KR20080064174A - 생약 추출물의 항산화 및 Ｆｅ2+ 킬레이팅 특성 - Google Patents
생약 추출물의 항산화 및 Ｆｅ2+ 킬레이팅 특성 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 북아메리카 인삼(특허권으로 보호되는 추출물 HT1001)을 단독으로, 또는 은행(Ginkgo biloba, GB), 세인트존스워트(Saint John's Wort, SJW), 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신, 및/또는 히퍼포린과의 복합제로 함유하는 항산화제 및 항증식제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항산화제 및 항증식제는 현저한 Fe2 +-촉매된 지질 과산화 억제 및 Fe2 + 킬레이션 활성, 하이드록실 자유 라디칼 제거 능력, 신경아세포종 세포수의 감소능력, 및/또는 신경돌기 성장 촉진 능력을 보인다. 이러한 효과들은 Fe2 + 킬레이터의 행동과 일치되며, 화학 성분들에 의해 발휘되는 효과의 형태 및 정도 모두에서의 변화는 상승적인 작용기전을 암시한다.
ＧＢ, 항산화, Ｆｅ2+ 킬레이팅, 생약 추출물
Description
본 발명은 북아메리카 인삼(특허권으로 보호되는 추출물 HT1001)을 단독으로, 또는 은행(Ginkgo biloba, GB), 세인트존스워트(Saint John's Wort, SJW), 징코라이드(ginkgolide), 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신(hypericin), 및/또는 히퍼포린(hypeforin)과의 복합제로 함유하는 약제학적 조성물과 그의 용도에 관한 것이다.
수세기 동안, 중국 생약요법에서는 매우 다양한 신경학적 질병 및 질환 치료에 인삼, 은행 (Ginkgo biloba, GB), 및 세인트존스워트(Saint John's Wort, Hypericum perforum, SJW)을 사용해왔다. 최근의 메타분석은, 비록 더 큰 임상시험들의 필요가 역설되긴 하지만, 현저한 부작용 없는 치매 치료를 위한 인지, 기분, 감정적 기능 및 삶의 질에 대한 은행 추출물의 유익한 효과를 기술했다. [Birks J, Grimley EV, van DM. Ginkgo biloba for cognitive impairment and dementia. Cochrane Database Syst Rev 2002; (4):CD003120]. 유사하게, 북아메리카 인삼 (Panax quinquefolius) 추출물은 또한 기억력을 향상시키고 [Sloley BD, Pang PK, Huang BH, Ba F, Li FL, Benishin CG, Greenshaw AJ, Shan JJ. American ginseng extract reduces scopolamine-induced amnesia in a spatial learning task. J Psychiatry Neurosci 1999 November; 24(5): 442-52] 그 성분인 진세노사이드 Rb1과 Rg1은 신경보호효과를 나타낸다고 보고되어 왔다 [Rudakewich M, Ba F, Benishin CG. Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb(1) and Rg(1). Planta Med 2001 August; 67(6):533-7]. 인삼의 유익한 특성은 그 사포닌 함량, 진세노사이드라고 집합적으로 불리는 다마렌 트리테르펜 글루코사이드 혼합물에 기인한다. 일부 진세노사이드는 단리되었고, 그 구조가 결정되었다. 이러한 진세노사이드에는 Rbl, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, 및 Rg가 있다 (참조 미국 특허등록 제4,157,894호 Bombardelli). 경등도 내지 중등도의 우울증 치료를 위해 독일에서 승인된 SJW는 최근 메타 분석에서, 합성 항우울제에 비해 보다 유리한 부작용 프로필(side effect profile)과 함께 현저하게 월등한 결과를 제공하는 것으로 나타났다 [Roder C, Schaefer M, Leucht S., Meta-analysis of effectiveness and tolerability of treatment of mild to moderate depression with St. John's Wort, Fortschr Neurol Psychiatr 2004 July;72(6):330-43].
산화적 스트레스는 다양한 신경학적 병리와 연루되어 있으므로, GB, 북아메리카 인삼, 및 SJW 추출물의 몇몇 효과들은 그들의 고유한 항산화 활성에서 기인한 것일 수 있다. GB와 SJW에 함유된 주된 생활성 성분으로 알려진 플라보노이드는 지질 과산화 방지, 자유라디칼 제거, 및 Fe2 + 킬레이션을 포함하는 항산화 활성을 갖는 것으로 보고되어 왔다 [Rice-Evans CA, Miller NJ, Paganga G. Structure- antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic Biol Med 1996;20(7):933-56; Sloley BD, Urichuk LJ, Morley P, Durkin J, Shan JJ, Pang PK, Coutts RT. Identification of kaempferol as a monoamine oxidase inhibitor and potential Neuroprotectant in extracts of Ginkgo biloba leaves. J Pharm Pharmacol 2000 May;52(4):451-9; Sloley BD, Urichuk LJ, Ling L, Gu LD, Coutts RT, Pang PK, Shan JJ. Chemical and pharmacological evaluation of Hypericum perforatum extracts. Acta Pharmacol Sin 2000;21(12): 1145-52]
항산화 효과는 또한 진세노사이드 Rb1과 Rg3 [Kim YC, Kim SR, Markelonis GJ, Oh TH. Ginsenosides Rbl and Rg3 protect cultured rat cortical cells from glutamate-induced neurodegeneration. J Neurosci Res 1998 September 15;53(4):426-32; Lim JH, Wen TC, Matsuda S, Tanaka J, Maeda N, Peng H, Aburaya J, Ishihara K, Sakanaka M. Protection of ischemic hippocampal neurons by ginsenoside Rbl, a main ingredient of ginseng root. Neurosci Res 1997 July;28(3):191-200] 및 SJW 추출물에 대해서도 개시되어 왔다 [Jang MH, Lee TH, Shin MC, Bahn GH, Kim JW, Shin DH, Kim EH, Kim CJ. Protective effect of Hypericum perforatum Linn (St. John's wort) against hydrogen peroxide-induced apoptosis on human neuroblastoma cells. Neurosci Lett 2002 September 30;329(2): 177-80] Fe2 + 킬레이션을 통해 항산화 세포보호효과를 나타내는 추출물 들은 사용된 모델의 조건 및 성질에 따라 항증식성(antiproliferative)/전-세포자멸(pro-apoptotic)효과를 나타낸다고 가정될 수도 있다. Fe2 + 은 세포 증식에 중요한 요소이기 때문에, 종양세포들에서는 Fe2 +의 요구가 증대된다. 신경아세포종을 포함하는 다양한 질환에 대해 Fe2 + 킬레이터 항암 활성이 또한 임상적으로 증명되어 왔다 [Donfrancesco A, Deb G, De SL, Cozza R, Castellano A. Role of deferoxamine in tumor therapy. Acta Haematol 1996;95(1):66-9]. 이들의 밝혀진 항-증식성(anti-proliferative) 효과에 더하여 [Renton FJ, Jeitner TM. Cell cycle-dependent inhibition of the proliferation of human neural tumor cell lines by iron chelators. Biochem Pharmacol 1996 July 14;5l(11): 1553-61], Fe2 + 킬레이터들은 또한 세포자멸을 유도하고 [Fan L, Iyer J, Zhu S, Frick KK, Wada RK, Eskenazi AE, Berg PE, Ikegaki N, Kennett RH, Frantz CN. Inhibition of N-myc expression and induction of apoptosis by iron chelation in human neuroblastoma cells. Cancer Res 2001 March 1 ;6l(3): 1073-9] 태생 암종 F9를 포함하는 몇 가지 튜머 라인들에서 세포 분화를 촉진시킬 수도 있다. [Tanaka T, Muto N, Ido Y, Itoh N, Tanaka K. Induction of embryonal carcinoma cell differentiation by deferoxamine, a potent therapeutic iron chelator. Biochim Biophys Acta 1997 July 5; 1357(1):91-7]
주의력 결핍 과잉 행동장애 (ADHD) 치료에 사용된, 특허권으로 보호되는 북 아메리카 인삼 추출물 HT1001 및 GB를 함유하는 고유한 추출물 복합제 (CVT-E033, AD-FX® CV Technologies, Edmonton, Alberta)에 대한 최근의 파일럿 연구는 이것이 인지 문제(cognitive problem)를 포함하는 ADHD 증상들을 개선시킬 수도 있다고 제안했다. [Lyon MR, Cline JC, Totosy de ZJ, Shan JJ, Pang P, Benishin C. Effect of the herbal extract combination Panax quinquefolium and Ginkgo biloba on attention-deficit hyperactivity disorder: a pilot study. J Psychiatry Neurosci 2001 June;26(3):221-8]. 이 연구는 북아메리카 인삼, GB, 및 SJW의 신경보호성/향신경성(neurotropic), 및 항산화 효능의 보고에 더하여, 이 물질들 및 그들의 복합제인 CVT-E033 및 CVT-E036 (Menta-fX®; GB, 북아메리카 인삼, 및 SJW)의 작용기전에 대한 연구를 야기했다.
미국 특허등록 제5,137,878호와 제6,083,932호 (Pang 등)는 선행기술 추출물들에 대한 검토를 포함하고 있다. 미국 특허등록 제5,137,878호와 제6,083,932호의 모든 개시는 본 출원에 참조로 포함된다. 미국 특허등록 제5,137,878호는 진세노사이드 Rb1 및 Rg1이 뇌의 대뇌피질과 해마 영역에서 Ach의 유효성을 증가시키고 알츠하이머형 노인성 치매의 증상들을 완화시킴을 개시한다. 미국 특허등록 제6,083,932호는 인삼으로부터 유래된 약제학적 조성물과 우울증이나 일반적인 인지능력 향상 뿐만 아니라 다양한 뇌 질병 이나 병의 치료방법을 개시한다.
발명의 간단한 요약
본 발명자들은 북아메리카 인삼의 특정 추출물, GB와 SJW의 추출물, 그리고 그들의 생활성 성분인 진세노사이드 Rbl, Rgl, Rc, Rd, Re, 징코라이드 A와 B, 플라보노이드 퀘르세틴과 루틴, 히퍼리신, 히퍼포린이 항산화 및 항증식 특성을 갖는다는 것을 비로소 발견하였다. 발명자들이 HT1001이라 부르는 약 15-50%, 바람직하게는 약 25-40%의 총 진세노사이드(a.k.a. 사포닌)를 함유하는 특정한 인삼추출물은 항산화제 또는 항증식제로서 단독으로 또는 GB 및/또는 SJW와 복합제로 투여될 수 있다.
본 발명자들은 특허권 있는 북 아메리카 인삼 추출물(HT1001) 단독 또는 GB 및/또는 SJW와의 복합제가 항산화 및 항암효과를 갖는 것을 발견하였다. 화학 성분 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신, 및 히퍼포린 또한 시험하여 항산화 활성을 갖는 것을 발견하였다. 항산화 활성은, 시험한 모든 생약추출물과 그 복합제에 대하여 Fe2 + -촉매된 지질 과산화의 현저한 억제, 쎌-프리 케미컬 어세이 시스템(cell-free chemical assay system)에서 Fe2 +을 킬레이트 하는 능력을 통하여 확인되었고, GB 및 CVT-E033(북아메리카 인삼과 GB)의 경우에는 자유라디칼 제거를 통해 확인되었다. 이에 더하여, Fe2 +-킬레이터 작용(behavior)과 일치하게 몇몇의 신경아세포종 모델에서는 모든 생약 추출물의 항증식성 및/또는 전-분화성(pro-diffentiative) 효과가 증명되었다.
항산화 활성은 시험된 모든 생약 추출물과 그들의 몇몇 화학성분에서 나타났다. CVT-E033 (북아메리카 인삼과 GB)과 CVT-E036 (북아메리카 인삼, GB, 및 SWJ)은 인간 신경아세포종 셀 라인인 SH-SY5Y에서 Fe2 + -촉매된 지질 과산화를 감소시키는 것이 확인되었다. 이것은, 모두 독립적으로 Fe2 + -촉매된 지질 과산화를 억제하는 HT1001, GB와 SJW의 기여에 기인한 것일 수 있다. GB 추출물 (Ramassamy C, Girbe F, Christen Y, Costentin J. Ginkgo biloba extract EGb 761 or trolox C prevent the ascorbic acid/Fe2+ induced decrease in synaptosomal membrane fluidity. Free Radic Res Commun 1993; 19(5):341-50.), 북아메리카 인삼 (Kitts DD, Wijewickreme AN, Hu C. Antioxidant properties of a North American ginseng extract. Mol Cell Biochem 2000 February;203(1-2): 1-1O), SJW (Zou Y, Lu Y, Wei D. Antioxidant activity of a flavonoid-rich extract of Hypericum perforatum L. in vitro. J Agric Food Chem 2004 September 11;52(16):5032-9) 및 플라보노이드 성분(Chen YT, Zheng RL, Jia ZJ, Ju Y. Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants. Free Radic Biol Med 1990;9(1): 19-21)은 앞서 지질 또는 리포좀 과산화 억제를 보여왔었다. Fe2 + -촉매된 지질 과산화는 자유라디칼 제거나 Fe2 + 킬레이션을 통하여 직접적으로 길항될 수도 있다. CVT-E033은 적당한 자유 라디칼 제거 활성을 나타내었는 데, 이는 검출가능한 활성을 갖지 않는 인삼 추출물 HT1001 때문이라기 보다는, 현저한 자유 라디칼 제거를 증명한 GB 성분 추출물 때문일 것 같다. 이것은 GB 추출물에 의한 자유라디칼 제거의 다른 보고와 일치한다 (Ramassamy C, Naudin B, Christen Y, Clostre F, Costentin J. Prevention by Ginkgo biloba extract (EGb 761) and trolox C of the decrease in synaptosomal dopamine or serotonin uptake following incubation. Biochem Pharmacol 1992;44(12):2395-401). 또한, 모든 추출물은 화학 모델에서 비슷한 정도의 Fe2 + 킬레이션을 나타냈다. 이런 추출물들의 순수한 화학 성분 일부에 대한 시험에서 퀘르세틴(Setili P, Guidarelli A, Dacha M, Cantoni O. Quercetin prevents DNA single strand breakage and cytotoxicity caused by tertbutylhydroperoxide: free radical scavenging versus iron chelating mechanism. Free Radic Biol Med 1998 August 15;25(2): 196-200에서 이미 보고된 바와 같음), 히퍼리신, 및 20-(s)-프로토파낙사디올(protopanaxadiol) 진세노사이드 Rbl, Rc, 및 Rd는 고유한 구조-활성 관계를 지시하는 Fe2 + 킬레이션 활성을 나타내었으나, 20-(s)-프로토파낙사트리올(protopanaxatriol) 진세노사이드 Rgl 및 Re는 뚜렷하게 그러하지 않았다. 다음의 실시예에서 제시하는 데이터는 CVT-E033, GB, HT1001, SJW, 및 CVT-E036이 Fe2 + 킬레이터로서 작용할 수 있는 명백한 화학성분을 갖는 것을 시사한다. 그러나 각 성분을 추출물 내에서의 그들의 함량을 반영한 농도에서 실험되면, 매우 낮은 활성을 보여 추출물의 각 성분이 Fe2 +과의 결합에 상승적으로 기여했거나 상가적인 효과를 제공하는 것으로 보였다.
항증식성 및/또는 전-분화효과는 다양한 신경아세포종 셀 라인에서 모든 추출물에 대해 관찰되었다. 이는 모든 생약제제가 Fe2 + 킬레이터, 신경아세포종에서 항암 및 항증식성 특성을 갖는 것으로 보여왔던 물질로 작용하는 것에 비추어 보면 놀라운 것이 아니다(Donfrancesco A, Deb G, De SL, Cozza R, Castellano A. Role of deferoxamine in tumor therapy. Acta Haematol 1996;95(1):66-9). 본 연구에서 사용된 신경아세포종 배양 모델에서, Fe2 +-킬레이션-관련 신경보호 (즉, 프로-생존 (pro-survival)) 활성(혈청 결핍 모델에서 시험 됨) 및 항-증식성/전-분화활성 사이의 균형이 후자쪽으로 이동하는 것을 보인다. 시험된 모든 화학성분 중에서, 퀘르세틴과 히퍼포린 만이 신경아세포종 세포 수의 억제를 나타내었다. 히퍼포린 (Dona M, Dell'Aica I, Pezzato E, Sartor L, Calabrese F, Della BM, Donella-Deana A, Appendino G, Borsarini A, Caniato R, Garbisa S. Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis. Cancer Res 2004 October 1;64(17):6225-32), GB, 및 일부 플라보노이드는 다른 종양모델에서 항-증식성/전-세포자멸 효과를 발휘하는 것으로 확인되었다. (Huang YT, Hwang JJ, Lee PP, Ke FC, Huang JH, Huang CJ, Kandaswami C, Middleton E Jr, Lee MT. Effects of luteolin and quercetin, inhibitors of tyrosine kinase, on cell growth and metastasis-associated properties in A431 cells overexpressing epidermal growth factor receptor. Br J Pharmacol 1999 December; 128(5):999-1010). 명백하게 본 연구기간 동안 시험된 진세노사이드들(Rbl, Rgl, Rc, Rd, 및 Re)은 아니더라도, 일부 특정 진세노사이드들은 인간 백혈병(THP-1) 세포를 포함하는 다양한 종양모델에서 항-증식성 및 전-세포자멸 효과 또한 보여 (Popovich DG, Kitts DD. Structure-function relationship exists for ginsenosides in reducing cell proliferation and inducing apoptosis in the human leukemia (THP-1) cell line. Arch Biochem Biophys 2002 November 1;406(1):1-8) 여기 제시된 결과들과 일치하였다. 이는 또한 북아메리카 인삼 추출물 HT1001 단독으로는 신경아세포종 세포 수 억제에 연관되어 있지 않다는 발견과 일치한다. HT1001과 GB사이에 상승효과가 관찰되었다. CVT-E033과 CVT-E036 모두는 개별 성분과 비교했을 때 저혈청 조건(스트레스) 하에서 세포 수를 감소시킨다. CVT-E033은 비-스트레스 조건 하에서도 이것이 가능했다. 본 발명자들은 추출물의 조합에서 그들의 부분(proportion)을 반영한 농도에서 성분들이 분석될 때 세포 수에서 현저한 효과가 없음이 관찰되어(도 4c), 성분들이 상승적으로 작용하는 것을 확인하였다.
항증식성/전-세포자멸 역할에 더하여, Fe2 + 킬레이터는 세포 분화 역시 야기하는 것으로 증명되었다(Tanaka T, Muto N, Itoh N, Dota A, Nishina Y, Inada A, Tanaka K. Induction of differentiation of embryonal carcinoma F9 cells by iron chelators. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1995 December; 90(2):211-20). 본 연구에서, 신경아세포종 분화의 표시를 제공하기 위해 신경돌기세포의 성장 정도가 정량화 되었다. CVT-E033, GB, 및 HT1001 모두는 N1E 115 세포에서 유사한 정도로의 현저한 신경돌기성장을 야기하는 것으로 확인되었다. GB 추출물은 배양된 신경모세포의 높은 비율에서 세포 사멸을 야기하는 것이 관찰되었지만, 살아남은 세포들은 대단히 고도의 신경돌기 성장을 나타냈다. HTl001이 신경아세포종 세포 수를 억제하지 않고 심지어 SH-SY5Y 세포에서는 미약하게 세포 수를 증가시켰기 때문에, 북아메리카 인삼 추출물은 아마도 알려지지 않은 메커니즘을 통한 세포 생존 강화와 분화 유도 두 가지에 의해 작용했을 것이다. 진세노사이드 Rb1과 Rg1 뿐 만 아니라 몇몇 인삼 조(粗) 추출물은 이미 직접적으로 신경돌기 성장을 증진시키거나, N1E 115세포에서 신경돌기 성장에 대한 신경성장인자(NGF) 자극 효과를 강화하는 것을 보여주었다 (Rudakewich M, Ba F, Benishin CG. Neurotrophic and neuroprotective actions of ginsenosides Rb(1) and Rg(1). Planta Med 2001 August; 67(6): 533-7). 나아가 진세노사이드 Rbl 및 Rb3 그리고 노토진세노사이드 R4, 6, 및 Fa7 또한 SK-N-SH 세포에서 신경돌기 성장-촉진 능력을 나타내었다(Zou K, Zhu S, Meselhy MR, Tohda C, Cai S, Komatsu K. Dammarane-type Saponins from Panax japonicus and their neurite outgrowth activity in SK-N-SH cells. J Nat Prod 2002 October;65(9): 1288-92).
북아메리카 인삼, GB, 및 SJW 추출물의 in vitro와 in vivo 모두에서의 향신경성 효과와 신경보호 효과에 대해 많은 보고가 있다. 이런 효과 다수가 신경전달물질 시스템에서 특정 효과들에 의해 기인할지라도, 항산화 활성 또한 실질적인 기여자가 될 것이다. 본 발명은 북아메리카 인삼, GB, SJW의 5개의 규격화된 생약 및 추출물 복합제에 대한 신경아세포종에서의 항산화제, 철 킬레이팅, 항증식성/전-분화효과의 첫 번째 기재를 제공한다. 본 발명은 또한 진세노사이드(20-(s)-프로토파낙사디올 진세노사이드)의 Fe2 + 킬레이션 활성에 대한 첫 증거과 고유한 구조-활성관계, 및 SJW 추출 성분, 히퍼리신에 대한 설명을 제공한다. 시험된 추출물 및 순수한 화학적 생활성 성분 일부의 Fe2 + 킬레이션 활성은 신경아세포종 악성 셀 라인에서 관찰된 항증식성 및 전-분화효과에 부분적으로라도 기여할 것이다.
HT1001에 대한 바람직한 추출 공정은 미국특허공보 제6,083,932호에 기재되어 있다. 이 방법에서는 건조 분쇄된 인삼가루 300kg이 출발물질로 사용된다. 원한다면, 인삼을 핏츠 밀(Fitz mill)에 넣고 약 80 메쉬로 분쇄할 수 있다. 다음으로 인삼은 에탄올을 이용한 추출과정을 거친다. 당 업계에서의 평균적인 기술자의 수준 내에서 변형이 적절히 이루어질 수 있지만, 바람직하게는 85%의 에탄올이 사용된다. 고체: 용매의 비율은 약 1:5 에서 1:10까지가 적당하며, 1:8이 바람직하다. 추출은 필요에 따라 약 1-5시간 동안 진행될 수 있다. 바람직한 추출시간은 3시간이다. 추출온도는 80~105℃의 범위 내 일 수 있지만, 90-95℃가 바람직하다. 교반이 권장된다. 아웃풋 라인(output line)에서 25 마이크론 인-라인 카트리지 필터를 사용하여 약 4200pm속도에서 디캔터 원심분리기로 액체와 고체상이 바람직하게 분리된다.
여러번 추출이 이루어지면, 상청액이 모아질 수 있다. 어쨌든, 상청액은 에탄올을 회수하기 위한 농축 단계를 거치게 된다. 진공증류과정이 바람직하다. 목적하는 고체함량은 약 10-12°(Brix)이다. 온도는 바람직하게는 15"Hg, 220-225kg/h의 공급 속도(feed rate)에서 약 50℃이다. 걸쭉해지는 것을 막기 위해 물이 첨가될 수도 있다.
농축된 추출물은 냉동, 오븐 또는 드럼 건조될 수 있지만, 바람직하게는 공급온도 약 42-58℃ 및 공급속도 약 20kg/h에서 분무건조 된다. 입구 온도(inlet temperature)는 바람직하게는 약 150-175℃이고, 출구 온도(outlet temperature)는 바람직하게는 약 70-90℃이다. 건조되면, 추출물은 분쇄될 수도 있고, 원한다면, 존재할 수 있는 덩어리를 제거한다. 0.065" 체(screen)가 구비된 핏츠 밀을 사용하는 것이 바람직하다. 그 후 추출물은 바람직하게는 혼합되어 20%의 수율로 제조된다.
은행(Ginkgo biloba) 추출물은 Acta Pharmacal (Sunnyvale, CA)과 같은 통상적인 공급원으로 얻을 수 있다. 은행잎의 표준화된 추출물은 Sloley BD, Urichuk LJ, Morley P, Durkin J, Shan JJ, Pang PK, Coutts RT. Identification of Kaempferol as a monoamine oxidase inhibitor and potential Neuroprotectant in extracts of Ginkgo biloba leaves (J Pharm Phamacol 2000 May;52(4):451-9) 에서 논의된 것처럼 약 24% 징코 플라본 글리코사이드 및 약 6% 테르펜 락톤을 함유한다.
세인트존스워트(Saint John's Wort) 추출물은 상업적인 공급원으로부터 얻을 수 있고, 일반적으로는 Sloley BD, Urichuk LJ, Ling L, Gu LD, Coutts RT, Pang PK, Shan JJ., Chemical and pharmacological evaluation of Hypericum perforatum extracts (Acta Pharmacol Sin 2000;2l(12): 1145-52.)에서 논의된 것처럼 0.3% 히퍼리신 함량으로 표준화된다.
약 15-50%, 바람직하게는 약 25-40%의 총 진세노사이드(a.k.a. 사포닌)를 함유하는 특정 인삼 추출물 HT1001은, 항산화제 또는 항증식제로서 단독으로 또는 GB, SJW, 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신 및/또는 히퍼포린과의 복합제로 투여될 수 있다.
본 발명에 의한 항산화제 또는 항증식제는 경구, 에어로졸, 또는 폐로의 투여를 위한 기타 기구, 비강 스프레이, 정맥내, 근육내, 복강내, 질내, 직장내 및 외용 또는 경피를 포함한 어떤 가능한 경로를 통해서든 투여 될 수 있다. 항산화제 또는 항증식제의 투여를 위한 비히클로서 사용될 수 있는 첨가제는 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 항산화제 또는 항증식제는 건조된 형태일 수 있고, 정맥주사로 투여되기 직전에 용해될 수 있다. HT1001 단독으로 또는 GB, SJW, 및/또는 그것들의 활성성분과의 복합제로서의 투여는 바람직하게는 경구 또는 정맥내 투여이다. 경구투여가 의도된다면, HT1001은 100mg 캡슐로 만드는 것이 바람직하다. HT1001과 GB의 복합제인 CVT-E033은 125mg 캡슐로 만드는 것이 바람직하다. HTl001과 GB의 복합제인 CVT-E036은 325mg 캡슐로 만드는 것이 바람직하다. (SJW:HT1001:GB, 200mg:100mg:25mg).
적당한 운반체, 희석제 또는 첨가제는 약제학적 조성물 제조를 위해 당해 기술 분야에서 알려져 있다. 그런 적당한 희석제 또는 첨가제는, 한정 되지 않지만, 물, 염용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 옥수수나 감자전분 같은 전분, 규산, 점성 파라핀, 지방산 모노글리세라이드 및 디글리세라이드, 펜타에리트리톨 지방산 에스터, 하이드록시메틸셀룰로오즈, 폴리비닐 피롤리돈 등이 있다. 약제학적 조성물은 살균될 수 있고, 원한다면 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염류, 완충제, 착색제, 향료 및/또는 방향성 물질과 같은 보조제와 혼합될 수 있다. 단독으로 투여된다면, HT1001는 1일 75kg 개인당 활성제 10-1000mg의 용량 범위로 투여되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 1일 75-500mg 용량으로, 가장 바람직하게는 1일 100-200mg 용량으로 투여된다.
본 발명에서 사용된 "유효량" 이라는 표현은 HT1001의 단독 또는 GB, SJW, 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신 및/또는 히퍼포린과의 복합제로의 투여를 포함한다. HT1001의 일반적인 유효량은 다른 항산화제나 항증식제와 병용투여 된다면 감소 될 수 있다. 그러므로, "유효량" 이라는 표현은 HT1001이 다른 유효 성분과의 복합제로서 사용되는 것을 포함하도록 의도되며, 이에 의해 성분들의 복합제가 유효하고 각 성분의 용량은 비례하여 감소 될 수 있다. 예를 들면, HT1001은 일반적으로 1일 1인당 100mg으로 효과적으로 투여되고, 은행은 일반적으로 1일 1인당 100mg으로 효과적으로 투여되고, 두 성분의 복합제는 각각 1일 1인당 50mg 투여하는 것으로 사용 될 수 있다. 그러한 복합제 사용은 많은 약들의 경우에서처럼 다른 활성 성분(HT1001을 제외한)이 고가인 경우, 소비자에게 비용 효율이 높을 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 산화적 스트레스, 철분 과다 치료, 및/또는 신경세포 성장 촉진에 사용될 수 있다. 산화적 스트레스 및 철분 과다는, 이들에 제한되지는 않으나, 암, 알츠하이머병, 결핵, 파킨슨병, 겸상 적혈구, 윌슨병, 간손상, 베타-지중해성 빈혈, 심장병, 다발성 경화증, 염증성 대장질환 (크론병과 궤양성 대장염), 감염, 종양형성, 심근병증 및/또는 관절병증을 포함하는 많은 질병과 질환에 기인한다. 특정 조직에서의 철분 축적은 질병의 위험 증가와 연관되어 있다 (Eugene D. Weinberg, Iron Loading and Disease Surveillance, Emerging Infectious Diseases, Vol. 5, No. 3, May-June 1999 346-352) 철분은 산화촉진제(pro-oxidant)로서 작용하여 자유 라디칼로 알려진 물질의 인체에의 손상효과를 촉진한다. 하기 표1은 다양한 조직에서 철분 과다와 관련되어 있는 질병들을 보여준다.
| 조직타입 | 질병 |
| 폐포대식세포 | 폐종양형성과 감염 |
| 뇌하수체 전엽 | 생식선 및 성장 기능부전 |
| 대동맥: 경동맥과 관상동맥 | 죽상경화증 |
| 결장직장 점막 | 선종, 암종 |
| 심장 | 부정맥, 심근병증 |
| 유아 소장 | 보튬리즘, 살모넬라증, 급사 |
| 관절 | 관절병증 |
| 간 | 바이러스성 간염, 경화증, 암종 |
| 대식세포 | 세포내 감염 |
| 췌장 | 선포 및 베타세포 괴사, 암종 |
| 혈장 및 림프 | 세포외 감염 |
| 골격계 | 골다공증 |
| 피부 | 나병, 흑색종 |
| 연조직 | 육종 |
| 흑색질 | 파킨슨병 |
도 1. SH-SY5Y 신경아세포종 세포에서의 Fe2 +-촉매된 지질 과산화에 대한 생약 제제의 효과
세포들은 1 x l06 세포/웰로 접종되어, 0.1 mM FeSO4가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서의 생약 추출물에 노출시키기 전에, 24시간 동안 키웠다. 그 후 세포막이 수확되어 지질 과산화물이 측정되었다. 지질 과산화물의 존재는 색을 띄는 MDA 생성물의 형성으로 감지되고, 결과는 대조군과 비교하여 표현했다. 생약 제제들은 가공되지 않은(raw) 흡광도 값을 사용하여 *P <0.05로 대조군과 유의적인 차이가 있다.
도 2. 생약추출물에 의한 Fe2 +와 페로진의 상호작용 억제.
다양한 생약 추출물(도 2b) 및 강력한 Fe2 + 킬레이터인 DFO (도 2a)를 0.5mM FeSO4 용액으로 지시농도에서 셀-프리 케미컬 어세이 시스템(cell-free chemical assay system)에서 배양되고 크로모젠, 페로진(최종 농도 1 mM)과 함께 배양되었다. 결과는 실험 시료의 562nm에서의 흡광도로 적절한 대조군과 비교되어 표현되었다.
도 3. 몇 가지 생약 추출물의 순수한 화학성분에 의한 Fe2 +와 페로진과의 상호작용 억제
순수한 화학물질 퀘르세틴, 루틴, 징코라이드 A와 징코라이드 B(도 3a), 진세노사이드 Rb1, Rgl, Rc, Rd, Re (도 3b), 및 히퍼리신과 히퍼포린 (도 3c)을 0.5mM FeSO4 용액과 함께 지시농도에서 셀-프리 케미컬 어세이 시스템에서 배양되고 크로모젠, 페로진(최종 농도 1 mM)과 함께 배양되었다. 결과는 실험 시료의 562nm에서의 흡광도로 적절한 대조군과 비교되어 표현되었다.
도 4. 저혈청조건과 정상혈청조건에서 신경아세포종 세포 증식에 대한 생약 추출물의 효과.
다양한 생약 추출물 또는 비히클 단독(대조군)을 50㎍/ml에서 96시간 동안 저농도(2%) 또는 정상농도(10%) FBS 에서 SK-N-SH (도 4a), SH-SY5Y (도 4b) 및 N1E 115 (도 4c) 세포와 함께 배양시켰다. 세포 수에 대한 Fe2 + 킬레이터 DFO의 효과는 N1E 115 (solid symbols)과 SH-SY5Y (unshaded symbols) 세포에서도 연구되었다(도 4d). 생존 가능한 세포 수는 WST-1 시약을 사용하여 측정하였다. 세포 수의 현저한 억제가 *P<0.05 또는 **P<0.001 에서 이뤄졌고, 세포 수의 현저한 자극은 # P<0.05에서 같은 혈청조건의 대조군과 대비해서 이뤄졌다.
도 5. 신경아세포종 세포 증식에서의 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드 및 히퍼포린의 효과.
징코라이드 A(GA)와 B(GB) 그리고 플라보노이드 루틴과 퀘르세틴(Q) (도 5a,b), 또는 히퍼포린 또는 진세노사이드 Rbl, Rgl, Rc, Rd, Re (도 5c, d), 또는 비히클 단독(대조군)을, 배양된 N1E 115 (도 5a, c), SH-SY5Y (도 5b, d) 세포로 지시농도에서 96시간 동안 배양시켰다. 생존 가능한 세포 수는 WST-1 시약을 사용하여 측정하였다. 대조군과 비교하여 *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.0001에서 유의하게 나타났다.
도 6. N1E 115 신경돌기 성장에서 생약 추출물의 용량-의존적 효과.
CVT-E033, HT1001 및 GB는 배양된 N1E 115 신경아세포종 세포와 지시농도에서 배양시키고 신경돌기 성장 스코어를 측정하였다. 대조군과 비교하여 *P<0.05 또는 **P<0.01에서 유의하게 나타났다.
물질
페로진(ferrozine), 데스페록사민(DFO), 퀘르세틴, 루틴, 징코라이드A, 및 징코라이드 B는 시그마에서 구입하였다. 화학성분 진세노사이드 (Rbl, Rgl, Rc, Rd, 및 Re) 뿐만 아니라 모든 추출물(HT1001, GB, SJW, CVT-E033, 및 CVT-E036)은 CV Technologies (Edmonton, Alberta, Canada)에 의해 제조 정제되었다. 북아메리카 인삼의 추출물인 HT1001(REMEMBER-fX®) (Sloley BD, Pang PK, Huang BH, Ba F, Li FL, Benishin CG, Greenshaw AJ, Shan JJ. American ginseng extract reduces scopolamine-induced amnesia in a spatial learning task. J Psychiatry Neurosci 1999 November;24(5):442-52), GB 추출물 (Sloley BD, Urichuk LJ, Morley P, Durkin J, Shan JJ, Pang PK, Coutts RT. Identification of Kaempferol as a monoamine oxidase inhibitor and potential Neuroprotectant in extracts of Ginkgo biloba leaves. J Pharm Pharmacol 2000 May;52(4):451-9.), 및 SJW ( Sloley BD, Urichuk LJ, Ling L, Gu LD, Coutts RT, Pang PK, Shan JJ., Chemical and pharmacological evaluation of Hypericum perforatum extracts. Acta Pharmacol Sin 2000;21(12): 1145-52.)의 화학적 특성은 앞서 기술하였다. CVT-E033 (AD-fX® 4: 1 HT1001:GB 추출물 (w/w))과 CVT-E036 (MENTA-fX® 8: 4: 1 SJW:HT1001:GB 표준화된 추출물(w/w))은 ChemBioPrintTM 을 통해 표준화된 특허권 있는 복합제이고, CV Technologies로부터 상업적으로 입수 가능하다. WST-1 세포 분열 증식 시약은 F. Hoffmann-La Roche Ltd. (Postfach, Switzerland)로 부터 구입했다. 세포배양 시약은 Gibco Life Technologies Canada (Burlington, ON, Canada)로부터 구입했다. 기타 모든 시약은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (Oaltville, Ontario, Canada)나 Fisher Chemical Co.(Edmonton, Alberta, Canada)로부터 구입했다. 수용성 진세노사이드를 제외한, 모든 시료는 먼저 DMSO에 녹이고, 실험을 위해 물로 희석되었다.
지질 과산화 측정
생약 추출물의 지질과산화 억제능력은 Ohkawa 등에 의해 개발된 티오바비투르산 시험과 (Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979 July;95(2): 351- 8), 카테콜아민성 신경아세포종 쎌 라인 SH-SY5Y (Dr. Peter Yu, University of Saskatchewan로부터의 관대하게 기증받음)를 이용하여 측정되었다. 세포는 10% 소태아 혈청(FBS)(v/v)과 1% 항생제 혼합물 (페니실린 50㎍/ml, 스트렙토마이신 50㎍/ml, 100㎍/ml: PSN)으로 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 거의 90-100% 컨플루언시가 될 때까지 유지되었다. 그 후 세포들은 1x106 세포/웰로 6-웰 Nunclon 조직 배양용 플레이트에 접종되고, 48시간 동안 0.1mM의 황산철 (FeSO4)이 존재하거나 존재하지 않는 생약추출물에 노출시키기 전에, 24시간 동안 키워졌다. 그 후 세포들은 일회용 유리 배양튜브에 수확되어 넣어지고, 원심분리되고, 펠렛들은 0.4ml 1.15% 염화칼륨액에 재현탁되고 초음파분쇄기로 균질화되었다. 그 후 300 ㎕ 분주량(aliquot)을 참고 표준 물질로서 테트라에톡시프로판을 사용한 Ohkawa 등의 방법을 이용해 지질과산화에 대해 측정되었다. 잔여 물질들은 Lowry의 방법을 이용해 단백질 함량이 측정되었다.
0.1mM Fe2 + 존재시 및 부존재시의 지질 과산화에 대한 생약 추출물의 효과를 도 1에 나타냈다. 모든 시료는 철분 단독 존재 하에서 지질 과산화를 현저하게 억제했지만, Fe2+ 부존재시는 아무 효능이 없었다(데이터 기재하진 않음). 효능순서는 GB > SJW > CVT-E033 = CVT-E036 > HT1001 순 이었다.
자유라디칼
제거
생약추출물과 순수한 화학성분의 하이드록실 자유 라디칼 제거능력은 Arnao 등에 의해 개발된 다이나믹 방법의 변형에 의해 측정되었다. (Arnao MB, Cano A, Hernandez-Ruiz J, Garcia-Canovas-F, Acosta M. Inhibition by L-ascorbic acid and other antioxidants of the 2.2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) oxidation catalyzed by peroxidase: a new approach for determining total antioxidant status of foods. Anal Biochem 1996 June 1;236(2):255-61). 간단히, 생약추출물을 50 mM의 트리스-염산 완충용액 (pH 7.2)에 과산화수소 및 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산)(ABTS)과 혼합하고, 반응을 2nM의 양고추냉이 과산화효소 (horseradish peroxidase)의 첨가로 개시했다. 각 시료의 하이드록실 라디칼 제거 활성은 착색된 ABTS 라디칼(흡광도 405nm) 형성을 방해하는 능력에 의해 추론되었다. 각 시료의 자유라디칼 제거 활성은 아스코르브산으로부터 생성된 표준곡선과 비교되었다.
GB 추출물, HT1001, CVT-E033의 자유 라디칼 제거 능력은 아래 표 2에 나타내었다. 하이드록실 자유라디칼 제거 활성은 과산화효소-촉매된 ABTS 라디칼 생성을 방해하는 능력으로부터 추론되었다. CVT-E033 및 더 높은 정도로 GB 추출물은 현저한 하이드록시 라디칼 제거 활성을 보인 반면, HT1001은 측정가능한 활성이 없었다.
| 물질 | 아스코르브산 등가량 (중량 %) |
| CVT-E033 | 0.183±0.004 |
| HT1001 | n.d. |
| GB | 1.18±0.021 |
표2는 북아메리카 인삼 추출물 HT1001, GB 추출물, 복합제 CVT-E033 (HT1001과 GB)에 의한 자유라디칼 제거능력을 나타낸 것이다.
생약추출물은 과산화수소 및 ABTS와 배양되고, 양고추냉이 과산화효소의 첨가로 반응이 개시되었다. 시료의 하이드록실 라디칼 제거활성은 착색된 ABTS 라디칼 (흡광도 405nm)의 형성 방해능력에 의해 추론되었다. 각 시료의 자유라디칼 제거 활성은 아스코르브산으로부터 생성된 표준 곡선과 비교됐고, 아스코르브산 중량%로 표현되었다.
Fe
2
+
킬레이션
측정
셀-프리 어세이 시스템에서 Fe2 +을 킬레이트하는 생약추출물 또는 순수한 화학성분의 능력은 FeSO4와 Fe2 +-킬레이팅 크로모젠, 페로진 배양에 따른 착색된 Fe(페로진)3 2+ 착체의 형성억제에 의해 평가되었다. 페로진은 앞서 페리틴으로부터 유리된 자유 Fe2 + 을 측정하기 위해 이용되어 왔다. 시험된 모든 생약추출물 및 순수 화학물질들은 4% DMSO 수용액에 5mg/ml 및 0.2mg/ml로 각각 준비되었다. 50㎕ 분주량은 96-웰 마이크로티터 플레이트(MTP)에서 1mM FeSO4 용액 50㎕와 실온에서 30분간 배양되었다. 결과용액 50㎕ 분주량은 새 96-웰 MTP에 옮겨지고, 2mM (포화농도) 페로진 용액 50㎕와 혼합되었다. HT1001, GB, SJW, CVT-E033, 및 CVT-E036은 1.25 mg/ml에서 시험되었고, 순수 화학성분들은 50㎍/ml(최종농도)에서 시험되었다. 색 형성은 즉각적이었고 흡광도는 562nm에서 읽었다. 결과는 대조군에 대해 상대적으로 표현되었고, 시료의 활성은 기지의 Fe2 + 킬레이터 DFO의 활성과 비교되었다. DMSO가 Fe(페로진)3 2+ 착체 형성을 억제할 수 있으므로, 실험추출물과 화학성분들은 DMSO 대조군 등가 퍼센트에 비교되었다.
모든 생약추출물과 순수한 화학성분 징코라이드 A 및 B, 플라보노이드 퀘르세틴 및 루틴, 히퍼포린, 히퍼리신, 및 다섯 개의 진세노사이드 Rbl, Rgl, Rc, Rd, 및 Re를 셀-프리 케미컬 어세이 시스템에서 Fe2 + 와 페로진의 결합을 억제하는 능력을 시험하였다. Fe(페로진)3 2+ 착체에 대한 적절한 흡광도 신호를 얻기 위해, 페로진과 반응하기 위한 Fe2 +의 비-생리학적 농도가 선택되었다. 이것으로 Fe2 +를 잠재적으로 킬레이트 하기 위해 생약추출물 및 성분들의 고농도를 요구하였다. CVT-E033, GB, HT1001, SJW, 및 CVT-E036 (도 2b)에서 Fe(페로진)3 2+ 착체 형성에 유사한 정도의 용량 의존 억제효과가 관찰되었다. 기지의 Fe2 + 킬레이터인 DFO의 용량-반응 곡선은 도 2a에 나타냈으며, 이는 DFO가 본 발명의 측정시스템에서 Fe(페로진)3 2+ 착체 형성을 방해할 수 있는 것을 나타낸다. 징코라이드 A와 B 및 플라보노이드 루틴에 대한 적정 곡선은 아무 활성을 나타내지 않는 반면, 플로보노이드 퀘르세틴은 Fe(페로진)3 2+ 착체 형성을 방해할 수 있었다 (도 3a). 20-(s)-프로토파낙사디올 Rbl, Rc, 및 Rd 또한 Fe2 +와 페로진의 상호작용을 방해할 수 있는 능력을 나타내었으나, 20-(s)-프로토파낙사트리올 진세노사이드 Rgl 및 Re는 그렇지 않았다(도 3b). SJW의 주된 기지의 생활성 성분의 분석은, 히퍼포린은 아니었지만, 히퍼리신은 Fe(페로진)3 2+ 착체 형성을 방해할 수 있음을 보여주었다. 모두 종합해 보면, 이들 데이터는 CVT-E033, GB, HT1001, SJW, 및 CVT-E036는 Fe2 + 킬레이터로서 작용할 수도 있는 명백한 화학성분을 가졌음을 제시한다. 그러나, 각 성분이 생약 추출물에서의 그들 함량을 반영한 농도에서 시험되었 때 매우 낮은 활성을 보여 추출물의 각 성분이 Fe2 + 결합에 상승적으로 기여하거나 상가적인 효과를 제공하는 것을 보여준다.
신경아세포종 세포
생존능
측정
SH-SYSY, N1E 115, 및 SK-N-SH (ATCC, Rockville, MD, USA) 신경아세포종 세포는 37℃, 5% CO2 및 95% 공기 조건하에서, 10% FBS (v/v), 1 mM 소듐 피브레이트, 2 mM L-글루타민 및 MEM 비-필수아미노산 혼합물로 보충된 최소 필수 배지 (minimal essential medium, MEM)에서의 계대배양(subculture)으로 유지되었다. 약 80% 컨플루언시에서, 세포들이 수확되고 생약추출물 또는 순수 화학성분 및 다양한 양의 FBS를 함유하는 96-웰 배양 플레이트에 1xl04세포/웰에 접종되었다. DMSO의 최종 농도는 0.05%를 초과하지 않도록 했다. 세포 수에 대한 효과는 제조자 지시서에 따라 각 시료 웰에 WST-1 세포 증식 시약을 첨가함에 의해 96시간 후에 평가되었다. 세포수는 앞서 기술했던 것 처럼 세포 증식 시약 WST-1 시험법을 이용하여 결정되었다(Ba F, Pang PK, Benishin CG. The establishment of a reliable cytotoxic system with SK-N-SH neuroblastoma cell culture. J Neurosci Methods 2003 March 15; 123(1): 11-22). 세포 수 측정의 전통적인 트리판 블루 배제법과 비교했을 때, WST-1 방법의 정확성은 두 방법 사이에 강한 상호관계를 보였다. 결과는 대조군과 비교하여 나타내었다.
모든 추출물의 효과는 50 ㎍/ml로 3개의 신경아세포종 셀 라인에서 정상(10%) 및 저(2%) 혈청조건 하에서 비교되었다. 결과는 도 4에 나타내었다. 은행 함유 추출물 GB, CVT-E033 및 CVT-E036은 가장 많이 세포수 억제를 나타내었다. 특히 GB는 인간 신경아세포종 라인 SK-N-SH 세포(저/정상 혈청 조건) 및 SH-SY5Y(저 혈청 조건)에서 세포수를 억제했다. 대조적으로 CVT-E033은 SH-SY5Y(저혈청 조건) 및 쥐 신경아세포종 셀 라인 NIE 115(저/정상 혈청 조건)에서 세포수를 현저하게 억제했고, CVT-E036은 세가지 셀 라인 모두에서의 저혈청 조건에서 및 추가적으로 N1E 115에서의 정상혈청 조건에서 세포수를 억제했다. SJW 추출물 또한 SH-SY5Y에 대해 저혈청 조건에서, N1E 115세포에서는 두가지 조건 모두에서 세포수를 억제했다. HT1001은 세포수에서 억제효과가 없었고, 높은 혈청조건 하에서 SH-SY5Y세포에 대해 낮은 세포수 자극 효과를 보였다. Fe2 +킬레이터 DFO 또한 N1E 115 세포에서 신경아세포종 세포수 억제를 보였지만(도 4d), SH-SY5Y 세포에서는 2상 효과(biphasic effect)를 나타냈다.
각 성분들이 추출물 내에서 그들의 부분(proportion)을 반영한 농도에서 분석될 때, 어떤 셀 라인에서도 세포수에 대한 현저한 효과는 관찰되지 않았다. 화합물의 일부분은 여과하는 동안 소실되었을 수도 있다는 것이 추측되었기 때문에, 그 후 쥐 모델(N1E 115)과 인간 신경아세포종 모델(SH-SY5Y) 모두에서 모든 성분에 대해 용량-반응 곡선은 구성되었다. GB 추출물에서 발견된 징코라이드(A와 B)와 CVT-E033과 CVT-E036 그리고 SJW 추출물에서 추가적으로 발견된 플라보노이드 (퀘르세틴과 루틴)의 용량-반응 곡선은 도 5a(N1E 115 세포)와 도 5b(SH-SY5Y)에서 나타내었다. 퀘르세틴만이 인간 SH-SY5Y와 쥐 NIE 115 셀 라인에서 5㎍/ml에서 처음으로 뚜렷이 유의성 있게 (P < 0.05) 현저한 세포수 억제를 보여주었다. 진세노사이드 및 히퍼포린에 대한 결과는 도5c (N1E 115 세포) 및 도 5d (SH-SY5Y 세포)에서 나타내었고, 히퍼포린만이 두 셀 라인에서 현저한 용량-의존적 억제를 나타내었다.
신경돌기 성장
쥐의 신경아세포종 셀 라인 N1E 115가 생약추출물 HT1001, GB 및 CVT-E033의 신경돌기 성장에 대한 효과를 연구하기 위해 사용되었다. N1E 115세포를 100cm2 조직 배양 플레이트에 접종하고 10% FBS와 1% PSN 항생물질(v/v)이 보충된(supplemented) DMEM 내에서 37℃로 유지했다. 세포는 기계적으로 이동되고 35mm 콜라겐-코팅된 조직 배양 디쉬에 2 x 104 세포/디쉬의 밀도로 평판 배양되었다. 신경돌기 성장은 생약 추출물로 배양해서 7 또는 14일 후에 세포의 대표적인 필드에 대해 정량되었다. 두 세포 필드들은 각 처리 디쉬별로 촬영되었고, 신경돌기 성장 정도는 다음과 같이 스코어링 되었다: S 1 = 세포가 늘어났거나 매우 낮은 신경돌기 성장; S2 = 세포체로부터 2개 초과의 작은 신경돌기 확장; S3 = 하나 또는 두개의 신경돌기가 최소 세포체 직경 2배 이상으로 성장; S4 = 2개 초과 긴 신경돌기. 신경돌기 지수(index)는 다음과 같이 계산했다:
신경돌기 지수 (In) = 총 신경돌기 스코어(∑S)/총 세포수 ∑N;
상기에서 ∑S = S1*N + S2*N + S3*N + S4*N, 및 N은 모든 세포 필드의 세포 수.
신경돌기 성장에 대한 CVT-E033, HT1001, 및 GB의 효과는 도 6에서 요약되었다. 시험된 모든 생약추출물은 50㎍/ml에서 시작하여 비슷한 정도로 N1E 115 신경아세포종 세포로부터 신경돌기 성장을 야기하는 능력이 증명되었다. GB와 HT1001의 효과는 용량-의존적이었다. GB는 세포 사멸을 야기하는 것으로 관찰되었지만(세포수에 대한 상기 연구에서 지지됨), 잔존한 세포들에서는 신경돌기성장을 자극했다.
Statistical
analyses
통계분석
달리 명기하지 않으면, 유의성 있는 차이를 결정하기 위해, 유의수준 0.05로 일원 변량 분석(one-way analysis of variance, ANOVA) (Student-Newman-Keuls test)이 사용되었다. 모든 결과는 평균±평균의 표준오차(SEM)로 나타냈다. 통계분석은 GraphPad Prism 이나 Sigmastat 그래프 및 통계 소프트웨어를 이용하여 수행했다.
본 발명에 따른 항산화제 및 항증식제는 현저한 Fe2 +-촉매된 지질 과산화 억제 및 Fe2 + 킬레이션 활성, 하이드록실 자유 라디칼 제거 능력, 신경아세포종 세포수의 감소능력, 및/또는 신경돌기 성장 촉진 능력을 보인다.
Claims (9)
- HT1001을, 은행, 세인트존스워트, 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신, 및 히퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약제와 복합제로 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 HT1001은 인삼 추출물의 약 15~50 중량%의 총 진세노사이드 함량을 갖는 것인 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 약제가 은행인 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 약제가 세인트존스워트인 약제학적 조성물.
- HT1001을 단독으로, 또는 은행, 세인트존스워트, 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신, 및 히퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약제와 복합제로 포함하는 약제학적 조성물을, 산화적 스트레스를 감소시키는 유효량으로, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 산화적 스트레스를 치료하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 산화적 스트레스는 암에 기인한 것인 방법.
- HT1001을, 은행, 세인트존스워트, 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신, 및 히퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약제와 복합제로 포함하는 약제학적 조성물을, 철분 과다(iron overload)를 감소시키는 유효량으로, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 철분 과다를 치료하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 철분 과다는 암, 알츠하이머병, 결핵, 파킨슨병, 겸상 적혈구, 윌슨병, 간손상, 베타 지중해성 빈혈(beta-thalassemia), 심장병, 다발성 경화증, 염증성 대장질환 (크론병과 궤양성 대장염), 감염, 종양형성(neoplasia), 심근병증, 또는 관절증에서 기인한 것인 방법.
- HT1001을, 은행, 세인트존스워트, 징코라이드, 플라보노이드, 진세노사이드, 히퍼리신, 및 히퍼포린으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 약제와 복합제로 포함하는 약제학적 조성물을, 신경돌기 성장을 촉진시키는 유효량으로, 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 신경돌기 성장을 촉진시키는 방법.
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