CZ293425B6

CZ293425B6 - Polyester obsahující jednu nebo více volných karboxylových skupin a přípravek tento polyester obsahující

Info

Publication number: CZ293425B6
Application number: CZ20002050A
Authority: CZ
Inventors: Shalaby W. Shalaby; Steven A. Jakson; Jacques-Pierre Moreau
Original assignee: Kinerton Limited
Priority date: 1993-01-06
Filing date: 1994-01-05
Publication date: 2004-04-14
Also published as: EP0678018A4; PT678018E; CN1115252A; ES2196023T3; RU2185393C2; SG47043A1; CN1163260C; ATE236655T1; PL174772B1; RU2146128C1; FI114898B; DE69432459D1; HU9502029D0; AU680650B2; CZ293378B6; CA2150574A1; DE69432459T2; FI953314A0; AU5992194A; FI953314A

Abstract

Polyester obsahující jednu nebo více volných karboxylových skupin a mající poměr mezi karboxyly a hydroxyly vyšší než jedna, přičemž zmíněný polyester obsahuje prvek vybraný ze skupiny L-kyselina mléčná, D-kyselina mléčná, DL-kyselina mléčná, kyselina jablečná, kyselina citronová, .epsilon.-kaprolakton, p-dioxanon, .epsilon.-kaprolová kyselina, alkylenoxalát, cykloalkylenoxalát, alkylensukcinát, .beta.-hydroxybutyrát, substituovaný nebo nesubtituovaný trimethylenkarbonát, 1,5-dioxepan-2-on, 1,4-dioxepan-2-on, glykolid, glykolová kyselina, L-laktid, D-laktid, DL-laktid, mesolaktid a jakékoliv jejich opticky aktivní izomery, racemáty nebo kopolymery. Přípravek obsahující výše uvedený polyester iontově konjugovaný s bioaktivním polypeptidem, obsahujícím alespoň jeden účinný ionogenní amin, přičemž nejméně 50 % hmotnosti přítomného polypeptidu ve zmíněném přípravku je iontově konjugováno ke zmíněnému polyesteru.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká polyesterové části polyester-polypeptidových iontových konjugátů, přípravku na bázi polypeptid-polyesterových iontových konjugátů připravených s tímto polyesterem, včetně dvou specifických forem těchto konjugátů.

Dosavadní stav techniky

Existuje již řada lékových dávkových systémů testovaných a využívaných pro řízené uvolňování 15 farmaceutických přípravků in vivo. Například polyestery jako poly(kyseliny DL-mléčná), poly(kyselina glykolová), poly(epsilon-kaprolakton) i různé jiné kopolymery byly používány k uvolňování biologicky aktivních molekul jako je progesteron; ve formě míkrokapslí, filmů nebo tyčinek (Pití CG, Marks TA, Schindler A. 1980). Po implantaci přípravku polymer/terapeutické činidlo, např. subkutánní nebo intramuskulámí, dochází po určité dané období 20 k uvolňování terapeutického činidla, takové biokompatibilní biodegradabilní polymemí systémy dovolují fixovanému terapeutickému činidlu difundovat z polymemí matrice. Během uvolňování terapeutického činidla dochází k in vivo degradaci polymeru, a díky tomu není nutné implantát odstraňovat chirurgicky. Ačkoliv stále ještě nerozumíme dobře faktorům které přispívají degradaci polymeru, lze předkládat, že degradace polyesterů je ovlivňována přístupností esterových 25 vazeb pro neenzymatickou autokatalytickou hydrolýzu polymemích složek.

Plánování struktury polymemích matric a jejich vlivu na rychlost a rozsah uvolňování terapeutických činidel in vivo byla věnována řada evropských a amerických patentů.

Například Deluca (zveřejnění evropské patentové přihlášky EP 0 467 389 A2 od University ofKentucky) popisuje fyzikální interakce mezi hydrofobním biodegradabilním polymerem a proteinem nebo polypeptidem.

Vytvořený přípravek byl směsí terapeutického činidla a hydrofobního polymeru, který vykazoval 35 po aplikaci nepřetržité difuzní uvolňování účinné složky z matrice.

Hutchinson (americký patent US 4 767 628/ICI) řídil uvolňování terapeutického činidla rovnoměrným dispergováním činidla v polymemím nosiči, zjistilo se, že řízené kontinuální uvolňování v tomto přípravku má dvě fáze: 1) uvolňování léčiva z povrchu přípravku závislé na 40 difúzi; 2) uvolňování hydratačními kanálky vznikajícími při degradaci polymeru.

Podstata vynálezu

Vynález se týká polyesteru obsahujícího jednu nebo více volných karboxylových skupin a majícího mezi karboxyly a hydroxyly vyšší nezjedná, který obsahuje buď kyselinu jablečnou, kyselinu citrónovou, nebo jejich kombinaci a jednotku vybranou ze skupiny sestávající z L-kyseliny mléčné, D-kyseliny mléčné, DL-kyseliny mléčné, ε-kaproloktanu, p-dioaxanonu, kyseliny ε-kaprolové, alkylenoxalátu, cykloalkylenoxalátu, alkylenskuckinátu, β-hydroxy50 butyrátu, substituovaného nebo nesusbtituovaného trimethylkarbonátu, l,5-dioxepan-2-onu, 1,4-dioxepan-2-onu, glykolidu, kyseliny glykolové, L-laktidu, D-laktidu, DL-laktidum, mesolaktidu a kteréhokoliv z jejich opticky aktivních izomerů, racemátů nebo kopolymerů.

Dále se vynález týká přípravku, který obsahuje výše uvedený polyester iontově konjugovaný s bioaktivním polypeptidem, obsahujícím alespoň jeden účinný ionogenní amin, přičemž k polyesteru je iontově konjugováno nejméně 50 % hmotnosti polypeptidu.

Alternativně lze k tvorbě molekulárního konjugátu předkládaného vynálezu použít libovolný polyester za podmínky, že předem reagoval s vhodnou bází, např. NaOH. jako peptidickou složku lze použít libovolný acidostabilní peptid, jako je např. peptid uvolňující růstový hormon (GHRP), lutenizační hormon (LHRP), somatostatin, bombesin, peptid uvolňující gastrin (GRP), kalcitonin, bradykinin, galantin, hormon stimulující melanocyty (MSH), faktor uvolňující růstový hormon (GRF), amylin, tachykininy, sekretin, parathormon (PTH), enkefalin, endothelin, peptid spouštějící kalcitoninový gen (CGRP), neuromediny, protein příbuzný parathormonu (PTHrP), glukagon, neurotensin, adrenokortikotropní hormon (ACTH), peptid YY (ΡΥΎ), peptid uvolňující glukagon (GLP), vasoaktivní intestinální peptid (VIP), peptid aktivující hypofyzámí adenylátcyklázu (PACAP), motilin, substance P, neuropeptid Y (NPY), TSH a analogy a fragmenty uvedených látek. Iontové molekulární konjugáty jsou schopné uvolňovat bioaktivní složky in vivo předem určenou rychlostí danou chemickou strukturou, molekulovou hmotností a pKa obou složek konjugátů. Mechanismus uvolňování zahrnuje přeměnu nerozpustné konjugované formy na složky rozpustné ve vodě částečně vlivem hydrolýzy hydrofobního polyesteru. Čili uvolňování polypeptidu se nezávisle zvyšuje se (a) snižujícím se rozdílem mezi pKa bioaktivního polypeptidu a polyesteru, (b) chemickou reaktivitu polyesterového řetězce která je odrazem nuklofilitykarbonylů, (c) snižující se hustotou polyesteru, která ovlivňuje teplotu skelného přechodu a minimalizuje schopnost krystalizace, a (d) rostoucí hydrofilitou matrice.

Ve výhodném provedení vynálezu tvoří polypeptid 1 až 50 % hmotn. celkové hmotnosti konjugátu,. a výhodně více než 85 % hmotn., výhodněji více než 95 % a nejvýhodněji více než 99 % hmotn. polypeptidu přítomného v přípravku je iontově konjugováno s polyesterem; polyesterová složka iontového molekulového konjugátu má viskozitu 0,05 až 0,7 dl/g v chlorformu; a průměrná molekulová hmotnost polyesteru je 1200 až 40 000.

Z polymemích iontových molekulárních konjugátů předkládaného vynálezu lze snadno vytvořit injikovatelná mikrotělíska nebo mikročástice, implantovatelné filmy nebo tyčinky, bez nutnosti použít postup vyžadující multifázové emulze nebo nevodné dvoufázové systémy. Je výhodné, lze—li mikročástice vytvořit (a) rozpuštěním přípravku vaprotickém rozpouštědle mísitelném s vodou, (b) mixováním organického rozpouštědla s vodou a (c) izolací mikročástic z vody, podle výhodného provedení vynálezu lze vhodné rozpouštědlo volit ze skupiny aceton, acetonitril, tetrahydrofuran, dimethylformamid a dimethoxyethylenglykol.

Podle výhodného provedení vynálezu je iontový molekulární konjugát polyester/polypeptid schopný uvolňovat in vivo terapeuticky účinné dávky bioaktivního polypeptidu po dobu nejméně 20 dnů, výhodněji 95 dnů ale ne méně než 7 dnů. Podle výhodného provedení vynálezu dochází k uvolňování z iontového molekulového konjugátu výlučně monofázově.

Protrahované uvolňování z přípravku předkládaného vynálezu je způsobeno především (a) přítomností volných karboxylovýcz skupin na polyesteru a přítomnosti alespoň jedné účinné ionogenní aminoskupiny na bioaktivním polypeptidu a (b) iontovou konjugací polyesteru s polypeptidem za vzniku iontového molekulárního konjugátu, v němž je nejméně 85 % hmotn. polypeptidu přítomného v konjugátu iontově konjugováno s polyesterem, výchozí polyester má mít dostatečné množství volných karboxylových skupin, nebo pokud neobsahuje dostatečné množství volných karboxylových skupin k požadovanému množství navázaného polypeptidu, lze polyester modifikovat (1) reakcí s např. kyselinou jablečnou nebo citrónovou pomocí esterifikace nebo funkční výměny, nebo (2) tvorbou „acid-tipped“ polyesteru reakcí s anhydridem kyseliny glutarové nebo (3) reakcí polyesteru s bází, např. NaOH, vedoucí k uvolnění kyselých skupin. Konečně lze z iontového molekulárního konjugátu polyester/polypeptid vytvořit implantovatelné filmy nebo tyčinky nebo injektovatelná mikrotělíska schopná uvolňovat polypeptid in vivo.

-2CZ 293425 B6

Polyester lze výhodně syntetizovat katalytickou nebo autokatalytickou kondenzaci jedné nebo více hydroxykyselin, např. ky seliny glykolové a mléčné, v prostředí předem stanovené koncentrace polykarboxylové hydroxykyseliny, např. jablečné nebo citrónové, takto připravené polyestery nesou hydroxylové skupiny, které jsou částečně nebo plně „acid-tipped“, tj. jsou na ně navázána uskupení nesoucí karboxylové skupiny.

Polyestery lze též syntetizovat katalytickou polymerací laktonů probíhající s otevřením kruhu, nebo polymerací cyklických monomerů jako je epsilon-kaprolakton, p-dioxanon, trimethylen karbonát, l,5-dioxepan-2-on, l,4-dioxepan-2-on v přítomnosti iniciátoru řetězce, např. polykarboxylové hydroxykyseliny.

Jiný postup syntézy spočívá v reakci hydroxykyseliny s cyklickým dimerem a následné kondenzaci otevřeného řetězového systému v přítomnosti polykarboxylové kyseliny.

Další možná syntetický postup zahrnuje reakci organické polykarboxylové kyseliny s předem připraveným polyesterem.

Podle výše uvedeného výhodného provedení vynálezu je poměr karboxylových skupin k hydroxylovým v „acid-tipped polyesteru vyšší než jedna a blíží se nekonečnou, tj. všechny hydroxylové skupiny jsou eliminovány, průměrný stupeň polymerace se pohybuje mezi 10 a 300, výhodně 20 a 50.

Alternativně lze polyester uzpůsobit k vazbě polypeptidu reakcí s bází, např. NaOH.

Je výhodné, pokud je iontový molekulární konjugát polyester/polypeptid syntetizován přímou interakcí mezi polyesterem, např. ve volné formě, a polypeptidem, např. ve volné formě, ve vhodném kapalném prostředí. Podle výhodného provedení vynálezu je vhodným prostředím pro tvorbu konjugátu směs aprotického rozpouštědla [např. aceton, tetrahydrofiiran (THF), dimethoxyethylenglykol] s rozpouštědlem vhodným pro polypeptid (např. voda) v mísitelném poměru. Výhodně je polypeptid ve formě soli monokarboxylové kyseliny o pKa vyšším nebo rovným 3,5. Výhodně má polypeptid nejméně jednu účinnou ionogenní aminoskupinu.

Ve výhodném provedení vynálezu tvoří polypeptid 1 až 50% hmotn., výhodně 10 až 20% hmotn. celkové hmotnosti iontového molekulárního konjugátu polyester/polypeptid. Ve částečně neutralizovány ionty alkalických kovů nebo organických bází. V dalším výhodným provedení vynálezu vede reakce s alkálií k disociaci řetězců polyesteru a tvorbě vazebných míst o nižší molekulové hmotnosti.

Zde užívaný výraz „polypeptid“ zahrnuje protein, peptid, oligopeptid nebo syntetický oligopeptid.

Zde užívaný výraz „polykarboxylový“ se týká sloučenin nesoucích více než jednu karboxylovou skupinu, např. kyselina jablečná a citrónová.

Zde užívaný výraz „průměrný stupeň polymerace“ představuje počet opakujících se sekvencí monomerů.

Zde užívaný výraz „účinná ionogenní aminoskupina“ se týká polypeptidu, který nese nejméně jednu aminoskupinu schopnou v podmínkách prostředí vytvořit iont.

Zde užívaný výraz „acid-tipped“ znamená, že sloučeniny nesou kyselou koncovou skupinu.

Zde užívaný výraz „částečně acid-tipped“ znamená, že sloučeniny mají své hydroxylové skupiny z 1 až 99 % „acid-tipped“ (tj. jsou na ně navázána uskupení nesoucí karboxylové skupiny.

-3CZ 293425 B6

Zde užívaný výraz „plně acid-tipped“ znamená, že sloučeniny mají své hydroxylové skupiny z více než 99,9 % „acid-tipped“ (tj. jsou na ně navázána uskupení nesoucí karboxylové skupiny).

Zde užívaný výraz „hydroxykyselina“ se vztahuje k libovolné sloučenině nesoucí současně 5 karboxylovou 1 hydroxylovou skupinu.

Zde užívaný výraz „monokarboxylová hydroxykyselina“ se vztahuje k organické kyselině s jednou karboxylovou a více hydroxylovými skupinami.

ío Zde užívaný výraz „polykarboxylová hydroxykyselina“ se vztahuje k organické kyselině s více karboxylovými i hydroxylovými skupinami.

Zde užívaný výraz „organický entrainer“ charakterizuje organické kapaliny, které kodestilují s vodní párou.

Zde užívaný výraz „bioaktivní“ charakterizuje molekulu která vyvolává nebo ovlivňuje biologické děje.

Zde užívaný výraz „acyklizuje“ charakterizuje chemickou reakci probíhající s otevřením kruhu.

Zde užívaný výraz „polykondenzace“ charakterizuje tvorbu polyesteru kondenzací dvou a více molekul.

Předkládaný vynález poskytuje nový farmaceutický přípravek, který váže chemickou vazbou 25 biokompatibilní biodegradabilní polyester s oligopeptidy, polypeptidy, peptidy a nebo proteiny za vzniku homogenní, iontové sloučeniny. Díky chemickému navázání polyesterů různých molekulových hmotností k terapeutickým činidlům lze lépe přizpůsobit chemické charakteristiky přípravků požadavkům řízeného uvolňování biologicky aktivní polypeptidické molekuly in vivo. Přípravky předkládaného vynálezu lze snadno optimalizovat z hlediska možnosti navázání 30 vyššího množství terapeuticky účinného polypeptidu.

Další rysy a přednosti vynálezu jsou zřejmé z následujícího podrobného popisu výhodných provedení vynálezu a z patentových nároků.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje izomery polykarboxylového „acid-tipped“ kopolymeru laktid/glykolid (jablečného typu).

Obr. 2 znázorňuje chemické interakce mezi iontovým molekulárním konjugátem kopolymeru laktid/glykolid (jablečného typu) a Somatostatinem (BIM-23014).

Obr. 3 znázorňuje graf průběhu uvolňování peptidu (v procentech) z iontového molekulárního 45 konjugátu do PBS pufru při 37 °C po dobu 28 dní.

Popis výhodných provedení vynálezu

Syntéza

Biodegrabilní nebo absorbovatelné polyestery předkládaného vynálezu byly uzpůsobeny z hlediska chemické reaktivity, aby umožňovaly řízenou hydrolyzovatelnost a vykazovaly maximum vazebné kapacity k oligopeptidům, polypeptidům nebo proteinům, které nesou kladný 55 náboj při fyziologickém pH. Těchto vlastností polyesterů bylo dosaženo pečlivým výběrem

-4CZ 293425 B6 stavebních monomerů, co-monomerů nebo comerů určených ke tvorbě řetězců a předem určeném složení a molekulových hmotnostech (viz např. obr. 2).

Syntetický plán přípravy přípravků předkládaného vynálezu je přístupný odborníkům v této oblasti techniky a zahrnuje tři hlavní stupně:

(1) syntéza polykarboxylových „acid-tipped“ polyesterů;

(2) syntéza iontového konjugátu polyester/polypeptid iontovou interakcí mezi polykarboxylovým „acid-tipped“ polyesterem (nebo polyesterem upraveným reakcí s bází) a biologicky aktivními polypeptidy; a (3) tvorba implantátů, tyčinek, mikrotělísek nebo mikročástic schopných in vivo uvolňovat terapeutické činidlo po dobu nejméně 7 dní z iontových konjugátů.

(1) Syntéza polykarboxylových „acid-tipped“ polyesterů

Polykarboxylové „acid-tipped“ polyesterové řetězce předkládaného vynálezu lze syntetizovat postupy přímé kondenzace 2-hydroxykyseliny a polykarboxylové organické kyseliny, postupné polymerace acyklizovaných produktů, polymerace laktonů nebo směsi laktonů probíhající s otevíráním kruhu, nebo funkční výměnou polykarboxylové organické kyseliny svysokomolekulámími polyestery (viz obr. 1). Následuje popis syntézy polykarboxylového „acid-tipped“ polyesteru výše zmíněnými postupy.

Přímá kondenzace 2-hydroxykyselin v opticky aktivní a/nebo inaktivní formě a předem určeného množství polykarboxylové organické kyseliny za přítomnosti nebo nepřítomnosti anorganického nebo organokovového katalyzátoru; např. kondenzace kyseliny glykolové kyseliny DL-mléčné a DL-jablečné, se obvykle provádí zahřátím monokarboxylové hydroxykyseliny nebo směsi dvou i více monokarboxylových hydroxykyselin v přítomnosti určitého množství polykarboxylové hydroxykyseliny ve skleněném reaktoru vybaveném zařízením pro kontinuální průtok suchého dusíku a účinným míchadlem (navržený Typ IA Polyester, viz tabulka 1). Typicky se polykondenzace provádí při 150 až 170 °C po dobu 4 až 72 hodin. Míchání reakční směsi lze provádět magneticky nebo probubláváním dusíku polyesterovou reakční směsí. Polymerace probíhá až k plánované molekulové hmotnosti, stanovované viskozitou roztoku a/nebo číslem kyselosti (stanoveným titrací koncových skupin).

Analýza polyesteru titrací koncových skupin: vzorky polyesteru (300 až 500 mg) byly přesně zváženy a rozpuštěny v minimálním množství (10 až 30 ml) acetonu, po rozpuštění byly vzorky zředěny na 100 ml benzylalkoholem (Mallinckrodt, Analytical Reagent) a titrovány do slabě růžového zbarvení (fenolftalein) roztokem hydroxidu draselného a benzylalkoholu (normalizovaný roztok proti HCI standardu). Stanovení čísla kyselosti polyesteru vycházelo ze srovnání objemu roztoku báze spotřebovaného na vzorek (delta Vs) a objemu roztoku báze spotřebovaného na čisté rozpouštědlo (delta Vo).

hmotnost vzorku (mg) číslo kyselosti =---------------------------------------------------{delta Vs(ml) - delta Vo(ml)} x N báze

Po ukončení polymerace byl polyester izolován a extrahován vodou nebo zředěným vodným roztokem hydroxidu sodného z vhodného organického roztoku pro odstranění nízkomolekulárních řetězců rozpustných nebo rozpustitelných ve vodě.

Analýza polyesteru pomocí GCP: průměrné molekulové hmotnosti (m.h.) polyesteru byly stanoveny pomocí GCP na přístroji skládacím se z pumpy dodávající rozpouštědla Waters Model 6000 a detektoru Dynamax (Rainin) model UV-D. Jednotlivá měření byla provedena

-5CZ 293425 B6 v tetrahydrofuranu (Burkick & Jackson UV grade) na koloně 500 x 10 mm (Jordi Associates) plněné Jordin Gel DVB 10'⁷ m, při průtoku 1,2 ml/min a 25 °C. Píky byly detekovány při 220 nm a l,0AUFS. Kolona byla kalibrována s použitím referenčních polystyrénoxých standardů vytvářejících úzké pásy (Polyscience lne.) o m.h. = 4000, 9200, a 25 000.

Průběh přímé kondenzace lze ovlivňovat použitím organického entraineru (tj. organická kapalina, která kodestiluje s vodní parou) a katexové pryskyřice jako katalyzátoru kondenzace (navržený Typ IB Polyester, viz tabulka 1). Odstranění katalyzátoru a entraineru v tomto postupu vyžaduje <

filtraci a odpaření. Konkrétní příklady polyesterů připravených tímto postupem a příslušné analytické údaje jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1: Přímá kondenzace polyesterů

Polymer číslo Polyestery typu IA	navážka	podmínky polymerace	číslo kyselosti	^inh	Tg, =C*
1 kvselina L-mléčná	35,7 g (0,349 mol)	100 °C/0,7 h 10“⁷	563	0,24	11
(88 %)
kyselina glykolová	4,65 g (0,612 mol)	165°C/17,5h
kyselina citrónová	1,75 g (0,0091 mol)
2 kyselina L-mléčná	25,6 g (0,25 mol)	165 °C/22 h	820	0,14	27

(88 %) kyselina glykolová 19,2 g (0,25 mol) ky selina jablečná 1,5 g (0,011 mol)

Polyestery typu 1B

3 kyselina L-mléčná (88 %)	25,6 g (0,25 mol)	132 °C/55 h	842	0,11	15
kyselina glykolová	19,2 g (0,25 mol)
ky selina citrónová	2,13 g (0,011 mol)	Dean-Stark
Amberlyst		Trap, dekant.
katalyzátor (lože #15)	0,5 g	filtr, v acetonu.
Toluen	150 ml	Sušeno.
		Promyto vodou. Sušeno vakuem.
4 kyselina L-mléčná (88%)	25,6 g (0,25 mol)	132 °C/68 h	1421	0,20	28
kyselina glykolová	19,2 g (0,25 mol)
kyselina jablečná	1,5 g (0,011 mol)	Dean-Stark
Amberlyst	0,5 g	Trap, dekant. filtr, v acetonu.
Toluen	100 ml	Sušeno.

Promyto vodou. Sušeno vakuem.

* Stanoveno na diferenčním skanovacím kalorimetru (TA 2100 DSC) s použitím vzorků 2 až 10 mg, rychlost ohřevu 10 °C/min v dusíkové atmosféře.

Postupná polymerace acyklizovaných produktů, kde hydroxykyselina reaguje s cyklickými dimery a následuje kondenzace výsledného otevřeného řetězcového systému v přítomnosti předem daného množství polykarboxylové kyseliny v přítomnosti nebo nepřítomnosti vhodného katalyzátoru kondenzace, např. kys. glykolová, L-laktid a kys. DL-jablečná, probíhá v podstatě ve stejných kondenzačních podmínkách směs monokarboxylové hydroxykyseliny, cyklický dimer druhé hydroxykyseliny a polykarboxylová hydroxykyselina. Konkrétní příklady polyesterů připravených tímto postupem a příslušné analytické údaje jsou uvedeny v tabulce 2. Pokud cyklický dimer předem zreaguje s vodou, stává se postup jednoduchou postupovou polymerací.

-6CZ 293425 B6

Tabulka 2: Postupná polymerace acyklizovaných produktů.

Polymer číslo Polyestery typu Π	navážka	podmínky polymerace	číslo kyselosti	Minh	Tg. =c*
1 L-laktid monomer kyselina glykolová kyselina jablečná	10,9 g(0,07 mol) 10,7 g (0,14 mol) 0,79 g (0,0061 mol)	160 °C/29h	1200	0,21	20
2 L-laktid monomer kyselina glykolová kyselina jablečná	20,0 g (0,139 mol) 7,1 g (0,093 mol 1,01 g (0,0075 mol)	25-155 °C/1,5 h 155 °C/70h rozp. v DCM, prom. vodou suš. vakuem	1800	0,13	27

* Stanoveno na diferenčním skanovacím kalorimetru (TA2100DSC) s použitím vzorků 2 až 10 mg, rychlost ohřevu 10 °C/min v dusíkové atmosféře.

Polymerace laktonu nebo směsi laktonů probíhající za otevření kruhu v prostředí dané koncentrace polykarboxylové hydroxykyseliny jako iniciátoru řetězce a katalytického množství organokovového katalyzátoru např. směsi L-laktidu, glykolidu a kys. DL-jablečné v přítomnosti oktoátu cínatého, vychází ze suchých cyklických monomerů nebo směsi cyklických monomerů, polykarboxylové hydroxykyseliny a stopového množství oktoátu cínatého (0,33 mol.r¹; roztok v toluenu). Reakční složky jsou v atmosféře bez kyslíku přeneseny do skleněného reaktoru vybaveného magnetickým nebo mechanickým míchadlem. Polymerace probíhá v atmosféře dusíku a řídí se vhodným plánem ohřevu až k dosažení molekulové hmotnosti polymerů (stanovované viskozitou roztoku). Po ukončení polymerace teplota reakční směsi klesne a zbylý monomer a nízkomolekulámí frakce rozpustné ve vodě jsou pak odstraněny extrakcí za nízké teploty z vhodného organického rozpouštědla. Roztok je pak vysušen a rozpouštědlo odpařeno. Stanovení molekulové hmotnosti vychází z hodnoty viskozity a číslo kyselosti je stanoveno titrací koncových skupin. Konkrétní příklady polyesterů připravených tímto postupem a příslušné analytické údaje jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3: Polymerace polyesterů probíhající s otevřením kruhu

Polymer číslo Polyestery typu III	navážka	podmínky polymerace	číslo kyselosti		Tg,’C*
1 glykolid L-laktid kyselina jablečná	3,22 g (0,028 mol) 10,7 g (0,14 mol) 0,79 g (0,0061 mol)	120 °C/0,5 h 150’C/6h 120°C/11 h	2150	0,79**	38
2 glykolid D,L-laktid kyselina jablečná	2,84 g (0,0245 mol) 20,0 g (0,139 mol) 0,876 g (0,00541 mol)	120 °C/0,5 h 180°C/2,5h 130°C/15 h	1206	0,08	26
3 glykolid D,L-laktid kyselina citrónová	2,84 g (0,0245 mol) 20,0 g (0,139 mol) 1,256 g (0,00654 mol)	155°C/1 h 185 °C/2,5h 190 °C/2,5 h 160 °C/13h	937	0,10	27
4 glykolid D,L-laktid kyselinajablečná	8,06 g (0,0694 mol) 10,0 g (0,0694 mol) 0,744 g (0,00555 mol)	180°C/1h 185°C/2h 195 °C/7h 120 °C/9h	970	026	23
5 glykolid D,L-laktid 1,6-hexandiol	8,06 g (0,0694 mol) 10,0 g (0,0694 mol) 0,656 g (0,00555 mol)	150°C/0,5h 185°C/4h 150°C/l,5h 120 °C/3 h	10 138	039	30

** V hexafluorizopropanolu

Funkční výměna organické polykarboxylové kyseliny nebo hydroxykyseliny ve vysokomolekulámím polyesteru o poměru COOH/OH rovnému jedné nebo blížícímu se nule, výhodně v přítomnosti organokovového katalyzátoru, např. tavení kopolymeru 85/15 laktid/glykolid o molekulové hmotnosti přesahující 5000 a poměru COO/OH < 1 s kyselinou DL-jablečnou v přítomnosti oktoátu cínatého vedoucí k nízkomolekulárním polyesterům o poměru

COOH/OH > 1, vyžaduje zahřívání vysokomolekulámího polyesteru s předem daným množstvím polykarboxylové kyseliny nebo polykarboxylové hydroxykyseliny v přítomnosti stopového množství organokovového katalyzátoru jako je např. oktoát cínatý’. Reakční směs je zahřívána na 150 °C v atmosféře suchého dusíku za intenzivního míchání až k ukončení žádané funkční výměny (až do vyčerpání nezreagované polykarboxylové kyseliny). Úplnost reakce je monitorována měřením molekulové hmotnosti (měření viskozity roztoku kapilárním viskozimetrem při 28 °C) vznikajícího nízkomolekulámího polyesteru a přítomné nezreagované polykarboxylové kyseliny. Vzorek polyesteru je extrahován vodou a extrakt je analyzován pomocí HPLC. Množství zbylého monomeru, dimeru a polykarboxylové kyseliny je stanoveno HPLC na přístroji sestávajícím z pumpy na rozpouštědla Waters Model 6000 a detektoru Dynamax (Rainin) model UV-D (205 nm, l,0AUFS). Jednotlivá měření jsou prováděna v 0,025 N Na₂HPO₄ pufru, pH=3,5 (izokraticky, průtok 1,0 ml/min) na koloně 25x4,6 mm plněné Nucleosilem Cl8, 5 pm.

Izolace a purifikace žádaného polyesteru je prováděna postupem uvedeným výše v části věnované polymeraci probíhající za otevření kruhu. Konkrétní příklady polyesterů připravených tímto postupem a příslušné analytické údaje jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4: polyestery připravené funkční výměnou

Polymer číslo Polyestery typu IV	navážka	podmínky polymerace	číslo ky selosti	«mh Tg, °C*
1 Boehminger A001 kyselina citrónová**	8,0 g (50/50) DL-Laktid/Glykolid 0,8 g (0,00417 mol)	150 °C 5 h	670	0,26 25

** Katalytické množství oktoátu cínatého (2 kapky 0,33 mol.r¹ roztoku, přibližně 0,03 nmol).

Dalšími monomery vhodnými pro syntézu polyesterů předkládaného vynálezu jsou: kyselina L-mléčná, DL-mléčná, epsilon-kaprolakton, p-dioxanon, kyselina epsilon-kapronová, trimethylen karbonát, 1,5-dioxepan-2-on, 1,4-dioxepan-2-on, glykolid a meso-laktid. Příklady vhodných polykarboxylových iniciátorů řetězce jsou kyselina jablečná a citrónová.

(2) Syntéza iontového konjugátu polyester/polypeptid iontovou interakcí mezi polykarboxylovým „acid-tipped“ polyesterem a biologicky aktivními polypeptidy

Výše uvedené polykarboxylové „acid-tipped“ biodegradabilní polyestery se používají pro přípravu iontových molekulárních konjugátů s mono- nebo polykarboxylovými oligopeptidy, polypeptidy nebo proteiny, které nesou přístupovou účinnou ionogenní aminoskupinu (viz obr. 2). Každý polyester lze reakcí s bází, např. NaOH, modifikovat tak, aby byl schopen tvořit iontový molekulární konjugát s polypeptidem. Reakce sbází odkrývá kyselé skupiny polyesteru a k iontové interakci s kationtovým polypeptidem může docházet na mnoha místech.

Uvedené konjugáty vznikají přímou interakcí molekul obou složek ve vhodném rozpouštědle, Polyester může nebo nemusí předem reagovat s bází kvůli zvýšení vazebné kapacity k bazickému léčivu. Jak již bylo uvedeno, iontová interakce obou složek iontového konjugátu se zvyšuje s rostoucím rozdílem jejich hodnot pKa.

Postup tvorby konjugátu: Polyester byl rozpuštěn ve vhodném aprotickém rozpouštědle na koncentraci v rozmezí 2 až 20 % hmotnost/objem. Vhodné rozpouštědlo je takové, které rozpouští polyestery a současně je mísitelné s vodou. Například tetrahydrofuran, aceton a ethylenglykoldimethylether. Ke vzniku roztoku byl přidán vodný roztok báze, např. hydroxid nebo uhličitan sodný, draselný nebo amonný kvůli zvýšení vazebné kapacity polyesteru. Obecně

-8CZ 293425 B6 množství přidané báze odpovídá množství potřebných kyselých skupin pro vznik iontových párů s bazickým polypeptidem.

Po krátkém promíchání směsi polyester-báze byl přidán vodný roztok peptidu nebo jeho soli 5 v poměru peptid/polyester 2 až 50% hmotn. (peptid/polyester). Tato směs byla míchána hodiny, rozpouštědla odstraněna a produkt sušen vakuem. Vzniklý materiál lze dále použít pro výrobu dávkových přípravků. Připravené farmaceutické přípravky jsou chemicky jednotné, jsou tvořeny výhradně iontovými molekulárními konjugáty a neobsahují v biodegradabilní matrici žádné mikroskopicky nebo makroskopicky dispergované domény účinné složky. Konkrétní io příklady iontových molekulárních konjugátů připravených tímto postupem a příslušné analytické údaje jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5: Vazba peptidu do iontového molekulárního konjugátu

Polymer	Peptid^	Navážka %	Retence³ %
1 50/50 DL-Laktid/Glykol	1	10	47
(komerční)	I	20	25
číslo kyselosti = 22 000	11	20	73
flinh ~ 0»53	III	20	48,5
2 Póly L-Laktid	I	10	62
(komerční) m.h. (prům.) = 2000 číslo kyselosti = 850	II	20	40
3 Póly L-Laktid (komerční) m.h. (prům.) = 50 000 číslo kyselosti = 2100	I	10	54
4 48/48/4 Póly D,l-Laktid/Glykolid/l,6-hexandioi (postup 3) číslo kyselosti = 10 138 n_inh = 0,39		20	43
5 49/49/2 Póly L-mléčná/	I	10	100
Glykolová/Jablečná kys.	I	20	99
(TypIB)	1	30	95,5
číslo kyselosti = 1 400	I	40	96,0
n_inh = 0,20	1	50	99,8
	II	20	99,8
	III	20	77,5
6 83,3/14,7/2 Póly L-mléčná/G!ykolová/Citronová kys (TypIA) číslo kyselosti = 563 nmh = 0,24	I	20	96
7 49/49/2 Póly D.l-Laktid/Glykolid/Jablečná kys.	I	20	96
(Typ II) číslo kyselosti = 1 200 Winh ~ 0,21	III	20	73,9
8 49/49/2 Póly D,l-Laktid/Glykolid/Citronová kys.	I	10	90

(Typ III) číslo kyselosti = 589 »_inh = 0,22 ¹ Konjugáty byly ve všech případech připravovány výše uvedeným postupem, jako rozpouštědlo byl použit aceton a jako báze hydroxid sodný. Všechny peptidy vstupovaly do reakce ve formě acetátových solí.

² Peptidy: IBIM-21003

D-Trp⁶-LHRH(pGlu-His-Trp-Ser-Typ-D-Trp-Leu-Arg-ProGly-NH₂) pKa =10,1

IIBIM-23014 (H₂N-p-D-V al-Cys-T yr-T rp-Lys-V al-Cys-ThrNH₂) pKa = 9,8

-9CZ 293425 B6

IIIBIM-26226 (H₂N-D-F₅Phe-Gln-Trp-Ala-Val-I>-Ala-His-LeuOCH₃) pKa = 8,0 ^J % retence: měřeno množství rozpouštěného peptidu pomocí HPLC ve vodných (D.I. voda) extraktech sušeného iontového konjugátu polyester/peptid vých. hmotnost peptidu - hmotnost rozp. peptidu % retence = 100 x-------------------------------------------------% vých. hmotnost peptidu (3) Tvorba implantátů, tyčinek, mikrotělísek nebo mikročástic schopných in vivo monofázově uvolňovat terapeutické činidlo po dobu nejméně 20 dní z iontových konjugátů

Ze solí iontových konjugátů předkládaného vynálezu lze připravit: (A) sterilní injektovatelná mikrotělísek (s nebo bez obsahu 0,1 až 10 % pevného polyhydroxylového alkoholu, který působí jako pomocná výrobní složka), která obsahují 1 až 50 % hmotn. polypeptidu, který je uvolňován výhradně monofázově, čímž je zajištěna protahovaná farmakologická účinnost v období 1 až 12 týdnů; (B) sterilní implantovatelné filmy tvořené odléváním, lisováním nebo protlačováním, s nebo bez obsahu farmakologicky neúčinné pomocné výrobní složky, které mají profil uvolňování účinné složky analogický jako výše uvedená mikrotělíska pod bodem (A) a; (C) sterilní injektovatelné tyčinky tvořené protlačováním nebo lisováním mající profil uvolňování účinné složky analogický jako výše uvedená mikrotělíska pod bodem (A).

Test uvolňování účinné složky in vitro:

Vzorky suchého rozemletého iontového konjugátu o hmotnosti 50 mg byly umístěny do scintilačních zkumavek o průměru 25 mm. Do každého vzorku bylo přidáno 5 ml alikvotně modifikovaného PBS pufru (PBS pufr: 2,87 g Na₂HPO₄, 0,654 g NaH₂PO₄, 5,9 g NaCl, 0,5gNaN₃, doplněno na 1 1 deionizovanou vodou; pH = 7,27) a zkumavky byly uloženy do třepačky Lab-Line Orbit Environ-Shaker a rychlostí otáčení 120ot/min při 37 °C. Zkumavky byly periodicky vyjímány, dekantovány a roztok nahrazován čerstvým PBS pufrem. v dekantovaných roztocích bylo stanovováno množství uvolněného peptidu v PBS pomocí HPLC.

Extrakce peptidu z iontových konjugátů:

mg vzorek iontového molekulárního konjugátu byl smíchán s 20 ml dichlormethanu. Směs byla postupně extrahována 2 N kyselinou octovou po 50 ml, 20 ml a 20 ml. Extrakty byly spojeny a obsah peptidu analyzován pomocí HPLC. Postup HPLC analýzy peptidu: HPLC měření bylo prováděno na přístroji sestávajícím z pumpy na rozpouštědla Waters model M-45 aUV detektoru EM Science MACS 700 při vlnové délce 220 nm a l,0AUFS. Dělení byla prováděna na koloně 25x4,6 mm s náplní Lichrospher (EM separace) Cl8, 1.10'⁸ cm, 5 pm, izokraticky elučním pufrem obsahujícím 30 % acetonitril/0,1 % TFA.

Podrobné údaje o in vitro uvolňování peptidu během 28 dní (tabulka 6) pro iontové molekulární konjugáty: 49:49:2 L-mléčná/glykolová/jablečná kys.\D-Trp⁶[LHRH] (příklad č. 8); 49:49:2 L-mléčná/glykolová/jablečná kysASomatostatinový analog inhibující nádory (příklad č. 9); a 73,5:2,45:2 póly L-laktid/glykolid/jablečná kys.\D-Trp⁶[LHRH] (příklad č. 10). Obr. 3 znázorňuje grafické vyjádření uvedených údajů.

-10CZ 293425 B6

Tabulka 6: Údaje in vitro testu

Den testu	Celkové množství uvolněného peptidu v procentech
př. č. 8	př. č. 9	př. č. 10
1	5,5 %	12.5%	11 %
7	26,9 %	21.3%	53%
14	55,2 %	47.3 %	55%
17	84,4 %	72.2 %	60%
21	98,6 %	82.5 %	66%
24	100%	98.2 %	75%
28	—	99.6 %	—

Stanovení množství navázaného peptidu v iontovém konjugátu:

Stanovení množství iontově navázaného peptidu v konjugátových přípravcích: 10 mg vzorky byly rozpuštěny v 5,7 ml směsi aceton/0,1 mol.l”¹ vodná TFA (9:1). Roztoky byly smíchány 15 až 24 hodin při 25 °C a přefiltrovány přes teflonové filtry 0,5 pm. Ve filtrátech byl stanoven obsah peptidů pomocí HPLC. Analýzy byly prováděny na přístroji Millipore model 717 Wisp Autosampler vybaveným pumpou model 510 a UV detektorem model 486 při 220 nm. Stanovení byla prováděna na koloně 25x4,6 mm s náplní Lichrospher (EM separace) Cl8, 1.10“⁸ cm, 5 pm, s průtokem l,0ml/min, izokraticky eluční směsí obsahující 35% acetonitrilu v 0,14% perchlorátovém pufru. Kvantitativní stanovení obsahu peptidů vycházelo ze srovnání plochy píku hledaného peptidu s plochou píku standardního peptidového vzorku.

Použití

Kterýkoliv z konjugátů (kyselý polyester/peptid) předkládaného vynálezu lze podávat samostatně nebo v kombinaci s farmaceuticky přijatelným médiem. Terapeutické přípravky lze podávat optimální cestou podle léčebného záměru, tedy subkutánné, intramuskulámě, parenterálně, jako čípky nebo přípravky do nosu, koncentrace přípravku předkládaného vynálezu v léku závisí na počtu dávek, velikosti podávaných dávek a cestě podání.

Bez dalšího pojednání lze předpokládat, že odborník v oboru dokáže předkládaný vynález provést v plném rozsahu. Následující příklady provedení jsou proto ilustrativní a v žádném směru vynález neomezující.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Přímá kondenzace. Příprava 50/50 Poly(D,L-mléčná-co-glykolová) katalyzovaná Amber lystem 15.

Kyselina D,L-mléčná (85% vodná směs; 13,7 g, 0,13 mol) byla smíchána s kyselinou glykolovou (10 g, 0,13 mol) v kulaté baňce vybavené magnetickým míchadlem, jímadlem Dean-Stark a vodním chladičem. Do směsi byl přidán toluen (100 ml) a Amberlyst 15 (100 mg) a reakční směs byla zahřívána pod zpětným chladičem v atmosféře dusíku 72 hodin, za odstraňování vody z reakční směsi. Směs byla ochlazena, toluen dekantován z tuhnoucího produktu a produkt byl rozpuštěn v dichlomethanu (250 ml). Roztok byl protřepán s aktivním uhlím (Darco, 500 mg), přefiltrován a sušen vakuem na rotační vakuové odparce, polyester byl dosušen vakuem při 13 Pa a 40 °C za vzniku bílého prášku.

(n_inh v CHCI3 = 0,3, číslo kyselosti = 2 439, Tg = 12 °C)

-11 CZ 293425 B6

Příklad 2 Přímá kondenzace. Příprava 50/50 Poly(D,L-mléčná-co-glykolová/citronová) katalyzovaná Amberlystem 15.

Podobně jako v předchozím příkladu, kyselina L-mléčná (88% vodná směs; 25,6 g, 0,25 mol) byla smíchána s kyselinou glykolovou (19,2 g, 0,25 mol), monohydrátenm kyseliny citrónové (2,33 g, 0,011 mol), toluenem (150 ml) a Amberlystem 15 (500 mg) v kulaté baňce. Směs byla za stálého míchání zahřívána kvaru pod zpětným chladičem 51 hodin a voda byla odstraňována Dean-Starkovým jímadlem. Z tuhnoucího produktu byl dekantován toluen, polyester rozpuštěn v acetonu (300 ml) a sušen vakuem na rotační vakuové odparce. Pevný polyester byl znovu rozpuštěn v dichlormethanu a dvakrát promyt vodou (2x150 ml) k odstranění rozpustných oligomerů. Organický roztok byl zahuštěn na rotační vakuové odparce a pečlivě vysušen vakuem za vzniku bílého prášku (viz tabulka 1, Typ IB Poly ester, Polymer č.4) («inh v CHC1₃ = 0,11, číslo kyselosti = 842, Tg = 15 °C)

Příklad 3 Postupná polymerace. Příprava 73,5/24,5/2 Poly(L-laktid-glykolová/jablečná) katalyzovaná kys. jablečnou.

V 150 ml válcové ampuli s přívodem vzduchu byl smíchán L-laktid (20 g, 0,139 mol) skys. glykolovou (7,1 g, 0,039 mol) a kys. D,L-jablečnou (1,0 g, 0,0075 M). Směs byla míchána probubláváním dusíkem (100 ml/min) a ohřátá z 25 na 155 °C během 100 minut. Reakční směs byla udržována na teplotě 155 °C po dobu 70 h a vznikající voda byla odstraňována chlazeným jímadlem ve vývodu z reakční nádoby. Po 70 hodinách byla reakční směs ochlazena na 100 °C a vlita do chlazené nerezové předlohy k dotuhnutí. Pevný polyester byl rozpuštěn v methylenchloridu a dvakrát promyt vodou (2 x 150 ml) k odstranění rozpustných oligomerů. Organický roztok byl zahuštěn na rotační vakuové odparce a pečlivě vysušen vakuem za vzniku bílého prášku (viz tabulka 2, Typ II Polyester, Polymer č.2).

(n_inh v CHC1₃ = 0,13, číslo kyselosti = 1 800, Tg = 27 °C)

Příklad 4 Polymerace za otevření kruhu. Příprava 75/25 Poly(L-laktid-co-glykolid) iniciovaná kys. jablečnou.

Do skleněné ampule a magnetickým míchadlem byly v atmosféře suchého dusíku dány složky: L-laktid (12,0 g, 0,0833 mol), glykolid (3,21 g, 0,0277 mol), kys. jablečná (0,3042 g, 0,00227 mol) a katalyzátor oktoát cínatý (0,33 mol roztok v toluenu, 67 pm, ,022 mmol). Systém byl před zastavením ampule několikrát propláchnut dusíkem. Reakční složky byly pak roztaveny při 140 °C a tavenina zahřívána na 180 °C, 190 °C, 180 °C a 150 °C v časových úsecích 1, 4,5, 12 a 2 hodiny. Po ochlazení na teplotu místnosti byl polyester znovu ohřát na 110°C při vakuu nižším než 13 Pa po dobu 1 hodiny k odstranění monomeru, znovu ochlazen na teplotu místnosti, zředěn kapalným dusíkem, izolován a sušen ve vakuu.

(«inh v CHCI3 = 0,20, číslo kyselosti = 2 560, Tg = 39 °C)

Příklad 5 Polymerace za otevření kruhu. Příprava 50/50 Poly(D,L-laktid-co-glykolid) iniciovaná kys. citrónovou.

Do skleněné ampule s magnetickým míchadlem byly v atmosféře suchého dusíku dány složky: D,L-laktid (10,0 g, 0,0694 mol), glykolid (8,06 g, 0,0694 mol), kys. citrónová (1,07 g, 0,00555 mol) a katalyzátor oktoát cínatý (0,33 mol.I¹ roztok v toluenu, 84 μΙ, 0,0278 mmol) a ampule byla zatavena pod vakuem. Reakční složky byly pak roztaveny, zahřívány na

-12CZ 293425 B6

180 °C, 185 °C, 195 °C a 120 °C v časových úsecích 1, 2. 7 a 9 hodin. Polyester byl ochlazen na teplotu místnosti, zředěn kapalným dusíkem, izolován a sušen.

(«inh v CHC1₃ = 0,26, číslo kyselosti = 970, Tg = 23 °C)

Příklad 6 Polymerace za otevření kruhu. Příprava 50/50 Poly(D,L-laktid-co-glykolid) iniciovaná 1,6-hexandiolem.

Podobně jako v předcházejícím příkladu byly do skleněné ampule s magnetickým míchadlem v atmosféře suchého dusíku dány složky: D,L-laktid (10,0 g, 0,0694 mol), glykolid (8,06 g, 0,0694 mol), 1,6-hexandiol (0,656 g, 0,00555 mol) a katalyzátor oktoát cínatý (0,33 mol. Γ¹ roztok v toluenu, 84 μΐ, 0,0278 mmol) a ampule byla zastavena pod vakuem. Reakční složky byly pak zahřívány na 150°C, 185 °C, 150 °C a 120 °C v časových úsecích 0,5,4, 1,5 a 3 hodin, polyester byl izolován a sušen (viz tabulka 3, Typ III Polyester, Polymer Č.5) («jnh v CHCI3, číslo kyselosti = 10 138, Tg = 30 °C)

Příklad 7 Funkční výměna. Příprava polykarboxylovaného polyesteru 50/50 Poly(D,Llaktid-co-glykolid).

Do skleněné ampule byly v atmosféře suchého dusíku dány složky: 50/50 poly(D,L-laktid-coglykolid) Boehringer A001, 8 g), kys. citrónová (0,8 g, 4,16 mmol) a katalyzátor oktoát cínatý (2 kapky) a ampule byla zatavena. Reakční složky byly pak zahřívány na 150 °C 4 hodiny, reakční směs ochlazena na teplotu místnosti, zředěna kapalným dusíkem, polyester izolován a sušen (víz tabulka 4, Typ IV Polyester, Polymer č.l).

(n_inh v CHCI3 = 0,26, číslo kyselosti = 670, Tg = 23 °C)

Příklad 8 Příprava iontového molekulárního konjugátu 49:49:2 L-mléčná/glykolová/jablečná kys. (viz tabulka 1, polymer č.4)\D-Trp⁶[LHRHJ.

500 mg 49:49:2 L-mléčná/glykolová/jablečná kys. (připraveného přímou kondenzací; m.h. = 9500; číslo kyselosti = 1420) bylo rozpuštěno v acetonu (10 ml) (Mallínckrodt Analytic Reagent). Byl přidán 0,1 N hydroxid sodný (1,14 ml) a směs míchána při teplotě místnosti 15 minut. Poté byl přidán 1 ml vodného roztoku obs. 100 mg D-Trp⁶[LHRH] (BIM-21003 Peptid I; obsah báze 87 %, obsah acetátů 7 %) a směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti. Poté byla rozpouštědla odpařena, napřed na rotační vakuové odparce Rotavap při teplotě < 40 °C a dále v exsíkátoru ve vakuu 13 Pa 1 hodinu při teplotě místnosti. Suchá pevná látka byla rozmělněna a míchána v deionizované vodě (100 ml) a odfiltrována. Ve vodném filtrátu byl pomocí HPLC stanoven obsah rozpustného peptidu < 1 mg. Pevný produkt byl několik dní sušen ve vakuu na konečnou hmotnost 540 mg bílého prášku. Prášek byl použit d testů in vitro (viz tabulka 6, příklad č.8).

Příklad 9 Příprava iontového molekulárního konjugátu 49:49:2 L-mléčná/glykolová/jablečná kys. (viz tabulka 1, polymer č.4)\Somatostatinový analog inhibující nádory.

100 mg 49:49:2 L-mléčná/glykolová/jablečná kys. (připraveného přímou kondenzací; m.h. = 9500; číslo kyselosti = 1420) bylo rozpuštěno v acetonu (2 ml) (Mallínckrodt Analytic Reagent). Byl přidán 0,1 N hydroxid sodný (0,32 ml) a směs míchána při teplotě místnosti 15 minut. Poté byly přidány 1,2 ml vodného roztoku obs. 20 mg Samotostatinového analogu

-13CZ 293425 B6 inhibujícího nádory (BIM-23014 Peptid II; obsah báze 83 %, obsah acetátů 9,8 %) a směs byla míchána 1 hodinu při teplotě místnosti. Poté byla rozpouštědla odpařena, napřed na rotační vakuové odparce Rotavap při teplotě < 40 °C a dále v exsikátoru ve vakuu 13 Pa 1 hodinu při teplotě místnosti. Suchá pevná látka byla rozmělněna a míchána v deionizované vodě (20 ml) a odfiltrována. Ve vodném filtrátu byl pomocí HPLC stanoven obsah rozpustného peptidu < 0,05 mg. Pevný produkt byl několik dní sušen ve vakuu na konečnou hmotnost 106 mg bílého prášku. Prášek byl rozemlet a použit do testů in vitro uvolňování účinné složky (viz tabulka 6, příklad č.9).

Příklad 10 Příprava iontového molekulárního konjugátu 73,5:24,5:2 póly L-laktid/glykolová/jablečná kys. (viz tabulka 2, polymer č.2)\D-Trp⁶[LHRH].

800 mg 73,5:24,5:2 póly L-laktid/glykolová/jablečná kys. (připraveného postupnou polymerací acyklizovaných produktů; číslo kyselosti = 1 800) bylo rozpuštěno v acetonu (16 ml). Byl přidán 0,1 N hydroxid sodný (2,8 ml) a směs míchána při laboratorní teplotě místnosti 20 minut. Poté byly přidány 2 ml vodného roztoku obs. 200 mg D-Trp⁶[LHRH] (BIM-21003 Peptid I; obsah báze 87 %, obsah acetátů 7 %) a směs byla míchána 90 minut při teplotě místnosti. Poté byla rozpouštědla a suchá pevná látka rozmělněna v deionizované vodě. Jako v příkladu 8 bylo zjištěno, že vodný filtrát obsahuje méně než 1 % rozpustného peptidu. Izolovaný pevný produkt byl 4 dny sušen ve vakuu na konečnou hmotnost 839 mg bílého prášku, prášek byl rozemlet a použit do testů in vitro (viz tabulka 6, příklad č.10)

Příklad 11 Příprava mikročástic 1,50 iontového molekulárního konjugátu peptid/polymer z polyesteru L-laktid/glykolid/D,L-jabIečná kys. (65;33;2)

Syntéza konjugátu: polyester připravený polymerací za otevření kruhu jak je uvedeno v příkladu 4 [m.h. = 4 700; polydisperzita = 1,3 stanoveno pomocí GPC na Jordi Gel 50 x 1 cm, lineárně, eluce THF, detektor dn/dc = 0,05; číslo kyselosti = 1 475, titrací; Tg = 42 °C] byl rozpuštěn v acetonu (40 ml), kyselé skupiny byly neutralizovány 2,0 m] 0,5 g BIM-23014 (obsah peptidu 83,7%, obsah acetátů 11,5%) ve 20 ml Milli-Q vody* pomalým přidáváním do míchaného roztoku polyesteru, během přidávání peptidu bylo do směsi přidáno postupně ještě 40 ml acetonu k zabránění precipitace. Čirý bezbarvý roztok byl míchán 1 hodinu a odpařen do sucha ve vakuu. Vzniklá pevná bílá látka byla znovu rozpuštěna ve směsi aceton (20 ml) a voda Milli-Q (2 ml) na čirý roztok. Tento roztok byl injikován přes teflonový filtr (0,2 gm) do účinně míchané nádoby s Milli-Q vodou (500 ml) při 4 °C. Fáze komplexu polymer/peptid se při styku s vodou okamžitě rozbila na malé částice. Suspenze byla míchána 30 minut při 4 °C, zbylý aceton byl odpařen za sníženého tlaku, pevné částice izolovány centrifugací, resuspendovány ve 100 ml Milli-Q vody a znovu centrifugovány. Izolované pevné částice byly sušeny lyofilizací na konečnou hmotnost 1 530 mg bílého volně tekutého prášku. Velikost částic se pohybovala v rozmezí 2 až 100 gm, Tg iontového konjugátu 53 °C. Celkové množství (zbylého) nenavázaného peptidu ve všech vodných supematantech bylo 63 mg dle HPLC analýzy. Celkový výchozí obsah peptidu stanovený elementární analýzou dusíku byl 19,90 hmotn. Podíl extrahovatelného peptidu z konjugátu extrakční technikou aceton/0,1 mol.l^-1 TFA byl stanoven na 16,98% hmotn. Výsledný konjugát si tedy uchoval z 84,8 % hmotn. iontový (extrahovatelný) charakter.

*Milli-Q voda je voda filtrovaná filtračním systémem vyráběným firmou Millipore, lne., Bedford, Massachusetts, USA. Jde o standardní systém používaný v mnoha světových průmyslových laboratořích i u nás. Získá se deminarelizovaná voda prostá organických příměsí, která je v hodná např. pro HPLC nebo iontovou chromatografií...

Výraz „Milli-Q“ je registrován jako ochranná známka výše jmenované firmy.

-14CZ 293425 B6

Z předcházejícího popisu odborník v oboru snadno ocení základní rysy předkládaného vynálezu a aniž by se odchýlil z duchu a rámce vynálezu může provést řadu modifikací, kterými přizpůsobí předkládaný vynález konkrétním použitím a podmínkám. Jiná provedení spadají tedy rovněž do rámce předkládaného vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polyester obsahující jednu nebo více volných karboxylových skupin a mající poměr mezi karboxyly a hydroxyly vyšší než jedna, který obsahuje buď kyselinu jablečnou, kyselinu citrónovou, nebo jejich kombinaci a jednotku vybranou ze skupiny sestávající zL-kyseliny mléčné, D-kyseliny mléčné, DL-kyseliny mléčné, ε-kaprolaktonu, p-dioaxanonu, kyseliny ε-kaprolové, alkylenoxalátu, cykloalkylenoxalátu, alkylenskuckinátu, β-hydroxybutyrátu, substituovaného nebo nesubstituovaného trimethylkarbonátu, l,5-dioxepan-2-onu, 1,4-dioxepan-2-onu, glykolidu, kyseliny glykolové, L-laktid, D-laktidu, DL-laktidu, mesolaktidu a kteréhokoliv z jejich opticky aktivních izomerů, racemátů nebo kopolymerů.
2. Polyester podle nároku 1, který obsahuje inertní karboxylovou skupinu v řetězci polyesteru.
3. Polyester podle nároku 1, který obsahuje kyselinu jablečnou nebo citrónovou.
4. Polyester podle nároku 2, který obsahuje kyselinu jablečnou nebo citrónovou.
5. Polyester podle nároku 3, ve kterém zmíněné skupiny kyseliny jablečné nebo citrónové jsou inertními členy polyesterového řetězce.
6. Polyester podle nároku 4, ve kterém zmíněné skupiny kyseliny jablečné nebo citrónové jsou inertními členy polyesterového řetězce.
7. Polyester podle nároku 5, kteiý obsahuje L-kyselinu mléčnou, D-kyselinu mléčnou nebo glykolovou.
8. Polyester podle nároku 6, který obsahuje L-kyselinu mléčnou, D-kyselinu mléčnou nebo kyselinu glykolovou.
9. polyester podle nároku 7, kteiý má průměrnou molekulovou hmotnost 1 200 až 40 000.
10. Polyester podle nároku 8, který má průměrnou molekulovou hmotnost 1 200 až 40 000.
11. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje polyester definovaný v nároku 1, iontově konjugovaný s bioaktivním polypeptidem, obsahujícím alespoň jeden účinný ionogenní amin, přičemž k polyesteru je iontově konjugováno nejméně 50 % hmotnosti přítomného polypeptidu.
12. Farmaceutický přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že polyester má inertní karboxylovou skupinu polyesterového řetězce.
13. Farmaceutický přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že polyester obsahuje kyselinu jablečnou nebo citrónovou.
14. Farmaceutický přípravek podle nároku 12, vyznačující se tím, že polyester obsahuje kyselinu jablečnou nebo citrónovou.

-15CZ 293425 B6
15. Farmaceutický přípravek podle nároku 13, vyznačující se tím, že skupiny kyseliny jablečné nebo citrónové jsou inertními členy polyesterového řetězce.
16. Farmaceutický přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že skupiny kyseliny jablečné nebo citrónové jsou inertními členy polyesterového řetězce.
17. Farmaceutický přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že polyester obsahuje L-kyselinu mléčnou, D-kyselinu mléčnou nebo kyselinu glykolovou.
18. Farmaceutický přípravek podle nároku 16, vyznačující se tím, že polyester obsahuje L-kyselinu mléčnou, D-kyselinu mléčnou nebo kyselinu glykolovou.
19. Farmaceutický přípravek podle nároku 17, vyznačující průměrnou molekulovou hmotnost 1200 až 40 000.
20. Farmaceutický přípravek podle nároku 18, vyznačující průměrnou molekulovou hmotnost 1200 až 40 000.
21. Farmaceutický přípravek podle nároku 19, vyznačující somatostatin, LHRH, popřípadě jejich analog nebo fragment.
22. Farmaceutický přípravek podle nároku 20, vyznačující somatostatin, LHRH, popřípadě jejich analog nebo fragment.