓度为30aM左右。于是需要一种可以检测出上述这样浓度非常低的靶分子的技术。
为了检测这种靶分子，考虑利用所述单分子酶分析，以单分子单位的灵敏度进行检测的方法。即为如下方法：将靶分子特异性地封入飞升级的液滴(超微液滴)中后，将由酶标记的抗体等连接到靶分子上，由此来检测标记酶的活性。作为将靶分子特异性地封入超微液滴中的方法，考虑使用与靶分子特定结合的由其他抗体等标记的颗粒等的方法。该方法具体为，使靶分子结合到颗粒上后，将颗粒封入超微溶液中。
此处，为了有效地检测出极少量地存在于溶液中的靶分子，例如，所述的30aM左右的靶分子等，必须准备100万个左右的非常多的超微液滴阵列，由该阵列捕捉颗粒。
但是在非专利文献2所记载的方法中，需要利用较强的离心力将颗粒导入阵列中，费时费力。另外，非专利文献2所记载的方法所使用的阵列数为5万个左右，极难应用于100万个左右的阵列中。因此，利用非专利文献2所记载的方法难以将大量颗粒高效地封入阵列中。另外，在专利文献1及非专利文献1中并未记载解决这种问题的方法。
本发明的目的在于提供一种将大量颗粒高效地封入阵列中的技术。
(解决问题的方案)
为了解决所述课题，本发明的颗粒封入方法的特征在于包括：颗粒导入步骤，其是向下层部与上层部之间的空间导入包含颗粒的亲水性溶剂，该下层部中形成有多个仅可以收容1个所述颗粒的收容部，多个所述收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，该上层部与该下层部的形成有所述收容部的面相对向；疏水性溶剂导入步骤，其在所述颗粒导入步骤之后向所述空间导入疏水性溶剂。
为了解决所述课题，本发明的阵列的特征在于：其具备下层部及上层部，所述下层部中形成有多个收容部，该多个收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，所述上层部与所述下层部的形成有所述收容部的面以隔着空间的方式而相对向。
(发明的效果)
使用本发明的颗粒封入方法，可以将大量颗粒高效地封入阵列中，因此有助于可以高灵敏度地检测出低浓度的靶分子的技术。
附图说明
图1的(a)～(e)是用来说明本发明的颗粒封入方法的模式图，表示阵列1的横向剖视图。
图2是模式性表示本发明的靶分子检测装置的一个实施方式的图。
图3是表示本发明的一个实施例中封入了颗粒的阵列的荧光图像的图。
图4是表示利用先前的方法检测出靶分子时的荧光强度的图表。
图5的(a)～(f)是表示本发明的其他实施例中封入了颗粒的阵列的显微镜图像的图。
图6是表示本发明的其他实施例中抗生蛋白链菌素的浓度与捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒数的比例的关系的图表。
图7是用来说明本发明的一个实施例中制作亲水/疏水压花玻璃的方法的图。
图8是表示使用具有流槽结构的阵列的情形(实施例3)与使用不具有流槽结构的阵列的情形(比较例2)时的颗粒的捕获效率的图。
[附图标记说明]
Figure BDA00003782632700031
Figure BDA00003782632700041
具体实施方式
以下对本发明的一个实施方式进行详细说明。
[颗粒封入方法]
参照图1的(a)～(e)对本实施方式的颗粒封入方法进行说明。图1的(a)～(e)是用来说明本发明的颗粒封入方法的模式图，表示阵列1的横向剖视图。
本实施方式中，对于具备下层部10与上层部20的阵列1中封入颗粒41、41′的情形进行说明。下层部10以被具有疏水性的上表面的侧壁12互相隔开的方式形成多个仅可以收容1个颗粒41、41′的收容部13。另外，上层部20与下层部10的形成收容部13的面相对向。
颗粒优选平均粒径为1μm～4μm。由此可以有效地封入阵列中且使阵列高密度化。另外，所谓“平均粒径”，此处是指利用电子显微镜观察或动态光散射法而测定的数值。
本实施方式中，对使用特异性捕捉靶分子的颗粒进行说明，但本发明并不特别限定于此。本实施方式中，封入的颗粒是未捕捉到靶分子的颗粒41与捕捉到靶分子的颗粒41′的混合物。
作为特异性捕捉靶分子的颗粒，例如可以使用结合用来特异性捕捉靶分子的分子的颗粒。用来特异性捕捉靶分子的分子可以经由例如连接子而结合在位于颗粒表面的修饰基团上。例如，可以通过经由含有N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)等的交联剂进行共价键合而结合在位于氨基修饰颗粒表面的氨基上。
所谓“靶分子”，是指作为检测对象的分子(目标分子)，此处即为通过被颗粒捕捉而检测的分子。作为靶分子，例如可以列举蛋白质、核酸、糖等活体分子，以及病毒粒子本身等。
作为用来特异性捕捉靶分子的分子(以下也称为“靶捕捉分子”)，只要根据靶分子进行选择即可，例如可以使用蛋白质、抗体、核酸等。另外，靶捕捉分子优选每1个颗粒结合10万分子以上。例如靶捕捉分子为抗体时，解离常数为nM级左右，如果是所述构成，那么可以充分提高颗粒与靶分子反应时的靶捕捉分子的浓度(例如颗粒的浓度为8×106粒子/mL时，靶捕捉分子达到约1nM)。
本实施方式的颗粒封入方法包括颗粒导入步骤、除气步骤及疏水性溶剂导入步骤。以下对各步骤进行详细说明。
(颗粒导入步骤)
参照图1的(a)～(b)对颗粒导入步骤进行说明。
颗粒导入步骤是向下层部10与上层部20之间的空间30导入含有颗粒41、41′的亲水性溶剂42的步骤。作为导入亲水性溶剂42的方法，只要沿和下层部10与上层部20相对向的面平行的方向导入下层部10与上层部20之间的空间30中即可。例如可以从形成于上层部20及下层部10的至少一个上的贯通孔(未图示)导入空间30内。
作为亲水性溶剂42，例如可以优选使用选自由水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈系溶剂、二甲基亚砜(DMSO)、及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)所组成的群中的至少1种或含有所述至少1种的混合物等。作为亲水性醇，例如可以列举乙醇、甲醇、丙醇、甘油等。作为亲水性醚，例如可以列举四氢呋喃、聚环氧乙烷、1，4-二恶烷等。作为酮，例如可以列举丙酮、甲基乙基酮等。作为腈系溶剂，例如可以列举乙腈等。
亲水性溶剂42中除了颗粒41、41′以外，还可以含有例如用来特异性检测被颗粒41′捕捉的靶分子的物质。作为这种物质，例如可以是被结合在被颗粒41′捕捉的靶分子上、或与该靶分子特异性结合的分子上的特定酶分解，从而释放荧光物质的荧光基质等。作为与靶分子特异性结合的分子，例如可以是二次抗体、核酸等。另外，作为特定酶，例如可以列举β-半乳糖苷酶、过氧化酶等。作为荧光基质，例如可以列举荧光素-二-β-吡喃半乳糖苷(Fluorescein-di-β-galactopyranoside，FDG)、Amplex red(注册商标)等。
(除气步骤)
参照图1的(c)对除气步骤进行说明。
除气步骤是在颗粒导入步骤之后、疏水性溶剂步骤之前，对下层部10与上层部20之间的空间30内进行除气的步骤。作为除气的方法，可优选使用例如将阵列1放置在减压环境下的方法等。具体而言，为将阵列1在约0.1个大气压的减压干燥器内放置约30秒的方法等。
在本发明中，除气步骤并非必需步骤，通过进行除气步骤，可以将收容部13内的空气除去，将含有颗粒41、41′的亲水性溶剂42高效地导入收容部13内。因此，由于可以高效地将颗粒41、41′封入收容部13内，所以更优选进行除气步骤。
(疏水性溶剂导入步骤)
参照图1的(d)～(e)对疏水性溶剂导入步骤进行说明。
疏水性溶剂导入步骤是向下层部10与上层部20之间的空间30导入疏水性溶剂43的步骤。疏水性溶剂导入步骤是在颗粒导入步骤之后进行的步骤，更优选在除气步骤之后进行。
疏水性溶剂43只要为不易与颗粒导入步骤中所使用的亲水性溶剂42混合的溶剂即可。作为疏水性溶剂43，例如可以优选使用选自由饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅酮油、全氟碳、卤素系溶剂及疏水性离子液体所组成的群中的至少1种或含有所述至少1种的混合物等。作为饱和烃，例如可以列举烷烃、环烷烃等。作为烷烃，例如可以列举癸烷、十六烷等。作为不饱和烃，例如可以列举三十碳六烯等。作为芳香族烃，例如可以列举苯、甲苯等。作为全氟碳，例如可以列举Fluorinert(注册商标)FC40(SIGMA公司制造)等。作为卤素系溶剂，例如可以列举氯仿、二氯甲烷、氯苯等。所谓疏水性离子液体，是指至少在水中不解离的离子液体，例如可以列举1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(1-Butyl-3-methylimidazolium Hexafluorophosphate)等。所谓离子液体，是指在室温下以液体形式存在的盐。
通过进行疏水性溶剂导入步骤，可以在各收容部13中高效地形成被疏水性溶剂43覆盖的液滴(droplet)。另外，可以将颗粒41、41′高效地封入各液滴内。
本实施方式中，通过使用下层部10与上层部20之间的空间30并导入颗粒41、41′，可以将颗粒高效地封入在较大的面积(例如1cm2以上的面积)上大量制作的各收容部13中。
根据本实施方式，可以实现具有大量收容部的大面积的液滴阵列。例如，即使是具有100万个以上收容部的阵列，也可以高效地将颗粒41、41′封入各收容部中。因此，本实施方式可以高灵敏度地检测出靶分子，所以即使是0.1aM左右的浓度非常低的靶分子也可以检测出。
[检测靶分子的方法]
接着对本实施方式的检测靶分子的方法进行说明。
本实施方式的检测靶分子的方法包括反应步骤、颗粒封入步骤及检测步骤。
本实施方式中，作为颗粒，使用的是特异性捕捉靶分子的颗粒。例如，颗粒可以结合用来特异性捕捉靶分子的分子。另外，关于颗粒、靶分子及用来特异性捕捉靶分子的分子，可以优选使用与本实施方式的颗粒封入方法中所例示的相同的方法。
反应步骤是使颗粒与靶分子进行反应的步骤。例如可以通过使含有颗粒的溶液与含有靶分子的溶液加以混合而反应。
颗粒封入步骤是使用在反应步骤中反应的颗粒进行所述颗粒封入方法的步骤。即，颗粒封入步骤是包括颗粒导入步骤与疏水性溶剂导入步骤的步骤，或者是包括颗粒导入步骤、除气步骤及疏水性溶剂导入步骤的步骤。另外，关于颗粒导入步骤、除气步骤及疏水性溶剂导入步骤，能够以与所述“颗粒封入方法”中的各步骤相同的方式进行，所以此处省略说明。
检测步骤是在颗粒封入步骤后，检测各收容部13中是否收容了捕捉到靶分子的颗粒41′的步骤。
作为检测是否收容了捕捉到靶分子的颗粒41′的方法，例如可以优选使用抗原抗体反应、抗生蛋白链菌素-生物素反应、核酸的互补结合等公知的分子识别反应。例如，可以列举：检测通过结合在靶分子上、或与该靶分子特异性结合的分子上的特定酶将荧光基质分解而释放的荧光物质的方法。作为荧光物质的检测方法，可以列举使用荧光显微镜、图像传感器等检测各收容部中的荧光强度的方法等。
另外，优选在检测步骤中也检测各收容部13中是否收容了颗粒41或颗粒41′。作为检测各收容部13中是否收容了颗粒41或颗粒41′的方法，例如可以通过在显微镜下观察有无颗粒41或颗粒41′而进行检测。另外，作为检测有无颗粒41、41′的方法，还有检测因颗粒引起的散射光的方法、利用使用场效晶体管(FET，field-effect transistor)进行电位测量的方法等。
检测步骤的结果，可以使用收容了颗粒41或颗粒41′的收容部13的个数与收容了捕捉到靶分子的颗粒41′的收容部13的个数，计算出捕捉到靶分子的颗粒个数在颗粒总数中的比例。由此可以将靶分子的浓度定量化。
本实施方式可以实现具有大量收容部的大面积的液滴阵列，即使是具有100万个以上收容部的阵列，也可以将颗粒41、41′高效地封入各收容部中。因此，本实施方式可以高灵敏度地检测出靶分子，所以即使是10aM左右的浓度非常低的靶分子也可以检测出。
[阵列]
接着，参照图1的(a)对本实施方式的阵列1的构成进行详细说明。阵列1可以是用于本实施方式的颗粒封入方法的阵列，也可以是用于本实施方式的检测靶分子的方法的阵列。
阵列1具备下层部10与上层部20。
下层部10具备板状部件11与具有疏水性的上表面的侧壁12。下层部10上以被侧壁12互相隔开的方式形成多个收容部13。
板状部件11优选具有亲水性表面。所谓“亲水性表面”，是指与亲水性溶剂的亲和性高于与疏水性溶剂的亲和性的表面。作为板状部件11，只要为固体材料即可，例如可以使用玻璃、硅、高分子树脂等。
侧壁12是设置在板状部件11的表面上、优选亲水性表面上的将多个收容部13一个个隔开的结构物。侧壁12具有疏水性的上表面。所谓“疏水性”，此处与“亲油性”的含义相同，是指与疏水性溶剂的亲和性高于与亲水性溶剂的亲和性。
另外，只要侧壁12的上表面即与上层部20相对向的面为疏水性即可，侧面即收容部13内的内壁可以是疏水性，也可以是亲水性。
例如，侧壁12也可以由亲水性的结构物和形成在该结构物上表面的疏水性层构成。亲水性的结构物可以使用例如玻璃、硅、高分子树脂等。疏水性层可以使用例如拨水性的树脂、氟系高分子树脂等。作为氟系高分子树脂，例如可以列举非晶氟树脂等。由于非晶氟树脂具有较高的疏水性，且对活体试样的毒性较低，因此优选使用非晶氟树脂。
作为所述非晶氟树脂，例如可以优选使用选自CYTOP(注册商标)、TEFLON(注册商标)AF2400及TEFLON(注册商标)AF1600中的至少1种。其中，由于容易进行微细加工的原因，所以最优选CYTOP(注册商标)。
另外例如，侧壁12也可以由疏水性材料构成。作为侧壁12，例如可以使用氟系高分子树脂、对二甲苯系高分子树脂等。作为氟系高分子树脂，例如可以列举非晶氟树脂等。作为非晶氟树脂，可以优选使用所述树脂。
侧壁12只要以在板状部件11上形成多个收容部13的方式构成即可，例如也可以为在形成收容部13的位置上形成孔的板形结构物。
自板状部件11的表面起的侧壁12的高度(垂直方向的厚度)只要达到收容到收容部13中的颗粒41、41′在后文叙述的疏水性溶剂导入步骤中不从收容部13排出的程度即可。例如可以为将收容到收容部13中的颗粒41、41′的大部分、优选为全部以低于侧壁12的上表面的方式收容的高度。
另外，就将颗粒41、41′高效地收容到收容部13中的观点而言，侧壁12的高度优选为颗粒41、41′的平均粒径的1倍以上。此外，就仅将1个颗粒41、41′收容到收容部13中的观点而言，侧壁12的高度优选为颗粒41、41′的平均粒径的1.5倍以下。
多个收容部13的每一个是仅可以收容1个颗粒41、41′的凹部，互相被侧壁12隔开。收容部13以板状部件11的表面的一部分作为底面，底面为亲水性。
收容部13只要为仅收容1个颗粒41、41′的形状及大小即可。由收容部13的底面及侧面围成的区域的形状可以为例如圆柱形状、棱柱形状等。
各收容部13的水平方向的宽度A(如果水平方向的截面是圆，那么为其直径；如果是正方形，那么为其一边的长度等)只要大于颗粒41、41′的平均粒径即可，优选为例如颗粒41、41′的平均粒径的1.5倍～2倍。各收容部13的深度在本实施方式中与侧壁12的高度相同。另外，就将颗粒高效地收容到收容部中的观点而言，本发明中的收容部的深度优选为颗粒的平均粒径的1倍以上。此外，就仅将1个颗粒收容到收容部中的观点而言，本发明的收容部的深度优选为颗粒的平均粒径的1.5倍以下。
本实施方式中，收容部13的底面为亲水性，且侧壁12的上表面为疏水性。由此，在后文叙述的颗粒导入步骤中，可以将含有颗粒41、41′的亲水性溶剂42高效地导入收容部13中，并且可以在后文叙述的疏水性溶剂导入步骤中防止疏水性溶剂43进入收容部13中。因此，可以利用疏水性溶剂将包含含有颗粒41、41′的液滴的收容部13高效地密封。
上层部20具备板状部件21与疏水性层22。疏水性层22设置在板状部件21的与下层部10相对向的面上。作为板状部件21，例如可以使用玻璃、硅、高分子树脂等。另外，作为疏水性层22，例如可以使用拨水性的树脂、氟系高分子树脂等。作为氟系高分子树脂，例如可以列举非晶氟树脂等。
上层部20与下层部10的形成收容部13的面隔着空间30而相对向。即，在侧壁12与疏水性层22之间空有空间30。该空间30构成流路。通过该构成，阵列1成为流槽结构。
空间30可以用作用来在下层部10与上层部20之间，沿与下层部10和上层部20相对向的面平行的方向流动流体的流路。
侧壁12的上表面与疏水性层22板状部件21之间的距离即空间30的垂直方向的宽度只要至少大于颗粒14、14′的平均粒径即可，优选10～150μm。
在下层部10或上层部20上也可以形成用来将流体导入空间30中的贯通孔(未图示)。例如，下层部10也可以具有形成收容部13的区域与未形成收容部13的区域。另外，可以在下层部10的未形成收容部13的区域、或上层部20的与该区域相对向的部分形成贯通孔。
本实施方式中，空间30的上表面为疏水性层22的表面，空间30的下表面为侧壁12的上表面及收容部13。因此，空间30中除收容部13的底面以外的部分均为疏水性。由此，在后文叙述的颗粒导入步骤中，可以将含有颗粒41、41′的亲水性溶剂42高效地导入各收容部13内。另外，在后文叙述的疏水性溶剂导入步骤中，不会使疏水性溶剂43进入各收容部13内。因此，通过将疏水性溶剂43导入空间30内，可以高效地形成将颗粒41、41′封入各收容部13中的液滴。
作为本实施方式的阵列1的一例，例如有形成了100万个以上收容部的阵列。即使为这种大面积的阵列，也可以通过使用本实施方式的颗粒封入方法或检测靶分子的方法，将颗粒高效地封入各收容部中。因此，本实施方式可以高灵敏度地检测靶分子，所以可以提供连0.1aM左右的浓度非常低的靶分子也可以检测出的阵列。
[试剂盒]
接着对本实施方式的试剂盒的构成进行说明。
本实施方式的试剂盒至少具备阵列1与颗粒41。作为阵列1，可以优选使用具有所述构成的阵列1。阵列1的各收容部13是以仅可以收容1个该试剂盒具备的颗粒41的方式构成的。
该试剂盒所具备的颗粒41可以是特异性捕捉靶分子的颗粒，例如可以是结合了与靶分子特异性结合的分子的颗粒。作为靶分子、及与其特异性结合的分子，可优选使用所述分子。
另外，该试剂盒还可以具备用来特异性检测靶分子的物质。作为用来特异性检测靶分子的物质，可以优选使用所述物质。另外，试剂盒还可以含有水溶性溶剂、疏水性溶剂等。
[靶分子检测装置]
接着参照图2对本实施方式的靶分子检测装置50的构成进行说明。图2是模式性表示本发明的靶分子检测装置的一个实施方式的图。
本实施形态的靶分子检测装置50具备阵列1、图像传感器51及光源52。作为阵列1，可以优选使用所述构成，所以此处省略说明。
图像传感器51是检测收容了捕捉到靶分子的颗粒时从各收容部13所发出的光的传感器。例如，可以是检测由结合在靶分子上或与该靶分子特异性结合的分子上的特定酶引起荧光基质分解而发出的荧光的传感器。作为图像传感器51，例如可以优选使用CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor Transistor，互补型金属氧化物半导体)图像传感器等。
光源52是向阵列1照射光的光源。另外，图2中，光源52设置在阵列1的上方，但本发明并不特别限定于此，例如也可以从阵列1的侧面照射光。
另外，在阵列1与图像传感器51之间也可以设置干涉滤光片、光导阵列等。此外，在光源52与阵列1之间也可以设置激发滤光片等。
本实施方式的阵列1与图像传感器51是直接连接的，所以可以不使用显微镜等其他装置，而容易地检测出各收容部13中是否收容了捕捉到靶分子的颗粒。因此，可以简便且高速地检测。另外，可以作为廉价的商品提供。
本申请包括以下的发明。
本发明的颗粒封入方法的特征在于包括：颗粒导入步骤，其是向下层部与上层部之间的空间导入包含颗粒的亲水性溶剂，该下层部中形成有多个仅可以收容1个所述颗粒的收容部，多个所述收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，该上层部与该下层部的形成有所述收容部的面相对向；疏水性溶剂导入步骤，其在所述颗粒导入步骤之后向所述空间导入疏水性溶剂。
另外，本发明的颗粒封入方法中，优选还包括：在所述颗粒导入步骤之后、所述疏水性溶剂导入步骤之前，对所述空间内进行除气的除气步骤。
另外，本发明的颗粒封入方法中，优选所述亲水性溶剂是选自由水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈系溶剂、二甲基亚砜及N，N-二甲基甲酰胺所组成的群中的至少1种，或是含有选自由水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈系溶剂、二甲基亚砜及N，N-二甲基甲酰胺所组成的群中的至少1种的混合物。
另外，本发明的颗粒封入方法中，优选所述疏水性溶剂是选自由饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅酮油、全氟碳、卤素系溶剂及疏水性离子液体所组成的群中的至少1种，或是含有选自由饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅酮油、全氟碳、卤素系溶剂及疏水性离子液体所组成的群中的至少1种的混合物。
为了解决所述课题，本发明的检测靶分子的方法的特征在于包括：反应步骤，使特异性地捕捉靶分子的颗粒与该靶分子进行反应；颗粒封入步骤，在所述反应步骤之后，使用所述颗粒进行所述任一种颗粒封入方法；检测步骤，在所述颗粒封入步骤之后，检测各所述收容部是否收容了捕捉到所述靶分子的颗粒。
另外，本发明的检测靶分子的方法中，优选在所述颗粒上结合有能与所述靶分子特异性地结合的分子。
本发明的阵列的特征在于，其具备下层部及上层部，所述下层部中形成有多个收容部，该多个收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，所述上层部与所述下层部的形成有所述收容部的面以隔着空间的方式而相对向。
另外，本发明的阵列中，优选各所述收容部的底面为亲水性。
另外，本发明的阵列中，优选所述上层部的与所述下层部相对向的面为疏水性。
另外，本发明的阵列中，优选在所述上层部及所述下层部的至少一方上形成有用来将流体导入所述空间中的贯通孔。
为了解决所述课题，本发明的试剂盒的特征在于：其具备所述任一阵列、及颗粒，且各所述收容部仅可以收容1个所述颗粒。
为了解决所述课题，本发明的靶分子检测装置的特征在于：其具备所述任一阵列、及检测当收容了捕捉到靶分子的颗粒时从各所述收容部发出的光的图像传感器。
本发明并不限定于所述各实施方式，可以在权利要求所示的范围内进行各种变更。以下例示实施例，对本发明的实施方式进行更详细说明。当然，本发明并不限定于以下的实施例，不言而喻，关于细节可以为各种态样。
[实施例]
对各实施例所使用的材料及方法进行说明。
(材料)
各实施例中，作为靶分子，使用由β-半乳糖苷酶标记了的抗生蛋白链菌素(Streptavidin，从SIGMA公司购入)(以下简称为“抗生蛋白链菌素”)。另外，作为颗粒，使用将平均粒径3μm的氨基颗粒(材质：聚苯乙烯；micromer-NH2-3μm；从Micromod公司购入)生物素化的生物素化颗粒。
(生物素化颗粒的制作)
利用以下方法，使氨基颗粒的氨基与NHS-PEO4-Biotin进行反应，将氨基颗粒生物素化。
首先，在氨基颗粒250μL中加入750μL缓冲剂A(100mM磷酸缓冲剂，pH值8.0)。
接着，在10000rpm、4℃下离心10分钟，收集氨基颗粒，悬浮在500μL的缓冲剂A中(悬浮液A)。然后，在悬浮液A中加入50μL的NHS-PEO4-Biotin(2μg/50μL DMSO)，一面缓慢混合一面在25℃下反应至少3小时(翻转(end-over-end)使管混合(mix))。
然后，将所得的生物素化颗粒清洗。在10000rpm、4℃下离心10分钟，收集生物素化颗粒，利用移液器(pipetman)去除水相。在该生物素化颗粒的沉淀中加入1mL的缓冲剂A而使其悬浮。将该操作重复6次，除去未反应的NHS-PEO4-Biotin。然后，悬浮在500μL的缓冲剂A中(悬浮液B)。在4℃下保存该悬浮液B。
接着，计算悬浮液B中的生物素化颗粒的浓度。使用血球计，通过对一定体积内的生物素化颗粒的个数进行计数，而算出生物素化颗粒的浓度(约3.0×108颗粒/mL)。另外，为了易于计数，例如，利用缓冲剂A将悬浮液B稀释成5倍左右而计数。
通过以上方法而获得生物素化颗粒。
(抗生蛋白链菌素的捕捉)
接着，利用以下方法，使用生物素化颗粒捕捉抗生蛋白链菌素。
首先，稀释生物素化颗粒(8×106颗粒/500μL)。此外，利用缓冲剂B(100mM磷酸缓冲剂，pH值8.0，含有0.1％的TWEEN20(洗涤剂(detergent)))将由β-半乳糖苷酶标记的抗生蛋白链菌素稀释成目标浓度的2倍的浓度(总量500μL)。
然后，在管内使生物素化颗粒500μL与稀释的抗生蛋白链菌素500μL进行混合(总量1mL)，将管缓慢地上下移动，在25℃下反应30分钟。
接着，在10000rpm、4℃下离心10分钟，收集反应后的颗粒(抗生蛋白链菌素与生物素化颗粒的复合物、和未反应的生物素化颗粒的混合物)，利用移液器去除水相。在该颗粒的沉淀中加入1mL的缓冲剂A，使其悬浮。通过重复进行4次该操作而将其清洗，除去未反应的靶分子。
接着，在清洗后的颗粒的沉淀中加入15μL缓冲剂C(100mM磷酸缓冲剂，pH值7.5，1mM的MgCl2)，使其悬浮。颗粒的浓度最终成为约6.5×106颗粒/15μL的缓冲剂C。
(阵列的制作)
接着，利用以下方法制作与图1的(a)～(e)所示的阵列1相同的流槽结构的阵列。以下说明中，对具有与阵列1的构成要件相同功能的构成要件标注相同的附图标记进行说明。
首先，准备亲水/疏水压花玻璃(下层部10)与上表面玻璃(上层部20)(长24mm×宽26mm×厚5mm，SiO2，有直径1mm的贯通孔)。
(亲水/疏水压花玻璃的制作)
参照图7对用来制作亲水/疏水压花玻璃而具体使用的方法进行说明。图7是用来说明本发明的一个实施例中制作亲水/疏水压花玻璃的方法的图。
本实施例中，利用光刻与干式蚀刻而在玻璃上制作了亲水/疏水图案。在制作亲水/疏水图案时，进行CYTOP(注册商标)涂布步骤、光刻步骤、蚀刻并除去光阻的步骤3个步骤。
CYTOP(注册商标)涂布步骤中，首先在长24mm×宽32mm的玻璃(商品名：NEO MICRO COVER GLASS Thickness No.1；MATSUNAMI公司制造)(板状部件11)上涂布CYTOP(注册商标)CTL-809(商品名，ASAHI GLASS公司制造)，形成疏水性的树脂层61。
接着，在光刻步骤中，涂布正型光阻62(商品名：AZ-4903，AZ ElectronicMaterials USA公司制造)。然后，经由目标图案的光罩63，自上部曝光UV，利用碱进行显影处理。通过该显影处理，只有照射了UV的部分的光阻62溶解，露出疏水性的树脂层61的面。
其后，在蚀刻并除去光阻的步骤中，经由一部分溶解了的光阻62′，利用O2等离子体对该玻璃进行蚀刻，由此除去树脂层61的一部分。由此形成疏水性的侧壁12。最后，通过利用有机溶剂溶解光阻62′而形成亲水/疏水图案。
更详细的顺序如以下所述。图7中，(1)～(23)所表示的数字与下述的(1)～(23)相对应。
<CYTOP(注册商标)涂布步骤(利用下述过程制作膜厚约3.3～3.5μm的CYTOP(注册商标)层)>
(1)首先，清洗玻璃(板状部件11)并涂布CYTOP(注册商标)CTL-809。
(2)接着，将该玻璃在10N KOH中浸泡一晚。
(3)利用脱离子水将在KOH中浸泡过的覆盖玻璃清洗10次以上。
(4)利用180℃的加热板干燥玻璃。
(5)使干燥过的玻璃恢复为室温。
(6)在玻璃上滴约70μL的CYTOP(注册商标)CTL-809。
(7)按照下述的程序A进行旋转涂布。
[程序A]
Slope 5秒
500rpm 10秒
Slope 5秒
2000rpm 30秒
Slope 5秒
End
(8)在加热板上，在180℃下烘烤1小时。
将以上的(6)～(8)重复4次，由此形成深度3.3～3.5μm的疏水性的树脂层61。
<光刻步骤>
接着进行光刻。
(9)将正型光阻62(AZ-4903)滴到CYTOP(注册商标)涂布步骤中所制作的树脂层61上。量为滴到玻璃上的光阻扩展为直径约8mm的程度。
(10)按照下述的程序B进行旋转涂布。
[程序B]
Slope 5秒
500rpm 10秒
Slope 5秒
4000rpm 60秒
Slope 5秒
End
(11)利用含有100％EtOH的纱布将残留在玻璃边缘的光阻擦去。
(12)在55℃下烘烤3分钟。
(13)在110℃下烘烤5分钟。
(14)利用丙酮清洗光罩63，将其设置在光刻机(SAN-EI ELECTORIC公司制造)上。
(15)将涂布了光阻62的玻璃置于光刻机的试样台上，升起试样台，由此使玻璃与光罩63相接触。
(16)照射UV35秒(Power＝256)。
(17)将玻璃浸泡在AZ Developer(AZ Electronic Materials USA公司制造)中5分钟以上进行显影。
(18)用MilliQ(蒸馏水)洗涤10分钟左右。
<蚀刻并除去光阻的步骤>
接着进行蚀刻并除去光阻。
(19)使用RIE-10NR(Samco公司制造)，利用特定的过程条件(O250sccm；Pressure 10Pa；Power 50W；Time 30min)进行O2等离子体蚀刻。
(20)将蚀刻后的玻璃浸泡在丙酮中，进行15分钟超声处理(sonication)。
(21)换掉丙酮，再进行一次15分钟的超声处理。
(22)利用EtOH进行15分钟超声处理。
(23)用MilliQ(蒸馏水)清洗。
通过以上的方法，在玻璃上形成多个凹槽(收容部13)。由各凹槽的底面及侧面围成的区域为圆柱形状。各凹槽的水平方向的截面是直径5μm的圆形，将各凹槽隔开的侧壁的高度为约3.3～3.5μm。另外，邻接的2个凹槽之间的距离B为5μm。
(上表面玻璃的制作)
另外，利用以下的方法制作上表面玻璃。作为上表面玻璃，使用形成直径1mm的贯通孔的厚度5mm的玻璃。利用CYTOP(注册商标)CTL-809(商品名，ASAHI GLASS公司制造)约70μL覆盖该玻璃的其中一个面，按照下述程序C进行旋转涂布。
[程序C]
Slope 5秒
500rpm 10秒
Slope 5秒
2000rpm 30秒
Slope 5秒
End
其后，在加热板上在180℃下烘烤1小时。
通过以上的方法，制成其中一个面具有厚度1μm的疏水性层的上表面玻璃。
(亲水/疏水压花玻璃与上表面玻璃的贴合)
接着，在封口膜(Peckiney Plastic Packaging公司制造)的衬纸上涂抹高真空润滑脂(DOW CORNING TORAY公司制造)，将其贴在亲水/疏水压花玻璃中形成亲水/疏水图案的面侧的未形成亲水/疏水图案的部分上。将上表面玻璃贴附到亲水/疏水压花玻璃的形成亲水/疏水图案的面上，使由涂布剂涂布的面成为亲水/疏水压花玻璃侧。
由此，在亲水/疏水压花玻璃与上表面玻璃之间形成了空间。该空间的垂直方向的宽度即亲水/疏水压花玻璃的侧壁的上表面与上表面玻璃之间的距离为约150μm。
(将颗粒封入液滴中)
接着，利用以下方法，将与抗生蛋白链菌素反应后的颗粒封入液滴中。
首先，利用FDG缓冲剂(100mM的KPi buffer(PH值＝7.5)，1mM的MgCl2，4μL/mL的2-mercaptethanol)稀释50mM的荧光素-二-β-吡喃半乳糖苷(FDG)(Marker Gene Technology公司制造)/DMSO，准备4mM的FDG溶液。然后，将颗粒(6.5×106颗粒/15μL的缓冲剂C)15μL与4mMFDG溶液15μL加以混合，制作颗粒溶液。
接着，利用黄色吸头(yellow tip)将该颗粒溶液30μL从上表面玻璃的贯通孔载入流路内(图1的(a)～(b))。
然后，为了抽掉各凹槽内的空气，进行1分钟除气(图1的(c))。除气是通过将阵列在0.1个大气压的减压干燥器内放置约30秒而进行的。其后静置5分钟，使颗粒沉到凹槽的底部。
其后，将Fluorinert(注册商标)FC40(SIGMA公司制造)200μL～1000μL从上表面玻璃的贯通孔载入流路内(图1的(d)～(e))。
其结果，水相仅被凹槽部分捕获并形成液滴，颗粒被封入液滴内。
[实施例1]
使用所述方法，使生物素化颗粒与1fM的抗生蛋白链菌素进行反应后，与FDG一并导入阵列中，将颗粒封入各液滴中。作为阵列，使用将形成2744个收容部的512μm×512μm的子阵列以20个×20个的方式配置的合计具有1097600个收容部的1.0cm×1.0cm的阵列。利用荧光显微镜(IX71(OLYMPUS公司制造))观察该阵列。
图3是表示本发明的一个实施例中封入了颗粒的阵列的荧光图像的图。另外，图3表示1个子阵列。如图3所示，在荧光图像中检测出若干亮点(一个视野中有138个)。该亮点表示封入了捕捉到抗生蛋白链菌素的生物素化颗粒的收容部所处的位置。因此可知，如果使用本发明的方法，那么可以充分检测出1fM的抗生蛋白链菌素。
[比较例1]
作为本发明的比较例，使用现有的整体(Bulk)测量法检测靶分子。
将为实施例1所使用的浓度(1fM)的12.5倍浓度的12.5fM抗生蛋白链菌素与FDG加以混合，利用荧光分光器测定荧光。另外，作为控制，使用500倍浓度的6.3pM的抗生蛋白链菌素，以同样的方式进行实验。
将其结果示于图4。图4是表示利用现有的方法检测靶分子时的荧光强度的图表。另外，图4中，图表a表示使用12.5fM的抗生蛋白链菌素时的结果，图表b表示使用6.3pM的抗生蛋白链菌素时的结果。
如图4所示，使用现有的方法时，无法检测出12.5fM的抗生蛋白链菌素。因此表示，利用现有的方法时，12.5fM为检测极限以下。
[实施例2]
接着，使生物素化颗粒与5种不同浓度(1fM、100aM、10aM、1aM、0.1aM)的抗生蛋白链菌素分别进行反应后，与FDG一并导入阵列中，将颗粒封入各液滴中。作为阵列，使用具有与实施例1相同构成的阵列。在显微镜下观察该阵列的亮视野图像与荧光图像。
(检测结果)
图5的(a)～(f)是表示本发明的其他实施例中封入了颗粒的阵列的显微镜图像的图。另外，图5的(a)、图5的(c)及图5的(e)是表示1个子阵列的亮视野图像的图。另外，图5的(b)、图5的(d)及图5的(f)是分别表示图5的(a)、图5的(c)及图5的(e)所表示的子阵列的荧光图像的图。另外，图5的(a)～(b)是关于1fM的抗生蛋白链菌素的结果，图5的(c)～(d)是关于100aM的抗生蛋白链菌素的结果，图5的(e)～(f)是关于10aM的抗生蛋白链菌素的结果。
使用1fM的抗生蛋白链菌素时，封入1个子阵列中的颗粒的总数为1735个，其中捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒为138个。使用100aM的抗生蛋白链菌素时，封入1个子阵列中的颗粒的总数为2008个，其中捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒为6个。使用10aM的抗生蛋白链菌素时，封入1个子阵列中的颗粒的总数为1360个，其中捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒为1个。
(理论值与实验值的比较)
另外，计算出在抗生蛋白链菌素的各浓度中，捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒(活性颗粒)个数相对于颗粒的总数的比例(％)的理论值与实验值。
理论值是作为抗生蛋白链菌素的分子数相对于所反应的颗粒的总数的比例(％)而算出的。另外，实验值是作为捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒个数相对于收容到阵列中的颗粒个数的比例(％)而算出的。
图6是表示本发明的其他实施例中，抗生蛋白链菌素的浓度与捕捉到抗生蛋白链菌素的颗粒个数的比例的关系的图表。图6中，图表a表示理论值，圆点表示实验值，虚线围成的圆圈表示实验值的平均值(N＝2～3)。图表b表示利用直线取实验值的平均值的近似值而得的图表。
如图6所示，理论值与实验值几乎重合，所以表示本实施例的方法的定量性较高，可以准确测定靶分子的浓度。根据以上结果可以看出，本实施例的方法即使是0.1aM左右的浓度也可以充分检测出。
[实施例3]
使用实施例1中所制作的流槽结构的阵列，利用所述方法将颗粒溶液(6.5×106颗粒/30μL)导入(载入)阵列中，将其封入(捕获在)液滴中。计算出此时的捕获效率(被捕获的颗粒个数相对于载入的颗粒个数的比例(％))。
将其结果示于图8。图8是表示使用具有流槽结构的阵列时(实施例3)与使用不具有流槽结构的阵列时(比较例2)的颗粒的捕获效率的图。
[比较例2]
本比较例中，使用不具有流槽结构的阵列(仅由所述亲水/疏水压花玻璃所构成的阵列)，进行颗粒(Φ＝3μm的氨基颗粒；micromer-NH2-3μm；micromod公司制造)的封入。
利用下述所示的方法，使用稀释成与使用具有流槽结构的阵列时(实施例3)相同浓度(2.2×108颗粒/mL＝6.5×106颗粒/30μL)的颗粒溶液，将颗粒封入亲水/疏水压花玻璃中。
(1)利用缓冲剂(100mM KPi buffer(PH值＝7.5)，1mM的MgCl2，2μL/mL的2-mercaptethanol)将颗粒稀释成2.2×108颗粒/mL。
(2)将亲水/疏水压花玻璃(利用所述方法所制作的玻璃)接著到培养皿(35mm培养皿；Becton Dickinson公司制造)的底面上。作为接著剂，使用了Araldite AR-R30(NICHIBAN公司制造)。
(3)用颗粒溶液500μL覆盖在亲水/疏水压花玻璃上。
(4)除气后，培养5分钟。
(5)在亲水/疏水压花玻璃上载入2mL的FC40(Fluorinert(注册商标)FC40，SIGMA公司制造)，封入颗粒。
(6)为了防止液滴的蒸发，用水覆盖在油相上。
其后，对封入液滴中的颗粒个数进行计数，计算出捕获效率(被捕获的颗粒个数相对于载入的颗粒个数的比例(％))。
将其结果示于图8。如图8所示，使用具有流槽结构的阵列时的捕获效率为使用不具有流槽结构的阵列时捕获效率的25倍以上。一般认为，使用不具有流槽结构的阵列时，在高度方向上可以散射的距离增加，所以颗粒不易接近基板。
另外，使用不具有流槽结构的阵列时，必须利用颗粒溶液覆盖阵列的基板的整个面，因此需要大量的颗粒溶液(使用具有流槽结构的阵列时的约16倍)。因此，如果使用具有流槽结构的阵列，那么可以利用少量的颗粒溶液而高效地封入颗粒。
[产业上的可利用性]
本发明可很好地适用于用来检测低浓度的靶分子的方法、阵列、装置等。

Claims (12)

1.一种颗粒封入方法，其特征在于包括：颗粒导入步骤，其是向下层部与上层部之间的空间导入包含颗粒的亲水性溶剂，该下层部中形成有多个仅可以收容1个所述颗粒的收容部，多个所述收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，该上层部与该下层部的形成有所述收容部的面相对向；
疏水性溶剂导入步骤，其在所述颗粒导入步骤之后向所述空间导入疏水性溶剂。
2.根据权利要求1所述的颗粒封入方法，其特征在于还包括：在所述颗粒导入步骤之后、所述疏水性溶剂导入步骤之前，对所述空间内进行除气的除气步骤。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒封入方法，其特征在于：所述亲水性溶剂是选自由水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈系溶剂、二甲基亚砜及N，N-二甲基甲酰胺所组成的群中的至少1种，或是含有选自由水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈系溶剂、二甲基亚砜及N，N-二甲基甲酰胺所组成的群中的至少1种的混合物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的颗粒封入方法，其特征在于：所述疏水性溶剂是选自由饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅酮油、全氟碳、卤素系溶剂及疏水性离子液体所组成的群中的至少1种，或是含有选自由饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅酮油、全氟碳、卤素系溶剂及疏水性离子液体所组成的群中的至少1种的混合物。
5.一种检测靶分子的方法，其特征在于包括：
反应步骤，使特异性地捕捉靶分子的颗粒与该靶分子进行反应；
颗粒封入步骤，在所述反应步骤之后，使用所述颗粒进行权利要求1至4中任一项所述的颗粒封入方法；
检测步骤，在所述颗粒封入步骤之后，检测各所述收容部是否收容了捕捉到所述靶分子的颗粒。
6.根据权利要求5所述的检测靶分子的方法，其特征在于：在所述颗粒上结合有能与所述靶分子特异性地结合的分子。
7.一种阵列，其特征在于：其具备下层部及上层部，
所述下层部中形成有多个收容部，该多个收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，
所述上层部与所述下层部的形成有所述收容部的面以隔着空间的方式而相对向。
8.根据权利要求7所述的阵列，其特征在于：各所述收容部的底面为亲水性。
9.根据权利要求7或8所述的阵列，其特征在于：所述上层部的与所述下层部相对向的面为疏水性。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的阵列，其特征在于：在所述上层部及所述下层部的至少一方上形成有用来将流体导入所述空间中的贯通孔。
11.一种试剂盒，其特征在于：其具备权利要求7至10中任一项所述的阵列、及颗粒，且各所述收容部仅可以收容1个所述颗粒。
12.一种靶分子检测装置，其特征在于：其具备权利要求7至10中任一项所述的阵列、及
检测当收容了捕捉到靶分子的颗粒时从各所述收容部发出的光的图像传感器。
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