BRPI0615573A2 - análogos de glp-1 estabilizados - Google Patents

Abstract

ANALOGOS DE GLP-1 ESTABILIZADOS Análogos de polipeptídeo da invenção que incluem: a) uma seqúência de aminoácido de base pelo menos 80% idêntica a uma de um fragmento de GLP-l; e b) resíduos de aminoácido ligados à extremidade carbóxi da seqúência de aminoácido de base, onde os análogos têm atividade semelhante à GLP-l de duração mais longa do que GLP-l nativo e/ou receptor de GLP-l tem uma afinidade maior para os análogos do que GLP-l nativo. Outros análogos de polipeptideo da invenção incluem a> uma seqúência de aminoácido de base de pelo menos 50% idêntico a um fragmento de GLP-l no qual o resíduo de aminoácido na seqúência de aminoácido base correspondendo a resíduo P'1 de GLP-l é um análogo de aminoácido tendo um carbono CB tetrassubstituído; e b) resíduos de aminoácido ligados à extremidade carbóxi da seqúência de aminoácido de base, onde os análogos têm as propriedades indicadas acima. A invenção também inclui métodos de tratamento onde esses análogos são administrados.

Description

ANÁLOGOS DE GLP-I ESTABILIZADOS

Pedidos Relacionados

0 presente pedido reivindica o beneficio de prioridadeao pedido de patente provisório dos Estados Unidos númerode série 60/715.322, depositado em 8 de setembro de 2005; oqual é incorporado aqui a título de referência na íntegra.

Antecedentes da Invenção

A terapêutica de polipeptídeo e peptídeo é amplamenteutilizada em prática médica. Sua facilidade de produção,por tecnologia de DNA recombinante ou sintetizadores depeptídeo, assegura seu uso contínuo em uma variedade decircunstâncias nos anos por vir. Por conseguinte,terapêutica de polipeptídeo, como hormônios, citocinas efatores de crescimento, representam uma classe importantede agentes terapêuticos. Certos polipeptídeos nativos,entretanto, podem ser inativados rapidamente in vivoatravés de proteólise ou isomerização. Essa inativação podeser inconveniente em casos onde se deseja manter um nívelde sangue consistente ou contínuo da terapêutica durante umperíodo de tempo, visto que administrações repetidas serãoentão necessárias. Em certos casos, um ou mais dos produtosproteolíticos do polipeptídeo podem ser antagonistas àatividade do polipeptídeo intacto. Nesses casos, aadministração de terapêutica adicional individualmente podeser insuficiente para superar o efeito antagonista dosprodutos proteolíticos.

Para ilustrar adicionalmente, um hormônio de peptídeocuja presença prolongada no sangue pode ser benéfica incluipeptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-I). GLP-I é umhormônio de polipeptídeo importante com função reguladoraem metabolismo de glicose e secreção e metabolismogastrintestinal. Os esforços atuais mostram que GLP-I é umfator de crescimento para células beta no pâncreas e talvezesteja envolvido em diferenciação de células em outrosórgãos além do pâncreas.

Acredita-se que GLP-I seja degradado por membros daclasse de clivagem pós-prolina de enzimas de proteinase deserina, como dipeptidil peptidase IV (DPP IV). DPP IV é umpeptidase de serina associado a membrana que clivadipeptídeos terminais-N a partir de uma cadeia de peptídeocontendo na penúltima (P1) posição, preferivelmente, umresíduo de prolina, ou um resíduo de alanina se o resíduode terminal-N (P2) for histidina ou um grande aromáticocomo tirosina, triptofano ou fenil alanina. A seqüência deextremidade amino de GLP-1 é HIs-Ala-Glu.Conseqüentemente,DPP IV está envolvido na regulação da atividade de GLP-1 invivo.

A remoção mediada por DPP IV de dipeptídeos Xaa-Ala ouXaa-Pro, onde Xaa é um resíduo de aminoácido, a partir daextremidade-N de hormônios de peptídeo bioativo como GLP-1torna os mesmos inativos, ou mesmo antagonistas. Porconseguinte, a clivagem e inativação de hormônios depeptídeo por proteinases de serina como DPP IV é um exemploque ilustra limitações para o uso de polipeptídeosterapêuticos; a saber, sua duração curta de ação in vivo.Por esse motivo, há necessidade na técnica por peptídeos deação mais longa com atividade semelhante a GLP-1.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê, genericamente, análogos deGLP-I que aumentaram a duração de atividade semelhante aGLP-I in vivo. A presente invenção também provê análogos deGLP-I que têm afinidade aumentada para o receptor de GLP-I.

Em um aspecto, a presente invenção é um análogo depolipeptídeo compreendendo:

a) uma seqüência de aminoácido de base pelo menos 8 0%idêntica a uma de GLP-I (7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I(7-36) eGLP-I(7-37) (SEQ ID NOS: 1-4); e

b) um a quinze resíduos de aminoácidos de ocorrência(natural ou não naturalmente) ligados à extremidade carbóxida seqüência de aminoácido,

onde o análogo tem atividade semelhante a GLP-I deduração mais longa in vivo em seres humanos do que GLP-Inativo.

Em outro aspecto, a presente invenção é um análogo depolipeptídeo compreendendo:

a) uma seqüência de aminoácido pelo menos 80% idênticaa um entre GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36) e GLP-1-(7-37) (SEQ ID NOS: 1-4); e

b) um a quinze resíduos de aminoácido ligados àextremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de base,

onde o receptor de GLP-I tem maior afinidade com oanálogo do que GLP-I nativo. Tais análogos têm tambémvantajosamente atividade semelhante a GLP-I de duração maislonga in vivo em seres humanos do que GLP-I nativo.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção é umanálogo de peptídeo compreendendo:

a) uma seqüência de aminoácido pelo menos 50% idênticaa um entre GLP-I-(7-34) , GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36) e GLP-l-(7-37) (SEQ ID NOS: 1-4) na qual o resíduo de aminoácidona seqüência de aminoácido de base correspondendo aoresíduo P'1 de GLP-I é um análogo de aminoácido tendo umcarbono Cp tetrassubstituído; e

b) um a quinze resíduos de aminoácido ligados àextremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de base,onde o análogo tem atividade semelhante a GLP-I deduração mais longa in vivo em seres humanos do que GLP-Inativo.

Em aspecto adicional, a presente invenção é um análogode peptídeo compreendendo:

a) uma seqüência de aminoácido pelo menos 50% idênticaa um entre GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36) e GLP-1 - (7-37) (SEQ ID NOS. 1-4) na qual o resíduo de aminoácidona seqüência de aminoácido de base correspondendo aoresíduo P'χ de GLP-I é um análogo de aminoácido tendo umcarbono Cp tetrassubstituído; e

b) um a quinze resíduos de aminoácido ligados àextremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de base,

onde o receptor de GLP-I tem atividade maior para oanálogo do que para GLP-I nativo. Tais análogos têm tambémvantajosamente atividade semelhante a GLP-I de duração maislonga in vivo em seres humanos do que GLP-I nativo.

A presente invenção também provê composiçõesfarmacêuticas que compreendem um ou mais dos presentesanálogos. Composições farmacêuticas exemplares compreendemum ou mais análogos formulados com veículos ou excipientesfarmaceuticamente aceitáveis.

Outro aspecto da presente invenção é um método detratar uma doença em um sujeito compreendendo aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz deum ou mais dos referidos análogos. Os presentes análogospodem ser administrados individualmente, ou podem seradministrados como parte de um regime terapêutico incluindooutras terapias apropriadas à indicação especifica dadoença. Como exemplo, a administração de um análogo para otratamento de diabetes pode ser utilizada individualmente,ou pode ser utilizada em combinação com modulação de dietae exercício, e/ou com administração de insulina. Métodos detratamento combinatórios exemplares, adicionais,compreendem a administração de um análogo e a administraçãode um inibidor da enzima ou enzimas específicas que clivamo polipeptídeo de GLP-I nativo. Tal inibidor pode serespecífico à enzima particular (por exemplo, um inibidorespecífico de DPP IV) ou pode ser mais genérico à classe deenzima (por exemplo, um inibidor de protease de serina).

Outro aspecto da presente invenção é utilizar ospresentes análogos para fins de diagnóstico.

Outro aspecto da presente invenção é utilizar ospresentes análogos para a fabricação de um medicamento parao tratamento de uma doença ou condição aqui revelada.

Um aspecto adicional da invenção é um método deaumentar a meia-vida in vivo em seres humanos de umpeptídeo pelo menos 8 0% idêntico a GLP-I, que inclui ligarum a quinze resíduos de aminoácido à extremidade carbóxi dopeptídeo.

Ainda outro aspecto da presente invenção é um métodode conduzir um negócio compreendendo identificar, fabricar,comercializar, distribuir e/ou licenciar um análogo dainvenção, composições farmacêuticas do mesmo, e/ou kitsincluindo o análogo.

Breve Descrição das FigurasA figura 1 mostra digestão de (A) Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Ser-NH2 ( ), Ala-Pro-Ile-Ser-Trp-Ser-NH2(A) e Ala-Pro-Tle-Ser-Trp-Ser-NH2 (V) , incubado com DPP IV de rato em 50 mMHEPES, 0.14 M NaCli pH 8,0 a 37°C; e (B) GLP-I (7-36 amida)(■) , TPA1B4 (♦) e P1732 (^ ) incubado com DPP IV humano em50 mM HEPES, 0.14 M NaCl7 pH 8,0 a 30°C. Nos temposindicados uma alíquota foi removida, a reação foi paradapela adição de HCl a um pH de 2, e as amostras foramanalisadas por LCMS. Concentrações de peptídeo foram 0.1mM. A percentagem de clivagem foi determinada porintegração dos picos de produto e substrato no cromatogramade MS. Os dados foram adaptados em uma equação exponencialde fase única.

A figura 2 mostra a competição de GLP-I (®), Exendin-4 (■*■), TPA144 (O)7 TPA1B4 (♦) e P1732 ) com ligação de125I exendin (9-39) em células COS-7 que expressam oreceptor de GLP-I humano. Valores de IC50 foram 1.5 nM paraGLP-1, 3 6.3 nM para TPA144, 7.6 nM para TPA1B4, 2.5 nM paraP1732 e 0.4 nM para Exendin-40. Os dados representam osresultados de experimentos independentes e são normalizadospara ligação de 125I exendin (9-3 9) na ausência deconcorrente.

A figura 3 mostra ativação do receptor de GLP-1, comomedido por produção de cAMP. Os peptídeos foram testados emrelação à atividade agonista em uma concentração de 3 00 nM.Os dados representam a média +SEM com η = 4.

A figura 4 mostra produção de cAMP em células COS-7expressando o receptor de GLP-I humano após incubação comvárias concentrações de GLP-I (■), P1732 (^r) e Exendin-4( ^ ). Os valores de dados + SEM são traçados e adaptados emuma curva de resposta de dose sigmoidal. Valores de EC50obtidos a partir das curvas adaptadas são 0.5 nM, 0.6 nM e0.2 nM para GLP-1, P1732 e Exendin-4, respectivamente.

A figura 5 mostra curso de tempo de efeitos de reduçãode glicose, onde as medições de glicose no sangue foramfeitas antes, e nos tempos indicados após injeção desolução salina (·), ou 8 μ<3 de GLP-I (■), TPA1B4 (♦),P1732 DGS65 ( ) , ou Exendin-4 (A ) . TPA1B4 com P3 β-dimetil Asp é comparado com GLP-I (A) e análogos depeptideo com modificações tanto de P3 como terminal carbóxisão comparados com exendin-4 (B). Em cada ponto de tempo apercentagem de alteração em glicose de sangue foideterminada para 10 camundongos e a alteração média ± SEM étraçada.

A figura 6 mostra a resposta de dose apresentada pelospeptideos do Exemplo 1 em camundongos diabéticos. Mediçõesde glicose de sangue foram feitas antes da injeção devárias doses de TPA1B4 (♦), P1732 (^r) e Exendin-4 (A) enovamente em 6 0 minutos após injeção. Em cada dose, apercentagem de alteração em glicose de sangue foideterminada para 10 camundongos e a alteração média ± SEM étraçada. Os dados foram adaptados em uma curva de respostade dose sigmoidal. Valores EC50 a partir dessas adaptações(e 95% de intervalos de confiança) são 0,4 μg (0,1 - 1,92μ9) para TPA1B4, 0,5 μg (0,4 - 3,5 μ9> para P173 e 0,5 μg(0,2 - 1,2 μ9) para exendin-4.

A figura 7 mostra o curso de tempo de efeitos deredução de glicose, onde as medições de glicose no sangueforam feitas antes, e nos tempos indicados após injeção desolução salina (■), ou 8 μg de TPA1B4 Cr), DGS69 (V) ouExendin-4 Ck). Em cada ponto de tempo, a percentagem dealteração em glicose no sangue foi determinada para 10camundongos e a alteração média ±SEM é traçada.

Descrição Detalhada da Invenção

1. Visão geral

A presente invenção refere-se genericamente a análogosde GLP-I que têm meia-vidas in vivo aumentadas, porexemplo, resultando de suscetibilidade reduzida à clivagempor enzimas proteoliticas e/ou afinidade aumentada para oreceptor de GLP-1, ainda assim retêm a atividade desejadade GLP-I. Em particular, a presente invenção refere-se àdescoberta de que a meia-vida in vivo de um peptídeo tendoatividade semelhante a GLP-I pode ser alongada pela ligaçãode um a quinze resíduos de aminoácido (de ocorrêncianatural ou não natural) à extremidade carbóxi do peptídeo.

Os análogos de GLP-I da invenção têm um a quinzeresíduos de aminoácido ligados à extremidade terminal decarbóxi da seqüência de aminoácidos de base. A seqüência deaminoácido de base se refere à seqüência de aminoácidoantes da modificação com um a quinze resíduos de aminoácidoadicionais. Tipicamente, a seqüência de aminoácido de baseé pelo menos 50% idêntica à seqüência de um entre GLP-I-(7-34), GLP-I (7-35) , GLP-I- (7-36) e GLP-I- (7-37) (SEQ ID NOS:1-4) particularmente pelo menos 80% idêntica, pelo menos90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, ou mesmo 100%idêntica. Tipicamente, a identidade de seqüência é medidasobre o comprimento inteiro da seqüência relevante. Emcertas modalidades da invenção, a seqüência de aminoácidode base é uma de GLP-I-(7-34), GLP-I(7-35), GLP-I-(7-36) eGLP-I-(7-37) (SEQ ID NOS: 1-4) ou difere em somente umresíduo de aminoácido a partir de GLP-I-(7-34), GLP-I(7-35), GLP-I-(7-36) e GLP-I-(7-37) (SEQ ID NOS: 1-4). Asseqüências de GLP-I-(7-34), GLP-I(7-35), GLP-I-(7-36) eGLP-I-(7-37) (SEQ ID NOS: 1-4) são como a seguir:

GLP-I-(7-34): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVK (SEQ ID NO:1)

GLP-I-(7-35): HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKG (SEQ IDNO: 2)

GLP-I-(7-36) : HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ IDNO: 3)

GLP-1-(7-37) : HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ IDNO: 4)

Os resíduos de aminoácido adicionados são tipicamenteresíduos de alfa-aminoácido.

Em certas modalidades, um ou mais (até mesmo todos)resíduos de aminoácido adicionados são de ocorrência nãonatural. Como utilizado aqui, aminoácidos de ocorrência nãonatural são aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidoscodificados para DNA humano. "Ocorrência não natural" nãopretende excluir todos os aminoácidos encontrados emorganismos (por exemplo, seres humanos e outros mamíferos)a menos que especificamente indicado.

Aminoácidos de ocorrência não natural exemplaresapropriados para uso na invenção são aqueles tendo cadeiaslaterais contendo arila. Em certas modalidades, a cadeialateral contendo arila tem um grupo de arila bicíclico oupolicíclico. Em certas modalidades, a cadeia lateralcontendo arila tem dois ou mais grupos de arila, comobifenil (4-fenil-fenil). Aminoácidos exemplares com cadeiaslaterais de ocorrência não natural incluem bifenil glicina,bifenil alanina e naftil glicina, cujas estruturas são comoa seguir:

adicionados são todos de ocorrência natural. Quando todosos resíduos de aminoácido adicionados são de ocorrêncianatural, os resíduos são vantajosamente selecionados de umou mais daqueles na extremidade carbóxi, resíduos 31-39, deexendin-4. Exendin-4 é um hormônio de peptídeo isolado apartir da salina de Heloderma suspectum (Gila monster) quetem atividade de redução de glicose em mamíferos. Osresíduos 31-39 de exendin-4 são:

Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 5).

Preferivelmente, pelo menos três resíduos consecutivosa partir dos resíduos 31-39, como Pro-Ser-Ser ou aseqüência inteira de nove resíduos, são adicionados àextremidade carbóxi de uma seqüência de aminoácido de base.Em outra modalidade preferida, somente Pro é ligado ãextremidade carbóxi.

Em certas modalidades da invenção, a seqüência deaminoácido de base é modificada para proteinases declivagem pós-prolina na posição P'i (o resíduo para o ladoterminal de carbóxi do sítio de clivagem de amida) . Essamodificação produz análogos de GLP-I com suscetibilidademuito reduzida à clivagem mediada por enzima em relação aGLP-I nativo, ainda assim os análogos retêm a atividadebiológica de GLP-I nativo.

Tipicamente, a modificação de análogos de GLP-I noresíduo P'i (do sítio de clivagem) envolve a substituiçãode um análogo de aminoácido tendo um carbono Οβ tetra-substituído. Tais análogos de aminoácido podem aumentaracentuadamente a meia-vida in vivo do análogo resultante,por exemplo, que pode ter uma duração mais longa de açãobiológica e/ou clearance reduzida (por exemplo, meia-vidade soro mais longa) em relação ao polipeptídeo do tiposelvagem.

Embora a substituição do resíduo de P'i por outroaminoácido de ocorrência natural seja considerada, emmodalidades preferidas, o resíduo de P'i com um análogo deaminoácido de ocorrência não natural e ainda maispreferivelmente, com um que é um análogo estrutural, porexemplo, retendo atributos similares com relação à naturezaestérica e/ou eletrônica. Para ilustrar, em certasmodalidades a presente invenção provê um polipeptídeomodificado que é tornado menos suscetível à proteólise poruma proteinase de clivagem pós-prolina, como dipeptidilpeptidase IV (DPP-IV), onde o polipeptídeo foi modificadona posição P'i com um aminoácido ou análogo de aminoácidoda Fórmula 1:

<formula>formula see original document page 12</formula>onde:

R1 e R2 representam cada um independentemente umaalquila inferior, heteroalquila, cicloalquila,heterocicloalquila, arila, alcoxila, carboxamida,carbonila, halogênio, hidroxila, amina ou ciano, ou Ri e R2tomados juntos formam um anel de 4-7 átomos;

R3 representa uma alquila inferior, heteroalquila,cicloalquila, heterocicloalquila, arila, amino, alcoxila,halogênio, carboxamida, carbonila, ciano, tiol, tioalquila,acilamino, um amido, ciano, nitro, azido, sulfato,sulfonato, sulfonamido, -(CH2)m-Ri, - (CH2)nT0ii' "(CH2)m-COOH, - (CH2)m-0-alquila inferior, -(CH2)m-0-alquenilainferior, -(CH2)n-O-(CH2)m-R4, -(CH2)m-S-alquila inferior,- (CH2) m-S-alquenila inferior, -(CH2)n-S-(CH2)m-R4, -(CH2)m-N-C (=NH) NH2, - (CH2) m-C (=0) NH2, OU-(CH2)m-NH2,,.

R4 representa independentemente para cada ocorrência,uma arila, aralquila, cicloalquila, cicloalquenila ou umheterociclo;

M = 0, 1 ou 2; e

N=O,1 ou 2.

Em certas modalidades preferidas, Ri e R2 representamcada um independentemente um grupo hidrofóbico pequeno,como alquila inferior (preferivelmente metila, etila oupropila, e ainda mais preferivelmente metila), umhalogênio, ou uma alquila inferior halogenada.

Em certas modalidades preferidas, R3 representa umaalquila inferior, mais preferivelmente metila, etila oupropila, e ainda mais preferivelmente metila. Em outrasmodalidades preferidas, R3 representa uma arila, comofenila ou hidróxi fenila (preferivelmente para-hidróxi) .Ainda em outras modalidades preferidas, R3 representa umgrupo de hidroxila. Ainda em outras modalidades preferidas,R3 representa -(CH2)ra-COOH7 onde m é preferivelmente 0 ou 1.

Em certas modalidades preferidas, η = 0.

Em certas modalidades preferidas de tais análogos desubstrato, o P'i é um análogo de aminoácido tendo umcarbono Οβ tetrassubstituido, como representado na fórmulaII:

<formula>formula see original document page 14</formula>

onde:

R1 e R2 representam cada um independentemente umaalquila inferior, heteroalquila, cicloalquila,hetrocicloalquila, arila, alcoxila, carboxamida, carbonila,halogênio, hidroxila, amina ou ciano, ou R1 e R2 tomadosjuntos formam um anel de 4-7 átomos;

R3 representa uma alquila inferior, heteroalquila,amino, alcoxila, halogênio, carboxamida, carbonila, ciano,tiol, tioalquila, acilamino, nitro, azido, sulfato,sulfonato, sulfonamido, -(CH2)m-R4, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, - (CH2)m-0-alquila inferior, - (CH2)m-0-alquenilainferior, -(CH2)n-O-(CH2)m-R4, -(CH2)m-S-alquila inferior,- (CH2) m-S-alquenila inferior, -(CH2)n-S-(CH2)m-R4, -(CH2)m-N-C(=NH)NH2, - (CH2)m-C(=0)NH2, OU -(CH2)m-NH2,,.

R4 representa independentemente para cada ocorrência,uma arila, aralquila, cicloalquila, cicloalquenila ou umheterociclo não aromático; em = O, 1 ou 2.

Em certas modalidades, Ri e R2 representam cada umindependentemente uma alquila inferior ou um halogênio; R3representa uma alquila inferior, arila, um grupo dehidróxi , -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-NH2, - (CH2) m-N-C (=NH) NH2 , -(CH2) m-C(=0) NH2, -SH, ou -(CH2)m-S-CH3; e m = 0, 1 ou 2.

Em certas modalidades preferidas, Ri e R2 representamcada um independentemente uma metila, etila ou propila, eainda mais preferivelmente uma metila.

Em certas modalidades preferidas, R3 representa umaalquila inferior, mais preferivelmente metila, etila oupropila, e ainda mais preferivelmente uma metila. Em outrasmodalidades preferidas, R3 representa uma arila, comofenila, hidróxi fenila (preferivelmente para-hidróxi),indol ou imidazol. Ainda em outras modalidades preferidas,R3 representa um grupo hidroxila. Em certas modalidadespreferidas, R3 representa -COOH ou -CH2-COOH. Ainda emoutras modalidades preferidas, R3 representa-CH2-CH2-N-C (=NH) NH2 , -CH2-C (=0) NH2 , -CH2-CH2-C (=0) NH2 , -SH,OU -CH2-S-CH3.

Seqüências de aminoácido de base exemplares tendo umresíduo P'i modificado são mostradas na Tabela 1, onde Xindica a posição do resíduo P' ι modificado:

Tabela 1

Seqüência nativa_Análogo exemplar

<table>table see original document page 15</column></row><table><table>table see original document page 16</column></row><table>

Mais genericamente, a presente invenção consideraespecificamente a geração de análogos para GLP-I que têmuma seqüência de aminoácido:

Xaa-Ala-Yaa-R ou Xaa-Pro-Yaa-R'

onde Xaa e Yaa representam resíduos de aminoácido, e Re R', independentemente para cada ocorrência, representamcadeias de polipeptídeo tendo atividade semelhante a GLP-1e compreendendo 1 a aproximadamente 100 resíduos deaminoácido, onde a seqüência de análogo Yaa é substituídapor um resíduo de aminoácido representado pela Fórmula I ouFórmula II. A invenção considera a modificação depolipeptídeos variantes que diferem em seqüência de GLP-1para produzir análogos de P'i variantes. Tais variantes sãopelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ou maior do que 99%idênticas a GLP-1-(7-36).

Em certas modalidades, R é um polipeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido selecionada de:

GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 10) , e

GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2 (SEQ ID NO: 11),

ou uma seqüência que difere em 5 ou menos resíduos deaminoácido para a mesma, ainda mais preferivelmente difereem não mais do que 4, 3 ou mesmo 2 resíduos de aminoácido.Uma seqüência de aminoácido de base preferida é:His-Ala-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO: 12),

onde Xaa é beta-dimetil aspartato ou terc-leucina,particularmente beta-dimetil aspartato. Aminoácidos ligadosvantajosamente a essa seqüência de aminoácido de baseincluem bifenil glicina, Pro-Ser-Ser e Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 5) .

II. Definições

O sítio de ligação parra um substrato de peptídeoconsiste em uma série de "sub-sítios de especificidade"através da superfície da enzima. O termo "sub-sítio deespecificidade" se refere a um bolso ou outro sítio naenzima capaz de interagir com uma porção de um substratopara a enzima.

Ao discutir as interações de peptídeos e substratos deproteína com proteinases, por exemplo, proteinases deserina e cisteína e similares, o presente pedido utiliza anomenclatura de Schechter e Berger [(1967) Biochem.Biophys. Res. Commun. 27:157-162) ] . Os resíduos deaminoácido individuais de um substrato ou inibidor são, apartir da extremidade amino para a extremidade carbóxi,designadas -P2-Pi-P' i-P' 2-/ etc. e os sub-sítioscorrespondentes da enzima são designados -S2-Si-S'i-S'2-,etc. A ligação scissile do substrato é a ligação de amidaque liga os resíduos Pi e Pi1.

Um "resíduo de Pii" se refere ao resíduo de aminoácidode um polipeptídeo de substrato que se torna a novaextremidade amino do polipeptídeo de produto resultando apartir de clivagem mediada por proteinase da estrutura deamida do polipeptídeo de substrato. Para ilustraradicionalmente, um polipeptídeo de substrato inclui umaligação de estrutura de amida que está sujeita a uma reaçãoproteolítica representada pelo esquema geral:

<formula>formula see original document page 18</formula>

Pelo termo "resíduo de aminoácido" quer se dizer umaminoácido, tipicamente um alfa-aminoácido. Em geral asabreviaturas utilizadas aqui para designar os aminoácidosde ocorrência natural se baseiam em recomendações do IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (videBiochemistry (1972) 11:1726-1732). Por exemplo, met, IlelLeu, Ala e Gly representam "resíduos" de metionina,isoleucina, leucina, alanina e glicina, respectivamente.Pelo resíduo quer se dizer um radical derivado a partir deα-aminoácido correspondente pela eliminação da porção de OHdo grupo carboxila e a porção H do grupo a-amino.

O termo "cadeia lateral de aminoácido" é aquela partede um resíduo de aminoácido exclusiva da estrutura, comodefinido por K. D. Kopple, "Peptides and Amino acids," W.A.Benjamin Inc., Nova York e Amsterdam, 1966, páginas 2 e 33;os exemplos de tais cadeias laterais dos aminoácidos comunssão -CH2CH2SCH2 (a cadeia lateral de metionina) , -CH2(CH3)-CH2CH3 (a cadeia lateral de isoleucina) , -CH2CH(CH3)2 (acadeia lateral de leucina) ou -H (a cadeia lateral deglicina). Essas cadeias laterais são pendentes a partir docarbono Ca de estrutura.

0 termo "carbono CP tetrassubstituído" se refere a umátomo de carbono que é (i) diretamente pendente a partir decarbono ca da estrutura de aminoácido, e (ii) contém quatrosubstituintes (incluindo o carbono Ca) , nenhum dos quais éhidrogênio.

Como utilizado aqui, "proteína" é um polímero queconsiste essencialmente em uma combinação de quaisquer dos20 aminoácidos. Embora "polipeptídeo" seja freqüentementeutilizado em referência a proteínas relativamente grandes,e "peptídeo" seja freqüentemente utilizado em referência àproteína pequena, o uso desses termos na técnica sesobrepõe e é variado. A menos que evidente a partir docontexto, os termos "peptídeo(s)", "proteína(s)" e"polipeptídeo(s)" são utilizados de forma intercambiávelaqui.

A International Union of Biochemistry and MolecularBiology (1984) recomendou o uso do termo "peptidase" para osubconjunto de hidrolases de ligação de peptídeo (SubclasseE.C.3.4). 0 termo amplamente utilizado "protease" ésinônimo de "peptidase", e são utilizados de formaintercambiável aqui. Peptidases compreendem dois grupos deenzimas: as endopeptidases e as exopeptidases.Endopeptidases clivam ligações de peptídeo em pontos dentrode uma proteína, e exopeptidases removem aminoácidosseqüencialmente a partir da extremidade amino ou carbóxi.O termo "proteinase" também é utilizado como sinônimopara endopeptidase. Proteinases são classificadas de acordocom seus mecanismos cataliticos. Quatro classes mecanistasforam reconhecidas pela International Union of Biochemistryand Molecular Biology: proteinases de serina, proteinasesde cisteína, proteinases aspárticas, e metaloproteinases.

O termo "agonista", como utilizado aqui, pretende sereferir a um análogo que retém a bioatividade do substratonativo de interesse (por exemplo, GLP-1) de modo a produzirum efeito biológico similar quando administrado a umanimal.

O termo "antagonista" se refere a um análogo que nãoretém a bioatividade do substrato nativo de interesse (porexemplo, GLP-1), ou pelo menos em um nível reduzido deatividade relativa ao substrato nativo, e inibe a açãobiológica do substrato nativo.

O termo "análogo" se refere a uma moléculasubstancialmente similar em função a um peptídeo ouproteína nativa ou um fragmento do mesmo.

"Instrução(ões)" como utilizado aqui significa umrótulo de produto e/ou documentos descrevendo materiaisrelevantes ou metodologias pertinentes ao uso de um kit ouproduto farmacêutico embalado. Esses materiais podemincluir qualquer combinação do que se segue: informaçõesantecedentes, lista de componentes, dosagens propostas,alertas em relação a possíveis efeitos colaterais,instruções para administração da droga, suporte técnico equaisquer outros documentos relacionados.

Uma "quantidade eficaz" de um composto, por exemplo,como um análogo da presente invenção, com relação ao uso notratamento, se refere a uma quantidade do análogo em umpreparado que, quando administrado como parte de um regimede dosagem desejado (a um mamífero, preferivelmente um serhumano) alivia um sintoma, melhora uma condição, ou diminuio início de condições de doença de acordo com padrõesclinicamente aceitáveis para o distúrbio ou condição a sertratada ou a finalidade cosmética, por exemplo, em umarazão razoável de benefício/risco aplicável em qualquertratamento médico.

O termo "alquila" se refere a um radical de cadeia decarbono ramificada ou não ramificada, totalmente saturada,tendo o número de átomos de carbono especificado, ou até 3 0átomos de carbono se nenhuma especificação for feita. Porexemplo, uma "alquila inferior" se refere a uma alquilatendo de 1 a 10 átomos de carbono, como metila, etila,propila, butila, pentila, hexila, heptila e octila eaqueles que são isômeros posicionais dessas alquilas.

Alquila de 10 a 30 átomos de carbono incluem decila,undecila, dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila,hexadecila, heptadecila, octadecila, nonadecila, eicosila,heneicosila, docosila, tricosila e tetracosila. Emmodalidades preferidas, uma alquila de cadeia reta oucadeia ramificada tem 3 0 ou menos átomos de carbono em suaestrutura (por exemplo, C1-C30 para cadeias retas, C3-C30para cadeias ramificadas), e mais preferivelmente, 20 oumenos. De modo semelhante, cicloalquilas preferidas têm de3-10 átomos de carbono em sua estrutura de anel, e maispref erivelmente têm 5, 6 ou 7 carbonos na estrutura deanel.

Além disso, o termo "alquila" (ou "alquila inferior")como utilizado em todo relatório descritivo, exemplos ereivindicações pretende incluir cadeias de alquila tantonão substituídas como substituídas, as últimas se referem afrações de alquila tendo substituintes substituindo umhidrogênio em um ou mais carbonos da estrutura dehidrocarboneto. Tais substituintes podem incluir, porexemplo, um halogênio, uma hidroxila, uma carbonila (comouma carboxila, um alcóxi carbonila, formila ou acila), umtiocarbonila (como tioéster, tioacetato ou tioformato), umalcoxila, fosforila, fosfato, fosfonato, fosfinato, amino,amido, amidina, ciano, nitro, sulfidrila, alquiltio,sulfato, sulfonato, sulfamoíla, sulfonamido, sulfonila,heterociclila, aralquila, ou uma fração aromática ouheteroaromática. Será entendido por aqueles versados natécnica que as frações substituídas na cadeia dehidrocarboneto podem elas próprias ser substituídas, seapropriado. Por exemplo, os substituintes de uma alquilasubstituída podem incluir formas substituídas ou nãosubstituídas de amino, azido, imino, amido, fosforila(incluindo fosfonato e fosfinato), sulfonila (incluindosulfonato, sulfonamido, sulfamoíla e sulfonato) e grupossilila, bem como éteres, alquiltios, carbonilas (incluindocetonas, aldeídos, carboxilatos e ésteres), -CF3, -CN esimilares. Alquilas exemplares substituídas são descritasabaixo. Cicloalquilas podem ser adicionalmente substituídascom alquilas, alquenila, alcoxilas, alquiltios,aminoalquilas, alquilas substituídas por carbonila, -CF3, -CN e similares.

A menos que o número de carbonos seja de outro modoespecificado, "alquila inferior", como utilizado aqui,significa um grupo de alquila, como definido acima, porémtendo de um a dez carbonos, mais preferivelmente de um aseis átomos de carbono em sua estrutura como metila, etila,n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, eterc-butila. De modo semelhante, "alquenila inferior" e"alquinila inferior" têm comprimentos de cadeia similares.Em todo pedido, grupos de alquila preferidos são alquilasinferiores. Em modalidades preferidas, um substituintedesignado aqui como alquila é uma alquila inferior.

Um "grupo de heteroalquila" é um grupo de alquila ondeum ou mais dos átomos de carbono internos (isto é, nãoterminal) é substituído por um heteroátomo, comonitrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo, selênio ou silício.Tipicamente, o heteroátomo é nitrogênio, oxigênio ouenxofre. Um "grupo heterocicloalquila" é o grupo de alquilacíclico análogo onde um átomo de carbono é substituído porum heteroátomo.

O termo "carbociclo", como utilizado aqui, se refere aum anel aromático ou não aromático no qual cada átomo doanel é carbono.

O termo "arila" como utilizado aqui inclui gruposaromáticos de anel único com 5, 6 e 7 membros que podemincluir de zero a quatro heteroátomos, por exemplo,benzeno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol,triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina epirimidina, e similares. Aqueles grupos de arila tendoheteroátomos na estrutura de anel também podem sermencionados como "heterociclos de arila" ou"heteroaromáticos". O anel aromático pode ser substituídoem uma ou mais posições de anel com tais substituintes comodescrito acima, por exemplo, halogênio, azida, alquila,aralquila, alquenila, alquinila, cicloalquila, hidroxila,alcoxila, amino, nitro, sulfidrila, imino, amido,fosfonato, fosfinato, carbonila, carboxila, silila, éter,alquiltio, sulfonila, sulfonamido, cetona, aldeído, éster,heterociclila, frações aromáticas ou heteroaromáticas, -CF3, -CN ou similares. O termo "arila" também incluisistemas de anel policiclico tendo dois ou mais anéiscíclicos nos quais dois ou mais carbonos são comuns a doisanéis contíguos (os anéis são "anéis fundidos") onde pelomenos um dos anéis é aromático, por exemplo, os outrosanéis cíclicos podem ser cicloalquila, cicloalquenilas,cicloalquinilas, arilas e/ou heterociclilas.

"Alquenila" se refere a qualquer radical de cadeia de15 carbono insaturado ramificada ou não ramificada tendo onúmero de átomos de carbono especificado, ou até 26 átomosde carbono se nenhuma limitação no número de átomos decarbono for especificado; e tendo 1 ou mais ligações duplasno radical. Alquenila de 6 a 26 átomos de carbono éexemplificado por hexenila, heptenila, octenila, nonenila,decenila, undecenila, dodenila, tridecenila, tetradecenila,pentadecenila, hexadecenila, heptadecenila, octadecenila,nonadecenila, eicosenila, heneicosoenila, docosenila,tricosenila e tetracosenila, em suas várias formasisoméricas, onde a(s) ligação(ões) insaturada(s) podem serlocalizadas em qualquer lugar no radical e podem ter aconfiguração (Z) ou (E) em torno da(s) ligação(ões)dupla(s).

O termo "alquinila" se refere a radicais dehidrocarbila do escopo de alquenila, porém tendo 1 ou maisligações triplas no radical.

Os termos "alcoxila" ou "alcóxi", como utilizado aqui,se refere a um grupo de alquila, como definido abaixo,tendo um radical de oxigênio ligado ao mesmo. Grupos dealcoxila representativos incluem metóxi, etóxi, propóxi,terc-butóxi e similares. Um "éter" são dois hidrocarbonetoscovalentemente ligados por um oxigênio. Por conseguinte, osubstituinte de uma alquila que fornece aquela alquila uméter é ou se parece com uma alcoxila, como pode serrepresentado por um entre -0-alquila, -O-alquenila, -0-alquinila, -O-(CH2)m-Ri, onde m e Ri são descritos abaixo.

Os termos "heterociclila" ou "grupo heterocíclico" sereferem a estruturas de anel de 3 a 10 membros, maispreferivelmente anéis com 3 a 7 membros, cujas estruturasde anel incluem um a quatro heteroátomos. Heterociclospodem ser também policiclos. Grupos de heterociclilaincluem, por exemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano,isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiina, pirrol,imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina,pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol,indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina,ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinolina,pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina,pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenazsazina,fenotiazina, furazan, fenoxazina, pirrolidina, oxolano,tiolano, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina,lactonas, lactamas como azetidinonas e pirrolidinonas,sultams, sultonas, e similares. 0 anel heterocíclico podeser substituído em uma ou mais posições com taissubstituintes como descrito acima, como por exemplo,halogênio, alquila, aralquila, alquenila, alquinila,cicloalquila, hidroxila, amino, nitro, sulfidrila, imino,amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonila, carboxila,silila, sulfamoíla, sulfinila, éter, alquiltio, sulfonila,cetona, aldeído, éster, um heterociclila, uma fraçãoaromática ou heteroaromática, -CF3, -CNou similar.

O termo "alquiltio" se refere a um grupo de alquila,como definido acima, tendo um radical de enxofre ligado aomesmo. Em modalidades preferidas, a fração de "alquiltio" érepresentada por um entre - (S)-alquila, - (S)-alquenila, -(S)-alquinila e -(S)-(CH2)m-Ri, onde m e Ri são definidosabaixo. Grupos de alquiltio representativos incluemmetiltio, etiltio e similares.

Como utilizado aqui, o termo "nitro" significa -NO2; otermo "halogênio" designa -F7 -Cl, -Br ou -I; o termo"sulfidrila" ou "tiol" significa -SH; o termo "hidroxila"significa -0H; e o termo "sulfonila" significa -SO2-.

Os termos "amina" e "amino" são reconhecidos natécnica e se referem a aminas tanto não substituídas comosubstituídas, por exemplo, uma fração que pode serrepresentada pelas fórmulas gerais:

<formula>formula see original document page 26</formula>

Em que R3, R5 e R6 representam cada umindependentemente um hidrogênio, uma alquila, alquenila, -(CH2)m-R1, ou R3 e R5 tomados juntamente com o átomo N aoqual são ligados completam um heterociclo tendo de 4 a 8átomos na estrutura de anel; Ri representa uma alquenila,arila, cicloalquila, cicloalquenila, heterociclila oupoliciclila; e m é zero ou um número inteiro na faixa de 1a 8. Em modalidades preferidas, somente um entre R3 ou R5pode ser um carbonila, por exemplo, R3, R5 e o nitrogêniojuntos não formam uma imida. Em modalidades maispreferidas, R3 e R5 (e opcionalmente R6) representam cada umindependentemente um hidrogênio, uma alquila, alquenila ou-(CH2)m-Ri- Desse modo, o termo "alquil amina" comoutilizado aqui, significa um grupo amina, como definidoacima, tendo uma alquila substituída ou não substituídaligada ao mesmo, isto é, pelo menos um entre R3 e R5 é umgrupo alquila. Em certas modalidades, um grupo amino ou umaalquil amina é básica, significando que tem um pKa > 7.00.

As formas protonadas desses grupos funcionais têm pKasrelativos à água acima de 7.00.

O termo "carbonila" é reconhecido na técnica e incluitais frações como podem ser representadas pela fórmulageral:

<formula>formula see original document page 27</formula>

Onde X é uma ligação ou representa um oxigênio ouenxofre, e R7 representa um hidrogênio, uma alquila, umaalquenila, -(CH2)m-R1 ou um sal farmaceuticamente aceitável,R8 representa um hidrogênio, alquila, alquenila, ou -(CH2)m-R1 onde m e Ri são como definido acima. Onde X é umoxigênio e R7 ou R8 não é hidrogênio, a fórmula representaum "éster" . Onde X é um oxigênio, e R7 é como definidoacima, a fração é mencionada aqui como um grupo carboxila,e particularmente quando R7 é hidrogênio, a fórmularepresenta um "ácido carboxíIico." Onde X é um oxigênio, eR8 é hidrogênio, a fórmula representa um "formato". Emgeral, onde o átomo de oxigênio da fórmula acima ésubstituído por enxofre, a fórmula representa um grupo"tiocarbonila". Onde X é um enxofre e R7 ou R8 não éhidrogênio, a fórmula representa um grupo "tioéster". OndeX é um enxofre e R7 é hidrogênio, a fórmula representa umgrupo de "ácido tiocarboxílico". Onde X é um enxofre e R8 éhidrogênio, a fórmula representa um grupo "tioformato". Poroutro lado, onde X é uma ligação, e R7 não é hidrogênio, afórmula acima representa um grupo "acila". Onde X é umaligação, e R7 é hidrogênio, a fórmula acima representa umgrupo de "aldexdo".

Como utilizado aqui, o termo "substituído" éconsiderado como incluindo todos os substituintespermissíveis de compostos orgânicos. Em um aspecto amplo,os substituintes permissíveis incluem substituintes decompostos orgânicos acíclico e cíclico, ramificado e nãoramificado, carbocíclico e heterocíclico, aromático e nãoaromático. Substituintes ilustrativos incluem, por exemplo,aqueles descritos acima. Os substituintes permissíveispodem ser um ou mais e iguais ou diferentes para compostosorgânicos apropriados. Para fins da presente invenção, osheteroátomos como nitrogênio podem ter substituintes dehidrogênio e/ou quaisquer substituintes permissíveis decompostos orgânicos descritos aqui que satisfazem asvalências dos heteroátomos. A presente invenção nãopretende ser limitada de modo algum pelos substituintespermissíveis de compostos orgânicos. Será entendido que"substituição" ou "substituído com" inclui a condiçãoimplícita de que tal substituição está de acordo comvalência permitida do átomo substituído e substituinte, eque a substituição resulta em um composto estável, porexemplo, que não é submetida espontaneamente àtransformação como por rearranjo, ciclização, eliminação,etc.

0 termo "sulfamoxla" é reconhecido na técnica e incluiuma fração que pode ser representada pela fórmula geral:

<formula>formula see original document page 29</formula>

em que R3 e R5 são como definidos acima.

0 termo "sulfato" é reconhecido na técnica e incluiuma fração que pode ser representada pela fórmula geral

<formula>formula see original document page 29</formula>

na qual R7 é como definido acima.

0 termo "sulfonamido" é reconhecido na técnica einclui uma fração que pode ser representada pela fórmulageral:

<formula>formula see original document page 29</formula>

na qual R2 e R4 são como definidos acima.o termo "sulfonato" é reconhecido na técnica e incluiuma fração que pode ser representada pela fórmula geral:

<formula>formula see original document page 29</formula>

na qual R7 é um par de elétrons, hidrogênio, alquila,cicloalquila ou arila.

Os termos "sulfóxido" ou "sulfinila" , como utilizadoaqui, se referem a uma fração que pode ser representadapela fórmula geral:

<formula>formula see original document page 30</formula>

na qual R12 é selecionado entre hidrogênio, alquila,alquenila, alquinila, cicloalquila, heterociclila,aralquila ou arila.

Substituições análogas podem ser feitas em grupos dealquenila e alquinila para produzir, por exemplo,aminoalquenilas, aminoalquinilas, amidoalquenilas,amidoalquinilas, iminoalquenilas, iminoalquinilas,tioalquenilas, tioalquinilas, alquenilas substituídas porcarbonila ou alquinilas.

Como utilizado aqui, a definição de cada expressão,por exemplo, alquila, m, n, etc., quando ocorre mais de umavez em qualquer estrutura, pretende ser independente de suadefinição em outro lugar na mesma estrutura.

Para fins dessa invenção, os elementos químicos sãoidentificados de acordo com a Tabela Periódica dosElementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics,67a ed., 1986-87, capa interna. Também para fins dapresente invenção, o termo "hidrocarboneto" é consideradocomo incluindo todos os compostos permissíveis tendo pelomenos um hidrogênio e um átomo de carbono. Em um aspectoamplo, os hidrocarbonetos permissíveis incluem compostosorgânicos acíclicos e cíclicos, ramificados e nãoramificados, carbocíclicos e heterocíclicos, aromáticos enão aromáticos que podem ser substituídos ou nãosubstituídos.

III. Modalidades exemplares

(a) Características de análogos

Em muitas modalidades, o análogo será selecionado parareter um ou mais da atividade in vitro ou in vivo dosubstrato nativo. As atividades in vitro e in vivo podemser medidas utilizando qualquer protocolo disponível a umapessoa com conhecimentos comuns que seja apropriado para oanálogo específico. Atividades funcionais exemplares quepodem ser medidas para determinar se um análogo mantématividade funcional igual ou similar incluem capacidade doanálogo de ligar seu(s) receptor(es) em um ensaio baseadoem célula ou livre de células, capacidade do análogo eminduzir uma alteração (por exemplo, proliferação,diferenciação, sobrevivência, crescimento, migração, etc.)em uma célula responsiva a GLP-1, capacidade do análogo demodular a expressão de um ou mais outros genes ou proteínasem uma célula responsiva a GLP-I.

Em certas modalidades, o análogo tem atividadesubstancialmente similar como GLP-I nativo ou um fragmentodo mesmo (por exemplo, aproximadamente 80%, 90%, 100%,110%, ou 120% tão ativo quanto o GLP-I nativo). Em algumasmodalidades, o análogo é menos ativo do que o GLP-I nativo(por exemplo, aproximadamente 50%, 60%, 70% ou 75% tãoativo quanto o polipeptídeo nativo). Observa-se que umanálogo que é de certo modo menos ativo pode ser útil, comoin vivo ou em cultura de células, se a redução em atividadeainda prover a capacidade de fornecer uma concentraçãolocal suficiente de análogo por um período de temposuficiente. Desse modo, um aumento em meia-vida obtido, porexemplo, por resistência a proteinase poderia compensar adiminuição em atividade causada pela construção do análogo.Ainda em outra modalidade, o análogo é mais ativo do queGLP-I nativo (por exemplo, aproximadamente 130%, 150%,175%, 200%, 300%, 500%, 800% ou mesmo 1000% tão ativoquanto GLP-I nativo). Em qualquer um dos acima, por"atividade" quer se dizer uma ou mais funções de GLP-Inativo. Por exemplo, uma atividade (por exemplo, uma funçãobiológica) de um análogo pode ser ligação por receptor,capacidade de atuar como um ativador ou repressor detranscrição, capacidade de participar em uma via detransdução de sinal específica, ou a capacidade deinfluenciar o comportamento de células (por exemplo,proliferação, diferenciação, sobrevivência ou migração).

Tais atividades podem ser expressas, por exemplo, comoconstante de ligação relativa (como para a ligação porreceptor), concentrações eficazes (EC30) e/ou doseseficazes (ED50).

Análogos exemplares têm uma meia-vida aumentada (ouduração de ação) em comparação com GLP-I nativo (in vitroe/ou in vivo). Entretanto, será genericamente reconhecidoque vários análogos terão meias-vidas diferentes (bem comouma mudança diferente em meia-vida em comparação com GLP-Inativo). A meia-vida in vitro e/ou in vivo (ou duração deação) pode ser facilmente medida por uma pessoa versada natécnica utilizando métodos padrão, por exemplo, o curso detempo de efeitos de redução de glicose. Em certasmodalidades, o análogo tem uma meia-vida in vitro ou invivo (duração de ação) que é aproximadamente um fator de0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,0,8, 0,9, 1,0, 1,3,1,5,2, 3, 5, 10, 25, 30, 50, 75, 100 ou ainda maior do que100 vezes a meia-vida in vitro e/ou in vivo do polipeptídeonativo sob condições similares de ensaio de medição demeia-vida.

b) Síntese de análogos de hormônio de peptídeo

Os análogos da invenção podem ser preparados porsíntese de fase sólida padrão; vide, por exemplo, Stewart,J.M., e outros, Solid Phase Synthesis (Pierce Chemical Co.,2a edição, 1984) . Como genericamente sabido, peptídeos docomprimento exigido podem ser preparados utilizandoequipamento e reagentes comercialmente disponíveis seguindoas instruções dos fabricantes para bloquear grupos deinterferência, proteger o aminoácido a ser reagido,acoplamento, desproteção e cobertura de resíduos nãoreagidos. Equipamentos apropriados podem ser obtidos, porexemplo, da Applied BioSystems em Foster City, Calif., ouBiosearch Corporation em San Raphael, Calif.

Em um método preferido, os análogos são sintetizadosutilizando protocolos de síntese de fase sólidaautomatizada padrão empregando alfa-aminoácidos t-butóxicarbonila com proteção de cadeia lateral apropriada. 0análogo completo é removido do suporte de fase sólida comdesproteção de cadeia lateral simultânea utilizando ométodo de fluoreto de hidrogênio padrão. Análogos brutossão adicionalmente purificados por HPLC-fase reversa semi-preparativo (Vydac C18) utilizando gradientes deacetonitrila em 0,1% de ácido trifuoroacético (TFA). Osanálogos são secos a vácuo para remover acetonitrila eliofilizados de uma solução de TFA a 0,1% em água. A purezaé verificada por RP-HPLC analítico. Os peptídeos podem serliofilizados e então solubilizados em água ou ácido acético0,01 M em concentrações de 1-2 mg/mL em peso.

0 uso dos métodos sintéticos acima mencionados énecessário se aminoácidos não codificados ou as formas D deaminoácidos ocorrem nos análogos. Entretanto, para análogosque podem ser codificados em gene pode-se recorrer também atécnicas recombinantes utilizando seqüências de DNAfacilmente sintetizadas em sistemas de expressãocomercialmente disponíveis.

(c) Ensaios funcionais

Uma variedade de métodos para determinar se um análogocandidato é resistente à proteólise são disponíveis natécnica. Por exemplo, a capacidade de uma proteinaseespecífica de clivar um análogo pode ser medida em umsistema isento de células in vitro. Em tal modalidade de umsistema de ensaio isento de células, o substrato candidato(por exemplo, um análogo e/ou um polipeptídeo nativo) érotulado na extremidade com um rótulo detectável comoradioatividade. O substrato rotulado é incubado na presençade proteinase. Com o passar do tempo, as amostras damistura de reação podem ser paradas e passadas em um gel.

Um deslocamento no tamanho da faixa radioativa indica que opolipeptídeo é clivado pela proteinase, e a taxa na qualesse deslocamento ocorre indica a taxa na qual opolipeptídeo é clivado pela proteinase. Essa taxa pode sercomparada com aquela observada com o polipeptídeo nativo.

Para ilustrar adicionalmente, um experimento exemplarpara testar um análogo específico envolve o que se segue. 0polipeptídeo nativo (GLP-I) e o análogo putativo sãoindividualmente rotulados de forma radioativa (observação:para fins de rotulação, tudo que é necessário é que aclivagem do polipeptídeo produza um fragmento radioativoque difere em tamanho a partir do polipeptídeo rotulado decomprimento total). O polipeptídeo nativo rotulado eanálogo é incubado com a proteinase específica. Apósincubação, tanto o polipeptídeo nativo como o análogo sãoseparados por eletroforese de gel, e a migração da espécierotulada é examinada. Uma vez que a proteinase específica éconhecida por clivar o polipeptídeo nativo, seria esperadover um deslocamento no tamanho do fragmento rotulado dopolipeptídeo nativo (antes e após incubação com enzima) como fragmento menor correspondendo a um produto de clivagem.Entretanto, se o análogo é resistente a proteólise, essedeslocamento em mobilidade após incubação com proteinasenão ocorrerá, ou ocorrerá muito mais lentamente do queocorre para a proteólise da proteína nativa.

A capacidade relativa de uma proteinase clivar umanálogo em comparação com um polipeptídeo nativo pode serdeterminada também um sistema in vitro baseado em células.

Em tal ensaio baseado em células, uma célula que expressauma dada proteinase é contatada com um polipeptídeo nativoou um análogo de tal modo que o polipeptídeo nativo ouanálogo esteja presente na célula. Bem similar ao ensaioisento de células descrito acima, o polipeptídeo nativo eanálogo são rotulados de forma detectável. A clivagem dopolipeptídeo nativo e análogo pode ser medida e comparadapela extração de proteína a partir das células e medição damigração de proteína rotulada.

Em um exemplo adicional de um ensaio baseado emcélulas, uma célula que não expressa uma dada proteinase écontatada com um polipeptídeo nativo rotulado de formadetectável ou análogo de tal modo que o polipeptídeo nativoou análogo seja expresso na célula. A célula éadicionalmente contatada com a proteinase específica de talmodo que a proteinase seja expressa na célula. A clivagemdo polipeptídeo nativo e análogo pode ser medida ecomparada pela extração de proteína a partir das células emedição da migração de proteína rotulada.

Em qualquer um dos ensaios baseados em célula acimamencionados, a invenção considera o uso de qualquer de umnúmero de células primárias ou linhagens de células. Emalguns casos, pode ser vantajoso selecionar uma célula oulinhagem de célula específica na qual conduzir análise invitro. Por exemplo, pode ser vantajoso em alguns casosselecionar uma linhagem de célula que seja maisestreitamente relacionada ao tipo de célula no qual sedeseja eventualmente utilizar o análogo. Entretanto, emoutros casos, pode ser mais útil executar classificaçãoinicial e teste de análogos candidatos em um tipo de célulapossivelmente não relacionada ou linhagem de célulaselecionada principalmente com base em conveniência, eexecutar posteriormente teste de eficácia e segurança emlinhagens de células mais específicas ou em modelos deanimais, conforme necessário.

Além de ensaios baseados em células e isentos decélulas, a resistência à proteinase de um análogoespecífico pode ser medida in vivo utilizando qualquer deum número de modelos de animais. 0 teste inicial daproteólise de um dado análogo pode ser determinado emanimais do tipo selvagem. Durante esse teste inicial, osefeitos positivo ou negativo em potencial do análogo nãosão a questão, porém em vez disso a questão é se um análogoespecífico é resistente à proteólise. Após um análogoespecífico ser mostrado como sendo resistente à proteóliseutilizando qualquer um dos ensaios isento de célula,baseado em célula ou in vivo, descritos acima, testeadicional in vitro e in vivo do análogo pode ser conduzidopara determinar a eficácia terapêutica do análogo.

Ensaios adicionais podem ser utilizados para avaliar aatividade funcional específica de um análogo. Tais ensaiospodem ser selecionados com base no análogo específico. Paraos análogos GLP-I presentes, a atividade funcional doanálogo pode ser avaliada medindo-se a capacidade doanálogo de ligar seu receptor em um ensaio baseado emcélulas ou isento de células, e comparar esse com acapacidade do hormônio de peptídeo nativo. Em qualquer umdesses exemplos, a atividade funcional também pode sermedida em modelos de animais, como aqueles ensaiando níveisde insulina ou glicose de sangue.

O exemplo ilustrativo a seguir provê métodos empotencial de avaliar uma atividade funcional de análogos.

I. Ensaios de atividade insulinotrópica

Peptídeos GLP-I ativos, 7-34, 7-35, 7-36 e 7-37, têmatividade insulinotrópica, e a invenção provê métodos parafazer análogos de peptídeos desses peptídeos GLP-I ativos.A resistência de análogos de peptídeo de GLP-I à proteólisepode ser facilmente medida. Adicionalmente, a atividadefuncional dos análogos de peptídeo GLP-I pode serdemonstrada pelo exame das propriedades insulinotrópicasdos análogos de hormônio de peptídeo. A atividadeinsulinotrópica pode ser determinada, por exemplo, pelaprovisão de um dado análogo de peptídeo a células deanimais, ou injetando aquele análogo em animais emonitorando a liberação de insulina imunorreativa (IRI) nomeio ou sistema circulatório do animal, respectivamente. Apresença de IRI pode ser detectada através do uso de umradioimunoensaio que pode detectar especificamenteinsulina.

O camundongo db/db é uma cepa de camundongogeneticamente obesa e diabética. Os camundongos db/dbdesenvolvem hiperglicemia e hiperinsulinemia concomitantecom seu desenvolvimento de obesidade e desse modo servemcomo modelo de diabetes tipo 2 obeso (NIDDM). Oscamundongos db/db podem ser adquiridos, por exemplo, de TheJackson laboratories (Bar Harbor, Me). Em uma modalidadeexemplar, para tratamento dos camundongos com um regimeincluindo um análogo de hormônio de peptídeo ou controle,amostras de sangue sinus sub-orbital são tiradas antes ealgum tempo (por exemplo, 60 minutos) após dosagem de cadaanimal. Medições de glicose de sangue podem ser feitas porqualquer uma de várias técnicas convencionais, comoutilizando um medidor de glicose. Os níveis de glicose nosangue de animais dosados com análogo de hormônio depeptídeo e controle são comparados.

0 destino metabólico de análogo GLP-I exógeno pode serseguido também em sujeitos não diabéticos ou diabéticos dotipo II, e o efeito de um análogo candidato determinado.Por exemplo, uma combinação de cromatografia líquida depressão elevada (HPLC), radioimunoensaios específicos(RIAs), e um ensaio imunossorvente ligado por enzima(ELISA), pode ser utilizada, pelo que GLP-I biologicamenteativo intacto e seus metabólitos podem ser detectados.Vide, por exemplo, Deaon e outros (1995) Diabetes 44:1126-1131. Para ilustrar, após administração de análogo de GLP-1, o peptídeo intacto pode ser medido utilizando um ELISAou RIA orientado terminalmente NH2, enquanto a diferença emconcentração entre esses ensaios e um RIA específico determinal COOH permitiu determinação de metabólitostruncados terminalmente-NH2. Sem o análogo, GLP-Isubcutâneo é rapidamente degradado em um modo dependente detempo, formando um metabólito que co-elui em HPLC com GLP-l-(9-36) amida e tem o meso perfil imunorreativo. Porexemplo, trinta minutos após administração de GLP-Isubcutânea a pacientes diabéticos (n-8), o metabólitorespondeu por 88,5 + 1,9% do aumento em imunorreatividadede plasma determinada pelo RIA de terminal-COOH, que eramais elevado do que os níveis medidos em sujeitos saudáveis(78,4 + 3,2%; η = 8; P < 0,05). Vide Deacon e outros,supra, GLP-I infundido por via intravenosa também foiextensamente degradado.

Outros métodos de medir atividades insulinotrópicas deanálogos de GLP-I são reveladas na patente US no.5.545.618.

(d) Preparados farmacêuticos

Para uso terapêutico, o análogo escolhido é formuladocom um veículo que é farmaceuticamente aceitável e éapropriado para administrar uma quantidade terapeuticamenteeficaz do análogo em um sujeito utilizando uma dosagemadaptada para uma via de administração escolhida, isto é,oral, intravenosa, ou parenteral, de modo a fornecer opeptídeo ao tecido desejado. Em certas modalidades, osanálogos são não pirogênicos, isto é, não desencadeiamelevação da temperatura corporal de um paciente em mais deuma quantidade clinicamente aceitável. Veículosfarmaceuticamente aceitáveis apropriados são aquelesutilizados convencionalmente com drogas à base de peptídeo,como diluentes, excipientes e similares. Pode-se fazerreferência a "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17aed., Mack Publishing Company, Easton, Pa, 1985, paraorientação sobre formulações de drogas em geral. Em umamodalidade da invenção, os compostos são formulados paraadministração por infusão, por exemplo, quando utilizadoscomo suplementos nutricionais líquidos para pacientes emterapia de nutrição parenteral total, ou por injeção, porexemplo, por via subcutânea, intramuscular ou intravenosa,e são por conseguinte utilizados como soluções aquosas emforma isenta de pirogênio e estéril e opcionalmentetamponadas até pH fisiologicamente tolerável, por exemplo,um pH fisiológico ou levemente acídico. Desse modo, oscompostos podem ser administrados em um veículo como águadestilada ou mais desejavelmente, em solução salina,solução salina tamponada com fosfato ou solução de dextrosea 5%. A solubilidade de água de um análogo pode seraumentada, se desejado, pela incorporação de umintensificador de solubilidade, como ácido acético ouhidróxido de sódio.

Os análogos da presente invenção podem ser fornecidosna forma de sais farmaceuticamente aceitáveis. Os exemplosde tais sais incluem, porém não são limitados a, aquelesformados com ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético,láctico, maléico, cítrico, málico, ascórbico, succínico,benzóico, metanossulfônico ou toluenossulfônico), ácidosinorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácidosulfúrico, ou ácido fosfórico), e ácidos poliméricos (porexemplo, ácido tânico, carboxi metil celulose, polilático,poliglicólico, ou copolímeros de ácidos poliláctico-glicólico).

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um análogoda presente invenção e uma substância de veículofarmaceuticamente aceitável (por exemplo, carbonato demagnésio, lactose ou um fosfolipídeo com o qual o análogoterapêutico pode formar uma micela) juntas formam umacomposição terapêutica (por exemplo, uma pílula, tablete,cápsula ou líquido) para administração (por exemplo, porvia oral, intravenosa, transdérmica, pulmonar, vaginal,subcutâneo, nasal, iontoforético, intratecal, intracranial,intramiocardial, intrapercardial, intramuscular) a umsujeito. Uma pílula, tablete, ou cápsula que deve seradministrada por via oral pode ser revestida com umasubstância para proteger a composição ativa a partir doácido gástrico ou enzimas intestinais no estômago por umperíodo de tempo suficiente para permitir que a mesma passenão digerida para dentro do intestino delgado. A composiçãoterapêutica também pode estar na forma de uma formulação deliberação contínua biodegradável ou não biodegradável paraadministração subcutânea ou intramuscular. Vide, porexemplo, as patentes US nos. 3.773.919 e 4.767.628 epublicação PCT no. WO 94/15587. A administração contínuatambém pode ser obtida utilizando uma bomba implantável ouexterna (por exemplo, bomba INFUSAID™) . A administraçãotambém pode ser conduzida de forma intermitente, porexemplo, injeção diária única, ou continuamente em uma dosebaixa, por exemplo, formulação de liberação contínua.

Composições terapêuticas ou de diagnóstico da invençãosão administradas em um indivíduo em quantidadessuficientes para tratar ou diagnosticar distúrbios. A doseeficaz de um peptídeo da presente invenção para tratar asdoenças ou distúrbios acima mencionados varia dependendo domodo de administração, idade e peso corpóreo do sujeito, ea condição do sujeito a ser tratado, e finalmente serádecidido pelo médico atendente ou veterinário.

Também é considerado compreendido no escopo dapresente invenção um peptídeo abrangido pela fórmulagenérica acima para uso no tratamento de doenças oudistúrbios associados a metabolismo de glicose aberrante,metabolismo de lipídeo ou distúrbio alimentar.

Outras características e vantagens da presenteinvenção serão evidentes a partir da descrição detalhada ea partir das reivindicações.

(e) Métodos de uso

1. Usos de diagnóstico

Os análogos da invenção podem ser utilizados em formaradiorrotulada ou não rotulada para diagnosticar ou trataruma variedade de estados de doença incluindo, porém, nãolimitado àqueles associados a metabolismo de glicose,metabolismo de lipídeo e ingestão de alimentos.

Preferivelmente, complexos radiorrotulados doscompostos da invenção são utilizados para tais diagnósticose tratamentos. Modalidadés radiorrotuladas, dos compostosda invenção podem ser utilizadas em cirurgia guiada porradioisótopo, como descrito em WO 93/18797 e em Woltering,e outros (1994) Surgery 116, 1139-1147. Em uma modalidadepreferida, um complexo de um radionuclide de emissão gamacomo 99Tc e um composto da invenção são utilizados paradiagnosticar um tumor que expressa SSTR, e subseqüentemente

um complexo de radionuclide de emissão de β como Re ou186Re com o composto é utilizado para tratar o tumor.

Para fins de diagnóstico, uma quantidade dediagnóstico eficaz do agente de diagnóstico ouradiodiagnóstico da invenção é administrada,preferivelmente por via intravenosa. Uma quantidade dediagnóstico eficaz é definida como a quantidade de agentede diagnóstico ou radiodiagnóstico necessária para efetuara localização e detecção do rótulo in vivo utilizandometodologias convencionais como a ressonância magnética,tomografia computadorizada, cintigrafia gama, SPECT, PET esimilares.

Para diagnóstico utilizando imageamento cintigráfico,preferivelmente, compostos rotulados Tc da invenção saoadministrados em uma dose injetável de unidade única. Oscompostos rotulados 99Tc fornecidos pela invenção podem seradministrados por via intravenosa em qualquer meioconvencional para injeção intravenosa como um meio desolução salina aquosa, ou em meio de plasma de sangue.

Genericamente, a dose unitária a ser administrada tem umaradioatividade de aproximadamente 0,01 mCi aaproximadamente 100 mCi, preferivelmente 1 mCi a 50 mCi. ASolução a ser injetada em dosagem unitária é deaproximadamente 0,01 mL a aproximadamente 10 mL. Apósadministração intravenosa, imageamento in vivo pode ocorrerem uma questão de alguns minutos. Entretanto, o imageamentopode ocorrer, se desejado, horas ou mesmo mais tempo após ocomposto radiorrotulado ser injetado em um paciente. Namaioria dos casos, uma quantidade suficiente da doseadministrada acumulará na área a ser imageada emaproximadamente 0,1 de uma hora para permitir tirarcintifotos. Qualquer método convencional de imageamentocintigráfico para fins de diagnóstico pode ser utilizado deacordo com a presente invenção.

2. Métodos de tratamento

Os análogos da invenção fornecem métodos aperfeiçoadosde tratar qualquer doença ou condição que possa ser tratadacom uma dada composição terapêutica, onde o polipeptídeo de"origem" é normalmente clivado in vivo por uma proteinase.

Dado que proteólise diminui ou elimina a disponibilidade daterapêutica, e em alguns casos leva à produção de produtosfuncionalmente antagonistas, a segurança e eficácia demuitas terapias de polipeptídeo que podem ser utilizadospara tratar doenças e condições específicas é grandementecomprometida. Por conseguinte, os métodos e composições deanálogos da invenção fornecem métodos aperfeiçoados detratar qualquer de um número de diversas doenças econdições.

Os análogos da invenção possuem, em certasmodalidades, a capacidade de diminuir níveis de glicose nosangue, aliviar a obesidade, aliviar a tolerância prejudicaà glicose, inibir neogênese de glicose hepática, e diminuiros níveis de lipídeo de sangue (por exemplo, ácidos graxoslivres) e inibir reductase aldose. Os análogos da invenção,em certas modalidades, também são capazes de aumentarproliferação de ilha e neogênese, aumentar secreção deinsulina dependente de glicose, aumentar biossíntese deinsulina, diminuir secreção de glucagon, retardaresvaziamento gástrico, diminuir ingestão de alimento e/ouapetite, aumentar a função cardíaca (por exemplo, fração deejeção de ventrículo esquerdo), aumentar o batimentocardíaco, aumentar a pressão sangüínea sistólica, diminuirresistência vascular (pressão sangue diastólica), aumentaro fluxo periférico de sangue, aumentar a excreção de sódioem pacientes hipermatrêmicos (por exemplo, diminuirhipertensão dependente de Na) , diminuir a lesão dereperfusão/isquemia (por exemplo, reduzir tamanho deinfarto após um infarto de miocárdio) , diminuir aneurotoxicidade (por exemplo,neurotòxicidade associada aglutamato ou excitotoxicidade de cainato), diminuir aapoptose (por exemplo, em neurônios), diminuir aprevalência de proteínas beta-amilóide e aumentaraprendizado espacial e/ou associativo. São desse modo úteispara, entre outras coisas, a prevenção e/ou terapia dehiperglicemia, obesidade, hiperlipidemia, complicaçõesdiabéticas (incluindo retinopatia, nefropatia, neuropatia,catarata, doença de artéria coronária e arteriosclerose),doença cardíaca, infartos miocardiais, distúrbioscirculatórios, doença neurodegenerativa (por exemplo,doença de Alzheimer, doença de Huntington, escleroselateral amiotrófica) e adicionalmente para osteoporose ehipertensão relacionada à obesidade. Desse modo, um aspectoda presente invenção é um método para tratar uma doença emum paciente ou sujeito compreendendo administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais análogosde GLP-I revelados aqui.

Os análogos de peptídeos de GLP-1 são particularmenteúteis quando administrados a um paciente que sofre dediabetes mellitus, incluindo diabetes mellitus tipo I etipo II, porém especialmente tipo II. Diabetes mellitus éuma doença caracterizada por hiperglicemia ocorrendo apartir de uma diminuição relativa ou absoluta em secreçãode insulina, resistência à insulina ou sensibilidadediminuída à insulina. A morbidez e mortalidade dessa doençaresultam de complicações vascular, renal, e neurológica. Umteste oral de tolerância a glicose é um teste clínicoutilizado para diagnosticar diabetes. Em um teste oral detolerância a glicose, a resposta fisiológica de um pacientea uma carga ou desafio de glicose é avaliada. Após ingerira glicose, a resposta fisiológica do paciente ao desafio deglicose é avaliada. Genericamente, isso é realizado pordeterminar os níveis de glicose no sangue do paciente (aconcentração de glicose no plasma, soro ou sangue integraldo paciente) para vários pontos predeterminados em tempo.

Desse modo, em um aspecto, a presente invenção refere-se a usos terapêuticos e relacionados de análogos de GLP-1resistentes a proteólise para tratar hiperglicemia,obesidade, hiperlipidemia, complicações diabéticas(incluindo retinopatia, nefropatia, neuropatia, catarata,doença de artéria coronária e arteriosclerose) e, alémdisso para osteoporose e hipertensão relacionada àobesidade.

A invenção considera o uso de análogos em métodos detratamento em que o análogo sozinho constitui o regimeterapêutico, bem como métodos de tratamento que utilizamadministração de um ou mais análogos como parte de umregime terapêutico multi-fatorial mais complexo. Porexemplo, no caso de métodos de tratar diabetes e/oucomplicações de diabetes, a presente invenção consideramétodos de tratar diabetes pela administração de um análogode GLP-I. A presente invenção considera ainda que, emalgumas circunstâncias pode ser preferível administrar maisde um análogo. Por exemplo, o método de tratamento podecompreender a administração de dois ou mais análogos. Alémdisso, a invenção considera que a administração de um oumais análogos pode ser utilizada como parte de um regimeterapêutico complexo. No caso de um método de tratardiabetes ou complicações de diabetes, um regime terapêuticoexemplar pode incluir administração de um ou mais análogos,administração de insulina, modulação de dieta, e modulaçãode exercício.

Ainda em um exemplo adicional de um regime terapêuticomultifacetado, a invenção considera a administração de umou mais análogos e um ou mais agentes que inibem aatividade enzimática da enzima específica que clivaendogenamente a proteína nativa. No caso de GLP-I, ummétodo exemplar compreenderia a administração de um ou maisanálogos com um ou mais inibidores de DDP IV. Os inibidoresde uma enzima específica podem ser específicos (porexemplo, um inibidor que modula somente a atividade de DPPIV) ou o inibidor pode ser mais promíscuo (por exemplo, uminibidor que modula a atividade de múltiplas proteases deserina). Adicionalmente, a invenção considera aadministração de um ou mais análogos e uma ou mais enzimasque degradam a enzima específica que cliva endogenamente aproteína nativa. No caso de GLP-1, um método exemplarcompreenderia a administração de um ou mais análogos depeptídeo com uma ou mais enzimas que degradam DPP IV. Taisenzimas podem ser específicas (por exemplo, uma enzima quedegrada somente DPP IV) ou a enzima pode degradar múltiplasoutras proteínas (por exemplo, uma enzima que degradavárias proteases de serina).

(f) Métodos comerciais

Outros aspectos da invenção fornecem certos métodos defazer negócios. Em particular, pôr em prática os métodos dainvenção pode identificar certos análogos de GLP-I. Essaetapa técnica, quando combinada com uma ou mais etapasadicionais, provê abordagens novas para conduzir um negóciofarmacêutico, agroquímico, biotecnológico oupreferivelmente de ciência da vida. Por exemplo, análogosde acordo com a presente invenção podem ser testados quantoà eficácia como terapêuticos em uma variedade de modelos dedoença, e as composições terapêuticas em potencial podemser então testadas quanto à toxicidade e outro perfil desegurança antes de formular, embalar e subseqüentementecomercializar a formulação resultante para o tratamento dedoença. Alternativamente, os direitos de desenvolver ecomercializar essas formulações ou conduzir essas etapaspodem ser licenciados para um terceiro para consideração.Em certos outros aspectos da invenção, os análogos dessemodo identificados podem ter utilidade na forma deinformação que pode ser fornecida a um terceiro paraconsideração de tal modo que uma compreensão aperfeiçoadada função ou efeitos colaterais dos referidos análogos emum contexto biológico ou terapêutico é obtido.Em certas modalidades, o análogo inicialmenteidentificado pode ser submetido à otimização adicional, porexemplo, para refinar ainda mais a estrutura de um análogoprincipal. Tal otimização pode levar ao desenvolvimento deanálogos que combinam duração máxima de ação com outrascaracterísticas farmacológicas desejáveis incluindo:solubilidade, permeabilidade, biodisponibilidade,

toxicidade, mutagenicidade, e farmacocinética.

Modificações estruturais são tipicamente feitas em umanálogo principal para tratar de questões com os parâmetroslistados acima. Essas modificações, entretanto, devem levarem conta possíveis efeitos colaterais na potência eatividade do análogo. Por exemplo, se a toxicidade de umanálogo principal é elevada quando testada em um modeloanimal, modificações podem ser feitas no análogo em umesforço para diminuir a toxicidade enquanto mantém ascaracterísticas desejadas.

Análogos candidatos (quer os análogos sejam ou nãomodificados para alterar para aperfeiçoar ascaracterísticas in vivo) ou combinações dos mesmos devemser testados em relação à eficácia e toxicidade em modelosde animais. Tal perfil terapêutico é comumente empregado natécnica farmacêutica. Antes de testar uma terapêuticaexperimental em seres humanos, perfil terapêutico extenso(teste pré-clínico) deve ser concluído para estabelecerparâmetros iniciais para segurança e eficácia. Teste pré-clínico estabelece um mecanismo de ação para a terapêutica,sua biodisponibilidade, absorção,distribuição, metabolismo,e eliminação através de estudos executados in vitro (istoé, em tubos de ensaio, béqueres, pratos petri, etc.) e emanimais. Os estudos em animais são utilizados para avaliarse a terapêutica fornecerá os resultados desejados. Dosesvariáveis da terapêutica experimental são administradaspara testar a eficácia da terapêutica, identificar efeitoscolaterais prejudiciais que podem ocorrer, e avaliartoxicidade.

Resumidamente, uma pessoa versada na técnicareconhecerá que a identificação de um análogo candidato éuma primeira etapa no desenvolvimento de um preparadofarmacêutico útil para administração. A administração deuma quantidade de um preparado farmacêutico compreendendo oanálogo eficaz para tratar uma condição ou doença deve sertanto segura quando eficaz. Experimentos de droga emestágio inicial, rotineiramente utilizados na técnica,ajudam a tratar de preocupações da segurança e eficácia deum produto farmacêutico em potencial. No caso especifico deura análogo, a eficácia do preparado farmacêutico poderiaser facilmente avaliada primeiramente em cultura de célula,e então em um modelo de camundongo o rato. Sistemas decultura de célula e modelos de animais apropriados para aindicação específica de doença para a qual um análogo dadoserá utilizado podem ser facilmente selecionados por umapessoa versada na técnica. Resumidamente, camundongos ouratos poderiam receber administração de doses variáveis dospreparados farmacêuticos durante vários programas de tempo.

A via de administração seria apropriadamente selecionadacom base nas características específicas do agente e notipo de célula à qual se deseja o fornecimento do análogo.

Camundongos de controle podem receber a administração de umplacebo (por exemplo, veículo ou excipiente sozinho).Em uma modalidade, a etapa de perfil terapêuticoinclui teste de toxicidade de análogos em culturas decélula e em animais; análise de farmacocinética emetabolismo do análogo candidato; e determinação deeficácia em modelos de animais, de doenças. Em certoscasos, o método pode incluir analisar a relação estrutura-atividade e otimizar análogos principais com base em perfisde eficácia, segurança e farmacocinética. O objetivo dessasetapas é a seleção de candidatos análogos para estudos pré-clínicos para levar arquivamento de pedidos de Nova drogaem Investigação ("IND") junto ao FDA antes de experimentosclínicos em humanos.

Entre a otimização principal e o perfil terapêutico,um objetivo é desenvolver um análogo que tem uma longaduração de ação em relação ao GLP-I nativo e fragmentos dosmesmos e pode ser administrado com efeitos colateraismínimos. No caso de análogos para uso in vitro, análogosexemplares não devem ser excepcionalmente tóxicos paracélulas em cultura, não devem ser mutagênicos para célulasem cultura, e não devem ser carcinogênicos para células emcultura. No caso de análogos para uso in vivo, análogosexemplares não devem ser excepcionalmente tóxicos (porexemplo, devem ter somente efeitos colaterais toleráveisquando administrados em pacientes), não devem sermutagênicos e não devem ser carcinogênicos.

Por perfil de toxicidade entende-se a avaliação deefeitos colaterais potencialmente perigosos que podemocorrer quando uma quantidade eficaz de um preparadofarmacêutico é administrada. Um efeito colateral pode serprejudicial ou não, e a determinação de se um efeitocolateral associado a um preparado farmacêutico é um efeitocolateral aceitável é feita pela Food and DrugAdministration durante o processo de aprovação regulador.Essa determinação não segue regras rígidas e rápidas, e oque é considerado um efeito colateral aceitável variadevido a fatores incluindo: (a) a gravidade da condiçãosendo tratada, e (b) a disponibilidade de outrostratamentos e os efeitos colaterais atualmente associados aesses tratamentos disponíveis. Por exemplo, o termo câncerabrange uma família complexa de estados de doençarelacionados ao crescimento regulado erroneamenteproliferação, e diferenciação de células. Muitas formas decâncer são doenças particularmente devastadoras que causamdor severa, perda de função do tecido afetado e morte.

Drogas quimioterapêuticas são uma parte importante daterapia padrão para muitas formas de câncer. Embora aprópria quimioterapia possa ter efeitos colaterais gravesincluindo perda de cabelo, náusea severa, perda de peso, eesterilidade, tais efeitos colaterais são consideradosaceitáveis dada a gravidade da doença que tem como objetivoo tratamento. No contexto da presente invenção, o fato dese um efeito colateral é considerado significativodependerá da condição a ser tratada e a disponibilidade deoutros métodos para tratar essa condição.

Testes de toxicidade podem ser realizados em tandemcom testes de eficácia, e camundongos administrados comdoses eficazes do preparado farmacêutico podem sermonitorados em relação a reações adversas ao preparado.

Um ou mais análogos, que provaram ser seguros eeficazes em estudos de animais, podem ser formulados em umpreparado farmacêutico. Tais preparados farmacêuticos podemser então comercializados, distribuídos e vendidos. Osanálogos exemplares e preparado farmacêutico dessesanálogos podem ser comercializados e vendidosindividualmente, ou podem ser vendidos como um pacotefarmacêutico e/ou kit. Além disso, em qualquer um dosaspectos acima, um método de conduzir um negócio com baseno desenho de um ou mais análogos pode incluiropcionalmente um sistema para faturar um paciente e/ou oprovedor de seguro do paciente, bem como um sistema paracobrar reembolso apropriado a partir do paciente e/ou doprovedor de seguro do paciente.

Exemplos

Os seguintes exemplos são mostrados como ilustração enão como limitação.

Exemplo 1

Duração de ação de análogos GLP-I

DPP-IV cliva o dipeptídeo terminal-N a partir depeptídeos com Pro ou Ala na penúltima posição (P2) . Ainserção do aminoácido não natural terc-Ieucina (Tle), quetem uma cadeia lateral terciária β-carbono, reduz em muitoa taxa de clivagem. Isso é demonstrado na figura IA comtrês peptídeos homólogos, Ala-Pro-Leu-Ser-Trp-Ser-NH2, Ala-Pro-Ile-Ser-Trp-Ser-NH2 e Ala-Pro-Tle-Ser-Trp-Ser-NH2, quediferem somente no arranjo dos átomos de cadeia lateral doresíduo P3. Há pouca diferença entre a taxa de clivagempara os peptídeos contendo Leu e Ile (meia-vida 4 9 e 41min. respectivamente). Nenhuma reação foi observada com opeptídeo contendo Tle durante uma digestão de 3 0 minutos.

DPP IV é conhecido por clivar GLP-I que tem um Ala emΡ2 e Glu em Ρ3. Um análogo de GLP-1 com Tle substituindo oresíduo Glu P3 é estável à degradação por DPP IV (figura1B). O resíduo Glu é conhecido como sendo importante paraativação e ligação de receptor GLP-1. Sintetiza-se portanto5 outro análogo com β-dimetil Asp (DMA) em P3. Essamodificação mantém o grupo acídico encontrado na seqüêncianativa porém introduz um β-carbono terciário. Como mostradona figura IB, os análogos de GLP-I substituídos por β-DMA eTle eram resistentes à degradação por DPP IV com meias-vidas maiores do que 1000 min. em comparação com uma meia-vida de 96 min. para Glp-1 nativo.

Embora a modificação do resíduo P3 de GLP-1estabilizou o peptídeo, as modificações também reduziram aafinidade de receptor. Não obstante, a ligação de resíduosde aminoácido a partir de exendin-4 à extremidade carbóxidos peptídeos melhora a afinidade dos peptídeos modificadospara o receptor de GLP-I e compensa muito a perda causadapelas modificações de P3 (figura 2). A alteração do resíduoGlu em P3 de GLP-1 para Tle, para produzir o peptídeomencionado como TPA144, resultou em uma diminuição de 20vezes na afinidade para o receptor GLP-I comparado com GLP-1. 0 IC50 aumentou de 1.5 nM para GLP-I para 36.3 nM paraTPA144. Quando o resíduo P3 era β-dimetil Asp, para formarTPA1B4, a diminuição em afinidade era somenteaproximadamente 5 vezes. TPA1B4 tinha um IC50 de 7.6 nM. Aadição de carbóxi terminal 9 resíduos de exendin-4 àextremidade da seqüência de TPA1B4, para formar P173 2,compensou a perda de afinidade a partir do resíduo DMA P3.A afinidade de P1732 não é significativamente diferentedaquele de GLP-1 (IC50 para P1732 era 2.5 nM versus 1.5 nMpara GLP-1). A ligação de exendin-4 ao receptor de GLP-Ifoi medida para comparação. Esse peptideo liga-se comaumento pequeno porém significativo em afinidade emcomparação com GLP-I, visto que o valor IC50 para ligaçãode exendin-4 ao receptor de GLP-I era 0.4 nM.

As modificações de GLP-I não afetam a eficácia depeptideo (figura 3). Em uma concentração elevada depeptideo, a quantidade de ativação de receptor de GLP-1,como medido por produção de cAMP, foi igual para GLP-I,TPAl44, TPA1B4 e P1732. Desse modo, os análogos GLP-I P3com modificações de P3 atuam como agonistas totais doreceptor de GLP-I. Extensão adicional da extensão determinal carbóxi não diminuiu essa atividade agonista. Apotência in vitro de P1732 foi medida e comparada com GLP-Ie exendin-4 pelas medições de valores de EC40 para ativaçãode receptor (figura 4). 0 análogo de GLP-I com modificaçõesde amino e carbóxi-terminal combinadas mantém potêncianormal com um EC50 de 0.4 - 1.1 nM, em comparação com GLP-1, que tinha um EC50 de 0.3 - 0.8 nM. Exendin-4 tinha umEC50 que foi levemente mais baixo do que GLP-I (0.1 - 0.5 nM).

Os análogos de GLP-I resistentes a DPP IV estenderam aduração de ação em comparação com GLP-I (figura 5A) . GLP-Idiminui a glicose de sangue em camundongos db em 3 0 minutosapós injeção porém esse efeito desaparece em 60 minutos. Aocontrário, o análogo resistente a DPP IV TPA1B4 mostra umefeito similar em 30 minutos porém a glicose de sanguecontinua a diminuir por 60 minutos após injeção. Os valoresde glicose de sangue em 60 minutos estão compreendidos nafaixa observada para camundongos normais. Esse efeitopersiste por pelo menos 90 minutos. Em 4 horas, os valoresde glicose de sangue retornam aos valores hiperglicêmicosobservados nos animais de controle.

Exendin-4 tem uma duração de ação significativamentemais longa do que GLP-I ou o análogo resistente a DPP IVTPA1B4. Valores de glicose de sangue são reduzidos emcamundongos db por pelo menos 4 horas após injeção (figura5B). Pela adição da extensão terminal-C de 9 resíduos paraformar P1732, o efeito sobre glicose de sangue éequivalente àquele de exendin-4. Para testar se a extensãode 9 resíduos inteira é necessária para esse efeito naduração de ação, o análogo GLP-I DGS65 foi preparado com umβ-DMA P3 e uma extensão terminal carbóxi de 3 resíduoscorrespondendo aos resíduos 31-33 de exendin-4 (Pro-Ser-Ser) . Como com exendin-4 e P1732, esse peptídeo diminuiu aglicose do sangue para valores normais em camundongos dbpor pelo menos 4 horas com um retorno a níveishiperglicêmicos em 8 horas.

Exendin-4 e os análogos GLP-I resistentes s a DPP IVP1732 e TPA1B4 foram administrados a camundongos db emdoses que variam de 0,008 μg a 80 μg para determinar adependência de dose do efeito de redução de glicose.Glicose de sangue foi medida em 60 minutos após injeção, oque corresponde ao tempo de efeito máximo na dose de 8 μg.Todos os três peptídeos mostraram dependência de dose(figura 6), com valores EC50 similares de 0,5 μg paraexendin-4, 1,1 Mg para P1732 e 0,4 μg para TPA1B4.

Os resultados do Exemplo 1 são resumidos na Tabela 2.

Tabela 2<table>table see original document page 57</column></row><table>

Exemplo 2

Duração de ação de análogo GLP-I com resíduo deaminoácido de ocorrência não natural terminal carbóxi

0 peptídeo dgs69 é homólogo ao análogo glp-iresistente a dpp iv TBA1B4. Esses dois peptídeos contêm,ambos, β-dimetil Asp na posição 3, que torna os mesmosresistentes à degradação por dpp iv. dgs69 difere de TPA1B4em que um aminoácido incomum, Bifenil alanina (Bip) foiadicionado à extremidade carbóxi. Essa adição de resíduoúnico aumentou significativamente a duração do efeito deredução de glicose de sangue em camundongos diabéticos. Ocurso de ação de tempo é comparado com aquele de TPA1B4 eExendin-4 na figura 7. As estruturas dos peptídeos sãomostradas abaixo.

glp-i haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-nh2 (seq idNO: 3) Exendin-4 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-[NH2]

(seq id no: 8)

tpaib4 haxgtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-nh2 (seq idno: 12)

dgs69 haxgtftsdvssylegqaakefiawlvkgrz-nh2 (seq id no: 13)X=p-dimetil Asp (DMA) Z=Bifenil alanina (Bip)

Em resumo, verificou-se que a adição de um aminoácidonão natural único, Bip, à extremidade carbóxi de um análogoGLP-I resistente a DPP IV transmite uma longa duração deação, essencialmente igual aquela de Exendin-4.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patentesão aqui incorporadas a título de referência na íntegra atéo mesmo ponto como se cada publicação individual, patenteou pedido de patente fosse específica e individualmenteindicada como sendo incorporada por referência na íntegra.

Equivalentes

Aqueles versados na técnica reconhecerão ou serãocapazes de determinar utilizando não mais do queexperimentação de rotina, inúmeros equivalentes aoscompostos e métodos de uso dos mesmos descritos aqui. Taisequivalentes são considerados como compreendidos no escopoda presente invenção e são abrangidos pelas reivindicaçõesa seguir.

Claims (37)

1. Análogo de polipeptídeo caracterizado porcompreender:a) uma seqüência de aminoácido de base pelo menos 80%idêntica a uma de GLP-I (7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I(7-36) eGLP-I (7-37) (SEQ ID NOS: 1-4); eb) um a quinze resíduos de aminoácidos ligados àextremidade carboxi da seqüência de aminoácido de base,onde o análogo tem atividade semelhante a GLP-I deduração mais longa in vivo em seres humanos do que GLP-Inativo.

2. Análogo de polipeptídeo caracterizado porcompreender:a) uma seqüência de aminoácido de base pelo menos 80%idêntica a uma de GLP-I-(7-34) , GLP-I-(7-35) , GLP-I-(7-36)e GLP-I-(7-37) (SEQ ID NOS. 1-4); eb) um a quinze resíduos de aminoácido ligados àextremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de base,onde o receptor de GLP-I tem maior afinidade com oanálogo do que GLP-I nativo.

3. Análogo de polipeptídeo caracterizado porcompreender:a) uma seqüência de aminoácido de base pelo menos 50%idêntica a uma de GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36)e GLP-I-(7-37) (SEQ ID NOS. 1-4) na qual o resíduo deaminoácido na seqüência de aminoácido de basecorrespondendo ao resíduo P'i de GLP-I é um análogo deaminoácido tendo um carbono Cp tetrassubstituído; eb) um a quinze resíduos de aminoácido ligados àextremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de base,onde o análogo tem atividade semelhante a GLP-I deduração mais longa in vivo em seres humanos do que GLP-Inativo.

4. Análogo de polipeptídeo caracterizado porcompreender:a) uma seqüência de aminoácido de base pelo menos 50%idêntica a uma de GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36)e GLP-I-(7-37) (SEQ ID NOS. 1-4) na qual o resíduo deaminoácido na seqüência de aminoácido de basecorrespondendo ao resíduo P'i de GLP-I é um análogo deaminoácido tendo um carbono Cp tetrassubstituído; eb) um a quinze resíduos de aminoácido ligados àextremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de base,análogo do que para GLP-I nativo.

5. Análogo, de acordo com a reivindicação 3 ou 4,caracterizado pelo fato do resíduo correspondendo aoresíduo P'χ reduzir a suscetibilidade do análogo à clivagempor uma proteinase em relação a GLP-I.

6. Análogo resistente ã proteinase da reivindicação 5,caracterizado pelo fato do resíduo correspondendo aoresíduo P'i ser representado pela seguinte fórmula:<formula>formula see original document page 60</formula>onde o receptor de GLP-I tem atividade maior para ohetrocicloalquila, arila, alcoxila, carboxamida, carbonila,halogênio, hidroxila, amina ou ciano, ou R1 e R2 tomadosjuntos formam um anel de 4-7 átomos;R3 representa uma alquila inferior, heteroalquila,cicloalquila, heterocicloalquila, arila, amino, alcoxila,halogênio, carboxamida, carbonila, ciano, tiol, tioalquila,acilamino, um amido, ciano, nitro, azido, sulfato,sulfonato, sulfonamido, -(CH2)m-R4, -(CH2)m-OH, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-0-alquila inferior, -(CH2)m-0-alquenilainferior, -(CH2)n-O-(CH2)m-R4, -(CH2)m-S-alquila inferior,- (CH2) m-S-alquenila inferior, -(CH2)n-S-(CH2)m-R4, -(CH2)m-N-C(=NH)NH2, - (CH2)m-C(=0)NH2, OU-(CH2)m-NH2,,.R4 representa independentemente para cada ocorrência,uma arila, aralquila, cicloalquila, cicloalquenila ou umheterociclo não aromático; em = 0, 1 ou 2.

7. Análogo, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de Ri e R2 representarem cada umindependentemente uma alquila inferior ou um halogênio; eR3 representar uma alquila, inferior, arila, um grupohidroxila, -(CH2)m-COOH, -(CH2)m-NH2, - (CH2) m-N-C (=NH) NH2, -(CH2) m- C (=0) NH2, -SH, ou -(CH2)m-S-CH3.

8. Análogo, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de Ri e R2 representarem cada umindependentemente uma metila, etila ou propila.

9. Análogo, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de R1 e R2 representaremindividualmente metila.

10. Análogo, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de R3 representar uma alquilainferior, fenila, hidróxi fenila indol, imidazol,hidroxila, -COOH, -CH2COOH, -CH2-CH2-N-C (=NH) NH2, -CH2-C(=0)NH2í -CH2-CH2-C (=0)NH2í -SH, ou -CH2-S-CH3.

11. Análogo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato doanálogo reter pelo menos 50 por cento da atividadebiológica de GPL-I.

12. Análogo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de umou mais resíduos de aminoácido de ocorrência não naturalserem ligados à extremidade carbóxi da seqüência deaminoácido de base.

13. Análogo, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato do resíduo de aminoácido deocorrência não natural ter uma cadeia lateral contendoarila.

14. Análogo, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato do aminoácido de ocorrência nãonatural ser bifenil alanina.

15. Análogo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato dosresíduos de aminoácido ligados à extremidade carbóxi daseqüência de aminoácido de base serem selecionados dosresíduos de aminoácido 31-39 de exendin-4.

16. Análogo, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácido ligadosà extremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de baseserem três ou mais resíduos de aminoácido consecutivosselecionados entre resíduos de aminoácido 31-39 de exendin-4.

17. Análogo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácido ligadosà extremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de baseserem Pro-Ser-Ser.

18. Análogo, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácido ligadosã extremidade carbóxi da seqüência de aminoácido de baseserem Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 5).

19. Análogo, de acordo com a reivindicação 3 ou 4,caracterizado pelo fato do análogo ter uma seqüência deaminoácidos de base pelo menos 80% idêntica a uma de GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36) e GLP-I-(7-37) (SEQ IDNOS: 1-4).

20. Análogo, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato do análogo ter uma seqüência deaminoácidos de base pelo menos 90% idêntica a uma de GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36) e GLP-I-(7-37) (SEQ IDNOS: 1-4).

21. Análogo, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato do análogo ter uma seqüência deaminoácido de base pelo menos 95% idêntica a uma de GLP-I-(7-34), GLP-I-(7-35), GLP-I-(7-36) and GLP-I-(7-37) (SEQ IDNOS: 1-4).

22. Análogo, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato do análogo ter a seguinte seqüênciade aminoácido de base:His-Ala-Xaa-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (SEQ ID NO: 12).,em que Xaa é beta-dimetil aspartato ou terc-leucina.

23. Análogo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato do análogo ter uma seqüência deaminoácidos de base diferindo em não mais do que um resíduoa partir da seqüência de GLP-I-(7-36) (SEQ ID NO: 3).

24. Análogo, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato do análogo ter uma seqüência deaminoácido de base idêntica a GLP-I-(7-36) (SEQ ID NO: 3).

25. Composição farmacêutica caracterizada porcompreender o análogo de qualquer uma das reivindicações de-1-24 e um veículo ou excipiente farmaceuticamenteaceitável.

26. Preparado farmacêutico embalado caracterizado porcompreender o análogo de qualquer uma das reivindicações de-1-24 e um veículo farmaceuticamente aceitável, e um rótulo,instruções ou ambos para administrar a um paciente.

27. Preparado veterinário embalado caracterizado porcompreender o análogo de qualquer uma das reivindicações de-1-24, e um veículo aceitável; e um rótulo, instruções ouambos para administrar a um animal.

28. Método de tratar uma ou mais entre resistência àinsulina, intolerância a glicose, hiperglicemia,hiperinsulinemia, obesidade, hiperlipidemia e complicaçõesdiabéticas em um paciente necessitando do mesmo,caracterizado por compreender administrar uma quantidadeeficaz de um análogo de qualquer uma das reivindicações de-1-24 .

29. Método de aumentar a meia-vida in vivo em sereshumanos de um peptídeo pelo menos 80% idêntico a GLP-1,caracterizado por compreender ligar um a quinze resíduos deaminoácido à extremidade carbóxi do peptídeo.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácido serem deocorrência não natural.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de pelo menos os resíduos deaminoácido de ocorrência não natural terem uma cadeialateral contendo arila.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de pelo menos um dos aminoácidos deocorrência não natural ser bifenil alanina.

33. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácidos seremselecionados de resíduos de aminoácido 31-39 de exendin-4.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácidos seremtrês ou mais resíduos de aminoácido consecutivosselecionados de resíduos de aminoácido 31-39 de exendin-4.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácido seremPro-Ser-Ser.

36. Método, de acordo com a reivindicação 34,caracterizado pelo fato dos resíduos de aminoácidos seremPro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO. 5).

37. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato do peptídeo diferir em não mais doque um resíduo de aminoácido a partir de GLP-I-(7-36) (SEQID NO. 3).