JP5927246B2 - 感知のための固定化生物層の形成 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本発明は、２００７年１２月２０日に出願された、共に係属中の米国特許出願第１１／９６１，５５０号に対し優先権を主張し、この全内容および開示は参照により本明細書に組み入れられる。

固定化生物層を製造するための装置および方法を開示する。ポイントオブケア臨床診断分野およびそれ以外の環境において、液体試料中の分析物を感知するために、その技術を使用することができる。固定化生物層の形成ための硬化可能な物質組成物もまた、開示する。

生物流体中の生物学的に重要な分析物種の測定のための小型センサの開発が、特に現場または家庭でのそのような分析種の測定を可能にするますます小型化された装置が必要とされているため、ますます重要になっている。センサ作製の分野における進歩にもかかわらず、そのようなセンサの小型化および作製における大きな課題が依然として存在する。１つのそのような課題は、生物活性分子を含む商業的に実現可能なセンサの大規模製造に関連する複雑度である。主要な関心事は、既存の半導体製造法に本来伴う厳しい物理および化学過程の、感応性化合物および不安定な生物活性分子（どちらも機能する生物センサの一部を占める）との適合性である。そのようなセンサの小型化および作製を取り巻く別の主要な関心事は、高感度で、大量に、高い再現性で製造することができるセンサの作製である。したがって、センサで使用される生物活性分子の感度を考慮するセンサを形成するための過程が必要とされ、ならびにセンサが大量に製造される場合の均一性の高いセンサが必要とされる。

本発明は、生物流体中の生物学的に重要な分析物種の測定のためのセンサにおいて使用するための固定化生物層の製造のための装置および方法を提供する。方法および装置は、大規模製造ロット全体でより均一な性能特性を有する装置を製造するのを助ける。本方法および装置の別の貴重な特徴は、液体、例えば、検量流体、対照流体および血液と接触する際に、大幅な耐膨潤性を有する生物層を提供することである。いずれの特定の理論にも縛られないが、該方法および装置を使用して製造した生物層は、層内にかなりのレベルの架橋が存在するので、耐膨潤性を有すると考えられる。このように膨潤に耐える膜は、かなりの膨潤を示す生物層が一貫性のない信号を与え、表面から剥離さえする可能性があるので、センサの動作に対して望ましいことが見出されている。

１つの態様では、本発明は、（ａ）１つ以上の酵素と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを水性混合物中で含む実質的に均質な水性混合物を形成させる工程と、（ｂ）ベースセンサを被覆するのに十分な、制御された体積の前記混合物をベースセンサに適用する工程と、（ｃ）前記適用された体積の混合物を十分なＵＶ放射に曝露させ、前記ベースセンサに接着された固定化酵素層を形成させる工程とを含む、センサを形成する方法に関する。

必要に応じて、酵素は、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、クレアチナーゼ、クレアチニナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、カタラーゼ、炭酸脱水酵素、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ピリドキサールオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。モノマは、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクレートおよびそれらの組み合わせから選択することができる。有機光開始剤は、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（請求項８に対する挿入手段）およびそれらの組み合わせから選択することができる。架橋剤は、必要に応じて、１，４−ビスアクリロイルピペラジン、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジアクリレート、（＋）−Ｎ，Ｎ’−ジアリル酒石酸アミドおよびそれらの組み合わせから選択される。ベースセンサは必要に応じて、電極、イオン選択性電極、電位差測定電極、電流測定電極、電気伝導度測定電極、酵素電極、バイオセンサ、光センサ、光ファイバセンサ、表面弾性波センサ、エバネセントセンサ、表面プラズモン共鳴センサおよび光導波路センサからなる群より選択される。好ましい実施形態では、酵素はウレアーゼであり、ベースセンサはアンモニウムイオン選択性膜である。

水性混合物は必要に応じて、ｐＨ緩衝剤、ジスルフィド結合還元剤、二価イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、ウシ血清アルブミン、塩、殺生物剤および湿潤剤からなる群より選択される１つ以上の安定化成分をさらに含む。水性混合物は必要に応じて、ウレアーゼ、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、ビスアクリロイルピペラジン、グリセロールおよびアクリルアミドモノマを含む。

混合物を適用する方法は、約５ｎＬ〜約１μＬの範囲の制御された体積をマイクロ塗布することによるものとすることができる。該混合物を適用する方法は、スピンコーティング、浸漬コーティング、噴霧コーティング、スクリーン印刷、インクジェット印刷、レーザ印刷、塗装および接触印刷からなる群より選択される手段によるものとすることができる。

ＵＶ放射は、例えば、約１８５〜４００ｎｍの波長範囲とすることができ、必要に応じて、約１００〜４００ｍＷ／ｃｍ^２の強度を有する。前記ＵＶ放射工程は、塗布サイクルにおける塗布工程直後に実施されるスポット硬化である。ＵＶ放射工程は必要に応じて、塗布工程後予め選択された時間遅延で実施されるスポット硬化であり、約０．１〜１０秒の間実施することができる。

別の実施形態では、本発明は、（ａ）ウレアーゼと、グリセロールと、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンと、ビスアクリロイルピペラジンと、アクリルアミドモノマとを含む実質的に均質な水性混合物を形成させる工程と、（ｂ）アンモニウムイオン選択性膜上に前記膜を被覆するのに十分な制御された体積の前記混合物を塗布する工程と、（ｃ）前記塗布された体積の混合物を十分なＵＶ放射に曝露させ、前記膜に接着された固定化ウレアーゼ層を形成させる工程とを含む、尿素センサを形成する方法に関する。

別の実施形態では、本発明は、実質的に平らな表面上に固定化酵素層を形成するための装置であって、例えば、約５ｎＬ〜約１μＬの範囲の制御された体積の光形成可能な酵素含有マトリクスを前記表面上の予め選択された位置に塗布するための塗布ヘッドと、前記マトリクスが塗布された後、放射ビームを前記予め選択された位置の範囲に及ぶ領域上に、予め決められた時間で、予め決められた期間の間、予め決められた強度で集束させることができる位置決めおよび位置合わせ手段を備えたＵＶ放射源、例えば、水銀ランプと、を備える装置に関する。必要に応じて、装置は、１組の予め選択された位置に固定化酵素層のアレイを形成するために、前記塗布ヘッドおよび前記ＵＶ放射源に対し前記表面の相対位置を変えるためのステップアンドリピート手段をさらに含む。

実質的に平らな表面は必要に応じて、シリコンウエハ、アルミナウエハ、液晶基材、ガラス基材およびプラスチック基材ならびにフレキシブルプラスチック基材から選択される。塗布ヘッドは、例えば、前記マトリクスのためのリザーバを有する注射針と、前記シリンジから前記表面上に塗布させる量を制御するための変位手段とを備えることができる。

光形成可能なマトリクスは必要に応じて、１つ以上の酵素と、湿潤剤と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを実質的に均質な水性混合物中で含む組成物である。

予め選択された位置は好ましくは、約１０μｍ^２〜約７５ｍｍ^２の範囲の領域を有する。必要に応じて、予め選択された位置は実質的に円形であり、約５μｍ〜約５ｍｍの範囲の半径寸法を有する。

必要に応じて、位置決めおよび位置合わせ手段は、ビームを前記表面の選択された領域上に集束させ、約１０μｍ^２〜約７５ｍｍ^２の範囲の領域を照射させる。コンピュータプログラムは、塗布のタイミングおよび位置および／または塗布のタイミングに対するＵＶ放射の適用のタイミングおよび位置を制御することができる。

必要に応じて、塗布ヘッドは、前記表面上の予め選択された組の位置に、一連の制御された体積の光形成可能なマトリクスを塗布することができ、前記ＵＶ放射は、各制御された体積が塗布された後予め決定された時間に順に、予め決定された期間の間、放射ビームを実質的に前記予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域上に集束させることができる。

別の実施形態では、本発明は、実質的に平らな表面上のセンサアレイ上に固定化酵素層のアレイを形成するための装置であって、一連の制御された体積の光形成可能な酵素含有マトリクスを前記表面上の予め選択された組の位置に塗布するための塗布ヘッドと、各制御された体積が塗布された後予め決定された時間に順に、予め決められた期間の間、放射ビームを実質的に前記予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域上に集束させることができる位置決めおよび位置合わせ手段を備えたＵＶ放射源と、備える装置に関する。

別の実施形態では、本発明は、実質的に平らな表面上のセンサ上に固定化層を形成する方法であって、（ａ）生物活性材料を含む、制御された体積の光形成可能なマトリクスを前記表面上の予め選択された位置で塗布する工程と、（ｂ）前記体積が塗布された後予め決められた時間で開始し、予め決められた期間の間、予め決められた強度で、実質的に前記予め選択された位置の範囲に及ぶ領域にＵＶ放射ビームを適用し、前記固定化層を形成させる工程とを含む方法に関する。

光形成可能なマトリクスは必要に応じて、１つ以上の酵素と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを水性混合物中で含む。生物活性材料は必要に応じて、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡからなる群より選択される。固定化層は好ましくは酵素層である。

別の実施形態では、本発明は、実質的に平らな表面上のセンサアレイ上で固定化層のアレイを形成する方法であって、（ａ）一連の制御された体積の光形成可能なマトリクスを前記表面上の予め選択された組の位置で塗布する工程と、（ｂ）各制御された体積が塗布された後予め決められた時間で、例えば約０．１〜約１０秒の範囲で開始し、順に、実質的に前記予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域にＵＶ放射ビームを適用し、前記放射を予め決められた強度で予め決められた期間の間、例えば、約０．１〜約１０秒の範囲で適用し、前記固定化層アレイを形成させる工程とを含む方法に関する。ＵＶ放射は好ましくは約１８５〜４００ｎｍの波長範囲であり、ＵＶ放射強度は約１００〜４００ｍＷ／ｃｍ^２の範囲とすることができる。平面は必要に応じて、シリコンウエハであり、予め選択された組の位置は、前記ウエハ上のセンサアレイである。ＵＶ放射ビームは必要に応じて、Ｎ−Ｘ番目の予め選択された位置に適用され、その間、塗布はＮ番目の予め選択された位置で起こり、ここで、Ｘは１〜１０の整数に等しい。

別の実施形態では、本発明は電極を備えるセンサに関し、前記電極を被覆する第１の層は、イオン選択性膜を含み、前記イオン選択性膜を被覆する第２の層は、１つ以上の酵素と、湿潤剤と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤との実質的に均質な水性混合物から形成されたＵＶ硬化マトリクスを含む。

本発明は下記非制限的な図面を考慮するとよりよく理解されるであろう。

参照電極と組み合わせてシリコンウエハ上に作製された血中尿素窒素（ＢＵＮ）センサの位相横断立面図である。 異なる製造工程でのシリコンチップ（２ｍｍ×３ｍｍ）上のＢＵＮセンサの平面図である。図２（ａ）：裸銀−塩化銀電極３５３、図２（ｂ）：（ａ）に関し、マイクロ塗布されたアンモニウムイオン選択性膜３５５を有したもの、図２（ｃ）：（ｂ）に関し、紫外線スポット硬化されたアクリルアミドウレアーゼ酵素層３５６を有したもの。 完成ＢＵＮセンサの電子写真である。図３（ａ）は従来のＥＬＶＡＣＥ（親水性および疎水性ドメインから構成される酢酸ビニルエチレンコポリマ）過程により形成された固定化酵素層を示し、図３（ｂ）は所望の均一なドーム形状を有するＵＶスポット硬化されたアクリルアミドウレアーゼ酵素層を示し、図３（ｃ）はＵＶフラッド硬化されたアクリルアミドウレアーゼ酵素層を示す。 検量流体から血液に進む、図１４（ａ）で説明される組成物を使用するアクリルアミドＢＵＮセンサのセンサ出力データ（クロノポテンシオメトリグラフ）を示す。 ＥＬＶＡＣＥに基づく（Ｗｏｏｄｇｌｕｅ）酵素固定化膜と比較した、加熱および非加熱チップの両方に対する全血（ＷＢ）における、図４で示した型のアクリルアミドＢＵＮセンサ（ＥＩＬ）のセンサ相関データを示す。 塗布装置およびＵＶ−スポット硬化サブシステムを示す図である。 スポット硬化サブシステムおよびＵＶ光ボックスの詳細を示す図である。 図８（ａ）塗布および図８（ｂ）スポット硬化サブシステムの詳細を示すである。 塗布およびスポット硬化のための過程アルゴリズム工程およびタイミングを示す図である。 センサカートリッジカバーの等角上面図である。 センサカートリッジカバーの等角底面図である。 センサカートリッジのためのテープガスケットの配置の上面図である。 センサカートリッジベースの等角上面図である。 好ましい実際の混合組成物を有するマトリクスのための試薬の表を示し、図１４（ａ）は唯一の酵素としてウレアーゼを有するウレアーゼ含有酵素固定化層に対する成分を示し、図１４（ｂ）は１４（ａ）と同様であるが、炭酸脱水酵素の添加を有する。 図１５（ａ）モノマーとしてアクリルアミド、メタクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）アクリレート（ＰＥＧＡ）、およびＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）、ダイマーとして１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン、図１５（ｂ）モノマーとしてアクリルアミド、ならびにダイマーとして１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン、ポリエチレングリコールジアクリレートポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ）およびトリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート（ＴＭＰＥＴＡ）を用いて生成された酵素固定化層から発生した信号のクロノポテンシオメトリデータを示す図である。 異なる強度および時間での、３１０ｎｍのＵＶ光への曝露の後のアクリルアミド／１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジンに基づく酵素固定化層から発生した信号のクロノポテンシオメトリデータを示す図であり、本実験で使用されるＵＶ光への曝露の時間および強度範囲の有意の影響はないことを明らかにする。 異なる有効期間および貯蔵条件を有する、異なる濃度での湿潤剤の影響に関するデータを示す図である。 ５つの異なる水性対照流体を用いたセンサ性能に対するＥＩＬ膜の印刷厚の比較的に小さな効果を示す図である。

１つの態様では、本発明は１つ以上の酵素と、湿潤剤と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを実質的に均質な水性混合物中で含む酵素固定化組成物に関する。

酵素
本発明の組成物中に含まれる１つ以上の酵素は、広範囲に異なり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の酵素はウレアーゼを含む。酵素ウレアーゼは、アッセイにおいて血中尿素窒素（ＢＵＮ）量を定量するバイオセンサに組み入れるのに、特によく適している。ＢＵＮアッセイは、血中の、腎臓により除去されるタンパク質代謝の老廃物である尿素窒素のレベルを測定する際に有用である。したがって、ＢＵＮアッセイは腎機能を評価する。臨床的に有用なＢＵＮ値は２〜１４０ｍｇ／１００ｍＬ（ｄＬ）である。高窒素血症として公知の状態、すなわち、ＢＵＮレベルの上昇は、腎機能障害、うっ血性心不全、脱水、ショック、胃腸管への出血、ストレス、急性心筋梗塞または過剰タンパク質摂取を示し得る。また、ＢＵＮ値の減少は、肝不全、栄養障害、タンパク質同化ステロイド使用、妊娠およびセリアック病を示し得る。

全血中の尿素は二段階過程で検出される。第１に、尿素は酵素的に、「ウレアーゼ反応」においてよく理解されていない機序を介して生成物ＮＨ_４ ^＋とＨＣＯ_３ ⁻に変換される。尿素検出の第２の工程は、ＮＨ_４ ^＋イオン選択性電極（ＩＳＥ）によるアンモニウムイオン活性の電位差定量である。Ｄ．Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４章（第２版、１９８２）を参照されたい。ＢＵＮセンサ応答、すなわち、ＮＨ_４ ^＋濃度の変化による電位変化は血液中の尿素の既知のレベルで較正される。センサ応答曲線のプロット（時間の関数としてのミリボルトで表したクロノポテンシオメトリグラフ）はこのように、センサ膜内のアンモニウムイオン濃度を示すために使用することができ、血液中の尿素濃度の間接的な推定量が提供される。

ウレアーゼによる尿素の酵素的分解によりＨＣＯ_３ ⁻の分解副産物として種Ｈ^＋およびＣＯ_２が生成するので、ＢＵＮ量はＨ^＋およびＣＯ_２の変化を検出するセンサを用いて決定することができる。血液中のアンモニウムイオンのバックグラウンド濃度は比較的低いので、アンモニウムイオンの検出が好ましい。対照的に、血液はＨ^＋、ＣＯ_２およびＨＣＯ_３ ⁻のかなりのバックグラウンドを有する。ウレアーゼ反応中のイオンの生成はまた、試料の導電率を増加させ、これは導電率センサにより検出することができる。

ウレアーゼの理想的な特性は、関連する生成物（アンモニウムイオン＜０．００００１μｍｏｌ／酵素単位）および他の窒素化合物の残留レベルが低いことである。本発明の酵素固定化組成物において使用されるウレアーゼは、理想的には、汚染プロテアーゼを含まないべきであり、２５℃で５００Ｕ／ｍｇタンパク質より大きな比活性を有するべきである。さらに、酵素はまた、高い純度を有するべきである。いくつかの実施形態では、ウレアーゼは約１〜約１００ｍＭ、例えば、約１〜約５０ｍＭまたは約２５〜約７５ｍＭの範囲、好ましくは約５０ｍＭのＫ_ｍを有するべきである。さらに、ウレアーゼは１６，０００（μｍｏｌ／ｍｌ／分）を超えるＶ_ｍａｘを有するべきである。最後に、ウレアーゼは約５×１０^５／分以上のＫ_ｃａｔを有するべきである。

好ましい実施形態では、ウレアーゼはＪａｃｋ Ｂｅａｎウレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５）（Ｂｉｏｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カルフォルニア州サンディエゴ）である。Ｊａｃｋ Ｂｅａｎウレアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．５）の別の供給源としては、（ｉ）Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．（カナダオンタリオ州オークビル）、（ｉｉ）Ｔｏｙｏｂｏ（日本、東京）、（ｉｉｉ）Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州レークウッド）、（ｉｖ）Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本発明の酵素固定化組成物は炭酸脱水酵素およびウレアーゼを含む。炭酸脱水酵素は、米国特許出願第１１／２１６，０４１号に記載されているように、ウレアーゼ反応により形成したビカーボネートを二酸化炭素に変換し、これによりアンモニウムイオン生成速度を増加させ、この全内容は参照により本明細書に組み入れられる。これらの組成物で使用される炭酸脱水酵素は、理想的には、窒素化合物の低い残留レベルを有し、汚染プロテアーゼを含まず、それ以外にも高い純度を有するべきである。さらに、炭酸脱水酵素は、０℃で２５００ Ｗｉｌｂｕｒ−Ａｎｄｅｒｓｏｎ単位／ｍｇタンパク質を超える比活性を有するべきである（Ｗｉｌｂｅｒ，Ｋ．Ｍ．およびＮ．Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７６：１４７−１５４（１９４８））。いくつかの実施形態では、炭酸脱水酵素は１〜５０ｍＭの間のＫ_ｍ値を有するべきであり、ここで、好ましいＫ_ｍは１〜５である。さらに、炭酸脱水酵素は、５０（μｌ／ｍｌ／分）を超える、好ましくは１０，０００（μｌ／ｍｌ／分）を超えるＶ_ｍａｘを有するべきである。最後に、炭酸脱水酵素は７５／分を超える、好ましくは５×１０^５／分を超えるＫ_ａｃｔを有するべきである。

好ましい実施形態では、炭酸脱水酵素は、ウシ炭酸脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、カナダオンタリオ州オークビル：Ｋ_ｍ：１．３１ｍＭ、Ｖ_ｍａｘ：６４．４μｍｏｌ／ｍｌ／分、Ｋ_ｃａｔ：７６．２４／分）である。ウシ炭酸脱水酵素（Ｅ．Ｃ．４．２．１．１）の別の供給源は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州レークウッド）である。

いくつかの好ましい実施形態では、本発明の酵素固定化組成物中で使用される酵素はウレアーゼであるが、固定化組成物と適合する任意の他の酵素を、個々に、または他の酵素（例えば、ウレアーゼおよび炭酸脱水酵素）と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、クレアチナーゼ、クレアチニナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ピリドキサールオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびそれらの組み合わせからなる群より選択することができる。使用される酵素によって感知される分析物が決まることが理解される。したがって、例えば、グルコースオキシダーゼはグルコースを検出するためのセンサで使用することができ、乳酸オキシダーゼはラクテートを検出するために使用することができ、ウレアーゼと炭酸脱水酵素の組み合わせはＢＵＮ量の同時検出のために使用することができる。

モノマ、光開始剤および架橋剤
上記のように、本発明の酵素固定化組成物はアクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを含む。いくつかの実施形態では、アクリル系モノマはアクリルアミドを含む。別の実施形態では、モノマはメタクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）アクリレート、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］メタクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、またはそれらの混合物を含む。

有機光開始剤はモノマを重合させることができる任意の光開始剤とすることができる。いくつかの実施形態では、光開始剤は、２，６−ビス（４−アジドベンジリデン）シクロヘキサノン、２，６−ビス（４−アジドベンジリデン）−４−メチルシクロヘキサノン、４，４−ジアジドスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩、重クロム酸アンモニウム、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−ペンチル−ケトン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ９０７）、２−メチル−１［４−（メチルチオ）フェニル］−２−モルホリノプロパン−１−オン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ １８４Ｃ）、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−プロパン−１−オン（Ｄａｒｏｃｕｒ １１７３）、５０重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ １８４Ｃと５０重量％のベンゾフェノンの混合光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ５００）、２０重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ １８４Ｃと８０重量％のＤａｒｏｃｕｒ １１７３の混合開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ １０００）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９）、メチルベンゾイルホルメート（Ｄａｒｏｃｕｒ ＭＢＦ）、α，α−ジメトキシ−α−フェニルアセトフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ６５１）、２−ベンジル−２−（ジメチルアミノ）−１−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−１−ブタノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ３６９）、３０重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ ３６９と７０重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ ６５１の混合開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ １３００）、ジフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）−ホスフィンオキシド（Ｄａｒｏｃｕｒ ＴＰＯ）、５０重量％のＤａｒｏｃｕｒ ＴＰＯと５０重量％のＤａｒｏｃｕｒ １１７３の混合開始剤（Ｄａｒｏｃｕｒ ４６２５）、ホスフィンオキシド、フェニルビス（２，４，６−トリメチルベンゾイル）（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ８１９）、５重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ ８１９と９５重量％のＤａｒｏｃｕｒ １１７３の混合開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２００５）、１０重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ ８１９と９０重量％のＤａｒｏｃｕｒ １１７３の混合開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２０１０）、２０重量％のＩｒｇａｃｕｒｅ ８１９と８０重量％のＤａｒｏｃｕｒ １１７３の混合開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２０２０）、ビス（エタ５−２，４−シクロペンタジエン−１−イル）ビス［２，６−ジフルオロ−３−（１Ｈ−ピロール−１−イル）フェニル］チタン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ ７８４）、ベンゾフェノンを含む混合開始剤（ＨＳＰ １８８）、およびそれらの誘導体からなる群より選択される。好ましい実施形態では、光開始剤は２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンを含む。別の実施形態では、光開始剤は、２−ヒドロキシ−３−（３，４−ジメチル−９−オキソ−９Ｈ−チオキサンテン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−１−プロパナミニウムクロリドを含む。さらに、これらの光開始剤は組み合わせて使用することができる。

好ましい実施形態では、架橋剤は、モノマから形成されたポリマの架橋を促進することができる任意の化学物質である。１つの実施形態では、架橋剤は、１，４−ビスアクリロイルピペラジン（ＢＡＰ）を含む。別の実施形態では、架橋剤は、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス（アクリロイル）シスタミン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、（＋）−Ｎ，Ｎ’−ジアリル酒石酸アミド、またはそれらの混合物を含む。

湿潤剤、緩衝剤および他の成分
アクリル系モノマ、水溶性有機光開始剤および水溶性アクリル系架橋剤の他に、酵素固定化マトリクスは必要に応じて、例えば、ｐＨ緩衝剤、ジスルフィド結合還元剤、二価イオンキレート剤、プロテアーゼ阻害剤、アルブミン、塩、糖、殺生物剤、湿潤剤および可塑剤を含む他の安定化成分をさらに有する。好ましい実施形態では、酵素固定化マトリクスはＴＲＩＳ緩衝剤、ビスアクリルアミド、ジチオトレイトール、エチレンジアミン四酢酸、スクロース、アプロチニン、ウシ血清アルブミン、塩化ナトリウム、塩化カリウム、アジ化ナトリウムおよびグリセロールを含む。図１４を参照されたい。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は湿潤剤を含む。湿潤剤を添加する場合、好ましくは、グリセロール、プロピレングリコール、三酢酸グリセリル、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、ポリデキストロース、キラヤ、乳酸、塩化リチウムおよび１，２−プロパンジオールから選択される。１つの実施形態では、組成物中の湿潤剤の濃度は２〜２０％程度、例えば、約２〜１５％、約２〜１０％、または約２〜８％（ｖ／ｖ）である。いくつかの場合では、高すぎる濃度では、湿潤剤は製品有効期間を低減させ得ることが見出されている。湿潤剤、例えば、グリセロールは、マトリクスがマイクロ塗布過程中、硬化工程前に乾燥しないように添加される。マイクロ塗布された液滴の乾燥が早すぎる場合、調合物の成分は溶液から沈殿し得、これは架橋および硬化に悪影響を与え得る。基材上に塗布された液滴のサイズが小さい結果、低い湿度の製造環境中でマイクロ塗布されたものは、容易に、急速乾燥する傾向がある。したがって、周囲温度および湿度を制御することが重要である。本明細書で記載した過程に対する好ましい範囲は４〜２５℃および３０％相対湿度である。

本発明の調合物は好ましくは、酵素活性を維持し、最適化するように有用な生化学緩衝成分を含む。例示的な緩衝剤としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ナトリウムバルビタール、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、トリシン、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ホスフェート、ホスフェート−生理食塩水、生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、生理食塩水リン酸ナトリウムエチレンジアミン四酢酸（ＳＳＰＥ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、トリス酢酸エチレンジアミン四酢酸（ＴＡＥ）、トリスホウ酸エチレンジアミン四酢酸（ＴＢＥ）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、緩衝剤はＴＲＩＳである。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は必要に応じて、還元剤を含む。例示的な還元剤としては、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ、ジチオエリトリトール、グルタチオンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい実施形態では、還元剤はＤＴＴである。組成物中に含まれている酵素が不活性多量体を形成しないように、本発明の組成物に還元剤を添加することは好都合であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は必要に応じてカチオン結合剤、好ましくは二価カチオン結合剤を含む。例示的な二価カチオン結合剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸ナトリウム、エチレングリコール四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エチレンジアミンおよびそれらの混合物が挙げられる。そのようなカチオン結合剤は、金属イオン不活性化を阻止するため、ならびにプロテアーゼの活性化を阻止するために、金属キレート剤として添加される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物はプロテアーゼ阻害剤を含む。例示的なプロテアーゼ阻害剤としては、アプロチニン、ニワトリ卵白シスタチン、アンチパイン、シスタルニン二塩酸塩、キモスタチン、３，４−ジクロロイソクマリン、Ｅ−６４、エブセレン、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ合成ペプチド、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン塩酸塩、Ｎ−αパラトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン塩酸塩、ペプスタチンＡ、ペシノストレプチン、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、アンチトロンビンＩＩＩ、ブデリン、補体Ｃ１エステラーゼ阻害剤、３，４−ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスファージ、エラスタチナール、メシル酸ガベキサート、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、Ｎ−アセチル−ｇｌｕ−ｓｅｒ−ｍｅｔ−ａｓｐ−ａｌ、Ｎ−アセチル−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ｔｈｒ−ａｓｐ−ａｌ、ジイソプロピルフルオロホスフェート、Ｎａ−Ｔ−Ｂｏｃ−デアセチルロイペプチン、アセチル−ペプスタチン、ヒスタチン５、Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ａｌ、Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｂ（ＯＨ）_２、ラクタシスチン、クラスト−ラクタシスチンβ−ラクトン、ジイソプロピルフルオロホスフェート、フェニルメチルスルホニルフルオリド、ペプスタチンＡ、Ｄ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−ｐｓｉ−（ＣＨ_２ＮＨ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ、ジエチレントリアミン五酢酸、１，１０−フェナントロリンモノヒドラーゼ、ホスホラミドン、ジイソプロピルフルオロホスフェート、Ｎ−アセチル−エグリンＣ、メシル酸ガベキサート、ヒルジン、Ｎα−（２−ナフタレンスルホニルグリシル）−４−アミジノ−ＤＬ−フェニルアラニンピペリジド、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−クロロメチルケトン、パラアンリノベンズアミジン二塩酸塩、エコチン、トリプシン阻害剤、トリプシン−キモトリプシン阻害剤、およびＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−クロロメチルケトンが挙げられる。好ましい実施形態では、アプロチニンが、血液試料分析時に膜に接触し得ると共に、製品有効期間に影響するマトリクス調合物中に存在し得る全てのプロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤として添加される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は殺生物剤を含む。例示的な殺生物剤としては、アジ化ナトリウム、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、チメロサール、ヒポクロリットおよびそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、スポット硬化前またはその後のいずれかで、調合物の微生物からの予防的保護のための殺生物剤としてアジ化ナトリウムが添加される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は可塑剤を含む。例示的な可塑剤としては、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、可塑剤はグリセロールである。いくつかの可塑剤、例えばグリセロールは可塑剤および湿潤剤の両方として作用することができ、そのため、本発明の組成物がより可撓性を有するものとなることを認識すべきである。これにより、温度変化および、環境応力亀裂（ＥＳＣ）として知られる、応力下に材料を置く他の条件中に、硬化アクリル樹脂が亀裂を生じ、剥離しないようにされる。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は塩を含む。例示的な塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびそれらの混合物が挙げられる。低濃度の塩、好ましくは塩化ナトリウムおよび塩化カリウムの添加は、その後に検量流体または血液試料と接触する際の剥離速度、すなわち、膜接着の損失を低減させることが見出された。いずれの理論にも縛られないが、この改善は、内因性塩の添加による試料と膜との間の浸透圧濃度差の低減によると考えられる。イオン選択性電極（ＩＳＥ）はナトリウムおよびカリウムイオンに感応するので、ＩＳＥに対するこのバックグラウンド影響を低減させるように濃度を最適化した。いくつかの実施形態では、塩濃度は約０．１ｍＭ〜約１４０ｍＭ、例えば、約３０ｍＭ〜約１４０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約４０ｍＭである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は０．９ｍＭ ＫＣｌを含み、３５ｍＭ ＮａＣｌが使用される。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は無水生物保護剤を含む。例示的な無水生物保護剤としてはスクロース、トレハロース、マンニトールおよびそれらの混合物が挙げられる。好ましい実施形態では、無水生物保護剤はスクロースである。スクロースは好ましくは、膜安定性を増強させ、センサがパッケージされる検査カートリッジが延長された有効期間、例えば、６〜１２ヶ月またはそれ以上を示すようにするために、無水生物保護剤として添加される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もまた、カートリッジ有効期間を増加させ、良好な膜接着を確保することが観察されたので、添加することができる。

組成物の調製
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は混合され、アリコートされ、その後、アリコートが解凍され、マイクロ塗布のために使用されるまで、凍結保存される。好ましい実施形態では、モノマ（例えば、アクリルアミド）および架橋剤（例えば、ＢＡＰ）が溶液中で共に混合される。モノマ／架橋剤溶液に、光開始剤（例えば、Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９）が添加される。いくつかの実施形態では、光開始剤を最後に添加することが望ましい。それは、光開始剤が最も反応性が高く、この予防措置により光への曝露が低減されるからである。好ましい実施形態では、試料は−６０℃で凍結され、少なくとも４ヶ月間安定であることが見出された。試料凍結は−２０〜−１２０℃の範囲とすることができ、より低い温度が好ましい。これらの低温では、調合物は数年間安定なままとすることができる。

本発明の組成物は好ましくは酵素を固定化するために使用されるが、当業者であれば、酵素の代わりに、または酵素と共に、他の生物活性材料、例えば、抗体、抗体断片、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを固定化するためにも使用することができることを認識する。例えば、Ｒｅｈｍａｎら、１９９９、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：６４９−６５５（１９９９）（参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。

本発明の酵素固定化組成物を調合する際、組成物の溶解度および緩衝作用の両方を考慮することが必要である。酵素は一般に、ｐＨ７近くの緩衝水溶液を必要とするが、例外、例えば、アルカリホスファターゼが存在する。例えば、ウレアーゼに対する最適ｐＨは８．０であると報告されている（Ｗａｌｌ ＆ Ｌａｉｄｌｅｒ，Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｒｅａ−Ｕｒｅａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍ：ＩＶ Ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ Ｉｎｅｒｔ Ｂｕｆｆｅｒ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ４３：３０７−３１１（１９５３））。しかしながら、本発明の組成物において最適酵素活性を獲得するためには、ｐＨ８．０未満のｐＨを使用することが好都合であることが見出されている。いくつかの実施形態では、本発明の組成物のｐＨは約６．５〜約７．４である。組成物のｐＨは周知の緩衝剤を使用することによりその範囲内で維持することができる。例示的な緩衝剤としては、ｐＨ７．６の１００ｍＭ ＴＲＩＳが挙げられるが、それに限定されない。１０〜２００ｍＭの範囲のＴＲＩＳ緩衝剤はまた、約ｐＨ６．５〜約８．０のｐＨ範囲においても使用することができる。本発明において有用な他の緩衝剤としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ＴＲＩＳ（トリヒドロキシメチルアミノメタン）、例えば、ＴＲＩＳ−Ｈ_２ＳＯ_４、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝剤およびバルビトンが挙げられる。

ほとんどの光開始剤はまた、水性溶媒中で制限された溶解度を有する。さらに、アクリル樹脂架橋剤もまた、水溶液にわずかに溶解できるにすぎない。例えば、光開始剤２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンは、モノマと架橋剤を含むアクリル樹脂溶液に溶解させた場合、わずかによく溶解できることが見出されており、水性溶液に溶解させ得る。より高い濃度の光開始剤が好ましい。しかしながら、光開始剤が溶液から沈殿しないことが重要である。したがって、適当な濃度範囲を特定することが重要である。いくつかの実施形態では、光開始剤の濃度範囲は約０．５〜約１０％、例えば約０．５〜約５％、または約０．５〜約４．０％である。

ウレアーゼと、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノンと、ビスアクリロイルピペラジンとアクリルアミドモノマとを含む好ましいマトリクスのマイクロ塗布された層を図２（ｃ）および３（ｂ）に示す。マトリクスは、膜を被覆するのに十分な制御された体積でアンモニウムイオン選択性膜上に塗布され、その後、十分なＵＶ放射に曝露され、膜に付着された固定化ウレアーゼ層が形成される。マイクロ塗布されたマトリクスの呼び体積は好ましくは５０ｎＬであるが、広範囲の体積を使用することができる。図２で示した寸法を有するセンサでは、範囲は好ましくは１０〜２００ｎＬである。

図３は異なるプロトコルを用いて作成した典型的な印刷を示す走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。スポット硬化を用いると（図３（ｂ）を参照されたい）、各マイクロ塗布された液滴はマイクロ塗布事象後、ＵＶに予め決められた時間間隔で曝露される。各印刷膜に対する時間ドメインの制御は図３（ｂ）に対しては以下の通りとした。ｔ_０ ：膜の塗布、ｔ_１ ：ＵＶの適用、ｔ_２ ：ＵＶ中止、ここで、ｔ_０とｔ_１との間は０．５秒であり、ｔ_１とｔ_２との間は０．６秒である。図３（ｂ）で示した固定化酵素層では、ＵＶ放射波長は３１０ｎｍであり、ＵＶ強度は２Ｗ／ｃｍ^２であった。好ましくは、塗布膜マトリクス工程であるｔ_０とｔ_１との間は約０．０５〜約２．０秒、例えば約０．１〜約１．０秒の範囲である。ＵＶ放射工程は好ましくは約０．０５〜約１２０秒、例えば、約０．１〜約６０秒の範囲である。ＵＶ放射波長は変動し得、例えば、約２６０〜約３６０ｎｍであり、好ましくは光開始剤に特異的である。好ましくは、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン光開始剤を用いると、ＵＶ波長は３１０ｎｍである。ＵＶ放射強度は約０．００５〜約５０Ｗ／ｃｍ^２、例えば、約０．０１〜約１０Ｗ／ｃｍ^２まで変動し得る。ＵＶ放射強度および時間は、過程における関連する特性であり、一方低減すると、典型的には、他方のパラメータの増加が余儀なくされる。さらに、ＵＶ放射のより短い波長は、感応性生物材料に悪影響を及ぼし得る。したがって、約３００ｎｍを超える波長が好ましい。

比較として、図３（ｃ）はフラッドＵＶシステムを使用する硬化工程を示す。ＵＶフラッド硬化システムでは、マトリクスの液滴全てが、フラッド硬化工程を実施する前に、基材、例えば、ウエハ上にマイクロ塗布されることが必要である。これは、初期の液滴は後の液滴よりも長い間乾燥（または固化）することを意味する。この遅延により、硬化構造における時間依存変動に至り得る。印刷された液滴のサイズが小さいことを考えると、それらは迅速に乾燥する可能性があり、成分は不溶性となり、したがってＵＶ硬化を受けにくくなる。比較として、図３（ａ）は従来のＥＬＶＡＣＥ過程により形成された酵素層を示す。「ＥＬＶＡＣＥ」は親水性および疎水性ドメインから構成される酢酸ビニルエチレンコポリマである。ＥＬＶＡＣＥ過程はＵＶ硬化工程を含まない。ＥＬＶＡＣＥ構造を使用した可変表面は、望ましくないことに、図３（ｃ）で示される構造でありうる様に、性能変動の一因となり得ることが知られている。

ＵＶスポット硬化過程は、図３（ｂ）で示されるように、最も一貫したドーム構造を提供し、驚いたことに、かつ、意外にも、優れたセンサ性能特性が得られることが見出されている。図４は、検量流体から血液に進行する、スポット硬化アクリルアミドＢＵＮセンサの、典型的なセンサ出力データを示し、図５は血液中でのスポット硬化アクリルアミドＢＵＮセンサの典型的なセンサ相関データを示す。これらの構造はまた、他の構造に比べ、優れた接着を有し、機械的により強固であることに注意されたい。

図４では、クロノポテンシオメトリグラフは、検量体溶液を時間点２００で測定し、その後試験試料、すなわちこの場合、低および高尿素濃度を有する２つの異なる血液試料をセンサに時間点２０１で添加した場合の電位差を示す。センサ出力を安定化させる短い時間後、電位差を時間点２０２で測定する。時間点２０２と２０１での電位間の差を、試料中の尿素濃度を決定するために使用することができる。これはＮｅｒｎｓｔ式に基づき、この式では、勾配および切片は実験により決定される。時間点２０２および２０１での電圧変化を、分析物濃度対数に対し片対数プロットすることができ、分析物濃度に基づく電圧の線形応答を有するグラフが得られる。

図５では、新規ＵＶ硬化酵素固定化層（ＥＩＬ）がＥＶＡＮＣＥ（フィルム形成ラテックスとも呼ばれる）で調合された先行技術酵素と比較されている。実験は２つの異なるバイオセンサチップを使用し、１つは加熱され（ＢＣＬ４−５）、もう一方は加熱されない（ＢＣＬ３−５）。２つの異なる血液ドナー試料、１６９Ｍ（男性）および６５８Ｆ（女性）を使用した。さらなる尿素の添加なしで試験した試料もあるし、尿素を添加することにより修正され、低添加および高添加として識別されたものもあった。５つのカートリッジを各試験条件に対し構築し、ｍＶで表した生電位差を記録した。５試料の標準偏差（ＳＤ）を試験した各試料に対し計算した。これらのデータから、先行技術ＥＬＶＡＣＥに基づく過程に匹敵する標準偏差が示された。

重要なことに、ＥＩＬ過程を使用すると、一貫して再現されるセンサを有する効果は、精度の増加、印刷厚の再現性、改善された製造の容易さおよび改善された製品収率であることが見出された。例えば、図１８は、ある印刷厚の範囲では、測定した電位差は印刷厚により有意に影響されないことを証明しており、このＥＩＬ過程の強固な性質が保証される。ＣＶ１、ＣＶ２、ＣＶ３、ＣＶ４およびＣＶ５は、それぞれ、１５２．５、５７．８、１０．７、５．９および３．４ｍｇ／ｄＬ ＢＵＮの尿素濃度を含む標準試験流体である。尿素の他に、これらの溶液はまた、他の塩および緩衝成分を含む。図１８では、５７．３、７１．４、９７．３μｍの厚さの印刷が試験され、グラフで表された。

１つ以上の酵素と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを、実質的に均質的な水性混合物中で含む酵素固定化組成物を調合する際、溶解度および緩衝作用の両方を考慮することが典型的には必要である。酵素は一般に、ｐＨ７近くの緩衝水溶液を必要とするが、例外があり、例えば、アルカリホスファターゼである。
ほとんどの光開始剤はまた、水性溶媒中で限られた溶解度を有する。さらに、アクリル樹脂架橋剤もまた、水溶液にわずかに溶解できるにすぎない。好ましい１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）−フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙにより製造、Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９）は、アクリル樹脂溶液（モノマと架橋剤）に溶解させた場合、わずかによく溶解できることが見出されており、水性溶液に溶解させることができた。より高い濃度の光開始剤が好ましい。しかしながら、光開始剤が溶液から沈殿しないことが重要であり、適当な濃度範囲を同定することが重要である。約０．５〜約４．０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度が好ましい。この光開始剤は３１０ｎｍのＵＶ光に感応するので、一般に室内光には感応性がないことが見出され、このため、レッドルームまたはイエロールーム製造条件が必要ない製造過程にとって有用であることが見出された。

図１４（ａ）および（ｂ）は、好ましい実際の混合組成物を有するスポット硬化マトリクスのための試薬の表を示す。第１の例は、唯一の酵素がウレアーゼであるスポット硬化センサ用であり（図１４（ａ））、第２の例は、ウレアーゼと炭酸脱水酵素の組み合わせに対するものである（図１４（ｂ））。好ましいウレアーゼ混合物において、混合順は下記の通りである。

電気泳動ゲルのために典型的に使用されるアクリル樹脂は、本出願で使用されるのが好ましいアクリル樹脂調合物に比べ、高いモノマ対架橋剤濃度にある。電気泳動型樹脂（例えば、アクリルアミドまたはビスアクリルアミド）は典型的には、それぞれ、０．２および０．００７ｇ／ｍｌのモノマおよび架橋剤濃度にあるが、本発明に対する好ましいマトリクスは、それぞれ、０．０５および０．０２ｇ／ｍｌのモノマおよび架橋剤濃度を含むアクリル樹脂調合物を有する。この架橋剤対モノマ比が高いほど、硬化および乾燥中のマイクロ塗布させたプリントの物理変化を低減させるのに好都合であると考えられる。様々な実施形態では、組成物は約０．０４：１を超える、例えば、約０．１：１を超える、または約０．３：１を超える架橋剤対モノマ重量比を含む。これらの比はまた、生物試料（例えば、血液）によるセンサ水和にとって好都合である。所望のモノマ：架橋剤比を達成し、溶液からの沈殿を阻止するために、典型的なゲル電気泳動架橋剤ビスアクリルアミドを、好ましい実施形態では、より高い水溶解度を示す１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン（ＢＡＰ）と置き換えた。

ウエハ作製およびバイオセンサ
シリコンウエハが好ましくは、バイオセンサチップが作製される固体基材として使用される。他の材料、例えば、プラスチック、アルミナおよびガラスをシリコンの代わりに使用することができるが、前者が、例えば年間何百万台もの装置の生産などの、平面構造の大量生産には便利な材料である。

シリコン上に、材料の層を特定の位置で追加し、一組の個々のチップを作製する。これらの過程は当業者には周知である。本発明では、二酸化ケイ素の薄層が好ましくはシリコン上に熱分解により形成される。その後、チタンまたはチタン−タングステン合金を二酸化ケイ素層の上面にスパッタし、光形成させる。これを、銀および他の金属を接着させるための層として使用する。この実施例では、銀および酸化銀を、図２（ａ）で示したように周知の過程を用いて形成させる。図２（ａ）では、アナライザ装置に接続するための導体パッド３５０が様々なセンサおよび電気コネクタに接続される。具体的には、ＢＵＮセンサ３５３の下にある層は銀および塩化銀を含む。塩化物センサ３５２はまた、銀／塩化銀層を有する。接地電極３５１は試料との複数の接触点を有する光形成された塩化銀電極である。これは、チップ上の他のセンサの電気測定のための接地電位を形成する。参照電極構造は３５４により示されており、米国特許第４，９３３，０４８号および公開米国特許出願第２００７００１５９７７号において詳細が記載されており、それらの全内容が参照により本明細書に組み入れられる。これらの層は好ましくは、いくつかの感光性マスクをそれらの過程で使用し、材料の特定の位置での配置を可能にする。

図２（ｂ）は、アンモニウムイオノファオ層３５５が、図２（ｂ）で示したＢＵＮ銀／塩化銀堆積物の上面上に配置される過程の次の工程を示す。アンモニウムイオノフォア層およびその調製法は米国特許第５，２００，０５１号において記載されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。この後、図１４で示されている組成物のＵＶに基づくＢＵＮ ＥＩＬ膜３５６と共に、図２（ｃ）に示されている塩化物（ＣＬ）センサ３５２のマイクロ塗布が続く。

図１は、位相様式で、本発明の１つの非制限的実施形態によるＢＵＮセンサの断面層を示す。図示したＢＵＮセンサは、図２（ａ）〜（ｃ）に反映される過程において記載される参照センサを含む。シリコンウエハ３２０を二酸化ケイ素層３１５で、チタンまたはチタンタングステン合金３１０と共に被覆し、続いて、銀３０５および塩化銀３０４で被覆する。ＰＶＣイオノフォア組成物３２５を銀／塩化銀層上に印刷し、続いて、ウレアーゼ酵素を含むＥＩＬ酵素層３１１を印刷する。

図１では、参照電極はまた、銀／塩化銀３０４層に至るまで見られる上記層を全て含むが、また、電解質層３１２、ガス透過性膜３０８も含み、必要に応じてフォトレジストキャップ３０９により処理される。

自動統合マイクロ塗布およびスポット硬化システム
本発明の好ましい態様では、本発明の微細加工過程は自動システムであり、正確でプログラム可能な量の材料を、対象のセンサ内で使用される平面材料の選択領域にマイクロ塗布し、さらに、ＵＶ放射により、統合された硬化、好ましくはスポット硬化を提供することができる。この態様で重要な概念は、マイクロ塗布工程およびその後のＵＶ曝露工程のタイミングおよび期間に関する時間ドメインを制御することである。ここで、時間ドメインの制御は典型的には数分の１秒である。これは微細加工装置にとってよく知られた大量製造過程と一致する。

１つの実施形態では、塗布ヘッドは、マトリクスのためのリザーバを有する注射針と、シリンジから選択された表面上に塗布させる量を制御するための変位手段と、を備える。装置はまた、表面、例えば、シリコンウエハを塗布ヘッドおよび前記ＵＶ放射源の両方に対して移動させるためのステップアンドリピート機構を含み、このようにして、予め選択された組の位置で固定化酵素層のアレイを形成することが可能になる。

好ましくは、塗布される制御された体積は、約１ｎＬ〜約１０μＬ、例えば、約５ｎＬ〜約１μＬまたは約５０ｎＬ〜約０．１μＬの範囲であり、塗布された体積は約１０μｍ^２〜約７５ｍｍ^２の範囲の領域を被覆する。好ましくは、この領域は約５μｍ〜約５ｍｍの範囲の半径寸法を有する実質的に円形である。

好ましい実施形態では、システムは、一連の制御された体積の光形成可能なマトリクス、例えば、本発明の上記酵素固定化組成物を表面上の予め選択された組の位置に塗布することにより、実質的に平らな表面上で固定化層の組織化されたアレイを形成する方法を提供する。この後、ＵＶ放射ビームを、実質的に予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域上に適用する。重要なことには、これは、各々の制御された体積が塗布された後の予め決められた時間で開始し、前記放射を予め決められた強度で予め決められた期間の間適用して、順番に起こり、前記固定化された層の固定化アレイが形成される。好ましくは、予め決められた時間は約０．１〜約１０秒の範囲であり、予め決められた期間は約０．１〜約１０秒の範囲である。好ましくは、方法は約１８５〜約４００ｎｍの波長範囲の、約１００ｍＷ／ｃｍ^２〜約１０Ｗ／ｃｍ^２の範囲の強度を有するＵＶ放射を使用する。当業者に知られているように、硬化は、選択された部位で特定の線量のＵＶ放射を発生させることにより達成することができる。時間、強度および距離のパラメータが全てＵＶ放射線量に影響し、特定のＵＶ線量を発生するように調節することができることは周知である。典型的には、高い強度はより多くの熱を発生し得、過程に他の効果を有し得る。好ましい方法はまた、シリコンウエハである平面を使用し、予め選択された組の位置は前記ウエハ上のセンサアレイであり、典型的にはＸ−Ｙアレイの単位セルに基づく。印刷工程後にＵＶ曝露という順序に関しては、本方法は好ましくは、ＵＶ放射ビームが、Ｎ番目の予め選択された位置で塗布が起きている間にＮ−Ｘ番目の予め選択された位置に適用される様式で動作する。典型的には、Ｘは１〜１０の整数に等しい。ウレアーゼ膜（３１１および３５６）に対する好ましい実施形態では、パラメータＵＶ曝露パラメータは、４．２Ｗ／ｃｍ^２の放射への、３１０ｎｍ波長、０．５６秒曝露を含む。

図６は、本発明の１つの実施形態によるマイクロ塗布システムを示す。図示されるように、マイクロ塗布システムは、真空チャック１０６とシリンジ１０２および１０５とを備え、シリンジの各々がこれらの要素の１つ以上の垂直、水平、側方または回転変位を変えるための別個の手段に取り付けられている。節約のために、真空チャックの位置を多方向に変化させることができる限り、シリンジの垂直変位を変えるための手段を有することで十分である。両方の要素の移動は、パソコンにより制御することができる。１つの態様では、真空チャックの位置は、ｘおよび／またはｙ方向のいずれかまたは両方で±５１μｍまたはそれより良好に再現可能とすることができ、チャックの平坦性は１μｍ以内である。

本発明の好ましい実施形態のマトリクス調合物は、制御可能な様式で層を確立する目的で、マイクロシリンジアセンブリ１０２に充填することができる。マイクロシリンジアセンブリには好ましくは、１５０μｍの内径および３００μｍの外径を有する２５〜３０ゲージの針１０５が取り付けられている。典型的には、マイクロシリンジ針１０５は、細長い部材と針先端とを含み、金属材料、例えば、ステンレス鋼から製造されている。追加の層を針上にコートし、その表面特性を変化させることができる。さらに、針本体、それ自体を製造する際に合成ポリマなどの他の材料も使用することができる。電極表面の前処理および適用した流体の体積量によって、約１〜約２００μｍの範囲の厚さの膜層を一貫して得ることができる。

ＵＶ硬化マイクロ塗布サブシステム（図６）は必要に応じて、針ホルダおよび円筒部１０２、ならびに針１０５に連結するチューブに連結されたバルブ１０１を備える。マイクロ塗布された液滴は必要に応じて顕微鏡１００を用いてモニタすることができる。マイクロ塗布された液滴は、必要に応じて用いられる光ガイドファイバ１０３からの放射線を用いる集束レンズアセンブリ１０４由来のＵＶ光を用いて硬化される。

非制限的な図７は、光ガイドファイバ１０３からの放射線を用いて集束レンズアセンブリ１０４中に集束される放射線を示し、この放射線はＵＶ光ボックス１５０内のＵＶ電球１５１により発生される。図示されるように、光放射の量および曝露時間は、光ボックス１５０内のシャッター／開口１５２を用いて制御される。後者は必要に応じてアルゴリズムを用いてコンピュータ内で実施される。

マイクロ塗布システムの１つの非制限的な実施形態がさらに、図８（ａ）に示されており、この場合、空気弁１０１がシステムに対し、チューブ１３２に沿って針ホルダおよび円筒部１０２に入る圧力を生成させる。図示されるように、針ホルダおよび円筒部１０２はシリンジハウジング１３１により保持され、シリンジハウジングはシリンジ３０を保持する。シリンジ１３０はマイクロ塗布される液滴の針１０５を通した送達を可能にする。

ＵＶ集束レンズアセンブリ１０４の必要に応じて用いる実施形態をさらに、図８（ｂ）で示し、ここでは、ＵＶ光は光ガイドファイバ１０３から光ガイド４０５を通してコンセントレータハウジング４０１に提供される。コンセントレータハウジング４０１は光ガイドファイバ１０３にマウンティングブラケット４００を用いて取り付けられる。光はこの実施例では、レンズブラケット４０２内でレンズスペーサ４０４によって共に定位置に保持される２つのレンズ４０３により集束される。１つのレンズで十分であり得るが、追加の必要に応じて用いられるレンズが任意で使用でき、それは当業者の理解するところである。

マイクロ塗布およびＵＶ硬化のための、必要に応じてコンピュータを用いる制御過程は、図９で示したアルゴリズムにより実施することができ、ここでは、針はＸ−Ｙトレイから上方に、かつ離れるように移動され、その後、最初の印刷位置に配置される。針は印刷位置に近接して下方に移動され、続いて、短期間の間印圧が生成される。針はその後、印圧が液滴塗布を終えた後に上昇される。マイクロ塗布過程と並行して、Ｘ−Ｙトレイがそれ自体新しい印刷位置に配置されると直ぐにその後のＵＶ硬化過程が開始され、再び移動する前に終了する。この過程が、全ての位置が印刷され、硬化されるまで、各印刷位置で繰り返される。

再現性よく塗布することができる液滴サイズは、広範囲にわたる。約５〜約５００ナノリットル（ｎＬ）の間の体積サイズでは、液滴は好ましくは約５％の精度で適用することができる。０．１％精度定格を有するソレノイドはこの目的に十分である。センサ上方の注射針の先端の高さは好ましくは、塗布される体積に依存して、約０．１〜約１ｍｍの間である。一般に、液滴の体積が小さいほど、センサからの針の高さが低くなる。注射針とセンサの予め選択された領域との正確な位置合わせが、カメラおよびレチクルにより光学的に達成できる。そのような操作は、オペレータにより手動で、または視覚認識システムにより自動で実施することができる。後者が好ましい。

単一の流体液滴を形成させ、針から放出させる際、それに関わる動力学を考慮することは有用である。より多くの流体が針先端から放出されるにつれ、液滴は、液滴の質量に作用する重力が、針先端との接触を維持する対抗力を超えるまで、サイズが増加する。これらの対抗力としては、針先端と流体または液体との間の接着力、液体自体の表面張力が挙げられる。別個の液滴形成が完全な低い液体流速では、液滴体積が固定されることが確立されている。しかしながら、体積は、上記流体関連パラメータのいずれかを変化させることにより、または針先端の直径を変えて、これにより流体接着のための有効表面積を変化させることにより、変えることができる。例えば、針先端に適用される疎水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）コーティングにより、液滴と針先端との間の接着力を低減させることにより、水性マトリクス材料の自然の液滴サイズが低減される。制御された体積が表面上にマイクロ塗布されなくてはならない状況では、マイクロシリンジ先端を平面上に、液滴を完全に形成させず（その後、重力の影響下で表面に落ちる）、部分的に形成された液滴が実際に表面と接触し、液体と表面との間の新しい接着力が液滴を広げ始める高さで配置させることが可能である。針先端が今や、表面からＺ軸方向で十分な距離だけ離して引っ込められる場合、液体の凝集力が克服され、固定された液滴サイズより小さな液体体積が表面と接触したままとなる。この技術を使用して再現性よく、固定液滴サイズの約１〜１０００分の１およびそれ以上の任意の体積の液体を塗布させることができる。

純粋液体とその気相との間の表面張力は試薬を添加することにより変化させることができる。例えば、水に添加された脂肪酸は表面張力を低減させるが、添加された塩は表面張力を増加させることができる。本発明のマイクロ塗布可能な流体組成物は好ましくは、制御された最適化表面張力を有するように調製される。必要な場合には適した添加物を使用することができる。流体の疎水性または親水性は同様に制御される。硬化された膜が最終製品として必要とされる場合、固体量および揮発溶媒量は好ましくは、注意深く調節される。さらに、これらの成分比はまた、粘度を制御するために使用される。

アンモニウムイオンセンサのための好ましいマイクロ塗布可能な組成物はＰＶＣポリマと、可塑剤と、イオノフォアと溶媒とを含み、その粘度は一般に膜の平面鋳造（例えば、スピンコーティング）のために使用されるものよりも高い。これらのより粘度の高い組成物は、膜層の変形無しで硬化または乾燥する。関連する問題、例えば、高粘度でマトリクスの均質性を確保し、このため、その後の材料の相分離を阻止すること（すなわち、有効期間に関する配慮）はまた、これらの組成物により軽減される。他の添加物もまた、膜の長期劣化を阻止するために使用される。

処方した組成物に関連する最適化表面張力を有する流体の制御された体積塗布に関連する上記因子の他に、基材、または流体が塗布される表面の表面自由エネルギーの調整により、得られる層の最終寸法、とりわけ厚さに対する制御が提供される。その結果として得られる過程は非常に万能であり、多様な組成および実用性の層のアレイの堆積を可能にする。厚い膜（例えば、４０〜６０μｍの厚さ）を確立するために、表面は好ましくは、マイクロ塗布される流体が表面と形成する接触角が大きくなるように調整される。例えば、水性酵素マトリクスがマイクロ塗布される前に、表面を最初にプラズマ処理し、制御された接触角を提供することができる。好ましいウレアーゼマトリクスでは、四フッ化炭素プラズマの工程により５０°〜７０°の範囲の接触角が得られる。

本明細書で記載した、マイクロ塗布システムの改善された１つの態様は、自動スポット硬化構成要素の統合である。ＥＸＦＯ Ｏｍｎｉｃｕｒｅ ＵＶシステムは、放射強度が過程を通して一貫して維持されることを確実にするために光開口を連続してモニタし、調整することができるために、統合に対し好ましい。これにより、設定時点で５０％強度を使用することにより、寿命（〜２０００作動時間）に対する典型的なＵＶ電球強度の問題が改善される。硬化時間と電球強度との間には関係があるので、製品処理時間を低減させるためには適度に高い設定が要求される。

ＵＶ硬化過程の別の態様は、ビームを特定のセンサ上に集束させ、他のセンサへのＵＶ曝露を避ける要望である。ビームの集束は、制限しすぎることを避けるのに適当であることが必要である。これは、処理される各センサを位置合わせさせるのに使用される視覚化システムが、正確に位置合わせされていない事象において強固な過程を確保するのに十分な柔軟性を必要とするからである。強度はＵＶビームの硬化部位までの距離と関係があり、したがって、より接近させることにより、強度が増加し、製品処理時間が減少する。

本発明を主に、微細加工されたイオン選択性電極を有するシリコンウエハに関して記載してきたが、他の型のセンサを、開示した組成物が塗布され、またはコートされる表面を組み入れるように作製することができる。それには、光センサ、光ファイバセンサ、表面弾性波センサ、エバネセントセンサ、表面プラズモン共鳴センサおよび光導波路センサが挙げられる。様々なベースセンサ、例えば、電極、イオン選択性電極、電位差測定電極、電流測定電極、電気伝導度測定電極、酵素電極、バイオセンサ、光センサ、光ファイバセンサ、表面弾性波センサ、エバネセントセンサ、表面プラズモン共鳴センサおよび光導波路センサもまた含まれる。センサ作製のための実質的に平らな表面としては、シリコンウエハ、アルミナウエハ、液晶基材、ガラス基材およびプラスチック基材、ならびに可撓性プラスチック基材が挙げられる。好ましい実施形態では、膜形成組成物は十分なＵＶ放射に曝露され、かなりの架橋が引き起こされ、こうして、表面上で接着された非膨潤固定化酵素層が形成される。

マイクロ塗布およびＵＶ硬化が統合された装置は、好ましくは、製造過程時間を最適化し、ＵＶ硬化を達成するために自動的にプログラムされる。マイクロ塗布およびＵＶ硬化工程は好ましくは相前後して実施される。好ましい態様では、ＵＶ硬化工程は約０．５秒かかり、一方、マイクロ塗布工程は約０．３〜０．４秒かかる。そのため、マイクロ塗布工程は典型的には、印刷部位間の約０．１秒のインデキシング時間により律速される。マイクロ塗布およびＵＶ硬化サブシステムは好ましくは２つの異なるが、隣接する物理的位置で同じ期間中動作するが、マイクロ塗布工程はＵＶ硬化動作前、およびそれに先だって起こる。図９は動作のための好ましいアルゴリズムを提供する。

統合されたＵＶ放射源を有する塗布装置は好ましくは、実質的に、マトリクス滴が塗布された位置の範囲に及ぶ領域上に放射ビームを集束することができる位置決めおよび位置合わせ手段を有する。コンピュータ手段は、ＵＶ放射の作動と停止を行うことができ、これはマトリクスが塗布された後、予め決められた時間に、予め決められた期間（および予め決められた強度で）起こる。位置決めおよび位置合わせ手段は、ビームを前記表面の選択された領域上に集束させ、約１０μｍ^２〜約７５ｍｍ^２の範囲の領域を照射させる。

各ウエハは好ましくは、複数のチップ（典型的には５インチウエハ上に約１０００）を有するように作製され、各々が１つ以上のセンサを含み、この場合各々がＢＵＮセンサを含む。これらのセンサは望ましくはウエハ上で均一なＸ−Ｙ配列で配列される。好ましい実施形態ではウエハを処理するために、チップは好ましくは、最初に接着テープをウエハの裏面に配置し、続いて、例えば、ダイヤモンドダイシングソーを使用して、ウエハを個々のチップにカットすることにより作製される。この過程により、ウエハ上のチップの元の位置に比べ、わずかな変位、および不均一な配列が引き起こされる。これを補正するために、図６に示されるような、顕微鏡１００を視覚認識ソフトウエアと共に使用し、マイクロ塗布過程のためにチップを再位置合わせする。ＵＶ硬化システムの最初の位置合わせおよび位置決めでは、ＵＶ感応紙を使用して正確な位置合わせを決定する。または、可視光源をＵＶ光源１５１の代わりに、光ガイド１０３上方に挿入し、ＵＶ硬化部位を位置合わせし、集束させることができる。さらに別のアプローチは、集束点を有するＵＶモニタニング装置（ラジオメーター）を使用し、強度および活性を使用してＵＶ硬化部位を位置合わせし、集束させる。また、代替的に、ダイシング工程は、塗布およびスポット硬化後に実施することができるが、ダイシングブレード用に使用される冷却水によって、ダイシングダストが硬化膜を損傷することがないようにする配慮が必要であることに注意されたい。基材がシリコンウエハではなくプラスチックである場合、ダイシングはより単純なカッティング過程により行われ、この場合、ダストによる損傷は問題とならない。ここでは、塗布およびスポット硬化後のダイシングが好ましい。

改善されたセンサを使用するためのカートリッジ構造
上記ダイスカットされたシリコンチップはその後好ましくは、使い捨てのプラスチックカートリッジのためのサブコンポーネントとして使用される。各カートリッジは典型的には、患者試料を分析装置で処理し、試料中の分析物、例えば、尿素の存在または量を決定することを可能にするいくつかの特長機能を含む。

図を参照すると、本発明のチップを受理するためのカートリッジは、カバー（２つの図面）、図１０、１１と、ベース、図１３と、ベースとカバーの間に配置され、それらを共に固定される薄膜接着ガスケット、図１２とを備える。具体的には、図１０で示したカバーの裏側が図１２のガスケットの暴露面と噛み合い、ガスケットの裏側と図１３のベースの暴露面とが噛み合う。ここで図１０を参照すると、カバー１は剛性材料、好ましくはプラスチックから製造され、可撓性のあるヒンジ領域５、９、１０において亀裂を生ずることなく繰り返し変形することができる。カバーは、可撓性ヒンジ９によりカバーの本体に取り付けられた蓋２を備える。操作時、試料を試料保持チャンバ３４中に導入した後、蓋は試料入口ポート４の入り口上に固定することができ、変形可能なシール１１により試料の漏れが阻止され、蓋はフック３により定位置に保持される。カバーはさらに、カバー本体に対して可動で、可撓性ヒンジ領域５、１０によりカバーに付着されている２つのパドル６、７を備える。操作時、ポンプ手段により作動すると、パドル６は、薄膜ガスケット２１により覆われている、空洞４３からなる空気袋に力を働かせ、流体をカートリッジの導管内に移動させる。第２のポンプ手段による作動時、パドル７はガスケット２１に力を働かせ、これは変形し得る。カートリッジは読み取り装置内への挿入のために適合され、したがって、この目的のために複数の機械的および電気的接続を有する。カートリッジの手動操作が可能であることも明らかなはずである。このように、カートリッジを読み取り装置に挿入した後、読み取り装置は圧力を、空洞４２に配置された約１３０μＬの検量流体で充填された流体含有ホイルパックに伝達し、スパイク３８上でパッケージを破裂させ、流体を導管３９内に放出させ、導管３９はベース内の短い横断導管を介してセンサ導管１６に接続されている。検量流体がセンサと接触すると、センサは、濡れて、流体中の較正イオンまたは分子の量と関連する信号を確立する。

図１２を参照すると、薄膜ガスケット２１は様々な穴およびスリットを備え、それらの穴及びスリットは、ベースおよびカバー内の導管間の流体の移動を促進し、必要に応じ、加圧下でガスケットが変形することを可能にする。穴３０および３３は、切込み部３５または３７のいずれか内に収容された１つ以上の尿素センサおよび１つ以上の参照電極を、導管１６内の流体と接触させる。

図１３を参照すると、導管３４は試料入口ポート４を組立カートリッジ内の第１の導管１６に接続する試料保持チャンバである。切込み部３５および３７は、本発明のチップを受け入れるためのハウジング内の位置である。必要に応じて、それらはまた、空気−液体境界の位置を決定するための電気伝導度検出センサを収容する。凹み４２は、流体含有パッケージ、例えば、破裂可能なパウチを組立カートリッジ内で収容し、これは、読み取り装置に挿入されるとパドル７上に働く圧力のためにスパイク３８により穴が開けられる。穴が開けられたパッケージからの流体は３９の第２の導管に流れ込み、その後、導管１６に流れ込む。空気袋は、上面がガスケット２１によって封止される凹み４３から構成される。空気袋がポンプ手段の１つの実施形態であり、パドル６に適用される圧力により作動され、これにより導管４０内の空気が移動し、これにより試料が試料チャンバ３４から導管１６に移動する。

膜アレイを形成し、硬化する改善された方法
１つの実施形態では、ＢＵＮセンサを製造する方法は２つの別個の印刷事象を必要とする。第１の工程は、ＮＨ_４ ^＋イオン選択性電極（ＩＳＥ）印刷工程を含み、その後、ウレアーゼ層印刷工程が続く。上記のように、印刷過程は好ましくは、正確に液滴をウエハの特定の位置上にマイクロ塗布させるために、Ｘ−Ｙテーブルの上面に微細ゲージの針を備える、空気ポンプおよびバルブを使用する。いくつかの制御可能な因子がセンサの総体的な性能に寄与する。これらとしては、（ｉ）所望の位置上の印刷された液滴の正確な位置決め、（ｉｉ）液滴の適当な粘度および表面張力、（ｉｉｉ）表面の関連する疎水性、（ｉｖ）液滴の高さおよび幅（または体積）、（ｖ）表面上での乾燥後の液滴の高さ、ならびに（ｖｉ）良好な接着が挙げられる。さらに、乾燥させた液滴の結晶の形成（分割）または亀裂はセンサの性能に悪影響を与え得る。

先行技術酵素膜（例えば、米国特許第５，２００，０５１号を参照されたい）は膜形成ラテックス、好ましくはＥＬＶＡＣＥ（Ｆｏｒｂｏ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、イリノイ州モリス）から構成される。しかしながら、この非均質材料は乾燥して、マイクロ塗布針先端を詰まらせやすく、これは製造に対し悪影響を有し得る。ＥＬＶＡＣＥの表面張力はまた、センサ性能に影響し得る不規則形状の構造を生成し得る。図３（ａ）を参照されたい。さらに、ＥＶＡＣＥは親水性および疎水性ドメインからなる酢酸ビニルエチレン（ＶＡＥ）コポリマであり、時間と共に分解し得、材料をより酸性とするアセテートを生成する可能性が最も高い。この時間依存過程により、材料の使用可能な寿命が低減する。結果として、この不均質水性マトリクスを大幅により安定な組成物、好ましくは光形成させることができ、酵素、例えばウレアーゼに対して安定な固定化環境を提供する均質水性マトリクスで置換することが望ましい。

本発明はまた、原材料寿命、印刷前の水性マトリクス寿命、ならびに完了センサにおける印刷および硬化マトリクスの寿命を含む、いくつかの寿命に関する問題を解決する。また、最終製品中で、血液試料に接触する際、溶解することがなく、破壊されることがない。これは信頼できるセンサ性能のために非常に望まれる良好な接着特性の証拠である。

最も重要なことに、信頼できる製造方法のために、本発明は、約４℃〜約３５℃の範囲の貯蔵温度で、サブコンポーネントの沈殿なしで、溶液のままであるマイクロ塗布可能なマトリクスを提供する。これはまた、凍結させて保存することができ、有害効果なく使用のために融解させることができる。好都合なことに、マトリクス組成物はまた、少なくとも約２００μｍまで延長する範囲の厚さで印刷されて、十分なＵＶ透過を有し、マトリクス全体にわたり高度のポリマ変換をもたらす。

本発明は、マトリクスが印刷過程中低粘度の状態で存在し、ＵＶ放射によりゲル化または固定状態に制御可能に変換されるので好都合である。ＵＶ硬化過程を使用するこの制御されたアプローチは、調合物中へのＵＶ光開始剤の組み入れを必要とする。これはまた、硬化される部分に向けられる制御されたＵＶ放射を発生させることができる硬化システムを必要とする。このＵＶ硬化システム仕様は、（ｉ）簡単な自動化、（ｉｉ）印刷システムと適合可能な短いサイクル時間での動作、（ｉｉｉ）硬化過程中のダイスウエハのラッキングの回避、（ｉｖ）オーブンまたは熱硬化工程の必要性の回避、および（ｖ）絶え間ないマトリクス混合の必要性の回避を可能にする必要がある。さらに、不必要な材料廃棄を回避することが望ましい。前に言及したように、製造の観点から、大バッチの材料を製造し、予めアリコートし、凍結形態で保存する場合も有用となる。

本発明は、強固な製造過程を可能にする。強固な製造過程の態様では、一貫した製品結果を発生させながら、過程の各工程でいくらかの範囲の精度が許容される。過程の１つの工程で、印刷厚はわずかに変動し得る。データから（図１８を参照されたい）、平均電位差信号は、好都合なことに、印刷厚に依存しないことが見出された。さらに、多くのウエハにわたってのこれらの値の標準偏差は、印刷厚とかなり独立している。これにより、製品性能に影響せずに、広範囲の酵素層厚が可能になる。

光棒、オーブン工程を伴う、または伴わないＵＶフラッド硬化、および光ガイドシステムを含む様々なＵＶシステムを使用することができる。印刷されたセンサ部位上に集束放射ビームを送達するためにこの過程のためにＵＶレーザもまた使用することができる。シリコンウエハまたは同様の基材、例えば、ガラスおよびプラスチック上で印刷された膜を硬化する過程では、光棒は全ての印刷位置上に配置される必要がある。これによりｎ×ｔだけ硬化工程時間が増加し得、ここでｎはチップ数／印刷位置であり、ｔは各ＵＶ硬化工程の秒で表した時間である。１つの実施形態では、ＵＶ硬化工程は、光棒を各連続印刷位置に正確に移動させるシステムにより提供される。光棒の移動は各印刷位置での印刷事象と統合される。

ＵＶ源がプリントヘッドと独立して移動するシステムでは、マトリクスは最初に、特定の位置で印刷針により印刷される。印刷針は、表面から、好ましくはＺ方向に移動する。ＵＶ源はその後、その位置に移動し、続いて、印刷位置でＵＶ硬化曝露が実施される。

ＵＶ源が印刷部位から固定オフセットにより追従するシステムでは、印刷針はタイプライタースタイル印刷過程の様式で印刷する（例えば、左から右へ、その後、左側に戻り、印刷部位の次のラインにインデクスし、再び左から右へ処理される）。ＵＶ源は、印刷針位置から１つ以上、ｎ、の印刷部位だけ離して配置される。印刷針は第１の印刷部位を印刷し、その後、ｎ印刷部位に到達するまで別の印刷部位を印刷する。ＵＶ源は印刷針に追従する。ＵＶ源が印刷針からｎ部位離して、左側の第１の印刷部位に配置されるとすぐに、ＵＶ源は印刷部位を露光し、硬化させる。印刷針が次の印刷部位に移動すると、ＵＶ源は次の部位に移動し、印刷針がマトリクスを塗布する間、ＵＶ源は印刷部位を曝露する。この印刷および追従ＵＶ硬化過程は、印刷針が平面の右側に到達するまで続く。ＵＶ硬化過程を終了するために、針は右に移動し続け、ＵＶ源が関連して移動し、残りのｎ部位を硬化し続ける。印刷針は、残りの印刷部位に対し印刷を中止するようにプログラムすることができる。印刷針およびＵＶ源は印刷される次の列にインデクスされ、設定が平面の左側で開始する。当業者であれば、印刷針およびＵＶ源はそれらの位置で固定することができ、平面を保持するテーブルを移動させ、各個々の印刷部位に対し印刷針およびＵＶ源を移動させることができることを理解すべきである。当業者であれば、他の工学的位置決め手段を使用して、塗布された各層が印刷された後に一定の時間で一定の様式で硬化されるように、時間ドメインの一貫した制御を確保する目的を達成することができることを認識するであろう。

好ましい実施形態では、光ガイドが使用される。光ガイドは、事実上、光のための管路であり、この場合、光はウエハの小さな領域上に集束され、ＵＶ源から直線で送達されない。ＵＶ放射は光ファイバ接続により光ガイドに沿って誘導される。これは、ランプおよびフィルタがパワーボックス内に含まれ、「フラッシュライト」が硬化部位の位置で非常に小さな占有面積を使用する光棒システムの利点を有する。さらにＵＶ放射は赤外放射よりも小さな付随熱を含み、そのため、硬化部分を冷たく維持する。

マトリクス中に存在する特定の光開始剤が特定の放射波長を要求する場合、これはその特定の光開始剤に適した特定のＵＶ電球を選択することにより達成される。最も標準的なＵＶ電球は複数の波長を発生させ、そのいくらかは望ましく、必ずしも望ましくないものもある。生物物質との適用では、他の波長には別の無関係な放射を有さない特定の放射波長を有することが好ましい。ＵＶＣ放射が生物学的にＵＶＡまたはＵＶＢよりも損害が少ないことが科学文献では周知であることに注意されたい。したがって、これらの波長を回避または制限することが生物試料では好ましい。Ｉｒｇａｃｕｒｅ ２９５９を使用する好ましいマトリクス調合物では、好ましい放射波長は約３１０ｎｍである。普通のＵＶ電球は水銀（「Ｈ」型）およびハロゲン化金属（「Ｄ」）を使用し、これらはＩｒｇａｃｕｒｅ ２９５９光開始剤を含むマトリクスに対し要求されるＵＶＡおよびＵＶＢ放射を発生させるので、どちらも硬化するために使用することができる。しかしながら、「Ｈ」電球は関係ない放射波長がより少なく、好ましい。

ＵＶシステムは、非イオン化放射の特定の波長を通過させるが、望ましくない波長の透過を阻止する統合された光学フィルタを有することが有利である。好ましい実施形態では、光開始剤に対し３１０ｎｍ付近の放射が要求される。有害な波長の放射にセンサを曝露させるのを制限する手段として、約３００〜３４０ｎｍの波長のみを効果的に許可するＧｉｌｗａｙ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ピーボディ）Ｎａｒｒｏｗｂａｎｄ Ｆｉｌｔｅｒ ＮＳ３１３などの狭帯域フィルタが、好ましい実施形態では有用である。ある別の光開始剤に対し特異的な、適当な放射波長に影響する、単独で、または組み合わせて使用される他のフィルタは当業者に明らかである。

好ましい実施形態では、光ガイドシステム（図６、７および８ｂ）は、光を特定の位置に誘導する能力を有する、スポット硬化という利点を有する。さらに、容易にフィルタにかけることができ、赤外（ＩＲ）放射をフィルタにかけるフラッド曝露に基づくシステムで見られる熱を発生させない。別のシャッターシステムも要求されない。この特徴はすでに装置に統合されているからである。このアプローチはまた、マイクロ塗布システムとの統合にとっても望ましい。電源をマイクロ塗布ハウジングの外側に配置することができ、光ガイドおよび関連するレンズを有するコンセントレータハウジングのみがマイクロ塗布ユニットの内側に挿入され、占有面積が最小に抑えるられるからである。

ＵＶ硬化性酵素マトリクスは、（ｉ）酵素、特に好ましい実施形態に対しては、酵素ウレアーゼ酵素との適合性、（ｉｉ）良好な印刷特性のために適当な流れおよび粘度を示す、（ｉｉｉ）高収率の製造過程に対応する、例えば、マトリクス有効期間を改善するための抗菌剤および酵素を安定化するための試薬を組み入れることができる信頼できる化学調合物との適合性、（ｉｖ）生物試薬に対応するための水に基づく技術である、（ｖ）ＵＶ硬化工程後表面への信頼できる接着を達成する、（ｖｉ）センサと共に使用される場合、迅速な濡れを提供する、（ｖｉｉ）酵素反応に対応し、維持するための層として形成された場合に、適当な酵素基質および水透過性を示す、（ｖｉｉｉ）電気化学センサと共に使用される場合に良好な電気特性を示す、ならびに（ｉｘ）室温または冷蔵下で、約６ヶ月を超える延長された処理後寿命を示す、例えば、真正の商品要求と適合する、という特性を有することが望ましい。図１４で説明した組成物はこれらの望ましい特性を有する。

本明細書で記載したＵＶ硬化システムを、各ＵＶ硬化性調合物と共に使用し、硬化された膜の寸法の精度および正確さならびに表面への膜の接着を含む多くの動作パラメータを特徴づけることができる。その後、センサは、あるマトリクスと硬化の組み合わせを用いてセンサ性能を決定するためにカートリッジ内で試験することができる。これは、ウエハ内およびウエハ間変動を含むことができ、この場合、各ウエハは１０００ものセンサを含むことができる。

図１６では、図１４（ａ）のマトリクスに基づく、センサ性能に対する放射効果。数多くのセンサを、それぞれ、１９０、３８０、７６０および１１４０ｍＪの放射線量を用いた０．５ｓ、１ｓ、２ｓ、および３ｓスポット硬化ＵＶ放射を用いる１つおよび複数のフラッドランプ過程を使用して調製した。これらのデータは、プロセスが様々な放射条件で強固であり、許容される試験結果を与えることを示す。

図１５は、別のモノマおよび架橋剤を含む組成物が試験溶液で同様なセンサ信号を発生さたことを証明している。試験したモノマには、アクリルアミド、メタクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）アクリレート（ＰＥＧＡ）、およびＮ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−メタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）が含まれた。さらに、試験した架橋剤には、１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン、ポリエチレングリコールジアクリレートポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド（ＤＨＥＢＡ）およびトリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート（ＴＭＰＥＴＡ）が含まれた。

図１７は加速した寿命貯蔵条件（例えば、３０℃または４０℃）下で湿潤剤グリセロールが存在しないと、性能にある影響があった実験を示す。グリセロールを本マトリクスに添加することにより（図１４の組成物を参照されたい）、良好な性能および有効期間を有する過程が達成される。

改善された血中尿素窒素センサ製造
１つの態様では、本発明の意図は、ＢＵＮ（血中尿素窒素）センサの製造を改善することである。新規ＢＵＮセンサの好ましい実施形態は、薄膜微細加工過程とマイクロ塗布技術の組み合わせを使用して製造される。これは、米国特許第４，９３３，０４８号（参照により本明細書に組み入れられる）において記載されている型の薄膜銀−塩化銀参照電極と組み合わされて動作する薄膜銀−塩化銀指示電極を備える。より好ましい参照電極は公開された米国特許出願第２００７００１５９７７号において記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

最初の工程では、基材シリコンウエハ上に、二酸化ケイ素の絶縁層を熱酸化により配置する。チタンとタングステンの合金（ＴｉＷ）、その後、銀の金属層を続いて二酸化ケイ素ベースウエハ上に堆積させ、その後、フォトリソグラフィー技術を用いてパターニングする。電気絶縁層、例えばポリイミドポリマまたは追加の二酸化ケイ素をその後、光パターニングし隣接するセンサ回路を絶縁する。銀−塩化銀指示電極（直径約２００μｍ）を、パターニングした銀から標準技術、例えば、電気化学、塩素ガスプラズマおよび塩化物イオンの存在下での無機酸化剤、例えばＣｒ_２Ｏ_７ ^２−またはＦｅ_３ ^＋によるＡｇ^０の酸化を用いて調製する。

ＢＵＮ電極の残りの層は２つの厚膜構造、すなわち（ｉ）有機ポリマ層（例えば、ポリ（塩化ビニル）−ＰＶＣ）およびアンモニウムイオンイオノフォアを含む半透過性膜、ならびに（ｉｉ）この特別なセンサ内で、必要に応じて炭酸脱水酵素を含むスポット光硬化アクリルアミドウレアーゼ層を含む最外バイオ層を含む。これらの層は米国特許第５，５５４，３３９号（参照により本明細書に組み入れられる）で記載されているマイクロ塗布技術により堆積される。しかしながら、本発明では、‘３３９特許で記載されているマイクロ塗布アセンブリは、上記のように、制御された時間ドメインでの自動印刷および硬化を可能にする統合された紫外線スポット硬化構成要素システムを含むように大幅に改善されている。

厚膜アンモニウムイオン感受性構造は、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）結合剤と、可塑剤としてのトリス（２−エチルヘキシル）ホスフェートと、イオノフォアとしてのノナクチンとを含む。指示電極は、同じ（または、同様の）結合剤と可塑剤組成物を使用するが、異なるイオノフォアを有することにより異なるイオンに対して選択的であるようにすることができる。例えば、バリノマイシン、モネンシンおよび（メチル）モネンシン、およびトリドデシルアンモニウムクロリドが、それぞれ、カリウム、ナトリウム、または塩化物イオン選択性電極を製造するために使用されている。他のイオノフォアとしては、クラウンエーテル、トリアルキルアミン、またはリン酸エステル、などが挙げられ得るが、それらに限定されない。また、ＰＶＣの他に、他のポリマ結合剤物質を使用することができる。これらのポリマとしては、例えば、シリコンゴム、ポリテトラフルオロエチレンプラスチック、またはイオン性官能基（例えば、カルボキシレート）を含むＰＶＣの誘導体が挙げられる。本発明で使用するのに適した他の可塑剤としては、トリス（２−エチルヘキシル）ホスフェート、ニトロシメン、２−ニトロフェニルオクチルエーテル、セバシン酸ジブチル、アジピン酸ジエチル、フタレート、プロピレンカーボネート、５−フェニルペンタノール、またはそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されない。さらに別の結合剤およびイオノフォアの組み合わせが当業者なら思いつくことができ、それらは本発明の範囲内にある。得られた半透過性イオン選択性膜は約２μｍ〜約２００μｍ、好ましくは約１０〜約３０μｍの範囲の厚さを有し得る。好ましい実施形態では、アンモニウムイオン選択性膜溶媒系は適当な表面張力および安定性を提供するように選択される。可塑剤、ＰＶＣポリマ、およびイオノフォアの固体量（重量％）は好ましくは、それぞれ、６０〜８０％、１５〜４０％および０．５〜３％である。

様々な方法を使用して、平らな基材上の層を規定することができる。厚膜（約５〜約２００μｍ）が要求される場合、粘性マトリクス、例えば上記光硬化性ウレアーゼマトリクスのマイクロ塗布が一般に好ましい。平らな基材上の層を規定するための他の方法としては、スピンコーティング、浸漬コーティング、噴霧コーティング、スクリーン印刷、インクジェット印刷、レーザ印刷、塗装および接触印刷が挙げられるが、それらに限定されず、代替法であり、異なる用途によりよく適合し得る。例えば、好ましいウレアーゼ光形成性マトリクスは単一パスで特定の時間（ｔ＝０）にウエハ上にスクリーン印刷することができる。スクリーンは必要に応じて、３００μｍの直径の開口を有し、各開口はウエハ上のアンモニウムイオン選択性膜のアレイとの位置合わせのために位置決めされている。印刷工程後、ウエハのフラッドＵＶ曝露がｔ＝１で実施される。上記スポット硬化法と同様に、本方法は、各マトリクスに対し、印刷からＵＶ工程への時間ドメインの制御を与える。この実施形態では、ｔ＝１は好ましくは、ｔ＝０後に２〜２０秒で自動的に設定される。ウエハを印刷ステーションから曝露ステーションに移動させるための自動装置は微細加工分野において周知である。好ましいウレアーゼマトリクスはまた、微細加工技術分野において広く使用されている様式で、スピンコートし、マスクを用いて光パターニングすることができる。

図１の位相図を参照すると、基材ウエハ３２０はシリコンであり、二酸化ケイ素絶縁層３１５が上に配置されている。さらに、印刷される層を制限するために使用される２つの円周印刷ウェル（３０２、３０３）を有するポリイミド層３０１が存在する。第１の金属層３１０はＴｉＷであり、ウエハに対する導体および接着層としての機能を果たす。続く層３０５および３０４は銀および塩化銀層である。図１の左側では、指示電極の残りの層は（ｉ）有機ポリマ層（例えば、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ））とアンモニウムイオンイオノフォアとを備える半透過性メンブラン膜３２５と、（ｉｉ）この特定の実施形態では、上記好ましい組成物のアクリルアミド光硬化ウレアーゼ層を備える最外生物層３１１と、を含む。

単位セルの参照電極部分は、図１で示されるように、オーバーレイ構造から構成することができる。この特定の実施形態では、参照電極の金属および塩化物層は、高濃度の塩を保持することができるが、好ましくは、光形成可能である任意の物質を含むことができる電解質層により被覆される。この点において、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）調合物が好ましい材料であり、最初に光パターニングすることができ、その後に塩、例えば塩化カリウムで飽和させることができる水透過性マトリクスを形成する。バルク分析試料に対する電解質または塩の損失を軽減するように機能するが、試料分析開始する前に参照電極の迅速な濡れ（すなわち、水または他の小さなガス分子の通過）を可能にする別のガス透過性膜もまた存在することができる。パターニング過程は、米国特許第４，９３３，０４８号および公開米国特許出願第２００７００１５９７７号に記載されているもののいずれかとすることができ、これらはどちらも参照により本明細書に組み入れられる。また、液界と銀／塩化銀の表面との間の距離が十分大きな参照電極構造を使用することができ、そのため、Ａｇ／ＡｇＣｌ構造のすぐ近くの電解質濃度は、指示電極と参照電極との間の電位差の測定を実施するのに十分な期間、実質的に一定である。

ここで図２を参照すると、指示電極および隣接する参照電極はそれぞれ、過不動態化信号線により、導体パッドに接続される。過不動態化（ポリイミド層）は同心円として形成された印刷ウェル３０２および３０３を含む。単位セルは長方形領域内に制限され、これが単一のシリコンウエハ上、１アレイ内で数百回繰り返される。本発明の特定の実施形態では、他の指示電極が、アンモニウムイオンの他に、他の種（例えば、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃｌ⁻）を同時測定するために単位セル内に存在することができる。

ＢＵＮベースセンサを製造するために、前に、濃硫酸および過酸化水素の混合物で綿密に清浄にされた、二酸化ケイ素の局所層を有するシリコンウエハが、プラズマ蒸着システム内に配置され、ＴｉＷ（０．１μｍ）および銀（０．５μｍ）の層が、ウエハ表面上に連続してスパッタされる。銀−チタン二層をその後処理し、ある領域に局在化させ、これは最終装置ではアンモニウムイオンセンサとして機能する。この過程は、ウエハがポジレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ ＡＺ １３７０ＳＦ）でスピンコートされる標準リソグラフィー技術により達成される。マスクを介したフォトレジストのＵＶ曝露および現像（Ｓｈｉｐｌｅｙ ＡＺ ３５１）後、曝露された銀をエッチング液としての硝酸鉄水溶液（０．９ｍＭ）で除去する。下に存在するチタン層をその後、同じフォトリソグラフィー工程だが、硝酸（３．９Ｍ）とフッ化水素酸（０．７８Ｍ）をエッチング液として使用して処理する。Ｎ−メチルピロリドン溶媒をその後使用して、残りのフォトレジストを除去し、要求された銀構造（直径約１５０μｍ）を露出させる。

信号線を不動態化するために、感光性ポリイミド（ＤｕＰｏｎｔ ２７０３）をウエハ上にスピンコートする。ウエハをＵＶ曝露させ、溶媒で現像するとすぐに、ポリマを３５０℃のオーブン内で３０分間、不活性雰囲気下で焼成させ、１５０℃まで冷却させ、その後除去する。パターニングに使用したマスクは層の周囲を規定するが、これはまた、印刷ウェル３０２および３０３を規定する。これらをその後使用して、２つの別個のマイクロ塗布された膜の寸法を制御する。

銀は好ましくは、その後、ウエハ全体を重クロム酸カリウム（１２ｍＭ）と塩酸（６０ｍＭ）の水溶液中に浸漬させることにより塩化物とされる。ウエハをその後洗浄し、部分的にダイスに切る。これらのパターニングされた塩化銀電極上に、アンモニウムイオン選択性膜を配置する。膜材料は、低分子量ＰＶＣ（Ｓｉｇｍａ）および高分子量カルボキシル化ＰＶＣ（Ｔｙｐｅ Ｇｅｏｎ、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）（１：１ ｗ／ｗ）をシクロヘキサノン、プロピオフェノン、およびＮ−メチルピロリドン（１：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）の溶媒系に溶解し、総固体量１０ｇ／ｄＬの溶液とすることにより製造する。混合物を７０℃で３０分間加熱することにより溶解を達成する。この混合物に、可塑剤トリス（２−エチルヘキシル）ホスフェート（Ｆｌｕｋａ）を添加し、３５ｇ／ｄＬの総固体量を提供する。得られた混合物をその後、４５℃まで冷却させ、ノナクチン（Ｆｌｕｋａ）を、混合物中２％の総固体に等しい量で添加する。室温で、この最終材料の１０〜１００ｎＬをウエハ上の塩化銀指示電極の各々上にマイクロ塗布させ、全ての側面を少なくとも約３０μｍだけ覆う。印刷ウェル３０２は好ましくは周囲を規定するために使用される。硬化はウエハを６０℃のホットプレート上に３０分間配置することにより達成される。この過程により、約１５μｍの厚さを有する安定した凹凸構造が得られる。

最終工程で、上記好ましいウレアーゼマトリクスを、装置を用いて、個々の膜上にマイクロ塗布し、ＵＶスポット硬化させる。印刷ウェル３０３は好ましくは周囲を規定するために使用される。上記のように、好ましい調合物では、使用前に、成分が共に混合され、低温冷凍機内で凍結される。これにより、日々の製品の一貫した製造およびマイクロ塗布前の長期貯蔵寿命が可能になる。混合物は標準参照法を用い、分光光度計を用いて酵素活性に対しアッセイすることができるので、この調合物はまた、マイクロ塗布事象前に品質制御（ＱＣ）試験を受けることができる。これにより製造過程において製品を製造する際の経費および無駄が低減される。

好ましい標準アッセイ法に関しては、解凍した凍結調合物のアリコート由来のウレアーゼ酵素活性を、Ｋａｌｔｗａｓｓｅｒ ＆ Ｓｈｌｅｇｅｌ，“ＮＡＤＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｏｕｐｌｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｕｒｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｍｍｏｎｉａ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：１３２−１３８（１９６６）の方法の改良法を用いて評価する。方法は、ウレアーゼに共役させたグルタミン酸デヒドロゲナーゼアッセイにおける３４０ｎｍでのＮＡＤＨからＮＡＤ^＋への分光光度変化を測定する。

改善されたＢＵＮセンサを用いたカートリッジ分析
好ましい実施形態では、センサを含む完成チップはその後、組み立てられて試験カートリッジとされ、血液中のＢＵＮ測定を実施するために使用される。本発明のカートリッジの１つの実施形態を図１０〜１３に示す。

カートリッジは好ましくは読み取り装置に挿入されるように適合され、したがって、この目的のために複数の機械的および電気的接続を有する。カートリッジの手動操作も可能であることも明らかなはずである。このように、カートリッジを読み取り装置に挿入した後、読み取り装置は、空洞４２内に配置された約１３０μＬの検量流体で充填した流体含有ホイルパック上に圧力を伝達させ、パッケージをスパイク３８上で破裂させ、流体を導管３９中に排出させ、導管３９は、ベース内の短い横断導管を介してセンサ導管１６に接続されている。検量流体がセンサを接触すると、センサは濡れ、流体中の較正イオンまたは分子の量と関連する電気信号を確立する。

図１２を参照すると、薄膜ガスケット２１は様々な穴およびスリットを備え、それらの穴及びスリットは、ベースおよびカバー内の導管間での流体の移動を促進し、ガスケットが加圧下で必要に応じて変形することを可能にする。穴３０および３３は、切込み部３５または３７のいずれか内に収容されている１つ以上の尿素センサおよび１つ以上の参照電極を導管１６内の流体と接触させる。図１３を参照すると、導管３４は試料入口ポート４を組立カートリッジ内の第１の導管１６に接続する試料保持チャンバである。切込み部３５および３７は必要に応じて、空気−液体境界の位置を決定するための電気伝導度センサを収容する。凹み４２は、流体含有パッケージ、例えば、破裂可能なパウチを組立カートリッジ内で収容し、これは、読み取り装置に挿入されるとパドル７上に働く圧力のためにスパイク３８により穴が開けられる。穴が開けられたパッケージからの流体は３９の第２の導管に流れ込み、その後、導管１６に流れ込む。空気袋は、上面がガスケット２１により封止される凹み４３から構成される。空気袋がポンプ手段の１つの実施形態であり、パドル６に適用される圧力により作動され、これにより導管４０内の空気が移動し、これにより試料が試料チャンバ３４から導管１６に移動する。

好ましい実施形態では、ＢＵＮセンサは米国特許第５，０９６，６６９号において開示されている型のカートリッジ内にパッケージされ、これもまた検量溶液を含む。これは検量体パッケージ（ｃａｌ−パック）に含まれ、血液試料分析中に破裂させられる。典型的な事象順序は、ｃａｌ−パックが破裂させられ、その後、較正溶液がセンサ上を通過し、センサを濡らす。典型的には、先行技術カートリッジのｃａｌ−パックは以下のイオン、すなわちナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、重炭酸イオンを含み、およびＨＥＰＥＳ緩衝剤、グルコース、ラクテート、尿素、クレアチンおよびクレアチニンもまた含んだ。研究目的のための診断試験として、尿素をアンモ二アと置き換えた。これにより、ウレアーゼを含む酵素固定化層とは独立して、アンモニウムイオノフォア性能の研究が可能になる。新規ＢＵＮセンサのためのｃａｌ−パックの好ましい構成は、好ましくは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、尿素、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、グルコース、ラクテート、クレアチンおよびクレアチニンを含む。

尿素のための電位差化学センサは、機能的に似ていない構成要素から構成されるシステムと考えることができる。血中尿素窒素（ＢＵＮ）センサの１つの実施形態では、最外層は分析物溶液と接触するものであり、尿素の輸送を可能にする一方、活性酵素分子を固定するようにも機能する。これらの酵素は上記のように尿素のアンモニアへの加水分解を触媒する。中性ｐＨ値では、このように生成されたアンモニアは主にアンモニウムイオンとして存在する。酵素含有層と銀−塩化銀指示電極との間に、アンモニウムイオンに対して高い感度および選択性を有するイオノフォアを含む別の層状構造を間に入れることにより、電極界面でのアンモニウムイオン濃度を測定することができる。この型の測定では、指示電極と参照電極との間の電位差が記録される。これは、電気化学測定技術分野において周知のように、２つの電極と接続する機器（またはアナライザ）内の電位差回路により実施される。測定の分析値は、電位差の大きさはＮｉｃｏｌｓｋｙ式により分析物、この場合、尿素の濃度に関連づけられるという事実から誘導される：

ここで、式中、Ｅは測定した起電力（信号）であり、Ｒはガス則定数であり、Ｔは絶対温度であり、ｎは分析物種ａ上の電荷の絶対数値であり（例えば、アンモニウムイオンに対してはｎ＝１）、Ｆはファラデー定数であり、Ａは分析物種ａの活性であり、Ｂは干渉化学種ｂの活性であり、ｋ（ａ，ｂ）は分析物種ａの活性の電気化学電位差定量に対する化学種ｂの存在の効果と関連する干渉係数であり、Ｅ_０はＴ、Ａ、またはＢとは独立した定数である。Ａｍｍａｎ，Ｄ．，Ｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９８６）ｐ．６８および本明細書で引用した参考文献を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる。

図４、５および１５〜１８で示したデータはこれらの原理を使用して記録および／または解析された。これらのデータは市販のＢＵＮ試験システムを用いて比較のために示したものである。新規センサの性能は確立されている技術よりも優れている。

実施例１
アプロチニンの溶液を、アプロチニン０．０１ｇを脱イオン水５０ｍＬに溶解し、０．００２％の濃度の原液を生成させることにより調製する。酵素緩衝溶液を、グリセロール４．３２ｇ、脱イオン水１３０ｇ、ｐＨ７．６の１Ｍ ＴＲＩＳ １３０ｇ、ｐＨ８．０の０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２．６ｇ、上記０．０２％アプロチニン原液１３ｇ、１，４−ジチオエリトリトール０．２ｇ、塩化ナトリウム２．７ｇ、塩化カリウム０．０９７ｇ、アジ化ナトリウム０．０５ｇ、スクロース９２．８ｇ、およびＢＳＡ２９ｇを添加することにより調製する。混合物を完全に溶解するまでボルテックスする。アクリル樹脂成分を含む溶液をその後、アクリルアミド７２．２ｇ、脱イオン水１５０ｇ、１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン２９．４ｇおよび活性炭２．５ｇを含有させて、調製する。このアクリル樹脂溶液を溶解するまで混合し、０．２μｍフィルタを用いて濾過し清浄な容器に入れる。この溶液に、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン１７．８ｇを添加し、混合し、アルミ箔で包んだ容器中で溶液が光に過剰曝露されないようにする。最後に、ウレアーゼ４０ｇを、約３３３ｇの上記濾過溶液に添加し、混合する。約４４ｇの脱イオン水を添加し、最後に、アクリル樹脂溶液（上記のように調製）１８４ｇを添加する。材料をアルミ箔で被覆したままとし、溶解するまで混合する。長期貯蔵のために、この溶液を１ｍｌの部分にアリコートし、−６０℃で凍結させる。

実施例２
ウレアーゼ酵素固定化層の別の実施形態は、酵素炭酸脱水酵素を含んだ。混合順序は下記の通りである：アプロチニンの溶液を、アプロチニン０．０１ｇを脱イオン水５０ｍＬに溶解し、０．００２％の濃度の原液を生成させることにより調製する。酵素緩衝溶液を、グリセロール４．３２ｇ、脱イオン水１３０ｇ、ｐＨ７．６の１Ｍ ＴＲＩＳ １３０ｇ、ｐＨ８．０の０．５Ｍ ＥＤＴＡ ２．６ｇ、上記０．０２％アプロチニン原液１３ｇ、１，４−ジチオエリトリトール０．２ｇ、塩化ナトリウム２．７ｇ、塩化カリウム０．０９７ｇ、アジ化ナトリウム０．０５ｇ、スクロース９２．８ｇ、およびＢＳＡ２９ｇを添加することにより調製し、内容物が完全に溶解されるまでボルテックスする。アクリル樹脂成分を含む溶液を次いで、アクリルアミド７２．２ｇ、脱イオン水１５０ｇ、１，４−ビス（アクリロイル）ピペラジン２９．４ｇおよび活性炭２．５ｇを含有させて、調製する。このアクリル樹脂溶液を溶解するまで混合し、０．２μｍフィルタを用いて濾過し清浄な容器に入れる。この溶液に、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン１７．８ｇを添加し、混合し、アルミ箔を用いて溶液が光に過剰曝露されないようにする。最後に、ウレアーゼ４０ｇおよび炭酸脱水酵素１４ｍｇを、約３３３ｇの上記濾過酵素溶液に添加し、混合する。約４４ｇの脱イオン水を添加し、最後に、上記で調製したアクリル樹脂溶液１８４ｇを添加する。材料をアルミ箔で被覆したままとし、溶解するまで混合する。この溶液を１ｍｌの部分にアリコートし、−６０℃で凍結させる。

任意の開示した実施に関して記載または主張した任意の特徴は、任意の他の開示した１つ以上の実施に関して記載または主張した任意の１つ以上の他の特徴と、特徴が必ずしも技術的に不適合ではない程度まで、任意の組みあわせで組み合わせることができ、そのような組み合わせは全て本発明の範囲内にある。さらに、下記添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内にある特徴のいくつかの非制限的な組み合わせを説明するが、任意の可能な組み合わせの、特許請求の範囲の任意の２つまたはそれ以上の対象の可能な組み合わせは全て、その組み合わせが必ずしも技術的に不適合でなければ、本発明の範囲にあるものとして企図されている。

Claims (26)

1. 実質的に平らな表面上に固定化酵素層を形成するための装置であって、制御された体積の光形成可能な酵素含有マトリクスを前記表面上の予め選択された位置に塗布するための塗布ヘッドと、前記マトリクスが塗布された後、放射ビームを、実質的に前記予め選択された位置の範囲に及ぶ領域上に、予め決められた時間で、予め決められた期間の間、予め決められた強度で集束させることができる位置決めおよび位置合わせ手段を備えたＵＶ放射源とを備える、装置。
2. 前記実質的に平らな表面が、シリコンウエハ、アルミナウエハ、液晶基材、ガラス基材およびプラスチック基材ならびにフレキシブルプラスチック基材からなる群より選択される、請求項１記載の装置。
3. 前記塗布ヘッドが、前記マトリクスのためのリザーバを有するシリンジと、前記シリンジから前記表面上に塗布させる量を制御するための変位手段とを備える、請求項１又は２記載の装置。
4. 前記光形成可能なマトリクスが、１つ以上の酵素と、湿潤剤と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを実質的に均質な水性混合物中で含む組成物である、請求項１から３の何れか１項記載の装置。
5. 前記制御された量が約５ｎＬ〜約１μＬの範囲である、請求項１から４の何れか１項記載の装置。
6. 前記予め選択された位置が、約１０μｍ^２〜約７５ｍｍ^２の範囲の領域を有する、請求項１から５の何れか１項記載の装置。
7. 前記予め選択された位置が実質的に円形であり、約５μｍ〜約５ｍｍの範囲の半径寸法を有する、請求項１から６の何れか１項記載の装置。
8. 前記ＵＶ放射源が水銀ランプである、請求項１から７の何れか１項記載の装置。
9. 位置決めおよび位置合わせ手段が、ビームを前記表面の選択された領域上に集束させ、約１０μｍ^２〜約７５ｍｍ^２の範囲の領域を照射させる、請求項１から８の何れか１項記載の装置。
10. 塗布のタイミングおよび位置を制御するためのコンピュータプログラムを含む、請求項１から９の何れか１項記載の装置。
11. 塗布のタイミングに対するＵＶ放射の適用のタイミングおよび位置を制御するためのコンピュータプログラムを含む、請求項１から１０の何れか１項記載の装置。
12. １組の予め選択された位置に固定化酵素層のアレイを形成するために、前記塗布ヘッドおよび前記ＵＶ放射源に対し前記表面の相対位置を変化させるためのステップアンドリピート手段をさらに含む、請求項１から１１の何れか１項記載の装置。
13. 前記塗布ヘッドが、前記表面上の予め選択された組の位置に、一連の制御された体積の光形成可能なマトリクスを塗布することができ、前記ＵＶ放射源が、各制御された体積が塗布された後予め決定された時間に順に、予め決定された期間の間、放射ビームを、実質的に前記予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域上に集束させることができる、前記実質的に平らな表面上の固定化層アレイを形成するための、請求項１から１２の何れか１項記載の装置。
14. 実質的に平らな表面上のセンサアレイ上に固定化酵素層のアレイを形成するための装置であって、一連の制御された体積の光形成可能な酵素含有マトリクスを前記表面上の予め選択された組の位置に塗布するための塗布ヘッドと、各制御された体積が塗布された後予め決定された時間に順に、予め決められた期間の間、放射ビームを、実質的に前記予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域上に集束させることができる位置決めおよび位置合わせ手段を備えたＵＶ放射源とを、備える装置。
15. 実質的に平らな表面上のセンサ上に固定化層を形成する方法であって、
    （ａ）生物活性材料を含む、制御された体積の光形成可能なマトリクスを前記表面上の予め選択された位置で塗布する工程と、
    （ｂ）前記体積が塗布された後予め決められた時間で開始し、予め決められた期間の間、予め決められた強度で、実質的に前記予め選択された位置の範囲に及ぶ領域にＵＶ放射ビームを適用し、前記固定化層を形成させる工程と
    を含む方法。
16. 前記光形成可能なマトリクスが、１つ以上の酵素と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤とを水性混合物中で含む、請求項１５記載の方法。
17. 前記生物活性材料が、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡからなる群より選択される、請求項１５又は１６記載の方法。
18. 前記固定化層が酵素層である、請求項１５から１７の何れか１項記載の方法。
19. 実質的に平らな表面上のセンサアレイ上に固定化層のアレイを形成する方法であって、
    （ａ）一連の制御された体積の光形成可能なマトリクスを前記表面上の予め選択された組の位置で塗布する工程と、
    （ｂ）各制御された体積が塗布された後予め決められた時間で開始し、順に、実質的に前記予め選択された位置の各々の範囲に及ぶ領域にＵＶ放射ビームを適用し、前記放射を予め決められた強度で予め決められた期間の間適用し、前記固定化層アレイを形成させる工程と
    を含む方法。
20. 前記予め決められた時間が、約０．１〜約１０秒の範囲である、請求項１９記載の方法。
21. 前記予め決められた期間が、約０．１〜約１０秒の範囲である、請求項１９又は２０記載の方法。
22. 前記ＵＶ放射が約１８５〜４００ｎｍの波長範囲である、請求項１９から２１の何れか１項記載の方法。
23. 前記ＵＶ放射強度が約１００〜４００ｍＷ／ｃｍ^２の範囲である、請求項１９から２２の何れか１項記載の方法。
24. 前記実質的に平らな表面が、シリコンウエハからなり、前記予め選択された組の位置が、前記ウエハ上のセンサアレイである、請求項１９から２３の何れか１項記載の方法。
25. 前記ＵＶ放射ビームが、Ｎ−Ｘ番目の予め選択された位置に適用され、その間、塗布がＮ番目の予め選択された位置で起こり、Ｘが１〜１０の整数に等しい、請求項１９から２４の何れか１項記載の方法。
26. 電極を備え、前記電極を被覆する第１の層が、イオン選択性膜を含み、前記イオン選択性膜を被覆する第２の層が、１つ以上の酵素と、湿潤剤と、アクリル系モノマと、水溶性有機光開始剤と、水溶性アクリル系架橋剤との実質的に均質な水性混合物から形成されたＵＶスポット硬化マトリクスを含む、センサ。

Images