KR100713718B1

KR100713718B1 - 희렴 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 혈압강하의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR100713718B1
Application number: KR1020050070953A
Authority: KR
Inventors: 신흥묵; 전수영
Original assignee: 신흥묵
Priority date: 2005-08-03
Filing date: 2005-08-03
Publication date: 2007-05-02

Abstract

본 발명은 희렴(희첨) 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 혈압강하의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 항암제, 항산화제 및 혈압강하제와 관련된 치료제 또는 예방제로 유효하게 사용할 수 있다.

희렴, 항암, 항산화, 혈압강하

Description

희렴 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 혈압강하의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물{A curing and preventing pharmaceutical composition having an effect of anticancer, antioxidant and hypotensor by containing a extract of Siegesbeckia spp}

도 1은 본 발명에 따른 희렴 추출물이 페닐에프린의 혈관수축에 대한 이완 효과를 생리신호기록으로 나타낸 그래프,

도 2는 본 발명에 따른 희렴 추출물이 염화칼륨의 혈관수축에 대한 이완 효과를 생리신호기록으로 나타낸 그래프,

도 3은 본 발명의 희렴 추출물이 HUVEC(A)와 HASMC(B) 세포사멸에 미치는 영향을 세포생존율로 나타낸 그래프,

도 4는 본 발명의 희렴 추출물이 카스파제-3 발현에　대한　영향을　웨스턴 블랏팅(A) 사진과 이를 통해 밴드의 농담 정도(B)를 측정하여 나타낸 그래프,

도 5는 세포사멸(Apoptosis)에 관여하는 본 발명의 희렴 추출물의 NO 생성능을 희렴 추출물의 농도별(A)과 처리 시간별(B)로 나타낸 그래프,

도 6은 PC-OOH의 생성량 대한 희렴추출물의 억제작용을 처리 시간별로 나타낸 그래프,

도 7은 본 발명의 희렴 추출물과 DPPH와 혼합한 혼합액의 라디칼 소거능을 농도별로 나타낸 그래프,

도 8은 본 발명에 따른 희렴 추출물의 간암세포에 대한 세포사멸효과를 나타낸 그래프,

도 9는 본 발명에 따른 희렴 추출물의 유방암세포 중 MCF-7 세포(A)와 MDA-MB-231(B)에 대한 세포사멸효과를 나타낸 그래프,

도 10은 본 발명에 따른 희렴 추출물의 간암세포(A)와 유방암 세포 중 MCF-7 세포(B)와 MDA-MB-231 세포(C)의 형태적 변화효과를 나타낸 사진,

도 11은 본 발명의 희렴 추출물에 의한 유방암 세포 중 MCF-7세포(A)와 MDA-MB-231(B)세포의 핵 형태 변화를 Hoechst 33342 염색법을 이용하여 타낸 사진,

도 12는 본 발명의 희렴 추출물에 의한 간암세포주(A)와 유방암 세포주 중 MCF-7세포(A)와 MDA-MB-231(B)세포의 DNA 분절 효과를 전기영동으로 나타낸 사진.

본 발명은 희렴(희첨) 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 세포사멸 유도의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 인체의 모든 기관은 수많은 세포로 구성되어 있으며, 이 세포들은 위치와 기능에 따라 여러 종류로 나누어지지만 하나의 수정란에서 기원하고 있기 때문에 동일한 유전정보를 가지고 있으며 일정한 세포주기를 가지고 분화하고, 성장하고, 소멸한다. 예를 들어 혈액 세포인 적혈구의 경우 골수에서 생성되어 약 120 여일 후 비장에서 자연 소멸하게 되고, 신경세포의 경우 일생에 한 번만 생성되는데 사망과 동시에 소멸하게 된다. 그러나 이러한 자연적인 세포주기에 이상이 생겨 세포가 정상적으로 분화하지 않고, 어느 정도 분화한 후에는 성장을 멈추어야 하는데도 불구하고 계속 성장하는 것을 종양(tumor)이라 하며 종양에는 양성종양과 악성종양이 있다. 이중 악성종양을 암이라고 한다.

그리고, 상기 악성종양을 유발하는 암세포는 여러 누적된 유전자의 손상에 의해 증식능이 증가한 반면 세포사멸(apoptosis)에 대한 민감도는 감소되어 있다.

이에, 암과 세포사멸(apoptosis)과의 관련성에 대해서도 많은 증거들이 유전학적 연구를 통하여 얻어지고 있다.

구체적인 예로 모낭성 림프종(Follicular lymphoma)의 경우 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 bcl-2 유전자가 염색체 18번에서 14번으로 전좌됨으로써 과도하게 발현되는 것이 원인이며, 악성 흑색종(malignant melanoma)는 세포사멸을 억제하는 FLIP 유전자의 과발현에 의한다고 알려져 있다(Irmler M et al,Nature, 1997).

또한, 많은 암에 있어서 새로운 세포사멸 억제 유전자인 서비빈(survivin)의 과활성화가 보고되고 있다(Ambrosini G et al, Nature medicine, 1997).

그리고, 고혈압은 암과 뇌졸중에 이어 현재 우리나라 사망원인 3위인 심장병의 3대 위험요인이다. 의학 교과서엔 높은 콜레스테롤 수치를 가장 위험한 것으로 싣고 있으나, 이것은 서양인을 대상으로 한 연구결과이며 실제 한국인에겐 콜레스테롤보다 고혈압이 더욱 위험한 요인이라고 심장 전문가들은 강조한다. 이처럼 심 장병의 가장 위험한 요인인 고혈압은 그 자체가 두려운 것이 아니라 동맥경화, 뇌출혈, 뇌경색, 뇌혈전, 심근경색, 협심증 및 신부전 등 합병증을 일으키기 때문에 조기치료와 관리가 중요하다.

또한, 산소를 이용하여 생존하는 인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소의 에너지 대사로부터 인체에 치명적인 생리적인 장애나 심각한 질병을 초래하는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼, 과산화수소, 히드록시 라디칼 등의 유해한 활성 산소종에 노출되기 쉬운데, 특히 스트레스에 의해 발생빈도가 높기 때문에 현대에 와서는 이에 대한 관심이 고조되고 있다. 특히, 세포가 노화되면서 자유라디칼이나 활성산소종에 의한 유해작용이 누적될 경우, 발암, 동맥경화, 심장질환 및 피부노화 등 성인병 관련 질환과 노화의 원인으로 알려져 있다(Harman, D., Free Radicals in Biology, Academic Press, New York, 255-275, 1982).

한편, 희렴(일명 희첨)은 진득찰(Siegesbeckia orientalis L. var. pubescens Mak., Siegesbeckia orientalis L., Siegesbeckia orientalis L. var. glabrescens Mak.)이라는 국화과(Compositae)식물의 전초를 건조시킨 한약재를 말하며, 동속식물(同屬植物)로 진득찰속에 진득찰(Sigesbeckia glabrescens), 제주진득찰(Siegebeckia orientalis L.), 털진득찰(Siegesbeckia pubescens)로 나뉘어지는 데, 이중 진득찰은 털진득찰에 비하여 줄기와 잎에 털이 없고 꽃자루에 선이 없는 것이 특징이고, 제주 진득찰은 진득찰과 털진득찰에 비하여 줄기가 우상(又狀)으로 갈라지고 잎의 하부는 불규칙하게 천렬(淺裂)하는 것이 특징이며, 털진득찰은 진득찰에 비하여 줄기와 잎뒤에 맥상에 백색의 긴털이 밀생(密生)을하고 잎이 대형 (大形)이며 화편(花梗)에 흔히 선모(腺毛)가 있고 수과(瘦果)는 2.5∼3.5mm로 보다 길다.

그리고, 전통적으로 관절염 등에 쓰여 온 한약재인 희렴에 대하여서는 이외에 창옹, 옹종, 사교상 및 급성황달에 대한 사용되고는 있으나 아직 암치료제나 암치료용 세포사멸 유도제로서 알려진 바는 없다.

이에, 본 발명자는 생약추출물을 사용하여 새로운 암치료제나 항산화제 또는 혈압강하제를 개발하고자 하였으며, 희렴 추출물이 항암, 항산화 및 혈압강하 효과가 우수하다는 것을 입증하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 희렴 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 혈압강하의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 희렴 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 혈압강하의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 조성물과 약제학적으로 허용된 담체가 포함되어 이루어지는 항산화제를 제공한다.

또한, 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 조성물과 약제학적으로 허용된 담체가 포함되어 이루어지는 항암제를 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 조성물과 약제학적으로 허용된 담체가 포함되어 이루어지는 혈압강하제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명은 희렴 추출물을 종래 전혀 알려지지 않았던 항암, 항산화 및 혈압강하 등의 치료 또는 예방 용도로 사용하는 것이다.

이때, 본 발명에서 사용되는 희렴 추출물은 열수추출물을 사용하는 것이 바람직한 데, 구체적으로 희렴 200g을 둥근 플라스크(round flask)에 넣고, 증류수 1000ml을 가하여 가열 추출한 후 추출액을 여과지로 여과하고, 이 여과액을 회전 증발기(rotary evaporator)로 감압 농축한 후 동결건조하여 수득한 21.59g의 분말을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 사용하는 상기 희렴은 한의학 본초서에서 제시한 바와 같이, 희렴의 약효는 증가시키면서 독성은 저감시키기 위하여, 주증(酒烝)한 희렴을 사용한다.

이때, 상기 주증한 희렴은 생희첨 10 중량부에 막걸리 100중량부를 적시고, 30분간 찐 다음, 이를 햇볕에 말리는 과정을 9회 반복한 것을 사용하는 것이 약효면에서나 독성 약화에 있어서 가장 바람직한 데, 이는 본 발명의 분야에서 당업자 라면 공지의 기술로 잘 알려져 있다.

그리고, 상기와 같이 추출된 희렴 추출물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용하여 정제(tablet), 캅셀제(capsule), 산제, 과립제, 현탁제, 유제와 같은 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회투여형 제제로 제조하고, 이를 항고혈압, 항산화 및 항암을 위한 치료 및 예방제로 사용할 수 있다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 그리고, 이때 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통해 약제의 투여를 의미한다.

또한, 상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화할 수 있다.

그리고, 본 발명에서 분리한 희렴 추출물을 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 특정 환자에 대한 투여 용량 수준은 사용될 특정 화합물, 체중, 연령 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배성율, 약제 혼합 및 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다. 그러나, 바람직하게 상기 본 발명의 방법 및 한의학 본초서에 기재된 일일 투여량에 기초하면 추출된 주증된 희렴 추출물은 경구투여 기준으로 일일 체중 1㎏당 15∼25㎎을 투여토록 하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

[실시 예 1] 본 발명의 희렴 추출물 제조

1 단계: 생희첨 200 그램을 막걸리 2리터에 적신 다음 30분간 찐다. 이를 햇볕에 말리고 같은 과정을 9회 반복하여 주증된 희렴을 제조하였다.

2 단계: 주증된 희렴 200g을 둥근 플라스크에 넣고, 증류수 1000ml을 가하여 70℃에서 1시간 30분동안 가열하여 추출액을 얻었다. 그리고, 상기 추출액을 No. 2 여과지(와트만스)로 여과하고, 이 여과액을 감압회전식 진공증발기(Rotary vacuum Evaporator; Heidolph vv 2000, Germany)로 농축한 후 원심진공건조기(일신, 한국)를 이용하여 건조시켜 21.59g의 분말을 수득하였다.

[실시예 2] 희렴 추출물의 항동맥경화성고혈압 효과 검색

본 실시에는 고혈압 상태인 수축혈관을 희렴이 이완하는 효과가 있는 지의 여부를 Organ Bath Study의 참고문헌 방법을 이용하여 확인하고자 하였다.

1. 희렴의 수축혈관의 이완 효과

먼저, 흰쥐를 에테르(ether)로 마취하여 실혈시키고 복강을 열어 흉부대동맥을 적출하였다. 그리고, 상기 적출된 조직을 Krebs-Ringer bicarbonate 용액에 넣 고 실온에서 혈관주위의 연조직과 지방을 제거하여 약 2mm정도로 잘라내어 고리형태의 혈관절편을 제작하였다.

그리고, 혈관근육의 정상적인 유지를 위해 Krebs-Ringer bicarbonate solution을 사용하였으며, 그 조성은 95%의 산소(O₂)와 5%의 이산화탄소(CO₂)를 혼합한 가스를 계속 주입시킨 상태에서 염화나트륨(NaCl) 119.8mM, 염화칼륨(KCl) 4.6mM, CaCl₂ 2.5mM, MgCl₂ 1.2mM, NaHCO₃ 25mM, KH₂PO₄ 1.2mM, 포도당(glucose) 10mM 로 하고 pH는 7.4로 조정한 것을 사용하였다.

그런다음, 95%의 O₂와 5%의 CO₂를 혼합한 가스가 연속적으로 공급되고 37±0.5℃로 유지되는 Krebs-Ringer bicarbonate 용액이 튜브연동식펌프(peristaltic pump)를 통하여 4 ml/분의 속도로 흐르고 있는 organ bath(용량 1.5 ㎖)에 혈관절편을 현수하여 한쪽 끝은 organ bath의 저부에 고정시키고 다른쪽 끝은 근 수축변환기에 연결하여 등장성 수축 및 이완을 기록하였다. 이때, 상기 혈관절편은 미세장력 조절장치(Grass FT-03)를 이용하여 초기 장력을 1g 부하하고 1시간 이상 회복시킨 후 실험에 이용하였는 데, 실험절편을 0.1μM의 페닐에프린(phenylephrine)을 사용하여 최고 수축기에 이르렀을 때, 희렴을 농도별로 희석하여 투여하여 나타나는 반응을 생리신호기록기(physiograph, Gass 7, USA)로 연속 기록하였다.

그리고, 염화칼륨(KCl)이 일으키는 세포막 탈분극에 의한 수축에 대한 이완효과는 실험전 65.4mM의 KCl로 1회 이상 수축시켰을 때 일정한 크기의 수축을 일으키는 절편에 희렴을 농도별로 첨가하여 나타난 반응을 생리신호기록기 (physiograph)로 연속 기록하였다.

이의 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 희렴 추출물은 페닐에프린(phenylephine; PE, 0.1μM)의 혈관수축에 대하여 농도 0.1㎎/㎖에서 12.0±4.72%, 0.3㎎/㎖에서 28.05±3.02%, 0.5㎎/㎖에서 44.94±6.95%, 0.8㎎/㎖에서 68.21±5.46%, 1.0㎎/㎖에서 91.88±4.09%의 이완효과를 나타내었다.

또한, 도 2에 도시된 바와 같이, 염화칼륨의 혈관수축에 대한 희렴의 이완 효과에서 염화칼륨(KCl)의 최대 수축(65.4mM)의 경우0.1㎎/㎖에서는 0.78±1.10 %, 0.3㎎/㎖은 9.89±0.62 %, 0.5㎎/㎖에서는 27.59±5.88 %, 0.8㎎/㎖에서는 39.92±2.13 %, 1.0㎎/㎖에서는 70.85±5.03 %의 이완효과를 보였다.

2. 희렴의 평활근 과다증식의 저해 효과

본 실시 예에서는 고혈압 상태로 유발된 평활근의 과다증식을 희렴이 저해 할 수 있는 지의 여부를 XTT법(D.A. Scudiero, Cancer Res., 48, 4827, 1988: Roche, USA)를 통해 확인하고자 하였다.

먼저, 96웰 세포 배양판에 DMEM (Gibco)배지 90%와 우태아 혈청(fetal bovine serum) 10% 혼합배지를 넣고 평활근 세포(Human aorta smooth muscle: Cambrex, USA)를 5X10³ 세포/웰의 양으로 가한 다음, 상기 실시 예 1에서 제조된 희렴 추출물을 0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0mg/ml까지 배지로 희석한 각 용액을 각 웰에 첨가하고, 대조군 웰에는 배지만 가하였다. 그리고, 상기 세포 배양판을 37℃에서 5% 이산화탄소하에서 24시간 배양하였다. 이어서 50㎕/웰의 XTT(sodium 3'- [1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis [4-methoxy-6-nitro] benzene sulfonic acid hydrate) + PMS (electron-coupling reagent; N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate, 0.383mg/ml in phosphate buffered saline)를 각 웰에 더한 후 4시간 동안 37℃, 5%의 이산화탄소하에서 배양하였다. ELISA판독기 (EL312e, Bio-tek instruments)로 490nm에서 광학밀도(O.D)를 측정하였다.

[실시 예 3] 세포사멸 유도 효과

본 실시 예에서는 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell: Cambrex, USA)와 HASMC(Human aorta smooth muscle: Cambrex, USA)에 대한 희렴의 세포사멸에 대한 영향을 확인하기 위하여 XTT, 현미경관찰, 트립판 블루 배제방법(tryphan blue exclusion)을 이용하여 농도별 세포 생존율을 관찰하였다.

1. 희렴의 농도에 따른 세포 생존율 검사

본 실시 예는 희렴의 농도에 따른 HASMC와 HUVEC의 세포 생존율을 대조군과 비교하여 측정하였다.

이의 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 희렴 추출물은 HUVEC에는 유의한 영향을 미치지 않았으나, HASMC에 대하여 0.1mg/ml의 농도에서 약 50%, 0.3mg/ml 이상의 농도에서 약 70% 내외의 세포사멸을 초래하는 것을 알 수 있었다.

2. 희렴에 의한 과다 증식된 혈관 평활근 세포의 세포사멸 유도 효과

본 실시 예에서는 희렴에 의한 과다 증식된 혈관 평활근 세포의 세포사멸 유도 유무를 확인 하기 위해 세포사멸 과정에 관여하는 카스파제(caspase)효소 중 세포사멸을 억제하는 카스파제 3(caspase-3)의 발현정도를 측정하였다.

먼저. 카스파제-3의 발현변화를 웨스턴 블랏팅(western blot)을 통해 확인하고자 세포를 100인치 세포 배양판에 90 %정도로 깔은 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 희렴 0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0 mg/ml의 농도를 배지로 희석하여 각 세포 배양판에 투여한 다음, 24시간 후 세포로부터 NP-40을 포함하는 RIPA buffer(10㎍/㎖ leupeptin, 10㎍/㎖ aprotinin & 1mM PMSF 포함)로 단백질을 추출한 뒤 Bio-Rad kit (Lowery methods)를 이용하여 정량하였다.

그리고, 정량 후 10% 소디움 도데실 설페이트 폴리 아크릴아마이드 겔 전기영동(sodium dodesyl sulfate-polyacrylamide gel electrophorisis; SDS-PAGE)에 의해 단백질을 분리하고，니트로셀룰로즈 막(nitrocellulose membrane)으로 전이(transfer)한 후 블라킹 완충용액(blocking buffer) 즉, TBS에 녹인 3% 탈지분유(nonfat dry milk)로 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그리고 탈지분유에 녹인 항 카스파제-3 항체(anti-caspase-3 antibody, 1:1,000로 희석)에 한 시간 반응시켰다. 그리고, TBST로 세척(10분×3)하고, 서양고추냉이 페옥시다제와 결합된 2차 항체(horse-radish peroxydase-conjugated secondary antibody)와 ECL kit(Amersham Pharmacology, USA)로 발색시켰다.

이의 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 항 세포사멸 단백질(Anti-apoptotic protein)인　caspase-3에　대한　영향을　웨스턴 블랏팅(A)와 이를 통해 밴드의 농담 정도(B)를 대조군과 비교하여 측정한 결과, 대조군에　비해　유의한　프로카스파제(procaspase-3)의　분해를 확인할 수 있었다．따라서 희렴은　caspase-3의　활성 유도를　통해　혈관평활근　세포의　세포사멸을　유도함을　알　수 있었다.

3. 희렴에 의한 평활근 세포의 세포사멸 유도시 일산화질소(NO)의 효과

희렴에 의한 평활근 세포의 세포사멸 유도시 NO와의 관련성을 파악하기 위해, 희렴을 농도별로 처리한 후 NO 생성량을 다음과 같이 측정하였다. 세포 배양액에 축적된 NO의 농도는 Griess 방법에 따라 ELISA reader (Bio-tek instruments EL312e)로 흡광도를 측정하였다.

먼저, 24 웰 플레이트에 1×10⁴ 세포/ml을 분주하고 24시간 배양한 다음, 혈청 배제 배지(serum free media)로 다시 24시간을 배양하였다.

그리고, 상기 검액, L-NNA(10^-4M, sigma), PMA(10^-7M, sigma)를 각각 또는 함께 처리하고 24시간 동안 배양 후, 각 검액로부터 배지를 E-튜브에 옮겼다. 모은 배지를 96 웰 플레이트에 50㎕씩 분주한 후 50㎕의 1% 설파닐아미드(sulfanilamide in phosphoric acid)를 첨가하였다. 그리고 진탕기(Shaker)에서 10분간 반응시킨 후, 다시 50㎕의 0.1% 나트틸 에틸렌디아민 디하이드로클로라이드(napthyl-ethylendiamine dihydrochloride)를 혼합하여 상온에서 10분간 반응 시킨 후, ELISA 판독기로 A₅₇₀에서 흡광도를 측정하였다. 이때, NO의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite)의 농도를 기준으로 작성한 표준곡선으로 환산하여 계산하였으며, 각 실험에서 기본 대조군은 세포 배양액을 그대로 사용하였다.

도 5에 도시된 바와 같이, 세포사멸(Apoptosis)에 관여하는 희렴의 NO 생성능을 농도차이(0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0mg/ml; A)및 시간차이(5, 10, 30, 60, 1440 분; 0.5mg/ml; B) 에 의한 NO^- ₂ 생성에 기초하여 측정한 결과, 희렴은 농도 의존적으로 NO^- ₂의 생성을 증가시켰으며 NO^- ₂ 생성은 0.5㎎/㎖의 희렴 추출물 처리 5분부터 증가하여 24시간까지 지속되는 것을 알 수 있었다.

[실시 예 4] 희렴 추출물의 항산화 효과

본 실시 예에서는 본 발명에 따른 희렴 추출물을 지방산에 사용하여 산화억제효과를 확인하고자 하였다.

1. 리놀레산

먼저, 리놀레산 에멀젼(Linoleic acid emulsion)은 Osawa 등의 방법에 따라 제조하였다. 즉, 리놀레산 0.39㎖과 99% 에탄올 10㎖에 50mM 인산 완충용액(phosphate buffer, pH 7.0) 10㎖를 혼합하고 증류수로 전체 용액이 25㎖가 되도록 제조하였다.

그리고, 리놀레산 에멀젼 600㎕에 희렴을 농도별로 첨가한 다음, 증류수로 전체 용액이 8㎖가 되도록 조절하고, 상기 혼합액을 팰콘 튜브(Falcon tube)에 넣고, 순환진탕기에서 37℃에서 72시간 배양하여 자동산화를 촉진시켰다. 이때, 지질과산화는 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 농도로 나타내었으며, MDA 정량은 TBA법(2-tiobarbituric acid)에 의한 Ohkawa (金昊顯 외, 동의생리학회지, 1995)등의 방법에 따라 다음과 같이 실시하였다.

즉, 37℃에서 배양시킨 리놀레산 에멀젼 0.8㎖에 8.1% SDS 0.2㎖, 20% 아세트산(pH 3.5) 1.5㎖, 0.8% TBA 1.5㎖를 가한 다음, 95℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, 냉각시켜 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, MDA농도는 자유 MDA(free MDA)로 표준선을 구하여 계산하였다.

이의 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 희렴의 과산화지질 억제효과는 배양 4일째부터 리놀레산의 자동산화를 유의하게 억제하기 시작하였다. 그리고, 반응 마지막 날을 기준으로 대조군의 100.13 나노몰(nmole)에 비하여 200㎍에서는 5.72 나노몰, 400㎍에서 8.88 나노몰, 600㎍에서 14.42 난노몰, 800㎍에서 13.48 나노몰 1000㎍에서 14.93 나노몰, 1200㎍에서 14.67 나노몰로 현저한 억제효과를 나타내었다.

2. 카르테노이드 및 포스타티딜콜린 하이드로페록사이드(Carotenoid and phosphatidylcholine hydroperoxide; PC-OOH)에 대한 희렴 추추물의 생성 효과

먼저, PC-OOH의 생성량은 Bligh-Dyer 방법을 이용하여 측정하였다.

즉, 10mg의 PC에 대해 0.1%(W/W)의 시료를 10mM의 Tris-HCl 완충용액(pH 7.4) 0.9㎖에 녹여 1분간 혼합기(vortex mixer)로 혼합하고, 실온에서 1분간 초음파를 가하여 멀티라멜라 리포좀(multilamellar liposomes)을 만든 다음 37℃, 암실에서 흔들어 주면서 5분간 예비반응시킨 후, 라디칼 저해제(radical initiator)로서 AAPH(2,2'-azobis(2-amidinopropane dihydrochloride) 0.1ml을 넣어 37℃, 암실에서 흔들어 반응을 개시시키고, 상기 반응액은 1시간 마다 100㎕씩 클로로포름(chloroform) 250㎕와 메탄올 125㎕를 가해 2분간 흔들어 하층을 취하고, 다시 클로포름 50㎕를 넣고 흔들어서 PC-OOH를 추출한 후 20㎕를 HPLC에 주입하여 PC-OOH의 생성량을 조사하였다.

이의 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, PC-OOH의 생성량 대한 희렴의 억제작용을 보면 0시간, 1 시간, 2시간, 3시간, 4시간 및 5시간에서 대조군의 38.35 pmol/㎎ PC-liposome(피코몰/mg-리포좀), 680.24 pmol/㎎ PC-liposome, 1207.26 pmol/㎎ PC-liposome, 2633.34 pmol/㎎ PC-liposome, 2817.93 pmol/㎎ PC-liposome, 3207.77 pmol/㎎ PC-liposome에 비하여 희렴을 처리한 군은 42.87 pmol/㎎ PC-liposome, 35.11 pmol/㎎ PC-liposome, 42.61 pmol/㎎ PC-liposome, 50.03 pmol/㎎ PC-liposome, 39.75 pmol/㎎ PC-liposome, 54.42 pmol/㎎ PC-liposome로 PC-OOH의 생성을 억제함을 알 수 있었다.

3. 희렴 추출물과 DPPH의 자유 라디칼의 소거 효과

희렴 추출액의 자유 라디칼(free radical)에 대한 소거효과를 보기위해 Yoshida방법에 따라 1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl(DPPH)에 의한 radical의 소거효과를 측정하였다.

먼저, 농도별 희렴 희석액과 증류수 혼합물 4㎖에 1.5×10^-4M DPPH/MeOH 1㎖를 첨가하여 혼합하고 실온에서 30분 동안 방치한 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 비히클(Vehicle)로는 1% CMC(carboxymethyl cellulose sodium salt)를 포함한 0.9% 염화나트륨(NaCl)을 사용하였다.

이의 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 희렴은 농도 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200㎍에서 각각 43.4%, 48.9%, 53.5%, 50.3%, 49.5%, 41.5%, 40.3%의 radical 소거 효과를 보여 400㎍에서 최대의 소거효과를 보였다.

[실시예 5] 희렴 추출물의 항암 효과

본 실시 예에서는 간암세포주인 HepG2와 유방암 세포인 MCF-7(에스트로겐 수용체 존재)와 MDA-MB-231(에스트로겐 수용체 비존재) 세포를 사용하여 희렴 추출물의 항암 효과를 확인하고자 하였다.

이때, 간암세포주인 HepG2와 유방암 세포인 MCF-7와 MDA-MB-231 세포를 95% O₂/5% CO₂가 유지되는세포 배양기에서 37℃의 온도로 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스테렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. 그리고, 각 세포가 90% 정도 자랐을 때, 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 처리하여 계대 배양한 후 포집한 것을 하기 실험에 사용하였다.

1. 본 발명에 따른 희렴 추출물의 세포 생존율에 대한 효과

세포 생존율은 XTT assay 방법을 이용하였다.

먼저, 96 웰 세포 배양판에 세포를 10×10³세포/웰 분주하고 24시간 안정화시킨 후 혈청이 없는 배지로 24시간 배양하였다. 그리고, 희렴을 처리한 후 24시간 동안 배양한 다음, 웰당 50㎕의 XTT(Roche, USA)를 처리하고 4시간 배양 후, ELISA 판독기(Bio-tek instruments EL321e)를 이용 490nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군을 기준으로 세포 생존율을 백분율(%)로 표시하였다. 희렴이 가지는 흡광도를 보정하기 위하여 세포를 뺀 배지를 같이 배양하여 대조군과 실험군의 흡광도를 비교·보정하여 세포 생존율을 백분율(%)로 표시하였다.

항 간암 활성효과를 평가하기 위한 선행실험으로 HepG2에 대한 희렴의 세포사멸 효과를 측정한 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 희렴 추출물은 간암세포에 대하여 0.1mg/ml의 농도에서 18±4%, 0.3mg/ml 이상의 농도에서 약 47%의 세포사멸을 초래하였다.

그리고, 도 9에 도시된 바와 같이, 에스트로겐 수용체(ER)가 존재하는 MCF-7에서 본 발명의 희렴 추출물이 0.1mg/ml인 경우에서는 -7.7±10.8, 0.3mg/ml은 45.2±18.2%, 0.5mg/ml은 66.8±5.8%, 0.8mg/ml은 67.7±5.6%, 1.0mg/ml은 67.1±5%의 세포사멸을 초래하였다(도 9-A 참조). 또한, 에스트로겐 수용체가 존재하지 않는 MDA-MB-231에서 희렴 추출물이 0.1mg/ml인 경우에서는 10.7±12.9, 0.3mg/ml은 51.6±11.3%, 0.5mg/ml은 73.9±5.7%, 0.8mg/ml은 75.7±4.6%, 1.0mg/ml은 74±4.5%의 세포사멸을 초래하였다(도 9-B 참조).

이상의 결과들을 통해 볼 때, 본 발명에 따른 희첨 추출물은 간암세포인 HepG2와 에스트로겐 수용체의 유무에 관계없이 인간 유방암 세포(human breast carcinoma)의 세포사멸을 유도 하였다. 또한, 희렴이 ER 양성(postivie)인 MCF-7보다는 ER 음성(negative)인 MDA-MB-231에서 좀더 유의한 세포사멸을 유도함을 알 수 있었다.

2. 본 발명에 따른 희렴 추출물의 세포 형태 변화의 효과

본 실시 예는 6 웰 세포배양판에 2×10⁵ 세포/웰의 세포를 분주하고 24시간 배양한 다음, 혈청이 없는 배지로 다시 24시간을 배양하였다. 그리고, 희렴 추출물을 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양 후, 광학 현미경 (inverted microscope : Olympus CK40, Japan)을 이용하여 세포의 형태변화에 어떠한 영향을 주는 지를 관찰하고자 하였다.

먼저, 희렴 추출물이 간암 세포의 형태적 변화에 영향을 미치는 농도를 결정하고자 농도별(0, 0.1, 0.3, 0.5mg/ml)로 관찰하였다.

이의 결과, 대조구와 비교하여 희렴 추출물로 처리한 간암 세포주인 HepG2의 경우에서는 핵과 세포질의 농축, 죽은 세포의 부유 등 형태적 변화가 관찰 되었다(도 10-A 참조). 그리고, 희렴의 농도(0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0 ㎎/㎖)에 따른 MCF-7 세포(도 10-B)와 MDA-MB-231 세포(도 10-C)의 형태적 변화를 광학현미경으로 관찰한 결과, 대조군의 세포는 플레이트에 잘 부착되어 전형적인 세포형태를 하고 있으나, 희렴의 처리에 의해 세포질의 수축이 일어나면서 형태가 둥글게 변하고, 핵 농축, 핵 분절 및 죽은 세포의 부유 등 아폽토시스소체(apoptotic body) 현상을 관찰할 수 있었다.

3. 본 발명에 따른 희렴 추출물의 유방암 세포사멸 유도 효과

본 실시 예에서는 세포사멸의 핵을 염색하는 Hoechst 염색법을 이용하여 희렴이 유방암 세포의 세포사멸을 유도하는 지를 확인 하고자 하였다.

먼저, 35mm 세포 배양판에 일정한 농도로 (10×10⁴ cells/ml)로 배양된 세포에 희렴 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 찬 PBS(cold Phosphate buffer saline)로 세포를 두 번 씻었다. 그리고, 3.5%의 파라포름알데히드(araformaldehyde)로 세포를 15분간 상온에서 고정한 후, 다시 찬 PBS(cold PBS)로 세포를 두 번 씻었다. 그런 다음, PBS에 희석된 Hoechst를 각 세포에 처리한 후 암실 조건에서 15분간 상온에서 반응시키고, PBS로 씻은 후, 50% 글리세롤(glycerol)로 마운팅(mounting)한 후, Leica 400 카메라로 형광 조건에서 관찰한 후 사진 촬영을 수행하였다.

도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명의 희렴 추출물에 의한 유방암 세포의 핵 형태 변화를 Hoechst 33342 염색법을 이용하여 관찰한 결과, 정상 세포(대조군)와 비교하여, 농도 의존적으로(0.1, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0mg/ml) 희첨 추출물을 처리시 MCF-7(A)과 MDA-MB-231(B)에서 Hoechst 33342가 밝게 염색된 아폽토시스소체(apoptotic body)를 관찰할 수 있었다.

4. 본 발명에 따른 희렴 추출물의 세포 내 DNA 분절 효과

본 실시 예에서는 본 발명의 희렴 추출물이 세포사멸에 의해 일어나는 DNA 분절 현상이 발생하는지를 여부를 관찰하고자 하였다.

먼저, 일정한 농도로 (1×10⁵ 세포/웰) 배양된 HepG2, MCF-7와 MDA-MB-231 세포에 희렴을 처리한 후 48 시간동안 배양하며 배지를 제거하고, PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 샘플 당 분해 완충용액(Lysis buffer; 10 mM Tris-Cl(pH8.0), 10 mM EDTA, 0.1% Triton X-100) 400㎕를 더한 뒤, 얼음 위에서 30분 동안 배양하고, 스크래이퍼(scraper)와 파이페팅(pipetting)으로부터 세포가 용해되도록 하였다.

그런 다음, 4℃에서 12,000rpm으로 30분간 원심 분리하여 취한 상층액에 동량의 페놀 용액(phenol solution; phenol/chloroform/isoamyl alcohol=25:24:1)을 넣고 교반(vortex)한 뒤 12,000rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다. 그리고, 이의 과정을 세 번 반복 수행하였다.

그리고, 상기 반복하여 수득한 상층액에 상기 상층액 1/10 부피의 3M 아세트산 나트륨 용액(sodium acetate; pH 5.2)을 넣고, 전체 부피의 2.5배 되는 100% ㅇ에탄올을 더하고 -70℃에서 30분 동안 배양하고, 상기 배양액을 12,000rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리한 후, 상층 액을 버리고 펠렛(pellet)를 3분 동안 에어 드라이(air-dry)하였다.

그리고, 상기 건조된 펠렛을 10㎕ TE buffer(+RNase)로 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하고, 1% 아가로스 젤(agarose gel)에 10㎕를 로딩(loading)하여 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide; EtBr)로 염색하여 관찰하였다.

이의 결과는 도 12에 도시하였는 데, 간암 세포 주에 대한 세포 죽음 효과가 세포사멸(apoptosis)에 의한 것인지를 확인하기 위해 세포사멸(apoptosis)의 특징인 뉴클레오좀간 DNA 분절(internucleosomal DNA fragmentation)을 확인한 결과, 희렴에 의한 농도 의존적 사다리(ladder)형의 DNA 분절을 관찰할 수 있었고(도 12-A 참조), 희렴 추출물에 의한 유방암세포(Human breast carcinoma cell)의 세포 죽음이 세포사멸에 의한 것인지를 확인한 결과, 0.3mg/ml의 희렴을 MCF-7과 MDA-MB-231세포에 시간별로(10, 60, 360, 1440 mins)처리시, MCF-7에서는 처리 10분에서부터 DNA의 분절화가 일어난 반면(도 12- B 참조), ER 음성인 MDA-MB-231세포에서는 처리한 후 12시간 이후부터 DNA 분절이 유도됨을 알 수가 있었다(도 12-C 참조).

이상과 같이, 본 발명의 희렴 추출물은 항암, 항산화 및 혈압강하를 유도할 수 있으므로, 항암제, 항산화제 및 혈압강하제와 관련된 치료제 또는 예방제로 유효하게 사용할 수 있다.

Claims

희렴 열수 추출물을 유효성분으로 하는 항암, 항산화 및 혈압강하의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 희렴 열수 추출물은 주증한 희렴을 열수추출하고, 상기 열수추출물을 건조하여 수득한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 2 항에 있어서,

상기 주증한 희렴은 생희첨 10 중량부에 막걸리 100중량부를 적시고, 30분간 찐 다음, 이를 햇볕에 말리는 과정을 9회 반복한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물과 약제학적으로 허용된 담체가 포함되어 이루어지는 항산화제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물과 약제학적으로 허용된 담체가 포함되어 이루어지는 항암제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물과 약제학적으로 허용된 담체가 포함되어 이루어지는 혈압강하제.