ES2830024T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento del edema macular - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento del edema macular

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ES2830024T3
ES2830024T3 ES16204718T ES16204718T ES2830024T3 ES 2830024 T3 ES2830024 T3 ES 2830024T3 ES 16204718 T ES16204718 T ES 16204718T ES 16204718 T ES16204718 T ES 16204718T ES 2830024 T3 ES2830024 T3 ES 2830024T3
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ES
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therapeutic agent
icam
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ES16204718T
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English (en)
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John Burnier
Thomas Gadek
Charles Semba
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Novartis AG
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Abstract

Un agente terapeutico que inhibe la interaccion de LFA-1 y un ICAM para uso en el tratamiento del edema macular, en donde el agente terapeutico es de Formula IIB o sus sales o esteres farmaceuticamente aceptables, **(Ver fórmula)** AR1 es un resto monociclico o policiclico arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, aliciclico o heterociclico; en que R17 es hidrogeno, sales o esteres farmaceuticamente aceptables, y en que R27 es **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para el tratamiento del edema macular
Antecedentes de la invención
En todo el mundo, una de las causas más importantes de ceguera es la retinopatía diabética (RD), que a menudo incluye un trastorno asociado, el edema macular diabético (EMD), que es una de las complicaciones de la diabetes que resulta en insulto, lesión y degeneración de la microvasculatura en el cuerpo y, en particular, el ojo. La pérdida del lugar de trabajo y la función personal posterior a una pérdida de la función visual de este tipo puede tener un impacto devastador en el individuo y en la comunidad que lo rodea en su conjunto. Casi todos los individuos con diabetes muestran algún grado de retinopatía diabética y el número de pacientes diabéticos está aumentando, por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos más efectivos para la pérdida de visión y los síntomas de la RD y el edema macular asociado.
El documento US 2004/028648 se refiere a métodos de tratamiento de la retinopatía, isquemia retiniana y/o edema retiniano, que comprenden administrar un antagonista de la integrina o subunidad de la integrina, un antagonista de las citoquinas inductoras de la adhesión de leucocitos o un antagonista del factor de crecimiento, un antagonista de selección o un antagonista de la molécula de adhesión.
Sumario de la invención y divulgación
La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con fines informativos. Además, cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
La presente invención proporciona un agente terapéutico tal como se define en las reivindicaciones 1 y 6 adjuntas para uso tal como se define en la reivindicación 1. También se describen métodos para tratar a un sujeto que padece retinopatía diabética, que comprenden administrar a dicho sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico que inhibe la interacción de LFA-1 y un ICAM.
También se describe un método para tratar a un sujeto que padece edema macular, que comprenden administrar a dicho sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico que inhibe la interacción de LFA-1 y un ICAM, reduciendo y/o previniendo con ello el edema macular en un ojo de dicho sujeto.
También se describe un método para tratar la retinopatía diabética en un sujeto, que comprende realizar una prueba de diagnóstico de retinopatía diabética en dicho sujeto; determinar si dicho sujeto padece retinopatía diabética basándose en los resultados de dicha prueba de diagnóstico y, tras el diagnóstico de dicha retinopatía diabética, administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un antagonista (LFA-1) en una formulación farmacéuticamente aceptable.
También se describe un método para reducir y/o prevenir la inflamación ocular post-operatoria en un sujeto que padece diabetes, que comprende administrar a dicho sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1, reduciendo y/o previniendo con ello la inflamación post-operatoria en un ojo de dicho sujeto.
La inflamación post-operatoria puede ser el resultado de vitrectomía, terapia de fotocoagulación con láser, terapia fotodinámica o LASIK. La etapa de diagnóstico puede realizarse formando imágenes de un ojo de dicho sujeto o analizando una muestra biológica de un ojo de dicho sujeto.
En algunas de las realizaciones de la divulgación, la ICAM es ICAM-1, ICAM-2 o ICAM-3. En algunas realizaciones, la ICAM es ICAM-1. En algunas realizaciones de la divulgación, el agente terapéutico es un antagonista de LFA-1. En algunas de las realizaciones de la divulgación, el antagonista de LFA-1 se une a un sitio de unión de alta afinidad en la subunidad aL de LFA-1 que se solapa con el sitio de unión de ICAM-1. En otras realizaciones de la divulgación, el antagonista de LFA-1 es directamente competitivo con la unión de ICAM-1 en la subunidad aL de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, el antagonista de LFA-1 es un inhibidor competitivo de la interacción entre LFA-1 e ICAM-1. En algunas realizaciones de la divulgación, el antagonista de LFA-1 es un antagonista alostérico de la unión de ICAM-1 en la subunidad aL de LFA-1.
La retinopatía diabética puede ser no proliferativa. En algunos aspectos de la divulgación, la retinopatía diabética es proliferativa. En algunas realizaciones de la divulgación, el daño resultante de la retinopatía diabética es edema macular, neovascularización retiniana, crecimiento fibrovascular sobre la retina, pérdida de visión, engrasamiento de la membrana basal, edema retiniano o isquemia retiniana.
En algunas de las realizaciones de la divulgación, se proporciona un antagonista de LFA que es un anticuerpo. En algunas de las realizaciones de la divulgación, se proporciona un antagonista de LFA que es un compuesto de Fórmula I, II, III, IV, V o VI.
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En algunas realizaciones, se proporciona el compuesto de Fórmula II que contiene una estereoquímica como en la Fórmula II'.
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Fórmula II'
En algunas de las realizaciones de la divulgación, se proporciona el compuesto de Fórmula III que contiene una estereoquímica como en la Fórmula III'.
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En algunas de las realizaciones de la divulgación, se proporciona un antagonista de LFA que es un compuesto de Fórmula IA, IIA o IIB.
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Fórmula IA Fórmula IIA Fórmula IIB
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y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables.
En algunas de las realizaciones de la divulgación, el antagonista de LFA-1 es un compuesto de Fórmula VII, VIII, IX, X u XI o enantiómeros, sales farmacéuticamente aceptables, o solvatos del mismo.
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Fórmula XI Fórmula X
En algunas de las realizaciones de la divulgación, el agente terapéutico se administra por vía tópica, oral, periocular, intraocular, mediante inyección, nasal, mediante un aerosol, mediante un inserto, mediante un dispositivo implantado o mediante una gota. En otra de las realizaciones de la divulgación, el agente terapéutico se administra en un vehículo soporte que es gotas líquidas, lavado líquido, líquido nebulizado, gel, pomada, aerosol, pulverización, micropartículas y nanopartículas poliméricas, solución, suspensión, sólido, matriz biodegradable, polvo, cristales, espuma o liposomas. En algunas de las realizaciones de la divulgación, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente terapéutico a un ojo de dicho sujeto mediante administración local o sistémica. En algunas de las realizaciones de la divulgación, se realiza una administración inyectable por vía intraocular o periocular. En algunas realizaciones de la divulgación, la administración se realiza mediante la administración de una instilación intraocular de un gel, crema, polvo, espuma, cristales, liposomas, pulverización, microesferas o nanoesferas poliméricas o una forma de suspensión líquida de dicho compuesto. En algunas de las realizaciones, se utilizan microesferas o nanoesferas poliméricas para suministrar el agente terapéutico mediante inyección o implantación periocular o intraocular.
En algunas de las realizaciones, se suministra una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico a un ojo de dicho sujeto mediante suministro local o sistémico.
En algunas de las realizaciones de la divulgación, el agente terapéutico se administra en un vehículo soporte que es gotas líquidas, lavado líquido, líquido nebulizado, gel, pomada, aerosol, pulverización, micropartículas y nanopartículas poliméricas, solución, suspensión, sólido, matriz biodegradable, polvo, cristales, espuma o liposomas. En algunas de las realizaciones de la divulgación, la administración tópica comprende la infusión de dicho compuesto en dichos ojos mediante un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un sistema de bomba-catéter, un inserto, un dispositivo de liberación continua o selectiva, un implante bioabsorbible, una formulación de liberación continua o sostenida y una lente de contacto. En algunas de las realizaciones de la divulgación, la administración inyectable se realiza por vía intraocular, intravítrea, periocular, subcutánea, subconjuntival, retrobulbar o intracameral. También se proporcionan formulaciones de liberación controlada en algunas realizaciones de la divulgación. En algunas realizaciones de la divulgación, los compuestos de la divulgación se formulan como profármacos. En algunas realizaciones de la divulgación, la formulación del agente terapéutico no incluye conservantes. En algunas realizaciones de la divulgación, la formulación del agente terapéutico incluye al menos un conservante. En algunas realizaciones de la divulgación, la formulación del agente terapéutico incluye un agente espesante. En otras realizaciones de la divulgación, la formulación del agente terapéutico utiliza micropartículas o nanopartículas de PLGA.
En algunas realizaciones de la divulgación, el compuesto se administra al sujeto en una cantidad suficiente para lograr concentraciones intraoculares o retinianas de aproximadamente 1 x 10-8 a aproximadamente 1 x 10 moles/litro. En algunas realizaciones de la divulgación, el compuesto se administra al menos una vez al año. En otras realizaciones de la divulgación, el compuesto se administra al menos una vez al día En otras realizaciones de la divulgación, el compuesto se administra al menos una vez por semana. En algunas realizaciones de la divulgación, el compuesto se administra al menos una vez al mes.
En algunas realizaciones de la divulgación, se administra un segundo agente terapéutico antes de, en combinación con, al mismo tiempo o después de la administración del antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en antioxidantes, agentes antiinflamatorios, antimicrobianos, esteroides, inhibidores de la proteína quinasa C, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, agentes antiangiogénicos, inhibidores del complemento y agentes anti-apoptóticos. En algunas realizaciones de la divulgación, el segundo agente terapéutico es un agente terapéutico anti-adherencia que se une a un sitio de unión alostérico en LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, el segundo agente terapéutico es un anticuerpo terapéutico anti-adherencia o un fragmento de anticuerpo.
En algunas realizaciones de la divulgación, se incluye una prueba de diagnóstico en un método de tratamiento con un antagonista de LFA-1. En una realización, se realiza una prueba de diagnóstico para la retinopatía diabética y después de que se haga un diagnóstico de la enfermedad, se administra al sujeto un antagonista de l FA-1 tal como se describe en esta memoria. En algunas realizaciones de la divulgación, la prueba de diagnóstico se realiza formando imágenes de un ojo del sujeto o analizando una muestra biológica de un ojo del sujeto.
En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica formulada para el suministro ocular, que comprende un agente terapéutico que inhibe la interacción de LFA-1 y una ICAM y un soporte farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un agente terapéutico que inhibe la interacción de LFA-1 y una ICAM, que es un compuesto de Fórmula I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X u XI. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para la administración tópica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para la administración mediante inyección. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es adecuada para la administración adecuada para la administración como un implante.
En otro aspecto, se proporcionan compuestos para uso en los métodos de la divulgación. Compuestos que son útiles en los métodos de la divulgación incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, polipéptidos, péptidos, polímeros y moléculas orgánicas pequeñas. En otra realización del método de la presente divulgación, el anticuerpo Raptiva se utiliza en una formulación ocular para tratar la retinopatía diabética.
Breve descripción de los dibujos
Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que recoge realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios de la divulgación, y los dibujos adjuntos, de los cuales:
La Figura 1 representa la rodadura, la adhesión de leucocitos y la migración transendotelial resultante de la interacción LFA-1:ICAM-1.
La Figura 2 representa la activación del antígeno de la interacción LFA-1:ICAM-1.
La Figura 3 representa la función co-estimulante de la interacción LFA-1:ICAM-1.
La Figura 4 representa antagonistas de moléculas pequeñas útiles en los métodos de identificación.
La Figura 5 representa el análisis SDS-PAGE de compuesto 5 LFA-1 reticulado.
La Figura 6 representa la unión de compuesto 2B e ICAM-1-Ig a células 293 que expresan LFA-1 de tipo salvaje o LFA-1 que carece del dominio I.
La Figura 7 representa la competencia de antagonistas por los compuestos 2A, 3, A-286982 y sICAM-1 en los ELISA de LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/molécula pequeña.
La Figura 8 representa la correlación de los valores de CI50 de la competencia de antagonistas en los ELISA de LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/molécula pequeña.
La Figura 9 representa el efecto de los antagonistas sobre la unión del ligando en los ELISA de LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/molécula pequeña.
La Figura 10 representa las regresiones de Schild del antagonismo de sICAM-1 y compuesto 3.
La Figura 11 es una representación gráfica del efecto de un antagonista de LFA-1 directamente competitivo de la divulgación sobre la liberación de citoquinas inflamatorias, en mononucleocitos humanos (PBMC) estimulados con enterotoxina B estafilocócica (SEB) en comparación con el efecto de ciclosporina-A (CsA).
La Figura 12 es una representación gráfica de la distribución en el ojo a través de la aplicación tópica de un antagonista de LFA-1 marcado con 14C directamente competitivo LFA-1 de la divulgación en el momento de 30 minutos y un momento de 4 horas después de la administración, tal como se mide mediante la detección del marcador radiactivo.
Descripción detallada de la invención y divulgación
I. Biología y Enfermedad: Retinopatía Diabética (RD) y el Uso de Antagonistas de LFA-1 en Tratamientos para RD.
La diabetes se describe a menudo como una enfermedad global que conduce a efectos deletéreos observados en todo el cuerpo de un individuo que padece esta enfermedad, que pueden aumentar significativamente a medida que el individuo envejece. Las complicaciones oculares de la diabetes son una de las principales causas de pérdida de visión y ceguera en todo el mundo.
Un efecto general es el desarrollo de alteraciones en la microvasculatura retiniana que conduce a la pérdida de la autorregulación microcapilar, una afección conocida como retinopatía diabética (RD).
La retinopatía diabética se divide a menudo en dos categorías para la gestión clínica de la enfermedad: no proliferativa (o etapa de fondo) y una fase proliferativa posterior.
La retinopatía diabética no proliferativa (RDNP) demuestra, al principio, anomalías de la arquitectura microvascular normal caracterizadas por degeneración de los capilares retinianos, formación de microaneurismas capilares saculares, capilares deficientes en pericitos y oclusión y obliteración capilares. Los mecanismos de acción incluyen la inflamación vascular inducida por la diabetes que conduce a la oclusión de la luz vascular por leucocitos y plaquetas, seguida de la muerte final tanto de los pericitos como de las células endoteliales. La atracción y adhesión de los leucocitos a la pared vascular por el proceso inflamatorio hace que los leucocitos se adhieran temporalmente al endotelio (leucostasis), liberen factores citotóxicos y dañen o exterminen la célula endotelial. La superficie endotelial dañada inicia la adherencia plaquetaria, la agregación, la formación de microtrombos, la oclusión vascular y la isquemia. Otra consecuencia de la lesión endotelial es la alteración de la barrera hemato-retiniana (BHR) que provoca un aumento de la permeabilidad vascular. Esto se puede evidenciar por la fuga de fluoresceína durante la angiografía con fluoresceína o el engrosamiento de la retina evaluado por tomografía de coherencia óptica (TCO). Las consecuencias de esta fuga pueden ser un edema macular clínicamente significativo y el depósito de lipoproteínas en la retina (exudados duros) que contribuyen al engrosamiento de la retina. A medida que continúa el proceso, las células ganglionares de la retina se pierden, lo que conduce a la pérdida de visión o ceguera. La autorregulación interrumpida y la disminución del flujo sanguíneo retiniano que resultan de los cambios en la vasculatura en las células endoteliales, la muerte de pericitos y la obliteración capilar son marcadores de progresión de la RD y conducen al desarrollo de isquemia retiniana, que permite el desarrollo de la etapa proliferativa más grave de la RD.
La RD proliferativa implica neovascularización o angiogénesis, inducida por isquemia retiniana del disco u otras localizaciones de la retina. Esta nueva vasculatura puede provocar una hemorragia del humor vítreo y desprendimientos de retina del tejido fibroso contráctil acompañante.
En cualquier momento durante esta progresión de la retinopatía diabética, se puede desarrollar edema macular o edema macular diabético (EMD), con un impacto grave en la función de la visión. La progresión de este trastorno asociado se predice por una fuga vascular retiniana y conduce a un tratamiento de la fotocoagulación con el fin de reducir el riesgo de pérdida de visión. Dado que una gran proporción de pacientes con retinopatía diabética también padecen este trastorno, es un objetivo de intervención clínica relevante. Todas esta lesiones o insultos degenerativas pueden conducir a un deterioro o incluso a la pérdida total de la agudeza visual y ofrecer objetivos para la intervención terapéutica. Actualmente no se dispone de opciones terapéuticas eficaces. La fotocoagulación por láser implica la administración de quemaduras con láser en diversas áreas del ojo y se utiliza en el tratamiento de muchos trastornos relacionados con la neovascularización. La neovascularización, en particular, se trata comúnmente con fotocoagulación panretiniana o dispersa. Sin embargo, el tratamiento con láser puede provocar puntos ciegos permanentes correspondientes a las áreas tratadas. El tratamiento con láser también puede provocar una hemorragia persistente o recurrente, aumentar el riesgo de desprendimiento de retina o inducir neovascularización o fibrosis. Otras opciones de tratamiento para trastornos relacionados con los ojos incluyen termoterapia, vitrectomía, terapia fotodinámica, radioterapia, cirugía, p. ej., eliminación del tejido ocular en exceso y similares. Sin embargo, en la mayoría de los casos, todas las opciones de tratamiento disponibles tienen un efecto terapéutico limitado, requieren procedimientos repetidos y costosos y/o están asociadas con efectos secundarios peligrosos.
El control de la hiperglucemia no ha demostrado ser suficiente para acabar con esta progresión. Se ha identificado una serie de procesos que contribuyen en la oclusión y obliteración capilar retiniana en la RD, que incluyen microtrombosis, apoptosis y cambios proinflamatorios, que pueden ser puntos de intervención útiles para prevenir la progresión de la RD y/o revertir el daño ya incurrido. Además, un evento temprano en el inicio de la descomposición de la BHR y la falta de perfusión capilar parece ser la adhesión de leucocitos a la vasculatura retiniana diabética.
Los leucocitos adherentes están asociados temporal y espacialmente con la lesión de las células endoteliales de la retina y la muerte en el espacio de una semana de la diabetes experimental inducida por estreptozotocina en ratas. Se ha demostrado que la neutralización basada en anticuerpos de ICAM-1 y CD18 previene tanto la adhesión de leucocitos como la lesión y muerte de las células endoteliales retinianas. (A. M. Joussen, T. Murata, A. Tsujikawa, B. Kirchof, S-E. Bursell, A. P. Adamis "Leukocyte- Mediated Endothelial Cell Injury and Death in the Diabetic Retina" (2001) A, J. Pathol.
158(1): 147-162).
La inhibición de los eventos de adhesión, la interrupción de los ciclos de respuesta proinflamatoria y la prevención de la formación de capilares acelulares en los tejidos isquémicos, todos los cuales surgen en este estado patológico, pueden ser estrategias de terapia ventajosas. Las interacciones del antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1)/molécula de adhesión intracelular -1 (ICAM-1) median en cada uno de estos eventos moleculares. Por lo tanto, los antagonistas de LFA-1 de la divulgación pueden ser útiles en terapias contra uno o más de los síntomas patológicos observados en esta enfermedad.
Sin pretender limitar el mecanismo de acción, los métodos de la presente divulgación implican la inhibición del inicio y la progresión de la retinopatía diabética (RD), inhibiendo la interacción entre LFA-1 e ICAM-1. LFA-1 e ICAM-1 son moléculas con dominios de receptores extracelulares que están implicados en el proceso de adhesión, migración y proliferación de linfocitos/leucocitos, conduciendo a una cascada de respuestas inflamatorias. En realizaciones preferidas, métodos de este tipo proporcionan efectos antiinflamatorios in-vitro e in-vivo, p. ej., tal como se describe con mayor detalle a continuación, y son útiles en el tratamiento de la RD.
La sangre humana contiene glóbulos blancos (leucocitos) que se clasifican además en neutrófilos, linfocitos (con subtipos B y T), monocitos, eosinófilos y basófilos. Varias de estas clases de leucocitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y linfocitos están implicados en trastornos inflamatorios. LFA-1 es uno de un grupo de leucointegrinas que se expresan en la mayoría de los leucocitos, y se considera que es la integrina linfoide queinteractúa con un cierto número de ICAMs como ligandos. La interrupción de estas interacciones y, por lo tanto, de la respuesta inmunitaria/inflamatoria permite reducir la inflamación, en particular, la inflamación del ojo.
Por ejemplo, ICAM-1 (CD54) es un miembro de la familia de receptores de adhesión ICAM (ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, ICAM-4) en la superfamilia de proteínas de inmunoglobulina, y se expresa en leucocitos activados, fibroblastos dérmicos y células endoteliales. Normalmente se expresa en las células endoteliales que recubren la vasculatura y se regula al alza tras la exposición a citoquinas, tales como IL-1, LPS y TNF durante la iniciación inmunitaria/inflamatoria.
La investigación realizada a lo largo de la última década ha ayudado a dilucidar los eventos moleculares implicados en el movimiento y la activación de las células en el sistema inmunológico, centrándose en las interacciones desencadenantes de célula a célula dentro de la cascada. La interacción de moléculas de adhesión intercelular (ICAMs) con leucointegrinas juega un papel en el funcionamiento del sistema inmunológico. Los procesos inmunitarios, tales como la presentación de antígenos, la citotoxicidad mediada por leucocitos, la citotoxicidad mediada por células T y la migración transendotelial de leucocitos (diapédesis) pueden requerir la adhesión celular mediada por ICAm que interactúa con leucointegrinas.
Se ha demostrado que la interacción de ICAM-1 y LFA-1 (a LFA-1 también se le alude como aLp2 y CD11a/CD18) está implicada en los procesos de adhesión, migración transendotelial de leucocitos, migración a sitios de lesión y proliferación de linfocitos en el sitio diana activado tal como se muestra en la Figura 1. Por ejemplo, actualmente se cree que antes de la adhesión de leucocitos y la migración transendotelial, los componentes de la respuesta inflamatoria, la presencia de citoquinas/quimioquinas activan las integrinas expresadas constitutivamente en los leucocitos. Las células endoteliales de los vasos sanguíneos también regulan al alza ICAM-1 en respuesta a la presencia de las mismas citoquinas/quimioquinas. A medida que los leucocitos rodantes se aproximan a las células endoteliales activadas, estos receptores de ICAM-1 regulados al alza ralentizan primero su progreso. A esto le sigue una interacción ligando/receptor entre LFA-1 e ICAM-1, expresada en las superficies de las células endoteliales de los vasos sanguíneos, que impide que el linfocito ruede más. Luego, el linfocito se aplana y tiene lugar la transmigración. Este proceso es de importancia tanto en la transmigración de linfocitos a través del endotelio vascular como en el tráfico de linfocitos desde la sangre periférica a los ganglios linfáticos. Sin embargo, en la retinopatía diabética (RD), tal como se comentó arriba, la leucostasis es el desencadenante inicial de la liberación del factor citotóxico que daña y/o destruye las células endoteliales en el área local. Este daño conduce a la filtración e inflamación de los vasos, que continúa y/o amplifica la respuesta dañina.
LFA-1 juega un papel en la creación y el mantenimiento de la sinapsis inmunológica, que puede definirse como la estructura física de las superficies que interactúan de las células T y las células presentadoras de antígeno (CPA) tal como se muestra en la Figura 2. LFA-1 estabiliza el compromiso de las células T con la CPA y, por lo tanto, conduce a la activación de las células T. La interacción de LFA-1 e ICAM-1 también parece proporcionar señales co-estimuladoras a las células T en reposo tal como se muestra en la Figura 3. La proliferación de células T CD4 y la síntesis de citoquinas están mediadas por esta interacción como parte de la respuesta inflamatoria.
Dado el papel que juega la interacción de ICAM-1 y LFA-1 en la respuesta inmunitaria/inflamatoria, es deseable modular estas interacciones para lograr un resultado terapéutico deseado (p. ej., Inhibición de la interacción en caso de una respuesta inflamatoria hiperactiva). Además, dado que LFA-1 tiene varios participantes ligandos dentro de la familia ICAM (ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3), que implican un cierto número de vías de señalización, en algunas realizaciones de la divulgación, es deseable modular estas interacciones de forma selectiva. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan agentes terapéuticos que interferirán con la asociación de LFA-1 con ICAM-1, ICAM-2 y/o ICAM-3 para modular así las vías de señalización respectivas para cada par de interacciones.
Los métodos y las composiciones descritos en esta memoria pueden modular uno o más componentes de las rutas descritas en esta memoria. Además de inhibir la interacción entre LFA-1 e ICAM-1, los métodos y las composiciones de la presente divulgación también pueden intervenir en porciones anteriores o posteriores del proceso inflamatorio. Por ejemplo, la regulación al alza de ICAM-1 o LFA-1 (activación) en células endoteliales o leucocitos, antes de la inmovilización y la migración transendotelial, puede modularse mediante los métodos y las composiciones descritos en esta memoria. La presente divulgación puede ser útil para modular la expresión de citoquinas o quimioquinas que activan ICAM-1 y LFA-1 en el curso del tráfico de leucocitos, para modular el transporte de las citoquinas o quimioquinas, para prevenir la transmigración del leucocito detenido, para modular la señalización a través de otros mecanismos que están implicados en la proliferación de leucocitos en el sitio de la lesión o inflamación, y similares.
La divulgación proporciona agentes terapéuticos que interfieren con la asociación de LFA-1 con ICAM-1, que pueden bloquear la adhesión, migración, proliferación y liberación de señales inflamatorias al tejido circundante por las células del sistema inmunológico. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para administrar un agente terapéutico que inhibe la interacción entre LFA-1 y un ICAM. En un ejemplo, el agente terapéutico se une a LFA-1 o se une a una ICAM. Más específicamente, la divulgación proporciona agentes terapéuticos que se unen a LFA-1 para inhibir la asociación de LFA-1 con ICAM-1, ICAM-2 y/o ICAM-3, actuando así como antagonistas de LFA-1. En algunas realizaciones, el agente terapéutico proporcionado por la divulgación se une al sitio de unión de alta afinidad en la subunidad aL que se solapa al sitio de unión de ICAM-1, que es un antagonista directamente competitivo de LFA-1. En algunas realizaciones, el agente terapéutico proporcionado por la divulgación inhibe la interacción entre LFA-1 e ICAM-1 pero no bloquea completamente el sitio de unión de alta afinidad en la subunidad aL que se solapa al sitio de unión de ICAM-1, y es competitivo pero no un antagonista directamente competitivo de LFA-1. En algunas realizaciones, el agente terapéutico proporcionado por la divulgación se une en un sitio fuera del sitio de unión de alta afinidad en la subunidad aL que se solapa al sitio de unión de ICAM-1, y es un antagonista alostérico. En algunas de las realizaciones, el agente terapéutico proporcionado por la divulgación es un antagonista alostérico y es un antagonista competitivo pero no directamente competitivo de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, los agentes terapéuticos son útiles para tratar la retinopatía diabética y los trastornos asociados con esa afección.
II. Compuestos Útiles en el Método.
El término "alifático", tal como se utiliza en esta memoria, incluye hidrocarburos alifáticos de cadena lineal (no ramificada) o ramificados, tanto saturados como insaturados, que están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales. Como apreciará un experto en la técnica, en esta memoria “alifático” pretende incluir restos alquilo, alquenilo, alquinilo. Por lo tanto, tal como se utiliza en esta memoria, el término "alquilo" incluye grupos alquilo lineales y ramificados. Una convención análoga se aplica a otros términos genéricos tales como "alquenilo" y "alquinilo".
Además, tal como se utiliza en esta memoria, los términos "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo" abarcan tanto grupos sustituidos como no sustituidos. En determinadas realizaciones, tal como se utiliza en esta memoria,, "alquilo inferior" se utiliza para indicar aquellos grupos alquilo (sustituidos, no sustituidos, ramificados o no ramificados) que tienen aproximadamente 1-6 átomos de carbono.
En determinadas realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la divulgación contienen aproximadamente 1-20 átomos de carbono alifáticos. En determinadas otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la divulgación contienen aproximadamente 1-10 átomos de carbono alifáticos. En aún otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la divulgación contienen aproximadamente 1-8 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la divulgación contienen aproximadamente 1-6 átomos de carbono alifáticos. En aún otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la divulgación contienen aproximadamente 1-4 átomos de carbono. Grupos alifáticos ilustrativos incluyen así, por ejemplo, restos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, alilo, n-butilo, sec.-butilo, isobutilo, terc.-butilo, n-pentilo, sec.-pentilo, isopentilo, terc.-pentilo, n-hexilo y sec.-hexilo, que de nuevo pueden portar uno o más sustituyentes.
Grupos alquenilo incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo y butenilo. Grupos alquinilo representativos incluyen etinilo y 2-propinilo.
La expresión "alquileno inferior", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una cadena hidrocarbonada que enlaza juntos otros dos grupos, es decir, está unida a otro grupo en cualquier extremo, por ejemplo, metileno, etileno y butileno. Un sustituyente de este tipo tiene preferiblemente de 1 a 10 carbonos y más preferiblemente de 1 a 5 carbonos. Dichos grupos pueden estar sustituidos, preferiblemente con un grupo amino, acetilamino (un grupo alquil inferior-carbonilo unido mediante un átomo de nitrógeno) o cicloalquilo inferior. Por lo último se entiende un anillo hidrocarbonado saturado, preferiblemente con un total de 3 a 10 metilenos (incluidos los carbonos de unión), más preferiblemente 3 a 6.
El término "alicíclico", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a compuestos que combinan las propiedades de compuestos alifáticos y cíclicos e incluyen hidrocarburos alifáticos monocíclicos o policíclicos y compuestos cicloalquilo puenteados, que están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales.
Como apreciará un experto ordinario en la técnica, en esta memoria "alicíclico" pretende incluir restos cicloalquilo, cicloalquenilo y cicloalquinilo, que están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales.
Por lo tanto, grupos alicíclicos ilustrativos incluyen, por ejemplo, restos ciclopropilo, -CH2-ciclopropilo, ciclobutilo, -CH2-ciclobutilo, ciclopentilo, -CH2-ciclopentilo, ciclohexilo, -CH2-ciclohexilo, ciclohexeniletilo, ciclohexaniletilo y norbornilo, que de nuevo, puede portar uno o más sustituyentes.
El término "alcoxi" o "alquiloxi", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un resto molecular parental saturado o insaturado a través de un átomo de oxígeno. En determinadas realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-20 átomos de carbono alifáticos. En determinadas otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1­ 10 átomos de carbono alifáticos. En aún otras realizaciones, el grupo alquilo empleado en la divulgación contiene aproximadamente 1-8 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de alcoxi incluyen metoxi, etoxi, isopropoxi, n-butoxi, ibutoxi, sec.-butoxi, terc.-butoxi, neopentoxi y n-hexiloxi.
La expresión "alcoxi inferior", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un alquilo inferior tal como se define arriba, que puede estar ramificado o no ramificado como también se define arriba y que está unido por un oxígeno a otro grupo (es decir, alquil éteres).
El término "tioalquilo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grupo saturado o insaturado (es decir, S-alquenilo y S-alquinilo) unido al resto molecular precursor a través de un átomo de azufre. En determinadas realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-20 átomos de carbono alifáticos. En determinadas otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-10 átomos de carbono alifáticos. En aún otras realizaciones, el grupo alquilo empleado en la divulgación contiene aproximadamente 1-8 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de tioalquilo incluyen, pero no se limitan a metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio y n-butiltio.
La expresión "alquil inferior-tio", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grupo alquilo inferior unido a través de un átomo de azufre divalente, por ejemplo, un grupo metilmercapto o isopropilmercapto. Por alquilen inferior-tio se entiende un grupo de este tipo que está unido en cada uno de los extremos.
El término "alquilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura NHR', en donde R' es alquilo, tal como se define en esta memoria. El término "alquilamino" se refiere a un grupo que tiene la estructura NH2R'-, en donde es como se define en esta memoria. En determinadas realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-20 átomos de carbono alifáticos. En determinadas otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-10 átomos de carbono alifáticos. En aún otras realizaciones, el grupo alquilo empleado en la divulgación contiene aproximadamente átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquilo contiene aproximadamente 1-4 átomos de carbono alifáticos. Ejemplos de alquilamino incluyen metilamino.
Algunos ejemplos de sustituyentes de los restos alifáticos (y otros) de compuestos de la invención arriba descritos incluyen alifático; alicíclico; heteroalifático; heterocíclico; aromático; heteroaromático; arilo; heteroarilo; alquilarilo; heteroalquilarilo; alquilheteroarilo; heteroalquilheteroarilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; Rx incluye independientemente alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo o heteroalquilheteroarilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, alicíclicos, heteroalifáticos, heterocíclicos, alquilarlo, o alquilheteroarilo arriba descritos y en esta memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos, ramificados o no ramificados, saturados o insaturados, y en donde cualquiera de los sustituyentes arilo o heteroarilo arriba descritos y en esta memoria puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en esta memoria.
En general, la expresión "resto aromático", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un resto insaturado monocíclico o policíclico estable que tiene preferiblemente 3-14 átomos de carbono, cada uno de los cuales puede estar sustituido o no sustituido. En determinadas realizaciones, la expresión "resto aromático" se refiere a un anillo plano que tiene orbitales p perpendiculares al plano del anillo en cada uno de los átomos del anillo y que cumple la regla de Huckel, en que el número de electrones pi en el anillo es (4n+2), en donde n es un número entero. Un resto monocíclico o policíclico que no satisface uno o todos estos criterios de aromaticidad se define en esta memoria como "no aromático " y está abarcado por el término "alicíclico".
En general, la expresión "resto heteroaromático", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un resto insaturado monocíclico o policíclico estable que tiene preferiblemente 3-14 átomos de carbono; cada uno de los cuales puede estar sustituido o no sustituido; y que comprende al menos un heteroátomo seleccionado de O, S y N dentro del anillo en lugar de un átomo de carbono del anillo). En determinadas realizaciones, la expresión "resto heteroaromático" se refiere a un anillo plano que comprende al menos un heteroátomo que tiene orbitales p perpendiculares al plano del anillo en cada uno de los átomos del anillo y que cumple la regla de Huckel, en que el número de electrones pi en el anillo es (4n+2), en donde n es un número entero.
También se apreciará que los restos aromáticos y heteroaromáticos, tal como se definen en esta memoria, pueden estar unidos mediante un resto alquilo o heteroalquilo y, por lo tanto, también incluyen restos -(alquil) aromáticos, -(heteroalquil) aromáticos, -(heteroalquil) heteroaromáticos y -(heteroalquilo) heteroaromáticos. Por tanto, tal como se utiliza en esta memoria, las frases "restos aromáticos o heteroaromáticos" y "aromático, (heteroalquil) aromático, -(heteroalquil) heteroaromático y (heteroalquil) heteroaromático" son intercambiables. Sustituyentes incluyen cualquiera de los sustituyentes mencionados anteriormente, p. ej., los sustituyentes enumerados para restos alifáticos, o para otros restos tal como se describe en esta memoria, dando como resultado la formación de un compuesto estable.
El término "arilo", tal como se utiliza en esta memoria, no difiere significativamente del significado común del término en la técnica, y se refiere a un resto cíclico insaturado que comprende al menos un anillo aromático. En determinadas realizaciones, "arilo" se refiere a un sistema de anillo carbocíclico monocíclico o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos que incluyen, pero no se limitan a fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo e indenilo.
El término " heteroarilo", tal como se utiliza en esta memoria, no difiere significativamente del significado común del término en la técnica, y se refiere a un radical aromático cíclico que tiene de cinco a diez átomos del anillo, de los cuales un átomo del anillo se selecciona entre S y N; cero, uno o dos átomos del anillo son heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de S y N; y los átomos restantes del anillo son carbono, estando el radical unido al resto de la molécula a través de cualquiera de los átomos del anillo, tales como, por ejemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo e isoquinolinilo.
Se apreciará que los grupos arilo y heteroarilo (incluidos los grupos arilo bicíclicos) pueden estar no sustituidos o sustituidos, en donde la sustitución incluye el reemplazo de uno o más de los átomos de hidrógeno de los mismos independientemente por uno cualquiera o más de los siguientes restos que incluyen: alifático; alicíclico; heteroalifático; heterocíclico; aromático; heteroaromático; arilo; heteroarilo; alquilarilo; heteroalquilarilo; alquilheteroarilo; heteroalquilheteroarilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCh; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(=O)Rx; -C(=O)N(Rx)2; -OC(=O)Rx; -OCO2Rx; -OC(=O)N(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, en donde cada aparición de Rx incluye independientemente alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo o heteroalquilheteroarilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, alicicíclicos, heteroalifáticos, heterocíclicos, alquilarilo o alquilheteroarilo arriba descritos y en esta memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos, ramificados o no ramificados, saturados o insaturados, y en donde cualquiera de los sustituyentes aromáticos, heteroaromáticos, arilo, heteroarilo, -(alquil) arilo o -(alquil) heteroarilo arriba descritos y en esta memoria puede estar sustituido o no sustituido. Adicionalmente, se apreciará que cualquiera de dos grupos adyacentes tomados juntos pueden representar un resto alicíclico o heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros, sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en esta memoria.
El término "cicloalquilo", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere específicamente a grupos que tienen de tres a siete, preferiblemente de tres a diez átomos de carbono. Cicloalquilos adecuados incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo, que, como en el caso de restos alifáticos, alicíclicos, heteroalifáticos o heterocíclicos, pueden estar opcionalmente sustituidos con sustituyentes que incluyen alifáticos; alicíclicos; heteroalifáticos; heterocíclicos; aromáticos ; heteroaromáticos; arilo; heteroarilo; alquilarilo; heteroalquilarilo; alquilheteroarilo; heteroalquilheteroarilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(=O)Rx; -C(=O)N(Rx)2; -OC(=O)Rx; -OCO2RX; -OC(=O)N(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, en donde cada una de las apariciones de Rx incluye independientemente alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo o heteroalquilheteroarilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, alicíclicos, heteroalifáticos, heterocíclicos, alquilarilo o alquilheteroarilo arriba descritos y en esta memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos, ramificados o no ramificados, saturados o insaturados, y en donde cualquiera de los sustituyentes aromáticos, heteroaromáticos, arilo o heteroarilo arriba descritos y en esta memoria puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en esta memoria.
El término "heteroalifático", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a restos alifáticos en los que uno o más átomos de carbono en la cadena principal han sido sustituidos con un heteroátomo. Por tanto, un grupo heteroalifático se refiere a una cadena alifática que contiene uno o más átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo o silicio, p. ej., de átomos de carbono. Los restos heteroalifáticos pueden ser lineales o ramificados y saturados o insaturados. En determinadas realizaciones, los restos heteroalifáticos se sustituyen mediante el reemplazo independiente de uno o más de los átomos de hidrógeno de los mismos con uno o más restos, incluidos los alifáticos; alicíclicos; heteroalifáticos; heterocíclicos; aromáticos; heteroaromáticos; arilo; heteroarilo; alquilarilo; alquilheteroarilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCh; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(=O)Rx; -C(=O)N(Rx)2; -OC(=O)Rx; -OCO2RX; -OC(=O)N(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, en donde cada aparición de Rx incluye independientemente alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo o heteroalquilheteroarilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, heteroalifáticos, alicíclicos, heterocíclicos, alquilarilo o alquilheteroarilo arriba descritos y en esta memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos, ramificados o no ramificados, saturados o insaturados, y en donde cualquiera de los sustituyentes aromáticos, heteroaromáticos, arilo o heteroarilo arriba descritos y en esta memoria puede estar sustituido o no sustituido. Ejemplos adicionales de sustituyentes generalmente aplicables se ilustran mediante las realizaciones específicas mostradas en los Ejemplos que se describen en esta memoria.
El término "heterocicloalquilo", "heterociclo" o "heterocíclico", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a compuestos que combinan las propiedades de compuestos heteroalifáticos y cíclicos e incluyen sistemas de anillos cíclicos monocíclicos o policíclicos saturados e insaturados que tienen 5-16 átomos, en donde al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado de S y N (en donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente), en donde los sistemas de anillo están opcionalmente sustituidos con uno o más grupos funcionales tal como se define en esta memoria. En determinadas realizaciones, el término "heterocicloalquilo", "heterociclo" o "heterocíclico" se refiere a un anillo no aromático de 5, 6 o 7 miembros o un grupo policíclico, en donde al menos un heteroátomo del átomo del anillo se selecciona entre S y N (en donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre se pueden oxidar opcionalmente), incluyendo un grupo bi- o tri-cíclico, que comprende anillos de seis miembros condensados que tienen entre uno y tres heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre y nitrógeno, en donde (i) cada uno de los anillos de 5 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, cada uno de los anillos de 6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces y cada uno de los anillos de 7 miembros tiene de 0 a 3 dobles enlaces, (ii) los heteroátomos de nitrógeno y azufre se pueden oxidar opcionalmente, (iii ) el heteroátomo de nitrógeno puede estar cuaternizado opcionalmente y (iv) cualquiera de los anillos heterocíclicos anteriores puede estar condensado con un anillo arilo o heteroarilo. Heterociclos representativos incluyen heterociclos, tales como furanilo, piranilo, pirrolilo, tienilo, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolilo, oxazolidinilo, isooxazolilo, isoxazolidinilo, dioxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, triazolilo, tiatriazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, morfolinilo, tiazolilo, tiazolidinilo, isotiazolilo, isotiazolidinilo, ditiazolilo, ditiazolidinilo, tetrahidrofurilo y derivados benzo-condensados de los mismos. En determinadas realizaciones, se utiliza un grupo "heterociclo o heterocicloalquilo o heterocíclico sustituido" y, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grupo heterociclo o heterocicloalquilo o heterocíclico tal como se definió arriba, sustituido por el reemplazo independiente de uno, dos o tres de los átomos de hidrógeno sobre los mismos con alifático; alicíclico; heteroalifático; heterocíclico; aromático; heteroaromático; arilo; heteroarilo; alquilarilo; heteroalquilarilo; alquilheteroarilo; heteroalquilheteroarilo; alcoxi; ariloxi; heteroalcoxi; heteroariloxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCh; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(=O)Rx; -C(=O)N(Rx)2; -OC(=O)Rx; -OCO2RX; -OC(=O)N(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, en donde cada aparición de Rx incluye independientemente alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo o heteroalquilheteroarilo, en donde cualquiera de los sustituyentes alifáticos, alicíclicos, heteroalifáticos, heterocíclicos, alquilarilo o alquilheteroarilo arriba descritos y en esta memoria pueden estar sustituidos o no sustituidos, ramificados o no ramificados, saturados o insaturados, y en donde cualquiera de los aromáticos, heteroaromáticos, arilo o heteroarilo arriba descritos y en el presente documento puede estar sustituido o no sustituido. Adicionalmente, se apreciará que cualquiera de los restos alicíclicos o heterocíclicos arriba descritos y en esta memoria puede comprender un resto arilo o heteroarilo condensado al mismo.
Los términos "halo" y "halógeno" utilizados en esta memoria se refieren a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "haloalquilo" designa un grupo alquilo, tal como se definió arriba, que tiene uno, dos o tres átomos de halógeno unidos al mismo y se ejemplifica por grupos, tales como clorometilo, bromoetilo y trifluorometilo.
El término "amino", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una amina primaria (-NH2), secundaria (-NHRx), terciaria (-NRXRy) o cuaternaria (-N+RxRyRz), en que Ry y Rz son independientemente un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático o heteroaromático, tal como se define en esta memoria. Ejemplos de grupos amino incluyen metilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dietilaminocarbonilo, isopropilamino, piperidino, trimetilamino y propilamino.
El término "acilo", tal como se utiliza en esta memora, se refiere a un grupo que tiene la fórmula general -C(=O)R, en que R es un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático o heteroaromático tal como se define en esta memoria.
El término "sulfonamido", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un grupo de fórmula general - SO2NRxRy, en que Rx y Ry son independientemente hidrógeno, o un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático o acilo, tal como se define en esta memoria.
El término "benzamido", tal como se utiliza en esta memora, se refiere a un grupo que tiene la fórmula general PhNRx, en que Rx es hidrógeno, o un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, aromático, heteroaromático o acilo tal como se define en esta memoria.
El término "alquilideno C1-6", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un radical divalente sustituido o no sustituido, lineal o ramificado, que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que tiene de uno a seis átomos de carbono, que tiene una valencia libre "-" en ambos extremos del radical.
El término "alquilideno C2-6", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a un radical divalente sustituido o no sustituido, lineal o ramificado, que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que tiene de dos a seis átomos de carbono, que tiene una valencia libre "-" en ambos extremos del radical, y en donde la insaturación está presente solo como dobles enlaces y en donde puede existir un doble enlace entre el primer carbono de la cadena y el resto de la molécula.
Tal como se utiliza en esta memoria, los términos "alifático", "heteroalifático", "alquilo", "alquenilo", "alquinilo", "heteroalquilo", "heteroalquenilo" y "heteroalquinilo" abarcan grupos sustituidos y no sustituidos, saturados e insaturados, lineales y ramificados. De manera similar, los términos, "alicíclico", "heterocíclico", "heterocicloalquilo" y 'heterociclo' abarcan grupos sustituidos y no sustituidos, y saturados e insaturados. Adicionalmente, los términos " cicloalquilo", "cicloalquenilo", "cicloalquinilo", 'heterocicloalquilo", "heterocicloalquenilo", "heterocicloalquinilo", "aromático", "heteroaromático", "arilo" y "heteroarilo" abarcan tanto grupos sustituidos como no sustituidos.
El término "aminoácido natural", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a uno cualquiera de los L-aminoácidos comunes que se producen de forma natural que se encuentran en las proteínas que se producen de forma natural: glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr), fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr), triptófano (Trp), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), asparagina (Asn), glutamina (Gln), cisteína (Cys) y metionina (Met).
La expresión "aminoácido no natural", tal como se utiliza en esta memoria se refiere a todos los aminoácidos que no son aminoácidos naturales. Esto incluye, por ejemplo, residuos de a -, p -, D-, L-aminoácidos y compuestos de la fórmula eneral:
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O
en donde la cadena lateral R es distinta de las cadenas laterales de aminoácidos que se producen en la naturaleza. Más generalmente, el término "aminoácido", tal como se utiliza en esta memoria, abarca aminoácidos naturales y aminoácidos no naturales.
El término "bioisósteros", tal como se utiliza en esta memoria, se refiere generalmente a dos o más compuestos o restos que poseen formas moleculares y/o volúmenes similares. En determinadas realizaciones, los bioisósteros tienen aproximadamente la misma distribución de electrones. En algunas otras realizaciones, los bioisósteros exhiben propiedades biológicas similares. En realizaciones preferidas, los bioisósteros poseen formas y volúmenes moleculares similares; tienen aproximadamente la misma distribución de electrones; y exhiben propiedades biológicas similares.
La expresión "derivado farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en esta memoria, indica cualquier sal, éster o sal de dicho éster, de dicho compuesto, o cualquier otro aducto o derivado farmacéuticamente aceptable que, tras la administración a un sujeto, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto tal como se describe de otro modo en esta memoria, o un metabolito o residuo del mismo. Los derivados farmacéuticamente aceptables incluyen, por tanto, entre otros pro-fármacos. Un pro-fármaco es un derivado de un compuesto, habitualmente con una actividad farmacológica significativamente reducida, que contiene un resto adicional, que es susceptible de ser separado in vivo produciendo la molécula precursora como la especie farmacológicamente activa. Un ejemplo de un pro-fármaco es un éster, que es escindido in vivo para producir un compuesto de interés. Pro-fármacos de una diversidad de compuestos y materiales y métodos para derivatizar los compuestos precursores para crear los pro-fármacos son conocidos y pueden adaptarse a la presente invención. Determinadas composiciones farmacéuticas a modo de ejemplo y derivados farmacéuticamente aceptables se discutirán con más detalle en esta memoria más adelante.
Tal como se utiliza en este memoria, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que son adecuadas para uso farmacéutico, preferiblemente para uso en los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin irritación, respuesta alérgica y similares excesivas. Sales farmacéuticamente aceptables de aminas, ácidos carboxílicos y otros tipos de compuestos son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, S. M. Berge, et al., describen sales farmacéuticamente aceptables en detalle en J Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977). Las sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos de la divulgación, o por separado, haciendo reaccionar una función de base libre o de ácido libre con un reactivo adecuado tal como se describe en general más adelante. Por ejemplo, una función de base libre puede reaccionar con un ácido adecuado. Además, cuando los compuestos de la divulgación llevan un resto de carácter ácido, sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de los mismos pueden incluir sales de metales, tales como sales de metales alcalinos, p. ej., sales de sodio o potasio; y sales de metales alcalinotérreos, p. ej., sales de calcio o magnesio. Ejemplos de sales por adición de ácidos no tóxicas y farmacéuticamente aceptables son sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos, tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o utilizando otros métodos utilizados en la técnica, tales como intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hernisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxi-etanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, valerato. Sales de metales alcalinos o alcalinotérreos representativas incluyen sodio, litio, potasio, calcio, magnesio. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, cationes de amonio, amonio cuaternario y amina no tóxicos, formados utilizando contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y arilsulfonato.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a ésteres que se hidrolizan in vivo e incluyen aquellos que se degradan fácilmente en el cuerpo humano para dejar el compuesto precursor o una sal del mismo. Grupos éster adecuados incluyen, por ejemplo, los derivados de compuestos de alcohol alifático farmacéuticamente aceptables, particularmente alcanos, alquenos, etilenglicol y cicloalcanos, en los que cada uno de los restos alquilo o alquenilo ventajosamente no tiene más de 6 átomos de carbono. Estos son únicamente a modo de ejemplo y de manera alguna limitan las posibilidades de ésteres conocidos en la técnica.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "profármacos farmacéuticamente aceptables" se refiere a aquellos profármacos de los compuestos de la presente divulgación que son adecuados para uso farmacéutico, preferiblemente para uso con los tejidos de seres humanos y animales inferiores con toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares excesivas, y eficaces para su uso pretendido, así como las formas de iones híbridos, en los casos en los que sea posible, de los compuestos de la invención. El término "profármaco" se refiere a compuestos que se transforman rápidamente in vivo para producir el compuesto precursor de la fórmula anterior, por ejemplo, mediante hidrólisis en sangre. Se proporciona una discusión detallada en T. Higuchi y V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A. C.
S. Symposium Series, y en Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.
C. Compuestos útiles en la Divulgación que son Antagonistas Directamente Competitivos o Antagonistas Alostéricos de la interacción de LFA-1 con ICAM-1.
Antagonistas que son antagonistas directamente competitivos de la interacción de LFA-1 con ICAM-1, en un sitio de unión de alta afinidad en la subunidad a L de LFA-1 que se solapan al sitio de unión ICAM-1 pueden identificarse, por ejemplo, realizando experimentos de unión competitiva tal como se describe en S.M. Keating, K.R. Clark, L. D. Stepanich, F. Arellano, C. P. Edwards, S.C. Bodary, S. A. Spencer, T. R. Gadek, J. C, Marsters Jr., M. H. Beresini, "Competition between intercellualr adhesion molecule-1 and a small molecule antagonist for a common binding site on the a1 subunit of lymphocyte function-associated antigen-1." (2006) Protein Science, 15:290-303. Se ha demostrado que este sitio de alta afinidad en LFA-1 que se solapa con el sitio de unión de ICAM-1 incluye el motivo MIDAS del dominio I en la subunidad a L de LFA-1. El antagonismo alostérico, que puede ser competitivo pero no directamente competitivo, también se puede identificar utilizando este diseño experimental.
1. Identificación del s itio de Unión de Antagonistas Directamente Competitivos de la interacción LFA-1: ICAM.
a. Reticulación del Compuesto 5 con la Subunidad aL de LFA-1.
El sitio de unión de antagonistas de moléculas pequeñas de esta clase se identificó mediante la unión del compuesto 5, un análogo fotoactivable y marcado con tritio del compuesto 3 a LFA-1 y luego fotorreticulación (Figura 4). Para maximizar la reticulación específica de alta afinidad, fue necesario filtrar en gel las muestras para separar el compuesto 5 no unido o débilmente unido antes de la irradiación (Figura 5, pistas e frente a f y g frente a h). En ausencia de filtración en gel, hubo una reticulación significativa de compuesto 5 con la subunidad a, la subunidad p y el heterodímero de LFA-1 (la banda en aproximadamente 200.000), mientras que no se observó una reticulación inespecífica en las muestras filtradas en gel (datos no mostrados). En condiciones de filtración en gel, el compuesto 5 se reticuló específicamente solo con la subunidad aL (Figura 5, pistas c y g). Además, la presencia de compuesto 3 durante la incubación redujo sustancialmente la incorporación de tritio en la subunidad aL (Figura 5, pista e frente a g). De manera similar, en presencia de compuesto 3, hubo una ligera reducción de la incorporación de tritio en la subunidad aL, la subunidad p2 y el heterodímero en ausencia de filtración en gel (Figura 5, pista f frente a h). No se produjo reticulación de compuesto 5 cuando se utilizaron muestras filtradas en gel de las subunidades aL o p2 aisladas, estructuralmente intactas (datos no mostrados). Por lo tanto, el sitio de unión de alta afinidad necesario para la reticulación después de la filtración en gel lo proporciona el heterodímero LFA-1 intacto.
El sitio de reticulación se definió además fragmentando la subunidad aL marcada con afinidad con hidroxilamina, separando electroforéticamente los fragmentos y luego realizando la secuenciación N-terminal en los fragmentos radiomarcados para determinar sus ubicaciones dentro de la secuencia de la proteína. Se identificaron dos secuencias, comenzando la primera con el residuo 1 (secuencia encontrada: YNLDVRGARSFS (SEQ ID NO 1)) y la segunda con el residuo 30 (secuencia encontrada: GVIVGAPGEGNST (SEQ ID NO 2)). Ambos péptidos tenían una longitud aproximada de 500 aminoácidos a juzgar por sus tamaños en SDS-PAGE (50 - 60 kDa); este tamaño de fragmento es consistente con los siguientes dos sitios de escisión predichos (N-G) para hidroxilamina, N507 y N530. No se incorporó marcador alguno en la mitad C-terminal de la subunidad.
b. Falta de Unión del Compuesto 2B a LFA-1 que Carece del Dominio I.
El papel del dominio I en la unión de compuesto 2B y análogos relacionados con LFA-1 se demostró mediante la preparación de una construcción de la subunidad aL que carece del dominio I. La construcción p2 sola (simulada) o junto con la construcción que carece del dominio I o aL de tipo salvaje se transfectó en células 293 y se examinó la unión de compuesto 2B a las células transfectadas (Figura 6). Compuesto 2B mostró una unión sustancial con las células transfectadas con aL de tipo salvaje, pero no demostró una unión significativa a las células transfectadas con aL que carecen del dominio I con relación a la unión a células transfectadas simuladas (132). Los transfectantes también se testaron para determinar su capacidad de adherirse a ICAM-1-Ig y, como era de esperar, las células transfectadas con LFA-1 que carecen del dominio I y los transfectantes simulados mostraron niveles de unión de fondo no distinguibles, mientras que las células transfectadas con aL de tipo salvaje mostraron una fuerte adhesión (Figura 6B). La evaluación de la unión de un panel de anticuerpos LFA-1 a las células transfectadas indicó que, aparte de la pérdida de unión por los anticuerpos que mapearon el dominio I, el heterodímero LFA-1 parecía estar intacto en las células transfectadas que carecen de dominio I de a L (datos no mostrados).
Los datos apoyan la conclusión de que el compuesto 3 y moléculas relacionadas se unen a un sitio de alta afinidad en LFA-1 que se solapa con el sitio de unión de ICAM-1 que previamente se ha demostrado que incluye el motivo MIDAS del dominio I en la subunidad aL de LFA-1.
La evidencia que corrobora la proximidad de ICAM-1 y los sitios de unión del antagonista de moléculas pequeñas en LFA-1 puede verse en el efecto común de la deleción del dominio I sobre la unión de ICAM-1-Ig y del compuesto 2B. Tanto el compuesto 2B como ICAM-1 fueron incapaces de unirse a LFA-1 que carece del dominio I, el dominio en el que se encuentra el sitio de unión de ICAM-1. Además, la capacidad de A-286982 para modificar alostéricamente la unión tanto de ICAM-1-Ig como del compuesto 2B es consistente con una proximidad cercana de sus sitios de unión al sitio de unión A-286982 en el motivo IDAS en el dominio I de la subunidad a de LFA-1. La reticulación fotoquímica selectiva de compuesto 5 a la cadena a de LFA-1 localiza su sitio de unión dentro de los residuos 30 - 507 de esta subunidad. Todos los hallazgos arriba indicados son consistentes con un único sitio de unión de moléculas pequeñas de alta afinidad ubicado en el dominio I de la cadena a de LFA-1.
Un examen minucioso del estudio de reticulación fotoquímica realizado con una concentración relativamente alta de compuesto 5 (4,1 |j M, Figura 5) proporciona evidencia directa de un sitio adicional de unión de moléculas pequeñas de baja afinidad en LFA-1. Se observan patrones de reticulación y proteínas drásticamente diferentes en presencia y ausencia de filtración en gel. Cuando las muestras se filtran en gel para separar las moléculas no unidas y unidas débilmente antes de la irradiación, solo se observa un marcaje de alta afinidad de la subunidad a. Sin embargo, en ausencia de la etapa de filtración en gel, la irradiación del complejo de compuesto 5 con LFA-1 da como resultado una reticulación de alta intensidad a la subunidad a y una reticulación de menor intensidad a un sitio de unión de baja afinidad en la subunidad p, cuyo complejo con el compuesto 5 es demasiado débil para sobrevivir a la filtración en gel. En ambas condiciones, la reticulación observada es inhibida parcialmente por un gran exceso (290 j M) de compuesto 3 (Figura 5, pistas e y g, f y h), demostrando la naturaleza específica de la unión a ambos sitios. Intentos de reticular el compuesto 5 con cualquiera de las subunidades a o p aisladas no proporcionaron complejos de alta afinidad capaces de sobrevivir al proceso de filtración en gel. En consecuencia, parece que la unión competitiva de alta afinidad de la clase de compuestos representada por el compuesto 3 requiere la presencia de un heterodímero LFA-1 de longitud completa intacto. Los intentos de capturar este sitio de unión en construcciones de cualquiera de las subunidades LFA-1 o el dominio I aislado dan como resultado una afinidad disminuida de LFA-1 por ICAM-1 y análogos de moléculas pequeñas del compuesto 3 (p. ej., XVA143). Es particularmente interesante observar la presencia de una banda menor de heterodímero de LFA-1 que aparece en ausencia de la filtración en gel (Figura 5, banda a > 200.000 dalton). La intensidad de la banda de LFA-1 a juzgar por la tinción con azul de Coomassie y la autorradiografía es compatible con la unión de baja afinidad a un segundo sitio de la cadena p que estabiliza el heterodímero.
El sitio de unión responsable de la estabilización de LFA-1 a SDS-PAGE puede residir en el dominio de tipo I de la subunidad p. Como se demostró arriba, este sitio de unión de la subunidad p no está relacionado con el sitio de unión de alta afinidad en la subunidad a que es el responsable de la inhibición competitiva directa de la unión de ICAM-1. Sin embargo, el sitio de unión de la subunidad p responsable de la estabilización de LFA-1 por el compuesto 3 puede ser el mismo que el sitio de reticulación de la subunidad p de baja afinidad.
Existen dos sitios de unión distintos para la clase de sondas antagonistas de moléculas pequeñas de LFA-1 utilizadas en esta memoria. El primero es un sitio de unión de alta afinidad en la subunidad a L de LFA-1 a través del cual la molécula pequeña y LFA-1 forman un complejo que es lo suficientemente estable (p. ej., Kd < 25 nM) para sobrevivir al proceso de filtración en gel. Es este sitio de unión de moléculas pequeñas el que se ha caracterizado en los experimentos de unión aquí reseñados como solapantes al sitio de unión de ICAM-1 y que se correlaciona con: la potente inhibición de la unión de LFA-1/ICAM-1 por los compuestos 3 y 4 (compuesto 4 CI50=1,4 nM); su potente inhibición de la proliferación de linfocitos inducida por LFA-1 (compuesto 4 CI50 = 3 nM) in vitro; y su inhibición de la respuesta del sistema inmunológico in vivo. El segundo sitio es un sitio de unión de menor afinidad (p. Ej., Kd > 1 j M) en la subunidad p que está implicado con la estabilización del heterodímero LFA-1 bajo SDS-PAGE. Este sitio es más dinámico por naturaleza (es decir, tasa de decrecimiento más rápida) y no sobrevive al proceso de filtración en gel/fotólisis. Las características de este segundo sitio de baja afinidad concuerdan con las de un sitio de unión de antagonista alostérico similar a a/p I en el dominio similar a I de la subunidad p. La unión de baja afinidad de los miméticos de ICAM-1 descritos en esta memoria a la subunidad p de LFA-1, presumiblemente al dominio de tipo I, probablemente se deba a la homología de secuencia entre los dominios I y de tipo I, particularmente con respecto a las similitudes. en motivos MIDAS y sus afinidades por el resto de ácido carboxílico común a esta clase de antagonistas. Dado que la familia p2 de integrinas, incluido MAC-1, comparte esta subunidad, la afinidad de los compuestos por el dominio similar a I en la subunidad p2 debe atenuarse con el fin de seleccionar antagonistas que sean específicos para LFA-1.
Los experimentos arriba descritos corroboran sustancialmente la unión de alta afinidad de los compuestos 3 y 4 a LFA-1 de una manera que es similar a la de ICAM-1, en un sitio que se solapa al sitio de unión de ICAM-1 que implica el motivo MIDAS dentro del dominio I de la subunidad a de LFA-1. Esto es consistente con su mimetismo propuesto del epítopo de ICAM-1, e inconsistente con cualquier conclusión de que funcionan como antagonistas alostéricos a/p de tipo I de LFA-1/ICAM-1. La unión de estos miméticos de ICAM-1 a la subunidad de integrina p2, aunque con menor afinidad, plantea la cuestión de si ICAM-1 en sí se une a un segundo sitio en el dominio de tipo I como parte de un mecanismo de retroalimentación.
Se ha demostrado, arriba, que moléculas pequeñas pueden unirse con alta afinidad a la subunidad a-L, que es exclusiva de LFA-1. En consecuencia, estos compuestos pueden ser selectivos para LFA-1 (aL p2) sobre Mac-1 (aMp2). Una realización preferida de la divulgación es utilizar inhibidores selectivos de LFA-1, que pueden conferir ventajas en seguridad terapéutica.
2. Experimentos de Unión Competitiva.
a. Competencia de Antagonistas en el ELISA LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/Molécula pequeña.
Los compuestos 2A y 3, A-286982 y sICAM-1 se utilizaron para ilustrar la inhibición competitiva de la unión de ICAM-1-Ig a LFA-1, mediante titulación en el ELISA LFA-1/ICAM-1. El formato y los resultados de esta forma del ensayo LFA-1/ICAM-1 son más sólidos debido a la captura de anticuerpos del LFA-1 en lugar del recubrimiento directo sobre la placa ELISA. El experimento se realizó mediante la adición de diluciones en serie 1/5 de compuesto 3 (-•-), compuesto 2A (-▲ -), A-286982 (-♦-) y sICAM-1 (-▼-) seguido de incubación con ICAM-1-Ig (A) o compuesto 2b (B) en placas que contienen LFA-1 capturado. Los datos mostrados son el promedio de dos placas de un solo experimento y son representativos de varias mediciones independientes. Las líneas continuas son los ajustes de los datos. Los valores de CI50 (nM) se proporcionan en las leyendas.
Las curvas de competencia típicas para estos inhibidores en el ELISA se muestran en la Figura 7A. Compuesto 3 inhibió potentemente la unión de IcAM-1-Ig a LFA-1 con una CI502 nM. El compuesto 2A, un análogo del compuesto 3, inhibió la unión, pero con un valor de CI50 aproximadamente 10 veces mayor. A-286982 y sICAM-1 inhibieron la unión de ICAM-1-Ig a LFA-1, pero con valores de CI50 que eran más de 100 veces la de compuesto 3.
También se demostró la capacidad de estos mismos compuestos para inhibir la unión de un antagonista de molécula pequeña marcado con FITC, compuesto 2B, a LFA-1 (Fig. 7B). Las potencias de los compuestos 2A y 3 y de ICAM-1 soluble como inhibidores de la unión del compuesto 2B eran paralelas a sus potencias como inhibidores de la unión de ICAM-1-Ig. Compuesto 3, compuesto 2A y sICAM-1 inhibió la unión de compuesto 2B a LFA-1 con valores de CI50 de 3, 56, y 1200 nM, respectivamente. A-286982 no inhibió, sino que más bien mejoró la unión de compuesto 2B a LFA-1 como lo indica el aumento transitorio de los valores de absorbancia, alcanzando un efecto máximo a aproximadamente 4 |jM antes de disminuir.
La evaluación de los valores de CI50 en los ELISAs de LFA-1/molécula pequeña y LFA-1/ICAM-1 se extendió a un conjunto más amplio de compuestos, incluido un grupo de péptidos derivados de kistrina y moléculas pequeñas que representan la evolución de esta clase de antagonistas de LfA -1 de moléculas pequeñas. Como se muestra en la Figura 8 (Correlación de valores de CI50 de antagonista de la competencia en los ELISAs de LFA-1: ICAM-1 y LFA-1:moléculas pequeñas. Los valores de CI50 de un grupo diverso de compuestos (4 péptidos, 5 moléculas pequeñas y sICAM -1) en competencia con compuesto 2B se representan frente a los valores de CI50 determinados en competencia con ICAM-1-Ig para la unión a LFA-1. La pendiente de la gráfica es de 0,964, intersección y, 0.237 y R = 0,940. Cada uno de los puntos de datos es el promedio de los valores de CI50 de dos placas), existe una buena correlación (R = 0,94) entre los valores de CI50 para la competencia en cada uno de los dos ensayos de unión de ligandos para este conjunto diverso de compuestos, incluyendo sICAM-1, compuestos 2A y 3, en cinco unidades logarítmicas de potencia. La tendencia común en potencias entre los dos ELISAs de competición de antagonistas con ICAM-1-Ig y compuesto 2B como ligandos revela que cada uno de los compuestos interrumpe la unión tanto de ICAM-1 como de ligandos de moléculas pequeñas de una forma mecánicamente similar. Este paralelismo en la potencia de inhibición demuestra que ICAM-1-Ig y compuesto 2B se unen al mismo sitio en LFA-1. Por lo tanto, los compuestos de la divulgación son antagonistas competitivos de LFA-1.
b. Modulación de Antagonistas de la Unión de Ligandos en ELISAs de LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/Molécula pequeña.
Un antagonista, que inhibe a través de la competencia directa con el ligando de interés, exhibe un desplazamiento hacia la derecha no saturable de las curvas de unión a ligando a valores a altas aparentes de la CE50 con el aumento de la concentración de antagonista y ninguna reducción en la unión máxima del ligando. La inhibición será superable, pero requerirá cantidades crecientes de ligando en presencia de concentraciones crecientes de un inhibidor competitivo directo. Los efectos del compuesto 3 directamente competitivo, un antagonista alostérico A-286982 y sICAM-1 sobre las curvas de unión de ICAM-1-Ig y compuesto 2B a LFA-1 se muestran en la Figura 9 como ejemplos de antagonistas que muestran competencia directa. Titulación de ICAM-1-Ig (A, C, E) o compuesto 2B (B, D, F) en ausencia (-◊-) o presencia de antagonista en el ELISA de LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/moléculas pequeñas. Los antagonistas se añadieron en diluciones dobles partiendo en 2,4 (A) y 2,7 (B) j M de sICAM-1, 0,040 (C) y 0,10 (D) j M de compuesto 3 y 20 (E) y 50 (F) j M de A-286982. El orden de las concentraciones de antagonistas fue, -□-(concentración de antagonista añadida más baja), -A-, -o-, -♦-, -■-, -▲- a -•- (concentración de antagonista más alta). Los ajustes de los datos se muestran como líneas continuas. Los datos mostrados son de una placa y son representativos de un mínimo de dos experimentos. (Téngase en cuenta que A-286982 (F) resultó en un aumento de la unión de compuesto 2B a LFA-1.) Por el contrario, un inhibidor alostérico puede alterar las curvas de unión del ligando al provocar una reducción en la unión máxima o saturación en los desplazamientos hacia la derecha de las curvas. Como se muestra en la Figura 9A, la presencia de concentraciones crecientes de sICAM-1 desplazó claramente las curvas de unión de ICAM-1 hacia la derecha a mayores valores de CE50. Adicionalmente, se observó el mismo grado máximo de unión de ICAM-1-Ig a LFA-1 en presencia y ausencia de sICAM-1 como era de esperar cuando dos formas moleculares del mismo ligando natural compiten directamente por unirse a un sitio en un receptor. De manera similar, concentraciones crecientes de compuesto 3 también desplazaron la unión de ICAM-1-Ig a valores de CE50 mayores con una variación mínima en la unión máxima de ICAM-1-Ig (Figura 9C). Aunque los desplazamientos hacia la derecha en las curvas de unión del ligando en presencia de un antagonista competitivo son típicamente paralelos, no siempre es este el caso. Las pendientes no paralelas para las curvas de unión de lFA-1/ICAM-1-Ig en presencia y ausencia del compuesto 3 pueden deberse a una incapacidad para alcanzar el equilibrio completo en las condiciones de ELISA de unión de ligando heterogéneo con este compuesto. En el formato LFA-1/compuesto 2B del ELISA de unión al ligando, las concentraciones crecientes de compuesto 3 también desplazaron claramente las curvas de unión del compuesto 2B a valores de CE50 más altos sin reducción en la unión máxima (Figura 9D). Las concentraciones crecientes de sICAM-1 también mostraron un efecto similar (Figura 9B), aunque la extensión del desplazamiento en las curvas estaba limitada por la concentración máxima alcanzable de sICAM-1 a 2,7 |jM. Por tanto, los efectos tanto de sICAM-1 como del compuesto 3 sobre la unión de ICAM-1-Ig yl compuesto 2B a LFA-1 son característicos de la competencia directa tal como se describió arriba.
El efecto de A-286982 sobre la unión de ICAM-1-Ig y compuesto 2B al receptor fue claramente diferente (Figuras 9E y 9F). En el ELISA de LFA-1/ICAM - 1, las curvas de ICAM-1-Ig se desplazaron hacia la derecha a valores de CE50 más altos; sin embargo, la unión máxima de ICAM-1-Ig a LFA-1 disminuyó considerablemente con concentraciones crecientes de A-286982. La reducción en la unión máxima y el desplazamiento hacia la derecha de las curvas de unión del ligando con la concentración creciente de A-286982 reflejan la inhibición alostérica como se describió arriba. A-286982 provoca reducciones tanto en la afinidad como en la capacidad de unión del ligando; esto demuestra que A-286982 es un antagonista insuperable de la unión de ICAM-1-Ig. En contraposición, en el ELISA de LFA/molécula pequeña, la presencia de A-286982 a concentraciones micromolares desplazó las curvas de unión del compuesto 2B a valores de CE50 más bajos y pareció potenciar la unión de compuesto 2B a LFA-1 (Figura 9F). Los efectos contrastantes de A-286982 sobre la unión del compuesto 2B y de ICAM-1-Ig pueden deberse al conocido efecto alostérico de la unión del compuesto al sitio IDAS en LFA-1. Los datos de unión de A-286982 sirven como ilustración de la inhibición alostérica de la unión de moléculas pequeñas y ligandos de proteínas a LFA-1 en los experimentos de unión demostrados en este método.
El análisis de Schild también se puede utilizar para investigar si un compuesto inhibe la unión del ligando mediante competencia directa por un único sitio de unión. Este modelo se basa en las suposiciones de que las respuestas equiactivas en un ensayo son el resultado de la ocupación equivalente del receptor por ligando y que la unión máxima no cambia por la presencia de antagonista. En un análisis de Schild, la relación de dosis es la relación de los valores de CE50 en presencia y ausencia de antagonista y es una medida de las concentraciones de ligando que conducen a respuestas equiactivas. Esta relación de dosis se determinó para cada una de las concentraciones de antagonista y se trazaron las regresiones de Schild tal como se muestra en la Figura 10. Una respuesta lineal con una pendiente de 1 en una regresión de Schild indica que la inhibición por un antagonista es directamente competitiva y reversible. El análisis de Schild produciría una relación no lineal y/o una pendiente que se desvía significativamente de 1 en el caso de un inhibidor alostérico que no da como resultado una reducción de la unión máxima. Las regresiones de Schild tanto para sICAM-1 como para el compuesto 3 se muestran en la Figura 10 con pendientes comparables de 1,26 y 1,24, respectivamente. Las regresiones de Schild del antagonismo de s-ICAM-1 (-▲-) y compuesto 3 (-•-) en el ELISA de unión al ligando LFA-1/ICAM-1 se representan a partir de los datos en la Figura 5 (A) y (C), respectivamente. La pendiente de la gráfica del compuesto 3 es 1,24 con una intersección en y de 10.9 y R = 0,99832. La pendiente de la gráfica sICAM-1 es 1,26, intersección en y, 8,51 y R = 0,99131. Aunque el análisis de Schild requiere una regresión lineal con una pendiente cercana a 1 para demostrar la inhibición competitiva directa, no existe una guía en la extensa bibliografía sobre qué intervalo de valores de Schild son aceptables. Las pendientes de 1,24 y 1,26 caen dentro de los límites de muchos valores de Schild publicados que se utilizan para respaldar las conclusiones vinculantes competitivas y, por lo tanto, estos valores de pendiente no se consideran significativamente diferentes de 1. La linearidad de los gráficos de regresión y la similitud en las pendientes de las relaciones son consistentes con la unión del ligando (ICAM-1-Ig) y ambos antagonistas (sICAM-1 y compuesto 3) al mismo sitio de una manera similar.
A. Anticuerpos
Se conocen en la técnica varios anticuerpos adecuados. El bloqueo de las ICAMs tal como, por ejemplo, ICAM-1, o las leucointegrinas tal como, por ejemplo, LFA-1, por anticuerpos dirigidos contra una o ambas de estas moléculas puede inhibir la respuesta inflamatoria. Estudios previos han investigado los efectos de los MAbs (anticuerpos) anti-CD11a sobre muchas funciones inmunes dependientes de células T in vitro y en un cierto número de respuestas inmunes in vivo. In vitro, los MAbs anti-CD11a inhiben la activación de células T (Véase Kuypers T.W., Roos D. 1989 "Leukocyte membrane adhesion proteins LFA-1, CR3 and p150,95: a review of functional and regulatory aspects" Res. Immunol., 140:461-465; Fischer A, Durandy A, Sterkers G, Griscelli C. 1986 "Role of the LFA-1 molecule in cellular interactions required for antibody production in humans" J. Immunol., 136, 3198; lisis de células diana por linfocitos T citotóxicos (Krensky et al., supra), formación de conjugados inmunes (Sanders VM, Snyder JM, Uhr JW, Vitetta ES., "Characterization of the physical interaction between antigen-specific B and T cells". J. Immunol., 137:2395 (1986); Mentzer SJ, Gromkowski SH, Krensky AM, Burakoff SJ, Martz E. 1985 "LFA-1 membrane molecule in the regulation of homotypic adhesions of human B lymphocytesn" J. Immunol., 135:9), y la adhesiópn de células T al endotelio vascular (Lo SK, Van Seventer GA, Levin SM, Wright SD., Dos receptores de leucocitos (CD11a/CD18 y CD11b/CD18) median en la adhesión transitoria al endotelio mediante la unión a diferentes ligandos., J. Immunol., 143:3325 (1989)). Dos MAb anti-CD11a, HI 111 y G43-25B están disponibles de Pharmingen / BD Biosciences. Adicionalmente, un estudio que incluyó F8.8, CBR LFA 1/9, BL5, May.035, TS1/11, TS1/12, TS 1/22, TS2/14, 25-3-1, MHM2 y efalizumab evaluó la gama de sitios de unión en LFA-1 que ocupaban estos anticuerpos. Véase Lu, C; Shimaoka, M.; Salas, A.; Springer, T.A. 2004, "The Binding Sites for Competitive Antagonistic, Allosteric Antagonistic, and Agonistic Antibodies to the I Domain of Integrin LFA-1" J. Immun. 173: 3972­ 3978 y referencias en el mismo. Se demostró que efalizumab, entre otros anticuerpos dirigidos contra LFA-1, es un antagonista directamente competitivo de LFA-1.
Por tanto, se puede utilizar un cierto número de anticuerpos que se dirigen contra LFA-1 para tratar la retinopatía diabética, incluido efalizumab (Raptiva).
B. Moléculas Pequeñas.
1. Péptidos.
Se ha investigado el uso de péptidos para reducir la interacción de LFA-1 con ICAM-1. Polipéptidos que no contienen una región Fc de una IgG se describen en la Patente de EE.UU. N° 5.747.035, que se pueden utilizar para tratar trastornos mediados por LFA-1, en particular la retinopatía diabética. El uso de péptidos duales, el primero un modulador de ICAM-1 y el segundo un péptido bloqueante con una secuencia obtenida de LFA-1 se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.843.885 para reducir las interacciones entre LFA-1 e ICAM-1. Los péptidos cíclicos se han descrito en la patente de EE.UU. N° 6.630.447 como inhibidores de la interacción LFA-1: CAM-1.
2. Moléculas Orgánicas Pequeñas
a. Compuestos a modo de Ejemplo que son Antagonistas Directamente Competitivos de LFA-1.
"Molécula orgánica pequeña" generalmente se utiliza para referirse a moléculas orgánicas de un tamaño equiparable a las moléculas orgánicas generalmente utilizadas en productos farmacéuticos. La expresión excluye típicamente biopolímeros orgánicos (p. ej., proteínas, ácidos nucleicos, etc.). Las moléculas orgánicas pequeñas varían con mayor frecuencia en tamaño hasta aproximadamente 5000 Da, en algunas realizaciones hasta aproximadamente 2000 Da, o en otras realizaciones, hasta aproximadamente 1000 Da.
i. En una realización, compuestos útiles en los métodos de la presente divulgación incluyen compuestos de Fórmula I:
Figure imgf000024_0001
Fórmula 1
en que R1 y R2 son, cada uno independientemente, hidrógeno, una cadena lateral de aminoácido, -(CH2)mOH, -(CH2)marilo, -(CH2)mheteroarilo, en donde m es 0-6,- CH(R1A)(OR1B), -CH(R1A)(NHR1B), U-T-Q, o un resto alifático, alicíclico, heteroalifático o heteroalicíclico, opcionalmente sustituido con UTQ; en donde U puede estar ausente o uno de los siguientes: -O-, -S(O)0-2-, -SO2N(R1A), -N(R1A)-, -N(R1A)C(=O)-, -N(R1A)C(=O)- O-, -N(R1A)C(=O)-N(R1B)-, -N(R1A)-SO2-, -C(=O)-, -C(=O)-O-, -O-C(=O)-, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo,-C (=O)-N(R1A)-, -OC(=O)N(R1A)-, -C(=N-R1E)-, -C(=N-R1E)-O-, -C(=N-R1E)-N(R1A)-, -O-C(=N-R1E)-N(R1A)-, -N(R1A)C(=N-R1E)-, -N(R1A)C(=N-R1E)-O-, -N(R1A)C(=N-R1E)-N(R1B)-, -P(=O)(OR1A)-O-, o -P(=O)(R1A)-O-; en donde T está ausente, o un resto alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo; y Q es hidrógeno, halógeno, ciano, isocianato, -OR1B; -SR1B; -N(R1B)2, -NHC(=O)OR1B, -NHC(=O)N(R1B)2, -NHC (=O)R1B, -NHSO2R1B, NHSO2N(R1B)2, -NHSO2NHC(=O)OR1B, -NHC(=O)NHSO2R1B, -C(=O)NHC(=O)OR1B, C(=O)NHC(=O)R1B, -C(=O)NHC(=O) N(R1B)2, -C(=O)NHSO2R1B, -C(=O)NHSO2N(R1B) 2, C(=S)N(R1B)2, -SO2R1B, -SO2OR1B, -SO2N(R1B) 2, -SO2-NHC (=O)OR1B, -OC(=O)-N(R1B)2, -OC(=O)R1B, -OC(=O)NHC(=O)R1B, -OC(=O)NHSO2R1B, -OSO2R1B, o un resto alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, o en donde R1 y R2 tomados juntos son un resto alicíclico o heterocíclico, o juntos son
Figure imgf000024_0002
en donde cada aparición de R1A y R1B es independientemente hidrógeno, un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo, -C(=O)R1C o -C(=O)NR1CR1D; en donde cada una de las apariciones de R1C y R1D es independientemente hidrógeno, hidroxilo, o un resto alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo; y R1E es hidrógeno, un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heterocíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo, -CN, -OR1C,-NR1C R1D o -SO2R1C;
en que R3 es -C(=O)OR3A, -C(=O)H, -CH2OR3A, -CH2OC(=O)-alquilo, -C(=O)NH(R3A). -CH2X0; en donde cada una de las apariciones de R3A es independientemente hidrógeno, un grupo protector, un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroalquilarilo, heteroalquilheteroarilo, o una sal o éster farmacéuticamente aceptable, o R3A, tomados en conjunto con R1 y R2, forma un resto heterocíclico; en donde X0 es un halógeno seleccionado de F, Br o I;
R4 para cada una de las apariciones es independientemente hidrógeno, halógeno, -CN, -NO2, un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo, o es GRG1, en donde G es -O-, -S-, NRG2-, -CO-, -SO-, -SO2-, C(=O)O-,-C(=O)NRG2-, C(=O)-, -NRG2C(=O)- o -SO2NRG2-, y RG1 y RG2 son independientemente hidrógeno, un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo; n es un número entero de 0 a 4 ;
AR1 es un resto monocíclico o policíclico arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alicíclico o heterocíclico;
A, B, D y E están conectados por un enlace sencillo o doble, según lo permita la valencia; en donde cada una de las apariciones de A, B, D y E es independientemente C=O, CRiRii, NRi, CRi, N, O, S, -S(=O) o SO2; en donde cada una de las apariciones de Ri y Rii son independientemente hidrógeno, halógeno, -CN, -NO2 , un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo, o es -GRG1, en donde G es -O-, -S-, -NRG2, -CO-, -SO-, -C(=O)O-,-C(=O) NRG2-, - OC(=O)-,-NRG2C(=O)- o -SO2NRG2-, y RG1 y RG2 son independientemente hidrógeno, un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo; o cualquiera de las dos apariciones adyacentes tomadas en conjunto representan un resto resto alicíclico, heteroalicíclico, arilo o heteroarilo;
p es un número entero de 0 a 4 ; y
L está ausente o es V-W-X-Y-Z, en donde cada una de las apariciones de V, W, X, Y y Z está independientemente ausente, C=O, NRL1, -O-, -C(RL1)=, =C(RL1)-, -C(RL1)(RL2), C (=N-ORL1), C(=NRL1), -N=, S(O)0-2; una cadena de alquenilideno C1-6 o alquenilideno C2-6 sustituida o no sustituida, en donde hasta dos unidades de metileno no adyacentes están reemplazadas opcionalmente, de manera independiente por -C(=O)-, -CO2-, -C(=O)C(=O)-, -C(C=O)NRL3-, -OC(=O)-, -OC(=O)NRL3-, -NRL3NRL4-, -NRL3NRL4C(=O)-, -NRL3C(=O)-, NRL3CO2-, NRL3C(=O)NRL4-, -S(=O)-, -SO2-, -NRL3SO2-, -SO2NR1-3, -NRL3SO2NRL4, -O-, -S- o -NRL3-; en donde cada una de las apariciones de RL3 y RL4 es independientemente hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo, heteroarilo o acilo; o un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo; y cada una de las apariciones de R-1 y R-2 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, hidroxilo protegido, amino, amino protegido, tio, tio protegido, halógeno, ciano, isocianato, carboxi, carboxialquilo, formilo, formiloxi, azido, nitro, ureido, tioureido, tiocianato, alcoxi, ariloxi, mercapto, sulfonamido, benzamido, tosilo o un resto alifático, alicíclico, heteroalifático, heteroalicíclico, arilo, heteroarilo, alquilarilo o alquilheteroarilo, o en donde una o más apariciones de R-1 y R-2, en conjunto, tomados junto con uno de V, W, X, Y o Z, forman un resto alicíclico o heterocíclico o forman un resto arilo o heteroarilo.
Al unas realizaciones referidas del método de la presente divulgación son de Fórmula II:
Figure imgf000025_0001
en que R28 es uno de los siguientes grupos:
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
y R29 es es hidrógeno, una sal o éster farmacéuticamente aceptable.
Algunas realizaciones preferidas de la divulgación son compuestos de Fórmula II'
Figure imgf000026_0003
O
Fórmula II'
en donde la sustitución es como en la Fórmula II.
Algunas realizaciones particularmente preferidas de compuestos del método de la presente divulgación son compuestos de Fórmula IA, IIA IIB:
Figure imgf000026_0002
Fórmula IA Fórmula IIA Fórmula IIB
en que R17 es hidrógeno, sales o ésteres farmacéuticamente aceptables, y R27 es como en la Fórmula II. Compuestos de esta clase se describen en la Patente de EE.UU. N° 7314938.
ii. Otro conjunto de realizaciones preferidas de compuestos del método de la divulgación son compuestos de Fórmula III:
Figure imgf000027_0001
Fórmula III
en que Cy es un carbociclo aromático, heterociclo aromático o un carbociclo o heterociclo no aromático opcionalmente sustituido con hidroxilo (-OH), mercapto (-SH), tioalquilo, halógeno (p. ej., F, Cl, Br, I), oxo (=O), tio (=S), amino, aminoalquilo, amidina (-C(NH)-NH2), guanidina (-NH2-C(NH)-NH2), nitro, alquilo o alcoxi. En una realización particular, Cy es un anillo de 3-5 miembros. En una realización preferida, Cy es un heterociclo no aromático de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido con hidroxilo, mercapto, halógeno (preferiblemente F o Cl), oxo (=O), tio (=S), amino, amidina, guanidina, nitro, alquilo o alcoxi. En una realización más preferida, Cy es un heterociclo no aromático de 5 miembros opcionalmente sustituido con hidroxilo, oxo, tio, Cl, alquilo C1-4 (preferiblemente metilo) o alcanoilo C1-4 (preferiblemente acetilo, propanoilo o butanoilo). Más preferiblemente, el heterociclo no aromático comprende uno o heteroátomos (N, O o S) y está opcionalmente sustituido con hidroxilo, oxo, mercapto, tio, metilo, acetilo, propanoílo o butilo. En realizaciones particulares, el heterociclo no aromático comprende al menos un átomo de nitrógeno que está opcionalmente sustituido con metilo o acetilo. En una realización particularmente preferida, el heterociclo no aromático se selecciona del grupo que consiste en piperidina, piperazina, morfolina, tetrahidrofurano, tetrahidrotiofeno, oxazolidina, tiazolidina opcionalmente sustituida con hidroxi, oxo, mercapto, tio, alquilo o alcanoílo. En una realización más preferida, Cy es un heterociclo no aromático seleccionado del grupo que consiste en tetrahidrofuran-2-ilo, tiazolidin-5-ilo, tiazolidin-2-ona-5-ilo y tiazolidin-2-tiona-5-ilo. y pirrolidina. En una realización preferida, Cy es un carbociclo o heterociclo aromático de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido con hidroxilo, mercapto, halógeno (preferiblemente F o Cl), oxo (=O), tio (=S), amino, amidina, guanidina, nitro, alquilo o alcoxi. En una realización más preferida, Cy es un carbociclo o heterociclo aromático de 5 miembros opcionalmente sustituido con hidroxilo, oxo, tio, Cl, alquilo C1-4 (preferiblemente metilo) o alcanoilo C1-4 (preferiblemente acetilo, propanoilo o butanoilo). Más preferiblemente, el carbociclo o heterociclo aromático comprende uno o heteroátomos (N, O o S) y está opcionalmente sustituido con hidroxilo, oxo, mercapto, tio, metilo, acetilo, propanoílo o butilo.
En otra realización preferida, Cy es un carbociclo de 3-6 miembros opcionalmente sustituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, oxo, tio, amino, amidina, guanidina, alquilo, alcoxi o acilo. En una realización particular, el carbociclo está saturado o parcialmente insaturado. En realizaciones particulares, Cy es un carbociclo seleccionado del grupo que consiste en ciclopropilo, ciclopropenilo, ciclobutilo, ciclobutenilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo o ciclohexenilo. X2 es un enlazador hidrocarbonado C1-5 divalente que opcionalmente tiene uno o más átomos de carbono reemplazados por N, O, S, SO o SO2 y opcionalmente está sustituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, amino, aminoalquilo, nitro, oxo o tio. En una realización preferida, X2 tendrá al menos un átomo de carbono. Los reemplazos y las sustituciones pueden formar un resto amida (-NRC(=O)- o - C(=O)NR-) dentro de la cadena hidrocarbonada o en uno o ambos extremos. X es también sulfonamida (-NRSO2- o -SO2NR), acilo, éter, tioéter o amina. En una realización particularmente preferida, X2 es el grupo -CH2-NR10-C(O)-, en donde la porción carbonilo -C(O)- del mismo es adyacente (es decir, está unida covalentemente) a Cy y R10 es alquilo, es decir, metilo o más preferiblemente H.
K es un carbociclo o heterociclo opcionalmente sustituido con hidroxilo, mercapto, halógeno, oxo, tio, un hidrocarburo, un hidrocarburo halo-sustituido, amino, amidina, guanidina, ciano, nitro, alcoxi o acilo. En una realización particular, K es arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido con halógeno o hidroxilo. En una realización particularmente preferida, K es fenilo, furan-2-ilo, tiofeno-2-ilo, fenilo sustituido con un halógeno (preferiblemente Cl) o hidroxilo, preferiblemente en la posición meta.
L2 es un hidrocarburo divalente que opcionalmente tiene uno o más átomos de carbono reemplazados por N, O, S, SO o SO2 y opcionalmente está sustituido con hidroxilo, halógeno oxo o tio; o tres átomos de carbono del hidrocarburo se reemplazan por un residuo de aminoácido. Preferiblemente L2 es menos de 10 átomos de longitud y más preferiblemente 5 o menos y lo más preferiblemente 5 o 3 átomos de longitud. En realizaciones particulares, L2 es -CH=CH-C(O)-NR10-CH2-, -CH2-NR10-C(O)-, -C(O)-NR10-CH2-, -CH(OH)-(CH2)2-, -(CH2)2-CH(OH)-, -(CH2)3-, -C(O)-NR10-CH(R7)-C(O)-NR10-, -NR10-C(O)-CH(R16)-NR10-C(O)-, -CH(OH)-CH2-O- o -CH(OH)-CF2-CH2-, en donde cada uno de los R10 es independientemente H o alquilo y R16 es una cadena lateral de aminoácido. Cadenas laterales de aminoácidos preferidas incluyen cadenas laterales que se producen de forma no natural, tales como fenilo o cadenas laterales que se producen de forma natural. Cadenas laterales preferidas son las de Phe, Tyr, Ala, Gln y Asn. En unas realizaciones preferidas, L2 es -CH=CH-C(O)-NR10-CH2-, en donde el resto -CH=CH- de la misma es adyacente (es decir, está unida covalentemente) a K. En otra realización preferida, L2 es -CH2-NR10-C(O)-, en donde el resto metileno (-CH2-) del mismo es adyacente a K.
R5 es H, OH, amino, O-carbociclo o alcoxi, opcionalmente sustituido con amino, un carbociclo, un heterociclo, o una sal o éster farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, R5 es H, fenilo o alcoxi C1-4 opcionalmente sustituido con un carbociclo tal como fenilo. En una realización particular R5 es H. En otra realización particular R5 es metoxi, etoxi, propiloxi, butiloxi, isobutiloxi, s-butiloxi, t-butiloxi, fenoxi o benciloxi. En aún otra realización particular R5 es NH2. En una realización particularmente preferida, R5 es etoxi. En otra realización particularmente preferida, R5 es isobutiloxi. En otra realización particularmente preferida R5 es alcoxi sustituido con amino, por ejemplo 2-aminoetoxi, N-morfolinoetoxi, N,N-dialquiaminoetoxi, amonio cuaternario, hidroxi alcoxi (p. ej., trimetilamoniohidroxietoxi).
R6-9 son independientemente H, hidroxilo, mercapto, halógeno, ciano, amino, amidina, guanidina, nitro o alcoxi; o R7 y R8 juntos forman un carbociclo o heterociclo condensado, opcionalmente sustituido con hidroxilo, halógeno, oxo, tio, amino, amidina, guanidina o alcoxi. En una realización particular R6 y R7 son independientemente H, F, Cl, Br o I. En otra realización particular, R8 y R9 son ambos H. En otra realización particular, uno de R6 y R7 es un halógeno, mientras que el otro es hidrógeno o un halógeno. En una realización particularmente preferida, R7 es Cl, mientras que R6, R8 y R9 son cada uno H. En otra realización particularmente preferida, R6 y R7 son ambos Cl, mientras que R8 y R9 son ambos H. R10 es H o una cadena hidrocarbonada opcionalmente sustituida con un carbociclo o un heterociclo. En una realización preferida, R10 es H o alquilo, es decir, metilo, etilo, propilo, butilo, i-butilo, s-butilo o t-butilo. En una realización particular, R10 es H.
Compuestos de la clase de Fórmula III se describen en las Patentes de EE.UU. N°s. 6667318, 6872735 y 6803384. iii. Realizaciones preferidas adicionales del método de la presente divulgación son compuestos de la Fórmula IV:
Figure imgf000028_0001
R12 es un grupo de la fórmula
Figure imgf000029_0001
en que R13 es hidrógeno, carboxi o alquilo inferior; n es 0 o 1; U2, V2 y W2 son independientemente hidrógeno, halógeno o alquilo inferior, con la condición de que U2 y V2 no sean ambos hidrógeno; X3 es carbonilo, alquileno inferior sustituido con fenilo, imino, imino sustituido, o sulfonilo; Y2 es alquileno inferior que puede estar sustituido con uno o más de amino, amino sustituido, alquilo inferior o cicloalquilo inferior, o Y2 es alquenileno inferior o alquilentio inferior;
k os 0 o 1; cuando k es 1, Z2 es hidrógeno, alquiltio inferior, -COOH, -CONH2, amino; y cuando k es 0 o 1, Z2 es 1-adamantilo, difenilmetilo, 3-[[(5-cloropiridin-2-il) amino] carbonilo] pirazin-2-ilo, hidroxi, fenilmetoxi, 2-cloro-4-[[[(3-hidroxifenil)metil] amino] carbonil] fenilo, [2 ,6-diclorofenil) metoxi] fenilo; además, cuando k es 0 o 1, Z2 puede ser cicloalquilo o arilo que contiene de 0 a 3 heteroátomos que pueden ser iguales o diferentes, o un sistema de anillos condensados que contiene dos o tres anillos, cuyos anillos son independientemente cicloalquilo o arilo que contienen de 0 a 3 heteroátomos que pueden ser iguales o diferentes, cualquiera de cuyos anillos puede estar no sustituido o sustituido con al menos uno de halógeno, ciano, amino, amino sustituido, aminosulfonilo, nitro, oxo, hidroxi, arilo, ariloxi, alquilo inferior no sustituido, alquilo inferior sustituido con halógeno, alquilo inferior sustituido con alcoxi inferior, alcoxi inferior, alcano inferior-sulfonilo, alquiltio inferior, acetilo, aminocarbonilo, hidrazino, carboxi, alcoxicarbonilo, acetoxi, o también, además de amino alquilo inferior; y R20 es hidrógeno, un sal o éster farmacéuticamente aceptable.
Una realización de compuestos de Fórmula IV tiene una estereoquímica como se indica en la Fórmula IV:
Figure imgf000029_0002
iv. Otro conjunto de realizaciones preferidas de los compuestos del método de la presente divulgación son compuestos de Fórmula V:
Figure imgf000030_0001
Fórmula V
en que R14 es un grupo de la fórmula:
HO
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000030_0004
en que R15 es hidrógeno, carboxi o alquilo inferior; U3, V3 y W3 son independientemente hidrógeno, halógeno, o U3, V3 y W3 son alquilo inferior, con la condición de que U3 y V3 no sean ambos hidrógeno; X4 es carbonilo, alquileno inferior sustituido con fenilo, imino, imino sustituido que incluye ciano, o sulfonilo; Y3 es alquenileno inferior, alquiilentio inferior, o es alquileno inferior que puede estar sustituido con amino, acetilamino o cicloalquilo inferior;
k2 es 0 o 1; cuando k2 es 1, Z es hidrógeno, alquiltio inferior, -COOH, -CONH2- o amino; cuando k2 es 0 o 1, Z3 es 1-adamantilo, difenilmetilo, 3-[[(5-cloropiridin-2-il) aminocarbonil]pirazin-2-ilo, y cuando k2 es 0 o 1, Z puede ser cicloalquilo o arilo que contiene 0 a 3 heteroátomos que pueden ser los mismos o diferentes, o un sistema de anillo condensado que contiene dos o tres anillos, anillos que son independientemente cicloalquilo o arilo que contiene 0 a 3 heteroátomos que pueden ser iguales o diferentes, cualquiera de cuyos anillos puede estar no sustituido o sustituido con al menos uno de halógeno, ciano, amino, amino sustituido, aminosulfonilo, nitro, oxo, hidroxi, arilo, ariloxi, alquilo inferior no sustituido, alquilo inferior sustituido con halógeno, alquilo inferior sustituido con alcoxi inferior, alcoxi inferior, carboxi, alcoxicarbonilo o acetoxi; y,
R21 es hidrógeno, sales o ésteres farmacéuticamente aceptables.
Una realización preferida de compuestos de Fórmula V tiene la estereoquímica como se indica en la Fórmula V':
Figure imgf000030_0005
Fórmula V'
Otros compuestos de la clase de Fórmula IV y V se describen en las Patentes de EE.UU. N°s 7217728, 6331640, 6515124 y 6803384.
v. Otra clase de compuestos preferidos del método están representados por la Fórmula VI
Figure imgf000031_0002
Fórmula VI
en que D4 es un anillo mono-, bi-, o tri-cíclico saturado, insaturado o aromático, teniendo cada uno de los anillos 5, 6 o 7 átomos en el anillo, en que los átomos en el anillo son carbono o de uno a cuatro heteroátomos seleccionados del grupo nitrógeno, oxígeno y azufre, en que cualquier átomo del anillo de carbono o azufre puede oxidarse opcionalmente, estando cada uno de los anillos sustituido con 0-3 R31;
L3 es un grupo de enlace bivalente que tiene una de las siguientes estructuras;
-L3-L2-L1-,
-L4-L3-L2-L,1 - o
-L5-L4-L3-L2-L1-,
en que L1 es oxo (-O-), S(O)s, C(=O), CR32, R32, CR32 het, NR30 o N,
L2 es oxo (-O-), S(O)s, C(=O), C(=N-O-R33), CR34R34', CR34, het NR30 o N,
L3 es oxo (-O-), S(O)s, C(=O), C(=N-O-R33), CR35R35', CR35, het NR30 o N,
L4 está ausente, es oxo (-O-), S(O)s, C(=O), C(=N-O-R33), CR36R36', CR36, NR30 o N,
L5 está ausente, es oxo (-O-), S(O)s, c (=O), CR37R37', CR37, NR30 o N, con la condición de que solo uno de que solo uno de L1-L3 pueda ser het y que cuando uno de L1-L3 es het el otro L1-L5 puede estar ausente,
en que
R32, R32', R34, R34', R35, R35', R36, R36', R37 y R37' son cada uno independientemente R38, R39 o U-Q-V-W, opcionalmente, R24 y R34', por separado o juntos, pueden formar un anillo condensado saturado, insaturado o aromático con B3 a través de un sustituyente RP en B, conteniendo el anillo condensado 5, 6 o 7 átomos en el anillo y conteniendo opcionalmente 1-3 heteroátomos seleccionados del grupo O, S y N, en que cualquier S o N puede opcionalmente ser oxidado;
opcionalmente, R35 y R35', por separado o juntos, y R36 y R36', por separado o juntos, pueden formar un anillo condensado saturado, insaturado o aromático con D3 a través de un sustituyente R31 en D3, conteniendo el anillo condensado 5, 6 o 7 átomos en el anillo y conteniendo opcionalmente 1-3 heteroátomos seleccionados del grupo O, S y N, en que cualquier S o N puede estar opcionalmente oxidado;
también opcionalmente, cada uno de los R32-R37, NR30 o N en L1-L5, junto con cualquier otro R32-R37, NR30 o N en L1-L5 pueden formar un homociclo o heterociclo de 5, 6 o 7 miembros ya sea saturado, insaturado o aromático que contiene opcionalmente 1-3 heteroátomos adicionales seleccionados de N, O y S, en que cualquier átomo de carbono o azufre del anillo puede oxidarse opcionalmente, cada ciclo está sustituido con 0-3 R31; y en que s es 0-2; B se selecciona del grupo:
Figure imgf000031_0001
V S )
en donde ^ es un anillo heterocíclico u homocíclico condensado que contiene 5, 6 o 7 átomos, siendo el anillo insaturado, parcialmente saturado o aromático, los heteroátomos seleccionados de 1-3 O, S y N,
Y3 es CH o NR30; n es 0, 1, 3 o 3:
G3 es hidrógeno o alquilo C1-C6, opcionalmente G tomado junto con T pueden formar un cicloalquilo C3-C6 opcionalmente sustituido con -V-W;
T3 es uno de los siguientes:
una cadena lateral de a-aminoácidos que se produce de forma natural,
y U4-Q4-V4-W4;
U4 es un radical bivalente opcionalmente sustituido que tiene una de las siguientes estructuras:
alquilo C1-C6, alquil C0-C6-Q, alquenil C2-C6-Q y alquinil C2-C6-Q, en que los sustituyentes en cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo son 1-3 R38;
Q4 está ausente o es -O-, -S(O)s-, -SO2-N(R30)-, -N(R30)-, -N(R30)-C(=O)-, -N(R30)-C(=O)-N(R30)-,
-N(R30)-C(=O)-O-, -N(R30)-SO2-, -C(=O)-, -C(=O)-O-, -het-, -C(=O)-N(R30)-,
-O-C(=O)-N(R30)-, -PO(OR30)O- o -P(O)O-;
en que
s es 0-2 y
het es un anillo heterocíclico monocíclico o bicíclico de 5, 6 , 7, 9 o 10 miembros, conteniendo cada uno de los anillos 1-4 heteroátomos seleccionados de N, O y S, en que el anillo heterocíclico puede estar saturado, parcialmente saturado o aromático y estando cualquier N o S opcionalmente oxidados, estando el anillo heterocíclico sustituido con 0-3 R41; V4 está ausente o es un grupo bivalente opcionalmente sustituido con una de las siguientes estructuras alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C8, alquil C0-C6-arilo C6-C10 y alquil C0-C6-het;
en que los sustituyentes en cualquier alquilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo o het son 1-3 R31;
W4 es hidrógeno, OR33, SR42, NR30R30, NH-C(=O)-O-R43, NH-C(=O)-NRnRn,
NH-C(=O)-R43, NH-SO2-R37, NH-SO2-NR30R30, NH-SO2-NH-C(=O)-R43, NH-C(=O)-NH-SO2-R37, C(=O)-NH-C(=O)-O-R43, C(=O)-NH-C(=O)-R43, C(=O)-NH-C(=O)-NR30R30', C(=O)-NH-SO2- -R37, C(=O)-NH-SO2-NR30R30', C(=S)-NR30R30', SO2-R37, SO2-O-R37, SO2-NR37R37', SO2-NH-C(=O)-O-R43, SO2-NH-C(=O)-NR30R30', SO2-NH-C(=O)-R43, O-C(=O)-NR30R30', O-C(=O)-R43, O-C(=O)-NH-C(=O)-R43, O-C(=O)-NH-SO2R46 u O-SO2-R37;
R44 es C(=O)-R45, C(=O)-H, CH2(OH) o CH2O-C(=O)-alquilo C i-Ca;
R38 es R38' o R38" sustituido con 1-3 R38'; en que
R38' es hidrógeno, halo (F. Cl, Br, I), ciano, isocianato, carboxi, carboxi-alquilo C1-C11, amino, amino-alquilo C1-C8, aminocarbonilo, carboxamido, carbamoílo, carbamoiloxi, formilo, formiloxi, azido, nitro, imidazolilo, ureido, tioureido, tiocianato, hidroxi, alcoxi C1-C6, mercapto, sulfonamido, het, fenoxi, fenilo, benzamido, tosilo, morfolino, morfolinilo, piperazinilo, piperidinilo, pirrolinilo, imidazolilo o indolilo;
R38" es alquil C0-C10-Q-alquilo C0-C6, alquenil C0-C10-Q-alquilo C0-C6, alquinil C0-C10-Q-alquilo C0-C6, cicloalquil C3-C11-Q-alquilo C0-C6, cicloalquenil C3-C10-Q-alquilo C0-C6, alquil C1-C6-aril C6-C12Q-alquilo C0-C6, aril C6-C10 -alquil C1-C6-Q-alquilo C0-C6, alquil C0-C6-het-Q-alquilo C0-C6, alquil C0-C6Q-het-alquilo C0-C6, het-alquil C0-C6-Q-alquilo C0-C6, alquil C0-C6-Q-arilo C6-C12 o -Q-alquilo C1-C6;
R43 es hidrógeno y alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, cicloalquilo C3-C11, cicloalquenilo C3-C10, alquil C1-C6-arilo C6-C12, aril C6-C10-alquilo C1-C-6, alquil C1-Ca-het, het-alquilo C1-C6, arilo C6-C12 o het,
en que los sustituyentes en cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo o het son 1-3 R31;
R31 es R40 o R41;
R41 es OH, OCF3, OR43, SR42, halo (F, Cl. Br, I), CN, isocianato, NO2, CF3, alquil C0-C6-NR30R30', alquil C0-C6-C(=O)-NR30R30', alquil C0-C6-C(=O)-R38, alquilo C1-C8, alcoxi C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, cicloalquilo C3-C6, cicloalquenilo C3-C6, alquil C1-C6-fenilo, fenil-alquilo C1-C6, alquil C1-C6oxicarbonilo, fenil-alquil C0-C6oxi, alquil C1-C6-het, het-alquilo C1-C6, SO2-het, -O-arilo C6-C12, -SO2-arilo C6-C12, -SO2-alquilo C1-C6 o het,
en que cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo puede estar opcionalmente sustituido con 1-3 grupos seleccionados de OH, halo (F, Cl, Br, I), nitro, amino y aminocarbonilo y los sustituyentes en cualquier arilo o het son 1-2 hidroxi, halo (F, Cl, Br, I), CF3, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6, nitro y amino;
R42 es S-alquilo C1-C6, C(=O)-alquilo C1-C6, C(=O)-NR30R30', alquilo C1-C6, halo (F, Cl, Br, I)-alquilo C1-C6, bencilo o fenilo; R30 es R43, NH-C(=O)-O-R43, NH-C(=O)-R43, NH-C(=O)-NHR43, NH-SO2-R46, NH-SO2-NH-C(=O)-R43, NH-C(=O)-NH-SO2-R37, C(=O)-O-R43, C(=O)-R43, C(=O)-NHR43, C(=O)-NH-C(=O)-O-R43, C(=O)-NH-C(=O)-R43, C(=O)-NH-SO2-R46, C(=O)-NH-SO2-NHR37, SO2-R37, SO2-O-R37, SO2-N(R43)2, SO2-NH-C(=O)-O-R43, SO2-NH-C(=O)-O-R43 o SO2-NH-C(=O)-R43; R30' es hidrógeno, hidroxi y alquilo C1-C11 sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C11, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, cicloalquilo C3-C11, cicloalquenilo C3-C10, alquil C1-C6-arilo C6-C12, aril C6-C10-alquilo C1-C- 6, aril C6-C10-alquil C0-C6oxi, alquil C1-C6-het, het-alquilo C1-C6, arilo C6-C12, het, alquil C1-C6carbonilo, alcoxi C1-C8carbonilo, cicloalquil C3-C8carbonilo, cicloalcoxi C3-C8carbonilo, aril C6-Cn oxicarbonilo, aril C7-Cn alcoxicarbonilo, heteroarilalcoxicarbonilo, heteroarilalquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, heteroarilalquilsulfonilo, heteroarilsulfonilo, alquil C1-C6sulfonilo o aril C6-C10sulfonilo, en que los sustituyentes en cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo, het o heteroarilo son 1-3 R31;
R30 y R30', tomados junto con el nitrógeno común al que están unidos pueden formar parte de un heterociclo opcionalmente sustituido que tiene una de las siguientes estructuras: morfolinilo, piperazinilo, tiamorfolinilo, pirrolidinilo, imidazolidinilo, indolinilo, isoindolinilo, 1,2,3,4-tetrahidro-quinolinilo, 1,2,3,4-tetrahidro-isoquinolinilo, tiazolidinilo o azabiciclononilo, en que los sustituyentes son 1-3 R38;
R33 es hidrógeno y alquilo C1-C6 sustituido o no sustituido, alquil C1-C6carbonilo, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, cicloalquilo C3-C8 o benzoílo, en que los sustituyentes en cualquier alquilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo are 1-3 R40;
R40 es OH, halo (F, Cl, Br, I), CN, isocianato, OR43, SR42, SOR43, NO2, CF3, R43, NR30R30', NR30C(=O)-O-R43, NRC(=O)-R43, C0-C6alkyl-SO2-R43, C0-C6alkyl-SO2-NR30R30', C(=O)-R43, O-C(=O)-R43, C(=O)-O-R43 o C(=O)-NR30R30', en que los sustituyentes en cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo, het o heteroarilo son 1-3 R31;
R46 es alquilo C1-C8 sustituido o no sustituido, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, cicloalquilo C3-C8, cicloalquenilo C3-C6, alquil C0-C6fenilo, fenil-alquilo C0-C6, alquil C0-C6-het o het-alquilo C0-C6,
en que los sustituyentes en cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo o het son 1-3 R31;
R45 es un hidroxi sustituido o no sustituido, alcoxi C1-C11, cicloalcoxi C3-C12, aralcoxi C8-C12, C8-C12cicloalcoxi, aril C6-C10oxi, alquil C3-C10 carboniloxialquiloxi, alcoxi C3-C10carboniloxialquiloxi, alcoxi C3-C10carbonilalquiloxi, cicloalquil C5-C10 alquilcarboniloxialquiloxi, cicloalcoxi C5-C10carboniloxialquiloxi, cicloalcoxi C5-C10carbonilalquiloxi, aril C8 C12oxicarbonilalquiloxi, aril C8-C12oxicarboniloxialquiloxi aril C8 -Ci2carbonlloxlalquiloxi alcoxi C5-Cioalquilcarboniloxialquiloxi, (R30)(R30)N(alcoxi C1-C10)-,
Figure imgf000033_0002
en que los sustituyentes en cualquier alquilo, alquenilo o alquinilo son 1-3 R38 y los sustituyentes en cualquier arilo o het son 1-3 R31 y
sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Compuestos de Fórmula I-VI también incluyen sales y ésteres farmacéuticamente aceptables, incluyendo compuestos pro-fármacos de Fórmula I-VI, en que R3A,R5 R10, R17, R18, R19, R20, R21, R29y un éster carboxílico en R44 puede ser alquilo inferior o -CH2 CH2 -R22 , en que R22 es uno de los siguientes:
^ H
Figure imgf000033_0003
en que R23 es hidrógeno o metilo y R24 es alquilo inferior o cicloalquilo inferior.
Una realización preferida de compuestos de Fórmula VI tiene la estereoquímica indicada en la Fórmula VI'.
Figure imgf000033_0001
R30
Fórmula VI'
Compuestos de la clase de Fórmula VI se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 20050203135. Algunos de los compuestos descritos en esta memoria pueden comprender uno o más centros asimétricos y, por tanto, pueden comprender estereoisómeros individuales, diastereómeros individuales y cualesquiera mezcla de los mismos. Además, compuestos de la divulgación pueden contener isómeros geométricos de dobles enlaces, que comprenden isómeros Z y E, y pueden estar presentes como isómeros geométricos puros o mezclas de los mismos.
En algunas realizaciones preferidas, los métodos de la presente divulgación se realizan con los siguientes compuestos:
Figure imgf000034_0001
y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables.
Compuestos de la presente divulgación incluyen los siguientes compuestos:
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables.
b. Compuestos a modo de Ejemplo que son Antagonistas A lostéricos de LFA-1.
i. Una familia de p-ariltio cinnamidas novedosas puede actuar como antagonistas alostéricos de LFA-1. Véase Liu, G.; Link, J.T.; Pei, Z.; Reilly, E.B.; Nguyen, B.; Marsh, K.C.; Okasinski, G.F.; von Geldern, T.W.; Ormes, M.; Fowler, K.; Gallatin, M. 2000 "Discovery of novel p-arylthio cinnamides as antagonists of leukocyte function-associated antigen-1/intracellular adhesion molecule-1 interaction. 1. Identification of an additional binding pocket based on an anilino diaryl sulfide lead." J. Med. Chem. 43, 4015-4030.
Compuestos de Fórmula VII se proporcionan en la presente divulgación que son útiles en los métodos de la invención, tal como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 20080234271, en donde:
Figure imgf000041_0001
I
Fórmula VII
y sus sales y profármacos farmacéuticamente aceptables,
en donde R1 , R2 , R3 , R4 y R5 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquenoxi, alquinilo, aldehído, alcanoílo, alcoxi, amido, amino, arilo, ariloxi, carboxi, ciano, cicloalquilo, éter, éster, halógeno, heterociclilo, hidroxi, cetona, nitro, oxo, perfluoroalquilo, sulfonilo, sulfonato, tio, u otros grupos que contienen carbonilo, R6 es alquilos no sustituidos, cicloalquilos saturados no sustituidos, carboxialquilos no sustituidos o heterociclilalquilos no sustituidos, en donde los cicloalquilos saturados, no sustituidos, carboxialquilos no sustituidos y heterociclilalquilos no sustituidos están unidos al NH de fórmula VII a través del grupo alquilo, en donde los carboxialquilos no sustituidos comprenden una cadena de alquilo ramificada,
con la condición de que al menos uno de R1 y R3 se seleccione de:
A. cinnamidas seleccionadas de cis-cinnamida o trans-cinnamida definida como
Figure imgf000041_0002
en donde R8 y R9 son cada uno, independientemente, hidrógeno, aldehído, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, amido, amino, arilo, carboxi, ciano, cicloalquilo, éster, éter, halógeno, hidroxi, cetona, nitro, sulfonato, sulfonilo, tio u otros grupos que contienen carbonilo;
B. sustituyentes de fórmula VII-a:
Figure imgf000041_0003
Fórmula VII-a
en donde D, B, Y y Z son cada uno, independientemente, -CR31=, -CR32R33-, -C(O)-, -O-, -SO2-, -S-, -N= o -NR34-; n es un número entero de cero a tres; y R31, R32, R33 y R34 son, cada uno independientemente, hidrógeno, alquilo, carboxi, hidroxialquilo, monoalquilaminocarbonilalquilo, dialquilaminocarbonilalquilo o carboxialquilo;
C. derivados de ciclopropilo seleccionados de ácido cis-ciclopropanoico, ácido trans-ciclopropanoico, cisciclopropanamida y trans-ciclopropanamida definidos como
Figure imgf000041_0005
Figure imgf000041_0004
"ácido cis-ciclopropanoico" "ácido trans-ciclopropanoico"
Figure imgf000041_0006
"cis-ciclopropanamida" "trans-cialopropanamida"
en donde R35 y R36 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, carboxi, hidroxialquilo o carboxialquilo, y en donde R37 y R38 son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo, carboxialquilo, monoalquilaminocarbonilalquilo o dialquilaminocarbonilalquilo;
D. sustituyentes de fórmula VII-b:
Figure imgf000042_0001
Fórmula VII-b
en donde R8 y R9 son como se definen arriba;
E. ácidos cinámicos de fórmula VII-c:
Figure imgf000042_0002
"ácido cis-cinámico" "ácido trans-cinámico"
Fórmula VII-c
en donde R8 y R9 son como se definen arriba;
en donde:
R10 y R11 son cada uno, independientemente, hidrógeno, alcanoílo, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, amido, amino, arilo, carboxi, ciano, cicloalquilo, éster, éter, halógeno, heterociclilo, hidroxi, cetona, nitro, sulfonilo, tio u otros grupos que contienen carbonilo; o
R10 y R11 se toman junto con N para formar un grupo heterociclilo que comprende al menos un sustituyente que es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquenoxi, alquinilo, aldehído, alcanoílo, alcoxi, amido, amino, arilo, ariloxi, carboxi, ciano, cicloalquilo, éter, éster, halógeno, heterociclilo, hidroxi, cetona, nitro, oxo, perfluoroalquilo, sulfonilo, sulfonato, tio u otro grupo que contenga carbonilo, o
R1 y R2 , y/o R4 y R5 se unen juntos para formar un anillo de cicloalquilo, arilo o heterociclilo de 5 a 7 miembros cuando R3 es una cinnamida, sustituyente de fórmula VII-a, sustituyente de fórmula VII-b, o derivado de ciclopropilo tal como se definió arriba; o R2 y R3 y/o R3 y R4 , y/o R4 y R5 se unen para formar un anillo de cicloalquilo, arilo o heterociclilo de 5 a 7 miembros cuando R1 se selecciona de cinnamidas, sustituyentes de fórmula VII-a, sustituyentes de fórmula VII-b, y derivados de ciclopropilo como se definieron arriba; y
en donde Ar es arilo sustituido o heteroarilo sustituido que tiene al menos un sustituyente que es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquenoxi, alquinilo, aldehído, alcanoílo, alcoxi, amido, amino, arilo, ariloxi, carboxi, ciano, cicloalquilo, éter, éster, halógeno, heterociclilo, hidroxi, cetona, nitro, oxo, perfluoroalquilo, sulfonilo, sulfonato, tio u otros grupos que contienen carbonilo.
En algunas realizaciones de los compuestos de Fórmula VII, R6 no es un heterociclilalquilo no sustituido de las siguientes estructuras:
Figure imgf000042_0003
Algunos compuestos a modo de ejemplo VII incluyen:
Figure imgf000042_0004
Otros compuestos de esta clase general se describen en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. N°s 20040116518, 20050014746, 20020156314, 20020132807, 20080249157 y 20070066585.
ii. Otra familia de antagonistas alostéricos de molécula pequeña de LFA-1 se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 20080108677. La presente divulgación proporciona compuestos de Fórmula VIII y sus sales farmacéuticamente aceptables, que son útiles en los métodos de la divulgación descritos en esta memoria.
Figure imgf000043_0001
Fórmula VIII
El compuesto de Fórmula VIII, en donde m es 0, 1 o 2; X es H, cicloalquilo o fenilo, que no está sustituido o está sustituido con uno o más sustituyentes que son alquilo inferior, hidroxi o halógeno; n es 0 o 1; e Y es fenilo, furanilo, indol o pirrol, que pueden estar todos sustituidos con uno o más sustituyentes que son independientemente alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, (3,5-dimetilfenoxi)propoxi o fenilo, en donde fenilo puede estar sustituido adicionalmente con uno o más átomos de halógeno, grupos nitro, amino o carboxilo.
Otro compuesto a modo de ejemplo VIII es
Figure imgf000043_0002
iii. Una familia adicional de antagonistas alostéricos de molécula pequeña de LFA-1 se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2008/0242710. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un 3a,4,5,6-tetrahidro-pirrolo[1,2-b]- isotiazol y sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde el azufre está en forma de un dióxido que es un compuesto de Fórmula IX, que es útil en los métodos de la presente divulgación.
Figure imgf000043_0003
Fórmula IX
tal como un compuesto de Fórmula IX-a:
Figure imgf000043_0004
en donde la línea de puntos es un enlace o no es enlace, Ri es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, alcoxi, arilo, heterociclilo, hidroxi, SH, SR5 , ciano, halógeno o amino, o
la línea de puntos no es un enlace y Ri está unido al sistema de anillo a través de un doble enlace y es oxo,
R2 es hidrógeno, o cicloalquilo, arilo o heterociclilo opcionalmente sustituido,
R3 es hidrógeno, COOR6 o aminocarbonilo, o alquilo, alquenilo, alquinilo, aralquilo, alcoxi, cicloalquiloxi, ariloxi o heterocicloxi opcionalmente sustituido,
R4 es hidrógeno, halógeno, hidroxi, SH, alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi o alquiltio opcionalmente sustituido, o R4 es un grupo sililo tal como trialquilsililo o trialquilsilil(oxi), p. ej., trialquil (C1 -6) silil(oxi), N3 , amino o
R4 es heterociclilo que comprenden al menos un átomo de nitrógeno tal como heteroátomo y estando unido a través de ese átomo de nitrógeno en el compuesto de fórmula IX, o
R4 está fijado al sistema de anillo a través de un doble enlace y es oxo; y
R5 y Ra, independientemente entre sí, son alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo o heterociclilo,
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula IX es:
Figure imgf000044_0001
iv. Antagonistas alostéricos de molécula pequeña incluyen estatinas que se unen al dominio CD11a de LFA-1. Véase Kallen, J., Welzenbach, K., Ramage, P. Geyl, D. Kriwacki, R., Legge, G., Cottens, S., Weitz-Schmidt, G.y Hommel, U. 1999. "Structural basis for LFA-1 inhibition upon lovastatin binding to the CD11a I-domain", J. Mol. Biol., 292: 1-9; y Weitz-Schmidt, G., Welzenbach, K., Brinkmann, V., Kamata, T., Kallen, J., Bruns, C., Cottens, S., Takada, Y. y Hommel, U.2001. Las estatinas inhiben selectivamente el antígeno-1 de la función leucocitaria uniéndose a un nuevo sitio regulador de la integrina, Nature Med., 7: 687-692; y Frenette, P. S. 2001. "Locking a leukocyte integrin with statins", N. Engl. J. Med., 345: 1419-1421. Moléculas derivadas del motivo de mevinolina/compactina también muestran actividad contra LFA-1. Véase Welzenbach, K., Hommel, U. y Weitz-Schmidt,G. 2002. "Small molecule inhibitors induce conformational changes in the I domain and the I-like domain of Lymphocyte Function-Associated Antigen-1", J. Biol. Chem., 277: 10590-10598, y Patente de EE.UU. N° 6,630,492.
Se describe una familia de antagonistas alostéricos de LFA-1 de Fórmula X, que son útiles en los métodos de la presente divulgación. Véase la Patente de EE.UU. N° 6818638.
Se proporciona un compuesto de Fórmula X para uso en los métodos de la divulgación, en los que
Figure imgf000044_0002
Fórmula X
Cada uno de a — b y a — (3, independientemente, es un enlace sencillo o un doble enlace Ri es
Figure imgf000044_0003
alqui
Figure imgf000044_0004
Ra is H, alquilo C1 -6 opcionalmente sustituido con OH o alcoxi C1 -4 , alquenilo C2 -6 o aril-alquilo C1 -4 ;
R2 es OH; -O-CO-R5 ;
R4 es H u OR19 en donde R19 es alquilo C1 -6 , hidroxi-alquilo C1 -6 , alcoxi C1-4-alquilo C1 -6 , aril-alquilo C1 -4 o alcoxi C1-4carbonyl-alquilo C1 -4 ;
R5 es alquilo C1 -8 , cicloalquilo C3 - 7 , cicloalquil C3 -7 -alquilo C1 -4 , arilo o aril-alquilo C1 -4 ; o R5 es -O-R6, en donde R6 es el residuo de un a-aminoácido fijado a O a través de su residuo carbonilo; o - R5 es -CHR7 --COR.8, en donde R7 es H, alquilo C1 -4 , heteroalquilo C1 -4 , cicloalquilo C3 - 7 , cicloalquil C3 -7 -alquilo C1 -4 , arilo o aril-alquilo C1 -4 y R8 es OH, alcoxi C1 -4 o NR9 R10 ;
cada uno de los R9 y R10 independientemente es H o alquilo C1 -4 , o R9 y R10 forman, junto con el nitrógeno al que están unidos, un grupo heteroarilo;
R3 es una lactama de fórmula X-a:
Figure imgf000045_0001
en donde R30 es alquilo C1 -8 , cicloalquilo C3 -7 , arilo, cicloalquil C3-7-alquilo C1 -4 , aril-alquilo C1 -4 , heteroaril o heteroarilalquilo C1 -4 ; y
R31 es OH, alcoxi C1 -4 , alquilo C1 -4 , alcoxi C1-4-carbonil-alquilo C1 -4 , hidroxi-alcoxi C1 -5 , alcoxi C1 -4 -alcoxi C1 -5 , alcoxi C1 -4-carbonil- alquilo C1 -4 , amino-alcoxi C1 -4 , HOOC--alcoxi C1 -4 , HOOC--alquilo C1 -4 , R9a R10a N--alcoxi C1 -5 , en donde Rga y R10a son, independientemente, R9 o R10.
En algunas realizaciones, siempre que aparezca "arilo" o "aril- alquilo C1 -4" en la definición anterior, es "fenilo" o "naftilo" opcionalmente sustituido con halógeno, OH, NR11 R12 , COOH, CF3 , alcoxi C1 -4 , alquilo C1 -4 , hidroxi-alquilo C1 -4 , hidroxialcoxi C1 , alcoxi C1-4-carbonilo, ciano o CONR11 R12 , siendo cada uno de R11 y R12 , independientemente, H, alquilo C1 -4 , fenilo, naftilo, fenil-alquilo C1 -4 o naftil-alquilo C1 -4 o R11 y R12 , junto con el nitrógeno al que están unidos, forman heteroarilo; y siempre que aparezca "heteroarilo", es un heteroarilo de 5 o 6 miembros opcionalmente condensado con un anillo de benceno; en forma libre o en forma de sal.
En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula X es uno de los siguientes compuestos:
Figure imgf000045_0003
v. También se puede utilizar como antagonistas una familia de inhibidores basados en hidantoína. Véase, Kelly, T. A., Jeanfavre, D. D., McNeil, D. W., Woska, J. R. Jr., Reilly, P. L., Mainolfi, E. A., Kishimoto, K. M., Nabozny, G. H., Zinter, R., Bormann, B.-J. y Rothlein, R. 1999. "Cutting edge: a small molecule antagonist of LFA-1-mediated cell adhesion", J. Immunol., 163: 5173-5177. Se cree que estos compuestos son inhibidores alostéricos de LFA-1.
Una familia de inhibidores de este tipo de Fórmula XI a base de hidantoína se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 2006/0148836 y son útiles en los métodos de la presente divulgación.
Se proporciona un compuesto de acuerdo con la fórmula XI para uso en los métodos de la divulgación,
Figure imgf000045_0002
Fórmula XI
y sus enantiómeros, sales farmacéuticamente aceptables o solvatos de los mismos, en donde:
Ri6 es:
Figure imgf000046_0001
cada uno de los R17 es independientemente -OR18 , -NR18R19 , -C(=O)Ri8, -CO2 R18 , -C(=O)NRi8Ri9, -NRi8C(=O)Ri9, -NRi8C(=O)ORi9, -S(O)pRi9, -NR18SO2 R19 o -SO2 NR18 R19 ;
Ri8 y R19 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, cicloalquilo o cicloalquilo sustituido; q es 1, 2 o 3; y p es 1 o 2.
En una realización, el compuesto de Fórmula XI es:
Figure imgf000046_0002
Otros compuestos de la clase general de compuestos de espiro-hidantoína que pueden ser útiles como antagonistas alostéricos de LFA-1 en los métodos de la divulgación son las Publicaciones de Solicitud de EE.UU. N°s 20060142319, 20060074099, 20060052434, 20050119279, 20050004153, 20040259897,20040248920,20040009998 y 20020143035. c. Otros Antagonistas de Moléculas Pequeñas.
Otras familias de inhibidores de moléculas pequeñas se describen en publicaciones (Véase, Gadek, T. R., Burdick, D. J., McDowell, R. S., Stanley, M. S., Marsters, J. C. Jr., Paris, K. J., Oare, D. A., Reynolds, M. E., Ladner, C., Zioncheck, K. A., Lee, W. P., Gribling, P., Dennis, M. S., Skelton, N. J., Tumas, D. B., Clark, K. R., Keating, S. M., Beresini, M. H., Tilley, J. W., Presta, L. G., y Bodary, S. C. 2002. "Generation of an LFA-1 antagonist by the transfer of the ICAM-1 immunoregulatory epitope to a small molecule" Science, 295: 1086-1089 y material complementario en línea) y en patentes, incluyendo la patente de EE.UU. N° 6.872.735, la patente de EE.UU. N° 6.667.318, la patente de EE.UU. N° 6803384, la patente de Ee .UU. N° 6.515.124, la patente de EE.UU. N° 6331640 y solicitudes de patente, incluyendo U.S.
20020119994. U.S. 20040058968, U.S. 20050080119, WO99/49856, WO00/21920, WO01/58853, WO02/59114, WO05/044817, y otras.
Los compuestos de la divulgación se pueden preparar mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, o descritos en las referencias citadas en esta memoria y se pueden purificar en un cierto número de modos, incluyendo la cristalización o precipitación en condiciones variadas para producir uno o más polimorfos. Por lo tanto, la presente divulgación abarca los compuestos de la invención arriba descritos, sus polimorfos, sus sales farmacéuticamente aceptables, sus solvatos farmacéuticamente aceptables y composiciones farmacéuticamente aceptables que los contienen.
Los ejemplos anteriores de realizaciones preferidas pretenden ilustrar algunos de los agentes terapéuticos potenciales y no pretenden limitar la divulgación de modo alguno. El método de la divulgación se puede poner en práctica con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, péptidos y otras moléculas sintéticas que es un inhibidor selectivo, potente y directamente competitivo de la interacción entre LFA-1 e ICAM-1, con el fin de tratar los síntomas de la retinopatía diabética.
II. Métodos de Tratamiento
El término "sujeto" tal como se utiliza en esta memoria incluye animales, en particular seres humanos así como otros mamíferos.
El término " tratar " y sus equivalentes gramaticales tal como se utilizan en esta memoria, incluye lograr un beneficio terapéutico y/o un beneficio profiláctico. Por beneficio terapéutico se entiende la erradicación o la mejora del trastorno subyacente que está siendo tratando. Además, se logra un beneficio terapéutico con la erradicación o la mejora de uno o más de los síntomas fisiológicos asociados con el trastorno subyacente, de manera que se observa una mejora en el sujeto, a pesar de que el sujeto aún pueda estar afectado por el trastorno subyacente. Para obtener un beneficio profiláctico, las composiciones se pueden administrar a un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad particular, o a un sujeto que informa uno o más de los síntomas fisiológicos de una enfermedad, aunque no se haya realizado un diagnóstico de esta enfermedad. Las composiciones se pueden administrar a un sujeto para prevenir la progresión de síntomas fisiológicos o del trastorno subyacente.
En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para administrar un agente terapéutico a un sujeto para tratar la retinopatía diabética. En algunas realizaciones de la divulgación, el agente terapéutico es un antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 es un antagonista directamente competitivo de LFA-1. En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 es un antagonista competitivo de LFA-1. En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 es un antagonista alostérico de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, el antagonista de LFA-1 puede modular la inflamación mediada por leucocitos. Otra realización de la divulgación trata a un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 para modular la inflamación asociada con la inflamación ocular. Una realización de la divulgación trata a un sujeto con síntomas de retinopatía diabética mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto con síntomas de diabetes Tipo II mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto con síntomas de diabetes Tipo I mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 para reducir el edema retinal en el ojo del sujeto. En otras realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de una cantidad con efecto terapéutico de un antagonista de LFA-1 para disminuir el edema macular. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 para disminuir el engrosamiento de la membrana basal en unjo del sujeto. En aún otras realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 para disminuir la neovascularización retiniana en un ojo del sujeto. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 para retardar la pérdida de visión debido a la retinopatía diabética. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar a un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 para disminuir la isquemia retiniana en el ojo del sujeto. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para disminuir el crecimiento fibrovascular sobre la retina en un ojo de un sujeto que padece retinopatía diabética, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para reducir la lesión o degeneración de la retina debido a la retinopatía diabética en un ojo de un sujeto que padece retinopatía diabética, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para limitar el daño no proliferativo de la retina en un ojo de un sujeto que padece retinopatía diabética, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para ralentizar el daño proliferativo de la retina en un ojo de un sujeto que padece retinopatía diabética, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para reducir o prevenir la adhesión de leucocitos a células epiteliales capilares en el ojo de un sujeto que lo necesite, administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En algunas otras realizaciones, se proporcionan métodos para reducir o prevenir el daño por reperfusión isquémica en un ojo de un sujeto que lo necesite, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos en los que el antagonista de LFA-1 que se administra al sujeto que padece retinopatía diabética, se une a un sitio de unión de alta afinidad en la subunidad aL de LFA-1 que se solapa al sitio de unión de ICAM-1. Algunas realizaciones de la divulgación utilizan compuestos que son inhibidores directamente competitivos de la interacción LFA-1/ICAM-1. Algunas de las realizaciones de la divulgación utilizan compuestos que compiten directamente por un sitio de unión de alta afinidad común para ICAM-1 en LFA-1. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos que administran a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 que es un compuesto de Fórmulas I, II, II', III, III', IV, IV', V o VI. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos que administran a un sujeto que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de LFA-1 que es un compuesto de Fórmulas VII, VIII, IX, X u XI.
En otras intervenciones terapéuticas que pueden asociarse con complicaciones diabéticas en el ojo, se pueden utilizar procedimientos de vitrectomía. Se ha demostrado que la dexametansona, un esteroide glucocorticoide, es útil para reducir la inflamación post-operatoria que puede potenciarse en sujetos diabéticos con relación a sujetos no diabéticos. Por lo tanto, puede ser deseable utilizar un antagonista de LFA-1 de la divulgación para reducir la inflamación. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para reducir la inflamación post-operatoria en sujetos diabéticos que se someten a procedimientos de vitrectomía mediante la administración de un antagonista de LFA-1 al sujeto que lo necesita. Además, en algunas realizaciones, un antagonista de LFA-1 de la invención puede administrarse a un sujeto antes de un procedimiento de vitrectomía para reducir profilácticamente la inflamación post-operatoria.
En otras intervenciones terapéuticas que pueden asociarse con complicaciones diabéticas en el ojo, se puede utilizar la terapia fotodinámica para corregir la oclusión o fugas, y puede provocar una inflamación excesiva en un sujeto diabético. Por lo tanto, puede ser deseable utilizar un antagonista de LFA-1 de la divulgación para reducir la inflamación. En algunas realizaciones de la divulgación se proporcionan métodos para reducir la inflamación post-operatoria en sujetos diabéticos que se someten a procedimientos terapéuticos fotodinámicos (PDT) administrando un antagonista de LFA-1 al sujeto que lo necesita. Además, en algunas realizaciones, un antagonista de LFA-1 de la divulgación puede administrarse a un sujeto antes de un procedimiento de PDT para reducir profilácticamente la inflamación post-operatoria.
En otras intervenciones terapéuticas que pueden asociarse con complicaciones diabéticas en el ojo, se puede utilizar la terapia de fotocoagulación por láser para corregir la oclusión o fugas, y puede provocar una inflamación excesiva en un sujeto diabético. Por lo tanto, puede ser deseable utilizar un antagonista de LFA-1 de la divulgación para reducir la inflamación. En algunas realizaciones de la divulgación se proporcionan métodos para reducir la inflamación post­ operatoria en sujetos diabéticos que se someten a procedimientos terapéuticos de fotocoagulación por láser administrando un antagonista de LFA-1 al sujeto que lo necesita. Además, en algunas realizaciones, un antagonista de LFA-1 de la divulgación puede administrarse a un sujeto antes de un procedimiento terapéutico de fotocoagulación por láser para reducir profilácticamente la inflamación post-operatoria.
En el tratamiento con LASIK de los defectos de la visión, los pacientes diabéticos tienen un riesgo incrementado de complicaciones post-operatorias por inflamación y defectos del epitelio corneal que los pacientes no diabéticos, y puede estar indicado un tratamiento antiinflamatorio. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para reducir la inflamación debida a las complicaciones diabéticas del tratamiento con LASIK en el ojo de un sujeto del mismo, mediante la administración de un antagonista de LFA-1 y, con ello, reducir dicha inflamación. La administración se realiza de forma post-operatoria o pre-operativa para prevenir o reducir profilácticamente una inflamación de este tipo.
Personas con EMD tienen un mayor riesgo de desarrollar cataratas, que es una causa frecuente de pérdida de la visión. Los pacientes diabéticos tienen un mayor riesgo de complicaciones tanto del segmento anterior como posterior después de la cirugía de cataratas. Uno de los más importantes es la neovascularización del iris, ya que puede progresar a glaucoma neovascular. Otras complicaciones de la cámara anterior incluyen la dispersión del pigmento con precipitados en la superficie de la lente intraocular (IOL) recién implantada, exudados fibrinosos o formación de membranas (por inflamación) en la cámara anterior. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos para reducir las complicaciones del segmento anterior o posterior después de la cirugía de cataratas en un ojo de un sujeto con EMD, mediante la administración de un antagonista de LFA-1 a un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para administrar profilácticamente un antagonista de LFA-1 a un sujeto con EMD que tiene mayor riesgo de desarrollar cataratas en comparación con un sujeto sano, reduciendo o previniendo con ello el desarrollo de cataratas.
Los métodos implican generalmente la administración de uno o más fármacos para el tratamiento de la retinopatía diabética, en que el fármaco se administra o se distribuye después de la administración en la retina o la región intraocular del ojo. Se pueden utilizar combinaciones de agentes para tratar la retinopatía diabética o para modular los efectos secundarios de uno o más agentes en la combinación. Dado que los eventos patológicos en este estado de enfermedad están marcados por una combinación de alteración de la autorregulación, apoptosis, isquemia, tejido reperfundido, neovascularización y estímulos inflamatorios, puede ser deseable administrar los antagonistas de LFA-1 de la divulgación en combinación con otros agentes terapéuticos. para intervenir adicional o sinérgicamente. En algunas realizaciones, el segundo agente terapéutico es un antioxidante, agente antiinflamatorio, antimicrobiano, agente antiangiogénico y/o antiapoptótico. En algunas realizaciones de la divulgación, además de administrar un compuesto que compite directamente por la unión a LFA-1, se puede administrar un agente terapéutico adicional que es un antagonista alostérico, pero no directamente competitivo, de LFA-1 como se discutió anteriormente, resultando en potencia en una eficacia sinérgica. Un ejemplo de un antagonista alostérico de este tipo es la clase de inhibidores de hidantoína de LFA-1. Otros ejemplos de antagonistas alostéricos incluyen compuestos de Fórmula VII, VIII, IX, X u XI.
Otra clase de agentes terapéuticos que puede ser útil administrar en combinación con, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo terapéutico anti-adhesión.
Otra clase de agentes terapéuticos que pueden ser útiles para administrar en combinación, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación es el grupo de fármacos que inhiben el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular y, por lo tanto, pueden fijar como objetivo otra ruta de inicio de la neovascularización. Cualquier inhibidor de VEGF puede ser útil en las composiciones de la divulgación, que incluyen, pero no se limitan a 1) anticuerpos monoclonales neutralizantes contra VEGF o su receptor, 2) inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña de receptores de VEGF, 3) receptores de VEGF solubles que actúan como receptores señuelo para VEGF, 4) ribozimas que fijan específicamente como objetivo a VEGF y 5) ARNip que fija específicamente como objetivo a proteínas de señalización de VEGF. Algunos ejemplos de anticuerpos que son activos contra VEGF son, por ejemplo, Lucentis (ranibizumab) y Avastina (bevacizumab). Un ejemplo de un fármaco oligonucleotídico es, p. ej., Macugen (inyección de pegaptanib sódico). Inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña incluyen, por ejemplo, pazopanib, sorafenib, sutent y similares.
La inflamación es inducida por la permeabilidad vascular provocada por la DR y por el proceso de adhesión y neovascularización leucocitaria. Por lo tanto, se pueden administrar otros agentes antiinflamatorios en combinación, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación. Los agentes antiinflamatorios se pueden elegir entre fármacos relacionados con corticosteroides, que incluyen, pero no se limitan a dexametasona, fluorometalona, medrisona, betametasona, triamcinolona, acetónido de triamcinolona, prednisona, prednisolona, hidrocortisona, rimexolona y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, prednicarbato, deflazacort, halometasona, tixocortol, prednilideno, prednival, parametasona, metilprednisolona, meprednisona, mazipredona, isoflupredona, acetato de halopredona, halcinonida, formocortal, flurandrenolida, fluprednisolona, acetato de fluprednidina, acetato de fluperolona, fluocortolona, fluocortina butilo, fluocinonida, acetonida de fluocinolona, flunisolida, flumetasona, fludrocortisona, fluclorinida, enoxolona, difluprednato, diflucortolona, diacetato de diflorasona, desoximetasona (desoximetasona), desonida, descinolona, cortivazol, corticosterona, cortisona, cloprednol, clocortolona, clobetasona, clobetasol, cloroprednisona, cafestol, budesonida, beclometasona, amcinonida, alopregnano acetonida, alclometasona, 21-acetoxipregnenolona, tralonida, acetato de diflorasona, deacilcortivazol, RU-26988, budesonida, deacilcortivazol y similares. Alternativamente, los agentes antiinflamatorios se pueden elegir del grupo de NSAIDs que incluyen, pero no se limitan a acetaminofeno, acemetacina, aceclofenaco, alminoprofeno, amfenaco, bendazac, benoxaprofeno, bromfenaco, ácido buclóxico, butibufeno, carprofeno, celecoxib, cinmetacina, clopirac, diclofenaco, etodolac, etoricoxib, felbinac, ácido fenclózico, fenbufeno, fenoprofeno, fentiazac, flunoxaprofen, flurbiprofeno, ibufenaco, ibuprofeno, indometacina, isofezolac, isoxicam, isoxepac, indoprofen, ketoprofen, lonazolaco, loxoprofen, ácido mefenámico, ácido meclofenámico, meloxicam, ácido metiazínico, mofezolac, miroprofen, naproxen, niflumic, oxaprozin, pirozolac, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, rofecoxib, ácido salicílico y sus derivados (es decir, por ejemplo, asprina), sulindac, suprofeno, suxibuzona, áido triaprofénico, tolmetina, valdecoxib, xenbucin, ximoprofeno, zaltoprofeno, zomepirac, aspirina, acemetcin, bumadizon, carprofenaco, clidanaco, diflunisal, ácido enfenámico, fendosal, ácido flufenámico, flunixin, ácido gentísico, ketorolac, mesalamina, profármacos de los mismos y similares.
Otro grupo de agentes terapéuticos que puede ser útil para administrar en combinación, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación es el grupo de fármacos que se sabe que inhiben la retinopatía inhibiendo NFK p. Algunas de estas clases de agentes terapéuticos incluyen inhibidores de PARP, benfotiamina u otros agentes que intervienen en el bloqueo de AGEs (productos finales de glicación avanzada), inhibidores de la aldosa reductasa, inhibidores de iNOS, inhibidores de FasL o angiopoyeitina-1.
El estrés oxidativo puede inducirse en células con procesos autorreguladores e isquémicos alterados inducidos por DR. Por lo tanto, los antioxidantes pueden ser útiles para administrar en combinación con, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación. Ejemplos de antioxidantes adecuados, útiles en los métodos de la divulgación incluyen, pero no se limitan a ácido ascórbico, tocoferoles, tocotrienoles, carotinoides, glutatión, ácido alfa-lipoico, ubiquinoles, bioflavonoides, carnitina y miméticos de superóxido dismutasa, tales como, por ejemplo, compuestos de nitróxido de 2,2,6,6-tetrametiM-piperidiniloxi (TEMPO), Do XYL, PROXYL; 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxi (Tempol), M-40401, M-40403, M-40407, M-40419, M-40484, M-40587, M-40588 y similares.
En algunas fases de la retinopatía diabética, el resultado es una isquemia retiniana que provoca una muerte celular adicional. En algunas realizaciones de la divulgación, se proporcionan métodos en los que se pueden administrar agentes terapéuticos anti-apoptóticos en combinación con, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación. Ejemplos de agentes anti-apoptóticos adecuados son, por ejemplo, inhibidores de caspasas, catepsinas y TNF-a.
Otra clase de agentes terapéuticos que pueden ser útiles para administrar en combinación con, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación son los inhibidores del complemento. El evento de unión de LFA-1/ICAM es aguas abajo de la activación del complemento de la regulación al alza de ICAM en el tejido y en las células epiteliales vasculares/capilares. La administración tanto de un inhibidor del complemento como de un antagonista de LFA-1 puede permitir una modulación más completa de los leucocitos que expresan LFA-1. Un ejemplo de inhibidor del complemento es Eculizumab. Otros inhibidores del complemento incluyen, pero no se limitan a las Patentes de EE.UU. N°s 7166568, 6319897, 5843884, 5135916 y 5624837.
Otra clase de agentes terapéuticos que pueden ser útiles para administrar en combinación con, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación son los medicamentos utilizados en la gestión del glaucoma en pacientes con DM de fondo, que incluye glaucoma primario, de ángulo abierto, de cierre de ángulo y neovascular. Algunos de los agentes terapéuticos utilizados para el glaucoma incluyen, pero no se limitan a análogos de prostaglandinas, tales como, por ejemplo, latanoprost, bimatoprost y travaprost; antagonistas de los receptores betaadrenérgicos tópicos, tales como, por ejemplo, timolol, levobunolol y betaxolol; agonista alfa 2-adrenérgico, tal como, por ejemplo, brimonidina; simpaticomiméticos, tales como, por ejemplo, epinefrina o dipivifrina; agentes mióticos, tales como, por ejemplo, pilocarpina; inhibidores de la anhidrasa carbónica, tales como, por ejemplo, dorzolamida, brinzolamida y acetozolamida; o fisostigmina.
Otra clase de agentes terapéuticos que pueden ser útiles para administrar en combinación con, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación son agentes antimicrobianos. Compuestos antimicrobianos adecuados incluyen, pero no se limitan a penicilinas tales como, por ejemplo, amoxicilina, ampicilina, azlocilina, carbenicilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, mezlocilina, nafcilina, penicilina, piperacilina, ticarcilina y similares; inhibidores de beta-lactamasa; carbapenémicos, tales como, por ejemplo, ertapenem, imipenem, meropenem y similares; cefalosporinas, tales como, por ejemplo, cefaclor, cefamandol, cefoxitina, cefprozil, cefuroxima, cefixima, cefdinir, cefditoren, cefoperazona, cefotaxima, cefpodoxima, cefadroxilo, ceftazidima, ceftibuten, ceftizoxima, ceffiriaxona, cefazolin, cefixima, cefalexin, cefepima, y similares; quinolonas, tales como, por ejemplo, ciprofloxacina, enoxacina, gatifloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, morifloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trovafloxacina y similares; macrólidos, tales como, por ejemplo, azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, milbemicina, troleandomicina y similares; monbactamas, tales como, por ejemplo, aztreonam y similares; tetraciclinas, tales como, por ejemplo, demeclociclina, doxiciclina, minociclina, oxitetraciclina, tetraciclina y similares; aminoglicósidos, tales como, por ejemplo, amikacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, estreptomicina, tobramicina y similares; carbacefem, tal como, por ejemplo, loracarbef y similares; estreptograminas; sulfonamidas, tales como, por ejemplo, mefanida, prontosil, sulfacetamida, sulfametizol, sulfanilamida, sulfasalazina, sulfisoxazol, trimetoprim, trimetoprim-sultametoxazol y similares; y los fármacos de combinación, tales como, por ejemplo, sulfametoxazol y trimetoprim, y similares; y polipéptidos, tales como, por ejemplo, bacitracina, colistina, polimixina B y similares.
Ejemplos de otros agentes terapéuticos que pueden ser útiles para administrar en combinación, antes de, después de o concomitantemente con los antagonistas de LFA-1 de la divulgación incluyen, pero no se limitan a: (a) agentes antidiabéticos, tales como insulina y miméticos de insulina, sulfonilureas (p. ej., gliburida, meglinatida), biguanidas, p. ej., metformina (Glucophage™), inhibidores de la alfa-glucosidasa (acarbosa), sensibilizadores de insulina, p. ej., compuestos de tiazolidinona, rosiglitazona (Avandia™), troglitazona (Rezulinia™), ciglitazona, pioglitazona (Actos™) y englitazona; (b) agentes reductores del colesterol, tales como inhibidores de la HMG-CoA reductasa (p. ej., lovastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina y otras estatinas), secuestrantes de ácidos biliares (p. ej., colestiramina y colestipol), vitamina B3 (también conocida como ácido nicotínico, o niacina), vitamina B6 (piridoxina), vitamina B12 (cianocobalamina), derivados del ácido fíbrico (p. ej., gemfibrozil, clofibrato, fenofibrato y benzafibrato), probucol, nitroglicerina e inhibidores de la absorción de colesterol (p. ej., beta-sitosterol e inhibidores de acilCoA-colesterol aciltransferasa (ACAT), tales como melinamida), inhibidores de HMG-CoA sintasa, inhibidores de escualeno epoxidasa e inhibidores de escualeno sintetasa; y (c) agentes antitrombóticos, tales como agentes trombolíticos (p. ej., estreptoquinasa, alteplasa, anistreplasa y reteplasa), heparina, hirudina y derivados de warfarina, beta-bloqueantes (p. ej., atenolol), agonistas beta-adrenérgicos (p. ej., isoproterenol), inhibidores de la ACE y vasodilatadores (p. ej., nitroprusiato de sodio, hidrocloruro de nicardipina, nitroglicerina y enaloprilato).
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéutico para reducir los síntomas de la retinopatía diabética en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90%, o eliminan sustancialmente los síntomas de la retinopatía diabética. En otras realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para reducir la degeneración de la retina en un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90%, o eliminar sustancialmente la degeneración de la retina.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para disminuir el edema retinal en un ojo tratado de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90%, o eliminar sustancialmente el edema retinal.
En aún otras realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para disminuir el engrosamiento de la membrana basal en un ojo tratado de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90%, o eliminar sustancialmente el engrosamiento de la membrana basal.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para disminuir la neovascularización retiniana en un ojo tratado de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,más del 90%, o eliminar sustancialmente la neovascularización retiniana.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para disminuir el crecimiento fibrovascular sobre la retina en un ojo tratado de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90% o eliminan sustancialmente el crecimiento fibrovascular sobre la retina.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para retardar la pérdida de visión en un ojo tratado de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90% o eliminar sustancialmente la pérdida de visión adicional.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para limitar el daño no proliferativo a la retina de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90%, o eliminar sustancialmente el daño no proliferativo de la retina.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 está presente en una cantidad suficiente para ralentizar el daño proliferativo a la retina de un sujeto en un promedio de al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, más del 90% o eliminan sustancialmente el daño proliferativo adicional a la retina.
En algunas realizaciones, una cantidad eficaz del antagonista de LFA-1 es una dosis diaria de aproximadamente 1x 10­ 11, 1x 10-10, 1x 10-9, 1x 10-8, 1x 10-7, 1x 10-6, 1x 10-5, 1x 10-4, 1x 10'3, 1x 10'2, 1x 10-1, 1, 1x 101, 1x 102 gramos.
La administración del agente terapéutico puede realizarse por cualquier medio adecuado. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante administración oral. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante administración transdérmica. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante instilación. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante inyección. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante inyección intravítrea de liberación lenta. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante implantación intraocular de liberación lenta. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra mediante implantación periocular. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra por vía tópica. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se administra por vía tópica, mediante un colirio. Si se administran combinaciones de agentes como composiciones separadas, se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. Si se administran combinaciones de agentes en una única composición, se pueden administrar por cualquier vía adecuada. En algunas realizaciones, las combinaciones de agentes se administran como una única composición mediante administración oral. En algunas realizaciones, las combinaciones de agentes se administran como una única composición mediante administración transdérmica. En algunas realizaciones, las combinaciones de agentes se administran como una única composición mediante inyección. En algunas realizaciones, las combinaciones de agentes se administran como una única composición por vía tópica.
En algunas realizaciones de la divulgación, se emplearán procedimientos de diagnóstico para identificar a un sujeto que necesite tratamiento mediante el método de la divulgación. Una lista a modo de ejemplo de procedimientos que se pueden utilizar para diagnosticar síntomas de retinopatía diabética, incluyen, por ejemplo, examen oftálmico completo (que puede incluir examen de rejilla de Amsler y examen con lámpara de hendidura), fotografía de fondo de ojo, angiografía con fluoresceína, tomografía de coherencia óptica, fotografía no miriádica, y ecografía de barrido beta, examen ocular convencional, tomografía de coherencia óptica, ecografía de barrido beta solo, examen oftálmico completo con fotografía de fondo de ojo y angiografía con fluoresceína.
El antagonista del método de la divulgación puede ser un anticuerpo, fragmento de un anticuerpo, péptido o molécula pequeña. En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 utilizado es un péptido que no es un anticuerpo. En otras realizaciones, el antagonista de LFA-1 utilizado es una molécula pequeña.
En algunas realizaciones de la divulgación, el tratamiento o la prevención de los síntomas de la retinopatía diabética utilizando antagonistas de LFA-1 requiere terapia crónica; por lo tanto, se pueden utilizar inhibidores de molécula pequeña de la interacción LFA-1/ICAM-1, ya que tienen el potencial de administración local como gotas oculares con un costo reducido de los productos. De manera similar, la administración oral ofrece ventajas en cuanto a la reducción del costo de los productos. Los dispositivos implantables, que pueden ser formulaciones de liberación lenta o liberación sostenida biodegradables o bioabsorbibles o biodegradables implantadas o inyectadas en el ojo o cerca del ojo en tejido periocular se utilizan para terapia crónica.
Otra realización es un método para tratar los síntomas de la retinopatía diabética utilizando agentes terapéuticos que son adecuados para la formulación y administración como agentes terapéuticos oculares.
Una formulación en crema de los compuestos de la divulgación puede ser útil en el suministro local de un antagonista de LFA-1 a la piel. Compuestos útiles a este respecto incluyen antagonistas de LFA-1 y sus profármacos que se transforman en el fármaco activo una vez dentro de la piel. Una crema para la piel que se aplica a la superficie externa de los párpados y que libera un antagonista de LFA-1 a través del párpado hasta el revestimiento interno del párpado y el tejido conjuntivo intermedio y las glándulas lagrimales accesorias y aparecen en forma de lágrima y, por lo tanto, se absorbe en el ojo. Esta forma de suministro puede ser deseable en el tratamiento de la inflamación del ojo mediada por LFA-1, particularmente en el tratamiento de la retinopatía diabética.
111. Adm inistración.
El método de la presente divulgación puede basarse en muchos modos de administración adecuados para suministrar el antagonista de LFA-1 de los métodos descritos en esta memoria. Un suministro de este tipo a las regiones afectadas del cuerpo se puede lograr mediante administración local o sistémica. Formulaciones adecuadas y soportes adicionales se describen en Remington " The Science and Practice of Pharmacy " (20a Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona una composición farmacéutica para la administración a un sujeto que contiene: (i) una cantidad eficaz de un agente terapéutico; y (ii) un excipiente farmacéutico adecuado para la administración oral. En algunas realizaciones, la composición contiene además: (iii) una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico. Una composición farmacéutica de la divulgación puede comprender cualquiera de las moléculas descritas en esta memoria.
Con el fin de reducir la inflamación en los trastornos oculares, la composición farmacéutica de la divulgación se suministra preferiblemente a la retina, el espacio intraocular, la superficie ocular, la inervación de interconexión, la conjuntiva, las glándulas lagrimales o las glándulas de Meibomio. Se prevé que el tratamiento eficaz puede abarcar la administración de agentes terapéuticos de la presente invención mediante administración oral, administración tópica, mediante inyección, por vía intranasal, rectal, transdérmica, mediante un dispositivo impregnado o recubierto tal como un inserto o implante ocular, o iontoforéticamente, entre otras vías de administración.
Para la administración mediante inyección, la composición farmacéutica se puede inyectar por vía intraocular, periocular, intramuscular, intraarterial, subcutánea o intravenosa Puede emplearse un mecanismo de bomba para administrar la composición farmacéutica a lo largo de un período preseleccionado. Para algunas realizaciones de la divulgación, es deseable suministrar el fármaco de forma local, por lo que las inyecciones se pueden realizar de forma periocular, intraocular, intravítrea, subconjuntiva, retrobulbar, en la esclerótica o intercameralmente. Para algunas realizaciones de la divulgación, se prefiere el suministro sistémico.
Para la administración sistémica, los compuestos de la divulgación se pueden formular para y administrar por vía oral. Para la administración que puede resultar en una distribución regional o sistémica de los agentes terapéuticos, la composición de la divulgación puede administrarse por vía intranasal, transdérmica o mediante algunas formas de administración oral, p. ej., con el uso de un colutorio o una pastilla que incorpore un compuesto de la invención que se absorbe mal del GI. Para la administración que puede dar como resultado el suministro regional o local de la composición de la invención, puede utilizarse la administración iontoforética o tópica.
Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse a la superficie ocular a través de un sistema de bomba-catéter, o liberarse desde dentro de un dispositivo de liberación continua o selectiva tal como, p. ej., membranas tales como, pero no limitadas a las empleadas en el sistema OcusertTM (Alza Corp, Palo Alto, CA). Las composiciones farmacéuticas se pueden incorporar, llevar o unir a las lentes de contacto que luego lleva el sujeto. Las composiciones farmacéuticas se pueden pulverizar sobre la superficie ocular.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse por vía intraocular o periocular mediante un sistema de bomba-catéter, o pueden liberarse desde dentro de un dispositivo de liberación continua o selectiva. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender formulaciones biodegradables de liberación sostenida, lenta y/o retardada, tales como, por ejemplo, microesferas, micropartículas o nanopartículas de PLGA que pueden administrarse mediante un dispositivo tal como se describió arriba o inyectarse por vía intraocular o periocular. En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 se administra en una dosis única. También puede utilizarse una dosis única de un antagonista de LFA-1 cuando se co-administra con otra sustancia (p. ej., un analgésico) para el tratamiento de una afección aguda.
En algunas realizaciones, el antagonista de LFA-1 (solo o en combinación con otros fármacos) se administra en múltiples dosis. La dosificación puede ser aproximadamente una vez, dos veces, tres veces, cuatro,veces cinco veces, seis veces, siete veces, ocho veces, nueve veces, diez veces o más de diez veces al día. La dosificación puede ser aproximadamente una vez al año, dos veces al año, cada seis meses, cada 4 meses, cada 3 meses, cada 60 días, una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. En una realización, el fármaco es un analgésico. En otra realización, el antagonista de LFA-1 y otra sustancia terapéutica se administran juntos de aproximadamente una vez al día a aproximadamente 10 veces al día. En otra realización, la administración del antagonista de LFA-1 y otra sustancia terapéutica continúa durante menos de aproximadamente 7 días. En aún otra realización, la co-administración continúa durante más de aproximadamente 6, 10, 14, 28 días, dos meses, seis meses o un año. En algunos casos, la dosificación co-administrada se mantiene tanto tiempo como sea necesario, p. ej., la dosificación para la inflamación crónica.
La administración de las composiciones de la divulgación puede continuar tanto tiempo como sea necesario. En algunas realizaciones, una composición de la divulgación se administra durante más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 o 28 días. En algunas realizaciones, una composición de la divulgación se administra durante menos de 28, 14, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 días. En algunas realizaciones, una composición de la divulgación se administra de forma crónica sobre una base continua, p. ej., para el tratamiento del dolor crónico.
La dosificación del antagonista de LFA-1 en el método de la divulgación se puede encontrar mediante experimentación de rutina. La dosis diaria puede variar desde aproximadamente 1x 10'8g a 5000mg. El intervalo de dosis diaria puede depender de la forma del antagonista de LFA-1, p. ej., los ésteres o sales utilizados y/o la vía de administración, tal como se describe en esta memoria. Por ejemplo, para la administración sistémica, los intervalos de dosis diarios típicos son, p. ej., aproximadamente 1-5000 mg, o aproximadamente 1-3000 mg, o aproximadamente 1-2000 mg, o aproximadamente 1-1000 mg, o aproximadamente 1-500 mg, o aproximadamente 1-100 mg, o aproximadamente 10-5000 mg, o aproximadamente 10-3000 mg, o aproximadamente 10-2000 mg, o aproximadamente 10-1000 mg, o aproximadamente 10-500 mg, o aproximadamente 10-200 mg, o aproximadamente 10 -100 mg, o aproximadamente 20-2000 mg o aproximadamente 20-1500 mg o aproximadamente 20-1000 mg o aproximadamente 20-500 mg, o aproximadamente 20­ 100 mg, o aproximadamente 50-5000 mg, o aproximadamente 50-4000 mg, o aproximadamente 50-3000 mg, o aproximadamente 50-2000 mg, o aproximadamente 50-1000 mg, o aproximadamente 50-500 mg, o aproximadamente 50-100 mg, aproximadamente 100-5000 mg, o aproximadamente 100-4000 mg, o aproximadamente 100-3000 mg, o aproximadamente 100-2000 mg, o aproximadamente 100-1000 mg, o aproximadamente 100-500 mg. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es de aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 mg.En algunas realizaciones, la dosis diaria del antagonista de LFA-1 es de 10 mg. En algunas realizaciones, la dosis diaria del antagonista de LFA-1 es de 100 mg. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es de 500 mg. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es de 1000 mg.
Para el suministro tópico a la superficie ocular, los intervalos típicos de dosis diarias son, p. ej., aproximadamente 1 x 10' 8g a 5,0 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 1,00 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 0,5g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 0,1 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 0,05 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 0,025 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 1 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 2,5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 1 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 5 x 10‘4g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 5,0 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 1,00g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 0,5 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 0,1 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 0,05 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 0,025 g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 1 x 10‘ 2g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 2,5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10‘7g a 1 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 5 x 10‘4g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 5,0 g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 1 g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 0,5 g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 0,1g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 5 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 5 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 2,5 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 1 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10_6g a 5 x 10‘ 3g, o aproximadamente 1 x 10‘6g a 2,5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10‘6g a 1x10‘3g, o aproximadamente 1 x 10‘6g a 5 x 10‘4g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 5 g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 1 g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 0,5g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 0,1g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 0,05 g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 2,5 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10‘5g a 1 x 10‘ 2g, o aproximadamente 1 x 10_5g a 5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_5g a 2,5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_5g a 1 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_5g a 5 x 10_4g. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es aproximadamente 1 x 10‘7, 1 x 10‘6, 1 x 10‘5, 1 x 10‘4, 1 x 10‘3g, 1 x 10‘2g, 1 x 101g o 1 g. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es 1 x 10_7g. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es 1 x 10‘ 5g. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es 1 x 10‘3g. En algunas realizaciones, la dosis diaria de antagonista de LFA-1 es 1 x10 _2g. En algunas realizaciones, la dosis objeto varía de aproximadamente 1 x 10‘8g a 5,0 g, o aproximadamente 1 x 10‘8g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10‘8g a 1,00 g, o aproximadamente 1 x 10‘8g a 0,5g, o aproximadamente 1 x 10‘8g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10‘8g a 0,1 g, o aproximadamente 1 x 10‘8g a 0,05 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 0,025 g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 1 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 2,5 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 1 x 10‘3g, o aproximadamente 1 x 10_8g a 5 x 10‘4g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 5,0 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 1,00g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 0,5 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 0,1 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 0,05 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 0,025 g, o aproximadamente 1 x 10_7g a 1 x 10‘2g, o aproximadamente 1 x 10-7g a 5 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-7g a 2,5 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-7g a 1 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-7g a 5 x 10-4g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 5,0 g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 2,5 g, 0 aproximadamente 1 x 10-6g a 1 g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 0,5 g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 0,1g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 5 x 10-2g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 5 x 10-2g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 2,5 x 10-2g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 1 x 10-2g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 5 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 2,5 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 1x10-3g, o aproximadamente 1 x 10-6g a 5 x 10-4g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 5 g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 2,5 g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 1 g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 0,5g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 0,25 g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 0,1g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 0,05 g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 2,5 x 10-2g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 1 x 10-2g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 5 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 2,5 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 1 x 10-3g, o aproximadamente 1 x 10-5g a 5 x 10-4g. En algunas realizaciones, la dosis individual descrita anteriormente se repite 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 veces al día.
En algunas realizaciones de la divulgación, el colirio, la crema, la loción u otras formulaciones tópicas de la divulgación liberan suficiente agente terapéutico intraocular o periocularmente para mantener un nivel de antagonista de LFA-1 de al menos aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 150 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 250 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 350 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 25 mM de una dosis a otra.
En algunas realizaciones de la divulgación, una formulación de colirio de la divulgación libera suficiente agente terapéutico intraocular o periocularmente para lograr un nivel de antagonista de LFA-1 en la retina de al menos aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 150 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 250 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 350 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 25 mM de una dosis a otra.
Para otras formas de administración, las dosificaciones diarias pueden variar alrededor de aproximadamente el intervalo descrito para la administración sistémica o pueden variar aproximadamente el intervalo descrito para la administración tópica.
Para dispositivos y formulaciones intraoculares o perioculares de liberación lenta o sostenida, en algunas realizaciones, un intervalo de dosis típico es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg de antagonista de LFA-1 liberado a lo largo del período de dosificación. En otras realizaciones, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 a aproximadamente 25 mg, aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 50 mg,aproximadamente 10 mg a aproximadamente 25 mg o aproximadamente 15 mg a aproximadamente 50 mg se liberan a lo largo del periodo de dosificación. El período de dosificación para formulaciones y dispositivos intraoculares o perioculares de liberación lenta varía típicamente de aproximadamente 10 días a aproximadamente 1 año, aproximadamente 30 días a aproximadamente 1 año, aproximadamente 60 días a aproximadamente 1 año, aproximadamente 3 meses a aproximadamente 1 año, aproximadamente 4 meses a aproximadamente 1 año, aproximadamente 5 meses a aproximadamente 1 año o aproximadamente 6 meses a aproximadamente 1 año. En algunas realizaciones, los dispositivos y las formulaciones intraoculares o perioculares de liberación lenta liberan el agente terapéutico a lo largo de un período de aproximadamente 1 mes a aproximadamente 9 meses, aproximadamente 1 mes a aproximadamente 8 meses, aproximadamente 1 mes a aproximadamente 7 meses, aproximadamente 1 mes a aproximadamente 6 meses, aproximadamente 1 mes a aproximadamente 5 meses, aproximadamente 1 mes a aproximadamente 4 meses o aproximadamente 1 mes a aproximadamente 3 meses. En otras realizaciones, las formulaciones y los dispositivos de liberación lenta liberan el agente terapéutico hasta durante 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 12 meses, 18 meses, 2 años, 30 meses o 3 años.
En algunas realizaciones de la divulgación, la formulación de liberación sostenida y/o implantes liberan suficiente agente terapéutico intraocular o periocularmente para mantener un nivel de antagonista de LFA-1 de al menos aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 150 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 250 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 350 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 25 mM a lo largo de un año. En algunas realizaciones de la divulgación, la formulación de liberación sostenida y/o implantes liberan suficiente agente terapéutico intraocular o periocularmente para mantener un nivel de antagonista de LFA-1 de al menos aproximadamente 10 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 100 nM, aproximadamente 150 nM, aproximadamente 200 nM, aproximadamente 250 nM, aproximadamente 300 nM, aproximadamente 350 nM, aproximadamente 500 nM, aproximadamente 600 nM, aproximadamente 700 nM, aproximadamente 800 nM, aproximadamente 900 nM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM, aproximadamente 8 mM, aproximadamente 9 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 25 mM a lo largo de 6 meses.
IV. Formulaciones.
Los compuestos de la divulgación se pueden formular como una solución o suspensión estéril, en vehículos adecuados, bien conocidos en la técnica. Formulaciones adecuadas y soportes adicionales se describen en Remington " The Science and Practice of Pharmacy " (20a Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore MD).
Para formulaciones inyectables, el vehículo se puede elegir entre los que se conocen en la técnica como adecuados, incluyendo soluciones acuosas o suspensiones oleosas, o emulsiones, con aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón o aceite de cacahuete, así como elixires, manitol, dextrosa, o una solución acuosa estéril, y vehículos farmacéuticos similares. La formulación también puede comprender composiciones poliméricas que son biocompatibles, biodegradables, tales como ácido poli(láctico-co-glicólico). Estos materiales pueden convertirse en micropartículas o nanopartículas, cargarse con fármaco y recubrirse o derivatizarse adicionalmente para proporcionar un rendimiento superior de liberación sostenida. Vehículos adecuados para inyección periocular o intraocular incluyen, por ejemplo, suspensiones de agente terapéutico en agua de calidad para inyección, liposomas y vehículos adecuados para sustancias lipofílicas. Otros vehículos para inyección periocular o intraocular son bien conocidos en la técnica.
Puede ajustarse la concentración de fármaco, tamponarse el pH de la solución y ajustarse la isotonicidad para que sea compatible con la inyección intravenosa, como es bien conocido en la técnica.
Cualquiera de las formas de LFA-1 también se puede moler para proporcionar propiedades más adecuadas para la formulación. La molienda puede proporcionar un tamaño de partícula más pequeño con una mayor superficie de exposición, lo cual puede proporcionar una solubilización más rápida in vivo o durante la formulación. Alternativamente, la molienda a un tamaño de partícula más pequeño puede proporcionar la capacidad de atravesar barreras biológicas, tales como la piel o la pared intestinal, directamente, sin solubilización inicial, permitiendo el uso como un sólido en la formulación, lo cual puede proporcionar beneficios adicionales de estabilidad de temperatura. vida útil, facilidad de transporte y facilidad de uso por parte del sujeto.
Las formulaciones orales pueden ser tabletas, cápsulas, trociscos, píldoras, obleas, gomas de mascar, pastillas, soluciones o suspensiones acuosas, suspensiones oleosas, jarabes, elixires o polvos o gránulos dispersables, y similares, y pueden prepararse de cualquier forma conocida en la técnica. Las formulaciones orales también pueden contener agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes y conservantes. Excipientes farmacéuticamente aceptables para formas de comprimidos pueden comprender ingredientes no tóxicos tales como diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico y similares.
En el caso de comprimidos para uso oral, los soportes que se utilizan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz, y comúnmente se añaden agentes lubricantes tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en forma de cápsulas, soportes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz. Ejemplos no limitativos adicionales de soportes y excipientes incluyen leche, azúcar, determinados tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, estearato de calcio, talco, grasas o aceites vegetales, gomas y glicoles.
Tensioactivos que pueden utilizarse para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a tensioactivos hidrofílicos, tensioactivos lipofílicos y mezclas de los mismos. Es decir, se puede emplear una mezcla de tensioactivos hidrofílicos, se puede emplear una mezcla de tensioactivos lipofílicos o se puede emplear una mezcla de al menos un tensioactivo hidrofílico y al menos un tensioactivo lipofílico.
Un tensioactivo hidrofílico adecuado puede tener generalmente un índice HLB de al menos 10, mientras que tensioactivos lipofílicos adecuados pueden tener generalmente un índice de HLB de o menos de aproximadamente 10. Un parámetro empírico utilizado para caracterizar la hidrofilicidad e hidrofobicidad relativas de compuestos anfifílicos no iónicos es el equilibrio hidrófilo-lipófilo (índice "HLB"). Tensioactivos con índices HLB más bajos son más lipofílicos o hidrofóbicos y tienen mayor solubilidad en aceites, mientras que los tensioactivos con índices HLB más altos son más hidrofílicos y tienen mayor solubilidad en soluciones acuosas. Generalmente se considera que los tensioactivos hidrofílicos son aquellos compuestos que tienen un índice HLB superior a aproximadamente 10, así como compuestos aniónicos, catiónicos o de iones híbridos para los cuales la escala h Lb no es generalmente aplicable. De manera similar, los tensioactivos lipofílicos (es decir, hidrofóbicos) son compuestos que tienen un índice HLB igual a o menor que aproximadamente 10. Sin embargo, el índice HLB de un tensioactivo es meramente una guía aproximada generalmente utilizada para permitir la formulación de emulsiones industriales, farmacéuticas y cosméticas.
Los tensioactivos hidrofílicos pueden ser iónicos o no iónicos. Tensioactivos iónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a sales de alquilamonio; sales de ácido fusídico; derivados de ácidos grasos de aminoácidos, oligopéptidos y polipéptidos; derivados de glicéridos de aminoácidos, oligopéptidos y polipéptidos; lecitinas y lecitinas hidrogenadas; lisolecitinas y lisolecitinas hidrogenadas; fosfolípidos y derivados de los mismos; lisofosfolípidos y derivados de los mismos; sales de ésteres de ácidos grasos de carnitina; sales de alquilsulfatos; sales de ácidos grasos; docusato de sodio; lactilatos de acilo; ésteres de ácido tartárico mono- y di-acetilados de mono- y di-glicéridos; mono- y di-glicéridos succinilados; ésteres de ácido cítrico de mono- y di-glicéridos; y mezclas de los mismos.
Dentro del grupo mencionado anteriormente, tensioactivos iónicos preferidos incluyen, a modo de ejemplo: lecitinas, lisolecitina, fosfolípidos, lisofosfolípidos y derivados de los mismos; sales de ésteres de ácidos grasos de carnitina; sales de alquilsulfatos; sales de ácidos grasos; docusato de sodio; lactilatos de acilo; ésteres de ácido tartárico mono- y diacetilados de mono- y di-glicéridos; mono- y di-glicéridos succinilados; ésteres de ácido cítrico de mono- y di-glicéridos; y mezclas de los mismos.
tensioactivos iónicos pueden ser las formas ionizadas de lecitina, lisolecitina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilserina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, ácido lisofosfatídico, lisofosfatidilserina, PEG-fosfatidiletanolamina, PVP-fosfatidiletanolamina, ésteres lactílicos de ácidos grasos, estearoil-2-lactilato, estearoil lactilato, monoglicéridos succinilados, ésteres de mono/diglicéridos de ácido tartárico mono/diacetilados, ésteres de ácido cítrico de mono/diglicéridos, colilsarcosina, caproato, caprilato, caprato, laurato, miristato, palmitato, oleato, ricinoleato, linoleato, linolenato, estearato, lauril sulfato, teracecil sulfato, docusato, lauroil carnitinas, palmitoil carnitinas, miristoil carnitinas y sales y mezclas de los mismos.
Tensioactivos no iónicos hidrofílicos pueden incluir, pero no se limitan a alquilglucósidos; alquilmaltósidos; alquiltioglucósidos; macrogolglicéridos de laurilo; éteres polioxialquileno de alquilo, tales como éteres de polietilenglicol de alquilo; polioxialquilen alquilfenoles, tales como polietilenglicol alquilfenoles; ésteres de ácidos grasos de polioxialquilen alquilfenol, tales como monoésteres de ácidos grasos de polietilenglicol y diésteres de ácidos grasos de polietilenglicol; ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol glicerol; ésteres de ácidos grasos de poliglicerol; ésteres de ácidos grasos de polioxialquilen sorbitán, tales como ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol sorbitán; productos de transesterificación hidrofílicos de un poliol con al menos un miembro del grupo que consiste en glicéridos, aceites vegetales, aceites vegetales hidrogenados, ácidos grasos y esteroles; polioxietilen esteroles, derivados y análogos de los mismos; vitaminas polioxietiladas y derivados de las mismas; copolímeros de bloques de polioxietileno-polioxipropileno; y mezclas de los mismos; ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol sorbitán y productos de transesterificación hidrofílicos de un poliol con al menos un miembro del grupo que consiste en triglicéridos, aceites vegetales y aceites vegetales hidrogenados. El poliol puede ser glicerol, etilenglicol, polietilenglicol, sorbitol, propilenglicol, pentaeritritol o un sacárido.
Otros tensioactivos hidrófilos no iónicos incluyen, sin limitación, laurato de PEG-10, laurato de PEG-12, laurato de PEG-20, laurato de PEG-32, dilaurato de PEG-32, oleato de PEG-12, oleato de PEG-15, oleato de PEG-20, dioleato de PEG-20, oleato de PEG-32, oleato de PEG-200, oleato de PEG-400, estearato de PEG-15, diestearato de PEG-32, estearato de PEG-40, estearato de PEG-100, dilaurato de PEG-20, trioleato de glicerilo PEG-25, dioleato de PEG-32, laurato de glicerilo PEG-20, laurato de glicerilo PEG-30, estearato de glicerilo PEG-20, oleato de glicerilo PEG-20, oleato de glicerilo PEG-30, laurato de glicerilo PEG-30, laurato de glicerilo PEG-40, aceite de almendra de palma PEG-40, aceite de ricino hidrogenado PEG-50, aceite de ricino PEG-40, aceite de ricino PEG-35, aceite de ricino PEG-60, aceite de ricino hidrogenado PEG-40, aceite de ricino hidrogenado PEG-60, maíz PEG-60 aceite, glicéridos de caprato/caprilato de PEG-6, glicéridos de caprato/caprilato de PEG-8, laurato de poligliceril-10, colesterol PEG-30, fitoesterol PEG-25, esterol de soja PEG-30, trioleato de PEG-20, oleato de sorbitán PEG-40, laurato de sorbitán PEG-80, polisorbato 20, polisorbato 80, p Oe -9 lauril éter, POE-23 lauril éter, POE-10 oleil éter, POE-20 oleil éter, POE-20 estearil éter, tocoferil PEG-100 succinato, PEG-24 colesterol, poliglicerilo-10 oleato, Tween 40, Tween 60, monoestearato de sacarosa, monolaurato de sacarosa, monopalmitato de sacarosa, serie PEG 10-100 nonil fenol, serie PEG 15-100 octil fenol y poloxámeros.
Tensioactivos lipofílicos adecuados incluyen, a modo de ejemplo, únicamente: alcoholes grasos; ésteres de ácidos grasos de glicerol; ésteres de ácidos grasos de glicerol acetilado; ésteres de ácidos grasos de alcohol inferior; ésteres de ácidos grasos de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos de sorbitán; ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol y sorbitán; esteroles y derivados de esteroles; esteroles polioxietilados y derivados de esteroles; éteres de alquilo de polietilenglicol; ésteres de azúcar; éteres de azúcar; derivados del ácido láctico de mono- y di-glicéridos; productos de transesterificación hidrofóbicbos de un poliol con al menos un miembro del grupo que consiste en glicéridos, aceites vegetales, aceites vegetales hidrogenados, ácidos grasos y esteroles; vitaminas/derivados vitamínicos solubles en aceite; y mezclas de los mismos. Dentro de este grupo, tensioactivos lipofílicos preferidos incluyen ésteres de ácidos grasos de glicerol, ésteres de ácidos grasos de propilenglicol y mezclas de los mismos, o son productos de transesterificación hidrofóbicos de un poliol con al menos un miembro del grupo que consiste en aceites vegetales, aceites vegetales hidrogenados y triglicéridos.
Los tensioactivos pueden utilizarse en cualquier formulación de la divulgación en donde su uso no se contradiga de otra manera. En algunas realizaciones de la divulgación, se prefiere el uso de no tensioactivos o clases limitadas de tensioactivos.
Otros vehículos acuosos adecuados incluyen, pero no se limitan a, solución de Ringer y cloruro de sodio isotónico. Las suspensiones acuosas pueden incluir agentes de suspensión, tales como derivados de celulosa, alginato de sodio, polivinil-pirrolidona y goma de tragacanto, y un agente humectante tal como lecitina. Conservantes adecuados para suspensiones acuosas incluyen p-hidroxibenzoato de metilo y n-propilo.
Agentes quelantes que se pueden utilizar para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), EDTA disódico, edetato cálcico disódico, EDTA trisódico, albúmina, transferrina, desferoxamina, desferal, desferoxamina. mesilato, EDTA tetrasódico y EDTA dipotásico, metasilicato de sodio o combinaciones de cualquiera de estos.
Conservantes que pueden utilizarse para formar composiciones y formas de dosificación farmacéuticas de la divulgación incluyen, pero no se limitan a purita, peróxidos, perboratos, imidazolidinilurea, diazolidinilurea, fenoxietanol, cloruros de alconio, incluidos cloruros de benzalconio, metilparabeno, etilparabeno y propilparabeno.
Agentes espesantes que pueden utilizarse para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, neopentanoato de isodecilo, escualeno, aceite mineral, benzoato C12-C15 y poliisobuteno hidrogenado. Son particularmente preferidos aquellos agentes que no alteren otros compuestos del producto final, tales como agentes espesantes no iónicos. La selección de agentes espesantes adicionales está dentro del conocimiento de un experto en la técnica.
Antioxidantes que pueden utilizarse para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a ésteres propílico, octílico y dodecílico de ácido gálico, hidroxianisol butilado (BHA, habitualmente adquirido como una mezcla de isómeros orto y meta), extracto de té verde, ácido úrico, cisteína, piruvato, ácido nordihidroguaiarético, ácido ascórbico, sales de ácido ascórbico, tales como palmitato de ascorbilo y ascorbato de sodio, ascorbil glucosamina, vitamina E (es decir, tocoferoles, tales como a-tocoferol), derivados de vitamina E (p. ej., acetato de tocoferilo), retinoides, tales como ácido retinoico, retinol, trans-retinol, cis-retinol, mezclas de trans-retinol y cisretinol, 3-deshidrorretinol y derivados de vitamina A (p. ej., acetato de retinol, retinal y palmitato de retinilo, también conocido como palmitato de tetinilo), citrato de sodio, sulfito de sodio, licopeno, antocianuros, bioflavinoides (p. ej., hesperitina, naringen, rutina y quercetina), superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, hidroxitolueno butilado (BHT), indol-3-carbinol, picnogenol, melatonina, sulforafano, pregnenolona, ácido lipoico y 4-hidroxi-5-metil-3[2H]-furanona. Cuando se formulan compuestos de la divulgación para administración oral, puede ser deseable utilizar formulaciones de retención gástrica para potenciar la absorción desde el tracto gastrointestinal (GI). Una formulación que se retiene en el estómago durante varias horas puede liberar compuestos de la divulgación lentamente y proporcionar una liberación sostenida que puede ser preferida en algunas realizaciones de la divulgación. La divulgación de este tipo de formulaciones gastro-retentivas se encuentra en Klausner, E.A.; Lavy, E.; Barta, M.; Cserepes, E.; Friedman, M.; Hoffman, A. 2003 "Novel gastroretentive dosage forms: evaluation of gastroretentivity and its effect on levodopa in humans.» Pharm. Res. 20, 1466­ 73, Hoffman, A.;Stepensky, D.; Lavy, E.; Eyal, S. Klausner, E.; Friedman, M. 2004 "Pharmacokinetic and pharmacodynamic aspects of gastroretentive dosage forms" Int. J. Pharm. 11, 141-53, Streubel, A.; Siepmann, J.; Bodmeier, R.; 2006 "Gastroretentive drug delivery systems" Expert Opin. Drug Deliver. 3, 217-3, y Chavanpatil, M.D.; Jain, P.; Chaudhari, S.; Shear, R.; Vavia, P.R. "Novel sustained release, swellable and bioadhesive gastroretentive drug delivery system for olfoxacin" Int. J. Pharm. 2006 epub Marzo 24. Pueden utilizarse técnicas expandibles, flotantes y bioadhesivas para maximizar la absorción de los compuestos de la divulgación.
La administración intranasal puede utilizar una suspensión en aerosol de partículas respirables formadas por los compuestos de la divulgación que el sujeto inhala. El compuesto de la divulgación se absorbe en el torrente sanguíneo mediante absorción pulmonar o se pone en contacto con los tejidos lagrimales a través de los conductos nasolagrimales y, posteriormente, se suministra a los tejidos retinianos en una cantidad farmacéuticamente eficaz. Las partículas respirables pueden ser sólidas o líquidas, con partículas de tamaño adecuado, como se conoce en la técnica que es eficaz para la absorción. Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados tal como se describe arriba. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes de preferencia farmacéuticamente aceptables se pueden nebulizar mediante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas se pueden inhalar directamente desde el dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador se puede conectar a una carpa de mascarilla facial o una máquina respiradora de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo se pueden administrar, preferiblemente por vía oral o nasal, desde dispositivos que administran la formulación de una manera apropiada.
Para la administración transdérmica, se puede utilizar cualquier formulación adecuada conocida en la técnica, ya sea como solución, gota, suspensión, gel, polvo, crema, aceite, sólidos, soluciones basadas en dimetilsulfóxido (DMSO) o formulación liposomal para uso en un parche u otro sistema de suministro conocido en la técnica. Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender soportes o excipientes sólidos o en fase gel adecuados, que son compuestos que permiten una penetración incrementada de, o ayudan en el suministro de moléculas terapéuticas a través de la barrera de permeabilidad del estrato córneo de la piel. Hay muchas de estas moléculas potenciadoras de la penetración conocidas por personas entrenadas en la técnica de la formulación tópica. Ejemplos de soportes y excipientes de este tipo incluyen, pero no se limitan a humectantes (p. ej., urea), glicoles (p. ej., propilenglicol), alcoholes (p. ej., etanol), ácidos grasos (p. ej., ácido oleico), tensioactivos (p. ej.,miristato de isopropilo y lauril-sulfato de sodio), pirrolidonas, monolaurato de glicerol, sulfóxidos, terpenos (p. ej., mentol), aminas, amidas, alcanos, alcanoles, agua, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, tales como polietilenglicoles. La construcción y el uso de parches transdérmicos para el suministro de agentes farmacéuticos son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. N°s 5.023.252, 4.992.445 y 5.001.139. Parches de este tipo se pueden construir para la administración continua, pulsátil o bajo demanda de agentes farmacéuticos.
Para la administración tópica, todas las formulaciones para la administración ocular tópica utilizadas en el campo de la oftalmología (p. ej., colirios, insertos, paquetes oculares, lentes de contacto impregnadas, sistemas de suministro por bombeo, suspensiones de soluciones a base de dimetilsulfóxido (DMSO), liposomas y pomadas para los ojos) y todas las formulaciones para uso externo en los campos de la dermatología y otorrinolaringología (p. ej., ungüento, crema, gel, polvo, ungüento, loción, formas cristalinas, espuma y spray) se pueden utilizar como se conoce en la técnica. En algunas realizaciones, la extraordinaria solubilidad de algunos de los antagonistas de LFA-1 de la divulgación permiten formulaciones en solución concentrada que luego pueden suministrar dosis terapéuticamente relevantes a regiones del ojo. Además, se pueden utilizar todas las formulaciones adecuadas para la administración tópica a la piel y las membranas mucosas de los conductos nasales para administrar los compuestos de la divulgación. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden ser una formulación liposomal para administración tópica u oral, cualquiera de las cuales se conocen en la técnica por ser adecuadas para el propósito de esta divulgación.
Lubricantes que pueden utilizarse para formar composiciones farmacéuticas y formas de dosificación de la divulgación incluyen, pero no se limitan a estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerol, sorbitol, manitol, polietilenglicol, otros glicoles, ácido esteárico, lauril-sulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (p. ej., aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja), estearato de zinc, oleato de etilo, laureato de etilo, agar o mezclas de los mismos. Lubricantes adicionales incluyen, por ejemplo, un gel de sílice siloide, un aerosol coagulado de sílice sintética o mezclas de los mismos. Opcionalmente, se puede añadir un lubricante, en una cantidad inferior a aproximadamente 1 por ciento en peso de la composición farmacéutica.
Agentes protectores de la piel son agentes que protegen la piel contra irritantes químicos y/o irritantes físicos, p. ej., luz UV, incluidos filtros solares, aditivos anti-acné, agentes anti-arrugas y anti-atrofia de la piel. Filtros solares adecuados como agentes protectores de la piel incluyen p-metoxicinnamato de 2-etilhexilo, N,N-dimetil-p-aminobenzoato de 2-etilhexilo, ácido p-aminobenzoico, ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico, octocrileno, oxibenzona, salicilato de homomentilo, salicilato de octilo, 4,4'-metoxi-t-butildibenzoilmetano, 4-isopropil-dibenzoilmetano, 3-bencilideno alcanfor, 3-(4-metilbencilideno) alcanfor, antanilatos, dióxido de titanio ultrafino, óxido de zinc, óxido de hierro, sílice, éster de 2,4-dihidroxibenzofenona del ácido 4-N,N-(2-etilhexil)metilaminobenzoico, éster del ácido 4-N,N-(2-etilhexil)-metilaminobenzoico con 4-hidroxidibenzoilmetano, ester de 2-hidroxi-4-(2-hidroxietoxi)benzofenona del ácido 4-N,N-(2-etilhexil)-metilaminobenzoico y éster de 4-(2-hidroxietoxi)dibenzoilmetano del ácido 4-N,N(2-etilhexil)-metilaminobenzoico. Agentes anti-acné adecuados incluyen ácido salicílico; ácido 5-octanoil salicílico; resorcinol; retinoides, tales como ácido retinoico y sus derivados; aminoácidos D y L que contienen azufre distintos de cisteína; ácido lipoico; antibióticos y antimicrobianos, tales como peróxido de benzoílo, octopirox, tetraciclina, 2,4,4'-tricloro-2'-hidroxidifenil éter, 3,4,4'-triclorobanilida, ácido azelaico, fenoxietanol, fenoxipropanol, fenoxisopropanol, acetato de etilo, clindamicina y melclociclina; flavonoides; y sales biliares, tales como sulfato de escimnol, desoxicolato y colato. Ejemplos de agentes anti-arrugas y anti-atrofia de la piel son el ácido retinoico y sus derivados, retinol, ésteres de retinilo, ácido salicílico y sus derivados, aminoácidos D y L que contienen azufre, excepto cisteína, alfa-hidroxiácidos (p. ej., ácido glicólico y ácido láctico), ácido fítico, ácido lipoico y ácido lisofosfatídico.
Las formulaciones también pueden contener aditivos que mitigan la irritación para minimizar o eliminar la posibilidad de irritación de la piel o daño de la piel resultante de los otros componentes de la composición. Aditivos mitigadores de la irritación adecuados incluyen, por ejemplo: -tocoferol; inhibidores de monoamina oxidasa, particularmente alcoholes fenílicos, tales como 2-fenil-1-etanol; glicerol; ácidos salicílicos y salicilatos; ácidos ascórbicos y ascorbatos; ionóforos, tales como monensina; aminas anfifílicas; cloruro amónico; N-acetilcisteína; ácido cis-urocánico; capsaicina; y cloroquina. El aditivo mitigante de irritantes, si está presente, puede incorporarse a las presentes formulaciones a una concentración eficaz para mitigar la irritación o el daño de la piel, que representa típicamente no más de aproximadamente 20% en peso, más típicamente no más de aproximadamente 5% en peso,.de la composición.
Un modificador de sensación seca es un agente que cuando se añade a una emulsión, imparte una "sensación seca" a la piel cuando la emulsión se seca. Modificadores de tacto seco pueden incluir talco, caolín, greda, óxido de zinc, fluidos de silicona, sales inorgánicas, tales como sulfato de bario, sílice tratada en superficie, sílice precipitada, sílice ahumada, tal como un Aerosil disponible de Degussa Inc. de Nueva York, N-Y. U.S.A. Otro modificador de tacto seco es un almidón de glicerilo reticulado con epiclorhidrina del tipo que se describe en la Pat. de EE.UU. N° 6.488.916.
También pueden añadirse otros agentes, tales como agentes antimicrobianos, para evitar el deterioro durante el almacenamiento, es decir, para inhibir el crecimiento de microbios tales como levaduras y mohos. Agentes antimicrobianos adecuados se seleccionan típicamente del grupo que consiste en los ésteres metílico y propílico del ácido p-hidroxibenzoico (es decir, metil y propil parabeno), benzoato de sodio, ácido sórbico, imidurea, purita, peróxidos, perboratos y combinaciones de los mismos.
La formulación también puede contener un agente estético. Ejemplos de agentes estéticos incluyen fragancias, pigmentos, colorantes, aceites esenciales, sensaciones cutáneas y astringentes. Agentes estéticos adecuados incluyen aceite de clavo, mentol, alcanfor, aceite de eucalipto, eugenol, lactato de metilo, bisabolol, destilado de hamamelis (preferido) y extracto de té verde (preferido).
Las fragancias son sustancias aromáticas que pueden impartir un aroma estéticamente agradable a la composición de protección solar. Fragancias típicas incluyen materiales aromáticos extraídos de fuentes botánicas (es decir, pétalos de rosa, flores de gardenia, flores de jazmín, etc.) que pueden utilizarse solos o en cualquier combinación para crear aceites esenciales. Alternativamente, se pueden preparar extractos alcohólicos para componer fragancias. Sin embargo, debido a los costos relativamente elevados de obtener fragancias a partir de sustancias naturales, la tendencia moderna es utilizar fragancias preparadas sintéticamente, particularmente en productos de gran volumen. Se pueden incluir opcionalmente una o más fragancias en la composición de filtro solar en una cantidad que varía de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 5 por ciento en peso, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,5 por ciento en peso. También pueden utilizarse conservantes adicionales, si se desea, e incluyen composiciones conservantes bien conocidas, tales como alcohol bencílico, alcohol feniletílico y ácido benzoico, diazolidinilo, urea, clorfenesina, yodopropinilo y carbamato de butilo, entre otros.
Adicionalmente, se prevé que los compuestos de la divulgación se puedan fijar de forma liberable a polímeros biocompatibles para uso en formulaciones de liberación sostenida sobre, en o fijados a insertos para administración tópica, intraocular, periocular o sistémica. La liberación controlada de un polímero biocompatible también se puede utilizar con un polímero hidrosoluble para formar una formulación instilable. La liberación controlada de un polímero biocompatible, tal como, por ejemplo, microesferas, micropartículas o nanopartículas de PLGA, se puede utilizar en una formulación adecuada para implantación intraocular o inyección para la administración de liberación sostenida, así como se puede utilizar cualquier polímero o matriz biodegradable y biocompatible adecuado.
Los colirios se pueden preparar disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa estéril tal como solución salina fisiológica, solución tampón, etc., o combinando composiciones en polvo a disolver antes de su uso. Se pueden elegir otros vehículos, tal como se conoce en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a: solución salina de equilibrio, solución salina, poliéteres hidrosolubles, tales como polietilenglicol, polivinilos, tales como poli(alcohol vinílico) y povidona, derivados de celulosa, tales como metilcelulosa e hidroxipropil metilcelulosa, derivados del petróleo, tales como aceite mineral y vaselina blanca, grasas animales, tales como lanolina, polímeros de ácido acrílico tal como gel de carboxipolimetileno, grasas vegetales tal como aceite de cacahuete y polisacáridos, tales como dextranos, y glicosaminoglicanos tal como hialuronato de sodio. Si se desea, se pueden añadir los aditivos que se utilizan normalmente en los colirios. Aditivos de este tipo incluyen agentes isotonizantes (p. ej., cloruro de sodio, etc.), agente tampón (p. ej., ácido bórico, monohidrógeno-fosfato de sodio, dihidrógeno-fosfato de sodio, etc.), conservantes (p. ej., cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, etc.), espesantes (p. ej., sacárido tal como lactosa, manitol, maltosa, etc.; p. ej., ácido hialurónico o su sal, tal como hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, etc.; p. ej., mucopolisacárido, tal como sulfato de condroitina, etc ; p. ej., poliacrilato de sodio, polímero de carboxivinilo, poliacrilato reticulado, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica).
La solubilidad de los componentes de las presentes composiciones puede potenciarse mediante un tensioactivo u otro co-disolvente apropiado en la composición. Co-disolventes de este tipo incluyen polisorbato 20, 60 y 80, Pluronic F68, F-84 y P-103, ciclodextrina u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. Co-disolventes de este tipo se pueden emplear a un nivel de aproximadamente 0,01% a 2% en peso.
La composición de la divulgación se puede formular como un tipo de dosis unitaria estéril que no contiene conservantes.
Las composiciones de la divulgación pueden envasarse en forma multidosis. Se pueden preferir conservantes para evitar la contaminación microbiana durante el uso. Conservantes adecuados incluyen: cloruro de benzalconio, timerosal, clorobutanol, metil parabeno, propil parabeno, alcohol feniletílico, edetato disódico, ácido sórbico, perborato sódico, Onamer M u otros agentes conocidos por los expertos en la técnica. En los productos oftálmicos de la técnica anterior conservantes de este tipo se pueden emplearse a un nivel de 0,004% a 0,02%. En las composiciones de la presente solicitud, el conservante, preferiblemente cloruro de benzalconio, se puede emplear a un nivel de 0,001% a menos de 0,01%, p. ej., de 0,001% a 0,008%, de preferencia aproximadamente 0,005% en peso. Se ha descubierto que una concentración de cloruro de benzalconio de 0,005% puede ser suficiente para preservar las composiciones de la presente divulgación frente al ataque microbiano.
La cantidad de administración y el número de administraciones del ingrediente activo utilizado en la presente divulgación varían de acuerdo con el sexo, la edad y el peso corporal del sujeto, los síntomas a tratar, los efectos terapéuticos deseables, las vías de administración y el período de tratamiento. Para los colirios para un adulto, las formulaciones que contienen los compuestos de la divulgación pueden variar en concentración desde aproximadamente de aproximadamente 0,0001 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,005 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,01 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,05 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,1 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,5 a 10,0% P/V, aproximadamente 1,0 a 10,0% P/V, aproximadamente 20 a 10,0% P/V, aproximadamente 3,0 a 10,0% P/V, aproximadamente 4,0 a 10,0% P/V o aproximadamente 5,0 a 10,0% P/Va. Una realización de la divulgación tiene una formulación de aproximadamente 1,0 a 10,0% P/V de los compuestos de la divulgación. Una realización de la divulgación tiene una formulación de aproximadamente 0,01 a 10,0% P/V de los compuestos de la divulgación. Una realización de la divulgación tiene una formulación de aproximadamente 5,0 a 10,0% P/V de los compuestos de la divulgación. La administración se puede administrar varias veces al día por ojo, preferiblemente de una a diez veces, más preferiblemente de una a cuatro veces, lo más preferiblemente una vez al día. El tamaño de la gota administrada puede estar en el intervalo de aproximadamente 10-100 pl, aproximadamente 10-90 pl, aproximadamente 10-80 pl, aproximadamente 10­
70 pl, aproximadamente 10-60 pl, aproximadamente 10-50 pl, aproximadamente 10-40 pl, aproximadamente 10-30 pl, aproximadamente 20-100 pl, aproximadamente 20-90 pl, aproximadamente 20-80 pl, aproximadamente 20-70 pl, aproximadamente20-60 pl, aproximadamente 20-50 pl, aproximadamente 20-40 pl o aproximadamentet 20-30 pl. Una realización de la divulgación administra una gota en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 pl. Una realización de la divulgación administra una gota en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 pl. Una realización de la divulgación administra una gota en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 pl. Una realización de la divulgación administra una gota en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 pl. Una realización de la divulgación administra una gota en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 pl.
Las formulaciones de la divulgación se pueden administrar varias gotas por vez, de una a cuatro gotas, preferiblemente de una a tres gotas, más preferiblemente de una a dos gotas y lo más preferiblemente de una gota al día. En una realización, las formulaciones de la divulgación se administran aproximadamente una gota por vez y una vez al día.
En formulaciones para ungüento, crema, loción,o spray, la concentración de los compuestos de la divulgación en la formulación pueden variar de aproximadamente 0,0001 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,005 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,01 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,05 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,1 a 10,0% P/V, aproximadamente 0,5 a 10,0% P/V, aproximadamente 1,0 a 10,0% P/V, aproximadamente 20 a 10,0% P/V, aproximadamente 3,0 a 10,0% P/V, aproximadamente 4,0 a 10,0% P/V o aproximadamente 5,0 a 10,0% P/Va. Una realización de la divulgación tiene una formulación de aproximadamente 1,0 a 10,0% P/V de los compuestos de la divulgación. Una realización de la divulgación tiene una formulación de aproximadamente 0,01 a 10,0% P/V de los compuestos de la divulgación. Una realización de la divulgación tiene una formulación de aproximadamente 5,0 a 10,0%
P/V de los compuestos de la divulgación. Estas formulaciones se pueden aplicar o pulverizar varias veces al día, preferiblemente de una a seis veces, más preferiblemente de una a cuatro veces y lo más preferiblemente una vez al día.
La relación de composición de cada uno de los ingredientes puede aumentarse o disminuirse adecuadamente en función del grado de las inflamaciones o infecciones.
Las formulaciones de la divulgación pueden incluir, además, otros ingredientes activos farmacológicos siempre que no contradigan el propósito de la presente divulgación. En una combinación de varios ingredientes activos, sus respectivos contenidos pueden aumentarse o disminuirse de manera adecuada en consideración de sus efectos y seguridad.
V. Kits
La divulgación también proporciona kits. Los kits incluyen un compuesto de la divulgación en un envase adecuado y material escrito que puede incluir instrucciones de uso, discusión de estudios clínicos, lista de efectos secundarios y similares. El kit puede contener, además, otro agente terapéutico que se co-administra con el antagonista de LFA-1 de la divulgación. En algunas realizaciones, el agente terapéutico y el antagonista de LFA-1 de la divulgación se proporcionan en forma de composiciones separadas en recipientes separados dentro del kit. En algunas realizaciones, el agente terapéutico y el antagonista de LFA-1 de la divulgación se proporcionan en forma de una composición única dentro de un recipiente en el kit. Se conocen en la técnica envases adecuados y artículos adicionales para uso (p. ej., copa medidora para preparaciones líquidas, envoltura de papel de aluminio para minimizar la exposición al aire, dispensadores y similares) y se pueden incluir en el kit.
VI. Ejemplos.
Los compuestos de los ejemplos que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas son ejemplos de referencia.
Ejemplo 1: Mediciones de Afinidad.
Las afinidades de las moléculas pequeñas por LFA-1 se midieron utilizando polarización de fluorescencia (FP) en un formato competitivo con un antagonista de molécula pequeña, el compuesto 1 (Figura 2) tal como se describió previamente. Todas las mediciones se realizaron en tampón que contenía Hepes 50 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, noctiglucósido al 0,05% y gamma globulinas bovinas (BGG) al 0,05% y MnCh 1 mM o CaCl2 1 mM y MgCh 1 mM. La afinidad del compuesto 1 para LFA-1 se midió primero mediante la adición de compuesto 12 nM a diluciones en serie de LFA-1 a partir de 1 |jM en tampón que contiene MnCh o CaCl2 y MgCh. Los experimentos de competición se realizaron mediante la adición de diluciones en serie de antagonistas a compuesto 12 nM (utilizando LFA-1 3 nM (en MnCh) o LFA-1 40 nM (en CaCl2 y MgCh)). En los experimentos de competición de ICAM-1-Ig, las concentraciones de LFA-1 se redujeron a LFA-1 2 y 20 nM en las dos condiciones de tampón de cationes divalentes para maximizar la inhibición por ICAM-1-Ig. Las diferentes concentraciones de LFA-1 utilizadas en los experimentos se tuvieron en cuenta en los cálculos de afinidad (véase más adelante). Las soluciones se incubaron en placas de 96 pocillos negras HE96 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) durante 2 horas a 37°C. Las mediciones de Polarización de Fluorescencia (FP) se realizaron en un lector de placas Analyst (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) utilizando excitación de 485 nm, emisión de 530 nm y filtros dicroicos de 505 nm. Todos los datos de intensidad brutos se corrigieron para las emisiones de fondo mediante la resta de las intensidades medidas de las muestras apropiadas sin el compuesto 1. Los datos de unión de LFA-1 y de competencia de antagonistas se analizaron utilizando un ajuste no lineal de mínimos cuadrados de una ecuación de cuatro parámetros con el software KaleidaGraph (Synergy SoftWare, Reading, PA) para obtener los valores de CE50 para la titulación de LFA-1 y los valores de IC50 de los antagonistas. La ecuación utilizada para ajustar los datos es Y = ((A-D)/(1+(X/C)AB))+ D, en que Y es la respuesta del ensayo, A es el valor de Y en la asíntota superior, B es la factor de pendiente, C es la CI50 o CE50 y D es Y - el valor en la asíntota inferior. En general, los datos medidos tanto en el formato FP homogéneo como en el formato ELISA heterogéneo que se describen más adelante, contienen relaciones de señal de fondo relativamente grandes y las estimaciones de error en los ajustes son típicamente menos del 10% del valor final del parámetro ajustado. Las constantes de disociación en equilibrio (Kd) de LFA-1 para el compuesto 1 con y sin A-286982 se calcularon utilizando análisis de Klotz y Hill. Las afinidades (Ki) de los antagonistas para LFA-1 se calcularon utilizando los valores de CI50 , las Kd del compuesto 1/LFA-1,y las concentraciones de compuesto 1 y LFA-1 en los experimentos de competición.
Ejemplo 2: Ensayos por Inmunoabsorción ligado a enzimas de LFA-1/ICAM-1 y LFA-1/molécula pequeña (ELISAs).
(A) Competencia de Antagonistas: Moléculas pequeñas y sICAM-1 se sometieron a ensayo para determinar la capacidad de interrumpir la unión de ICAM-1-Ig o un antagonista de molécula pequeña marcado con fluoresceína, compuesto 2B, a LFA-1 en un formato competitivo. El compuesto 2B es similar al compuesto 1, pero con un enlazador más largo entre la molécula pequeña y la fluoresceína para maximizar la unión del anticuerpo de detección anti-fluoresceína. Se recubrieron placas de 96 pocillos con 5 jg/m l (33,3 nM) de integrina p2 anti-humana de ratón (un anticuerpo bloqueante sin función) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con tampón de ensayo (Hepes 20 mM, pH 7,2, NaCl 140 mM, MnCh 1 mM, albúmina de suero bovino (BSA) al 0,5% y Tween-20 al 0,05%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar en tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, se añadieron NaCl 100 mM, MnCb 1 mM y Tween-20 al 0,05%), LFA-1 8 nM (ELISA LFA-1/ICAM-1) o de LFA -12 nM (ELISA de LFA-1/molécula pequeña), seguido de incubación durante 1 h a 37 °C. Las placas se lavaron y para el ELISA de LFA-1/ICAM-1, se añadieron diluciones en serie de los antagonistas de molécula pequeña o sICAM-1 a las placas durante 30 minutos, seguido de la adición de ICAM-1-Ig 0,89 nM (final concentración) durante 2 horas a 37 °C. Después de un lavado adicional, se añadió HRP (Fc específico) anti-huIgG de cabra y se incubó durante una hora a 37 °C. En el ELISA de LFA-1/molécula pequeña, los antagonistas diluidos y compuesto 2B 25 nM se añadieron simultáneamente a las placas, seguido de una incubación durante 2 horas a 37 °C. HRP anti-fluoresceína de oveja se añadió después de un lavado y se incubó durante una hora a 37 °C. Para ambos ensayos, después del lavado, los anticuerpos conjugados con HRP unidos se detectaron mediante la adición de tetrametilbencidina (TMB), seguido de la medición de la absorbancia del producto a 450 nm después de la adición de H3 PO4 1 M para detener la reacción. Los valores de CI50 para cada una de las curvas se determinaron ajustando la ecuación de cuatro parámetros descrita anteriormente utilizando el software KaleidaGraph. (B) Unión de ligando: Los ELISAs de LFA-1/ICAM-1 y de LFA-1/molécula pequeña se realizaron como se describió arriba, excepto que se añadieron diluciones en serie de ICAM-1-Ig o compuesto 2B a las placas en presencia o ausencia de antagonista. En todos los casos, el ligando se añadió al mismo tiempo que el antagonista. Las placas se incubaron durante 6 h a 37 °C para acercarse a las condiciones de equilibrio después de la adición de antagonista y ligando, antes del lavado y la adición del anticuerpo de detección. Los valores de CE50 para cada una de las curvas se determinaron ajustando con un modelo de cuatro parámetros tal como se describió arriba. Los valores de CE50 generados en presencia y ausencia de antagonista se analizaron mediante regresión de Schild. Las gráficas de Schild de Log (Relación conc. -1)frente a antagonista de concentración se calculan a partir de, (Relación conc.-1.) = ((Ligando CE50 con antagonista)/(ligando CE50 sin antagonista)) -1. Las pendientes de las gráficas del Log (Relación de conc. -1) frente a la concentración de antagonista se calculan ajustando la línea a la ecuación lineal, Y = A BX.
Ejemplo 3: Reticulación de un Análogo Fotoactivable y Radiomarcado de Compuesto 3 a LFA-1.
LFA-1 o BSA (0,35 mg/mL [1,4 y 5,3 M, respectivamente] asociada a la membrana humana de longitud completa en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl25 mM, MgCb 5 mM, MnCb1 mM y n-octilglucósido al 1 %, pH 7,2) se incubó durante la noche a 37 °C con compuesto 54,1 |j M, un análogo fotoactivable marcado con tritio del compuesto 3, en presencia o ausencia de compuesto 3290 j M. La relación molar del compuesto 5 a LFA-1 fue de 3:1. Para la incubación se utilizó una placa de 96 pocillos recubierta previamente con BSA al 1%. Justo antes de la reticulación, el exceso de compuesto 5 se searó rápidamente mediante filtración en gel con una columna microspin G-25 en un formato de 96 pocillos equilibrado con el mismo tampón. El complejo LFA-1/compuesto 5 se reticuló mediante exposición a una lámpara de vapor de mercurio a alta presión (450 vatios, vidrio Ace, Vineland, Nueva Jersey). Durante la irradiación, las muestras se enfriaron en hielo y se protegieron con una placa de vidrio de borosilicato de 5 mm de espesor para minimizar la degradación de las proteínas. El compuesto 5 residual no enlazado se separó mediante filtración en gel (G-25) como antes. A continuación, el complejo reticulado se desnaturalizó en hidrocloruro de guanidina 8 M (GuHCl) y se redujo y alquiló. Las proteínas tratadas se sometieron a SDS-PAGE seguido de tinción con azul de Coomassie. Las proteínas radiomarcadas se visualizaron mediante audiorradiografía.
Para identificar los sitios de unión del compuesto 5, las subunidades aL y (32 tratadas se separaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño en presencia de GuHCl 6 M, Hepes 20 mM, EDTA 10 mM, pH 6,8 y luego se escindieron químicamente con hidroxilamina 2,6 M en ácido acético al 10%. ácido con GuHCl 7 M durante 4 h a 75 °C. Los fragmentos de proteína radiomarcados se separaron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autorradiografía o se transfirieron a una membrana de ' poli(fluoruro de vinilideno), se tiñeron con azul de Coomassie y luego se identificaron mediante secuenciación de proteínas N-terminal.
Ejemplo 4: Generación de la Construcción aL que Carece del dom inio I.
La construcción utilizada, pLFA.huID.Ap, contiene la secuencia del gen aL desde el sitio de restricción Nar1 5' del dominio I hasta el segundo sitio de restricción PflM1 3' del dominio I en el que se abolió el primer sitio de restricción PflM1 3' del dominio I (Edwards et al. 1995). Con el fin de generar el mutante que carece del dominio I, se fabricaron los siguientes cebadores: el cebador directo CACTGTGGCGCCCTGGTTTTCAGGAAGGTAGTGGATCAGGCACAAGCAAACAGGACCTGACTTC (SEQ ID NO 3), que contiene la secuencia desde el sitio Nar1 hasta el inicio del dominio I, una secuencia de ADN que codifica GSGSG ( SEQ ID NO 3) y las 23 pb de la secuencia aL después del final del dominio I, y el cebador inverso TCTGAGCCATGTGCTGGTATCGAGGGGC (SEQ ID NO 5), que ceba en el segundo sitio de restricción PflM1 después del dominio I. La PCR se realizó utilizando estos cebadores y el pLFA.huID.Ap linearizado con Bgl II, que corta en un sitio dentro del dominio I. Se amplificó un fragmento de ADN que contenía la secuencia desde el sitio Nar 1 hasta el segundo sitio PflM1 y en el que todo el dominio I, desde C125 hasta G311, se reemplazó por una secuencia de ADN que codifica GSGSG. Este trozo de ADN se purificó, se digirió con Nar1 y PflM1 y se insertó en el plásmido aL humano (pRKLFAam) en los sitios Nar1 y PflM1 correspondientes. La inserción correcta de la secuencia de ADN que codifica GSGSG se confirmó mediante análisis de la secuencia.
Ejemplo 5: Unión de LFA-1 que Carece del dom inio I a ICAM-1 o al Compuesto 2B.
Se transfectaron células 293 con la construcción p2 sola (simulacro) o con la construcción aL de tipo salvaje (wt) o la construcción aL que carecía del dominio I (sin I) y se dejó que se recuperaran durante 3 días. Las células se separaron y se resuspendieron en tampón de adhesión (HEPES 0,02 M, pH 7,2, NaCl 0,14 M, glucosa al 0,2%). La unión a ICAM-1-Ig unida a placa se realizó tal como se describe (Edwards et al. 1998). Para la unión de compuesto 2B, se añadieron 2 x 105 células por pocillo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos en tampón de adhesión que contenía BGG al 0,5%, MnCl2 0,1 mM, 1 □g/ml de anticuerpo MEM-48 activante anti-p2 y 1 |jM de compuesto 2B. Las células se incubaron durante 1 hora a 37°C, se lavaron con PBS frío y se fijaron con formaldehído al 1%/PBS. A continuación, las células se incubaron con una dilución 1:500 de HRP anti-fluoresceína de oveja durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron con PBS y se incubaron con TMB durante 15 minutos. La reacción se detuvo con H3 PO4 1M y se leyó a 450 nm. En paralelo, los transfectantes se testaron para determinar la integridad estructural de los complejos aL/p2 expresados en la superficie y la presencia o ausencia del dominio I mediante análisis FACS utilizando un panel de anticuerpos con epítopos de unión conocidos.
Ejemplo 6: Modelo de Retinopatía Diabética en Ratas Inducida por Estreptozotocina.
Se inyecta por vía intraperitoneal a 15 ratas de laboratorio adultas (Sprague-Dawley) el día 1 estrepozocina (SZT), 65 mg/kg, para volverlas hiperglucémicas e inducir la diabetes. Se tratan 5 ratas adicionales con un volumen similar de solución salina, para crear un grupo de control no diabético. A partir de entonces, diariamente durante un total de 6 días, 8 de las ratas diabéticas reciben una instilación de un antagonista de LFA-1 en un vehículo portador adecuado en cada ojo. 7 de los animales diabéticos reciben instilaciones similares del mismo volumen de vehículo portador solo, de acuerdo con el mismo programa de dosificación. Los animales del grupo de control no diabético reciben instilaciones de vehículo portador solo y permanecen siendo normogilcémicos.
El día 14 se examinan los ojos de todos los animales mediante angiografía con fluoresceína. A continuación, se sacrifican todos los animales de los tres grupos, se extirpan quirúrgicamente los ojos y se aísla el tejido de la retina. El tejido de la retina se examina mediante micropictografía. El grado en el que se desarrollan anomalías de la microvasculatura en el tejido corneal del control diabético, su inhibición mediante la administración de antagonista LFA-1 en el grupo de tratamiento diabético y la comparación con el grupo control normoglémico se cuantifican mediante análisis morfométrico estandarizado de las fotomicrografías.
Ejemplo 7: Ensayo de Adhesión de Células T Humanas.
El ensayo de adhesión de células T se realizó utilizando la línea de células linfoides T humanas HuT 78 (ATCC TIB-161). Se diluyó anti-HuIgG(Fc) de cabra a 2 jg/ml en PBS y placas de 96 pocillos se recubrieron con 50 jl/pocillo a 37°C durante 1 h. Las placas se lavaron con PBS y se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con BSA al 1% en PBS. Se diluyó ICAM-Ig del dominio 5 a 100 ng/ml en PBS y se añadieron 50 jl/pocillo a las placas O/N a 4°C. Células HuT 78 se centrifugaron a 100 g y el sedimento celular se trató con EDTA 5 mM durante ~ 5' a 37°C en una incubadora a 5% de CO2. Las células se lavaron en NaCl 0,14 M, Hepes 0,02 M, glucosa al 0,2% y MnCh 0,1 mM (tampón de ensayo) y se centrifugaron. Las células se resuspendieron en tampón de ensayo a razón de 3.0X106 c/ml. Los inhibidores se diluyeron en tampón de ensayo hasta una concentración final 2X y se pre-incubaron con células HuT78 durante 30' a temperatura ambiente. Se añadieron 100 jl/pocillo de células e inhibidores a las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Se añadieron 100 jl/pocillo de PBS y las placas se sellaron y se centrifugaron invertidas a 100 g durante 5'. Las células no fijadas se retiraron de la placa y el exceso de PBS se secó sobre una toalla de papel. Se añadieron a la placa 60 jl/pocillo de p-nitrofenil n-acetil-p-D-glucosaminida (0,257 g a 100 ml de tampón citrato) y se incubó durante 1,5 h a 37°C. La reacción enzimática se detuvo con 90 jl/pocillo de glicina 50 mM/EDTA 5 mM y se leyó en un lector de placas a 405 nM. Se midió la adhesión de las células HUT78 a 5dICAM-Ig utilizando el método de p-nitrofenil n-acetil-p-D-glucosaminida de Landegren, U. (1984). J. Immunol. Methods 57, 379-388. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados de ensayos de adhesión y resultados de solubilidad para antagonistas de LFA-1 directamente competitivos seleccionados de la invención.
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La escala de la tabla representa los valores CE5ode la siguiente manera: * representa 3 |jM o menos, ** representa 300 nM o menos, *** representa 100 nM o menos, y **** representa 50 nM o menos.
La escala en la tabla representa los valores de Solubilidad de la siguiente manera: representa más de 10 mg/mL, + representa más de 50 mg/mL y ++ representa más de 100 mg/mL.
Ejemplo 8: Inhibición In-Vitro de la Liberación Estimulada por Antígenos de Citoquinas a partir de Monocitos de la Sangre Periférica Humana (PBMC).
Se evaluó un antagonista de LFA-1 directamente competitivo de la invención en cuanto a su capacidad para inhibir la liberación de citoquinas inflamatorias, en mononucleocitos humanos (PBMC) estimulados con enterotoxina B estafilocócica (SEB). Se prepararon soluciones madre de antagonista, Rebamipida (un agente protector de las mucosas) y Ciclosporina A (CsA) en medio de cultivo y se prepararon diluciones mediante la adición de medio de cultivo para lograr la concentración deseada. Se prepararon controles negativos sin estimulación con SEB. La estimulación con SEB con vehículo (DMSO al 0,25%/medio) se utilizó como control positivo.
Se descongelaron PBMC humanos, congelados en medio de crioconservación, se lavaron con medio de cultivo RPMI que contenía FBS al 10% en medio de crecimiento y se sembraron en una placa de 96 pocillos a razón de 20.000 células/pocillo que contenía 180 |jl de medio de cultivo. Las células se incubaron en presencia de antagonista, Rebamipida o CsA a 37°C durante 1 hora antes de la estimulación con SEB. Se añadió SEB a razón de 1 ng/ml y se recogieron los sobrenadantes celulares a las 6, 16 y 48 horas. Los niveles de citoquinas en los sobrenadantes del ensayo se determinaron utilizando un ensayo multiplex Luminex.
El antagonista demostró una potente inhibición de la liberación de citoquinas inflamatorias, particularmente las citoquinas reguladoras de células T, IL-2 e IL-4, con dosis crecientes. Los resultados se muestran en las Tablas 2, 3 y 4 y se representan gráficamente en la Figura 11. El patrón de liberación de citoquinas inhibido en más del 50% con el antagonista de LFA-1 directamente competitivo es similar al observado en comparación con CsA. Las excepciones a esta similitud, IL-3, IL-6 e IL-12p40, no han demostrado ser importantes a la inflamación mediada por células T.
Tabla 2. Concentraciones CE50 para la inhibición de IL-2, IFN y, MIP-1a y TNF-a.
Liberación de Citoq uinas CE50 mM
IL-2 IFN MIP-1a TNF-a
Antagonista 0,076
LFA
Rebamipida
Figure imgf000071_0002
>1000
Ciclosporina A 0,00094 0,00050 0,0011 0,00049
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Tabla 3. Concentraciones CE50 para la inhibición de IL-4, IL-10, IP-10, GM-CSF y MCP-1.
Liberación de Citoq uinas CE50 mM
IL-4 IL-10 IP-10 GM-CS MCP-1
Antagonista 1,158 0,545 0,0050
LFA-1
Rebamipida
Figure imgf000071_0006
>1000
Figure imgf000071_0005
>1000
Figure imgf000071_0003
>1000
Ciclosporina A 0,0063 0,0292 0,167 0,0202 0,0926
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Tabla 4. Concentraciones CE50 para la inhibición de IL-1a, IL-13, IL-3, IL-5, IL-6, IL-12p40 e IL-13.
Liberación de Citoq uinas CE50 mM IL-1a IL-1 IL-3 IL-5 IL-6 IL-12 40 IL-13 Antagonista 52,23 0,11 43,51 0,36 LFA-1 Rebamipida
Figure imgf000071_0011
>1000
Figure imgf000071_0008
>1000
Figure imgf000071_0009
>1000
Figure imgf000071_0010
>1000 Ciclosporina A 0,002 0,003 0,002 0,073 0,001 0,002 0,074
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Ejemplo 9: Formulaciones de un Antagonista de LFA-1.
Se formuló un antagonista de LFA-1 directamente competitivo de la invención en varias composiciones para su administración en forma de geles, lociones, ungüentos y soluciones, para su administración por diversas vías, que incluyen pero no se limitan a tópica, por instilación, en aerosol, por parche transdérmico, vía inserto o administración oral.
Tabla 5. Formulaciones de Gel 1 y 2 de Antagonista de LFA-1.
Formulación 1 (% p/ Formulación 2 (% p/p)
Antagonista de LFA-1 Antagonista de LFA-1
Dimetil Isosorbida al Dimetil Isosorbida al
Transcutol al 25% Transcutol al 25%
Hexilenglicol al 12%
Figure imgf000071_0012
Hexilenglicol al 12%
Propilenglicol al 5% Propilenglicol al 5%
Figure imgf000071_0013
Metilparabeno al 0,15% Metilparabeno al 0,15%
Propilparabeno al 0,05% Propilparabeno al 0,05%
EDTA al 0,01%
Figure imgf000072_0001
EDTA al 0,01%
Penmulen TR-1 al 0,5% Hidroxietil Celulosa al 1%
c.s. pH 6,0 Trolamina al 25% c.s. pH 4,5 Trolamina al 25
c.s. 100 Agua c.s. 100 Agua
Figure imgf000072_0002
Tabla 6. Formulaciones de Loción 3 y 4 de Antagonista de LFA-1.
Formulación 3 (% p/ Formulación 4 (% p/p)
Antagonista de LFA- Antagonista de LFA-1
Dimetil Isosorbida al Dimetil Isosorbida al
Transcutol al 20% Transcutol al 20%
Hexilenglicol al 10% Hexilenglicol al 10%
Propilenglicol al 4% Propilenglicol al 4%
Metilparabeno al 0,15 Metilparabeno al 0,15
Propilparabeno al 0,0 Propilparabeno al 0,0
EDTA al 0,01% EDTA al 0,01%
Carbopol Ultrez 10 al Carbopol Ultrez 10 al
Penmulen TR-1 al 0,2 Penmulen TR-1 al 0,2
Miristato de Isopropilo Alcohol Cetílico al 2%
Alcohol Oleílico al 5% Aceite Mineral Ligero
Figure imgf000072_0003
Vaselina Blanca al 5 Ácido Oleico al 5%
Hidroxitolueno Butilad Hidroxitolueno Butilado al 0,02%
c.s. pH 6,0 Trolamina
Figure imgf000072_0004
c.s. pH 6,0 Trolamina al 25%
c.s. 100 Agua c.s. 100 Agua
Figure imgf000072_0005
Tabla 7. Formulaciones de Ungüento 5 y 6 de Antagonista de LFA-1.
Formulación 5 (% p/p) Formulación 6 (% p/p)
Antagonista de LFA-1 al 1% Antagonista de LFA-1 al 1%
Figure imgf000072_0006
PEG 400 al 15% Dimetil Isosorbida al 10%
Hidroxitolueno Butilado al 0,0 Hidroxitolueno Butilado al 0,02%
Span 80 al 2% Span 80 al 2%
Cera Blanca al 10%
Figure imgf000072_0007
Cera Blanca al 10%
Vaselina Blanca al 71,98% Vaselina Blanca al 76,98%
Figure imgf000072_0008
Tabla 8. Formulaciones de Solución 7 8 9 de Anta onista de LFA-1.
Figure imgf000072_0010
Tabla 9. Formulaciones de Solución 10, 11,12, 13 y 14 de Antagonista de LFA-1.
% P/P Formulación Formulación Formulación Formulación Formulación
Figure imgf000072_0009
i __________________________ c.s. pH 7,0 HCl al 1%____________ | c.s. Agua
Figure imgf000073_0001
Tabla 10. Formulaciones de Solución 15 de Antagonista de LFA-1.
Formulación 15__________________________
1 ml de una solución de Antagonista de LFA-1 al 10% P/P en agua, más 0,158 mmol de
bicarbonato sódico______________________
Diluir con 9 ml de PBS
Ejemplo 10. Absorción Percutánea In-Vitro de un Antagonista Directamente Competitivo de LFA-1 de la Invención Después de la Aplicación Tópica.
La biodisponibilidad después de la aplicación tópica in vivo se evaluó utilizando métodos de ensayo de absorción percutánea in-vivo, utilizando procedimientos adaptados de Skelly et al., Pharmaceutical Research 19874(3): 265-276, "FDA and AAPS Report of the Workshop on Principles and Practices of In-Vitro Percutaneous Penetration Studies: Relevance to Bioavailability and Bioequivalence".
Las Formulaciones 1-9 se aplicaron a tejido de la piel humana con dermatoma extirpado de un solo donante en una sola dosis clínicamente relevante de 5 mg/cm2, que es equivalente a una dosis de 30-35 |jg. El grosor del tejido varía de 0,023 a 0,039 pulgadas (0,584 a 0,991 mm) con una media /- desviación estándar en el grosor de 0,030 /- 0,004 pulgadas (0,773 /- 0,111 mm) y un coeficiente de variación del 14,4%. Las muestras de tejido se montaron en celdas de difusión de flujo continuo Bronaugh. Las células se mantuvieron a una temperatura constante de 32°C utilizando baños de agua recirculante. Las células tienen un área de difusión nominal de 0,64 cm2. Se utilizó PBS, a pH 7,4, con azida sódica al 0,1% y Albúmina de Suero Bovino al 4% como fase receptora debajo del tejido montado. La fase receptora fresca se bombeó continuamente bajo el tejido a un caudal nominal de 1,0 ml/h y se recogió a intervalos de 6 horas. Se recogieron las fases del receptor para su análisis.
Las muestras de tejido se expusieron a las Formulaciones 1-9 durante 24 horas. El exceso de formulación que residía en el estrato córneo en ese momento se separó mediante pegado con cinta adhesiva con discos de pelado CuDerm D-Squame. Las tiras de cinta se descartaron. La epidermis y la dermis se separaron mediante disección roma. Se analizaron la epidermis, la dermis y la fase receptora para determinar el contenido de Antagonista de LFA-1. Los resultados se representan en la Tabla 11.
Los niveles de permeación tisular (la fase receptora) del Antagonista de LFA-1 para todas las formulaciones, excepto la Formulación 9, que contenía 99% de DMSO, estaban por debajo de los límites de cuantificación, que era de 0,54 ng/ml (que equivale a 0,013% de la dosis aplicada). La Formulación 9, por el contrario, proporcionó 1,4% de la dosis aplicada, penetrando a través de todas las capas del tejido de la piel durante el período de exposición de 24 horas.
La deposición epidérmica del Antagonista de LFA-1 durante el período de exposición de 24 horas fue muy alta y consistente con un gran porcentaje de la dosis aplicada retenida en las capas superiores de la epidermis. Los niveles reseñados en la Tabla 10 se obtuvieron a partir de muestras de pequeño volumen, que no se pudieron volver a ensayar y, por lo tanto, se consideran sub-estimaciones de la cantidad de fármaco presente en la epidermis.
Los datos analíticos de la dermis cayeron dentro del intervalo de linearidad establecido para el Antagonista de LFA-1 y son cuantitativos.
Deposición dérmica de Antagonista de LFA-1 después de una exposición de 24 horas varió de 0,66% (Formulación 6, 0,258 |jg/cm2) a 4,4% (Formulación 7, 34,3 |jg/cm2) de la dosis aplicada. La concentración de Antagonista de LFA-1 en la dermis se calcula como 6,7 jM (Formulación 6) o mayor (es decir, la Formulación 7 proporciona una concentración en la dermis de 54.1 jM ) para las Formulaciones 1 a 9 en la dermis. Estas concentraciones están muy por encima de la concentración CE50 in vitro para obtener la mitad del efecto máximo en la inhibición de la liberación de citocinas inflamatorias por la clase de antagonistas de LFA-1 mostrada en el Ejemplo 7 y la Tabla 1 correspondiente. Por lo tanto, estos resultados son predictivos de la capacidad de una diversidad de formulaciones, que incorporan Antagonista de LFA-1 al 1% P/P, para proporcionar niveles terapéuticamente eficaces de inhibición in-vivo de la liberación de citoquinas.
Tabla 11. Fase del Receptor Acumulada y Niveles Tisulares del Antagonista de LFA-1 Después de 24 Horas de Exposición Tópica.
Contenido de la Fase del
Receptor a las 24 horas Epidermis Dermis
Formulación n° jg/cm2 % Dosis jg/cm2 % Dosis jg/cm2 jg/m % Dosis Aplicada Aplicada Aplicada Media 3,93 7,48 1,14 18,8 2,15 DE1 < Límite de Cuantificación 2,92 5,50 0,91 14,9 1,73
Figure imgf000074_0001
% CV2 74 74 80 80 80
Media 6,03 11,9 0,750 12,3 1,49 2 DE < Límite de Cuantificación 2,56 5,1 0,304 5,0 0,63
Figure imgf000074_0002
% CV 43 42 40 40 42
Media 6,03 12,1 1,40 23,0 2,74 3 DE < Límite de Cuantificación 2,97 6,4 0,27 4,4 0,47 % CV 49 53 19 19 17
Figure imgf000074_0003
Media 7,92 17,0 0,975 16,0 2,10 4 DE < Límite de Cuantificación 3,41 7,2 0,350 5,8 0,75
% CV 43 42 36 36 36
Media 5,71 14,6 0,670 11,0 1,71 5 DE < Límite de Cuantificación 1,73 4,2 0,351 5,8 0,87
Figure imgf000074_0008
% CV 30 29 52 52 51
Media 6,47 16,8 0,258 4,25 0,657 6 DE < Límite de Cuantificación 1,07 2,7 0,158 2,6 0,394
% CV 17 16 61 61 60
Media 7,22 15,0 2,08 34,3 4,35 7 DE < Límite de Cuantificación 2,15 4,5 0,84 13,7 1,83
% CV 30 30 40 40 42
Media 8,58 18,0 1,48 24,3 3,09 8 DE < Límite de Cuantificación 3,53 7,7 0,99 16,2 2,07 % CV 41 43 67 67 67
Figure imgf000074_0010
Media 0,660 1,43 5,78 13,2 1,19 19,6 2,63
9 DE
Figure imgf000074_0005
0,253
Figure imgf000074_0011
0,49
Figure imgf000074_0012
3,18
Figure imgf000074_0006
8,3
Figure imgf000074_0007
0,49
Figure imgf000074_0009
8,1
Figure imgf000074_0004
1,15
% CV 38 34 55 63 41 41 44
1. Desviación Estándar
2. Porcentaje Coeficiente de Variación.
Ejemplo 11: Ensayo de Proliferación de Células T.
Este ensayo es un modelo in vitro de proliferación de linfocitos resultante de la activación, inducida por el acoplamiento del receptor de células T y LFA-1, tras la interacción con células presentadoras de antígeno (Springer, Nature 346: 425 (1990)).
Placas de microtitulación (Nunc certificadas de 96 pocillos ELISA) se pre-recubrieron durante la noche a 4°C con 50 |jl de 2 jg/ml de anti-Fc humano de cabra (Caltag H10700) y 50 j l de 0,07 jg/ml de anticuerpo monoclonal para CD3 (Immunotech 0178) en PBS estéril. Al día siguiente, se aspiran las soluciones de la capa. Después, las placas se lavan dos veces con PBS y se añaden 100 j l de 5d-ICAM-1-IgG 17 ng/ml durante 4 horas a 37°C. Las placas se lavan dos veces con PBS antes de la adición de células T CD4+ Los linfocitos de la sangre periférica se separan de la sangre entera heparinizada extraída de donantes sanos Un método alternativo es obtener sangre entero de donantes sanos mediante leucoforesis. La sangre se diluye 1:1 con solución salina, se estratifica y se centrifuga a 2500 xg durante 30 minutos en LSM (6,2 g de Ficoll y 9,4 g de diztrizoato de sodio por cada 100 ml) (Organon Technica, N.J.). Los monocitos se agotan utilizando un método de reactivo de agotamiento de células mieloides (Myeloclear, Cedarlane Labs, Hornby, Ontario, Canadá). Los PBL se resuspenden en suero Bovino Fetal inactivado por calor al 90% y DMSO al 10%, se toman partes alícuotas y se almacenan en nitrógeno líquido. Después de descongelar, las células se resuspenden en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, N.Y.) complementado con suero Bovino Fetal inactivado por calor al 10% (Intergen, Purchase, N.Y.), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 3 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM, 500 jg/ml de penicilina, 50 jg/ml de estreptomicina, 50 jg/ml de gentamicina (Gibco).
La purificación de las células T CD4+ se obtiene mediante el método de selección negativa (Kit de Columna de Recuperación de Células CD4 Humanas n° CL110-5 Accurate). Se cultivan 100.000 células T CD4+ purificadas (90% de pureza) por pocillo de placa de microtitulación durante 72 horas a 37°C, en 5% de CO2 en 100 ml de medio de cultivo (RPMI 1640 (Gibco) complementado con FBS (Intergen) inactivado por calor al 10%, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, Piruvato de Sodio 1 nM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 jg/ml de estreptomicina, 50 jg/ml de Gentamicina, Hepes 10 mM y Glutamina 2 mM). Se añaden inhibidores a la placa al inicio del cultivo. Las respuestas proliferativas en estos cultivos se miden mediante la adición de 1 |jC¡/poc¡llo de timidina titulada durante las últimas 6 horas antes de la recolección de células. La incorporación de marcador radiactivo se mide mediante recuento de centelleo líquido (recolector y contador Packard de 96 pocillos). Los resultados se expresan en recuentos por minuto (cpm).
Ejemplo 12: Modelo de Cultivo de Linfocitos Mixtos In vitro.
El modelo de cultivo mixto de linfocitos, que es un modelo in vitro de trasplante (A. J. Cunningham, "Understanding Immunology, Transplantation Immunology" páginas 157-159 (1978) examina los efectos de diversos antagonistas de LFA-1 en los brazos proliferativo y efector de la respuesta de linfocitos mixtos humanos.
Aislamiento de Células: Células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) se separan de la sangre entera heparinizada extraída de donantes sanos La sangre se diluye 1:1 con solución salina, se estratifica y se centrifuga a 2500 xg durante 30 minutos en LSM (6,2 g de Ficoll y 9,4 g de diztrizoato de sodio por cada 100 ml) (Organon Technica, N.J.). Un método alternativo es obtener sangre entero de donantes sanos mediante leucoforesis. Las PBMCs se resuspenden en suero Bovino Fetal inactivado por calor al 90% y DMSO al 10%, se toman partes alícuotas y se almacenan en nitrógeno líquido. Después de descongelar, las células se resuspenden en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, N.Y.) complementado con suero Bovino Fetal inactivado por calor al 10% (Intergen, Purchase, N.Y.), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 3 mM, aminoácidos no esenciales 1 mM, 500 |jg/ml de penicilina, 50 |jg/ml de estreptomicina, 50 |jg/ml de gentamicina (Gibco).
Respuesta de linfocitos mixtos (MLR): Una forma de establecer cultivos de linfocitos mixtos humanos es en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. 1,5x105 PBMCs respondedoras se co-cultivan con un número igual de alogénicos irradiados (3000 rads durante 3 minutos, 52 segundos PBMCs estimuladoras en 200 jil de medio completo. Se añaden antagonistas de LFA-1 en el inicio de los cultivos. Los cultivos se incubaron a 37°C en 5% de CO2 durante 6 días, luego se pulsan con 1 jiCi/pocillo de 3H-timidina (6,7 Ci/mmol, NEN, Boston, Mass.) durante 6 horas. Los cultivos se recogen en un recolector de células Packard (Packard, Canberra, Canadá) La incorporación de [3H] TdR se mide mediante recuento de centelleo líquido. Los resultados se expresan como recuentos por minuto (cpm).
Ejemplo 13: Ensayo de adhesión de células T utilizando células Jurkat.
El propósito de este estudio es evaluar las propiedades anti-adhesivas de Antagonistas de LFA-1 sobre la unión de células Jurkat a ICAM-1 después de la exposición in v itro .
Se preparan soluciones madre de Antagonista de LFA-1 y control positivo en DMSO/agua (1:1) y se diluyen en medio de ensayo y las diluciones posteriores se preparan mediante la adición de medio de ensayo para lograr la concentración deseada. Un antagonista de LFA-1 reseñado se utiliza como control positivo.
Células Jurkat se marcan con una solución 8 jiM de BCECF-AM (2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(y-6)-carboxifluoresceína) en medio de crecimiento a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células marcadas se incuban en 70 jiL de medio de ensayo en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos a razón de 500.000 células por pocillo con 70 jiL de Antagonista de LFA-1 o control positivo en medio de ensayo a 37°C durante 30 minutos. Se deja sedimentar una parte alícuota de 100 jiL de esta suspensión de células Jurkat marcada con fluorescencia en presencia del antagonista de LFA-1 o del control positivo en los pocillos de una placa de 96 pocillos recubiertos con ICAM-1 humana recombinante expresada como una quimera Fc a 37°C durante 1 hora. Las células no adherentes se separan mediante lavado y centrifugación a 100 g durante 1 minuto. Las células adherentes se determinan como unidades fluorescentes adherentes en un lector de placas fluorescentes.
Ejemplo 14. Suministro Dérmico de un Antagonista de LFA-1 Directamente Competitivo de la Invención mediante Aplicación Tópica al Torrente Sanguíneo.
Se realiza un estudio para determinar el suministro de un antagonista de LFA-1 directamente competitivo de la invención mediante aplicación tópica en la piel, al torrente sanguíneo. Las formulaciones de gel (formulado como en la Formulación n° 1, Tabla 5), loción (formulada como en Formulación n° 3, Tabla 6), ungüento (formulado como en Formulación n° 5, Tabla 6) y solución de DMSO al 1% (Control) se evalúan en ratas macho Sprague Dawley, como se muestra en la Tabla 12.
Administración de la Dosis. Los animales no están en ayunas para este estudio. Todas las dosis únicas y múltiples se administran de forma fija (formulación de 200 jiL/animal/dosis). Los pesos de los aparatos de dosis cargados y vacíos se registran para la determinación de los pesos reales de la formulación administrada.
Dérmica. Para la administración dérmica en los Grupos 1 a 4 (Grupo 1 (Gel); Grupo 2 (Ungüento); Grupo 3 (Loción); Grupo 4 (DMSO) estudio de un solo día, datos no mostrados), cada uno de los animales recibe una sola aplicación tópica a la piel del dorso el Día 1. Para la administración dérmica en los Grupos 6 a 9 (Grupo 6 (Gel); Grupo 7 (Ungüento); Grupo 8 (Loción); Grupo 9 (DMSO, Dérmico)), cada uno de los animales recibe 3 aplicaciones tópicas administradas diariamente (aproximadamente con 4 horas de diferencia) a la piel del dorso durante 7 días consecutivos.
Intradérmica Para cada uno de los animales del Grupo 5 (DMSO, intradérmica), la dosis intradérmica única de 200 |jL se administra el Día 1 como dos inyecciones de 100 j L administradas secuencialmente mediante una jeringa y una aguja en una zona afeitada de la región subescapular.
Recogida de Muestras: Sangre (Todos los Grupos) Para la administración de la dosis final según corresponda en base al grupo de estudio, se recoge sangre de cada uno de los animales antes de la dosis y a las 0,25, 0,5, 1,2 y 4 horas después de la dosis.
Recogida de Muestras: Sitios de Aplicación (Solo Grupos Dérmicos). Después de sacrificio para la muestra de sangre terminal, se escinde la sección de la piel expuesta a la formulación de artículo de ensayo. El estrato córneo y cualquier formulación de artículo de ensayo no absorbida que quede en la superficie de la piel se separa mediante cinta adhesiva. Las tiras se combinaron en un vial de muestra para cada uno de los animales y la sección de piel restante se colocó en un segundo vial de muestra. Se registraron los pesos de las muestras.
Tabla 12. Dosis Administradas a Ratas Macho Sprague Dawley dan Dosis Dérmica o Intradérmica de un Antagonista de LFA-1 directamente competitivo de la Invención en Diversas Formulaciones (Grupos 5 a 9).
Dosis Diana Nominal
Animal Antagonista Dosis Concentració Nivel deDosis Administrada
n Dosis
Número Formulación Vía (mg/g) (mg/animal) (g/animal)a (mg/animal) (mg/kg)
B11704 Gel 1% Dérmica. 10 2 0,2088 2,09 6,76
B11705 Gel 1% Dérmica. 10 2 0,2080 2,08 6,69
B11706 Gel 1% Dérmica. 10 2 0,2079 2,08 6,79
B11707 Ungüento 1% Dérmica. 10 2 0,1669 1,67 5,06
B11708 Ungüento 1% Dérmica. 10 2 0,1722 1,72 5,63
B11709 Ungüento 1% Dérmica. 10 2 0,1744 1,74 5,64
B11710 Loción 1% Dérmica. 10 2 0,2075 2,08 6,69
B11711 Loción 1% Dérmica. 10 2 0,2003 2,00 6,34
B11712 Loción 1% Dérmica. 10 2 0,2063 2,06 6,92
B11713 DMSO 1% Dérmica. 10 2 0,2195 2,20 7,13
B11714 DMSO 1% Dérmica. 10 2 0,2180 2,18 6,96
B11715 DMSO 1% Dérmica. 10 2 0,2201 2,20 6,94
B11716 DMSO 1% Intradérmic 10 2 0,2209 2,21 6,97
a
B11717 DMSO 1% Intradérmic 10 2 0,2201 2,20 7,01
a
B11718 DMSO 1% Intradérmic 10 2 0,2248 2,25 7,54
a
a Peso de formulación administrado.
Resultados Los datos de la Tabla 13 demuestran que el fármaco penetró de forma apreciable en la piel en las formulaciones de ensayo y se detectó circulando en el plasma después de la absorción de los capilares en la dermis y la epidermis.
Tabla 13. Concentración de un Antagonista de LFA-1 Directamente Competitivo en Sangre mediante Suministro en Diversas Formulaciones después de 7 Días (dérmica) o 1 Día (Intradérmico).
Conc.
Punto de
Animal n° evaluación Grupo Vía de Dosis (ng/mL)
B11704 Pre-dosis Gel 1% Dérmica. <0,500
B11704 4. H Gel 1% Dérmica. <0,500
B11705 Pre-dosis Gel 1% Dérmica. <2,00~
B11705 4. H Gel 1% Dérmica. <0,500
B11706 Pre-dosis Gel 1% Dérmica. NR
B11706 4. H Gel 1% Dérmica. <0,500
B11707 Pre-dosis Ungüento 1% Dérmica. <0,500
B11707 4. H Ungüento 1% Dérmica. <0,500
B11708 Pre-dosis Ungüento 1% Dérmica. <0,500
B11708 4. H Ungüento 1% Dérmica. <0,500
B11709 Pre-dosis Ungüento 1% Dérmica. <0,500
B11709 4. H Ungüento 1% Dérmica. <0,500
B11710 Pre-dosis Loción 1% Dérmica. <2,00~
B11710 4. H Loción 1% Dérmica. <0,500
B11711 Pre-dosis Loción 1% Dérmica. <2,00~
B11711 4. H Loción 1% Dérmica. <0,500
B11712 Pre-dosis Loción 1% Dérmica. <2,00~
B11712 4. H Loción 1% Dérmica. <0,500
B11713 Pre-dosis DMSO 1% Dérmica. <2,00~
B11713 4. H DMSO 1% Dérmica. 2,08
B11714 Pre-dosis DMSO 1% Dérmica. <0,500
B11714 4. H DMSO 1% Dérmica. 2,81
B11715 Pre-dosis DMSO 1% Dérmica. <2,00~
B11715 4. H DMSO 1% Dérmica. 2,22
B11716 Pre-dosis DMSO 1% Intra-Dérmica <2,00~
B11716 4. H DMSO 1% Intra-Dérmica 93,9
B11717 Pre-dosis DMSO 1% Intra-Dérmica <2,00~
B11717 4. H DMSO 1% Intra-Dérmica 214
B11718 Pre-dosis DMSO 1% Intra-Dérmica <0,500
B11718 4. H DMSO 1% Intra-Dérmica 136
< 0.500 = Por debajo del Límite de Cuantificación (BLQ).
< 2,00 = Por debajo del Límite de Cuantificación (BLQ) debido a una dilución de 4,00 veces.
NR = Respuesta estándar interna baja. Volumen de muestra insuficiente para volver a analizar.
Ejemplo 15. Farmacocinética Ocular de Rata.
Se utiliza un modelo de rata para medir la distribución de un antagonista de LFA-1 directamente competitivo en los tejidos del ojo, particularmente en la retina. (Véase S. P. Ayalasomayajula, and U. B. Kompella, European Journal of Pharmacology, (2003)" Celecoxib, un inhibidor selectivo de ciclooxgenasa-2, inhibe la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular retiniano y la fuga vascular en un modelo de rata diabética inducida por estreptozotocina ", 458: 283­ 289). Una sola gota de una formulación de solución al 1% de un antagonista de LFA-1 radiomarcado con 14C de la invención (Formulación 12, Tabla 9 o Formulación 15, Tabla 10) se administra en el ojo de ratas, y la radiactividad es seguida a lo largo del tiempo. Datos para t = 30 min y t = 4 horas, se representa gráficamente en la Figura 12. En la Figura 12, la concentración de antagonista radiomarcado medida en cada región anatómica se indica mediante la escala de grises creciente del recuadro correspondiente a la región anatómica marcada. Los valores numéricos para estos datos se muestran en la Tabla 14 y se da en equivalentes de nanogramos de antagonista de LFA-1 radiomarcado por gramo de tejido.
Tabla 14. Concentración de Antagonista de LFA-1, ng Equivalentes de [14C]-Antagonista de LFA-1/g de tejido.
Región física 0,5 horas tras la 4,0 horas tras la
administración administración
Humor acuoso 1770 116
Conjuntiva (bulb 31500 4480
Conjuntiva (palp 26300 2183
Córnea 17150 1346
Cuerpo iris-ciliar 17550 500
Lente 38,8 9,69
Nervio Óptico 796 0
Retina y Coroid 510 46,7
Esclerótica
Figure imgf000078_0001
2750
Figure imgf000078_0002
387
Humor Vítreo 1330 183
Figure imgf000078_0003
Los resultados demuestran que se alcanzan niveles terapéuticos de antagonista de LFA-1 en la retina, extendiéndose hasta el momento de cuatro horas después de la administración, en que se observa una concentración de fármaco de 50 ng/g en la retina. Esto está muy por encima del umbral esperado de 10 nM requerida para la inhibición de la adhesión de leucocitos y la función en Edema Macular Diabético/Retinopatía Diabética para un antagonista con una CI50 en el ensayo de adhesión celular Hut78 de aproximadamente 2 a 6 nM.
Ejemplo 16: Estudio en Seres Humanos de Fase 1.
Se inscriben sujetos sanos. Se lleva a cabo un ensayo aleatorizado, controlado, de escalada de dosis de administraciones únicas y múltiples de antagonista de LFA-1. Se tratan cohortes de 7 sujetos cada una (5 de tratamiento, 2 de placebo) en cada uno de los 6-8 niveles de dosis de antagonistas de LFA-1 formulados como soluciones acuosas tamponadas, isotónicas, neutras, estériles. Los sujetos reciben una sola instilación el Día 1. Se obtienen muestras para evaluaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas durante la semana siguiente. A partir del Día 8, los sujetos reciben la misma dosis de antagonista de LFA-1 diariamente durante un total de 14 días. Se evalúan evaluaciones PK/PD, estudios de laboratorio de seguridad, exámenes oftálmicos, tinción corneal y angiografías con fluoresceína.
Ejemplo 17: Estudio en Seres Humanos de Fase II.
Se inscribieron sujetos adultos con retinopatía diabética en dos grupos segregados en aquellos con y aquellos sin edema macular diabético según lo definido por los criterios clave de inclusión/exclusión. Se lleva a cabo un ensayo aleatorizado y controlado de búsqueda de dosis de antagonistas de LFA-1. Tres grupos de sujetos reciben instilaciones de vehículo portador solo o uno de los dos niveles de dosis de antagonista de LFA-1, formulado como una solución acuosa isotónica tamponada neutra, diariamente durante doce semanas. Los sujetos son seguidos en cuanto a seguridad y evidencia de mejoría en la angiografía con fluoresceína, fotografía del fondo de ojo y exámenes de agudeza visual general durante un período de seguimiento de tres meses.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un agente terapéutico que inhibe la interacción de LFA-1 y un ICAM para uso en el tratamiento del edema macular, en donde el agente terapéutico es de Fórmula IIB o sus sales o ésteres farmacéuticamente aceptables,
    Figure imgf000081_0001
    AR1 es un resto monocíclico o policíclico arilo, heteroarilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, alicíclico o heterocíclico; en que R17 es hidrógeno, sales o ésteres farmacéuticamente aceptables, y
    en ue R27 es
    Figure imgf000081_0002
    2. Un agente terapéutico para uso según la reivindicación 1, en donde dicha ICAM es ICAM-1, ICAM-2 o ICAM-3, o en donde dicho agente terapéutico es un antagonista de LFA-1, preferiblemente en donde dicho antagonista de LFA-1 se une a un sitio de unión de alta afinidad en la subunidad aL de l Fa -1 que se solapa al sitio de unión de ICAM-1 o en donde dicho antagonista de LFA-1 es directamente competitivo con la unión de ICAM-1 en la subunidad aL de LFA-1.
    3. Un agente terapéutico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 de la Fórmula II:
    Figure imgf000081_0003
    Figure imgf000081_0004
    Figure imgf000082_0003
    y R29 es hidrógeno, una sal o éster farmacéuticamente aceptable, en donde los compuestos de Fórmula II comprenden estereoquímica como en la Fórmula II',
    Figure imgf000082_0001
    Fórmula II’
    4. Un agente terapéutico para su uso según la reivindicación 1 de la fórmula:
    Figure imgf000082_0002
    Figure imgf000085_0001
    o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.
    5. Un agente terapéutico para uso según la reivindicación 1 de la fórmula
    Figure imgf000085_0002
    o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.
    6. Un agente terapéutico que inhibe la interacción de LFA-1 y una ICAM para uso en el tratamiento del edema macular, en donde el a ente tera éutico es de la fórmula:
    Figure imgf000086_0001
    o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.
    7. Un agente terapéutico para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho agente terapéutico se administra por vía tópica, oral, peri-ocular, intraocular, mediante inyección, nasal, mediante un aerosol, mediante un inserto, mediante un dispositivo implantado o mediante una gota; preferiblemente en donde dicho agente terapéutico se administra en un vehículo portador que es gotas líquidas, lavado líquido, líquido nebulizado, gel, ungüento, aerosol, spray, micro- y nano-partículas poliméricas, solución, suspensión, sólido, matriz biodegradable, polvo, cristales, espuma, o liposomas, opcionalmente en donde dicho agente terapéutico se administra tópicamente y dicha administración tópica comprende la infusión de dicho compuesto a dichos ojos a través de un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un sistema de bomba-catéter, un inserto, un dispositivo de liberación continua o selectiva, un implante bioabsorbible, una formulación de liberación continua o sostenida y una lente de contacto; o, alternativamente, en donde dicho agente terapéutico se administra mediante inyección y dicha inyección se realiza por vía intraocular, intravítrea, periocular, subcutánea, subconjuntival, retrobulbar o intracameralmente.
    8. Un agente terapéutico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho agente terapéutico se suministra al ojo mediante administración local o sistémica, o en donde la administración se realiza mediante la administración de una instilación intraocular de un gel, crema, polvo, espuma, cristales, liposomas, spray, micro- o nano-partículas de polímero, o forma de suspensión líquida de dicho compuesto, preferiblemente, en donde dicho compuesto se administra a dicho sujeto en una cantidad suficiente para lograr concentraciones intraoculares o retinianas de desde aproximadamente 1x10'8 a aproximadamente 1x10'1 moles/litro.
    9. Un agente terapéutico para uso según se reivindica en cualquiera de la reivindicaciones 1 -6, en donde dicho compuesto se administra al menos una vez al año, al menos una vez al día, al menos una vez a la semana o al menos una vez al mes.
    10. Un agente terapéutico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende, además, administrar un segundo agente terapéutico antes, en combinación con, al mismo tiempo o después de la administración de dicho antagonista de LFA-1, preferiblemente, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en antioxidantes, agentes antiinflamatorios, antimicrobianos, esteroides, inhibidores de la proteína quinasa C, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, agentes antiangiogénicos, inhibidores del complemento y agentes antiapoptóticos; opcionalmente, en donde el segundo agente terapéutico es un agente terapéutico anti-adhesión con un sitio de unión competitivo alostérico en LFA-1, por ejemplo, en donde el segundo agente terapéutico es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo terapéutico anti-adhesión.
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