HU220137B

HU220137B - Biológiailag lebontható poliészterek és biológiailag aktív polipeptidek ionos molekuláris konjugátumai, eljárás ezek előállítására és eljárás mikrorészecskék előállítására

Info

Publication number: HU220137B
Application number: HU9502029A
Authority: HU
Inventors: Steven Jackson; Jacques-Pierre Moreau; Shalaby W. Shalaby
Original assignee: Kinerton Ltd.
Priority date: 1993-01-06
Filing date: 1994-01-05
Publication date: 2001-11-28
Also published as: CN1115252A; WO1994015587A2; FI114898B; CZ173495A3; JPH08505395A; HUT73188A; RU2185393C2; EP0678018A1; HU9502029D0; NZ261250A; SK74495A3; ZA9477B; FI953314A0; EP0678018B1; CN1163260C; DK0678018T3; WO1994015587A3; ES2196023T3; EP0678018A4; CA2150574A1

Description

A találmány biológiailag aktív polipeptidek nyújtott felszabadulására vonatkozik.

Számos gyógyszer-transzportáló rendszert kifejlesztettek, vizsgáltak és alkalmaztak már gyógyászati készítmények szabályozott in vivő felszabadítására. így például poliésztereket, mint például poli(DL-tejsav)-at, poliglikolsavat, poli(e-kaprolakton)-t és különféle egyéb kopolimereket alkalmaztak biológiailag aktív molekulák, például progeszteron felszabadítására. Ezek mikrokapszulák, filmek vagy pálcikák formájában vannak (Pitt CG, Marks, TA és Schindler A. 1980). A polimer/gyógyhatású szer kompozíció például szubkután módon vagy intramuszkulárisan történő beültetése után a gyógyhatású szer egy specifikus időtartam alatt szabadul fel. Az ilyen biológiailag kompatibilis, biológiailag lebontható polimer rendszereket úgy tervezik, hogy a befogott gyógyhatású szer ki tudjon difftmdálni a polimer mátrixból. A gyógyhatású szer felszabadulása után a polimer in vivő degradálódik, ezáltal az implantátum sebészeti eltávolítása feleslegessé válik. Noha a polimer degradálódásában meghatározó faktorok még nem teljesen ismertek, a poliészterek fenti degradálódását valószínűleg az szabályozza, hogy az észterkötések mennyire hozzáférhetők a polimer komponensek nem enzimatikus, autokatalitikus hidrolízise szempontjából.

Számos EP szabadalmi publikáció és US szabadalmi leírás foglalkozik polimer mátrixok tervezésével, és azok szerepével a gyógyhatású szerek in vivő felszabadulásának sebessége és mértéke szabályozásában.

így például Deluca (EP A2 0 467 389 számú szabadalmi leírás/Univ. of Kentucky) fizikai kölcsönhatást írt le egy hidrofób, biológiailag degradálható polimer és egy protein vagy polipeptid között. Az előállított készítmény egy gyógyhatású szer és egy hidrofób polimer elegye volt, amely a páciensbe való bevitelt követően meghosszabbította a hatóanyag diffúziós felszabadulását a mátrixból.

Hutchinson (US 4 767 628 számú szabadalmi leírás/ICI) a gyógyhatású szer felszabadulását egységes diszpergálással szabályozta egy polimer eszközben. Leírta, hogy ez a készítmény a folyamatos, szabályozott felszabadulást két fázis átfedésével biztosítja: 1. a gyógyszer diffúziótól függő kiszűrődése a készítmény felületéből, 2. a polimer degradálódása által keletkező vizes csatornákon keresztüli felszabadulás.

Általánosságban a találmány nyújtott hatóanyag-felszabadulást biztosító gyógyászati készítményre vonatkozik, amely egy vagy több szabad hidroxilcsoportot tartalmazó poliészterből és azzal ionosán konjugált, legalább egy effektív ionogén amint tartalmazó biológiailag aktív polipeptidből áll, ahol a készítményben lévő polipeptid legalább 50 tömeg%-a ionosán kapcsolódik a poliészterhez.

Az előnyös kiviteli alakokban a poliésztert úgy módosítjuk, hogy a karboxil/hidroxil végcsoportok arányát 1-nél nagyobbról a végtelenig növeljük, azaz az összes hidroxilcsoport karboxilcsoporttal lehet helyettesítve. Megfelelő poliészterek azok, amelyek L-tejsavból, D-tejsavból, DL-tejsavból, ε-kaprolaktonból, p-dioxanonból, ε-kapronsavból, szubsztituált vagy szubsztituálatlan trimetilén-karbonátból, l,5-dioxepán-2-onból, l,4-dioxepán-2-onból, glikolidból, glikolsavból, L-laktidból, D-laktidból, DL-laktidból, mezo-laktidból, alkilén-oxalátból, cikloalkilén-oxalátból, alkilén-szukcinátból, (β-hidroxi-butirátból), és a fenti vegyületek optikailag aktív izomerjeiből, racemátjaiból vagy kopolimeijeiből, valamint hasonló vegyületekből származnak. A hagyományos poliészterekhez hasonló egyéb heteroláncú polimerek is alkalmazhatók (például poliortoészterek, poliortokarbonátok és poliacetálok).

A poliésztereket előnyösen almasavval vagy citromsavval reagáltatva alakítjuk polikarboxilvegyületekkel.

Egy előnyös kiviteli alakban a poliésztert glutársavanhidriddel reagáltatva részlegesen látjuk el sav végcsoporttal. Egy másik előnyös kiviteli alakban a poliésztert glutársavanhidriddel reagáltatva teljes mértékben sav végcsoporttal látjuk el. Előnyösen a poliészterben az átlagos polimerizációs fok 10 és 300 közötti, még előnyösebben 20 és 50 közötti.

A találmány szerinti ionos molekuláris konjugátumokat előnyösen polikarbonsav végcsoportokkal ellátott poliészterekből állítjuk elő, amelyeket legalább egy effektív ionogén amincsoportot tartalmazó egybázisú vagy több-bázisú, biológiailag aktív polipeptidekkel konjugálunk. Alternatív módon bármely poliészter alkalmazható a találmány szerinti ionos molekuláris konjugátum előállítására, feltéve, ha azt előkezeljük egy megfelelő bázissal, például nátrium-hidroxiddal. Továbbá bármely sav-stabil peptid alkalmazható, például növekedési hormont felszabadító peptid (GHRP), luteinizáló hormont felszabadító hormon (LHRH), szomatosztatin, bombezin, gasztrinfelszabadító peptid (GRP), kalcitonin, bradikinin, galanin, melanocitastimuláló hormon (MSH), növekedési hormont felszabadító faktor (GRF), amilin, tachikininek, szekretin, paratiroid hormon (PTH), enkafelin, endotelin, kalcitonin gént felszabadító peptid (CGRP), neuromedinek, paratiroid hormonhoz hasonló protein (PTHrP), glukagon, neurotenzin, adrenokortikotróp hormon (ACTH), YY peptid (PYY), glukagonfelszabadító peptid (GLP), vazoaktív intesztinális peptid (VIP), hipofízis adenilátcikláz aktiváló peptid (PACAP), motilin, P anyag, Y neuropeptid (NPY), TSH és ezek analógjai és fragmentumai. Az ilyen ionos molekuláris konjugátumokból azok biológiailag aktív komponensei in vivő előre meghatározott sebességgel tudnak felszabadulni, amelyet a kémiai szerkezet, a móltömeg és a konjugátum mindkét komponensének pKa-értéke határoz meg. A hatóanyag szabaddá válásának mechanizmusa abból áll, hogy az oldhatatlan konjugátum vízben oldódó komponensekké alakul, részben a hidrofób poliészter hidrolízise által. így a biológiailag aktív polipeptid felszabadulása egymástól függetlenül fokozódik (a) a biológiailag aktív polipeptid és a poliészter pKaértéke közötti különbség csökkenésével, (b) a poliészterlánc kémiai reaktivitásával, amelyet a karbonil nukleofilicitása tükröz, (c) a poliészter sűrűségének csökkenésével, mivel az az üvegesedési hőmérséklettel és a csökkent kristályosodási képességgel van összefüggésben és (d) a mátrix hidrofilicitásának növekedésével.

HU 220 137 Β

Az előnyös kiviteli alakokban a polipeptid az ionos molekuláris konjugátum teljes tömegének 1-50 tömeg%-át teszi ki, és a kompozícióban lévő polipeptidnek előnyösen több mint 85 tömeg%-a, még előnyösebben 95 tömeg%-a és még előnyösebben 99 tömeg%-a ionosán kapcsolódik a poliészterhez; az ionos molekuláris konjugátum poliészterkomponensének viszkozitása körülbelül 0,05-körülbelül 0,7 dl/g kloroformban, és a poliészter átlagos móltömege körülbelül 1200-40 000.

A találmány szerinti polimer ionos molekuláris konjugátumokból könnyen készíthetők injektálható mikrogömbök vagy mikrorészecskék, vagy implantálható filmek vagy pálcikák olyan eljárások alkalmazása nélkül, amelyek többfázisú emulziók vagy nemvizes kétfázisú rendszerek alkalmazásával járnának. A mikrorészecskéket előnyösen úgy állítjuk elő, hogy

a) a kompozíciót aprotikus, vízzel elegyedő, szerves oldószerben oldjuk;

b) a szerves oldószert vízzel elegyítjük; és

c) a vízből izoláljuk a mikrorészecskéket.

Az előnyös kiviteli alakokban a szerves oldószert aceton, acetonitril, tetrahidrofurán, dimetil-formamid és dimetoxi-etilénglikol közül választjuk.

Az előnyös kiviteli alakokban a poliészter/polipeptid ionos molekuláris konjugátumokból legalább 20 napon keresztül, még előnyösebben egészen 95 napon át, de nem kevesebb mint 7 napon át tud a biológiailag aktív polipeptid gyógyászatilag hatásos dózisa in vivő felszabadulni. Más előnyös kiviteli alakokban a gyógyászatilag hatásos ionos molekuláris konjugátumból a felszabadulás lényegében egyfázisú.

A találmány szerinti nyújtott hatású készítményeket előnyösen úgy állítjuk elő, hogy

a) veszünk egy szabad karboxilcsoportokat tartalmazó poliésztert, és egy biológiailag aktív polipeptidet, amely legalább egy effektív ionogén amint tartalmaz, és

b) ionosán konjugáljuk a poliésztert a polipeptiddel, így ionos molekuláris konjugátumot kapunk, amelyben a jelen lévő polipeptidnek legalább 85 tömeg%-a ionosán kötődik a poliészterhez.

Poliészterként olyan vegyületet alkalmazhatunk, amely vagy eredetileg is elegendő szabad karboxilcsoportot tartalmaz, vagy ha ilyen csoportokat nem tartalmaz elegendő számban a kívánt peptid kapcsolásához, akkor a poliésztert

1. reagáltathatjuk például almasavval vagy citromsavval, észterezéssel vagy fúnkcióscsoport-kicserélődéssel, vagy

2. savcsoportokkal láthatjuk el, például glutársavanhidriddel, vagy

3. a poliésztert bázissal, például nátrium-hidroxiddal kezelhetjük, és így szabaddá tehetjük a savcsoportokat.

Végül a poliészter/polipeptid ionos molekuláris konjugátumot implantálható filmmé vagy pálcikává alakíthatjuk, vagy injektálható mikrogömböt vagy mikrorészecskét készíthetünk belőle, amelyekből a polipeptid in vivő felszabadulhat.

A poliésztert előnyösen úgy szintetizáljuk, hogy egy vagy több hidroxisav, például glikolsav vagy tejsav direkt kondenzációját katalizáljuk vagy autokatalizáljuk meghatározott koncentrációjú polikarboxil-hidroxisav, például almasav vagy citromsav jelenlétében. Az így képződött poliészterek savvégződéssel ellátott hidroxil végcsoportokkal rendelkeznek, amelyek előnyösen részlegesen vagy teljes mértékben sav végcsoportokkal vannak ellátva.

A poliésztereket úgy is előállíthatjuk, hogy katalizáljuk a laktonok gyűrűfelnyitásos polimerizációját, vagy a ciklusos monomereket, például ε-kaprolaktont, p-dioxanont, trimetilén-karbonátot, l,5-dioxepán-2-ont vagy l,4-dioxepán-2-ont polimerizálunk lánciniciátor, például egy hidroxi-polikarbonsav jelenlétében.

Az előállítás egy másik módja szerint egy hidroxisavat ciklusos dimerrel reagáltatunk, majd a nyílt láncú rendszert polikarbonsav jelenlétében kondenzáljuk.

Egy újabb szintetikus eljárás szerint egy szerves polikarbonsavat egy előre elkészített poliészterrel reagáltatunk.

A fent említett előnyös kiviteli alakokban a sav végcsoporttal ellátott poliészterben a karboxil/hidroxil végcsoportok aránya 1-nél nagyobb, és a végtelenhez közelít (azaz az összes hidroxilcsoportot elimináljuk), az átlagos polimerizációs fok 10 és 300 közötti, a különösen előnyös kiviteli alakokban 20 és 50 közötti.

Alternatív módon a poliésztert egy bázissal, például nátrium-hidroxiddal végzett kezeléssel tesszük képessé ionos molekuláris konjugátum képzésére egy biológiailag aktív polipeptiddel. A poliészter/polipeptid ionos molekuláris konjugátumot előnyösen a poliészter, például szabad formában lévő poliészter és a polipeptid, például szabad formában lévő polipeptid közötti közvetlen kölcsönhatással állítjuk elő megfelelő cseppfolyós közegben. Más előnyös kiviteli alakokban megfelelő oldószer a konjugátum előállítására az aprotikus oldószerek [például aceton, tetrahidrofurán (THF) vagy etilénglikol-dimetil-éter] és a peptid megfelelő oldószere (például víz) olyan arányú elegye, amelyben a két rendszer egymással elegyedik. A polipeptid előnyösen egy pKa>3,5 értékkel rendelkező monokarbonsav sója. A polipeptid előnyösen legalább egy effektív ionogén amincsoportot tartalmaz.

Az előnyös kiviteli alakokban a polipeptid 1-50 tömeg%-át, és előnyösen 10-20 tömeg%-át teszi ki a poliészter/polipeptid ionos molekuláris konjugátumnak. Az előnyös kiviteli alakokban a poliészter hozzáférhető karboxilcsoportjai részlegesen semlegesítve vannak alkálifémionokkal vagy szerves bázisokkal. Egy másik előnyös kiviteli alakban a lúgos kezelés a poliészter láncának disszociálódását és alacsonyabb móltömegű kötőhelyek képződését eredményezi.

Polipeptid alatt proteint, peptidet, oligopeptidet vagy szintetikus oligopeptidet értünk.

Polikarbonsav alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek egynél több karboxilcsoportot tartalmaznak, ilyenek például az almasav és citromsav.

Átlagos polimerizációs fok alatt az ismétlődő monomer szekvenciák számát értjük.

HU 220 137 Β

Effektív ionogén amin alatt olyan polipeptidet értünk, amely legalább egy olyan amincsoportot tartalmaz, amely az uralkodó körülmények között képes iont képezni.

Savvégződéssel ellátott alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek savterminálissal rendelkeznek.

Részlegesen savvégződéssel ellátott alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek hidroxil végcsoportjainak 1-99%-át savcsoport helyettesíti.

Teljesen savvégződéssel ellátott alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek hidroxil-végcsoportjainak több mint 99,9%-át savcsoport helyettesíti.

Hidroxisavak alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek hidroxil- és karboxilcsoportokat tartalmaznak.

Monokarboxi-hidroxisav alatt olyan szerves savakat értünk, amelyek egy karboxilcsoportot és egy vagy több hidroxilcsoportot tartalmaznak.

Polikarboxi-hidroxisav alatt olyan hidroxisavakat értünk, amelyek egynél több karboxilcsoportot tartalmaznak.

Szerves behúzószer alatt olyan szerves folyadékokat értünk, amelyek vízzel együtt desztillálnak.

Biológiailag aktív alatt olyan molekulákat értünk, amelyek biológiai folyamatokban vesznek részt vagy azokra hatnak.

Aciklizálás alatt olyan kémiai reakciót értünk, amely gyűrűnyitással megy végbe.

Polikondenzáció alatt poliészterképződést értünk két vagy több molekula kondenzációjával.

A találmány új gyógyászati készítményre vonatkozik, amelyben egy biokompatibilis, biológiailag lebontható poliészter kémiailag kötődik oligopeptidekhez, polipeptidekhez, peptidekhez és/vagy proteinekhez homogén, ionos vegyületként. A különböző móltömegű poliészterek kémiai kötése a gyógyászatilag hatásos vegyületekhez lehetővé teszi a készítmény kémiai jellemzőinek pontosabb szabályozását, hogy a biológiailag aktív polipeptidmolekula szabályozott, egyfázisú in vivő szabaddá válása követelményeinek jobban megfeleljen. Ezenkívül a találmány szerinti készítményeket könnyű úgy optimalizálni, hogy megfelelő funkciós tulajdonságokkal rendelkezzenek a gyógyászatilag hatásos polipeptid nagyobb terheléséhez.

A találmány további jellemzői és előnyei az előnyös kiviteli alakok részletes leírásából az alábbiakban kitűnnek.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábrán szemléltetjük a polikarbonsawégződéssel ellátott, laktid/glikolid (almasav típusú) kopolimer izomereket.

A 2. ábrán egy ionos molekuláris konjugátum látható, amely a laktid/glikolid (almasav típusú) kopolimer és a Somatuline (BIM-23014) közötti kémiai kölcsönhatásokat szemlélteti.

A 3. ábra egy grafikon, amely az ionos molekuláris konjugátumból 37 °C-on 28 nap alatt PBS-pufferben felszabaduló peptid százalékos mennyiségét mutatja.

Az előnyös kiviteli alakokat az alábbiakban ismertetjük.

Szintézis

A találmány szerinti, biológiailag degradálható vagy abszorbeálódó poliésztereket úgy szerkesztjük meg az alkotó monomerek, komonomerek vagy komerek megfelelő megválasztásával, és ezáltal a meghatározott összetételű és móltömegű láncok kialakításával, hogy a kívánt kémiai reaktivitással rendelkezzenek, amely a lánc szabályozott hidrolizálhatóságát biztosítja, és maximális kötőkapacitást mutassanak az oligopeptidekhez, polipeptidekhez vagy proteinekhez, amelyek fiziológiás pH-η nettó pozitív töltéssel rendelkeznek, (lásd például 2. ábrát).

A találmány szerinti készítmények előállítására szokásos módon háromlépéses, szintetikus tervet készítünk, a lépések az alábbiak:

1. polikarbonsavvégződéssel ellátott poliészterek szintézise,

2. poliészter/polipeptid ionos konjugátum szintézise a polikarbonsavvégződéssel ellátott poliészterek (vagy bázissal kezelt poliészterek) és a biológiailag aktív polipeptidek közötti ionos kölcsönhatás révén, és

3. az ionos konjugátumok átalakítása implantátumokká, pálcikákká, mikrogömbökké vagy mikrorészecskékké, amelyekből a hatóanyag in vivő legalább 7 napon keresztül szabadul fel.

1. Polikarbonsawéggel ellátott poliészterek szintézise

A találmány szerinti polikarbonsawéggel ellátott poliészterláncokat különféle eljárásokkal állíthatjuk elő, így például egy 2-hidroxisav és egy polikarbonsav típusú szerves sav direkt kondenzálásával, aciklizált termékek lépésenkénti polimerizálásával, egy lakton vagy egy laktonelegy gyűrűfelnyitó polimerizálásával, vagy egy polikarbonsav típusú szerves sav előre kialakított nagy móltömegű poliészterekkel való funkcionális kicserélődésével (lásd 1. ábra). A polikarbonsawéggel ellátott poliészterek szintézisét a fenti módszerekkel az alábbiakban ismertetjük.

Egy optikailag aktív és/vagy inaktív formában lévő 2-hidroxisav és egy előre meghatározott mennyiségű, polikarbonsav típusú szerves sav direkt kondenzálását szervetlen vagy szerves fémkatalizátor jelenlétében vagy a nélkül, így például glikolsav, DL-tejsav és DLalmasav kondenzálását általában úgy végezzük, hogy a monokarboxi-hidroxisavat vagy két vagy több monokarboxi-hidroxisav elegyét a polikarboxi-hidroxisav egy frakciójának jelenlétében üvegreaktorban melegítjük, amely száraz nitrogén folyamatos áramoltatását és a tömeg keverését biztosító eszközökkel van ellátva (IA. típusú poliészter, I. táblázat). A polikondenzációt tipikusan 150-170 °C-on, 4-72 órán keresztül játszatjuk le. A rekacióelegy keverését mágneses keverővei vagy poliésztertömegen keresztül nitrogéngáz átbuborékoltatásával biztosíthatjuk. A polimerizációt addig folytatjuk, amíg a kívánt átlagos móltömeget (amelyet az oldat viszkozitásával határozunk meg) és/vagy savszámot (amelyet végcsoporttitrálással határozunk meg) elérjük. A poliészter analízisét végcsoporttitrálással az alábbiak szerint végezzük. 300-500 mg poliésztermintát pontosan lemérünk, és minimális mennyiségű (10-30 ml)

HU 220 137 Β acetonban oldjuk. Az oldódás után az oldatot 100 ml-re hígítjuk benzil-alkohollal (Mallinckrodt, analitikai reagens), és halvány rózsaszín végpont eléréséig (fenolftalein) titráljuk kálium-hidroxiddal benzil-alkoholos oldatban (HCl-standarddal normalizálva). A mintára fogyott lúgoldat térfogatát (AVs) az oldószeres vakra fogyott lúgoldat térfogatával (AVo) összehasonlítva határozzuk meg a poliészter savszámát az alábbi képlet segítségével :

Minta tömege (mg)

Savszam=[AVs(ml)-AVo(ml)] χ bázis normalizálása

A polimerizáció befejeztével a poliésztert elválasztjuk, és a vízoldható vagy szolubilizálható kis móltömegű láncok eltávolítása céljából vízzel vagy híg, vizes nátrium-hidroxid-oldattal extraháljuk egy megfelelő szerves oldatból.

A poliészterek analízisét GPC-vel az alábbiak szerint hajtottuk végre. A poliészter átlagos molekulatömegét (MW) GPC-vel határoztuk meg Waters Model 6000 oldószerszállító szivattyút és egy Dynamax (Rainin) modell UV-D detektort alkalmazva. A futtatásokat tetrahidrofiiránnal (Burdick és Jackson, UV-tisztaságú) haj5 tottuk végre Jordin Gél DVB 1000 Á, 50 cmx 10 mm oszlop (Jordi Associates) alkalmazásával, 1,2 ml/perc átfolyási sebességgel, 25 °C-on. A csúcsot 220 nm-nél és 1,0 AUFS-nél detektáltuk. Az oszlopot keskeny sávú polisztirol referenciastandardok alkalmazásával kalib10 ráltuk (Polysciences Inc.), amelyek móltömege 400, 9200 és 25 000.

A közvetlen kondenzációs eljárás módosítása egy szerves behúzószer és egy kationos ioncserélő gyanta mint kondenzációs katalizátor alkalmazásával jár (lásd 15 I. táblázat, IB. típusú poliészter). Ebben az eljárásban egy szűrést és egy bepárlási lépést kell végezni a katalizátor, illetve a behúzószer eltávolítására. A fenti eljárással előállított poliészterek jellegzetes példáit és jellemző analitikai adatait az I. táblázatban ismertetjük.

I. táblázat

Direkt kondenzációs eljárással előállított poliészterek IA. típusú poliészterek

Polimer száma	Töltet	Polimerizációs körülmények	Savszám	Hinh	Tg (“O*
1.	L-Tejsav (88%) Glikolsav Citromsav	35,7 g (0,349 mol/l) 4,65 g (0,612 mol/l) 1,75 g (0,0091 mol/l)	100 °C/0,7 óra 165 °C/17,5 óra	563	0,24	11
2.	L-tejsav (88%) Glikolsav Almasav	25,6 g (0,25 mol/l) 19,2 g (0,25 mol/l) 1,5 g (0,011 mol/l)	165 °C/22 óra	820	0,14	27

I. táblázat folytatása IB. típusú poliészterek

Polimer száma	Töltet Polimerizációs körülmények	Savszám	Hinh	Tg (°Q*
3.	L-Tejsav (88%) 25,6 g (0,25 mol/l) Glikolsav 19,2 g (0,25 mol/l) Citromsav 2,13 g (0,01 mol/l) Amberlyst 15 gyöngykatalizátor 0,5 g Toluol 150 ml	132 °C/53 óra Dean-Stark-csapda alkalmazása, dekantálás, acetonban szűrés, szárítás, vízzel mosás, vákuumban szárítás	842	0,11	15
4.	L-Tejsav (88%) 25,6 g (0,25 mol/l) Glikolsav 19,2 g (0,25 mol/l) Almasav 1,5 g (0,011 mol/l) Amberlyst Toluol 100 ml	132 °C/68óra Dean-Stark-csapda alkalmazása, dekantálás, szűrés, szárítás, vízzel mosás és vákuumban szárítás	1421	0,20	28

* Differenciálletapogató kaloriméterrel (TA 2100 DSC) meghatározva, 2-10 mg minta, 10 °C/perc melegítési sebesség alkalmazásával, nitrogénatmoszférában

Az aciklizált termékek lépcsős növekedésű polimerizációja, amikor egy hidroxisavat a ciklusos dimerrel reagáltatunk, majd a kapott nyílt láncú rendszert kondenzáljuk meghatározott mennyiségű polikarbonsav jelenlétében megfelelő kondenzálókatalizátor, például glikolsav, L-laktid vagy DL-almasav jelenlétében vagy a nélkül, lényegében ugyanaz, mint a fent ismertetett kondenzációs eljárás, azzal az eltéréssel, hogy ebben egy monokarboxi-hidroxisav, egy másik hidroxisav ciklusos dimerje és egy hidroxi-polikarbonsav elegyét alkalmazzuk. A fenti eljárással előállított poliészterek példáit, és a jellegzetes analitikai adatokat a II. táblázatban ismertetjük. Ha a ciklusos dimert vízzel előkezeljük, a rendszert egyszerű lépcsős növekedésű polimerizációként kezeljük.

HU 220 137 Β

II. táblázat

Aciklizált termékek lépcsős polimerizációja II. típusú poliészterek

Polimer száma	Töltet	Polimerizációs körülmények	Savszám	Oinh	Tg (°C)*
1.	L-Laktid monomer 10,0 g (0,07 mol/1) Glikolsav 10,7 g (0,14 mol/1) Almasav 0,79 g (0,0061 mol/1)	160 °C/29 óra	1200	0,21	20
2.	L-Laktid monomer 20,0 g (0,139 mol/1) Glikolsav 7,1 g (0,093 mol/1) Almasav 1,01 g (0,0075 mol/1)	25 °C-155 °C/l,5óra 155 °C/70 óra DCM-ben oldás, vízzel mosás, és vákuumban szárítás	1800	0,13	27

* Differcnciálletapogató kaloriméterrel (TA 2100 DSC) meghatározva, 2-10 mg minta, 10 °C/perc melegítési sebesség alkalmazásával, nitrogénatmoszférában.

Egy lakton vagy laktonelegy gyűrűfelnyitásos polimerizációját előre meghatározott koncentrációjú hidroxi-polikarbonsav mint lánciniciátor és katalitikus mennyiségű szerves fémkatalizátor jelenlétében, például L-laktid, glikolid és DL-almasav elegyében, ón(II)oktoát jelenlétében úgy hajtjuk végre, hogy vízmentes, gyűrűs monomereket vagy gyűrűs monomerek elegyét, hidroxi-polikarbonsavat és nyomnyi mennyiségű ón(II)oktoátot (0,33 mol/1 koncentrációjú toluolos oldat formájában) alkalmazunk, amelyeket száraz, oxigénmentes atmoszférában mágneses vagy mechanikus keverővei felszerelt üvegreaktorba viszünk. A polimerizációs reakciót nitrogén alatt végezzük, megfelelő melegítést alkalmazva, amíg a kívánt móltömeget eléijük (amelyet az oldat viszkozitásaként határozunk meg). A polimerizáció befejeztével a hőmérsékletet csökkentjük, és a reagálatlan monomert vákuumban desztilláljuk. A poliésztertömeget ezután lehűtjük, és a vízben oldható alacsony móltömegű frakciókat egy megfelelő, szerves oldatból alacsony hőmérsékleten végrehajtott extrakcióval eltávolítjuk. Az oldatot ezután szárítjuk, és az oldószert eltávolítjuk. Ezután belső viszkozitásként, meghatározzuk a móltömeget, és a savszámot végcsoporttitrálással határozzuk meg. A fenti eljárással előállított poliészterek tipikus példáit és a termékek analitikai adatait a III. táblázatban foglaljuk össze.

III. táblázat

Gyűrűfelnyitásos polimerizációval előállított poliészterek III. típusú poliészterek

Polimer száma	Töltet	Polimerizációs körülmények	Savszám	^linh	Tg (°C)*
1.	Glikolid L-Laktid Almasav	3,22 g 10,7 g 0,79 g	(0,028 mol/1) (0,14 mol/1) (0,0061 mol/1)	120 °C/0,5 óra 150 °C/6 óra 120 °C/11 óra	2150	0,79**	38
2.	Glikolid D,L-Laktid Almasav	2,84 g 20,0 g 0,876 g	(0,0245 mol/1) (0,139 mol/1) (0,00541 mol/1)	120 °C/0,5 óra 180 °C/2,5 óra 130 °C/15 óra	1206	0,08	26
3.	Glikolid D,L-Laktid Almasav	2,84 g 20,0 g 1,256	(0,0345 mol/1) (0,139 mol/1) (0,00654 mol/1)	155 °C/1 óra 185 °C/2,5 óra 190 °C/2,5 óra 160 °C/13 óra	937	0,10	27
4.	Glikolid D,L-Laktid Almasav	8,06 g 10,0 g 0,744 g	(0,0694 mol/1) (0,0694 mol/1) (0,00555 mol/1)	180 °C/1 óra 185 °C/2 óra 195 °C/7 óra 120 °C/9 óra	970	0,26	23
5.	Glikolid D,L-Laktid 1,6-hexándiol	8,06 g 10,0 g 0,656 g	(0,0694 mol/1) (0,0694 mol/1) (0,0555 mol/1)	150 °C/5 óra 185 °C/4 óra 150 °C/1,5 óra 120 °C/3 óra	10 138	0,39	30

* DifFerenciálletapogató kaloriméterrel (TA 2100 DSC) meghatározva, 2 -10 mg minta, 10 °C/perc melegítési sebesség alkalmazásával, nitrogénatmoszférában ** Hexafluor-izopropanolban

HU 220 137 Β

Az alacsony móltömegű, COOH/OH<1 arányú poliészterek előállítása céljából polikarboxi- vagy hidroxitöbb bázisú szerves savak funkcionális kicserélődése az előre kialakított nagy móltömegű poliészterekkel - amelyekben a COOH/OH arány 1 és látszólag 0 között váltó- 5 zik - előnyösen egy szerves fémkatalizátor jelenlétében, például egy 5000-nél nagyobb molekulatömegű és COOH/OH>1 arányú, 85/15 laktid/glikolid kopolimer és DL-almasav ömlesztéses reakcióját ón-oktoát jelenlétében úgy játszatjuk le, hogy a nagy móltömegű poliész- 10 tért előre meghatározott mennyiségű polikarbonsavval vagy hidroxi-polikarbonsavval melegítjük nyomnyi mennyiségű szerves fémkatalizátor, például ón-oktoát jelenlétében. A reaktánsokat 150 °C feletti hőmérsékleten, száraz nitrogénatmoszférában melegítjük intenzív 15 keverés közben, amíg a funkcionális kicserélődés befejeződik (amelyet a maradék reagálatlan polikarbonsavak elfogyásával mérünk). Ténylegesen ezt úgy határozzuk meg, hogy nyomon követjük a keletkező alacsony móltömegű poliészter móltömegét (az oldat viszkozitásának mérésével, kapilláriás viszkozimétert alkalmazva 28 °Con), és az elreagálatlan polikarbonsav jelenlétét. Ezt úgy hajtjuk végre, hogy a poliésztermintát vizes extrakciónak vetjük alá, és az extraktumot nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással analizáljuk. A maradék monomer, dimer és polikarbonsav koncentrációkat HPLCvel határozzuk meg, Waters Model 6000 oldószerszállító szivattyút és Dynamax (Rainin) modell UV-D detektort (205 nm, 1,0 AUFS) alkalmazva. A futtatásokat 0,025 n Na₂HPO₄ puffer (pH 3,5) alkalmazásával végezzük (izokratikus átfolyási sebesség 1,0 ml/perc), Nukleosil C18 oszlopot (5 pm, 25 cmx4,6 mm) alkalmazva.

A kívánt poliésztert izoláljuk, és a fentiekben, a gyűrűfelnyitásos polimerizációra ismertetett módon tisztítjuk. A fenti eljárással előállított poliészterek példáit és a vonatkozó analitikai adatokat a IV. táblázat tartalmazza.

IV. táblázat

Funkcionális kicserélődéssel előállított poliészterek IV. típusú poliészterek

Polimer száma	Töltet	Polimerizációs körülmények	Savszám	^linh
1.	Boehringer A001 8g (50/50 dilaktid/glikolid) Citromsav** 0,8 g (0,00417 mol/1)	150 °C/5 óra	670	0,26

* Differenciálletapogató kalorimctcrrel(TA 2100 DSC) meghatározva, 2-10 mg minta, 10°C/perc melegítési sebesség alkalmazásával, nitrogénatmoszférában ** Katalitikus mennyiségű ón(II)-oktoát (2 csepp 0,33 mol/1 koncentrációjú oldat, körülbelül 0,03 nmol)

A találmány szerint alkalmazott poliészterek szintézisére megfelelő monomerek például az L-tejsav, DL-tejsav, ε-kaprolakton, p-dioxanon, ε-kapronsav, trimetilénkarbonát, l,5-dioxepán-2-on, l,4-dioxepán-2-on, glikolid és mezo-laktid. A megfelelő polikarbonsavlánc-iniciátorok és/vagy -lánc-módosítók közé tartozik például az almasav és a citromsav.

2. Poliészter/polipeptid ionos konjugátumok szintézise a polikarbonsawéggel ellátott poliészterek és a biológiailag aktív polipeptidek közötti ionos kölcsönhatás révén

A fentiekben ismertetett, polikarbonsawéggel ellátott, biológiailag lebontható poliésztereket hozzáférhető, effektív ionogén amincsoportokat tartalmazó monovagy polikarbonsav oligopeptidekkel, polipeptidekkel vagy proteinekkel alkotott ionos molekuláris konjugátumok előállítására alkalmazzuk (lásd 2. ábrát). Ezenkívül bármelyik poliésztert alkalmassá tehetjük egy polipeptiddel ionos molekuláris konjugátum képzésére, hogyha azt egy bázissal, például 0,1 n nátrium-hidroxiddal kezeljük. Az ilyen kezelés a poliészter savcsoportjait több helyen is szabaddá teszi a kationos polipeptiddel való ionos kölcsönhatás számára.

A fenti konjugátumok kialakítását a komponensek közötti közvetlen molekuláris kölcsönhatással érjük el megfelelő oldószerben, a poliészter szervetlen savval történő előkezelésével vagy a nélkül, amelynek célja a poliészter kötődési sebességének maximalizálása a bázikus hatóanyaghoz. Mint fentebb említettük, az ionos konjugátum komponensei közötti ionos kölcsönhatás növekedik a pKa-értékek közötti különbséggel.

A poliésztert egy megfelelő aprotikus oldószerben oldjuk 2-20 vegyes% koncentrációban. így az oldószer a poliésztert oldja, de a vízzel is részben elegyedik. A fenti célra megfelelő oldószer például a tetrahidrofúrán, aceton és az etilénglikol-dimetil-éter. Ehhez az oldathoz egy bázis, például nátrium-, kálium-, vagy ammónium-hidroxid vagy -karbonát vizes oldatát adjuk a poliészter kötődési kapacitásának maximalizálására. Általában a hozzáadott bázis mennyisége az alkalmazandó bázikus peptid ellen-anion koncentrációja által képviselt sav mennyiségének felel meg.

A poliészter-bázis kombinációt rövid ideig keverjük, majd hozzáadjuk a peptid vagy peptid sójának vizes oldatát, a peptid/poliészter koncentráció 2-50 tömeg% (peptid/poliészter). A kapott elegyet legfeljebb 3 órán keresztül keverjük, majd az oldószereket eltávolítjuk, és a terméket vákuumban szárítjuk. A kapott anyagot ezután a dózisformák kialakítása céljából további feldolgozásnak vethetjük alá. A kapott gyógyászati készítmények kémiailag egységes készítmények, amelyek teljesen ionos molekuláris konjugátumokat tar7

HU 220 137 Β talmaznak, és teljesen mentesek a hatóanyag mikro- tott ionos molekuláris konjugátumok példáit és jellegzeszkopikusan vagy makroszkopikusan diszpergált részei- tes analitikai adatait az V. táblázat tartalmazza, tői a biológiailag lebontható mátrixban. Az így előállíV. táblázat

Peptidek ionos molekuláris konjugátumai¹

Alkalmazott polimer	Peptid^{I. 2}	Felvitel (%)	Retenció³ (%)
1.	50/50 dilaktid/glikolid	I	10	47
	(kereskedelmi)	II	20	25
	savszám: 22 000	III	20	73
	hi„h=0>53			48,5
2.	Poli(L-laktid)	I	10	62
	(kereskedelmi) átlagos móltömeg: 2000 savszám: 850	II	20	40
3.	Poli(L-laktíd) (kereskedelmi) átlagos móltömeg: 50 000 savszám: 2100	I	10	54
4.	48/48/4 poli(D,L-laktid/glikolid/l,6-hexándiol) (III. módszer) savszám: 10 138 n_inh=o,39	I	20	43
5.	49/49/2 poli(L-tejsav/	I	10	100
	glikolsav/almasav)	I	20	99
	(IB. típus)	I	30	95,5
	savszám: 1400	I	40	96,0
	úinh = 0-20	I	50	99,8
		II	20	99,8
		III	20	77,5
6.	83,3/14,7/2 poli(L-tejsav/glikolsav/citromsav) (IA. típus) savszám: 563 binh = 0>24	I	20	96
7.	49/49/2 poli(D,L-laktid/glikolid/almasav)	I	20	96
	(II. típus) savszám: 1200 0inh = 0.21	III	20	73,9
8.	48/48/4 poli(D,L-laktid/glikolid/citromsav) (III. típus) savszám: 589 n,„h=0,22	I	10	90

¹A konjugátumokat minden esetben a leírásban ismertetett módon állítottuk elő, oldószerként acetont és bázisként nátrium-hidroxidot alkalmazva. Az összes peptidet acetátsó formájában alkalmaztuk.

² Peptidek:

I. B12M 21 003 D-Trp^é-LHRH (pGlu-His-Trp-Scr-Tyr-D-Trp-Lcu-Arg-Pro-Gly-NH₂) pKa=10,l;

II. BIM-23 014 (H₂N-P-D-Nal-Cys-Tyr-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂) pka=9,8;

III. BIM-26 226 (H₂N-D-F₅Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-OCH₃) pKa=8,0;

³ A %-os rctenciót úgy határozzuk meg, hogy a szárított poliészter/peptid ionos konjugátumot ionmentes vízzel mossuk, és a mosóoldatban HPLC-vel meghatározzuk az oldható peptid mennyiségét.

Felvitt peptid tömegc-Oldható peptid tömege %-os retenció= xl00%

Felvitt peptid tömege

HU 220 137 Β

3. Ionos konjugátumok átalakítása implantátumokká, pálcikákká mikrogömbökké vagy mikrorészecskékké, amelyekből a hatóanyag in vivő legalább 20 napon keresztül szabadul fel egyfázisú profillal

A találmány szerinti ionoskonjugátum-sókat átalakíthatjuk:

(A) steril injektálható mikrogömbökké (segédanyagként

0,1-10% szilárd, többértékű alkoholt alkalmazva, vagy a nélkül), amelyek 1-50 tömeg% polipeptidet tartalmaznak, amely lényegében egyfázisú profillal képes felszabadulni, és gyógyászati aktivitást 1-12 héten keresztül képes biztosítani;

(B) steril, implantálható filmekké, amelyeket öntéssel, préseléssel vagy extrudálással állítunk elő, gyógyászatilag elfogadható, inaktív adalékanyagokkal vagy a nélkül, és amelyek a fenti (A) részben ismertetetthez hasonló felszabadulási profilt képesek biztosítani, és (C) steril, injektálható pálcikákká, amelyeket extrudálással vagy préseléssel állítunk elő, és amelyek a fenti (A) részben ismertetetthez hasonló felszabadulási profilt képesek biztosítani.

In vitro felszabadulás vizsgálata A szárított és aprított ionoskonjugátum-anyagból mg-os mintákat 25 mm átmérőjű szcintillációs fiolába helyezünk. Minden egyes fiolába bemérünk 5 ml módosított PBS-puffert (PBS-puffer: 2,87 g Na₂HPO₄, 0,654 g NaH₂PO₄, 5,9 g NaCl, 0,5 g NaN₃ionmentes vízzel 1,0 literre töltve; pH 7,27), és a fiolákat Lab-Line Orbit Environ-Shakerbe helyezzük, és 120 fordulat/perc 37 °C-on rázatjuk. Meghatározott időközökben a fiolákat levesszük, dekantáljuk, és friss PBS-oldattal feltöltjük. A szabaddá vált peptid mennyiségét a dekantált PBS-oldatokból határozzuk meg HPLC-vel.

Peptid extrakciója az ionos konjugátumokból Az ionos molekuláris komjugátumból vett 50 mg mintákat 20 ml metilén-kloriddal elegyítjük. Az elegyet egymásután 50 ml, 20 ml és 20 ml 2 n ecetsavval extraháljuk. Az ecetsavas extraktumokat egyesítjük, és a peptidtartalmat nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) analizáljuk. A peptid analízisét HPLCvel az alábbiak szerint végezzük. A HPLC-t Waters Model M-45 oldószerszállító szivattyúval és EM Science MACS 700 detektorral határozzuk meg 220 nmen, 1,0 AUFS-sel. A peptideket Lichrospher (EM Separations) C18 oszlopon (100 Á, 5 pm, 25 cmx4,6 mm) futtatjuk, 30% acetonitril/0,1% TFA izokratikus eluens puffer alkalmazásával.

A VI. táblázatban részletesen ismertetjük az in vitro vizsgálat eredményeit, amelyből látható a 28 nap alatt felszabadult peptid mennyisége. 49/49/2=L-tejsav/glikolsav/almasav-D-Trp⁶-[LHRH] (8. példa), 49/49/2=Ltejsav/glikolsav/almasav-szomasztotatin tumor inhibitor analóg (9. példa) és 73,5/24,5/2 =poli(L-laktid)/glikolsav/almasav-D-Trp⁶-[LHRH] (10. példa) ionos molekuláris konjugátumok esetén. A fenti adatokat grafikusan a

3. ábrán mutatjuk be.

VI. táblázat

In vitro vizsgálati adatok

Vizsgálat napja	Felszabadult peptid az összes peptid százalékában
8. példa	9. példa	10. példa
1.	5,5%	12,5%	11%
7.	26,9%	21,3%	53%
14.	55,2%	47,3%	55%
17.	84,4%	72,2%	60%
21.	98,6%	82,5%	66%
24.	100%	98,2%	75%
28.	-	99,6%	-

Peptidek mennyiségének meghatározása az ionos konjugátumokban

A konjugátumtermékekben az ionos kötött peptidek mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy 10 mg mintát 5,7 ml 9:1 arányú aceton/0,1 mol/l vizes trifluor-ecetsav elegyben oldottunk. Az oldatokat 25 °C-on 15-24 órán keresztül rázattuk, majd 0,5 pm teflonszűrő patronokon átszűrtük. A szűrleteket ezután nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással (HPLC) analizáltuk peptidtartalomra. A peptidanalízist HPLC-vel az alábbi körülmények között végeztük: Millipore Model 717 Wisp Autosampler, Model 510 szivattyú és Model 486 UVdetektorkészlet 220 nm-nél. A peptideket Lichrospher (EM Separations) C18 oszlopon (25 cm χ 4,6 mm, 5 pm, 100 Á, 1,0 ml/perc átfolyási sebességgel futtattuk, izokratikus eluens rendszerként 35% acetonitril/0,14%-os nátrium-perklorát puffért alkalmazva. A peptidek menynyiségét a mintával kapott megfelelő csúcs alatti terület és egy beinjektált standard peptiddel kapott terület összehasonlításával határoztuk meg.

Alkalmazás

A találmány szerinti, savcsoportokat hordozó poliészter/polipeptid ionos konjugátumokat önmagukban vagy gyógyászatilag elfogadható közeggel kombinálva adhatjuk a kezelendő betegnek. Az adagolás célszerűen szubkután módon, intramuszkulárisan, parenterálisan, kúp formájában vagy nazálisán történhet, de egyéb adagolási módszer is választható a kezelendő betegségtől függően. A találmány szerinti gyógyászati készítményekben a találmány szerinti kompozíció koncentrációja különféle faktoroktól függ, többek között a beadandó dózis nagyságától és az adagolás módjától.

A találmányt közelebbről - a korlátozás szándéka nélkül - az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.

1. példa

Direkt kondenzációs eljárás - 50/50 arányú poli(D.L-tejsav-koglikolsav) kopolimer szintézise Amberlyst 15 katalizátorral

13,7 g (0,13 mól) 85%-os vizes elegy formájában lévő D,L-tejsavat 10 g (0,13 mól) glikolsavval elegyí9

HU 220 137 Β tünk egy mágneses keverővei, Dean-Stark-csapdával és vízhűtéses hűtővel felszerelt gömblombikban. Hozzáadunk 100 ml toluolt és 100 mg Amberlyst 15 gyöngyöt, és az elegyet nitrogénatmoszférában 72 órán keresztül visszafolyató hűtő alatt forraljuk, miközben az elegyből a vizet eltávolítjuk. Az elegyet lehűtjük, a toluolt a megszilárdult anyagról dekantáljuk, és a terméket 250 ml metilén-kloridban oldjuk. A metilén-kloridos oldatot 500 mg aktív szénnel (Darco) kezeljük, szüljük, és vákuumban, rotációs bepárlóval szárítjuk. A poliésztert nagyvákuumban (1 Hgmm), 40 °C-on tovább szárítva fehér port kapunk.

T)_jnh, (kloroformban)=0,3; savszám=2439; Tg=12 °C.

2. példa

Direkt kondenzációs eljárás - 49/49/2 arányú poli(L-tejsav-koglikolsav/citromsav) kopolimer szintézise Amberlyst 15 katalizátorral

A fentiekhez hasonló rendszert alkalmazva 25,6 g (0,25 mól) L-tejsavat (88%-os vizes elegy formájában) 19,2 g (0,25 mól) glikolsavval, 2,33 g (0,011 mól) citromsav-monohidráttal, 500 mg Amberlyst 15 gyönggyel és 150 ml toluollal elegyítünk egy gömblombikban. Az elegyet keverés közben 51 órán keresztül visszafolyató hűtő alatt forraljuk, miközben a vizet Dean-Stark-csapdával eltávolítjuk. A félszilárd termékről a toluolt dekantáljuk. A poliésztert 300 ml acetonban oldjuk, szüljük, és rotációs bepárlón szárítjuk. A szilárd poliésztert ezután újra feloldjuk metilén-kloridban, és 2 χ 150 ml vízzel mosva eltávolítjuk az oldható oligomereket. A szerves oldatot rotációs bepárlóval koncentráljuk, és a terméket vákuumban alaposan megszárítjuk. Fehér, szilárd anyagot kapunk (I. táblázat, IB. típusú poliészter, 4. számú polimer).

q_jnh (kloroformban)=0,ll; savszám=842; Tg=15 °C.

3. példa

Lépcsős polimerizációs eljárás - 73,5/24,5/2 arányú poli(L-laktid-koglikolsav/almasav) kopolimer szintézise almasavkatalízissel

150 ml-es, hengeres ampullában - amely levegőelzáróval van felszerelve - 20 g (0,139 mól) L-laktidot 7,1 g (0,093 mól) glikolsavval és 1,0 g (0,0075 mól) D,L-almasavval elegyítünk. Az elegyet a légelzáró bevezetésen keresztül nitrogén átbuborékoltatásával keverjük (100 ml/perc) és 100 perc alatt 25 °C-ról 155 °C-ra melegítjük. A reakcióelegyet 155 °C-on tartjuk 75 órán keresztül, és a polimerizációban keletkező vizet egy hideg csapdában távolítjuk el a reaktor kivezetési vonalán. 70 óra elteltével a reakcióelegyet 100 °C-ra hűtjük, és lehűtött, rozsdamentes acél szedőedénybe öntjük, ahol az megkeményedik. A szilárd poliésztert ezután metilén-kloridban oldjuk, és 2 χ 150 ml vízzel mosva eltávolítjuk az oldható oligomereket. A szerves oldatot rotációs bepárlóval koncentráljuk, és a terméket vákuumban alaposan szárítjuk. Fehér, szilárd anyagot kapunk (II. táblázat, II. típusú poliészter,

2. számú polimer).

q,_nh (kloroformban)=0,13; savszám=1800; Tg=27 °C.

4. példa

Gyűrűfelnyitásos polimerizációs eljárás - 75/25 arányú poli(L-laktid-koglikolid) kopolimer szintézise almasaviniciátorral

Mágneses keverővei felszerelt üvegampullába száraz nitrogén alatt 12,0 g (0,0833 mól) L-laktidot, 3,21 g (0,0277 mól) glikolidot, 0,3042 g (0,00227 mól) almasavat és 67 μΐ (0,022 mmol) 0,33 mol/1 koncentrációjú, toluolos oldott ón(II)-oktoát-oldat katalizátort helyezünk. A rendszert nitrogénnel átöblítjük, és vákuummal néhányszor leszívatjuk, majd az ampullát leforrasztjuk. A reaktánsokat ezután 140 °C-ra melegítjük, és az olvadékot 180 °C-on 1 órán, 190 °C-on 4,5 órán, 180 °C-on 12 órán és 150 °C-on 2 órán keresztül melegítjük. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hűtjük, a poliésztert újra 110 °C-on melegítjük körülbelül 1 órán keresztül 1 Hgmm-nél kisebb vákuumban, ezzel a monomert eltávolítjuk, majd újra szobahőmérsékletre hűtjük, cseppfolyós nitrogénnel a reakciót leállítjuk, a terméket izoláljuk, és vákuumban szárítjuk.

q_inh (kloroformban)=0,20; savszám=2560; Tg=39 °C.

5. példa

Gyűrűfelnyitásos polimerizációs eljárás = 50/50 arányú poli(D,L-lakod-koglikolid) kopolimer szintézise citromsaviniciátorral

10,0 g (0,0694 mól) D,L-laktidot 8,06 g (0,0694 mól) glikoliddal, 1,07 g (0,00555 mól) citromsavval és 84 μΐ (0,027 mmol) 0,33 mol/1 koncentrációjú, toluolos ón(II)-oktoát-oldat katalizátorral elegyítünk vízmentes nitrogénatmoszférában egy üvegampullában, amely mágneses keverőt tartalmaz, és az ampullát vákuumban leforrasztjuk. A reaktánsokat megolvasztjuk, és 180 °C-on 1 órán, 185 °C-on 2 órán, 195 °C-on 7 órán és 120 °C-on 9 órán keresztül melegítjük. A poliésztert szobahőmérsékletre hűtjük, a reakciót cseppfolyós nitrogénnel leállítjuk, a terméket izoláljuk, és szárítjuk.

η_ιη1ι (kloroformban)=0,26; savszám=970; Tg=23 °C.

6. példa

Gyűrűfelnyitásos polimerizációs eljárás - 50/50 arányú poli(D,L-laktid-koglikolid) kopolimer szintézise 1,6-hexándioiniciátorral

A fentiekhez hasonló rendszert alkalmazva, 10,0 g (0,0694 mól) D,L-laktidot, 8,06 g (0,0694 mól) glikolidot, 0,656 g (0,00555 mól) 1,6-hexándiolt és 84 μΐ (0,0278 mmol) 0,33 mol/1 koncentrációjú, toluolos ónoktoát-oldatot adunk vízmentes nitrogén alatt egy üvegampullába, amelyet ezután vákuumban leforrasztunk. A komponenseket 150 °C-on 0,5 órán, 185 °C-on 4 órán, 150 °C-on 1 órán és 120 °C-on 3 órán keresztül melegítjük. A kapott poliésztert kinyeijük és szárítjuk (lásd III. táblázat, III. típusú poliészter, 5. számú polimer). r|_inh (kloroformban)=0,39; savszám=10138; Tg=30 °C.

7. példa

Funkcionális kicserélödéses eljárás — karbonsavcsoportot tartalmazó 50/50 arányú poli(D,L-lakodkoglikolid) kopolimer szintézise

HU 220 137 Β

Üvegampullába száraz nitrogén alatt 8 g 50/50 arányú (D,L-laktid-koglikolid) kopolimert (Boehringer A001), 0,8 g (4,16 mmol) citromsavat és 2 csepp ónoktoátot adunk, majd az ampullát leforrasztjuk. Az elegyet 150 °C-on 4 órán keresztül melegítjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük, a reakciót cseppfolyós nitrogénnel leállítjuk, a terméket izoláljuk és szárítjuk (lásd IV. táblázat, IV. típusú poliészter, 1. számú polimer). r|_inh (kloroformban)=0,26; savszám=670; Tg=23 °C.

8. példa

49/49/2 arányú L-tejsav/glikolsav/almasav polimer (I. táblázat, 4. számú polimer) és D-Trp⁶-[LHRH] ionos molekuláris konjugátumának előállítása 500 mg 49/49/2 arányú L-tejsav/glikolsav/almasav polimert (amelyet direktkondenzációval állítottunk elő, móltömege 9500, savszáma 1420) 10 ml acetonban (Mallinckrodt analitikai reagens) oldunk. Hozzáadunk 1,14 ml 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatot, és az elegyet szobahőmérsékleten 15 percen keresztül keverjük. Hozzáadjuk 100 mg D-Trp⁶-[LHRH] (BIM-21003, I. peptid, bázistartalma 87%, acetáttartalma 7%) 1,0 ml vízzel készült oldatát, és az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keverjük. Az oldószereket ezután eltávolítjuk, először Rotovappal 40 °C-nál alacsonyabb hőmérsékleten, majd exszikkátorban 1 Hgmm alatti nyomáson szobahőmérsékleten 1 órán át tartva. A szárított, szilárd anyagot eldörzsöljük, és 100 ml ionmentes vízzel keverjük, majd szűréssel elválasztjuk. A vizes szűrletet HPLC-vel vizsgálva azt találtuk, hogy 1 mg-nál kevesebb oldható peptidet tartalmaz. A szilárd anyagot néhány napon keresztül vákuumban szárítva 540 mg fehér port kapunk. A port alkalmazzuk az in vitro vizsgálatban (lásd VI. táblázat, 8. példa szerinti vegyület).

9. példa

49/49/2 arányú L-tejsav/glikolsav/almasav polimer (I. táblázat, 4. számú polimer) és szomatosztatin/tumor inhibitor analóg ionos molekuláris konjugátumának előállítása

100 mg 49/49/2 arányú L-tejsav/glikolsav/almasav polimert (amelyet direktkondenzálással állítottunk elő, móltömege 9500, savszáma 1420) 2 ml acetonban (Mallinckrodt analitikai reagens) oldjuk. Hozzáadunk 0,32 ml 0,1 n nátrium-hidroxid-oldatot, és az elegyet szobahőmérsékleten 15 percen keresztül keveijük. Ezután hozzáadjuk 20 mg szomatosztatin/tumor inhibitor analóg (BIM-23014, II. peptid; bázistartalom 83%; acetáttartalom 9,8%) 1,2 ml vízzel készült oldatát, és az elegyet szobahőmérsékleten 1 órán keresztül keveijük. Az oldószereket ezután eltávolítjuk, először Rotovappal 40 °C alatti hőmérsékleten, majd exszikkátorban, szobahőmérsékleten 1 órán át 1 Hgmm-nél kisebb vákuumban szárítva. A szárított, szilárd anyagot eldörzsöljük, 20 ml ionmentes vízzel keverjük, és szűréssel elválasztjuk. A vizes szűrletet HPLC-vel vizsgálva azt találtuk, hogy 0,05 mg-nál kisebb az oldható peptidtartalom. A szilárd anyagot néhány napon keresztül vákuumban szárítva 106 mg fehér port kapunk. A port aprítjuk, és az in vitro felszabadulási vizsgálatban alkalmazzuk (VI. táblázat, 9. példa szerinti vegyület).

10. példa

73,5/24,5/2 arányú L-laktid/glikolsav/almasav polimer (II. táblázat, 2. számú polimer) és D-Trp⁶[LHRH] ionos molekuláris konjugátumának előállítása

800 mg 73,5/24,5/2 arányú L-laktid/glikolsav/almasav polimer (amelyet aciklizált termékek lépcsős polimerizációjával állítottunk elő, savszáma 1800) 16 ml acetonban oldunk. Hozzáadunk 2,8 ml 0,1 n nátriumhidroxid-oldatot, és az oldatot szobahőmérsékleten 20 percen keresztül keveijük. Hozzáadunk 200 mg DTrp⁶-[LHRH]-t (BIM-21003, bázistartalom 87%; acetáttartalom 7%) 2 ml vízben oldva, és az elegyet 90 percen keresztül keveijük. Az oldószereket eltávolítjuk, és a kapott szilárd anyagot ionmentes vízzel eldörzsöljük. A 8. példa szerint megvizsgálva kimutatható, hogy az oldható peptidsó 1%-nál kisebb mennyiségben van jelen. Az izolált szilárd anyagot vákuumban 4 napon keresztül szárítva 839 mg fehér port kapunk. A port aprítjuk, és az in vitro felszabadulási vizsgálatban vizsgáljuk (VI. táblázat, 10. példa szerinti vegyület).

11. példa

Peptidpolimer ionos konjugátum mikrorészecskék (1,50) előállítása 65/33/2 arányú L-laktid/glikolid/D,L-almasav poliészter alkalmazásával A poliésztert gyűrűfelnyitásos polimerizációval állítjuk elő a 4. példában leírtak szerint [móltömeg=4700; polidiszperzitás=l,3 (GPC-vel meghatározva Jordi Gél 50x1 cm-es, vegyes lineáris ágyas oszlopon, THFeluenssel, Wyatt Mini Dawn fényszórásdetektorral, dn/dc=0,05); savszám=1475 titrálással; Tg=42 °C] és 40 ml acetonban oldjuk. A savas csoportokat 2,0 ml eleggyel semlegesítjük, amely 20 ml Milli-Q vízben 0,5 g ΒΙΜ-23014-et (peptidtartalom 83,7%, acetáttartalom 11,5%) tartalmaz, az elegyet lassan, keverés közben adjuk a polimer oldathoz. A peptid hozzáadása közben további 40 ml acetont is adunk részletekben az elegyhez a kicsapódás elkerülése céljából. A tiszta, színtelen oldatot 1 órán keresztül keverjük, majd vákuumban szárazra pároljuk. A kapott fehér, szilárd anyagot 20 ml aceton és 2 ml Milli-Q víz elegyében feloldva tiszta oldatot kapunk. Ezt az oldatot egy 0,2 μ-os teflonszűrőn keresztül gyors keverés közben 500 ml Milli-Q vízbe injektáljuk 4 °C-on. A polimer/peptid komplex fázis azonnal kiválik apró részecskék formájában a vízzel való érintkezéskor. A szuszpenziót 4 °C-on 30 percen keresztül keverjük, a maradék acetont vákuumban eltávolítjuk, és a szilárd anyagokat centrifugálással elválasztjuk, 100 ml Milli-Q vízben újra szuszpendáljuk, majd újra centrifugáljuk. Az izolált, szilárd anyagokat liofilizálással szárítva 1530 mg fehér, szabadon folyó port kapunk. A részecskeméret 2-100 pm tartományba esik. Az ionos konjugátum Tg-je 53 °C. A maradék (nem kötött) peptidtartalom a vizes felülúszókban összesen 63 mg HPLC szerint. Az összes kiindulási peptidtartalmat az eleminitrogén-analízis alapján 19,9 tö11

HU 220 137 Β meg%-nak találtuk. A konjugátumból extrahálható peptid százalékos mennyisége 16,9 tömeg%, aceton/ /0,1 mol/1 TFA extrakciós rendszer alkalmazásával. így a kapott konjugátumban az ionos (extrahálható) jelleg 84,8%-a marad meg.

A fenti leírásból szakember számára nyilvánvalóak a találmány alapvető jellemzői. A találmány oltalmi körébe tartoznak mindazok a módosítások és különféle változtatások, amelyek a találmánnyal ekvivalens megoldásokat eredményeznek.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több szabad karboxilcsoportot tartalmazó poliészterből és azzal ionosán konjugált, legalább egy effektív ionogén amint tartalmazó, biológiailag aktív polipeptidből áll, ahol a készítményben lévő polipeptid legalább 50 tömeg%-a ionosán kapcsolódik a poliészterhez.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a poliészterben a karboxil/hidroxil arány 1-nél nagyobb.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a poliészter L-tejsavból, D-tejsavból, DLtejsavból, ε-kaprolaktonból, p-dioxanonból, ε-kapronsavból, alkilén-oxalátból, cikloalkilén-oxalátból, alkilén-szukcinátból, β-hidroxi-butirátból szubsztituált vagy szubsztituálatlan trimetilén-karbonátból, 1,5-dioxepán-2-onból, l,4-dioxepán-2-onból, glikolidból, glikolsavból, L-laktidból, D-laktidból, DL-laktidból, mezo-lakodból, és a fenti vegyületek optikailag aktív izomerjeiből, racemátjaiból vagy kopolimerjeiből származik.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a poliészter glutársavanhidriddel van részlegesen savvégződéssel ellátva.
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a poliészter glutársavanhidriddel van teljes mértékben savvégződéssel ellátva.
6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a poliészter átlagos polimerizációs foka 10 és 300 közötti.
7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a poliészter viszkozitása körülbelül 0,05-körülbelül 0,7 dl/g kloroformban, és átlagos móltömege körülbelül 1200-40 000.
8. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a biológiailag aktív polipeptid 1-50%-át teszi ki az ionos molekuláris konjugátum teljes tömegének.
9. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polipeptidnek több mint 85%-a ionosán kötődik a poliészterhez.
10. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polipeptid LHRH, szomatosztatin, bombezin/GRP, kalcitonin, bradikinin, galanin, MSH, GRF, amilin, tachikininek, szekretin, PTH, CGRP, neuromedinek, PTHrP, glukagon, neurotenzin, ACTH, GHRP,

GLP, VIP, PACAP, enkefalin, PYY, motilin, P-anyag, NPY, TSH vagy ezek valamely analógja vagy fragmentuma.
11. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a polipeptid gyógyászatilag hatásos dózisa az ionos konjugátumból legalább 7 napon keresztül szabadul fel in vivő.
12. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) veszünk egy szabad karboxilcsoportokat tartalmazó poliésztert, és egy biológiailag aktív polipeptidet, amely legalább egy effektív ionogén amint tartalmaz, és

b) a poliésztert a polipeptiddel ionosán konjugálva ionos molekuláris konjugátumot állítunk elő, amelyben a jelen lévő polipeptidnek legalább 85 tömeg%-a ionosán kapcsolódik a poliészterhez.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményben lévő polipeptidnek legalább 50 tömeg%-át ionosán kapcsoljuk a poliészterhez.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliészterként savvégződéssel ellátott hidroxil végcsoportokat tartalmazó poliésztert alkalmazunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxil végcsoportokat glutársavanhidriddel látjuk el részlegesen savvégződéssel.
16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxil végcsoportokat glutársavanhidriddel látjuk el teljes mértékben savvégződéssel.
17. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliésztereket hidroxi-polikarbonsav-lánciniciátorok alkalmazásával szintetizáljuk.
18. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliészterekként savvégződéssel ellátott hidroxil végcsoportokat tartalmazó poliésztert alkalmazunk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxil végcsoportokat glutársavanhidriddel látjuk el részlegesen savvégződéssel.
20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidroxil végcsoportokat glutársavanhidriddel látjuk el teljes mértékben savvégződéssel.
21. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poliészterként 10 és 300 közötti átlagos polimerizációs fokú poliésztert alkalmazunk.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliészterben a karboxil/hidroxil végcsoportok aránya 1-nél nagyobb.
23. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a poliészter/polipeptid ionos molekuláris konjugátum előállítására

a) a poliésztert tetrahidrofúránban, acetonban vagy etilénglikol-dimetil-éterben oldjuk, majd egy bázist adunk hozzá, és

b) hozzáadjuk a polipeptid vagy annak sója vizes oldatát, amellyel a poliészter tömegére vonatkoztatva a polipeptidet 2-50 tömeg% mennyiségben visszük fel a poliészterre.
24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet egy pKa>3,5 savval alkotott sója formájában alkalmazzuk.

HU 220 137 Β
25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptid az ionos konjugátum össztömegének 1-50 tömeg%-át teszi ki.
26. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polipeptidnek több mint 85%-a ionosán kötődik a poliészterhez.
27. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakcióban a reaktánsok között ionos kötést alakítunk ki.
28. Készítmény, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti eljárással van előállítva.
29. Eljárás mikrorészecskék előállítására, azzal jel lemezve, hogy

a) egy 1. igénypont szerinti készítményt aprotikus, víz zel elegyedő szerves oldószerben oldunk,

5 b) a szerves oldószert vízbe keverjük, és

c) a vízből izoláljuk a mikrorészecskéket.
30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy szerves oldószerként acetont, acetonitrilt, tetra hidrofuránt, dimetil-formamidot vagy dimetoxi-etilén

10 glikolt alkalmazunk.