ES2742162T3 - Método para producir aminoácidos tipo micosporina utilizando microbios - Google Patents
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Abstract
Un método para producir un aminoácido tipo micosporina, que comprende las etapas de: cultivar un microorganismo que produce el aminoácido tipo micosporina de forma extracelular, aislar la solución de cultivo de células microbianas y la solución de cultivo extracelular, y recuperar el aminoácido tipo micosporina de la solución de cultivo extracelular en donde el microorganismo comprende genes de enzimas biosintéticas de aminoácidos tipo micosporina heterólogos, y los genes de enzimas biosintéticas de aminoácidos tipo micosporina están compuestos por amir_4256, amir_4257, amir_4258 y amir_4259 derivados de Actinosynnema mirum o compuestos de amir_4256 de codones optimizados (SEQ ID NO: 9), amir_4257 de codones optimizados (SEQ ID NO: 10), amir_4258 de codones optimizados (SEQ ID NO: 11) y amir_4259 de codones optimizados (SEQ ID NO: 12).
Description
DESCRIPCIÓN
Método para producir aminoácidos tipo micosporina utilizando microbios
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para producir un aminoácido tipo micosporina utilizando un microorganismo, a un aminoácido tipo micosporina producido por el método y a un agente que absorbe el UV que comprende el aminoácido tipo micosporina.
Técnica antecedente
Se sabe que los rayos ultravioleta (UV) provocan reacciones cutáneas tales como eritema, envejecimiento de la piel y cáncer de piel. Los rayos ultravioleta contenidos en la luz solar se clasifican, en base a la longitud de onda, en tres tipos: UV-A (320 nm-400 nm), UV-B (280 nm-320 nm) y UV-C (200-280 nm). Entre ellos, los rayos UV que tienen un efecto sobre los cuerpos vivos son los UV-A y UV-B; mientras que el UV-C es inofensivo ya que normalmente no puede atravesar la atmósfera.
Se sabe que el UV-B es la causa principal de quemaduras solares en el exterior y tiene una energía relativamente mayor que el UV-A. Cuando el UV-B se absorbe por la capa de la piel, llega al estrato córneo y a la epidermis, y causa una pigmentación aguda de la piel tal como manchas y pecas. También se sabe que el UV-B causa inmunosupresión implicada en el envejecimiento y en la aparición de cáncer de piel.
El UV-A tiene una longitud de onda más larga que el UV-B y la energía es menor; sin embargo, el UV-A penetra en una parte más profunda de la piel que el UV-B y se sabe que llega a la dermis. Como resultado, no solo se produce una pigmentación cutánea aguda tal como manchas y pecas, sino también una reducción de la elasticidad de la dermis (elastosis actínica), con el resultado de que se induce el envejecimiento prematuro de la piel tal como arrugas y piel flácida. Asimismo, en los últimos años, se ha descubierto que el UV-A también causa inmunosupresión y está implicado en lesiones cutáneas precancerosas y en la aparición del cáncer de piel.
La cantidad de UV-B varía en función de, por ejemplo, la estación, el clima y la latitud; mientras que la cantidad de UV-A que alcanza la superficie de la Tierra es constante durante el año. Por lo tanto, también es importante proteger la piel del UV-A.
Los protectores de UV disponibles actualmente en el mercado se dividen en agentes que absorben el UV y agentes que dispersan el UV. Los agentes que absorben el UV convierten la energía del UV en energía térmica y la liberan, e incluyen, por ejemplo, un compuesto orgánico tal como el 4-terc-butil-4'-metoxidibenzoilmetano. Los agentes que dispersan el UV contienen una partícula inorgánica tal como el óxido de titanio (TO2) y el óxido de zinc (ZnO), y cuando se aplica el agente que dispersa el UV a la piel, las partículas inorgánicas presentes sobre la piel reflejan los rayos UV y sirven como una barrera para el UV.
Los agentes que absorben el UV tienen inconvenientes: (1) los agentes que absorben el UV se descomponen fácilmente por la luz y tienen poca estabilidad, (2) se produce excitación molecular y se acelera la producción de melanina que causa picores y alergia, y (3) dan una mala imagen a los usuarios debido a sustancias sintetizadas químicamente. Los agentes que dispersan el UV tienen los inconvenientes: (1) es probable que la piel se vea blanca cuando se aplican y el usuario tiende a sentir peso en la piel, (2) se induce la generación de oxígeno activo y (3) se cierran los poros de la piel y puede que se inhiba la respiración de la piel. A causa de estos inconvenientes, se ha esperado mucho el desarrollo de una sustancia de origen natural segura que absorba el UV.
Los aminoácidos tipo micosporina (de aquí en adelante denominados MAA) son sustancias naturales que absorben UV-A, que se sabe que están presentes en una amplia variedad de organismos acuáticos tales como el coral, algas rojas, vísceras de pescado y microalgas. Entre otros, se sabe que la sinorina es la sustancia natural más efectiva que absorbe el UV-A. Se ha intentado la síntesis química de un MAA; sin embargo, esta requiere procesos largos y complejos (Documento de Patente 1). Asimismo, se ha intentado la producción de un MAA mediante irradiación con luz de cianobacterias; sin embargo, la cantidad de producción de MAA es extremadamente baja (Documento no de Patente 1). Además, se ha intentado la extracción de MAA de productos naturales tales como el laver, algas y crustáceos; sin embargo, en estos casos no se ha obtenido un rendimiento suficiente (Documento de Patente 2 y Documentos no de Patente 2 a 4). Asimismo, la extracción y la producción a partir de productos naturales se ve fácilmente influenciada por las condiciones climáticas y en su mayoría inestables y, por tanto, es difícil obtener MAA de forma estable en una gran cantidad. Entretanto, se ha intentado la biosíntesis microbiana de MAA; sin embargo, estos procesos requieren la ruptura de células y la extracción con un disolvente orgánico para obtener MAA biosintetizados de las células microbianas (Documento de Patente 3 y Documentos no de Patente 5 y 6). Por tanto, la operación se vuelve complicada y se requiere una operación adicional para eliminar los desechos derivados de las células microbianas.
Listado de citas
Documentos de Patentes
Documento de Patente 1: WO02/39974
Documento de Patente 2: JP2013-518871A
Documento de Patente 3: JPH6-62878A
Documento no de Patente
Documento no de Patente 1: World J. Microbiol. Biotechnol. (2008) 24: 3111-3115
Documento no de Patente 2: Marine Biology 108, 157-166 (1991)
Documento no de Patente 3: Photomedicine and Photobiology (2002), 24, 39-42
Documento no de Patente 4: Tetraedro: Letters (1979), 3181-3182
Documento no de Patente 5: FEMS Yeast Res. (2011), 11: 52-59
Documento no de Patente 6: J. Bacteriol. (2011), 193 (21): 5923-5928
Resumen de la invención
Problema a resolver por la invención
Los problemas a resolver por la presente invención incluyen proporcionar un método para producir de forma estable y en gran cantidad una sustancia que absorbe el UV segura de origen natural.
Medios para resolver el problema
Los inventores han establecido un método para biosintetizar un MAA mediante el uso de un microorganismo que produce el MAA de forma extracelular, y obtener los MAA en una gran cantidad a partir de la solución de cultivo extracelular. Los inventores descubrieron que puede producirse un MAA de origen natural de manera más fácil y estable por este método que con los métodos convencionales, y han completado la presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona:
(I) un método para producir un aminoácido tipo micosporina, que comprende las etapas de:
cultivar un microorganismo que produce el aminoácido tipo micosporina de forma extracelular, aislar la solución de cultivo de células microbianas y la solución de cultivo extracelular, y
recuperar el aminoácido tipo micosporina de la solución de cultivo extracelular; como se desvela en las reivindicaciones adjuntas.
2) El método de acuerdo con (1), que comprende además una etapa de purificación del aminoácido tipo micosporina recuperado;
(3) el método de acuerdo con (1) o (2), en donde el microorganismo es un microorganismo que pertenece a Escherichia coli, levaduras, actinomicetos, microalgas o laberintúlidos;
(4) el método de acuerdo con (3), en donde el microorganismo es un actinomiceto;
(5) el método de acuerdo con (4), en donde el actinomiceto pertenece al género Streptomyces, al género Actinosynnema, al género Pseudonocardia o al género Corynebacterium;
(6) el método de acuerdo con (3), en donde el microorganismo es un laberintúlido y pertenece al género Aurantiochytrium;
(7) el método de acuerdo con (3), en donde el microorganismo es una levadura y pertenece al género Saccharomyces;
(8) el método de acuerdo con cualquiera de los pasos (1) a (7), en donde el microorganismo comprende genes heterólogos de enzimas biosintéticas de aminoácidos tipo micosporina;
(9) el método de acuerdo con (8), en donde los genes de la enzima biosintética de aminoácidos tipo micosporina están compuestos por los genes amir_4256, amir_4257, amir_4258 y amir_4259 derivados de Actinosynnema mirum;
(10) el método de acuerdo con (8), en donde un codón de al menos un gen de los genes de la enzima biosintética de aminoácidos tipo micosporina se modifica para un microorganismo en el que se va a introducir el gen;
( I I ) El método de acuerdo con (9) o (10), en donde el microorganismo es Streptomyces avermitilis MA-4680 (número de ingreso NITE: NBRC 14893), Streptomyces lividans 1326 (NITE número de ingreso: NBRC 15675), Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NlTE número de ingreso: NBRC 12168), Aurantiochytrium sp. SAM2179 (FERM BP-5601), Escherichia coli JM109 o Saccharomyces cerevisiae YPH499XW;
También se desvela:
(12) un aminoácido tipo micosporina representado por la fórmula 1:
(13) el aminoácido tipo micosporina de acuerdo con (12), producido por el método de acuerdo con uno cualquiera de los pasos (1) a (11);
(14) una composición que absorbe el UV que comprende un aminoácido tipo micosporina producido por el método de acuerdo con uno cualquiera de los pasos (1) a (11) o el aminoácido tipo micosporina de acuerdo con (12) o (13) y un componente aceptable para cosméticos, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos; y (15) una composición para prevenir al menos un síntoma o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en reacciones cutáneas agudas, envejecimiento de la piel y cáncer de piel, que comprende un aminoácido tipo micosporina producido por el método de acuerdo con uno cualquiera de los pasos (1) a (11) o el aminoácido tipo micosporina de acuerdo con (12) o (13) y un componente aceptable para cosméticos, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos.
Efectos de la invención
De acuerdo con la presente invención, es posible producir un MAA de forma más fácil que una síntesis química convencional complicada que tiene muchas etapas. También es posible obtener un MAA en una cantidad mayor que con los métodos convencionales de obtención de MAA de un producto natural como el laver y los crustáceos. Por tanto, Se puede producir un MAA de forma estable. Además, como se puede obtener un MAA a partir de una solución de cultivo extracelular, la etapa de purificación se simplifica en comparación con los métodos de obtención de MAA por ruptura de una célula microbiana. Como resultado, se puede obtener rápidamente un MAA altamente purificado con un alto rendimiento.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra las cantidades de sinorina y porphyra-334 producidas por Streptomyces avermitilis MA-4680 (número de ingreso NITE: NBRC 14893) en comparación con la producción en la solución de cultivo extracelular y en las células microbianas. (A) Sinorina; (B) Porphyra-334. Línea continua-círculo blanco: Solución de cultivo extracelular; Línea discontinua-círculo negro: Células microbianas.
La Figura 2 muestra los cambios temporales de las concentraciones de sinorina y porphyra-334, en una solución de cultivo extracelular de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NITE número de ingreso: NBRC 12168). Triángulo negro: Sinorina; Triángulo blanco: Porphyra-334.
Descripción de las realizaciones
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un MAA que comprende las etapas de: cultivar un microorganismo que produce el MAA de forma extracelular; aislar la célula microbiana y la solución de cultivo extracelular; y recuperar el MAA de la solución de cultivo extracelular.
De acuerdo con el método de la presente invención, se obtiene un MAA a partir de un sobrenadante de un cultivo de un microorganismo. Por tanto, el MAA se puede obtener en una cantidad mayor que los métodos convencionales utilizando un producto natural. Además, el método de la presente invención no requiere una etapa de ruptura de una célula microbiana. Por tanto, el tiempo y el coste pueden reducirse en comparación con los métodos convencionales de extracción de MAA mediante ruptura de productos naturales tales como las algas. En un método que comprende una etapa de alteración, los contaminantes resultantes de la ruptura se transportan en procesos posteriores y complican los siguientes procesos de purificación. Sin embargo, en el método de la presente invención, tal transporte de contaminantes se puede prevenir, con el resultado de que los procesos de purificación posteriores pueden simplificarse. Como resultado, pueden reducirse tanto el tiempo como el coste necesarios para la purificación.
En la presente invención, la expresión "aminoácido tipo micosporina (en lo sucesivo denominado MAA)" es una expresión general de un compuesto que tiene un esqueleto de ciclohexenona o ciclohexanamina (que opcionalmente tiene un sustituyente) al que se une/unen aminoácidos.
Los ejemplos de MAA incluyen, aunque no de forma limitativa, sinorina (la fórmula 2 siguiente), porphyra-334 (la
fórmula 3 siguiente), asterina-330 (la fórmula 4 siguiente), paliteno (la fórmula 5 siguiente), palitino (la fórmula 6 siguiente), micosporina-glicina (la fórmula 7 siguiente), micosporina-glicina:valina (la fórmula 8 siguiente) y micosporina serinol (la fórmula 9 siguiente).
Ċ 
5
Como se usa en el presente documento, los ejemplos del "microorganismo (microbio)" incluyen, aunque no de forma limitativa, bacterias tales como actinomicetos, Escherichia coli y Bacillus subtilis;hongos tales como mohos y levaduras; microalgas tales como cianobacterias; y laberintúlidos.
El término "actinomiceto" se refiere a una bacteria gram positiva que pertenece a las Actinobacteria. Los ejemplos de "actinomiceto" incluyen, por ejemplo, el género Streptomyces tal como Streptomyces lividans, Streptomyces violaceoruber, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis yStreptomyces griseus; el género Actinosynnema tal como Actinosynnema pretiosum y Actinosynnema mirum; el género Pseudonocardia tal como Pseudonocardia autotrophics, Pseudonocardia thermophila;y al género Corynebacterium tal como Corynebacteriumglutamicum. Los actinomicetos pueden aislarse de, por ejemplo, suelo, u obtenerse de instituciones depositarias de microorganismos. Las "levaduras" incluyen las levaduras ascosporógenas, levaduras basidiosporógenas y levaduras pertenecientes a los hongos imperfectos. Los ejemplos de levaduras incluyen, por ejemplo, el género Saccharomyces tal como Saccharomyces cerevisiae; el género Schizosaccharomyces tal como Schizosaccharomyces pombe; el género Phaffia tal como Phaffía rhodozyma; el género Kluyveromyces tal como Kluyveromyces marxianus; el género Yarrowia tal como Yarrowia lipolytica; el género Pichia tal como Pichia stipitis; y el género Candida tal como Candida utilis. Las levaduras pueden aislarse por ejemplo, de plantas, animales y suelo, u obtenerse de instituciones depositarias de microorganismos.
El término "microalgas" se refiere a algas que tienen una estructura microscópica, excepto las algas marinas que son organismos multicelulares. El término "algas" se refiere a todos los organismos fotosintéticos oxigenados, excepto los musgos, helechos y plantas de semilla que viven principalmente en el suelo. Las algas incluyen varios organismos unicelulares y pluricelulares. Por ejemplo, las algas incluyen algas marinas; Cyanobacteria pertenecientes a los procariotas; y Glaucophyta, Rhodophyta (algas rojas) y Chlorophyta pertenecientes a los eucariotas. Las microalgas también incluyen un cuerpo grupal formado por una pluralidad de células. Las microalgas no siempre viven en el agua y se incluye a aquellas que viven en el suelo o en la superficie corporal de los animales. Los ejemplos de "Cyanobacteria'rincluyen, por ejemplo, Anabaena variabilis, Nostocpunctiforme, Nostoclinckia, Nostoccommune, Nostoc verrucosum y Nostoc muscorum. Las Cyanobacteria pueden aislarse de la naturaleza u
obtenerse de instituciones depositarías de microorganismos.
El "laberintúlido" es un eucariota ameboide incluido en los estramenopilos. Los ejemplos de laberintúlidos incluyen, por ejemplo, el género Aurantiochytrium, al género Schizochytrium, el género Thraustochytrium y el género Ulkenia. Los laberintúlidos pueden aislarse de la naturaleza, tal como las algas marinas y las plantas terrestres, u obtenerse de instituciones depositarias de microorganismos.
Como se usa en el presente documento, la expresión "microorganismo que produce de forma extracelular un aminoácido tipo micosporina (microbios que producen MAA en el exterior de células bacterianas)" se refiere a un microorganismo que tiene la capacidad de biosintetizar y producir un MAA de forma extracelular, por ejemplo, un microorganismo que tiene un gen de enzima biosintética de MAA. Tal "microorganismo que produce de forma extracelular un mAa " puede ser una cepa de tipo salvaje o mutada artificialmente. Los ejemplos de un tratamiento de mutación artificial incluyen recombinación genética, irradiación con UV, irradiación de rayos X y tratamiento con un agente de mutagénesis. Asimismo, el microorganismo que produce de forma extracelular un MAA puede ser un mutante espontáneo. El "microorganismo que produce de forma extracelular el MAA" incluye un microorganismo que tiene un gen de enzima biosintética de MAA homólogo o heterólogo. Por ejemplo, se puede usar un microorganismo en el que se introduce un gen de enzima biosintética de MAA heterólogo por recombinación genética. Para introducir un gen heterólogo en un microorganismo, se puede utilizar un método ampliamente conocido en la técnica.
En el caso de que un gen de enzima biosintética de MAA homólogo o heterólogo se introduzca en un microorganismo por recombinación genética, por ejemplo, un promotor, una región no traducida (UTR) 5', un gen marcador para la selección de transformantes, una región no traducida (UTR) 3', o una parte de la misma. En este caso, se puede usar un promotor, etc. ampliamente conocido por los expertos en la materia como los utilizados en el microorganismo. Asimismo, un codón del gen puede modificarse apropiadamente dependiendo del uso de codones en el microorganismo en el que se va a introducir el gen de enzima biosintética de MAA. El uso de codones en un microorganismo puede verificarse por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante el uso de la base de datos de uso de codones (http://www.kazusa.or.jp/codon/) del Instituto de Investigación de ADN de Kazusa. Como alternativa, El uso de codones puede verificarse mediante el uso del programa de diseño de secuencias de genes, GeneOptimizer (R) proporcionado por GENEART AG, etc. Además, basándose en la información del uso de codones así obtenida, el codón de un gen en cuestión puede optimizarse mediante una práctica habitual.
Los ejemplos del gen de la enzima biosintética de aminoácidos tipo micosporina incluyen, aunque no de forma limitativa, los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827; genes pseP1_010100031425 (SEQ ID NO: 5), pseP1_010100031430 (SEQ ID NO: 6), pseP1_010100031435 (SEQ ID NO: 7) y pseP1_010100031440 (SEQ ID NO: 8) derivados de Pseudonocardia sp. P1; Ava3855, Ava3856, Ava3857 y Ava3858 derivados de Anabaena variabilis ATCC29413 (véase, Balskus EP et al., Science, (2010), 329: 1653-1656); y genes mysA, mysB, mysC y mysD derivados de Nostoc punctiforme ATCC29133 (véase, JOURNAL OF BACt Er IOLOGY, Nov. 2011, vol. 193, No. 21, p. 5923-5928). Por ejemplo, en una realización en la que se usa un laberintúlido, se usa el gen amir_4256 de codones optimizados (SEQ ID NO: 9), amir_4257 de codones optimizados (SEQ ID NO: 10), amir_4258 de codones optimizados (SEQ ID NO: 11) y amir_4259 de codones optimizados (SEQ ID NO: 12) como genes de enzimas biosintéticas de aminoácidos tipo micosporina.
En una realización de la presente invención, el microorganismo que se usa en el presente documento es un microorganismo perteneciente a Escherichia coli, levaduras, actinomicetos, microalgas o laberintúlidos. Por ejemplo, el microorganismo que se usa en el presente documento es un microorganismo perteneciente a Escherichia coli, levaduras, actinomicetos o laberintúlidos.
En una realización donde se usa un actinomiceto, se usa un microorganismo perteneciente al género Streptomyces, al género Actinosynnema, al género Pseudonocardia o al género Corynebacterium. En otra realización, se usa un microorganismo perteneciente al género Streptomyces o al género Corynebacterium. En otra realización, se usa Streptomyces lividans, Streptomyces avermitilis o Corynebacterium glutamicum. En otra realización más, Se usa un actinomiceto que comprende, los genes amir_4256, amir_4257, amir_4258 y amir_4259 derivados de Actinosynnema mirum. Por ejemplo, Streptomyces avermitilis MA-4680 (NITE número de ingreso: NBRC 14893, depositado en el Depositario de Microorganismos de Patentes (NPMD), Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE), ubicado en 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japón); Streptomyces lividans 1326 (NITE número de ingreso: NBRC 15675, depositado en el Depositario de Microorganismos de Patentes (NPMD), Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE), ubicado en 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japón); o se usa Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NITE número de ingreso: NBRC 12168, depositado en el Depositario de Microorganismos de Patentes (NPMD), Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE), ubicado en 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, Japón), que comprende los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) and amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum,.
En una realización donde se usa un laberintúlido, se usa un microorganismo perteneciente al género Aurantiochytrium, al género Schizochytrium, al género Thraustochytrium o al género Ulkenia. En otra realización, se
usa un microorganismo perteneciente al género Aurantiochytrium. En otra realización, se usa un laberintúlido que comprende los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum. En otra realización más, se usa un laberintúlido que comprende los genes de codones modificados (para laberintúlidos) amir_4256, amir_4257, amir_4258 y amir_4259. En otra realización, Aurantiochytrium sp. SAM2179 (FERM BP-5601) que comprende los genes de codones modificados (para laberintúlidos) amir_4256, amir_4257, amir_4258 y amir_4259 (debe tenerse en cuenta que esta cepa se depositó como Ulkenia sp. SAM2179, y la clasificación de esta cepa se modificó en una fecha posterior después de la finalización de la secuenciación del genoma).
En una realización donde se usa una levadura, se usa un microorganismo perteneciente al género Saccharomyces, al género Schizosaccharomyces, al género Phaffia, al género Kluyveromyces, al género Yarrowia, al género Pichia o al género Candida. En otra realización, se usa un microorganismo perteneciente al género Saccharomyces. En otra realización, se usa una levadura que tiene un gen de asimilación de xilosa. En otra realización más, se usa una levadura que comprende los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827. En otra realización, se usa Saccharomyces cerevisiae YPH499XW que tiene un gen de asimilación de xilosa y que comprende los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827.
En una realización donde se usa Escherichia coli, se usa Escherichia coli que comprende los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827. En otra realización, se usa Escherichia coli JM109 que comprende los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827.
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula microbiana" se refiere a una célula de un microorganismo. Además, como se usa en el presente documento, la expresión "solución de cultivo extracelular (fluido)" se refiere a una parte obtenida al eliminar la célula microbiana de la solución de cultivo obtenida al cultivar un microorganismo. Es decir, la solución de cultivo extracelular comprende varios componentes contenidos en el medio de cultivo utilizado en el cultivo y sustancias producidas por un microorganismo durante el cultivo.
Los expertos en la materia seleccionan apropiadamente un método para aislar una célula microbiana y una solución de cultivo extracelular. Por ejemplo, una célula microbiana y una solución de cultivo extracelular pueden aislarse sometiendo a la solución de cultivo obtenida mediante el cultivo de un microorganismo a centrifugación. Las condiciones de centrifugación tales como la temperatura, el tiempo y la velocidad varían dependiendo del tipo de microorganismo y de las condiciones bien conocidas por los expertos en la materia. Como alternativa, una solución de cultivo extracelular y de células microbianas se puede aislar filtrando la solución de cultivo obtenida cultivando un microorganismo mediante el uso de una membrana de filtración apropiada. Como alternativa, las células microbianas pueden agregarse con la ayuda de un agente de agregación apropiado y después someterse a centrifugación o filtración.
Recuperar un MAA de una solución de cultivo extracelular se refiere a obtener un líquido que contiene principalmente un MAA mediante la eliminación de varios componentes contenidos en el medio de cultivo utilizado en el cultivo que a su vez están contenidos en la solución de cultivo extracelular y sustancias excepto el MAA producido por el microorganismo durante el cultivo. Los expertos en la materia también seleccionan apropiadamente un método para recuperar un MAA de una solución de cultivo extracelular. Por ejemplo, se puede recuperar un MAA de una solución de cultivo extracelular mediante filtración con una membrana o usando un medio apropiado. Los expertos en la materia seleccionan el medio de forma apropiada. En una realización preferente, se utiliza un disolvente acuoso. Los ejemplos del disolvente acuoso incluyen, aunque no de forma limitativa, una solución acuosa ácida, neutra o alcalina o una solución acuosa que contiene una sal.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el método mencionado anteriormente que comprende además una etapa de purificación del MAA recuperado. Para la purificación de MAA, se puede usar un método para purificar un metabolito de un cultivo de un microorganismo que es bien conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede obtener un MAA purificado por extracción con un disolvente orgánico, un tratamiento con carbono activado, filtración en gel, cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cristalización y/o electrodiálisis.
En la presente invención, puede neutralizarse un medio de cultivo, si fuera necesario. Como neutralizador, pueden usarse los conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, un carbonato tal como el carbonato de calcio, carbonato de magnesio, carbonato de sodio e hidrogenocarbonato de sodio; un hidróxido tal como el hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio e hidróxido de magnesio; amoniaco; cal viva, caliza y cal hidratada. En una realización, el neutralizador usado en la presente invención es un carbonato tal como carbonato de calcio, carbonato de magnesio e hidrogenocarbonato de sodio. El neutralizador puede agregarse a un medio de cultivo antes o durante el cultivo. El neutralizador puede agregarse de forma continua o intermitente. La cantidad de adición de neutralizador se puede determinar fácilmente midiendo el pH del medio de cultivo. El pH del medio de cultivo puede
medirse mediante un método convencionalmente conocido, por ejemplo, mediante un pH-metro.
En la presente invención, el medio de cultivo y otras condiciones de cultivo (por ejemplo, temperatura, tiempo, pH, agitación o no) para cultivar un microorganismo pueden seleccionarse apropiadamente por los expertos en la materia dependiendo del tipo de microorganismo a cultivar.
En el caso donde se usa un actinomiceto, por ejemplo, un medio semisintético para un actinomiceto (6 % de glucosa, 0,2% de NaCl, 0,05% de K2HPO4, 0,01 % de MgSO4'7H2O, 0,2% de (NH4)2SO4, 0,2% de extracto de levadura, 0,005 % de FeSO4'7H2O, 0,005 % de MnSO4'4H2O, 0,005 % de ZnSO4'7H2O, 0,5 % de CaCOa), Medio de cultivo TSB (0,25% de glucosa, 1,7% de digerido pancreático de caseína, 0,3 % de digerido papaico de soja, 0,5 % de NaCl, 0,25 % de K2HPO4), o medio de cultivo SYN (0,7 % de casaminoácido, 0,2 % de extracto de levadura, 0,264% de (NH4)2SO4, 0,238 % de KH2PO4, 0,556 % de K2HPO4, 0,1% de MgSO4 7 H2O, 0,0064 % de CuSO4-5H2O, 0,0011 % de FeSO47 H2O, 0,0079 % de MnSO4'4H2O, 0,0015 % de ZnSO4'7H2O, 0,5 % de CaCOa). En el caso donde se usa Escherichia coli, por ejemplo, puede usarse medio de cultivo LB, medio de cultivo YT 2 x, medio de cultivo NYZ, medio de cultivo M9, medio de cultivo SOC o medio de cultivo YPD. En el caso donde se usa una levadura, por ejemplo, puede usarse medio de cultivo SD, medio de cultivo YPD o medio de cultivo YPAD.
El medio de cultivo anterior puede modificarse apropiadamente para mejorar el estado de cultivo del microorganismo. Por ejemplo, el medio de cultivo puede modificarse aumentando la concentración inicial de glucosa en el medio de cultivo o agregando una solución de oligoelementos (x200) (CuSO4-5H2O 64 mg, FeSO4'7H2O 11 mg, MnSO4'4H2O 79 mg, ZnSO4'7H2O 15 mg/50 ml).
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un MAA producido por el método antes mencionado de la presente invención. El MAA producido por la presente invención no se limita a los MAA cuyas estructuras ya están determinadas, sino que puede incluirse un MAA cuya estructura está recién determinada. En una realización, el MAA precedente puede ser sinorina, porphyra-334, palitina, micosporina serinol o micosporina glicina, o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de MAA que tienen una nueva estructura incluyen micosporina-glicinaalanina (la fórmula 10 siguiente). Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona micosporina-glicina-alanina. En otra realización, la presente invención proporciona micosporina-glicina-alanina producida por el método mencionado anteriormente de la presente invención.
Como método para identificar un MAA, se puede usar un método convencionalmente conocido. Por ejemplo, se puede utilizar la cromatografía líquida de alto rendimiento con espectrometría de masas de tiempo de vuelo (HPLC-TOFMS). Del mismo modo, como método para identificar un nuevo MAA, se puede usar un método convencionalmente conocido. Por ejemplo, se puede identificar un nuevo MAA mediante espectrometría de masas de alta resolución (HR-MS) y en combinación con resonancia magnética nuclear (RMN). Como alternativa, se puede identificar un MAA utilizando HPLC basado en el tiempo de retención y los resultados de un espectro UV. Como alternativa, se puede identificar un nuevo MAA midiendo un espectro de absorción UV y una masa precisa mediante el uso de un aparato HPLC equipado con un detector de matriz de fotodiodos y un detector HR-MS.
La presente divulgación proporciona además una composición que absorbe el UV que comprende una cantidad eficaz de MAA producida por el método de la presente invención o micosporina-glicina-alanina como se menciona anteriormente como ingrediente activo y otro componente aceptable para cosméticos, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos. La composición que absorbe el UV de la presente invención puede usarse no solo en los campos de la cosmética y la farmacia, sino también como una composición de pintura y otro agente de recubrimiento. Por ejemplo, en el caso en el que la composición que absorbe el UV de la presente invención se aplique a la piel humana, la composición puede comprender el MAA producido por el método de la presente invención en una cantidad de aproximadamente el 0,05 al 10% en peso, un medio de fase oleosa (aproximadamente del 5 al 40% en peso), un emulsionante (aproximadamente del 1 al 10% en peso), una pequeña cantidad de un agente auxiliar y un medio de fase acuosa tal como agua.
La presente divulgación proporciona además una composición, para prevenir al menos un síntoma o enfermedad seleccionada del grupo que consiste en reacciones cutáneas agudas, envejecimiento de la piel y cáncer de piel, que comprende un MAA producido por el método de la presente invención o micosporina-glicina-alanina como se menciona anteriormente y un componente aceptable para cosméticos, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos. La composición comprende una cantidad efectiva de MAA producida por el método de la presente invención como ingrediente activo.
La composición como se mencionó anteriormente puede prepararse en la forma que pueden tomar cosméticos o productos farmacéuticos comunes para la aplicación en la piel, tal como una crema, loción, pasta, pomada, emulsión (emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite, emulsión múltiple, microemulsión, emulsión PET, emulsión Pickering), gel (hidrogel, gel de alcohol), suspensión, espuma, pulverización, comprimido o polvo.
Los ejemplos del componente que puede estar comprendido en la composición como se mencionó anteriormente y aceptable para cosméticos, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos incluyen auxiliares y aditivos de cosméticos comunes, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos, por ejemplo, un conservante tal como el cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, cloruro de hexametonio, alcohol butílico, alcohol bencílico, alquil parabenos tal como metil parabeno o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y m-cresol; un antioxidante tal como ácido ascórbico y metionina; un tampón tal como el ácido fosfórico, ácido cítrico y otros ácidos orgánicos; un emulsionante tal como un éster de sorbitán, Tween (R), poliol de silicio, estearato de potasio y un éster de ácido graso etoxilado; un estabilizador de emulsión; polímero aniónico, catiónico, no iónico o anfótero; agentes quelantes, tales como el EDTA; un medio de fase oleosa (un aceite a base de hidrocarburos tales como un aceite mineral, una cera de parafina, un aceite natural, un aceite de silicona, un éster de ácido graso tal como palmitato de isopropilo, un alcohol graso tal como alcohol estearílico); un espesante; un humectante; un emoliente; un tensioactivo tal como el polietilenglicol (PEG); un agente acidificante o basificante; un aromatizante; una fragancia; un tinte; un agente colorante; u otros componentes generalmente combinados en cosméticos, cuasimedicamentos o productos farmacéuticos.
Ejemplos
La presente invención se describirá en detalle y específicamente por medio de ejemplos; sin embargo, se proporcionan solo con fines ilustrativos y no deben considerarse limitantes de la presente invención.
(Ejemplo 1)
1. Producción de MAA usando Streptomyces
Los presentes inventores produjeron MAA usando Streptomyces lividans y Streptomyces avermitilis. Además, los presentes inventores compararon la cantidad de producción de MAA con respecto a la producción en una solución de cultivo extracelular y en células microbianas (Figura 1).
1-1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA
1-1-1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA en Streptomyces lividans
Como genes de enzimas biosintéticas de MAA, se utilizaron los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827. Estos genes se ligaron a un vector que tenía un pIJ101 ori bajo el control del promotor PLD (véase el documento JP2002-51780A) para preparar un vector de expresión génica. Streptomyces lividans 1326 (NITE número de ingreso: NBRC 15675) se transformó con el vector de expresión génica para obtener una cepa productora de MAA. Streptomyces lividans se transformó de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
1-1-2. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA en Streptomyces avermitilis
Los genes anteriormente mencionados: amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4), se introdujeron en Streptomyces avermitilis MA-4680 (número de ingreso NITE: NBRC 14893) por recombinación homóloga para obtener una cepa productora de MAA. La recombinación homóloga de Streptomyces avermitilis se realizó de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
1-2. Precultivo de Streptomyces lividans y Streptomyces avermitilis
Se añadió una solución madre de glicerol de una espora de Streptomyces lividans 1326 o Streptomyces avermitilis MA-4680, que se preparó en la Sección 1-1 anterior y que tiene los genes de enzimas biosintéticas de MAA, a 5 ml de medio de cultivo AVM (véase la Tabla 1 siguiente). Estos actinomicetos se cultivaron a 28 °C y se agitaron a 160 rpm durante 48 horas.
T l 11
1-3. Cultivo principal de Streptomyces lividans y Streptomyces avermitilis
La solución de precultivo (una cantidad correspondiente al 0,1%) se añadió a 50 ml de medio de cultivo TSBt (véanse las tablas 2 a 4 siguientes) contenido en un matraz con deflector de 500 ml. Se añadió más glucosa al medio de cultivo TSBt al comienzo del cultivo, de modo que la concentración inicial de glucosa pasó a ser 50 g/l. Estas cepas se cultivaron a 28 °C y se agitaron a 160 rpm durante dos semanas.
T l 2
T l
T l 4
1-4. Medición del MAA
Durante el cultivo principal, se tomó una muestra de 1 ml de la solución de cultivo en un tiempo predeterminado y se midió la turbidez de la solución de cultivo muestreada a 600 nm. La solución de cultivo muestreada se centrifugó a 14000 rpm durante 20 minutos para aislar la solución de cultivo extracelular y un precipitado (células microbianas). La solución de cultivo extracelular aislada se usó como una muestra de solución de cultivo extracelular. Se añadió metanol (1 ml) a las células microbianas aisladas, y las células microbianas se alteraron mediante agitación y luego se sometieron a centrifugación para recuperar el sobrenadante (muestra de células microbianas). Las cantidades de producción de sinorina y porphyra-334 en cada una de las muestras de solución de cultivo extracelular y las muestras de células microbianas diluidas se midieron mediante HPLC. Las condiciones de medición de HPLC son las que se muestran en la siguiente tabla.
T l 1
1- 5. Resultados
Los resultados de Streptomyces avermitilis MA-4680 se muestran en la Figura 1. La Figura 1 (A) muestra la distribución de sinorina; mientras que la Figura 1 (B) muestra la distribución de porphyra-334. Se verificó que tanto la sinorina como el porphyra-334 están distribuidos más ampliamente en la solución de cultivo extracelular que en las células microbianas. A partir de estos resultados, se demostró que la cantidad de producción de sinorina en la solución de cultivo extracelular es aproximadamente 5 veces mayor que la cantidad de producción en células microbianas a las dos semanas del inicio del cultivo. Del mismo modo, se demostró que la cantidad de producción de porphyra-334 en la solución de cultivo extracelular es aproximadamente 7 veces mayor que la cantidad de producción en las células microbianas. En Streptomyces lividans 1326, la cantidad de producción extracelular de sinorina fue de 150 mg/l y la cantidad de producción intracelular fue de 50 mg/l pasada aproximadamente una semana desde el inicio del cultivo. La cantidad de producción extracelular de la misma fue de 510 mg/l y la cantidad de producción intracelular de la misma fue de 105 mg/l a aproximadamente dos semanas desde el inicio del cultivo.
(Ejemplo 2)
2. Producción de un MAA nuevo (micosporina-glicina-alanina)
2- 1. La Streptomyces avermitilis que produce un MAA se cultivó de la misma manera que en el ejemplo 1 durante dos semanas. La concentración inicial de glucosa se ajustó a 100 g/l. Como resultado, en la solución de cultivo extracelular, la micosporina-glicina-alanina se produjo como un nuevo MAA además de la sinorina y la porphyra-334. La cantidad de producción de micosporina-glicina-alanina obtenida fue de 25 mg/l. El análisis por HPLC se llevó a cabo en las condiciones que se muestran en la Tabla 5 y, como resultado, el tiempo de retención fue de alrededor de 15 minutos.
2-2. Identificación del nuevo MAA (micosporina-glicina-alanina)
El MAA nuevo se identificó de la siguiente manera. Usando un aparato de HPLC equipado con un detector de matriz de fotodiodos y un detector HR-MS, se midieron el espectro de absorción UV y la masa exacta. Las condiciones de medición de HPLC son las que se muestran en la siguiente tabla.
T l 1
El espectro de absorción UV de un pico eluido alrededor de 9 minutos tuvo un máximo de absorción a alrededor de 333 nm y exhibió el mismo patrón que la sinorina y la porphyra-334. El pico se ionizó por ESI (voltaje fragmentador de 200,0 V) y la masa precisa se midió mediante un detector TOF. El valor de m/z ([M H]+) fue 317,1338 (valor calculado para C13H21N2O7+: 317,1349).
(Ejemplo 3)
3. Producción de MAA usando Corynebacterium
Los presentes inventores produjeron MAA usando Corynebacterium glutamicum.
3-1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA
3-1-1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA en Corynebacterium glutamicum
Como genes de enzimas biosintéticas de MAA, se utilizaron los genes amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) derivados de Actinosynnema mirum DSM43827. Estos genes se ligaron a un vector que tiene un pBL1 ori, bajo el control de un promotor gapA (véase, Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81: 291-301) para obtener un vector de expresión génica. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NITE número de ingreso: NBRC 12168, depositado en el Depositario Internacional de Organismos de Patentes (IPOD), Instituto Nacional de Tecnología y Evaluación (NITE), ubicado en 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba) se transformó con el vector de expresión génica mediante electroporación para obtener una cepa productora de MAA. La electroporación se realizó de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
3-2. Precultivo de Corynebacterium glutamicum
Se añadió una solución madre de glicerol de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 que tiene los genes de la enzima biosintética MAA y que se preparó en la Sección 3-1 anterior, a 50 ml de medio de cultivo BHI (ver Tabla 7). El Corynebacterium glutamicum se cultivó a 30 °C y se agitó a 180 rpm durante 24 horas.
T l 7
3-3. Cultivo principal de Corynebacterium glutamicum
La solución del precultivo (una cantidad correspondiente al 3%) se añadió a 50 ml de medio de cultivo BHI contenido en un matraz Sakaguchi. Al comienzo del cultivo, se añadieron 5 ml de gluconato de sodio 400 g/l al medio de cultivo BHI de forma adicional, de modo que la concentración inicial de gluconato de sodio paso a ser de 20 g/l. Para ajustar el pH, se añadieron 5 ml de solución de carbonato de calcio al 10%. La cepa se cultivó a 30 °C y se agitó a 180 rpm durante 48 horas.
3-4. Medición del MAA
Durante el cultivo principal, se tomó una muestra de 1 ml de la solución de cultivo en un tiempo predeterminado y se midió la turbidez de la solución de cultivo muestreada a 600 nm. La solución de cultivo muestreada se centrifugó a 15000 rpm durante 10 minutos para aislar la solución de cultivo extracelular y un precipitado (células microbianas). La solución de cultivo extracelular aislada se filtró usando un filtro de membrana que tenía un diámetro de poro de
0,2 |jm y el filtrado se usó como una muestra de solución de cultivo extracelular. Las cantidades de producción de sinorina y porphyra-334 en la muestra de solución de cultivo extracelular se midieron por HPLC. Las condiciones de medición de HPLc son las mismas que se muestran en la Tabla 5.
3- 5. Resultados
Los resultados se muestran en la Figura 2. Se verificó que tanto la sinorina como el porphyra-334 están presentes en la solución de cultivo extracelular.
(Ejemplo 4)
4. Producción de MAA usando una levadura
Los presentes inventores produjeron MAA utilizando Saccharomyces cerevisiae.
4- 1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA
4-1-1. Construcción de YPH499XW
Los casetes que expresan XYL1 por separado (xilosa reductasa derivada de Scheffersomyces stipitis) (SEQ ID NO: 13) XYL2 (xilitol deshidrogenasa derivada de Scheffersomyces stipitis) (SEQ ID NO: 14) y XKS1 (xiluloquinasa derivada de Saccharomyces cerevisiae) (SEQ ID NO: 15) codificando cada uno un gen de asimilación de xilosa, bajo el control del promotor TDH3, se digirieron con BssHII del plásmido pWX1X2XK (véase, Appl Environ Microbiol. 2004 Sep; 70 (9): 5407-14). Estos casetes se ligaron al vector pRS404 (número de ingreso ATCC: ATCC 87515) digerido con BssHII y que tiene un marcador de selección TRP1 para preparar un vector de integración genómica pIWX1X2XK. El vector de integración genómica pIWX1X2XK se trató con EcoRV. Saccharomyces cerevisiae YPH499 (Genetics 1989 May; 122 (1): 19-27) se transformó con los fragmentos obtenidos para obtener YPH499XW con capacidad de asimilación de xilosa. Saccharomyces cerevisiae se transformó de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
4-1-2. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA en Saccharomyces cerevisiae YPH499XW
Los genes de enzimas biosintéticas de MAA, amir 4256 (SEQ ID NO: 1) y amir 4257 (SEQ ID NO: 2) se ligaron al vector pAT426 (FEMS Yeast Res. 2014 May; 14 (3): 399-411) que tiene un 2 j oriy un marcador de selección URA3 de modo que estos genes se expresaron bajo el control del promotor TDH3 y el promotor ADH1 para preparar un vector de expresión génica pAT426-amir4256-7. Asimismo, Los genes de enzimas biosintéticas de MAA, amir4258 (SEQ ID NO: 3) y amir4259 (SEQ ID NO: 4) se ligaron al vector pAT425 (FEMS Yeast Res. 2014 May; 14 (3): 399 411) que tiene un 2 j ori bajo el control del promotor TDH3 y el promotor ADH1 para obtener un vector de expresión génica pAT425-amir4258-9. YPH499XW se transformó con estos vectores de expresión génica pAT426-amir4256-7 y pAT425-amir4258-9 para obtener una cepa productora de MAA, es decir, YPH499XWmAa . Saccharomyces cerevisiae se transformó de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
4-2. Precultivo de YPH499XWMAA
Una reserva de glicerol de YPH499XWMAA que tiene genes de enzimas biosintéticas de MAA, la cual se preparó en la sección 5-1 anterior, se cultivó en un medio de agar SD-LUW (véase, la Tabla 8 siguiente). Posteriormente, La colonia obtenida se inoculó en 5 ml de medio líquido SX-LUW (véase la Tabla 9 siguiente). La cepa se cultivó a 30 °C y se agitó a 150 rpm durante 13 días.
T l 1
T l 1
4-3. Cultivo principal de YPH499XWMAA
La solución de precultivo (una cantidad correspondiente al 2%) se añadió a 100 ml de medio líquido SD-LU contenido en un matraz con deflector de 300 ml. La cepa se cultivó a 30 °C y se agitó a 150 rpm durante 48 horas.
4-4. Medición del MAA
Después de continuar el cultivo durante 13 días, se tomaron muestras de 4 ml de la solución de cultivo y se midió la turbidez de la solución de cultivo muestreada a 600 nm. La solución de cultivo muestreada se centrifugó a 3.000 rpm durante 5 minutos para aislar la solución de cultivo extracelular y un precipitado (células microbianas). La solución de cultivo extracelular aislada se pasó a través de un filtro de PTFE (0,45 pm) y la solución resultante se usó como una muestra de solución de cultivo extracelular.
4- 5. Resultados
Se midió la concentración de MAA de la solución de cultivo extracelular. Como resultado, La sinorina se produjo de forma extracelular en una cantidad de 0,19 mg/l.
(Ejemplo 5)
5. Producción de MAA usando un laberintúlido
Los presentes inventores produjeron MAA usando un laberintúlido.
5- 1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA
5-1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA en el laberintúlido
Para Aurantiochytrium (Aurantiochytrium sp.) SAM2179 (FERM BP-5601), los codones de los genes anteriores, amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4) se modificaron (SEQ ID NO: 9 a 12, respectivamente). Estos genes así modificados se introdujeron en Aurantiochytrium SAM2179 por recombinación homóloga para obtener una cepa que produce MAA. La recombinación homóloga del laberintúlido se llevó a cabo de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
5-2. Precultivo de Aurantiochytrium
Se añadió una solución madre de glicerol de Aurantiochytrium SAM2179 que tiene los genes de la enzima biosintética MAA y que se preparó en la Sección 5-1 anterior, a la placa de medio de agua de mar GY que contiene 1,5% de agar (véase, la Tabla 10 siguiente). Aurantiochytrium se cultivó a 28 °C durante 2 días.
T l 1
continuación
5-3. Cultivo principal de Aurantiochytrium
El Aurantiochytrium pre-cultivado en la Sección 5-2 anterior se cultivó en 10 ml de medio de agua de mar GY (véase la Tabla 11 siguiente) a 28 °C y se agitó a 300 rpm durante 5 días.
T l 111
5-4. Medición del MAA
Tras la finalización el cultivo principal, la solución de cultivo se centrifugó a 15000 rpm durante 10 minutos para aislar la solución de cultivo extracelular y un precipitado (células microbianas). La solución de cultivo extracelular aislada se pasó a través de un filtro de membrana que tenía un diámetro de poro de 0,2 pm y la solución resultante se usó como una muestra de solución de cultivo extracelular. La cantidad de producción de sinorina en la muestra de solución de cultivo extracelular se midió por HPLC. Las condiciones de medición de HPLC son las mismas que se muestran en la Tabla 5.
5- 5. Resultados
La sinorina se produjo de forma extracelular en una cantidad de 1,5 mg/l.
(Ejemplo 6)
6. Producción de MAA utilizando Escherichia coli
Los presentes inventores produjeron MAA usando Escherichia coli.
6- 1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA
6-1-1. Introducción de genes de enzimas biosintéticas de MAA en Escherichia coli
Como genes de enzimas biosintéticas de MAA, se utilizaron amir_4256 (SEQ ID NO: 1), amir_4257 (SEQ ID NO: 2), amir_4258 (SEQ ID NO: 3) y amir_4259 (SEQ ID NO: 4). Estos genes se ligaron a un vector pkk223-3 (GenBank No. M77749) que tiene un pBR322 ori bajo el control del promotor tac para preparar un vector de expresión génica. La Escherichia coli JM109 (código de producto: 9052, fabricado por Takara Bio Inc.) se transformó con este vector de expresión génica para obtener una cepa productora de MAA. Escherichia coli se transformó de acuerdo con un método convencionalmente conocido.
6-2. Precultivo de Escherichia coli
Se añadió una solución madre de glicerol de Escherichia coli JM109 que tiene los genes de la enzima biosintética MAA, y que se preparó en la Sección 6-1 anterior, a 5 ml de medio de cultivo LB (véase, la Tabla 12 siguiente). La Escherichia coli se cultivó a 37 °C y se agitó a 160 rpm durante 18 horas.
Claims (9)
1. Un método para producir un aminoácido tipo micosporina, que comprende las etapas de:
cultivar un microorganismo que produce el aminoácido tipo micosporina de forma extracelular,
aislar la solución de cultivo de células microbianas y la solución de cultivo extracelular, y
recuperar el aminoácido tipo micosporina de la solución de cultivo extracelular
en donde el microorganismo comprende genes de enzimas biosintéticas de aminoácidos tipo micosporina heterólogos, y los genes de enzimas biosintéticas de aminoácidos tipo micosporina están compuestos por amir_4256, amir_4257, amir_4258 y amir_4259 derivados de Actinosynnema mirum o compuestos de amir_4256 de codones optimizados (SEQ ID NO: 9), amir_4257 de codones optimizados (SEQ ID NO: 10), amir_4258 de codones optimizados (SEQ ID No : 11) y amir_4259 de codones optimizados (SEQ ID NO: 12).
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además una etapa de purificación del aminoácido tipo micosporina recuperado.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el microorganismo es un microorganismo perteneciente a Escherichia coli, levaduras, actinomicetos, microalgas o laberintúlidos.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el microorganismo es un actinomiceto.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el actinomiceto pertenece al género Streptomyces, al género Actinosynnema, al género Pseudonocardia o al género Corynebacterium.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el microorganismo es un laberintúlido y pertenece al género Aurantiochytrium.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el microorganismo es una levadura y pertenece al género Saccharomyces.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde un codón de al menos un gen de los genes de la enzima biosintética de aminoácidos tipo micosporina se modifica para un microorganismo en el que se va a introducir el gen.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el microorganismo es Streptomyces avermitilis MA-4680 (número de ingreso NITE: NBRC 14893), Streptomyces lividans 1326 (NITE número de ingreso: NBRC 15675), Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (NITe número de ingreso: NBRC 12168), Aurantiochytrium sp. SAM2179 (FERM BP-5601), Escherichia coli JM109 o Saccharomyces cerevisiae YPH499XW.
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