WO2013070030A1 - 3-도데카노일옥시-2-이소부티릴옥시-4-메틸펜타노익산을 유효성분으 로 포함하는 조성물 - Google Patents

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WO2013070030A1
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isobutyryloxy
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dodecanoyloxy
acid
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PCT/KR2012/009482
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박덕훈
이종성
김영수
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바이오스펙트럼 주식회사
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    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
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    • C07C67/56—Separation; Purification; Stabilisation; Use of additives by solid-liquid treatment; by chemisorption

Definitions

  • composition comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient
  • the present invention relates to 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid and a composition comprising the same as an active ingredient.
  • preservatives that prevent decay by microorganisms are essential. Especially, in the case of cosmetic products with a long shelf life and many microbial nutrients, preservatives are required. do.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid (3- (dodecanoyloxy) -2- (i sobut yr y 1 oxy) represented by the following Chemical Formula 1 ) -4 ⁇ me t hy 1 pent ano ic acid):
  • the present inventors earnestly tried to develop a natural antimicrobial agent having safety, economical efficiency and a broad antibacterial spectrum that can be applied to food, cosmetics, textiles and pharmaceuticals.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid ⁇ -(dodecanoyloxy ⁇ GsobLityryloxy ⁇ A-methylpentanoic acid) isolated from rare extracts has high safety and economical efficiency, and has broad antibacterial properties.
  • the present invention has been completed by identifying that it has a spectrum.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing a natural compound. Another object of the present invention to provide an antimicrobial composition.
  • Another object of the present invention to provide a preservative composition.
  • Another object of the present invention is to provide an antioxidant composition.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-inflammatory composition.
  • Another object of the present invention to provide a composition for improving skin conditions. Another object of the present invention is to provide an antiallergic composition.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-obesity composition.
  • Another object of the present invention to provide a hair loss prevention or hair growth promoting composition.
  • Another object of the present invention to provide a composition for stimulating relaxation.
  • Another object of the present invention is 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methyl tanoic acid (dodecanoy 1 oxy) — 2— (i sobutyry 1 oxy) -4-methy 1 pent ano ic acid) is provided.
  • Another object of the present invention is to provide an antibacterial method.
  • Another object of the present invention is to provide an antiseptic method.
  • Another object of the present invention is to provide an antioxidant method.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-inflammatory method.
  • Another object of the present invention is to provide an anti-obesity prevention.
  • Another object of the present invention to provide a hair loss prevention or hair growth promoting method.
  • Another object of the present invention to provide a method for stimulating relaxation.
  • Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description and claims.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid represented by the following general formula (1) (3- (dodecanoyloxy) -2- (is obut ry 1 oxy) -4-me t hy 1 pent ano ic acid) gives:
  • the present inventors earnestly tried to develop a natural antibacterial agent having high safety, economical efficiency and a broad antibacterial spectrum that can be applied to foods, cosmetics and pharmaceuticals.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid (3- (dodecanoyloxy) -2- (is 3utyryloxy) -4-methylpentanoic acid) isolated from the extract was safe And it was confirmed that the economy is high, and has a broad antibacterial spectrum.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid comprises 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4- Provided are methods for preparing natural compounds of 3- (dodecanoy loxy) -2- (i sobut yry 1 oxy) -4-methylpentanoic acid):
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid provides a process for preparing natural compounds of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid.
  • 3-dothecanoyloxy ⁇ 2-isobutyryloxy-4- Methylpentanoic acid obtains a peripheral extract of bear from ⁇ Siegesbeckia ⁇ 7a / vesc 7s) containing 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid.
  • the lottery is identified and then harvested in domestic habitat or purchased from the market. Cut off after room temperature drying to facilitate the extraction of the collected bear's peripheral.
  • the chopped may use a conventional method in the art using a grinder or the like.
  • the term 'extract' as used to refer to a lottery means not only an extraction result obtained by treating the extraction solvent in the lottery, but also a lump processed product formulated (eg, powdered) to be administered to the animal itself.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid of the present invention revolves a rare extract comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid
  • various extraction solvents can be used.
  • a polar solvent or a nonpolar solvent can be used.
  • Suitable as polar solvents are G) water, ( ⁇ ) alcohols (preferably methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propane, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxyethane Or ethylene glycol), (iii) acetic acid, (iv) dimethyl-formamide (DMFO) and (v) dimethyl sulfoxide (DMS0).
  • alcohols preferably methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propane, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxyethane Or ethylene glycol
  • acetic acid preferably methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propane, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxyethane Or ethylene glycol
  • acetic acid preferably dimethyl-formamide
  • Suitable as nonpolar solvents are acetone, acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane, nucleic acids, 2,2,4-trimethylpentane, decane, cyclonucleic acid, cyclopentane, diisobutylene, 1- Pentene, 1-chlorobutane, 1-chloropentane, 0-xylene, diisopropyl ether, 2-chloropropane, toluene, 1-chloropropane, chlorobenzene, benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, chloroform, Dichloromethane, 1,2-dichloroethane, anneal, diethylamine, ether, carbon tetrachloride and THF (Tetrahydrofuran).
  • the extraction solvent used in the present invention is ( a ) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethane, propanol, butanol, etc.), (c) the lower alcohol and Mixed solvent with water, (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform, (g) butyl acetate, (h) 1,3-butylene glycol, (i) nucleic acid and (j) diethyl ether It includes.
  • the extract of the present invention is obtained by treating alcohol with rare color.
  • the extract of the present invention is treated with alcohol and concentrated filtered filtrate is concentrated to a fine powder or dissolved in alcohol to be used for storage after storage.
  • solvent fraction is obtained by applying the fractionation process to the peripheral extract of the bear.
  • a solvent fraction is obtained from the rare extract.
  • various solvents may be used.
  • a polar solvent or a nonpolar solvent can be used.
  • Suitable polar solvents include (i) water, ( ⁇ ) alcohols (preferably methanol, ethanol, propane, butanol, normal-propanol, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxy Ethanol or ethylene glycol), (iii) acetic acid, (iv) D FO (dimethyl-formamide) and (v) DMSOCdimethyl sulfoxide (V).
  • alcohols preferably methanol, ethanol, propane, butanol, normal-propanol, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxy Ethanol or ethylene glycol
  • acetic acid preferably methanol, ethanol, propane, butanol, normal-propanol, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxy Ethanol or ethylene glycol
  • acetic acid preferably methanol,
  • Suitable non-polar solvents are acetone, acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane, nucleic acid, 2,2,4-trimethylpentane, decane, cyclonucleic acid, cyclopentane, diisobutylene, 1- Pentene, 1-chlorobutane, 1-chloropentane, 0-xylene, diisopropyl ether, 2—chloropropane, toluene, 1-chloropropane, chlorobenzene, benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, chloroform, Dichloromethane, 1,2-dichloroethane, annealed diethylamine, ether, carbon tetrachloride and THF (Tetrahydrofuran).
  • the fractional solvent used in the present invention is ( a ) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethane, propanol, butane, etc.), (c) the lower alcohol.
  • Mixed solvent of water with (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform, (g) butyl acetate, (h) 1,3-butylene glycol, (i) nucleic acid (j) diethyl ether And mixed solutions thereof.
  • the solvent fraction of the present invention is obtained by treating a mixed solution of distilled water and ethyl acetate with a mixed solution of chloroform and methanol in a flash.
  • distilled water and ethyl acetate are added to the peripheral extract of the bear obtained in step (a), and the ethyl acetate fraction is obtained and concentrated and dried.
  • the ethyl acetate fraction was dissolved in a mixture of chloroform and methanol in a volume ratio of 10: 0, adsorbed onto silica gel, and gradually increased in volume ratio of methanol from 98: 2 to 80:20, eluted with the mixture of chloroform and methanol to elute the solvent fraction.
  • the solvent fractions of the present invention are additionally performed by fractions obtained by passing an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), and the like. It can be obtained through various purification methods.
  • the 3-dodecanoyl-yloxy-2-isobutyryl-4-methyl pentanoic acid in the present invention is a solvent fraction obtained in the above step (b) C 5 - 18 applied to a hydrophobic column chromatography to give And further preferably subjecting said solvent fractions to C 18 hydrophobic column chromatography.
  • the solvent fraction obtained in step (b) is adsorbed on C 18 hydrophobic column chromatography and eluted with methanol, followed by Ci 8 High performance liquid chromatography (HPLC). 3-dodecanoyloxy—2-isobutyryloxy-4'methylpentanoic acid is obtained.
  • a antibacterial composition comprising 3-dodecanoyloxy-2 ′ isobutyryloxy—4-methylpentanoic acid as an active ingredient. to provide.
  • the composition comprises Streptococcus spp., Salmonella spp. ISahnonella spp.), Escherichia ⁇ Escherichia spp.), Staphylococcus spp., Shigella ⁇ Shigella spp.), Pseudomonas ⁇ Pseudo ⁇ as spp.),. Listeria spp.), Vibrio ⁇ (Vibrio spp.) / Bacillus ⁇ iBacillus spp.), Propionibacterium ⁇ Propionibacteriwi spp.), Campylobacter species (Campylobacter spp.), Helicobacter ⁇ Hel icobacter spp.
  • Clostridia spp. Clostridia spp.), Bordetella sp. IBordetel la spp.), Yersinia sp. ⁇ Yersinia spp.), Legionella sp. Egionella spp.), Aeromonas sp. Eromonas spp.), Bacteroids ⁇ Bacteroides spp.), Neisseria ⁇ Neisseria spp J, Moraxella spp. Ioraxella spp.), Corynebacterium spp. Corynebacterhm spp.), Actinobacillus
  • the term 'comprising as an active ingredient' means including an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the following 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid. do.
  • the present invention is a composition extracted from a rare nutrient, which is a natural product, and thus, even when excessively administered, there is no adverse effect on the human body, so that 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid is included in the composition of the present invention.
  • the person skilled in the art can select and carry out within an appropriate range.
  • the antibacterial activity of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid is minimally inhibited against Gram-negative bacteria in aerobic bacteria.
  • the concentration is 0.013 ⁇ 4> -0.03%, and 0.001% -0.01% for Gram-positive bacteria. Also, in anaerobic bacteria, it is 0.008% to 0.01% for gram-negative bacteria and 0.0073 ⁇ 4> to 0.10% for gram-positive bacteria.
  • the composition of the present invention shows no cytotoxicity below 5% exhibiting antimicrobial activity (Experimental Example 4 and Table 6), 3-dodecanoyloxy-2 by heat treatment at 120 ° C.
  • antibacterial activity is maintained within the range of pH 2 to pH 11, indicating that it has a very high pH stability (Experimental Example 6 and Table 8).
  • an antiseptic composition comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • the composition is a preservative composition against at least one microorganism selected from the group consisting of Escherichia species, Pseudomonas species and Staphylococcus.
  • an antioxidant composition comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • an anti-inflammatory composition comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • a composition for improving skin condition comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • the improvement of skin condition is whitening, increase in skin elasticity, promotion of collagen synthesis or inhibition of collagenase.
  • the 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid of the present invention is 3-4 times higher than the untreated group in the animal experiments measuring skin elasticity. A better effect is shown, showing an increase in collagen synthesis and a collagenase inhibitory effect.
  • an antiallergic composition comprising 3—dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • an anti-obesity composition comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • a hair loss prevention or hair growth promoting composition comprising an active ingredient 3-dodecanoyloxy ⁇ 2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid.
  • a composition for stimulating relaxation comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy ⁇ 4-methylpentanoic acid as an active ingredient.
  • antimicrobial composition Preferably, antimicrobial composition, antiseptic composition, antioxidant composition, anti-inflammatory composition, skin condition improvement comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid active ingredient of the present invention
  • the composition for anti-allergic composition, anti-obesity composition, anti-hair loss or hair growth promoting composition, and composition for alleviating stimulation are cosmetic compositions.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention include components commonly used in cosmetic compositions in addition to 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient, such as stabilizers, Conventional adjuvants such as solubilizers, vitamins, pigments and flavorings, and carriers.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, Gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, sprays, and the like, but are not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • carrier oils include animal oils, vegetable oils, waxes, paraffins, starches, tracantes, salulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silica, talc or zinc oxide. Can be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, chamo silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol , 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid ester.
  • suspensions such as water, ethane or liquid diluent such as propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbide esters and polyoxyethylene sorbitan esters are used as carrier components.
  • ethane or liquid diluent such as propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbide esters and polyoxyethylene sorbitan esters
  • microcrystalline salose, aluminum metahydroxy bentonite, agar, or tracant may be used.
  • the carrier component is an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide.
  • Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol Esters and the like can be used.
  • antimicrobial composition Preferably, antimicrobial composition, antiseptic composition, antioxidant composition, anti-inflammatory composition, skin condition improvement comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid as an active ingredient of the present invention
  • the composition for anti-allergic composition, anti-obesity composition, anti-hair loss or hair growth promoting composition, and composition for alleviating irritation are food compositions.
  • the food composition of the present invention may include, as an active ingredient, 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid, as well as ingredients commonly added during food production, for example And protein, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavorings.
  • examples of the above carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And sugars such as conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclotextin and the like and xylitol, sorbitol, erythritol and the like.
  • natural flavoring agents [tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring systems (saccharin, aspartame, etc.) can be used.
  • synthetic flavoring systems sacharin, aspartame, etc.
  • citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid , Fruit juice, two-layer extract, jujube extract, licorice extract may be further included.
  • antimicrobial composition Preferably, antimicrobial composition, antiseptic composition, antioxidant composition, anti-inflammatory composition, skin condition improvement comprising 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid of the present invention as an active ingredient
  • the composition for use, the anti-allergic composition, the anti-obesity composition, the hair loss prevention or hair growth promoting composition and the composition for alleviating the stimulation are pharmaceutical compositions.
  • composition of the present invention when prepared as a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier, for example, lactose, cactose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, Alginate, gelatin, silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and / Or mineral Oil may be included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are
  • Appropriate dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to reaction. Can be.
  • the topical dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-100000 rag / kg per day.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • composition of the present invention may include an antioxidant to improve the stability of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxysyl 4-methylpentanoic acid.
  • an antioxidant such as diluent paper, cysteine hydrochloride, dibutyl hydroxy toluene (BHT), nordihydroguazaleic acid, butylhydroxy anisole (BHA) or propyl gallate may be used together. And dibutylhydroxyluene.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid (3- (dodecanoyloxy) -2- (i sobu t yr y 1) oxy) -4-meth t hy 1 pent ano ic acid)
  • the 3- (dodecanoyloxy) -2- (isobutyryloxy) -4 ′ methylpentanoic acid of the present invention can be separated from natural products, but can also be prepared through organic chemical synthesis.
  • the 'halo' or 'halogen' of steps (b), (d) and (f) of the present invention represents a halogen group element and includes, for example, fluoro, chloro, bromo and iodo.
  • the removal of the first protecting group in step (g) is removed by Palladium-Carbon.
  • the removal of the second protecting group in step (e) is trimethylsilyl It is removed by trimethylsilyl trif luoromethanesulfonate and Tetrabutylammonium bromide.
  • an antimicrobial method comprising applying to a subject a composition comprising an effective amount of 3-dotecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4 ⁇ methylpentanoic acid to provide.
  • an antiseptic method comprising applying to a subject a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4—methylpentanoic acid. do.
  • an antioxidant method comprising applying to a subject a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4 -methylpentanoic acid to provide.
  • an anti-inflammatory method comprising applying to a compositionol subject comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid to provide.
  • a skin condition improvement comprising applying to a subject a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid Provide a method.
  • an anti-allergic method comprising applying to a subject a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy ⁇ 4 ⁇ methylpentanoic acid. to provide.
  • a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2 ′ isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid It provides an anti-obesity method comprising applying to a subject.
  • a hair loss prevention or hair growth comprising applying to the subject a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid
  • a method for stimulating alleviation comprising applying to a subject a composition comprising an effective amount of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid To provide.
  • the present invention provides an antimicrobial composition comprising 3- (dodecanoyloxy) -2- (isobutyryloxy) -4-methylpentanoic acid isolated from natural products.
  • composition of the present invention provides an antimicrobial composition having high stability and economy and having a broad antimicrobial spectrum.
  • the 3- (dodecanoyloxy) -2- (isobutyryloxy) -4-methylpentanoic acid of the present invention has various physiological activities (eg, antiseptic effect, antioxidant effect, anti-inflammatory effect, immunosuppressive effect, whitening). Effect, anti-wrinkle effect, anti-allergic effect, anti-obesity effect, hair loss prevention and hair growth effect and stimulating effect), and can be used for food, cosmetics and medicine.
  • FIG. 2 shows the antibacterial activity of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid in aerobic Gram-negative bacteria and aerobic Gram-positive bacteria.
  • 3 Dodecanoyloxy-2-iso. Butyryloxy-4'methylpentanoic acid (0. 23 ⁇ 4, 0.005% and 0.00) was treated separately to compare the minimum inhibitory concentrations for each bacterial growth of the test substance. [Specific contents to carry out invention]
  • Step 1 collect raw materials
  • fermented alcohol as a solvent that is harmless to the human body since it is used in food and cosmetics (Alcohol alcohol) was selected.
  • Plant samples were mixed at 2: 1 (W / W) and extracted at room temperature for 2 weeks. More preferably, in order to increase the extraction efficiency, the extract was extracted for 1 week, filtered and the filtrate was concentrated separately, and the fermentation alcohol of 2 times was added to the residue and extracted again for 1 week.
  • the filtrate obtained through the above process was concentrated using a depressurizer (rotary evaporator, EYILA, Japan) to completely evaporate the extract at 1-72 hours at 4 C.
  • Each concentrated plant extract was powdered into fine particles. It was dissolved in alcohol or alcohol and adjusted to a concentration of 100 mg / and used in the antibacterial test while keeping it in a refrigerated state. After distilled water and ethyl acetate (ethylacetate) in a volume ratio of 1: 2 were added to the dried sample, the component dissolved in ethyl acetate was taken and concentrated to dryness again.
  • ethyl acetate ethylacetate
  • the sample was dissolved in ethyl acetate, and the concentrated and dried sample was dissolved in 10 m £ of a solution of chloroform: methane (CHC1 3 : MeOH) (10: 0), adsorbed onto a silica gel column (70X 400 Hz), and adsorbed material.
  • the fractions of chloroform: methanol were eluted at a slow flow rate of 0.5 per minute with fractions of 20 m £, gradually varying from 98: 2, 93: 7, 90: 10 and 85: 15.
  • KCCM 41657 Reggio Nella pneumophila Philly Night (Ze ⁇ v 'o? E // pneumophilia )
  • KCCM 41779 Pseudomonas years old Erotic Monitor Let G1 ⁇ 2rOTO /?
  • KCTC 12266 Neisseria Meningitidis fe / sser / a meningitidis
  • KCCM 41562 Antibacterial effect on Moraxella catalis for re // a catarrhalis
  • KCCM 40056 Actinobacillus ureai G4 ⁇ / 7 ⁇ acv7 / AS ureae) KCTC 2674.
  • the antibacterial activity was measured by the agar diffusion method. This method is to determine the concentration of antibiotics in the solution. The antibiotics of known concentrations are buried in several discs, which are placed on a solid agar medium coated with the test strain, and then grown.
  • the present inventors further found that 3'dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4- was found in Gram-negative and Gram-positive bacteria.
  • gram-positive bacteria 5. aureus and gram-negative group E. coli, dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy- 4-methylpentanoic acid (0.01% , 0.005% and 0.001%) was treated by concentration to compare the minimum growth concentration of microorganisms.
  • the growth inhibitory activity of each bacterium was measured by the liquid medium dilution method, and the minimum inhibitory concentration (MIC) of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid was measured for the strain. That is, 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4 diluted to a concentration of 2 ⁇ 10 6 CFU / m to 2 mi 10 CFU / m, and diluted to 0.01-20 mg / mi 1. A ⁇ methylpentanoic acid solution was added to the tubes by 50 ⁇ each. Thereafter, the cells were incubated at 37 ° C.
  • MKXMinimum inhibitor concent rat ion MKXMinimum inhibitor concent rat ion (Table 4).
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) for Gram-negative bacteria in aerobic bacteria of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid is 0.01% to 0.03%, and Gram For positive bacteria it was confirmed that the 0.001% to 0.01%. It was confirmed that all 3 ′ dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid had very high antibacterial activity in gram positive bacteria than in gram negative bacteria.
  • the minimum inhibitory concentration for anaerobic bacteria was 0.007% to 0.1% for 3-dodecanoyloxy-2'isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid for gram positive bacteria, and 0.008% to 0.01 for gram negative bacteria.
  • 3-dodecanoyloxy-2 ′ asobutyryloxy-4-methylpentanoic acid showed relatively high antibacterial activity against anaerobic bacteria.
  • MIC Minimum Inhibitory Concentration
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid was confirmed to have antibacterial activity that was little different from the control (no treatment) in all heat treated groups.
  • 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid is a very stable material. Therefore, it is determined that 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid will not deactivate the antibacterial activity in the processing aptitude by heat.
  • Experimental Example 6 Confirmation of P H Stability of 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid
  • MIC Minimum Inhibitory Concentration
  • the bacteria used were Escherichia coli ⁇ , Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus (5 a / 3 ⁇ 43 ⁇ 4 ococa / s.
  • the preservative effect was measured up to 20 days, Preservative efficacy was observed 4 times at 5 day intervals (Table 9).
  • the patch method used the fin chamber (Finn chamber, Epitest Ltd, Finland). Each of the skin external preparations was added dropwise to the chamber by 15 ⁇ , followed by patching. The degree of response to the skin each time was scored using Equation 1 below, and the results are shown in Table 10 below.
  • the score is 1 point, + is 2 points, and + is 4 points in the reaction band, and when the average reaction band is less than 3, it is determined as a safe composition.
  • Test Table 3 the number of people corresponding to ⁇ , +, and ++ was 1, 0, and 0, respectively, and the rest did not appear.
  • the average semi-arithmeticity of Test Groups 1 to 4 was 0.00, 0.00, 0.09 and 0.27, respectively, which were 3 or less, 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4- Methylpentanoic acid did not show a pronounced cumulative stimulus pattern and was determined to be safe for human skin.
  • Experimental Example 9 Acute Oral Nontoxicity Confirmation
  • SODs Superoxide dismutases
  • each well was added calcium ionophore (Sigma) and [1-14C] arachidonic acid 1 (in EtOH, 0.1 M i / ml, Sigma) and incubated for 10 minutes under the same conditions. . After incubation, citric acid was added to each well, the pH was adjusted to 3.5, shaken, and each culture solution was taken up to 500 ⁇ , divided into a microcentrifuge tube, and 700 ⁇ ethyl acetate was added thereto, followed by shaking extraction for 10 minutes.
  • calcium ionophore Sigma
  • [1-14C] arachidonic acid 1 in EtOH, 0.1 M i / ml, Sigma
  • Radioactive bands are authentic eicosanoids
  • the radioactivity of the identified band was measured using a BAS 2000 bio-imaging analyzer (Fuji, Japan). Inhibitory effect of each enzyme was DMSCXDimethyl sulfoxide) as a control group, and showed the inhibitory activity of C0X activity using 3 ⁇ 4 relative to the control group.
  • NF- ⁇ luciferase reporter activity experiment Whether or not the samples used in the present invention inhibit the immune related response related to inflammation was examined again through NF- ⁇ luciferase reporter activity experiment.
  • the NF- ⁇ promoter is reported to play an important role in the production of immune-related cytokines associated with inflammation.
  • the following method was used. Human monocyte cells such as THP-1 cells (Korea Cell Line Bank), each dispensing 1X10 6 pieces in 6 well and can double check "transfection reagent (superfect transfection reagent, In vitrogen, USA) using the NF- ⁇ luciferase reporter Plasmid DNA (NF-KB lucif erase reporter plasmid DNA, Stratagene, USA) was transfected.
  • the whitening effect by the samples used in the present invention was measured using brown guinea pigs (Tortoiseshel 1 guinea pigs) known to cause pigmentation by ultraviolet rays.
  • the aluminum foil was peeled off and the sample was applied in the following manner. Pigmentation appeared 2-3 days after UV irradiation and reached a peak after about 2 weeks, from which each sample was applied.
  • AL * L * value after coating 00 days - L * value of the coating and the start day
  • the effect of the whitening material can be seen by comparing the AL * value with the sample application site and the control site.
  • the anti-wrinkle effect can usually be measured as collagen biosynthesis and collagenase degradation inhibition and abnormality test in humans.
  • Human normal fibroblasts Pacific Co., Ltd.
  • Human normal fibroblasts Pacific Co., Ltd.
  • 6-well microplates (2 ⁇ 10 5 cells / well) containing DMEM medium.
  • the medium was removed from each well, and the sample dissolved in a titration solution at a concentration of 0.1% was treated and cultured for 24 hours. After 24 hours, cell media were collected to prepare samples.
  • the amount of collagen synthesized was determined by using the collagen measurement kit (Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), Takara, Kyoto, Japan) of the procollagen type I C-peptide (Type I C-peptide (PICP)). The amount was measured. Detailed test methods were performed in accordance with Takara's kit instructions.
  • An antibody against collagenase was used as a method for measuring the activity of collagenase, an enzyme that degrades collagen. The entire test was performed according to the vendor's protocol. Type I collagenase assay kit (Amersham Biosciences, RPN2629) was used and absorbance was measured with an ELISA reader (Bio-Tek ELx808 TM Series Ultra Microplate Reader, UK). The measured standard values were expressed in the form of mean mean standard deviation, and the significance was tested by t-test using the SPSS / PC + program. The results are shown in Table 15 below.
  • Wrinkle improvement effect of the composition for skin containing the material used in the present invention was measured through clinical trials.
  • the preparation of the cream was made with a common cream of oil in water type according to known methods.
  • Wrinkle improvement effect was evaluated by measuring skin elasticity change. Skin elasticity is measured in 30 healthy women (25 to 35 years old) under the condition that the temperature is maintained at a constant temperature of 24 to 26 ° C, humidity of 38 to 40% to the face of each subject 2 After 3 months of use, measurements were made using a cutometer SEM 474 (Courage + Khazaka, Cologne, Germany) . The criteria for determination were 0 for skin elasticity and 0 for many. Was compared. The test results are shown in Table 15 below.
  • the 3-dodecanoyloxy-2-isobutyryloxy-4-methylpentanoic acid of the present invention is 3-4 times more than the untreated group in the animal test for measuring skin elasticity. Appeared good. Treatment concentration-dependent effects were also shown in collagen synthesis growth rate and collagenase inhibition rate. Experimental Example 15 Anti-allergic Effect
  • the systemic anaphylaxis-induced test was performed by administering samples dissolved in various solvents as shown in Table 16 below, and the mortality rate was dose-dependent. At 1.0 mg / g body weight, the mortality rate was 0%.
  • Obesity inhibition test was generally carried out by the following method using a well-known animal. The results are shown in the table below.
  • the method for measuring obesity inhibitory activity is as follows:
  • mice Seven-week-old ICR male mice (Charles River, Japan) were pre-cultured for one week and used in experiments in seven groups of one. Animals are kept in a constant temperature room set at a temperature of 23 ° C 1 ° C, a humidity of 55 ° C, 5% of lighting time and 12 hours / day of lighting time. Ingestion was made. Samples were prepared in liposome formulations (dissolved in 5% lecithin) to 0.1%. Each sample solution was adjusted to a dose of 0.1 administration per 10 g of mouse, and the dose was 1.5 g / kg or 1 g / kg. In addition, the control group was a 5% lecithin emulsion. Mice were fasted from the day before administration and were forcibly administered once the next day. The test period was 2 weeks and body weight and general symptoms were measured and observed.
  • a test was performed by preparing a liposome formulation containing 33 ⁇ 4 of lecithin derived from preservatives, thickeners and soybeans. Using the prepared external preparation for hair growth, it was applied to the bald area of 10 alopecia patients following weakening or radiation exposure twice a day for 3 months, 3 cc each. As a result, it was found that there were excellent effects such as the development of new hair roots in 8 hair loss patients.
  • the test results are as follows. As a control, moxidil sold in Hanmi Pharm was used.

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Abstract

본 발명은 3-도데카노일옥시-2-이소부티릴옥시-4-메틸펜타노익산 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 본 발명은 천연물로부터 분리한 3-(도데카노일옥시)-2-(이소부티릴옥시)-4-메틸펜타노익산을 포함하는 안정성 및 경제성이 높고 넓은 항균 스펙트럼을 갖는 항균용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 3-(도데카노일옥시)-2-(이소부티릴옥시)-4-메틸펜타노익산는 다양한 생리활성(예컨대, 방부 효과, 항산화 효과, 항염증 효과, 면역 억제능, 미백 효과, 주름 개선 효과, 항알레르기 효과, 항비만 효과, 탈모방지 및 육모 효과 및 자극완화 효과)을 갖고 있어, 식품, 화장품 및 의약품에 응용될 수 있다.

Description

[명세서】
【발명의 명칭】
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산을 유효성분으 로 포함하는 조성물
【기술분야]
본 발명은 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 【배경기술】
식품， 화장품， 섬유， 의약품 등의 제품은 품질을 오랫동안 유지하기 위해서, 미생물에 의한 부패를 막아주는 방부제가 필수적이며， 특히 제품 특성상 유통기간이 비교적 길며 미생물 영양원이 많은 화장품의 경우는 더욱 방부제가요구된다.
기존의 방부제로서 화장품， 식품， 의약품 등에 가장 범용적으로 사용되는 파라벤류의 방부제들은 피부 알러지, 내성균 유발이라는 문제점이 제시되고 있으며, 이러한 문제점올 해결하고자 제품의 안전성과 경제성이 우수한 천연방부제에 대한 연구가 지속되고 있다.
현재 보고 된 천연 항균성물질의 대부분은 색취, 안정성 저하， 좁은 항세균스펙트럼， 제형상의 문제점 등으로 인하여 상용화되지 못하고 있으며 : 편백추출물인 히노키티을 (Hinokitiol), 목련추출물인 마그놀를 (Magnolol), 자몽종자추출물 DF-100등 극히 일부만이 상용화되고 있다. 이중에서 제품개발이 가장 앞선 DF-100의 경우 항균력은 DF-100에 포함된 유기산 및 합성보존료인 benzethoni urn chloride 때문인 것으로 알려져 있으며， 그 외 다른 천연항세균제 등은 경제성이 낮거나 좁은 항균스펙트럼 또는 물성에 의한 사용범위의 제한 등의 문제가 있어 보다 진보되고 제품화 개발이 가능한 천연항균제가 절실한 실정이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명의 일 양태에 따르면， 하기 화학식 1로 표시되는 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 (3-(dodecanoyloxy)-2- ( i sobut yr y 1 oxy ) -4~me t hy 1 pent ano i c acid)을 제공한다:
화학식 1
Figure imgf000004_0001
본 발명자들은 식품, 화장품， 섬유 및 의약품에 적용될 수 있는 안전성， 경제성 및 넓은 항균 스펙트럼을 갖는 천연항균제를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과， 희첨 추출물에서 분리한 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 ^-(dodecanoyloxy^^GsobLityryloxy^A- methylpentanoic acid)이 안전성 및 경제성이 높으며， 넓은 항균스펙트럼을 갖는 다는 것을 규명함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 3-도데카노일옥시— 2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 천연화합물 제조방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 항균용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 방부용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 항알레르기 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항비만 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 탈모방지 또는 육모촉진 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 자극완화용 조성물을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸 타노익산 (3一( dodecanoy 1 oxy )— 2— ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항균 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 방부 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항염증 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 피부 상태 개선 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 항알레르기 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항비만 방벋을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 탈모방지 또는 육모촉진 방법올 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 자극완화 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 하기 화학식 1로 표시되는 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 (3-(dodecanoyloxy)-2- ( i s obut r y 1 oxy ) -4-me t hy 1 pent ano i c acid)을 제공한다 :
화학식 1
Figure imgf000006_0001
본 발명자들은 식품 , 화장품 및 의약품에 적용될 수 있는 안전성 , 경제성이 높고 넓은 항균 스펙트럼을 갖는 천연항균제를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과， 회첨 추출물에서 분리한 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 (3-(dodecanoyloxy)-2-(is이 3utyryloxy)-4- methylpentanoic acid)이 안전성 및 경제성이 높으며， 넓은 항균스펙트럼을 갖는 다는 것을 규명하였다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 다음 단계를 포함하는 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 ( 3- ( dodecanoy loxy)-2-(i sobut yry 1 oxy ) -4- methylpentanoic acid)의 천연화합물 제조방법을 제공한다:
(a) ^^iSiegesbeckia glabrescens^)S셰 추출물을 수득하는 단계 ; (b) 상기 추출물로부터 용매 분획물을 수득하는 단계; 및
(C) 상기 용매 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피이에 적용하여
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산올 수득하는 단계 . 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 천연화합물 제조방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다: 단계 (a): ^^iSiegesbeclda glabrescens)로계 추출물의 수득 본 발명에 따르면， 3-도테카노일옥시ᅳ2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산은 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산을 포함하는 ^^ Siegesbeckia ^7a/vesc 7s)로부터 곰의말초 추출물을 수득한다.
바람직한 구현예에 따르면, 회첨을 국내 자생지에서 동정한 다음 채취하거나， 시장에서 구입한다. 수집한 곰의말초의 추출을 용이하게 하기 위해 실온 건조 후에 세절한다. 상기 세절은 분쇄기 등을 이용한 당업계의 통상적인 방법을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 회첨을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물' 은 회첨에 추출용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 희첨 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제형화 (예컨대， 분말화)된 희첨 가공물도 포함하는 의미를 갖는다.
본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산를 포함하는 희첨 추출물을 회첨에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는， 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은， G) 물， (Π) 알코올 (바람직하게는， 메탄올， 에탄올， 프로판올， 부탄올， 노말 -프로판을， 이소 -프로판올， 노말- 부탄올， 1-펜탄올, 2—부특시에탄을 또는 에틸렌글리콜)， (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMS0(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은， 아세톤， 아세토나이트릴， 에틸 아세테이트， 메틸 아세테이트， 플루오로알칸, 펜탄, 핵산, 2，2，4- 트리메틸펜탄， 데칸， 사이클로핵산, 사이클로펜탄， 디이소부틸렌， 1-펜텐， 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄， 0-자일렌， 디이소프로필 에테르， 2- 클로로프로판, 를루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠， 벤젠， 디에틸 에테르， 디에틸 설파이드, 클로로포름， 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린， 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran)를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코을 (메탄올， 에탄을， 프로판올， 부탄올 등)， (c) 상기 저급 알코올과 물과의 흔합용매， (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름， (g) 부틸아세테이트， (h) 1,3- 부틸렌글리콜， (i) 핵산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 알코을을 희첨에 처리하여 수득한 것이다.
바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 추출물은 희첨에 알코올을 처리하고 여과한 여과액을 농축하여 미립자로 분말화 하거나 알코올에 녹여 넁장보관 후 실험에 이용한다. 단계 (b): 추출물로부터 용매 분획물의 수득
이어, 상기 곰의말초 추출물로부터 용매 분획물을 수득한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '용매 분획물' 은 곰의말초 추출물에 분획과정을 적용하여 수득하는 것이다. 본 발명의 조성물에서 이용되는 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시— 4-메틸펜타노익산은 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시— 4-메틸펜타노익산를 수득하기 위해 희첨 추출물로부터 용매 분획물을 수득한다. 회첨 추출물에 용매를 처리하여 얻는 경우에는， 다양한 용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는， 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은， (i) 물, (Π) 알코올 (바람직하게는， 메탄올， 에탄올， 프로판을， 부탄올， 노말 -프로판올, 이소 -프로판올, 노말-부탄올， 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜)， (iii) 아세트산， (iv) D FO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSOCdimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤， 아세토나이트릴， 에틸 아세테이트， 메틸 아세테이트， 플루오로알칸， 펜탄， 핵산， 2，2，4-트리메틸펜탄， 데칸， 사이클로핵산, 사이클로펜탄， 디이소부틸렌, 1-펜텐， 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, 0-자일렌， 디이소프로필 에테르, 2—클로로프로판， 를루엔， 1-클로로프로판， 클로로벤젠， 벤젠， 디에틸 에테르， 디에틸 설파이드， 클로로포름， 디클로로메탄， 1,2-디클로로에탄， 어닐린 디에틸아민， 에테르， 사염화탄소 및 THF(Tetrahydrofuran)를 포함한다.
보다 바람직하게는， 본 발명에서 이용되는 분획용매는 (a) 물， (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄을, 프로판올， 부탄을 등)， (c) 상기 저급 알코을과 물과의 흔합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트， (f) 클로로포름， (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3- 부틸렌글리콜， (i) 핵산 (j) 디에틸에테르 및 이의 흔합용액을 포함한다. 가장 바람직하게는， 본 발명의 용매분획물은 증류수 및 에틸 아세테이트의 흔합용액과 클로로포름 및 메탄올의 흔합용액을 회첨에 처리하여 수득한 것이다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)에서 수득한 곰의말초 추출물에 증류수 및 에틸아세테이트를 첨가하고 에틸아세테이트 분획을 수득하여 농축 및 건조한다. 상기 에틸아세테이트 분획을 부피비 10:0의 클로로포름 및 메탄올 흔합액에 용해하여 실리카겔에 흡착시키고， 98:2 내지 80 :20으로 점진적으로 메탄올의 부피비를 증가하여 상기 클로로포름 및 메탄올 흔합액으로 용출하여 용매 분획물을 수득한다. 단계 (c): 용매 분획물로부터 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산의 수득
이어, 상기 용매 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 3-도데카노일옥시— 2-이소부티릴옥시 -4—메틸펜타노익산을 수득한다.
본 발명의 용매 분획물은 일정한 분자량 컷 -오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획， 다양한 크로마토그래피 (크기， 전하， 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등， 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 수득할 수 있다.
바람직하게는， 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산은 상기 단계 (b)에서 수득한 용매 분획물을 C5-18 소수성 컬럼 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가적으로 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 용매 분획물을 C18 소수성 컬럼 크로마토그래피에 적용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 수득한 용매 분획물을 C18 소수성 컬럼 크로마토그래피에 흡착시키고 메탄올로 용출한 후에 Ci8 고속액체크로마토그래피 (Highperformance liquid chromatography; HPLC)를 실시하여 3-도데카노일옥시— 2-이소부티릴옥시 -4ᅳ 메틸펜타노익산을 수득한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 3-도데카노일옥시 -2ᅳ 이소부티릴옥시— 4-메틸펜타노익산을 유효성분으로 하는 항균용 조성물을 제공한다.
바람직하게는. 상기 조성물은 스트렙토코쿠스 종 {Streptococcus spp.), 살모넬라 종 iSahnonella spp.), 에스케리치아 ^ Escherichia spp.), 스태필로코쿠스 종 {Staphylococcus spp.), 쉬젤라 ^ Shigella spp.), 슈도모나스 ^Pseudo醒 as spp.),. 리스테리아 종 {Listeria spp.), 비브리오 ^{Vibrio spp.)/ 바실러스 ^iBacillus spp.), 프로피오니박테리움 ^ Propionibacteriwi spp.), 캄필로박터 종 {Campylobacter spp.), 헬리코박터 ^ Hel icobacter spp . ) , 클로스트리디아 종 {Clostridia spp.), 보르데텔라 종 iBordetel la spp.), 예르시니아 종 ^Yersinia spp.), 레지오넬라 종 egionella spp.), 에어로모나스 종 eromonas spp.), 박테로이드스 ^ Bacteroides spp.), 네이세리아 ^ Neisseria spp J, 모락셀라 종 ioraxella spp.), 코리네박테리움 종 Corynebacterhm spp.), 액티노바실러스
^{Actinobaci lluss spp . ) , 프로피오니박테 " ^Propi oni bacter him spp.), 클로스트리디움 Vos r/oYiro spp.), 캠필로박터 (( /¾pyA?^c/er spp.), 헬리코박터 0W/ ?bac er spp.) 및 박테로이데스 fec ero/cfes spp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 대하여 항균 활성을 나타내는 것올 특징으로 하는 항균용 조성물이다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는' 이란 하기의 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연물인 희첨으로부터 추출한 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 표 4에 기재되어 있듯이 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 활성은 호기성 세균에 있어서 그람음성균에 대한 최소저해농도는 0.01¾> 내지 0.03%이고, 그람 양성균에 대해서는 0.001% 내지 0.01%이다. 또한， 혐기성 세균에 있어서， 그람 음성균에 대하여 0.008% 내지 0.01%이고 그람 양성균에 대하여 0.007¾> 내지 0.10%이다. 특히, 3—도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 호기성 세균， 병원성 세균 및 혐기성 세균에 대한 항세균 활성을 비교하였을 때， 그람 음성균에서 보다 그람 양성균에서 항세균 활성이 매우 높은 것을 확인 할 수 있다. 이러한 본 발명의 항균용 조성물은 기존의 천연항균제 (DF-100)와 비교하여 항세균 활성이 매우 우수한 것을 나타낸다 (표 5).
바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 항균활성을 나타내는 5%이하에서 세포독성이 없는 것을 보여주며 (실험예 4 및 표 6)， 120°C의 열처리에 의해서도 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 활성이 유지되는 것을 확인하여 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 열에 매우 안정한 물질임을 보여준다 (실험예 5 및 표 7). 또한， pH 2 내지 pH 11의 범위 내에서 항세균 활성이 유지되어 매우 높은 pH 안정성을 갖는 것을 나타낸다 (실험예 6 및 표 8). ,
본 발명의 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시- 4-메틸펜타노익산을 유효성분으로 하는 방부용 조성물을 제공한다.
바람직하게는， 상기 조성물은 이스케리치아 종， 슈도모나스 종 및 스태필로코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 대한 방부용 조성물이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산을 유효성분으로 하는 항산화 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시- 4-메틸펜타노익산을 유효성분으로 하는 항염증 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산을 유효성분 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.
바람직하게는， 상기 피부 상태 개선은 미백， 피부탄력도의 증가， 콜라겐 합성 촉진 또는 콜라게네이즈 억제이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 3-도데카노일옥시- 2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 피부탄력도를 측정한 동물실험에서 무처리군에 비하여 3-4배 더 좋은 효과는 나타내며， 콜라겐 합성증가 및 콜라게네이즈 억제 효과를 갖는 것을 보여준다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 3—도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시- 4-메틸펜타노익산을 유효성분으로 하는 항알레르기 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4—메틸펜타노익산을 유효성분으로 하는 항비만 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시ᅳ 2-이소부티릴옥시- 4-메틸펜타노익산을 유효성분 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시ᅳ 4-메틸펜타노익산을 유효성분 포함하는 자극완화용 조성물을 제공한다.
바람직하게는， 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산올 유효성분 포함하는 항균용 조성물, 방부용 조성물， 항산화 조성물， 항염중 조성물, 피부 상태 개선용 조성물， 항알레르기 조성물， 항비만 조성물， 탈모방지 또는 육모촉진 조성물 및 자극완화용 조성물은 화장료 조성물이다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며， 예컨대 안정화제， 용해화제， 비타민， 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며， 예를 들어， 용액， 현탁액， 유탁액， 페이스트, 겔， 크림， 로션, 파우더， 비누， 계면활성제 -함유 클린싱， 오일， 분말 파운데이션， 유탁액 파운데이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는， 유연 화장수 , 영양 화장수， 영양 크림， 마사지 크림， 에센스， 아이 크림， 클렌징 크림， 클렌징 포음， 클렌징 워터， 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유， 왁스， 파라핀， 전분， 트라칸트， 샐를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트， 실리카， 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크， 실리카, 알루미늄 히드록시드， 칼슴 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본 , 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고， 예컨대 물， 에탄올, 이소프로판올， 에틸 카보네이트， 에틸 아세테아트, 벤질 알코을, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜， 1,3-부틸글리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물， 에탄을 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 회석제， 에톡실화 이소스테아릴 알코을， 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 샐를로오스， 알루미늄 메타히드록시드 벤토나이트， 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트， 지방족 알코을 에테르 설페이트， 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트， 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인， 지방족 알코을， 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄올아미드， 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
바람직하게는， 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산을 유효성분 포함하는 항균용 조성물， 방부용 조성물, 항산화 조성물， 항염증 조성물， 피부 상태 개선용 조성물， 항알레르기 조성물， 항비만 조성물， 탈모방지 또는 육모촉진 조성물 및 자극완화용 조성물은 식품 조성물이다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며， 예를 들어， 단백질， 탄수화물， 지방, 영양소， 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어， 포도당, 과당 등; 디사카라이드， 예를 들어 말토스， 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드， 예를 들어 덱스트린, 사이클로텍스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리틀， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미계 (사카린， 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대， 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 이외에 구연산, 액상과당， 설탕， 포도당， 초산， 사과산， 과즙， 두층 추출액， 대추 추출액， 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
바람직하게는， 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산을 유효성분 포함하는 항균용 조성물， 방부용 조성물， 항산화 조성물， 항염증 조성물， 피부 상태 개선용 조성물， 항알레르기 조성물, 항비만 조성물, 탈모방지 또는 육모촉진 조성물 및 자극완화용 조성물은 약제학적 조성물이다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우에는， 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며， 예컨대, 락토스， 빡스트로스， 수크로스， 솔비를, 만니를， 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴, 규산 칼슴， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피롤리돈, 셀를로스， 물， 시럽, 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 /또는 미네랄 오일을 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는
Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편， 본 발명의 약제학적 조성물의 피부국소 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100000 rag/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시ᅳ 4- 메틸펜타노익산의 안정성을 향상시키기 위해 항산화제를 포함할 수 있다. 예컨대， 과이액지 , 시스테인염산염， 디부틸히드록시를루엔 (Dibutyl hydroxy toluene; BHT) , 노르디히드로구아자레트산， 부틸히드록시아니솔 (butylhydroxy anisole; BHA) 또는 갈산프로필 등의 항산화제가 함께 사용될 수 있으며， 바람직하게는 디부틸히드록시를루엔이다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 다음의 단계를 포함하는 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 (3-(dodecanoyloxy)-2- ( i sobu t yr y 1 oxy ) -4-me t hy 1 pent ano i c acid)의 제조방법을 제공한다:
(a) 2-히드록시아세트산 (2-hydroxyacetic acid) 및 제 1보호기 (protect ion group)인 벤질 알코을을 반웅시켜 벤질 2— 히드록시아세테이트를 수득하는 단계 ;
(b) 상기 벤질 2-히드록시아세테이트와 및 제 2보호기인 메틸할로메틸 에테르를 반웅시켜 벤질 2- (메록시메톡시)아세테이트 (benzyl 2- (methoxymethoxy)acetate)를 수득하는 단계;
(c) 상기 벤질 2- (메록시메톡시)아세테이트와 리튬 핵사메틸실라잔 및 이소부틸 알데히드를 반웅시켜 벤질 3-히드록시 -2- (메특시메록시) -4- 메틸펜타노에이트 (benzyl 3-hydroxy-2-(methoxymethoxy)-4- me t hy 1 pent anoa t e ) ¾· 수득하는 단계 ;
(d) 상기 벤질 3-히드록시 -2- (메록시메특시) -4-메틸펜타노에이트와 도데카노일 할로겐을 반웅시켜 1- (벤질옥시) -2ᅳ (메록시메톡시) -4-메틸 -1- 옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (l-(benzyloxy)-2-(methoxymethoxy)-4- inethyl— 1— oxopentane一 3-yl dodecanoate)를 수득하는 단계;
(e) 상기 1- (벤질옥시) -2- (메특시메톡시) -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트로부터 상기 제 2보호기를 제거하여 1- (벤질옥시) -2- 히드록시 -4-메틸— 1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (l-(benzyloxy)-2- hydroxy-4-methyl-l-oxopentane-3-yl dodecanoate)를 제조하는 단계;
(f) 상기 1- (벤질옥시) -2-히드록시 -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트와 이소부티릴 할로겐을 반응시켜 1- (벤질옥시 ) -2-
(이소부티릴옥시 )-4-메틸ᅳ -옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 ( l-(benzyloxy)- 2- ( i sobut yr y 1 oxy ) -4-me t hy 1 - 1-oxypen t ane-3-y 1 dodecanoate)를 제조하는 단계; 및
(g) 상기 1- (벤질옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4-메틸 -1—옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트로부터 상기 제 1보호기를 제거하여 3- (도데카노일옥시 )-2ᅳ
(이소부티릴옥시 )-4-메틸펜타노익산 (3-(dodecanoy loxy )-2-( i sobutyryloxy)- 4-methylpentanoic acid)을 제조하는 단계.
본 발명의 3- (도데카노일옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4ᅳ 메틸펜타노익산은 천연물로부터 분리할 수 있지만， 유기화학적 합성을 통해서도 제조 할 수 있다.
본 발명의 단계 (b), 단계 (d) 및 단계 (f)의 상기 '할로' 또는 '할로겐' 은 할로겐족 원소를 나타내며， 예컨대， 플루오로， 클로로， 브로모 및 요오도를 포함한다.
바람직하게는， 상기 단계 (g)의 제 1보호기 제거는 팔라듬ᅳ 탄소 (Palladium-Carbon)에 의해 제거된다.
바람직하게는， 상기 단계 (e)의 제 2보호기 제거는 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (Trimethylsilyl t r i f luoromethanesul f onate) 및 테트라부틸암모늄 브로미드 (Tetrabutylammonium bromide)에 의해 제거된다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 3-도테카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4ᅳ메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항균 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시- 4—메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 방부 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4ᅳ메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항산화 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시- 4-메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물올 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항염증 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 피부상태 개선 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시ᅳ4ᅳ메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항알레르기 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2ᅳ 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항비만 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시- 4-메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 자극완화 방법을 제공한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 천연물로부터 분리한 3- (도데카노일옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4-메틸펜타노익산을 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 안정성 및 경제성이 높고 넓은 항균 스펙트럼을 갖는 항균용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명의 3- (도데카노일옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4- 메틸펜타노익산는 다양한 생리활성 (예컨대， 방부 효과， 항산화 효과， 항염증 효과, 면역 억제능， 미백 효과, 주름 개선 효과， 항알레르기 효과， 항비만 효과， 탈모방지 및 육모 효과 및 자극완화 효과)을 갖고 있어， 식품， 화장품 및 의약품에 웅용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산의 합성 반응식을 나타낸다.
도 2는 호기성 그람 음성균과 호기성 그람 양성균에서 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 활성을 비교 하기 위하여， 3—도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4ᅳ메틸펜타노익산 (0.이¾， 0.005% 및 0.00 ))을 각각 처리하여 시험물질의 각 세균생장에 대한 최소저해 농도를 비교한 결과이다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실사예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 제조예 1: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 추출 분리 및 정제
제 1단계: 원재료 수집 단계
원재료를 수집하는 단계에서 재료로 사용되는 ^^ Siegesbeclda gJabrescens)을 일반적으로 국내 자생지에서 동정한 다음 채취하였거나， 시장에서 구입하였다. 수집한 식물은 추출을 용이하게 하기 위하여 실온에 건조 후 또는 건조된 시료를 세절하였다. 이때 식물의 세절 (분쇄)은 분쇄기 등을 이용한 일반적인 방법을 사용할 수 있다. 제 2단계: 유효성분 추출 단계
상기에서 준비한 식물체로부터 용존고형물을 주정으로 추출하는 단계로서， 제 1 단계에서 분쇄된 시료의 유효성분을 추출하였으며， 본 발명의 천연항균제는 식품 및 화장품에 사용하는 것이므로 인체에 무해한 용매제로서 발효주정 (주정알콜)을 선택하였다. 이 주정에 식물 시료를 2:1(W/W)로 섞은 후 상온에서 2 주 동안 추출하였다. 더욱 바람직하게는， 추출효율올 높이기 위해 1주간 추출한 후 여과시켜 여과액을 따로 농축하고, 잔사에 2 배량의 발효주정을 넣어 다시 1 주간 추출하였다. 상기 과정을 통해 얻은 여과액을 감압기 (감압농축기: rotary evaporator, EYILA, 일본)를 이용하여 4( C에서 1-72시간 완전히 증발시켜 추출물을 농축하였다. 농축된 각 식물추출물은 미립자로 분말화 하거나 혹은 주정으로 녹여 100 mg/ 의 농도로 조절하여 냉장상태로 보관하면서 항균시험에 사용하였다. 제 3단계: 유효성분 분리정제 단계 상기 건조된 시료에 1 ： 2 부피비의 증류수 및 에틸아세테이트 (ethylacetate)를 첨가한 후， 에틸아세테이트에 녹는 성분을 취하여 다시 농축건조시켰다.
에틸아세테이트에 녹는 성분을 취하여 농축건조한 시료를 클로로포름 ： 메탄을 (CHC13 ： MeOH) (10 ： 0)의 용액 10 m£에 녹여 실리카겔 (silicagel) 칼럼 (70X 400 麵)에 흡착시킨 후 흡착된 물질을 클로로포름 ： 메탄올의 부피비를 98 ： 2， 93 ： 7, 90 ： 10 및 85 ： 15 로 점차 달리하면서 분당 0.5 의 느린 유속으로 용출시켜 20 m£씩 분획하였다.
대장균 ( 과 같은 식중독 유발균에 대하여 저해활성을 강하게 나타내는 분획을 모아 실리카겔 칼럼 (30X310 mm)에 한번 더 흡착시킨 후， 홉착된 물질을 클로로포름 (CHC13) ： 메탄올 (MeOH)을 10 ： 0 의 흔합비로 흔합한 용매에서 85 ： 15 의 흔합비로 흔합한 용매까지 메탄올의 부피비를 점차 증가시키면서 상기와 같은 방법으로서 재용출시키면서 분획하였다. 상기 분획 중에서 대장균 ( coin 등에 저해활성을 강하게 나타내는 분획을 모아 C-18 역상 칼럼 크로마토그라피 (흡착제 (adsorbent); 200 g, Analytichem BONDESIL C18, 40 μΆ, 준비 단계 (preparat ive grade), Varian, glass column; 10 mm i.d. , 140 廳 leng)에 흡착시킨 후 500 m£의 증류수로 용출하고， 다시 1000 의 20% 메탄을 및 40% 메탄올로 순차적으로 용출한 후， 마지막으로 100% 메탄을 1000 m£로 용출시켰다.
대장균 ( o/ ) 등에 저해활성을 강하게 나타내는 분획을 모아 중류수 ： 아세토나이트릴 (¾0 ： Acetonitrile;ACN)의 부피비를 100 ： 0 에서 94 ： 6으로 점차 달리하면서 C-18 고속액체크로마토그라피 (HighPerformance Liquid Chromatography; HPLC)로 정제하였다.
상기 용출액을 감압회전건조기로 40°C에서 농축건조하여 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 (3-(dodecanoyloxy)-2- ( i s obu t y r y 1 oxy ) -4-me t hy 1 pen t ano i c acid)을 약 46 mg 수득하였다. 제조예 2: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 유기합성 상기 추출 및 정제된 3-도데카노일옥시 -2ᅳ이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산은 유기합성을 통해서도 수득할 수 있다. 합성 화학반웅식은 도 1에 자세히 설명되어 있다. 제 1단계: 벤질 2-히드록시아세테이트 (2 )의 제조
15 g 2-히드록시아세테이트 (197.2 mmol)를 벤질 알콜 50 ^에 용해시키고 황산 0.2 를 가한 다음 18시간 동안 환류 교반하였다. 반웅이 종결되면 초산에틸로 희석하고 물로 세척하여, 포화중조수 그리고 포화식염수로 세척하였다ᅳ 유기층을 분리하여 소디움 설페이트 (sodium sulfate)로 탈수하고 여과한 다음 감압농축하여 26.8 g 벤질 2- 히드톡시아세테이트 ( )를 수득하였으며， 수율은 수율 82%이다.
¾ NMR(CDC13) 57.47(m,2H),7.38(m,3H)(5.20(s,2H),4.49(s,2H),3.65(s,OH) 제 2단계: 벤질 2- (메톡시메특시)아세테이트 (3)의 제조
9 g 벤질 2-히드톡시아세테이트 ( )를 디클로로메탄 100 에 용해시키고, 디이소프로필 에틸아민 14 g 을 가한 후 메틸 클로로메틸 에테르 8.72 g 을 천천히 적가하였다. 반응흔합물을 실온에서 12 시간 교반시킨 후 1 N 염산수용액으로 세척하고 소디움 설페이트로 탈수하고 여과한 다음 감압농축 하였다. 수득한 잔사를 컬럼크로마토그래피 (n- 핵산:초산에틸 =6:1)로 분리 정제하여 12 g 벤질 2- (메록시메톡시)아세테이트 (호)를 수득하였으며, 수율은 95%이다.
NMR(CDC13) 57.47(m,2H),7.38(m,3H)(5.20(s,2H),4.50(s,2H)(4.33(s,2H))3.30 (s,3H) 제 3 단계: 벤질 3ᅳ히드록시 -2- (메록시메톡시) -4-메틸펜타노에이트 (4)의 제조
12 g 벤질 2-(메톡시메특시)아세테이트( )(57.1隱01)을 질소 존재 하에서 96 테트라히드로퓨란에 용해시키고 리튬 핵사메틸실라잔을 - 78°C에서 적가한 후 10 분간 교반하였다. 반응흔합물에 6.2g 이소부틸 알데히드를 천천히 적가하였다. 반웅이 종결되면 물 96 mi를 가한 후 초산에틸로 희석하고 층분리하였다. 분리된 유기층을 물로 세척하고 소디움 설페이트로 탈수하여 여과한 다음 감압농축하였다. 수득한 잔사를 컬럼크로마토그래피 (n-핵산：초산에틸 =4:1)로 분리 정제하여 8.4 g 벤질 3- 히드록시 -2- (메록시메톡시) -4-메틸펜타노에이트 ( )를 수득하였으며， 수율은 52%이다.
¾
蘭 R(CDC13) S7.47(m,2H),7.38(m,3H),5.45(s,2H),5.34(s,2H),4.16(t,J=7.0Hz, lH),3.75(d,J=7.0Hz,lH),3.58(sI0H,lH),1.92(m,lH),0.91(d>3HX2) 제 4 단계: 1- (벤질옥시) -2- (메톡시메톡시)— 4-메틸 -1—옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (^)의 제조
8 g 벤질 3-히드록시 -2- (메톡시메록시) -4-메틸펜타노에이트 ( )(28.33 隱 ol)를 디클로로메탄 80 ηιΗᅵ 용해시킨 후 피리딘 4.5 ra를 가한 후 6.¾ 도데카노일 클로라이드를 적가하였다. 반응흔합물을 80°C에서 3 시간 동안 교반한 후 반웅이 종결되면 1 N 염산용액 및 물로 세척하고 층분리하였다. 유기층을 소디움 설페이트로 탈수하고 여과한 다음 감압농축하였다. 수득한 잔사를 컬럼크로마토그래피 (n-핵산:초산에틸 =5:1)로 분리 정제하여 10.7 g
1- (벤질옥시 )ᅳ2- (메톡시메록시) -4-메틸— 1-옥소펜탄 -3ᅳ일
도데카노에이트 (호)을 수득하였으며， 수율은 81%이다.
¾
NMR(CDC13) 57.47(m)2H),7.38(m,3H),5.44(s,2H),5.36(s,2H)(4.90(dd(J=7.0Hz
,lH),4.26(d,J=7.0Hz,lH),2.43(m,lH),2.35(t,lH),1.64(m,2H),1.31~1.26(m,l
6H),0.92~0.88(m,3HX3) 제 4 단계: 1ᅳ (벤질옥시) -2-히드록시 -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (6)의 제조
10 g 1- (벤질옥시 )ᅳ2- (메톡시메록시) -4-메틸— 1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 ( )(23.78 mmol)를 디클로로메탄 100 에 용해시키고 ᅳ
78°C로 냉각시킨 후 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 12 ml 및 테트라부틸암모늄 브로미드 11.5g 을 가한 다음 1 시간 교반하였다. 반웅흔합물을 -20°C까지 상승시키면서 30 분간 추가 교반하였다. 반웅이 종결되면 반웅흔합물을 1 N 염산용액 및 포화중조수로 세척하고 층분리하였다. 유기층을 소디움 설페이트로 탈수하고 여과한 다음 감압농축하였다. 수득한 잔사를 컬럼크로마토그래피 (n- 핵산:초산에틸 =4:1)로 분리 정제하여 4.7 g 1ᅳ (벤질옥시) -2-히드톡시 -4- 메틸 -1-옥소펜탄— 3-일 도데카노에이트 ( )를 수득하였으며， 수을은 52%이다. ¾
NMR(CDC13) 57.47(m,2H))7.38(m,3H),5.34(s,2H),4.66(dd,J=7.0Hz,lH),4.60(d
,J=7.0Hz,lH),2.43(m,lH),2.35(t,lH),1.64(m,2H),1.31~1.26(m,16H),0.93~0.
88(m,3HX3) 제 6단계: 1- (벤질옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4-메틸 -1옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (7)의 제조
4.5 g 1- (벤질옥시) -2-히드록시 -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 ( )(10.7mmol)를 디클로로메탄 45 에 용해시킨 후 피리딘 4 를 적가하였다. 반웅물에 2.6g 이소부티릴 클로라이드를 천천히 적가한 후 40°C에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응이 종결되면 반웅흔합물을 1 N 염산용액 및 포화중조수로 세척하고 층분리하였다. 유기층을 소디움 설페이트로 탈수하고 여과한 다음 감압농축하였다. 얻어진 잔사를 컬럼크로마토그래피 (n-핵산:초산에틸 =5:1)로 분리 정제하여 3.5 g 1- (벤질옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4-메틸 -1 옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (2)를 수득하였으며， 수율은 96%이다.
¾
NMR(CDC13) 57.47(m,2H),7.38(m(3H),5.38(d, 7.0Hz,lH),5.34(s>2H),5.17(dd ,J=7.0Hz,lH),2.67(m,lH),2.43(m,lH),2.35(t,lH),1.63(m)2H),1.31~1.26(m,l 6H),1.14(d,3HX2),0.92~0.88(m,3HX3) 제 7 단계: 3- (도데카노일옥시 )-2ᅳ (이소부티릴옥시) -4- 메틸펜타노익산 (8)의 제조
3 g 1- (벤질옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4-메틸 -1 옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 를 초산에틸에 용해시킨 후 0.3 g 팔라듐 -탄소 (10%)을 가한 후 수소 하에서 3 시간 교반하였다. 반응이 종결되면 여과하고
Figure imgf000024_0002
i】 1
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^$ 10
실험예 1: 병원성 세균 (호기성)에 대한 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 효능 확인
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 효능올 측정하기 위해 병원성 세균 (호기성) 18 종 (그람 양성 5 종- 스트렙토코쿠스 ^^^ Streptococcus /nutans) KCTC 3065, 스타필로코쿠스 아우레우스 (5 y/ococci/s aureus) KCTC 1916, 스타필로코쿠스 에피더미디스 {St aphyl ococcus epidermidis) KCTC 3958, 리스테리아 모'노키토게네스 (£/s e monocytogenes) KCTC 3569, 바실러스 서브틸리스 0¾c///i/s subtilis) KCTC 1021； 그람 음성 13 종-이스케리치아 콜 \0 Escherichia coli) KCTC 1039, 살모넬라 타이피무리움 (5a/w e//a typhi murium) KCTC 2514, 살모넬라 엔터리티디스 (53½o/2e//a enteritidis) KCTC 12400, 쉬겔라 플렉스네리 ¾ / / /a flexneri) KCTC 2517, 쉬겔라 소네이 (^/^//3 sonne Π KCTC 2518, 비브리오 파라해모라이티커스 ( parahaewolyticus) KCTC .27, 보더텔라 브론티셉티카 O ofe^//a bronchi sepica) KCCM 21998， 예르시니아 엔테로콜리티카 0 rs/?/a entrocolitica) KCCM 41657, 레조넬라 뉴모필리야 (Ze§v'o?e// pneumophilia) KCCM 41779， 에로모나스 살모니시다 G½rOTO/?as salmonicida) KCTC 12266, 나이세리아 메닝기티디스 fe/sser/a meningitidis) KCCM 41562 ; 모락셀라 카탈리스 for re//a catarrhalis) KCCM 40056， 악티노바실러스 우레아이 G4^/7^acv7/AS ureae) KCTC 2674)에 대한 항세균 효과를 수행하였다. 항세균 활성 측정법으로는 한천 확산법을 이용하였다. 이 방법은 용액 중 항생물질 농도를 결정하는 방법으로서 여러 개의 원반에 기지농도의 항생물질 용액을 묻혀 시험균주가 도포된 고체 한천배지에 을려놓고 배양한 후 원반 주변의 투명대 (growth inhibition halo)의 크기를 측정한다. 한천 확산법의 하나로 현재 널리 사용되고 있는 방법은 커비- 바우엘 (Kirby-Bauer) 방법이다. 이러한 방법을 통해 항세균 실험을 수행한 결과， 표 2와 같이 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4ᅳ메틸펜타노익산은 모든 균에 대하여 높은 항세균 효능을 나타내었다.
【표 2】
호기성 세균에 대한 항세균 효과
Figure imgf000026_0001
A: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산 또한, 추가적으로 본 발명자들은 그람 음성균과 그람 양성균에서 3ᅳ 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 활성을 비교 확인하기 위하여, 그람 양성균인 5. aureus 및 그람 음성군인 E.coli 에, 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시— 4-메틸펜타노익산 (0.01%， 0.005% 및 0.001%)을 농도별로 처리하여 미생물 생장 최소저해농도를 비교하였다. 그 결과， 도 2 에서 보여주는 바와 같이, S. aureus 는 0.001%부터 미생물 생장이 억제되었으며 E.coli \ 경우 0.01%에서부터 미생물 생장이 억제되는 결과를 보였다. 이를 통해 그람 음성균에서 보다 그람 양성균에서 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 활성이 높은 것을 확인할 수 있었다. 실험예 2: 병원성 세균 (혐기성)에 대한 3-도데카노일옥시 -2— 이소부티릴옥시 -4ᅳ메틸펜타노익산의 항세균 효능 확인
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 병원성 세균 (혐기성)에 대한 항세균 효능을 측정하기 위해 실험예 1 과 동일한 방법으로 혐기성 세균 8 종 (그람 양성 5 종-프로피오니박테리움 아크네Propionibacterium acne) ATCC 6919, 프로피오니박테리움 그라누로섬 Propioni bacterium granulosu )kl 25564, 클로스트리디움 퍼프리겐스 {Clostridhim perfrigens) KCCM 12098, 클로스트리디움 디피실리 {Clostridium difficile) KCCM 12115， 코리네박테리움 글루타미쿰 {Corynebacter i im glutamicum) KCTC 1445； 그람 음성 3 종- 캄필로박터 제주니 {Campylobacter jejuni) KCTC 5327, 헬리코박터 피로리 {Helicobacter pylori) KCTC 5335, 박테로데스 프라길리스 {Bacteroides fragilis) KCTC 3688)에 대해 항세균력을 측정하였다 (표 3). 표 3 에서 보는 바와 같이 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 8종의 혐기성 세균에 대해 비교적 높은 항세균 효능을 나타내었다.
【표 3】
혐기성 세균에 대한 항세균 효과
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Ά： 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시— 4-메틸펜타노익산 실험예 3: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 최소억제농도 (MIC) 확인
각 균의 생육저해 활성은 액체배지 회석법에 의하여 상기 균주에 대한 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 최소저해농도 (MIC)를 측정하였다. 즉 5 mi 튜브에 균의 농도를 2X106 CFU/m이 되도록 희석시켜 2 씩 첨가하고， 0.01-20 mg/mi 1 의 농도로 희석시킨 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4ᅳ메틸펜타노익산 용액을 상기 튜브에 각 각 50 ^씩 첨가하였다. 그 후 37°C에서 24시간 배양하였고， 걸보기 균의 성장을 100% 억제하는 최소 농도를 MKXMinimum inhibitor concent rat ion)로 정의하였다 (표 4). 표 4 에 나타나 있듯이， 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 호기성 세균에 있어서 그람 음성균에 대한 최소저해농도 (MIC)는 0.01% 내지 0.03%이고， 그람 양성균에 대해선 0.001% 내지 0.01%임을 확인하였다. 3ᅳ 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 모두 그람 음성균에서 보다 그람 양성균에서 항세균 활성이 매우 높은 것을 확인 할 수 있었다.
한편， 혐기성 세균에 대한 최소저해농도는 3-도데카노일옥시 -2ᅳ 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 그람 양성균에 대하여 0.007% 내지 0.1%였고, 그람 음성균에 대하여는 0.008% 내지 0.01%였다. 호기성세균에서와 마찬가지로 혐기성 세균에 대하여 3-도데카노일옥시 -2ᅳ 아소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 비교적 높은 항세균 활성을 나타내었다. 【표 4】 3-도데카노일옥시— 2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 최소억제농도 (MIC)
균주 최소억제농도 ¾)
Figure imgf000029_0001
'A： 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4-메틸펜타노익산 비교실험예 1:
상기 실험예 1 과 동일하게 실시하되 항균제로 기존의 천연항균제 (DF— 100), 합성항균제 (Germell II) 및 소르브산 (Sorbic acid)에 대하여 대표적 식중독 유발 균주 5 종에 대한 항세균력을 검토하고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
【표 5】
Figure imgf000030_0001
상기 표 5 에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 천연항균제인 3- 도데카노일옥시— 2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 경우 기존의 합성 항균제들과 유사하게 항세균력이 나타났지만， 천연항균제로 가장 널리 사용되고 있는 DF-100보다 항세균력이 매우 우수한 것을 확인 할 수 있다. 실험예 4: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 세포 무독성 확인
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 세포독성 효과에 대해 인간 각질세포주인 HaCaT (한국세포주은행) 및 인간 정상 섬유아세포 (아모레퍼시픽， 한국)를 이용해 Μπ 실험을 수행하였다. 인간 정상 섬유아세포 및 HaCaT 의 경우， 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산은 5% 이하 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다. 하지만 5% 이상의 농도에서는 약간의 세포독성을 나타내었다 (표 6). 실질적으로 항세균 활성을 보이고 있는 5% 이하에서는 전혀 세포독성이 없는 것을 볼 때， 화장품 및 의약용 등으로 안전하게 사용할 수 있는 가능성을 제시하였다.
【표 6】
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 세포독성
Figure imgf000031_0001
실험예 5: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 열 안정성 확인
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타^익산의 열 안정성을 측정하기 위해 40， 80, 100 및 120°C에서 1 시간 동안 열처리한 후 처리 온도별로 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 농도가 0.0 가 되도록 액체배지 회석법으로 실험예 1 과 동일한 방법으로 E. co//에 대해 항세균력을 측정하였다 (표 7).
【표 7】
열처리 후의 3—도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 최소억제농도 (MIC)
Figure imgf000031_0002
표 7 에서와 같이 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산은 모든 열 처리군에서 대조군 (무처리)과 차이가 거의 없는 항세균활성을 확인하였다. 특히 120°C의 열처리에 의해서도 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 활성이 있는 것으로 보아 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 열에 매우 안정한 물질임을 알 수 있었다. 따라서 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 열에 의한 가공 적성에서 항세균 활성이 실활되지 않을 것으로 판단된다. 실험예 6: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 PH 안정성 확인
pH 안정성은 pH 에 따라 용매를 2， 5， 7， 9， 11 로 조절한 후시료를 가하고 37°C에서 1 시간 동안 방치한 다음 pH 7 로 중화시켜 실험예 1 과 동일한 방법으로 항세균력을 측정하였다 (표 8).
【표 8】
pH 변화에 따른 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 최소억제농도 (MIC)
Figure imgf000032_0001
상기 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 항세균 효과에 대한 유의성은 실험예 1에서와 동일하게 실시하였다.
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 모든 PH 조건에 대하여 대조군 (무처리)과. 비교시 항세균 활성에 있어 큰 차이가 나타나지 않아 pH 안정성이 매우 우수함을 알 수 있다. 일반적으로 세균은 pH 6~7 부근에서 최적 생육을 나타내므로, pH 를 낮게 조절함으로써 세균의 생육을 억제할 수 있다. 식품에 첨가되는 항균 소재들은 대부분 산미제로, 식초가 대표적인 예이다. 표 8 에서 보는 바와 같이 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 넓은 pH 스펙트럼을 보이는 것으로 나타나 기존의 합성 보존제와는 다른 기작을 가지고 있을 뿐 아니라 본래 식품의 맛과 성상 등이 변화하지 않는다는 장점을 지니고 있어 이용도가 넓을 것으로 예상된다. 실험예 7: 화장품에서의 3-도데카노일옥시—2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산의 방부 효과 확인
실험예 1 에서 제조된 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산을 1 중량 % 함유한 로션을 사용하여 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 방부 효과를 평가하였다. 방부효과 평가 방법은 국소 제제에 대해 1996 년에 유럽약전위원회 (European Pharmacopoeia Commission; E.P.)에서 제시한 미생물 챌린지시험을 이용하였다 (Letters in Applied Microbiology 2002， 35, 385-389). 사용한 세균은 이스케리치아 콜^ ^(Escherichia coli) , 슈도모나스 에루지노入 \ Pseudomonas aeruginosa)， 스타필로코쿠스 아우레우스 (5 a/¾¾ ococa/s 이다. 방부 효과를 최대 20 일까지 측정하였고, 5일 간격으로 4번씩 방부 효능을 관찰하였다 (표 9).
【표 9】
Figure imgf000033_0001
표 9 에 제시된 것처럼， 20 일 기간을 두고 1 %의 3-도데카노일옥시- 2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산를 함유한 로션의 방부 시험 결과, 처리 후 10 일 이내에 균이 모두 사멸하였다. 이는 본 발명의 3-도데카노일옥시- 2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산가 각종 세균에 대한 강력한 방부 효능이 있음을 제시하는 것이다. 실험예 8: 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산의 인체 피부에 대한 안전성 확인
상기와 같이 항균 활성 및 방부 효능이 우수하다고 판명된 3- 도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 인체 피부에도 안전한지 확인하기 위하여, 피부 안전성 검증 실험을 수행하였다. 시험방법으로 는 피부누적자극 시험을 실시하였다.
스쿠알렌 (Squalene)을 베이스로 하여 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산을 각각 0.1 중량 %， 1 중량 %, 중량 5 % 또는 10 중량 %를 첨가한 첩포 제형을 제조하고， 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 동안 누적 첩포를 시행하는 것에 의하여 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.
첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber , Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15 ^씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 아래의 수학식 1 을 이용하여 점수화하였으며， 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
[수학식 1]
평균반응도 = [[반웅지수 X반웅도 / 총피검자수 X최고점수
(4점 )] X100 ] ÷ 검사회수 (9회 )
이 때， 반웅도에서 士는 1 점, +는 2 점, ++는 4 점의 점수를 부여하며， 평균반웅도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.
【표 10]
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
상기 표에서 시험군 3 의 경우, 土， + 및 ++에 해당하는 사람의 수가 각각 1 명, 0 명 및 0 명이었고， 그 외 나머지는 반웅이 나타나지 않았다. 상기 기재된 식에 따라 계산하면 시험군 1 내지 시험군 4 의 평균 반웅도가 각각 0.00, 0.00， 0.09 및 0.27 로 모두 3 이하가 되어， 3-도데카노일옥시- 2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 뚜렷한 누적 자극 양상을 나타내지 않았으며 인체 피부에 안전한 물질로 판정되었다. 실험예 9: 급성경구 무독성 확인
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 식품에도 안전하게 적용될 수 있는가를 확인하기 위해 급성 경구독성시험을 실시하였다. 실험동물로서 5 내지 6 주령 된 SPF SD 계 랫트 20 마리를 사용하여 다음과 같은 조건에서 급성독성시험을 실시하였다:
.은도 및 습도조건 : 온도 22 ± 2 °C. 상대습도 50 士 10 %
•명암사이클: 형광등조명 (08시 점등， 20시 소등)
.조도: 200 내지 300 Lux
•자외선 처리된 음용수는 자유섭취 시킴
-시험물질을 멸균증류수에 회석하여 투여시료를 제조하여 대조구로서 멸균 증류수를 사용하여 동량 투입 투여 당일은 4 시간까지 매 시간마다 일반상태를 관찰하고， 투여 다음날부터 14 일까지는 매일 1 회씩 일반상태의 변화， 중독증상， 운동성， 외관, 자율신경 및 사망동물의 유무를 주의깊게 관찰하고 여러 가지 병리 해부학적인 검증을 거쳐 독성 유무를 판단하였다. LD50 이 24500 rag/kg B.W. (Body Weigh)이었으며， 독성은 없는 것으로 판단되었다. 실험예 10: 항산화 효과
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (Superoxide dismutase; SOD)는 슈퍼옥사이드 음이온을 ¾02 및 02로 전환시키는 항산효소로 알려져 있다. 이 실험은 잔틴 옥시다제 (Xanthine oxidase)에 의해 발생한 슈퍼옥사이드 음이온이 시료에 의해서 제거된 비율을 관찰함으로써, 시료의 항산화능을 평가한다. 시험은 도진도 (Dojindo, 일본)에서 구입한 키트를 사용하여 실시하였으며， 시험은 판매회사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 시료는 DMS0 에 용해시켜서 사용하였다. Tween 80 처리 시에는 최종 Tween 80 이 0.1% 함유토록 하고 pH 를 최종 5.0 으로 조정하였으며， 이하 본 발명에 사용된 모든 Tween 80 용액은 같은 농도 및 같은 pH로 조정하여 사용하였다. 물에 용해시킬 경우 역시 pH 를 5.0 정도로 조정하여 사용하였으며 이하 발명에서도 같은 pH 로 조정하여 사용하였다. 특히 일부 시험에서는 배지나 완충액 (Sodium acetate buffer)이 용매로 사용되었는데 이 경우도 같은 pH 로 조정하여 사용하였다. 시료에 의한 슈퍼옥사이드 음이온의 제거율을 관찰함으로써， 항산화 기능의 유무를 판단하였고, 결과는 표 11에 정리되어 있다. 【표 11】
Figure imgf000037_0001
-: 항산화능 없음, +: 1-10% 항산화능， ++: 11-20% 항산화능， +++: 20-30% 항산화능
상기 표 11 에서 확인할 수 있듯이, 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 강력한 항산화능을 갖고 있음을 알 수 있다. 실험예 11: 항염증 효능 평가
항염증 효과가 있는지 살펴보기 위하여 인간단핵구 세포인 THP-1 세포 (한국세포주은행)에서 통상의 방법에 따라 COX(cyclooxygenase) 활성억제능 실험을 시행하였다. C0X 활성 측정은 F. J. Van de Ouderaaa and Muytenhek 가 발표한 Methods in Enzymology 43:9(1994)에 따라 실시하였다. THP-1 세포주를 배양하여 24-웰 플레이트에 분주하였다. 웰당 반응 부피를 500 f — 맞추고 1 g/! 리포폴리사카리드 (Lipopolysaccharide; LPS, Sigma, 미국)와 하기 표 12 에 표기된 용매에 각각 용해시킨 시료 화합물 2 ^를 첨가한 다음 24-48 시간 동안 동일 조건으로 배양하였다. 24-48 시간 후 각 웰에 칼슘 이오노포어 (calcium ionophore, Sigma) 및 [1-14C] 아라키돈산 1 (in EtOH, 0.1 M i/ml, Sigma)를 첨가한 다음 동일 조건으로 10 분간 배양하였다. 배양 후 각 웰에 시트르산을 첨가하여 pH 를 3.5 로 맞추어 흔들어 준 다음 각 배양액 500 ^를 취하여 마이크로 원심분리기 튜브에 분주하고 에틸아세테이트 700 ^를 첨가하여 10 분 동안 진탕 추출하였다. 에틸아세테이트 층을 500≠ 취하여 스피드 진공 건조기를 이용하여 20 분 동안 농축한 다음 농축된 잔여부분 20 ^를 에틸아세테이트로 녹인 다음 TLC 플레이트에 어센틱 스탠다드 (authentic standard)와 함께 적용하였다. 방사능 밴드는 어센틱 이코사노이드 스탠다드 (authentic eicosanoid standards)로 확인하였고， 확인된 밴드의 방사능은 BAS 2000 바이오-이미징 분석기 (bio-imaging analyzer, Fuji, 일본)를 이용하여 측정하였다. 각 효소의 억제효과는 DMSCXDimethyl sulfoxide)의 값을 대조군으로 하고 대조군에 상대적인 ¾를 이용하여 C0X활성 억제능을 나타내었다.
【표 12】
Figure imgf000038_0001
-: C0X 억제능 없음, +: 1-10% 억제능， ++: 11-20% 억제능， +++: 20-30% 억제능
상기 표 12 에서 확인 할 수 있듯이， 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 강력한 C0X 억제능, 즉 항염증능을 갖고 있음을 알 수있다. 실험예 12: 면역 억제능 평가
본 발명에 사용된 시료들이 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제하는지의 여부를 NF-κΒ 루시퍼라아제 리포터 활성실험을 통해 다시 조사하였다. NF-κΒ 프로모터는 염증과 관련된 면역관련 사이토카인의 생산에 중요한 역할을 한다고 보고 되어있다. NF-κΒ 루시퍼라아제 활성을 측정하기 위해서 다음과 같은 방법을 사용하였다. 인간 단핵구세포인 THP-1 세포 (한국세포주은행)를 6 웰에 각각 1X106 개로 분주하고 수퍼펙트 '트랜스펙션 시약 (superfect transfection reagent , In vitrogen, 미국)를 이용하여 NF-κΒ 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 DNA(NF-KB lucif erase reporter plasmid DNA, Stratagene, 미국)를 형질감염 시켰다. 24 시간이 경과한 후 리포폴리사카라이드 (100 ng/ )를 처리하여 THP-1 세포를 활성화시킴과 동시에 각각의 시료를 0.1%가 되도록 DMS0에 용해하여 농도를 조정하고 처리하였다. 24시간후 세포를 수집하여 루미노미터 (himinometer, Berthold Technologies GmbH&Co.KG, 독일)를 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 결과를 정리하면 다음과 같다. 【표 13]
Figure imgf000039_0001
-: NF-κΒ 프로모터 억제능 없음， +: 1-10% 억제능, ++: 11-20% 억제능, +++: 20-30% 억제능
상기 표 13 에서 확인할 수 있듯이 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 면역억제능을 갖고 있음을 알 수 있다. 실험예 13: 미백효과측정
사람과 유사하게 자외선에 의해 색소침착이 발생한다고 알려진 갈색 기니아 피그 (Tortoiseshel 1 guinea pigs; Brown guinea pigs)를 사용하여 본 발명에 사용된 시료들에 의한 미백효과를 측정하였다.
상기 갈색 기니아 피그에서 자외선 (UV)에 의한 색소침착을 유발하기 위하여， 갈색 기니아 피그의 배 위의 털을 제거한 피부에 3X3 cm2 의 정방형 창문이 뚫린 차광용 알루미늄 호일을 접착시킨 후， SE 램프 (파장 290-320 nm, 도시바)로 자외선을 조사하였다 (총 조사 에너지량 = 1350 mJ/cm2). 자외선 조사 후 알루미늄 호일을 벗겨내고 아래와 같은 방법으로 시료를 도포하였다. 자외선 조사 후 2-3 일 후에 색소침착이 나타났으며, 약 2주 후에 최고에 도달하였고， 이 때부터 각 시료를 도포하였다.
도포회수는 1 일 당 1 회 또는 2 회로 50 일간 계속하였다. 시료는 하기 표 14 에 표기된 특정한 용매를 사용하여 용해 및 희석하였으며， 면봉으로 도포하고, 다른 부위에 반드시 용매를 도포하는 대조부위를 마련하였다. 효과 판정과 함께 누적자극성 여부도 관찰하였다. 본 실험예에서 DMS0 은 도포 시 너무 흐르기 때문에 적량의 점증제를 사용하여 젤 상태가 되도록 한 후 사용하였다. 점증제로는 잔탄 검 (Xanthan Gum)이 0.5%사용되었다.
색차계 (CR2002 크로마미터， 미놀타， 일본)를 사용하여 피부의 혹백정도를 측정하여 효과를 판정하였으며， 그 결과를 하기 표 14 에 나타내었다. 색을 표시하는 데는 L*A*B* 표색계를 사용하며， 본 발명에서는 L*값을 지표로 하였다. L*값은 표준 백판으로 교정하며, L*값은 1 개 부위에 5 회 이상 반복하여 측정하였고， 색소침착을 균등하게 하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이 (AL*)를 하기 수학식 2 로 구하고 이 값으로 효과를 판정하였다. 그 결과는 하기 표 14에 나타내었다. [수학식 2]
AL* = 도포 00일 후의 L*값 - 도포개시 일의 L*값
AL* 값을 시료도포 부위와 대조군 부위에 대해서 구한 후 비교하면 미백물질의 효과를 알 수 있다.
【표 14]
Figure imgf000040_0001
-: 미백효능 없음， +: 1-10% 미백효능, ++: 11-20% 미백효능， +++: 20-30% 미백효능
상기 표 14 에서 확인할 수 있듯이 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산이 미백효능을 갖고 있음을 알 수 있다. 실험예 14: 주름개선 효과 측정
주름개선효과는 통상 콜라겐 생합성능과 콜라게네이즈 분해 억제능 및 사람에 대한 이상시험으로서 효과를 측정할 수 있다. 사람의 정상 섬유 아세포 (Human normal fibroblast, (주)태평양)를 DMEM 배지가 들어 있는 6-웰 마이크로 플레이트 (2X105 세포 /웰)에 5% C02 배양기에 37°C로 24 시간 배양하였다. 24 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 적정용액에 0.1% 농도가 되도록 녹인 시료를 처리하며 24 시간 동안 재배양하였다. 24 시간 후， 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.
콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트 (Procollagen Type I C-peptide EIA kit (MK101), 다카라， 교토， 일본)를 이용하여 프로콜라겐 (procollagen) 타입 I C-펩타이드 (Type I C-peptide: PICP)의 양을 측정하였다. 자세한 시험방법은 다카라의 키트 설명서에 따라 수행하였다.
콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게네이즈에 대한 항체를 이용하였다. 전체적인 시험은 판매회사의 프로토콜에 따라 실시하였다. 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트 (Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며 , ELISA 판독기 (Bio- Tek ELx808™ Series Ultra Microplate Reader , 영국)로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균士 표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+ 프로그램을 이용하여 t-test 로 유의성을 검정하였고 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
본 발명에 사용된 물질을 함유한 피부용 조성물의 주름 개선효과를 임상 시험을 통하여 측정하였다. 크림의 제조는 공지의 방법에 따라 수중유형 (oil in Water type)의 일반적인 크림으로 제조하였다.
주름개선 효과는 피부탄력 변화의 측정을 통해 평가하였다. 피부탄력의 측정은 온도 24 내지 26°C, 습도 38 내지 40%로 일정하게 유지되는 조건에서 건강한 여성 30 명 (25 내지 35 세)을 대상으로 시료인 영양 크림을 각각 피검자의 얼굴에 1일 2회씩 3개월 동안사용하게 한 후, 큐토미터 SEM 474(Courage+Khazaka, Cologne, 독일)를 이용하여 측정함으로써 이루어졌으며， 판정기준은 피부탄력이 없는 .경우를 0， 많은 경우를 5 로 하여 상대적인 값을 비교하였다. 시험결과는 하기 표 15 에 나타내었다.
【표 15】
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Figure imgf000042_0001
상기 표 15 에서 확인 할 수 있듯이 본 발명의 3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 피부탄력도를 측정한 동물시험에서 무처리군에 비하여 3-4 배 더 좋게 나타났다. 콜라겐 합성증가율과 콜라게네이즈 억제율에서도 처리농도 의존적으로 효능을 나타내었다. 실험예 15: 항알레르기 효과
먼저 ICR 마우스 각 15 마리씩에 시료 (3-도데카노일옥시 -2- 이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산)을 0.50 mg/g 체증 투여한 군에서는 치사현상이 전혀 관찰되지 아니하였으나, 비반세포 자극제 (Compound 48/80； N-methyl-p-methoxyphenylethylamine)(Sigma)만을 투여한 군에서는 100%의 치사율을 나타내었다.
또한 ICR 마우스 15 마리에 비반세포 자극제를 투여하기 1 시간 전， 하기 표 16 에서 보는 바와 같은 여러 용매에 녹은 시료들을 투여하여 전신성 아나필락시 속 유발실험을 실시한 결과 치사율은 용량의존적인 경향을 보였으며， 적어도 1.0 mg/g 체중이 되었을 때 치사율 0%가 됨을 알 수 있었다.
이에 대한 비교실험은 비반세포막의 안정화 작용으로 화학적 매개물질의 유리를 억제함으로써 우수한 항알레르기 효과를 갖는 것으로 알려진 DSCG(Disodium Cromoglycate, Merck, 미국)를 이용하였으며， 자극제는 마우스의 복강 내에 8 mg/kg체중 만큼 주사했다.
【표 16】
Figure imgf000042_0002
상기 표 16 에서 확인할 수 있듯이 비반세포 자극제가 처리된 처리군에서는 모두 치사한 것으로 나타났다. 반면에 항알레르기 물질인 DSCG 처리군에서는 0.5 rag/g 체증만큼 투여할 때는 20% 내외의 항알레르기 효과가 나타났다. 반면에 1.0 rag/g 체중만큼 투여 시 치사율이 0%으로 나타났다. 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산은 농도의존적으로 12%와 25% 내외의 항알레르기 효과를 나타내었다. 실험예 16: 항비만 효과
비만억제시험은 일반적으로 잘 알려진 동물을 이용한 하기 방법으로 실시하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
비만억제활성의 측정방법은 다음과 같다:
생후 7 주된 ICR 계 수컷 마우스 (찰스리버， 일본)를 1 주일 동안 예비사육하고 1 군 7 마리로 실험에 사용하였다. 동물은 온도 23士 1°C, 습도 55土 5%， 조명시간 12 시간 /일 (day)로 설정된 항온항실에서 사육하고， 라보 腿 스록크 (일본농산공업 제조)의 사료를 사용하며 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 시료는 0.1%가 되도록 리포좀 제형 (레시틴 5%에 녹인 것)으로 제조하였다. 각 시료 용액은 마우스 10 g 당 0.1 투여되도톡 농도를 조정하여， 투여량을 1.5 g/kg 또는 1 g/kg으로 하였다. 또한, 대조군은 5% 레시틴 에멀젼으로 하였다. 마우스는 투여하기 전날부터 절식 (絶食)상태로 하여 다음 날 강제로 단회 (單回) 투여하였다. 시험기간은 2주일로 하고 체중 및 일반증상을 측정 및 관찰하였다.
시험결과， 체중은 시험된 시료는 대조군에 비해 유의성 있는 비만억제 효능을 나타내었다. 일반증상은 시험된 시료와 대조군과 비교하여 특별히 이상은 나타나지 않았다. 따라서 안전성에는 전혀 문제가 없었다. 【표 17】
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실험예 17: 탈모방지 및 육모효과
탈모방지 및 육모효과에 대한 효과를 측정하기 위하여 시료를 방부제， 점증제 및 콩에서 유래한 레시틴을 3¾ 함유한 리포좀 제형으로 만들어 시험을 실시하였다. 제조한 발모촉진용 외용액제를 이용하여 약화 또는 방사능노출에 따른 탈모 환자 10 명의 탈모부위에 1 일 2 회 각각 3 cc씩 6 개월간 적용하였다. 그 결과， 탈모 환자 8 명에게서 새로운 모근이 발생하는 등의 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다. 시험결과는 다음과 같다. 대조구로서 한미약품에서 판매 중인 목시딜을 사용하였다.
【표 18]
Figure imgf000044_0002
확인할 수 았듯이, 탈모방지와 육모에 대한 시료들의 효능을 살펴보면 농도 의존적인 효능이 있음을 알 수 있다. 실험예 18: 자극완화 효과
0.01% SDS( Sodium Dodecyl Sulfate)로 피부에 자극을 주어 피부조직을 손상시킨 후, 0.0 ) 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산을 각각 0.01% 또는 0.03% 함유한 크림을 윗팔뚝 부위에 첩포하여 피부조직이 개선되는지의 여부를 관찰하였다. 이 실험에서는 건강한 성인 30명을 대상으로 하였다.
첩포 방법은 핀 챔버 (Finn chamber , Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부외용제를 15 ^씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 3 를 이용하여 점수화 하였으며， 그 결과를 하기 표 19에 나타내었다. [수학식 3]
(반■§—지수 X반들도 ÷총피검자수 X최고점수 (4¾ )) 100
Figure imgf000045_0001
검사희수 (9희 )
이 때， 반웅도에서
Figure imgf000045_0002
부여하였다.
【표 19】
Figure imgf000045_0003
상기 표 19 와 같이， 0.0 ) SDS 를 피부에 도포하였을 경우, 평균 반웅도가 4.33 이 되어 피부가 심하게 손상된 것을 알 수 있다. 반면에， 시험군 1 및 시험군 2 를 각각 도포하였을 경우, 피부자극에 대한 완화효과가 있음을 확인하였다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ( 3一 ( dodecanoy 1 oxy ) -2- ( i sobutyry 1 oxy) -4-methy 1 pent ano i c acid):
화학식 1
Figure imgf000047_0001
【청구항 2】
다음의 단계를 포함하는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ( 3— ( dodecanoy 1 oxy )—2— ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 천연화합물 제조방법:
(a) ^^ Siegesbeckia glabrescens)로^^ 추출물을 수득하는 단계;
(b) 상기 추출물로부터 용매 분획물을 수득하는 단계 ; 및
(c) 상기 용매 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 적용하여
3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4-메틸펜타노익산을 수득하는 단계.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 후에 단계 (c)의 결과물을 C5-18 소수성 컬럼 크로마토그래피에 적용하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4]
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸 1타노익산 (3_( dodecanoy 1 oxy )-2-(i sobutyry 1 oxy )一 4_me thylpent ano i c acid)을 유효성분으로 하는 항균용 조성물.
【청구항 5]
제 4 항에 있어서， 상기 조성물은 스트랩토코쿠스 종 {Streptococcus spp.), 살모넬라 종 {Salmonella spp.), 에스케리치아 종 {Escherichia spp.), 스태필로코쿠스 ^^Staphylococcus spp.), 쉬젤라 종 {Shigella spp.), 슈도모나스 종、 Pseudᄋ醒 as spp J, 리스테리아 종 {Listeria spp.), 비브리오 종 {Vibrio spp.), 바실러스 종 {Bacillus spp.), 프로피오니박테리움 쫓― {Prop i on i bacterium spp.), 캄필로박터 ^ Ca晴 lobacter spp.), 헬리코박터 종 Hel icobacter spp.), 클로스트리디아 ^ Clostridia spp.), 보르데텔라 종 Bordetella spp.), 예르시니아 ^{Yersinia spp.), 레지오넬라 ^{Legionella spp.), 에어로모나스 종 ieromonas spp.), 박테로이드스 ^( cteroides spp.), 네이세리아 종 Neisseria spp.), 모락셀라 ^(Jioraxella spp.), 코리네박테리움 종 Corynebacte uni spp.), 액티노바실러스 (Ασί inobacilluss spp . )， 프로피오니박테 ^ ~ Propioni bacterium sp . ) , 클로스트리디
Figure imgf000048_0001
spp.), 캠필로박터 (Ca/^oy/otec e" spp.), 헬리코박터 Ofe//cobac er spp.) 및 박테로이데스 0¾c ero/flfes spp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 대하여 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
【청구항 6】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ( 3- ( dodecanoy 1 oxy )一 2— (isobutyryl oxy ) -4-methy 1 pen t ano i c acid)을 유효성분으로 하는 방부용 조성물.
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 조성물은 이스케리치아 종， 슈도모나스 및 스태필로코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물 대한 방부용 조성물.
【청구항 8】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 (3— ( dodecanoy 1 oxy )-2-( i sobutyry 1 oxy ) -4-me thylpent ano i c acid)을 유효성분으로 하는 항산화 조성물 .
【청구항 9】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 (3_( dodecanoy 1 oxy )—2— ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy lpent ano i c acid)을 유효성분으로 하는 항염증 조성물 .
【청구항 10】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸편 1타노익산 ( 3_ ( dodecanoy 1 oxy )-2-( i sobut yry 1 oxy ) -4-methy lpent ano i c acid)을 유효성분 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 .
【청구항 111
제 10 항에 있어서 , 상기 피부 상태 개선은 미 백， 피부탄력도의 증가， 콜라겐 합성 촉진 또는 콜라게네이즈 억제인 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 12】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2—이소부티 릴옥시 -4- 메틸편 1타노익산 ( 3一 ( dodecanoy 1 oxy )一2一 ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)을 유효성분으로 하는 항알레르기 조성물 .
【청구항 13】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸 타노익산 ( 3— ( dodecanoy 1 oxy )-2-( i sobutyry 1 oxy ) -4-me thyl ent ano i c acid)을 유효성분으로 하는 항비 만 조성물 .
【청구항 14】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ( 3一 ( dodecanoy 1 oxy )—2— ( i sobutyry 1 oxy) -4-methy 1 pent ano i c acid)올 유효성분 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진 조성물 .
【청구항 15】
상기 제 1 항의 3-도데카노일옥시— 2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ( 3— ( dodecanoy 1 oxy )— 2— ( i sobutyry 1 oxy )—4— me thylpent ano i c acid)을 유효성분 포함하는 자극완화용 조성물 .
【청구항 16】
제 4 항에서 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서 , 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 17】
제 4 항에서 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 18】
제 4 항에서 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물 .
【청구항 19】
다음의 단계를 포함하는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸텐타노익산 ( 3一 ( dodecanoy 1 oxy )-2-( i sobut yry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 제조방법 :
(a) 2-히드록시 아세트산 (2-hydroxyacet ic acid) 및 제 1보호기 (protect ion group)인 벤질 알코을을 반응시 켜 벤질 2- 히드록시아세테이트를 수득하는 단계 ;
(b) 상기 벤질 2-히드록시아세테이트와 및 제 2보호기 인 메틸할로메틸 에 테르를 반웅시켜 벤질 2- (메톡시메톡시 )아세테이트 (benzyl 2- (met hoxymethoxy ) acet at e ) ¾· 수득하는 단계 ;
(c) 상기 벤질 2- (메톡시메록시 )아세테이트와 리튬 핵사메틸실라잔 및 이소부틸 알데히드를 반웅시켜 벤질 3-히드록시 -2- (메록시메톡시 )-4ᅳ 메틸펜타노에이트 (benzyl 3-hydroxy-2-(methoxymethoxy)-4- methylpentanoate)를 수득하는 단계 ;
(d) 상기 벤질 3-히드록시 -2- (메록시메톡시) -4-메틸펜타노에이트와 도데카노일 할로겐을 반웅시켜 1- (벤질옥시 ) -2- (메록시메특시 )ᅳ4-메틸 -1- 옥소펜탄ᅳ 3-일 도데카노에이트 (l-(benzyloxy)-2-(methoxymethoxy)-4- me t hy 1 - 1-oxopent ane~3-y 1 dodecanoate)를 수득하는 단계;
(e) 상기 1- (벤질옥시) -2- (메록시메톡시) -4-메틸 -1-옥소펜탄— 3-일 도데카노에이트로부터 상기 제 2보호기를 제거하여 1- (벤질옥시) -2- 히드록시 -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 (l- enzyloxy^S- hydroxy一 4— methyl_l—oxopentane—3—yl dodecanoate)를 제조하는 단계;
(f) 상기 1- (벤질옥시) -2-히드록시 -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트와 이소부티릴 할로겐을 반응시켜 1- (벤질옥시) -2- (이소부티릴옥시 )-4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트 ( 1-( benzyl oxy)- 2-(isobutyryloxy)-4-methyl-l-oxypentane-3-yl dodecanoate)를 제조하는 단계; 및
(g) 상기 1- (벤질옥시) -2- (이소부티릴옥시) -4-메틸 -1-옥소펜탄 -3-일 도데카노에이트로부터 상기 제 1보호기를 제거하여 3— (도데카노일옥시) -2- (이소부티 ¾옥시 )-4—메틸펜타노익산 (3-(dodecanoyloxy)-2-( i sobutyryloxy)- 4-methylpentanoic acid)을 제조하는 단계.
【청구항 20】
제 19 항에 있어서, 상기 단계 (g)의 제 1보호기 제거는 팔라듐- 탄소 (Palladium-Carbon)에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 21]
제 19 항에 있어서， 상기 단계 (e)의 제 2보호기 제거는 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트 (Trimethylsilyl tr i f luoromethanesul fonate) 및 테트라부틸암모늄 브로미드 (Tetrabutyl ammonium bromide)에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법 .
[청구항 22】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ('3一 (dodec anoy loxy)-2-( isobutyryl oxy ) -4-me t hy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항균 방법：
화학식 1
Figure imgf000052_0001
【청구항 23】
제 22 항에 있어서， 상기 방법은 스트렙토코쿠스 ^ Streptococcus spp.), 살모넬라 종 {Salmonella spp.), 에스케리치아 ^{Escherichia spp.), 스태필로코쿠스 종 StaphyJococcus spp.), 쉬젤라 종 {Shigella spp.), 슈도모나스 ^ Pseudo賺 as spp.), 리스테리아 ^ Listeria spp.), 비브리오 종 Vibrio spp.), 바실러스 종 Bacillus spp.), 프로피오니박테리움 ^ P pionibacterium spp.), 캄필로박터 종 (、 Campylobacter spp.), 헬리코박터 ^ Hel icobacter spp.), 클로스트리디아 종 Clostridia spp.), 보르데텔라 종 Bordetel la spp.), 예르시니아 종 {Yersinia spp.), 레지오넬라 종 {Legionella spp.), 에어로모나스 종 {Aero瞧 as spp.), 박테로이드스 Bacteroides spp.), 네이세리아 ^ Neisseria spp.), 모락샐라 종 Moraxella spp.), 코리네박테리움 ^ Corynebacteriwi spp.), 액티노바실러스 종 ( ctinobacilluss sp . ) , 프로피오니박테 · Ρ )ι) i on i bac t er h spp . )， 클로스트리디움 Vos r/ 'iw spp.), 캠필로박터 (( a/j^o^c er spp.), 헬리코박터 fe//a¾ c er spp.) 및 박테로이데스 (^c ero/ofes spp.)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 대하여 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 24】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸 타노익산 ( 3一 ( dodecanoy 1 oxy )-2-(i sobut yry 1 oxy ) -4-met hyl ent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 방부 방법：
화학식 1
Figure imgf000053_0001
【청구항 25】
제 24 항에 있어서， 상기 방법은 이스케리치아 종， 슈도모나스 종 및 스태필로코쿠스로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물에 대한 방법 .
【청구항 26】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티릴옥시 -4- 메틸 타노익산 (3一 (dodec anoy loxy)-2-(isobutyryloxy) -4-me t hyl ent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject)에게 적용하는 단계를 포함하는 항산화 방법：
화학식 1
Figure imgf000054_0001
【청구항 27]
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 (3_( dodecanoy 1 oxy )-2-( i sobutyry 1 oxy ) -4-me t hy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subj ect )에 게 적용하는 단계를 포함하는 항염증 방법 :
화학식 1
Figure imgf000054_0002
【청구항 28】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 (3— ( dodecanoy 1 oxy )一2— ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject )에 게 적용하는 단계를 포함하는 피부상태 개선 방법 :
화학식 1
Figure imgf000055_0001
【청구항 29]
제 28 항에 있어서， 상기 피부 상태 개선은 미 백， 피부탄력도의 증가， 콜라겐 합성 촉진 또는 콜라게네이즈 억 제인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 30]
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메.틸 타노익산 ( 3— ( dodecanoy 1 oxy )一2一 ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject )에 게 적용하는 단계를 포함하는 항알레르기 방법：
화학식 1
Figure imgf000055_0002
【청구항 31】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸 타노익산 ( 3_ ( dodecanoy 1 oxy )-2- ( i sobutyry 1 oxy )—4— met hy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject )에 게 적용하는 단계를 포함하는 항비만 방법 :
화학식 1
Figure imgf000056_0001
【청구항 32】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸펜타노익산 ( 3_ ( dodecanoy 1 oxy )—2— ( i sobutyry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject )에 게 적용하는 단계를 포함하는 탈모방지 또는 육모촉진 방법：
화학식 1
Figure imgf000056_0002
【청구항 33】
하기 화학식 1로 표시되는 3-도데카노일옥시 -2-이소부티 릴옥시 -4- 메틸 타노익산 (3_( dodecanoy 1 oxy ) _2_ ( i sobut yry 1 oxy ) -4-methy 1 pent ano i c acid)의 유효량을 포함하는 조성물을 객체 (subject )에 게 적용하는 단계를 포함하는 자극완화 방법： 화학식 1
Figure imgf000057_0001
【청구항 34]
제 22 항， 제 24 항， 제 26 항 내지 제 28 항 및 제 30 항 내지 제
33 항 중 어느 한 항에 있어서 , 상기 조성물은 화장료 조성물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 35】
제 22 항， 제 24 항 , 제 26 항 내지 제 28 항 및 제 30 항 내지 제
33 항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 조성물은 식품조성물인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 36】
제 22 항， 제 24 항 , 제 26 항 내지 제 28 항 및 제 30 항 내지 제
33 항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 조성물은 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 방법 .
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