CN110476067A - 微小物质检测方法及微小物质检测用装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：作为能够利用简易操作将核酸、蛋白质、病毒及细胞等检测对象物质封入极小容积的液滴中进行高灵敏度检测的技术，检测容纳于互相分开形成的多个容器内的微小物质的方法，其包括：(1)将包含上述微小物质的溶剂导入到下层部与上层部之间的空间的步骤，所述下层部中形成有所述容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对；以及(2)将气体导入上述空间，在上述容器内形成包含上述微小物质的溶剂的液滴的步骤；以及(3)光学、电和/或磁性检测在上述液滴内存在的上述微小物质的步骤。

Description

微小物质检测方法及微小物质检测用装置
技术领域
本发明涉及微小物质检测方法及微小物质检测用装置。更具体而言，涉及在基板上互相分开形成的多个容器内形成封入微小物质的微小的液滴，光学、电和/或磁性检测该液滴内存在的微小物质的方法等。
背景技术
为了进行疾病、传染病等的诊断，因此，要求用于迅速、简便，且高灵敏度地检测核酸、蛋白质、病毒及细胞等的标记的技术。例如，从在体积1mm3的肿瘤中包含的100万个癌症细胞将标记蛋白(从各细胞各100分子)分泌到5L的血中的情况下，标记蛋白的血中浓度为30aM左右。要求对这样的浓度非常低的物质也能够检测的技术。
作为这样的技术，存在“单分子酶测定”：其将核酸、蛋白质、病毒及细胞等检测对象物质封入极小容积的液滴中，通过使用了标记抗体的免疫学手段进行检测。利用单分子酶测定，能够将检测对象物质以一分子单位的灵敏度进行检测。
在专利文献1中，作为能够应用于单分子酶测定的技术，公开了“一种颗粒封入方法，其特征在于包括：颗粒导入步骤，其是向下层部与上层部之间的空间导入包含颗粒的亲水性溶剂，该下层部中形成有多个仅可以收容1个所述颗粒的收容部，多个所述收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，该上层部与该下层部的形成有所述收容部的面相对向；疏水性溶剂导入步骤，其在所述颗粒导入步骤之后向所述空间导入疏水性溶剂”。
专利文献1所公开的技术，使用了“一种阵列，其特征在于：其具备下层部及上层部，所述下层部中形成有多个收容部，该多个收容部被具有疏水性的上表面的侧壁互相隔开，所述上层部与所述下层部的形成有所述收容部的面以隔着空间的方式而相对向”，其使用的是具有下层部和上层部隔着空间相对的流通池结构的阵列。根据该技术，认为“可以将大量颗粒高效地封入阵列中，因此能够以高灵敏度检测出低浓度的靶分子”。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2012/121310号
专利文献2：日本特开2004-309405号
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的主要目的在于提供用于利用简易的操作，将核酸、蛋白质及病毒等检测对象物质封入极小容积的液滴中，能够进行高灵敏度的检测的技术。
解决问题的方法
为了解决上述课题，本发明提供以下[1]～[20]。
[1]检测微小物质的方法，所述微小物质容纳于互相分开形成的多个容器内，其包括：
(1)将包含上述微小物质的溶剂导入到下层部与上层部之间的空间的步骤，所述下层部中形成有所述容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，以及
(2)将气体导入上述空间，在上述容器内形成包含上述微小物质的溶剂的液滴的步骤，以及
(3)光学、电和/或磁性检测在上述液滴内存在的上述微小物质的步骤。
[2]基于生色底物的吸光度变化和/或荧光的光学检测微小物质的方法，所述微小物质容纳于互相分开形成的多个容器内，其包括：
(1)将包含上述微小物质的溶剂导入到下层部与上层部之间的空间的步骤，所述下层部中形成有所述容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，以及
(2)将气体导入上述空间而用气体置换该空间内的上述溶剂，在容器内形成包含上述微小物质的溶剂的液滴的步骤，以及
(3)检测在上述液滴内存在的上述生色底物的吸光度变化和/或荧光的步骤。
[3]根据[1]或[2]的方法，其包括抑制上述液滴的蒸发的手段。
[4]根据[3]的方法，其中，上述容器的高宽比为1以上。
[5]根据[3]的方法，其中，在上述步骤(2)的前部分，进一步包括使上述气体与水接触的步骤。
[6]根据[3]的方法，其中，在上述下层部形成有：能够在内部保持上述溶剂，其内容积大于上述容器的内容积的贮器。
[7]根据[3]的方法，其中，上述步骤(2)及步骤(3)在湿润环境中进行。
[8]根据[3]的方法，其中，上述溶剂包含高水合性物质。
[9]物质检测用装置，其具备：基板，其具备下层部和上层部，其中，所述下层部中形成有互相分开形成的多个能够容纳微小物质的容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，
送液部，其将溶剂导入在该基板的上述下层部与上述上层部之间的空间，
将气体导入该空间的送气部，以及
光学、电和/或磁性检测在上述容器内存在的上述微小物质的检测器。
[10]根据[9]的装置，其具备抑制上述液滴的蒸发的手段。
[11]根据[10]的装置，其中，上述容器的高宽比为1以上。
[12]根据[10]的装置，其中，上述送气部具备使上述气体与水接触的储器。
[13]根据[10]的任一种装置，其中，上述基板在上述下层部具备：能够在内部保持上述溶剂，其内容积大于上述容器的内容积的贮器。
[14]根据[10]的装置，其具备将上述基板保持在湿润环境中的腔室。
[15]物质检测用装置，其能够搭载基板，所述基板具备下层部和上层部，其中，所述下层部中形成有互相分开形成的多个能够容纳微小物质的容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，
所述装置具备：
所述装置具备：
送液部，其将溶剂导入在该基板的上述下层部与上述上层部之间的空间，
将气体导入该空间的送气部，以及
光学、电和/或磁性检测在上述容器内存在的上述微小物质的检测器。
[16]根据[15]的装置，其具有抑制上述液滴的蒸发的手段。
[17]根据[16]的装置，其中，上述容器的高宽比为1以上。
[18]根据[16]的装置，其中，上述送气部具备使上述气体与水接触的储器。
[19]根据[16]的装置，其中，上述基板在上述下层部具备：能够在内部保持上述溶剂，其内容积大于上述容器的内容积的贮器。
[20]根据[16]的装置，其具备将上述基板保持在湿润环境中的腔室。
发明的效果
根据本发明，可提供用于利用简易的操作，将核酸、蛋白质及病毒等检测对象物质封入极小容积的液滴中，能够进行高灵敏度的检测的技术。
附图简单说明
[图1-1]说明本发明涉及的物质检测方法的步骤的图。
[图1-2]说明本发明涉及的物质检测方法的步骤的图。
[图2]用于说明基于在病毒的颗粒表面存在的酶与生色底物的反应而成的反应产物的图。
具体实施方式
以下，参考附图对用于实施本发明的优选形态进行说明。需要说明的是，以下说明的实施方式仅为示出本发明的代表的实施方式的一个实例，并不意在解释为使本发明的范围变窄。
在本发明涉及的物质检测方法中，包括以下步骤(A)～(C)。
(A)将包含微小物质的溶剂导入到阵列下层部与阵列上层部之间的空间的步骤，所述阵列下层部为其中形成容器的阵列下层部，所述阵列上层部在该下层部中与在该容器形成的面相对(物质导入步骤)。
(B)将气体导入上述空间而用气体置换该空间内的上述溶剂，并在容器内形成包含上述微小物质的溶剂的液滴的步骤(物质容纳步骤)。
(C)光学、电和/或磁性检测在上述液滴内存在的上述微小物质的步骤(检测步骤)。
以下，对本发明涉及的物质检测方法的各步骤进行说明。
[检测对象物质]
在本发明涉及的物质检测方法等中，对作为检测对象的微小物质(微观小体(microscopic body)，以下也称为“靶标物质”)而言，只要是容器能够容纳的大小的物质即可，没有特别限定。靶标物质可以为：核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体，以及病毒等。靶标物质优选为能够作为各种疾病或传染病的标记的核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体。
在核酸中，包括DNA及RNA等天然核酸及LNA及PNA等人工核酸，也包括它们的聚合物。
靶标物质可以为被保持在载体上的那些。作为载体，广泛使用了微珠。在本发明中，“微珠”与“颗粒”以同义使用，为本技术领域中常用的技术。对微珠的形状没有特别限定，通常制成球形。对微珠的材料也没有特别限定，可以为玻璃、硅胶、聚苯乙烯、聚丙烯、膜及磁性材料等。作为具体材料，可列举：纤维素、纤维素衍生物、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、乙烯与丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯等交联而成的聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、乳胶凝胶、聚苯乙烯葡聚糖、橡胶、硅、塑料、硝酸纤维素、纤维素、天然海绵、硅胶、玻璃、金属塑料、纤维素、交联葡聚糖(Sephadex(商标))及琼脂糖凝胶(Sepharose(商标))等。对珠而言，可以为多孔性的。珠的平均粒径优选为5μm以下，例如1μm～4μm左右。需要说明的是，平均粒径可以使用例如电子显微镜观察或动态光散射法而测定。
[阵列]
用于本发明涉及的物质检测方法的装置的阵列1(参考图1(A))，其包含形成有容纳靶标物质的多个容器112的下层部1a、和与下层部1a相对的上层部1b。下层部1a和上层部1b以夹着空间1c的方式相对。各容器112利用侧壁113而被互相分开。各容器112在侧壁113与侧壁113之间具有与空间1c相接的开口。多个容器112沿阵列1的下层部1a的面方向配置，能够从它们的开口将靶标物质捕获到容器112内。
阵列1可使用玻璃制基板层的湿式蚀刻、干式蚀刻，或塑料制基板层的纳米压印、注射成型、切削加工等公知的技术而成型。对阵列1的材质而言，在对靶标物质进行光学检测的情况下，设为具有光透过性的材质，例如设为：玻璃、各种塑料(PP、PC、PS、COC、COP、PDMS等)。对阵列1的材质而言，为了自体荧光小、波长分散小，优选选择光学误差少的材质。
对下层部1a与上层部1b的相对面之间的距离(空间1c的高度)，没有特别限定，为10μm～100μm左右。
容器112设为能容纳靶标物质的大小(容积)及形状。对容器112的大小而言，靶标物质为核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体；病毒中的任一种的情况下，例如：底面的直径为0.1μm～10μm左右，高度(深度)为0.1μm～10μm左右，以容积计为1×10-21升～1×10-18升左右。对孔11的形状而言，从成型的容易程度的观点出发，优选为圆柱形或者棱柱形。
并且，为了进行在后述的物质容纳步骤中的液滴形成，对容器112而言，其高宽比的值设为1以上、优选为1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.4以上、更优选为1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上、进一步优选为2.0以上、2.1以上、2.2以上、2.3以上、2.4以上或大于2.5。
另外，高宽比可设为1～2.5、优选为1.5～2.5，更优选为2.0～2.5。
高宽比是指在容器112的底面的直径(在容器112为圆柱形或长方体的情况下，与开口的直径相同)设为d，高度设为t的情况下，由t/d定义的比率。这里，在容器112的底面为椭圆形或长方形等的情况下，直径d作为指该底面的长度方向的直径。另外，深度t作为指容器112的最大深度。
[物质导入步骤]
首先，将包含靶标物质3的第一溶剂S1导入空间1c(参考图1(A))。
在此，对与靶标物质3一起，导入用于对靶标物质3进行基于吸光度变化和/或荧光的光学检测的生色底物4的例子进行说明。
第一溶剂S1可以为用于溶解或悬浊靶标物质3及生色底物4的适当溶剂，可以使用在检测核酸、蛋白质、糖、脂质及它们的复合体，及病毒等时通常使用的溶剂。第一溶剂S1可以为选自例如：由水、醇、醚、酮、腈类溶剂、二甲亚砜(DMSO)、及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)组成的组中的至少1个或包含它们的混合物等，优选为水。作为醇，可列举例如：乙醇、甲醇、丙醇、甘油等。作为醚，可列举例如：四氢呋喃、聚氧乙烯、1，4-二噁烷等。作为酮，可列举例如：丙酮、甲乙酮等。作为腈类溶剂，可列举例如：乙腈等。
第一溶剂S1可以包含缓冲物质。作为缓冲物质，没有特别限定，可与荧光染料的pKa配合而使用MES(2-吗啉代乙磺酸)、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)、PIPES(哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)等所谓Good′s缓冲液(Good′s Buffer)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、DEA(二乙醇胺)等。
另外，第一溶剂可以包含表面活性剂。通过包含表面活性剂，由此第一溶液S1变得易于被导入溶液导入到空间11a及容器112内。作为表面活性剂，没有特别限定，例如可列举：TWEEN20(CAS编号：9005-64-5，单月桂酸聚氧乙烯山梨糖醇酐)及Triton X-100(CAS编号：9002-93-1，统称聚乙二醇单-4-辛基苯基醚(n≈10))等。对在第一溶剂20中的表面活性剂的添加浓度没有特别限定，优选为0.01～1％。
进一步，作为表面活性剂，可以广泛使用：阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂、天然来源的表面活性剂等。
作为阴离子性表面活性剂，例如分类为：羧酸型、硫酸酯型、磺酸型、磷酸酯型。其中，具体而言，可列举例如：十二烷基硫酸钠、月桂酸钠、α-磺脂肪酸甲酯钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基乙氧基硫酸钠等，其中，优选使用十二烷基苯磺酸钠。
作为阳离子性表面活性剂，例如分类为：季铵盐型、烷基胺型、杂环胺型。具体而言，可列举例如：硬脂基三甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、氯化十六烷基吡啶、十二烷基二甲基苄基氯化铵等。
作为非离子表面活性剂，可列举例如：聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯单脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、烷基多糖苷、N-甲基烷基葡糖酰胺等。其中，优选：十二烷基醇乙氧基化物、壬酯苯酚乙氧基化物、月桂酰二乙醇酰胺，除此以外，以Triton X(Triton X-100等)、Pluronic(注册商标)(Pluronic F-123、F-68等)、Tween(Tween 20、40、60、65、80、85等)、Brij(注册商标)(Brij35、58、98等)、Span(Span 20、40、60、80、83、85)的名字市售的那些。
作为两性表面活性剂，有例如：月桂基二甲基氨基乙酸甜菜碱、十二烷基氨基甲基二甲基磺丙基甜菜碱、3-(十四烷基二甲基氨基)丙烷-1-磺酸盐等，优选使用3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)等。
作为天然来源的表面活性剂，优选为例如：卵磷脂、皂素，在被称为卵磷脂的化合物中，具体而言，优选为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油等。另外，作为皂素，优选皂树(Quillaja)皂素。
包含靶标物质3和生色底物4的第一溶剂S1，例如可以从设于上层部1b而与空间1c连接的进口注入。需要说明的是，在空间1c的进口连接侧的相反侧，可以连接将溶剂及气体排出的出口。导入到空间1c中的第一溶剂S1，通过毛细管现象进入下层部1a与上层部1b之间，填充到空间1c(参考图1(B))。由此，靶标物质3和生色底物4被导入到容器112内。
在第一溶剂S1中的靶标物质3的浓度较低的情况下，在各容器112中，靶标物质3成为被1分子导入或完全没有被导入中的一种情况。另外，在第一溶剂S1中的靶标物质3的浓度更高的情况下，在各容器112中，能够导入2分子以上的靶标物质3。
一方面，生色底物4优选以与靶标物质3的浓度相比足够高的浓度包含在第一溶剂S1中。因此，生色底物4，在几乎全部的容器112中导入了1分子或者2分子以上。
本发明涉及的物质检测用装置，除了阵列1以外，任选包含向空间1c导入第一溶剂S1的送液部。对送液部而言，包含供给第一溶剂S1的储器、和连接该储器与上述进口的管及泵等。
本发明涉及的物质检测用装置，阵列1及上述送液部除了以外，可以包含温度调节器。温度调节器，可以为能够利用帕尔帖元件、焦耳-汤姆逊元件等控制阵列1的温度的加热块。
[物质容纳步骤]
接着，将气体G导入空间1b(参考图1(C))。气体G可以从与第一溶剂S1相同或不同的进口注入，从与第一溶剂S1相同或不同的出口排出。本发明涉及的物质检测用装置，除了阵列1、上述送液部以外，任选包含向空间1c导入气体G的送气部。对送气部而言，包含供给气体G的储器、和连接该储器与上述进口的管及泵等。
对气体G而言，可以在本步骤的环境温度(没有特别限定，为室温即可)中为气体，没有特别限定，可以优选使用例如空气或氮气。
导入到空间1c的气体G，在置换填充在空间1c内的第一溶剂S1的同时进入空间1c。由此，在容器112内，形成包含生色底物4的第一溶剂S1的液滴D(参考图1(C))。在容器112中形成的液滴D中的一定的比例中，与生色底物4一起封入了靶标物质3。
需要说明的是，气体G的导入，可以通过从进口压入气体G的方法进行，也可以通过从出口施加负压而从进口导入气体G这样的方法进行。在这种情况下，也可以为利用将进口开放的状态下对出口施加负压，由此从进口导入空气的方式。进一步，也可以为在处于将进口开放的状态的基础上，对于阵列1赋予从进口朝向出口的方向的离心力，由此将填充在空间1c内的第一溶剂S1从出口排出并且从进口导入空气的方式。作为这样的赋予离心力的方法，可列举将基板1装载于旋转板上的方法。
在本步骤中，为了易于将第一溶剂S1保持在容器112内，促进液滴D形成，或为了抑制已形成的液滴D的蒸发，容器112的高宽比为1以上、优选为1.1以上、1.2以上、1.3以上、1.4以上、更优选为1.5以上、1.6以上、1.7以上、1.8以上、1.9以上、进一步优选为2.0以上、2.1以上、2.2以上、2.3以上、2.4以上或者大于2.5。
另外，高宽比可设为1～2.5、优选为1.5～2.5、更优选为2.0～2.5。
如果高宽比小于该范围，则可能会连容器112内的第一溶剂S1也被气体G置换，或已形成的液滴D由于蒸发而损失，从而液滴D的形成效率降低。需要说明的是，可以通过将深度变得大于向容器112的空间1c的开口直径，由此易于将第一溶剂S1保持在容器112内。
为了促进液滴D的形成、或对已形成的液滴D的蒸发进行抑制而进行保持，优选在本步骤的前部分进行使气体G与水接触的步骤。通过使气体G与水接触而预先提高向空间1c导入的气体G的水蒸气饱和度，能够对保持在容器112内的第一溶剂S1的蒸发进行抑制而促进液滴D的形成，并且对已形成的液滴D的蒸发进行抑制。
存在以下的可能性：干燥空气促进溶剂的蒸发，饱和空气使性能变得不稳定。因此，在本发明中，使给定的操作基本在常温附近进行，在利用相对湿度对气体中包含的水分进行定义的情况下，优选使为约50～80％左右。
本发明涉及的物质检测用装置优选在送气部具备使气体G与水接触的储器。
另外，为了抑制保持在容器112内的第一溶剂S1的蒸发及已形成的液滴D的蒸发，也优选将空间1c的水蒸气饱和度保持较高。为此，预先在下层部1a形成能够在内部保持第一溶剂S1，其内容积大于容器112的内容积的贮器能够起效。通过设置贮器，在物质导入步骤中被导入到贮器内的第一溶剂S1，能够作为用于提高本步骤中空间1c的水蒸气饱和度的水供给源(液池)发挥功能。对贮器而言，可以在下层部1a中，在对靶标物质3的检测不造成影响的区域设1个或2个以上。
进一步，为了抑制保持在容器112内的第一溶剂S1的蒸发及已形成的液滴D的蒸发，将本步骤及以下检测步骤在湿润环境中进行也能够起效。为此，本发明涉及的物质检测用装置优选具备用于将基板1保持在内部而保持在湿润环境中的腔室。
为了保持在容器112内的第一溶剂S1的蒸发及已形成的液滴D的蒸发，在第一溶剂S1为水的情况下，也可以向其中添加高水合性的物质。通过高水合性物质保持水，由此能够抑制第一溶剂S1的蒸发。
对高水合性物质而言，只要在后述的检测步骤中，对靶标物质3的光学性、电性和/或磁性检测不造成影响即可，没有特别限制，可优选使用例如：琼脂糖及丙烯酰胺等凝胶；聚乙二醇及纤维素等亲水性高分子；以及甘氨酸、甜菜碱、山梨糖醇、蔗糖、甘露醇、海藻糖及尿素等渗透剂等。这些高水合性物质在第一溶剂S1中的添加浓度，例如为0.1～5％左右、优选为0.5～2％左右。
以下检测步骤中，对液滴D内存在的靶标物质3进行光学、电和/或磁性检测。在此说明的例子，是通过对生色底物4的吸光度变化和/或荧光进行检测而对靶标物质3进行光学检测的，更具体而言，是将靶标物质3为在表面或内部具有相对于生色底物4的底物切割活性的酶的病毒、而生色底物4为利用该酶切割而使作为生色团的反应产物游离的物质的情况为例进行说明的。其中，生色底物4只要是在与酶发生反应后生成具有与反应前不同的光学特性的反应产物的那些即可，可以为在反应前后吸光度、旋光度发生变化的物质、在反应后变得呈现荧光的物质。
作为这样的病毒与酶的组合，可例示以下。
[表1]
冠状病毒 血凝素酯酶
SARS病毒 血凝素酯酶
MARS病毒 血凝素酯酶
流感病毒 神经氨酸酶
腮腺炎病毒(腮腺炎感冒) 神经氨酸酶
麻疹病毒 神经氨酸酶
尼帕病毒 神经氨酸酶
犬瘟热病毒 神经氨酸酶
在容器112中已形成的液滴D中，进行在极小容积中共存的靶标物质3(病毒)的颗粒表面或内部存在的酶与生色底物4的反应，生成反应产物。参考图2进行详细说明。在病毒的颗粒表面或内部中存在酶31(图中示出酶31存在于病毒表面的情况)。生色底物4与酶31发生接触而反应时，生成反应产物6。反应产物6显示与生色底物4不同的光学特性，显示吸光度、旋光度的移位、荧光(或发光)。
利用酶31与生色底物4的反应而在液滴D的极小容积(10-21升～10-18升的级别)中生成、蓄积反应产物6。进一步，由于液滴D不与其它溶剂、溶液和界面接触，因此，液滴D中生成、蓄积的反应产物6不发生从液滴D中的漏出。根据这些，使得反应产物6的生成迅速进行直至能够在下个检测步骤检测出的浓度为止，因此，使得能够实现在检测步骤中反应产物6的高灵敏度检测。
病毒为流感病毒(参考表1)，生色底物4使用4-甲基伞形酮-α-D-神经氨酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid：4MU-NANA)的情况为例进行进一步具体说明。
在流感病毒的颗粒表面存在神经氨酸苷酶(酶31)。4MU-NANA(生色底物4)与神经氨酸苷酶接触而反应时，生成作为源自基于4MU-NANA的神经氨酸苷酶的水解而呈现荧光的生色团的4-甲基伞形酮(反应产物6)。4-甲基伞型酮在液滴D的极小容积中进行蓄积，蓄积的4-甲基伞型酮发出增强的荧光。
需要说明的是，对于反应产物6而言，虽然也是在本步骤前如果在第一溶剂S1中生色底物4与酶31发生接触则能够生成的物质，但在本步骤中形成包含靶标物质3和生色底物4的第一溶剂S1的液滴D前，生成的反应产物6并不在极小容积中蓄积。因此，在反应产物6的检测中，在本步骤前生成的反应产物6的影响小到了可以忽视的程度。
[检测步骤]
在本步骤中，对液滴D内存在的靶标物质3进行光学、电和/或磁性检测(参考图1(D))。在此说明的具体例中，通过对在液滴D内生成的反应产物6(4-甲基伞型酮)发出的荧光进行检测，而检测作为靶标物质3的流感病毒。
光学检测能够利用检测器7进行，所述检测器7具备：光源、将来自光源的光聚光至容器112内且将从容器112内产生的光聚光至传感器的光学路径、和传感器。本发明涉及的物质检测用装置，除了阵列1、上述送液部、及上述送气部以外，可以包含检测器7。来自光源的光从阵列1的下方侧(与孔11的开口面为相反面侧)照射至容器112内，从容器112内产生的光也从同侧进行聚光。在光源与阵列1之间、及阵列1与CMOS图像传感器等传感器之间，配置有通常使用的透镜、滤波片等。
另外，本发明涉及的微小物质检测用装置中，可以包含控制阵列1的温度的温度调节器。在温度调节器中，可采用专利文献2中公开的加热机构或温度调节机构。温度调节器，可以为例如利用帕尔帖元件、焦耳-汤姆逊元件等能控制温度的加热块。
如上所述，对于反应产物6而言，虽然也是在物质容纳步骤前可能在第一溶剂S1中生成的物质，但对在物质容纳步骤前生成的反应产物6中的多数而言，在物质容纳步骤中利用气体G将第一溶剂S1置换的同时被除到外部。因此，在本步骤中的反应产物6的检测中，在物质容纳步骤前生成的反应产物6并不成为噪声，能够选择性地检测出来自在液滴D的极小容积中生成、蓄积的反应产物6的信号。
在物质导入步骤中的第一溶剂S1中的靶标物质3的浓度比较高的情况下，在各液滴D中，可以导入2分子以上的靶标物质3。在这种情况下，进行液滴D中的4-甲基伞型酮(反应产物6)的荧光检测，使用获得的荧光强度和预先制作的规定荧光强度与神经氨酸苷酶活性的关系的标准曲线，从而计算出神经氨酸苷酶的酶活性。进一步，使用算出的酶活性预先制作的规定酶活性与病毒颗粒数的关系的标准曲线，从而进行有无流感病毒的存在的判定或者颗粒数的定量(类似物定量)。由此，能够检测作为靶标物质3的流感病毒，也可以定量地确定病毒量。
另一方面，在第一溶剂S1中，靶标物质3被稀释至足够低的浓度的情况下，进入1个容器112中的靶标物质3的数量可以为0或最大为1。在这种情况下，也可以使用检测到靶标物质3的容器112的数量，与没有检测到靶标物质3的容器112的数量的比率，基于预先制作的规定第一溶剂S1中的靶标物质3的浓度与该比率的关系的标准曲线，确定靶标物质3的浓度(数字化定量)。
在物质容纳步骤中，由于在第一溶剂S1的液滴D中能够将反应产物6蓄积至高浓度，因此，即使在作为靶标物质3的病毒仅有1个颗粒进入容器112的情况下，也能够以高灵敏度进行反应产物6的检测。因此，根据本发明涉及的物质检测方法，即使是病毒等极其微量的靶标物质3也能够以高灵敏度检测，能够实现高精度地确定其存在量。
根据本实施方式，能够实现具有多个孔11及容器112的大面积的阵列1。例如，即使是具有100万个以上的容器112的阵列1，也能够有效地将靶标物质3容纳在各容器112中。因此，本实施方式能够高灵敏度地检测靶标分子3，因此，即使是10aM左右的非常低浓度的靶标分子3也能够实现检测，能够应用于例如数字ELISA、ELISA-PCR等应用中。
符号说明
1：阵列、1a：下层部、1b：上层部、1c：空间、112：容器、113：侧壁、3：靶标物质、4：生色底物、6：反应产物、7：检测器、D：液滴、G：气体、S1：第一溶剂。

Claims (20)

1.检测微小物质的方法，所述微小物质容纳于互相分开形成的多个容器内，其包括：
(1)将包含所述微小物质的溶剂导入到下层部与上层部之间的空间的步骤，所述下层部中形成有所述容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，以及
(2)将气体导入所述空间，在所述容器内形成包含所述微小物质的溶剂的液滴的步骤，以及
(3)光学、电和/或磁性检测在所述液滴内存在的所述微小物质的步骤。
2.基于生色底物的吸光度变化和/或荧光的光学检测微小物质的方法，所述微小物质容纳于互相分开形成的多个容器内，其包括：
(1)将包含所述微小物质的溶剂导入到下层部与上层部之间的空间的步骤，所述下层部中形成有所述容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，以及
(2)将气体导入所述空间而用气体置换该空间内的所述溶剂，并在容器内形成包含所述微小物质的溶剂的液滴的步骤，以及
(3)检测在所述液滴内存在的所述生色底物的吸光度变化和/或荧光的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括抑制所述液滴的蒸发的手段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述容器的高宽比为1以上。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述步骤(2)的前部分，进一步包含使所述气体与水接触的步骤。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，在所述下层部形成有：能够将所述溶剂保持在内部，其内容积大于所述容器内容积的贮器。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(2)及步骤(3)在湿润环境中进行。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，所述溶剂包含高水合性物质。
9.物质检测用装置，其具备：
基板，其具备下层部和上层部，其中所述下层部中形成有互相分开形成的多个能够容纳微小物质的容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，
送液部，其将溶剂导入在该基板的所述下层部与所述上层部之间的空间，
送气部，其将气体导入该空间，以及
检测器，其光学、电和/或磁性检测在所述容器内存在的所述微小物质。
10.根据权利要求9所述的装置，其具有抑制所述液滴的蒸发的手段。
11.根据权利要求10所述的装置，其中，所述容器的高宽比为1以上。
12.根据权利要求10所述的装置，其中，所述送气部具备使所述气体与水接触的储器。
13.根据权利要求10所述的装置，其中，所述基板在所述下层部具备：能够将所述溶剂保持在内部，其内容积大于所述容器内容积的贮器。
14.根据权利要求10所述的装置，其具备将所述基板保持在湿润环境中的腔室。
15.物质检测用装置，其能够搭载基板，所述基板具备下层部和上层部，其中所述下层部中形成有互相分开形成的多个能够容纳微小物质的容器，所述上层部与所述下层部中形成所述容器的面相对，
所述装置具备：
送液部，其将溶剂导入在该基板的所述下层部与所述上层部之间的空间，
送气部，其将气体导入该空间，以及
检测器，其光学、电和/或磁性检测在所述容器内存在的所述微小物质。
16.根据权利要求15所述的装置，其具有抑制所述液滴的蒸发的手段。
17.根据权利要求16所述的装置，其中所述容器的高宽比为1以上。
18.根据权利要求16所述的装置，其中所述送气部具备使所述气体与水接触的储器。
19.根据权利要求16所述的装置，其中所述基板在所述下层部具备：能够将所述溶剂保持在内部，其内容积大于所述容器内容积的贮器。
20.根据权利要求16所述的装置，其具备将所述基板保持在湿润环境中的腔室。
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