JPWO2015174427A1

JPWO2015174427A1 - 微生物を用いたマイコスポリン様アミノ酸を生産する方法

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Publication number: JPWO2015174427A1
Application number: JP2015545234A
Authority: JP
Inventors: 治生池田; 山本　省吾; 省吾山本; 松本　淳; 淳松本; 匡洋曽田
Original assignee: Kitasato Institute; Nagase and Co Ltd
Current assignee: Kitasato Institute; Nagase and Co Ltd
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2017-04-20
Anticipated expiration: 2035-05-12
Also published as: EP3144392B1; US10307356B2; JP5927593B2; WO2015174427A1; KR20170002587A; ES2742162T3; KR102148740B1; CN106574282A; CN106574282B; US20170202762A1; EP3144392A1; EP3144392A4

Abstract

本発明は、マイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡ）を生産する方法であって、ＭＡＡを菌体外に産生する微生物を培養する工程、菌体と菌体外培養液を分離する工程、および菌体外培養液からＭＡＡを回収する工程を含む方法、下記式１で表されるＭＡＡ、本発明の方法によって生産されるＭＡＡまたは下記式１で表されるＭＡＡを含む紫外線吸収用組成物、ならびに急性皮膚反応、皮膚老化および皮膚癌からなる群から選択される一以上の症状または疾患を予防するための、本発明の方法によって生産されるＭＡＡまたは下記式１で表されるＭＡＡを含む組成物を提供する。［化１］

Description

本発明は、微生物を用いたマイコスポリン様アミノ酸を生産する方法、前記方法により生産されたマイコスポリン様アミノ酸、および前記マイコスポリン様アミノ酸を含む紫外線吸収剤に関する。

紫外線（ＵＶ）は、紅斑などの急性皮膚反応、皮膚老化および皮膚癌を誘発することが知られている。太陽光線に含まれる紫外線は、その波長によって、ＵＶ−Ａ（３２０ｎｍ−４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ（２８０ｎｍ−３２０ｎｍ）およびＵＶ−Ｃ（２００−２８０ｎｍ）の３種類に分類される。この中で、生体への影響があるのはＵＶ−ＡとＵＶ−Ｂであり、ＵＶ−Ｃは通常は大気を通過することができないため問題とならない。

ＵＶ−Ｂは、屋外での日焼けの主因であり、ＵＶ−Ａと比べて相対的にエネルギーが大きいことが知られている。皮膚層に吸収されると、角質層および表皮に到達し、シミ・ソバカスなどの急性皮膚色素沈着を引き起こす。また、老化や皮膚癌の発症に関与する、免疫抑制を引き起こすことも知られている。

ＵＶ−Ａは、ＵＶ−Ｂに比べて波長が長くエネルギーは小さいが、ＵＶ−Ｂよりも皮膚のさらに深いところまで浸透し、真皮にまで到達することが知られている。その結果、シミ・ソバカスなどの急性皮膚色素沈着だけでなく、真皮の弾力低下（光線性弾性線維症）を引き起こし、しわ・たるみといった早期皮膚老化現象を引き起こす。さらに近年、ＵＶ−Ａも免疫抑制を引き起こし、前癌性の皮膚病変および皮膚癌の発症に関与することがわかってきている。

ＵＶ−Ｂは、季節、天候、緯度などによってその量が異なるのに対し、ＵＶ−Ａは一年を通して一定量が地表に達する。そのため、ＵＶ−Ａから皮膚を保護することも、重要である。

現行の紫外線防御剤は、紫外線吸収剤と紫外線散乱剤に分類することができる。紫外線吸収剤は、紫外線エネルギーを熱エネルギーに変換して放出するものであり、例えば、４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４’−ｍｅｔｈｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｙｌｍｅｔｈａｎｅなどの有機化合物が挙げられる。紫外線散乱剤は、酸化チタン（ＴｉＯ_２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）などの無機粒子を含み、皮膚に塗布した場合、皮膚表面に存在する無機粒子が紫外線を反射するバリアとして機能する。

紫外線吸収剤には、（１）光で分解されやすく安定性が悪い、（２）分子励起を起こし、メラニン生成を促進することで、かゆみやアレルギーを引き起こす、（３）化学合成物質であるため、使用者に与えるイメージが悪い、といった問題点がある。紫外線散乱剤には、（１）皮膚に塗布した際、白くなりやすく、皮膚に重たい感じを与えやすい、（２）活性酸素の生成を引きおこす、（３）皮膚の毛穴を塞ぎ、皮膚呼吸が阻害される懸念がある、といった問題点がある。このような問題点から、天然由来の安全な紫外線吸収物質への期待が高まっている。

マイコスポリン様アミノ酸（Ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅＡｍｉｎｏＡｃｉｄ、以下ＭＡＡとする）は、サンゴ、紅藻類、魚の内臓、微細藻類等、水生生物に広く存在することが知られている、天然のＵＶ−Ａ吸収物質である。中でも、シノリンは天然で最も有効なＵＶ−Ａ吸収物質であると知られている。これまでに、化学合成によってＭＡＡを製造することが試みられているが、その工程は長く、煩雑である（特許文献１）。また、シアノバクテリアを用いる光照射法によるＭＡＡの製造も試みられているが、その産生量は極めて少ない（非特許文献１）。さらに、ノリ、藻類、貝などの天然物からＭＡＡを抽出することも試みられているが、いずれも十分な収量が得られていない（特許文献２および非特許文献２〜４）。また、天然物からの抽出や、天然物からの生産は、季候などの影響を受け易く不安定なことが多く、ＭＡＡを安定的に大量に得ることが困難である。一方、微生物にＭＡＡを生合成させる方法も試みられているが、これらの方法では、生合成されたＭＡＡを菌体内から抽出するために、菌体破砕や有機溶剤を用いた抽出等の操作が行われている（特許文献３および非特許文献５〜６）。そのため、操作が煩雑になる上、菌体由来の夾雑物を除く精製操作が更に必要となる問題があった。

国際公開第０２／３９９７４号特表２０１３−５１８８７１号公報特開平６−６２８７８号公報

ＷｏｒｌｄＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００８）２４：３１１１−３１１５ＭａｒｉｎｅＢｉｏｌｏｇｙ１０８，１５７−１６６（１９９１）ＰｈｏｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２），２４，３９−４２ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ１９７９，３１８１−３１８２ＦＥＭＳＹｅａｓｔＲｅｓ（２０１１），１１：５２−５９ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ（２０１１），１９３（２１）：５９２３−５９２８

本発明の解決課題には、天然由来の安全な紫外線吸収物質を、安定的にかつ大量に生産する方法を提供すること等が包含される。

本発明者らは、ＭＡＡを菌体外に産生する微生物を用いてＭＡＡを生合成し、菌体外の培養液からＭＡＡを大量に取得する方法を確立した。これにより、従来法よりも比較的容易に、かつ安定的に天然由来のＭＡＡを生産できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、以下を提供するものである：
（１）マイコスポリン様アミノ酸を生産する方法であって、
マイコスポリン様アミノ酸を菌体外に産生する微生物を培養する工程、
菌体と菌体外培養液を分離する工程、および
菌体外培養液からマイコスポリン様アミノ酸を回収する工程
を含む、方法；
（２）回収したマイコスポリン様アミノ酸を精製する工程をさらに含む、（１）に記載の方法；
（３）微生物が大腸菌、酵母、放線菌、微細藻類またはラビリンチュラ類に属する微生物である、（１）または（２）に記載の方法；
（４）微生物が放線菌である、（３）に記載の方法；
（５）放線菌が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である、（４）に記載の方法；
（６）微生物がラビリンチュラ類であって、該ラビリンチュラ類がオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属である、（３）に記載の方法；
（７）微生物が酵母であって、該酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である、（３）に記載の方法；
（８）微生物が異種由来のマイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子群を含む、（１）〜（７）のいずれか一つに記載の方法；
（９）マイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子群が、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）由来のａｍｉｒ＿４２５６、ａｍｉｒ＿４２５７、ａｍｉｒ＿４２５８およびａｍｉｒ＿４２５９遺伝子である、（８）に記載の方法；
（１０）マイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子のコドンが、導入される微生物用に改変されている、（８）に記載の方法；
（１１）微生物が、ストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１４８９３）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１５６７５）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株）（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１２１６８）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＳＡＭ２１７９株（ＦＥＲＭＢＰ−５６０１）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９ＸＷ株である、（９）または（１０）に記載の方法；
（１２）下記、式１で表されるマイコスポリン様アミノ酸

（１３）（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法によって生産される、（１２）に記載のマイコスポリン様アミノ酸；
（１４）（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法によって生産されるマイコスポリン様アミノ酸、または（１２）もしくは（１３）に記載のマイコスポリン様アミノ酸と、化粧品、医薬部外品もしくは医薬品に許容される成分とを含む、紫外線吸収用組成物；および
（１５）急性皮膚反応、皮膚老化および皮膚癌からなる群から選択される一以上の症状または疾患を予防するための、（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法によって生産されるマイコスポリン様アミノ酸、または（１２）もしくは（１３）に記載のマイコスポリン様アミノ酸と、化粧品、医薬部外品もしくは医薬品に許容される成分とを含む、組成物。

本発明によれば、工程数が多く煩雑な従来の化学合成法に比べ、容易にＭＡＡを生産することができる。また、従来行われていたノリや貝などの天然物から取得する方法よりも大量にＭＡＡを取得することができる。そのため、安定的にＭＡＡを生産できる。また、菌体外の培養液からＭＡＡを取得できることから、微生物菌体を破砕してＭＡＡを取得する方法と比べて、精製工程が単純化されるので、高純度のＭＡＡを迅速かつ高収率で得ることができる。

図１は、ストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１４８９３）を用いた、菌体外培養液中および菌体内におけるシノリンおよびポルフィラ−３３４の生産量の比較を示す。（Ａ）はシノリン、（Ｂ）はポルフィラ−３３４を示す。白丸・実線：菌体外培養液、黒丸・破線：菌体内。図２は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１２１６８）の菌体外培養液中のシノリンおよびポルフィラ−３３４濃度の経時変化を示す。黒三角はシノリン、白三角はポルフィラ−３３４を示す。

１つの実施態様において、本発明は、ＭＡＡを生産する方法であって、ＭＡＡを菌体外に産生する微生物を培養する工程、菌体と菌体外培養液を分離する工程、および菌体外培養液からＭＡＡを回収する工程を含む方法を提供する。

本発明の方法によれば、微生物の培養上清からＭＡＡを取得する。そのため、従来行われていた天然物を用いる方法よりも大量にＭＡＡを取得することができる。また、本方法は、微生物自体の破砕工程を必要としない。そのため、従来法である藻類などの天然物を破砕してＭＡＡを抽出する方法と比べ、時間およびコストを削減することができる。また、破砕工程を含む方法では、破砕により生じる夾雑物の持ち込みが、その後の精製工程を複雑にするが、本方法ではそのような夾雑物の持ち込みを防ぐことができるため、その後の精製工程を容易にすることができる。これにより、精製に要する時間およびコストも削減することができる。

本発明において、「マイコスポリン様アミノ酸（Ｍｙｃｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｌｉｋｅａｍｉｎｏａｃｉｄ、以下ＭＡＡとする）」とは、置換基を有していても良いシクロヘキセノンまたはシクロヘキセンイミン骨格にアミノ酸が結合した化合物の総称である。

ＭＡＡには、例えば、シノリン（以下、式２）、ポルフィラ−３３４（以下、式３）、アステリナ−３３０（以下、式４）、パリテン（以下、式５）、パリチン（以下、式６）、マイコスポリン−グリシン（以下、式７）、マイコスポリン−グリシン：バリン（以下、式８）、マイコスポリンセリノール（以下、式９）等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、「微生物」とは、例えば、放線菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌、カビおよび酵母などの真菌、ラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）などの微細藻類、およびラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）が挙げられるが、これらに限定されない。

「放線菌」とは、放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属するグラム陽性の真正細菌を指す。「放線菌」には、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、およびストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）などのストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノシネマ・プレチオスム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｐｒｅｔｉｏｓｕｍ）およびアクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）などのアクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）属、シュードノカルディア・オートトロフィカ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、シュードノカルディア・サーモフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）などのシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、ならびにコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などのコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が含まれる。放線菌は、例えば、土中から分離することができ、また微生物寄託分譲機関から入手することもできる。

「酵母」には、有子嚢胞子酵母、担子胞子形成酵母、および不完全菌類に属する酵母が含まれる。例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）などのシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ファフィア・ロドチーマ（Ｐｈａｆｆｉａｒｈｏｄｏｚｙｍａ）などのファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、クルイベロマイセス・マーキシアンス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）などのピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ならびにカンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）などのカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属が含まれる。酵母は、例えば、植物、動物、土中などから分離することができ、また微生物寄託分譲機関から入手することもできる。

「微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）」とは、藻類（ａｌｇａｅ）から多細胞生物である海藻類を除いた、微視的な構造を持つ藻類を指す。「藻類（ａｌｇａｅ）」とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたもの全てを指す。藻類には、様々な単細胞生物及び多細胞生物が含まれる。例えば、海藻類、原核生物であるラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、真核生物である灰色植物門（Ｇｌａｕｃｏｐｈｙｔａ）、紅色植物門（紅藻）（Ｒｈｏｄｏｐｈｙｔａ）、緑色植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）などが含まれる。微細藻類には、複数個の細胞が群体を形成するものも含まれる。また、必ずしも水中に生息するとは限らず、土壌中や動物の体表などで生息しているものも存在する。「ラン藻（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）」には、例えば、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノストク・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、ノストク・リンキア（Ｎｏｓｔｏｃｌｉｎｃｋｉａ）、ノストク・コミューン(Ｎｏｓｔｏｃｃｏｍｍｕｎｅ)、ノストク・ベルコスム（Ｎｏｓｔｏｃｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）およびノストク・ムスコルム（Ｎｏｓｔｏｃｍｕｓｃｏｒｕｍ）などが含まれる。ラン藻は、例えば、自然界から分離することができ、また微生物寄託分譲機関から入手することもできる。

「ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）」は、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）に含まれるアメーバ様の真核生物である。ラビリンチュラ類には、例えば、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属が含まれる。ラビリンチュラ類は、例えば、海藻や陸上植物など自然界から分離することができ、また微生物寄託分譲機関から入手することもできる。

本明細書において、「マイコスポリン様アミノ酸を菌体外に産生する微生物」とは、ＭＡＡを生合成し、菌体外に産生する能力を有する微生物、例えば、ＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する微生物を指す。これらの「ＭＡＡを菌体外に産生する微生物」は、野生株であってもよく、あるいは人工的に変異処理が施された株であってもよい。人工的な変異処理としては、遺伝子組換え、ＵＶ照射、Ｘ線照射、変異剤での処理等が挙げられる。また、ＭＡＡを菌体外に産生する微生物は、自然発生による突然変異株であってもよい。「ＭＡＡを菌体外に産生する微生物」には、同種または異種由来のＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する微生物も含まれる。例えば、異種由来のＭＡＡ生合成酵素遺伝子が遺伝子組換えにより導入された微生物であってもよい。上述した微生物への異種遺伝子の導入には、当技術分野において広く知られている方法が用いられ得る。

同種または異種由来のＭＡＡ生合成酵素遺伝子を遺伝子組換えにより微生物に導入する場合、例えばプロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、形質転換体選択用マーカー遺伝子、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）またはそれらの一部分を、当該遺伝子と共に導入してもよい。この場合、各微生物で用いられるものとして当業者に広く知られているプロモーター等を用いてもよい。さらに、ＭＡＡ生合成酵素遺伝子が導入される微生物のコドン使用頻度に応じて、当該遺伝子のコドンを適宜改変して用いてもよい。当業者であれば、ある微生物のコドン使用頻度を、例えば、かずさＤＮＡ研究所のデーターベースＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＤａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）を利用して、調査することができる。あるいは、ＧＥＮＥＡＲＴ社の遺伝子配列設計プログラムＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）などを用いて、コドン使用頻度を調査することもできる。さらに、そのようにして得られたコドン使用頻度の情報に基づいて、常套的な手段を用いて、対象の遺伝子のコドンを最適化することができる。

マイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子には、例えば、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子、シュードノカルディア属菌（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．）Ｐ１由来のｐｓｅＰ１＿０１０１０００３１４２５（配列番号５）、ｐｓｅＰ１＿０１０１０００３１４３０（配列番号６）、ｐｓｅＰ１＿０１０１０００３１４３５（配列番号７）、ｐｓｅＰ１＿０１０１０００３１４４０（配列番号８）遺伝子、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ２９４１３由来のＡｖａ３８５５、Ａｖａ３８５６、Ａｖａ３８５７およびＡｖａ３８５８遺伝子（ＢａｌｓｋｕｓＥＰら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（２０１０）、３２９：１６５３−１６５６を参照のこと）、ノストク・パンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）ＡＴＣＣ２９１３３由来ｍｙｓＡ、ｍｙｓＢ、ｍｙｓＣおよびｍｙｓＤ遺伝子（ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ，Ｎｏｖ．２０１１，Ｖｏｌ．１９３，Ｎｏ．２１，ｐ．５９２３−５９２８を参照のこと）などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ラビリンチュラ類が用いられる場合、一実施形態では、マイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子として、コドン改変されたａｍｉｒ＿４２５６（配列番号９）、コドン改変されたａｍｉｒ＿４２５７（配列番号１０）、コドン改変されたａｍｉｒ＿４２５８（配列番号１１）およびコドン改変されたａｍｉｒ＿４２５９（配列番号１２）遺伝子が用いられる。

本発明の一実施形態では、本明細書で用いられる微生物は、大腸菌、酵母、放線菌、微細藻類またはラビリンチュラ類である。例えば、本明細書で用いられる微生物は、大腸菌、酵母、放線菌またはラビリンチュラ類である。

放線菌が用いられる場合、一実施形態では、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属、またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が用いられる。他の実施形態では、ストレプトマイセス属またはコリネバクテリウム属が用いられる。別の実施形態では、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が用いられる。さらに別の実施形態では、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）由来のａｍｉｒ＿４２５６、ａｍｉｒ＿４２５７、ａｍｉｒ＿４２５８およびａｍｉｒ＿４２５９遺伝子を含む、放線菌が用いられる。例えば、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を含む、ストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０株（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、日本、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）、ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１４８９３）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、日本、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）、ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１５６７５）、またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、日本、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）、ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１２１６８）が用いられる。

ラビリンチュラ類が用いられる場合、一実施形態では、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、またはウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属が用いられる。他の実施形態では、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属が用いられる。別の実施形態では、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を含む、ラビリンチュラ類が用いられる。さらに別の実施形態では、ラビリンチュラ類用にコドンが改変されたａｍｉｒ＿４２５６、ａｍｉｒ＿４２５７、ａｍｉｒ＿４２５８およびａｍｉｒ＿４２５９遺伝子を含む、ラビリンチュラ類が用いられる。他の実施形態では、ラビリンチュラ類用にコドンが改変されたａｍｉｒ＿４２５６、ａｍｉｒ＿４２５７、ａｍｉｒ＿４２５８およびａｍｉｒ＿４２５９遺伝子を含む、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＳＡＭ２１７９株（ＦＥＲＭＢＰ−５６０１：なお、この菌株は、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａｓｐ．）ＳＡＭ２１７９株として寄託されたものであるが、後日ゲノム解読により分類変更された）が用いられる。

酵母が用いられる場合、一実施形態では、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属が用いられる。他の実施形態では、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属が用いられる。別の実施形態では、キシロース資化性遺伝子を有する酵母が用いられる。さらに別の実施形態では、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を含む、酵母が用いられる。他の実施形態では、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を含む、キシロース資化性遺伝子を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９ＸＷ株が用いられる。

大腸菌が用いられる場合、一実施形態では、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を含む、大腸菌が用いられる。別の実施形態では、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を含む、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株が用いられる。

本明細書において、「菌体」とは微生物細胞を指す。また、本明細書において、「菌体外培養液」とは、微生物を培養して得られた培養液のうち、微生物細胞を除いた部分をいう。すなわち、菌体外培養液には、培養に用いられた培地に含まれる種々の成分、培養中に微生物が産生した物質等が含まれる。

菌体と菌体外培養液を分離する方法は、当業者により適宜選択される。例えば、微生物を培養して得られた培養液を遠心分離に供することにより、菌体と菌体外培養液を分離してもよい。温度、時間および速度などの遠心分離の条件については、用いた微生物の種類に応じて、当業者によく知られた条件が用いられ得る。あるいは、適切なろ過膜を用いて、微生物を培養して得られた培養液をろ過することにより、菌体と菌体外培養液を分離してもよい。また、適切な凝集剤を用いて菌体を凝集した後に、遠心分離またはろ過を行ってもよい。

菌体外培養液からのＭＡＡの回収とは、菌体外培養液中に含まれる、培養に用いられた培地に含まれる種々の成分、培養中に微生物が産生したＭＡＡ以外の物質等を除き、ＭＡＡを主に含む溶液を取得することを指す。菌体外培養液からＭＡＡを回収する方法もまた、当業者により適宜選択される。例えば、膜による濾過あるいは適切な媒体を用いて菌体外培養液からＭＡＡを回収することができる。媒体は、当業者により適宜選択される。好ましい実施形態では、水系の媒体が用いられる。水系の媒体には酸性、中性またはアルカリ性の水溶液、あるいは塩を含む水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。

他の実施態様において、本発明は、回収したＭＡＡを精製する工程をさらに含む、上述した本発明の方法を提供する。ＭＡＡの精製には、微生物の培養物から代謝産物を精製するための、当業者によく知られた方法が用いられ得る。例えば、有機溶媒による抽出、活性炭処理、ゲルろ過、イオン交換カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、結晶化、電気透析などを用いて、精製ＭＡＡを得てもよい。

本発明では、培地を必要に応じて中和してもよい。中和剤には公知のものを用いてもよく、例えば、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムおよび水酸化マグネシウムなどの水酸化物、アンモニア、生石灰、石灰石、消石灰などが用いられる。ある実施形態では、本発明で用いられる中和剤は、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩である。中和剤は、培養前に培地に添加しておいてもよく、培養中に添加してもよい。また、中和剤の添加は、連続的であってもよく、間歇的であってもよい。中和剤の添加量は、培地のｐＨを測定することによって、容易に決定することができる。ｐＨは、従来公知の方法、例えばｐＨ計を用いて、測定することができる。

本発明において、微生物を培養するための培地およびその他の培養条件（温度、時間、ｐＨ、撹拌の有無等）は、培養される微生物の種類に応じて、当業者により適宜選択され得る。

放線菌を用いる場合、例えば、放線菌用の半合成培地（６％グルコース、０．２％ＮａＣｌ、０．０５％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．０１％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．２％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２％酵母抽出物、０．００５％ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００５％ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ、０．００５％ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５％ＣａＣＯ_３）、ＴＳＢ培地（０．２５％グルコース、１．７％カゼイン膵消化物、０．３％大豆パパイン消化物、０．５％ＮａＣｌ、０．２５％Ｋ_２ＨＰＯ_４）、またはＳＹＮ培地（０．７％カザミノ酸、０．２％酵母抽出物、０．２６４％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．２３８％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５５６％Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．１％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００６４％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．００１１％ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．００７９％ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ、０．００１５％ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５％ＣａＣＯ_３）を用いてもよい。大腸菌を用いる場合、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、またはＹＰＤ培地を用いてもよい。酵母を用いる場合、例えば、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地、またはＹＰＡＤ培地を用いてもよい。

上記の培地は、微生物の培養を改良するために、適宜改変して用いてもよい。例えば、培地中のグルコース初期濃度の増加、あるいはＴｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ（×２００）（ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ６４ｍｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１１ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ７９ｍｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ１５ｍｇ／５０ｍＬ）の添加により、培地を改変してもよい。

別の実施態様において、本発明は、上述した本発明の方法によって生産される、ＭＡＡを提供する。本発明によって生産されるＭＡＡは、既に構造決定されているＭＡＡだけでなく、新規な構造を有するＭＡＡも含み得る。一実施形態では、かかるＭＡＡは、シノリン、ポルフィラ−３３４、パリチン、マイコスポリンセリノール、もしくはマイコスポリングリシン、またはこれらの任意の組み合わせである。新規な構造を有するＭＡＡの例として、マイコスポリン−グリシン−アラニン（以下、式１０）が挙げられる。従って、ある実施形態では、本発明は、マイコスポリン−グリシン−アラニンを提供する。他の実施形態では、本発明は、上述した本発明の方法によって生産される、マイコスポリン−グリシン−アラニンを提供する。

ＭＡＡの同定方法については、従来公知の方法が用いられ得る。例えば、高速液体クロマトグラフ−飛行時間型質量分析法（ＨＰＬＣ−ＴＯＦＭＳ）を用いてもよい。同様に、新規ＭＡＡの同定方法についても、従来公知の方法が用いられ得る。例えば、高分解能質量分析法（ＨＲ−ＭＳ：ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ：ＮｕｃｌｅａｒＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ）法を組み合わせることで、新規ＭＡＡを同定してもよい。また、ＨＰＬＣを用いて、保持時間およびＵＶスペクトルの結果からＭＡＡを同定してもよい。あるいは、フォトダイオードアレイ検出器とＨＲ−ＭＳ検出器を備えたＨＰＬＣを用いて、紫外吸収スペクトルと精密質量を測定することにより、新規ＭＡＡを同定してもよい。

本発明はさらに、活性成分として、有効量の本発明の方法によって生産されるＭＡＡまたは上述したマイコスポリン−グリシン−アラニンと、化粧品、医薬部外品または医薬品に許容される他の成分とを含む、紫外線吸収用組成物を提供する。本発明の紫外線吸収用組成物は、化粧品、医薬品分野のほか、塗料組成物やその他のコーティング剤として使用され得る。例えば、本発明の紫外線吸収用組成物は、ヒトの皮膚に適用される場合、本発明の方法によって生産されたＭＡＡを約０．０５〜１０重量％含み、かつ油相媒質を約５〜４０重量％、乳化剤を約１〜１０重量％、微量の補助剤および水などの水相媒質を含み得る。

本発明はさらに、急性皮膚反応、皮膚老化および皮膚癌からなる群から選択される一以上の症状または疾患を予防するための、本発明の方法によって生産されるＭＡＡまたは上述したマイコスポリン−グリシン−アラニンと、化粧品、医薬部外品または医薬品に許容される成分とを含む、組成物を提供する。当該組成物は、活性成分として、本発明の方法によって生産された有効量のＭＡＡを含む。

例えば、上述した本発明の組成物は、クリーム、ローション、ペースト、軟膏、エマルジョン（水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、多重エマルジョン、ミクロエマルジョン、ＰＥＴ−エマルジョン、ピッカリング・エマルジョン）、ゲル（ヒドロゲル、アルコールゲル）、懸濁液、フォーム、スプレー、錠剤または粉末などの、皮膚への適用を目的とした通常の化粧品または医薬品が取り得る形態である。

また、上述した本発明の組成物に含まれ得る化粧品、医薬部外品または医薬品に許容される成分としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ヘキサメトニウム、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、およびｍ−クレゾールなどの保存料；アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤；リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；ソルビタンエステル、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、シリコンポリオール、ポタシウムステアレートおよびエトキシル化脂肪酸エステルなどの乳化剤；乳化安定剤；アニオン性、カチオン性、非イオン性または両性ポリマー；ＥＤＴＡなどのキレート剤；油相媒質（ミネラルオイルなどの炭化水素系オイル、パラフィンワックス、天然オイル、シリコンオイル、イソプロピルパルミテートなどの脂肪酸エステル、ステアリルアルコールなどの脂肪酸アルコール）；増粘剤；保湿剤；エモリエント剤；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの界面活性剤；酸性化または塩基性化剤；香料；芳香剤；染料；着色剤；あるいは化粧品、医薬部外品または医薬品に通常配合される他の成分など、通常の化粧品、医薬部外品または医薬品の補助剤および添加剤を含み得る。

以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明の例示のために用いられるものであり、本発明の限定を意図するものではない。

（実施例１）
１．ストレプトマイセスを用いたＭＡＡの産生
本発明者らは、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）およびストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）を用いて、ＭＡＡを産生した。また、本発明者らは、菌体外培養液および菌体内におけるＭＡＡ産生量の比較を行った（図１）。

１−１．ＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
１−１−１．ストレプトマイセス・リビダンスへのＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
ＭＡＡ生合成酵素遺伝子として、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を用いた。これらの遺伝子を、ＰＬＤプロモーター（特開２００２−５１７８０号公報を参照のこと）の制御下にてｐＩＪ１０１の複製起点を有するベクターに連結し、遺伝子発現ベクターを作製した。この遺伝子発現ベクターを用いて、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１５６７５）を形質転換し、ＭＡＡ生産株を得た。ストレプトマイセス・リビダンスの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。

１−１−２．ストレプトマイセス・エバメチルスへのＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
上記遺伝子ａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）をストレプトマイセス・エバメチルスＭＡ−４６８０株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１４８９３）に、相同組換えによって導入し、ＭＡＡ生産株を得た。ストレプトマイセス・エバメチルスの相同組換えは、従来公知の方法に従って行った。

１−２．ストレプトマイセス・リビダンスおよびストレプトマイセス・エバメチルスの前培養
５ｍＬのＡＶＭ培地（以下、表１を参照のこと）に、上記１−１で作製したＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株またはストレプトマイセス・エバメチルスＭＡ−４６８０株の胞子のグリセロールストックを添加した。２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間、これらの放線菌を振盪培養した。

１−３．ストレプトマイセス・リビダンスおよびストレプトマイセス・エバメチルスの本培養
０．１％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢｔ培地（以下、表２〜４を参照のこと）に添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢｔ培地へグルコースをさらに追加した。２８℃、１６０ｒｐｍで２週間、振盪培養した。

１−４．ＭＡＡの測定
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。採取した培養液を１４０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。分離した菌体外培養液を、菌体外培養液サンプルとして用いた。分離した菌体に１ｍＬのメタノールを添加し、撹拌によって菌体を破砕した。次いで、遠心分離に供し、上清を回収した（菌体サンプル）。菌体外培養液サンプルおよび、希釈した菌体サンプルそれぞれにおける、シノリンおよびポルフィラ−３３４の生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表の通りである。

１−５．結果
ストレプトマイセス・エバメチルスＭＡ−４６８０株の結果を図１に示す。図１（Ａ）はシノリンの分布を、図１（Ｂ）はポルフィラ−３３４の分布を示す。シノリンおよびポルフィラ−３３４のいずれについても、菌体内よりも菌体外培養液中に多く分布していることが確認された。これらの結果より、培養開始から２週間の時点で、菌体外培養液中のシノリン生産量は、菌体内のシノリン生産量に比べ、約５倍であることが示された。ポルフィラ−３３４についても同様に、菌体外培養液中の生産量が菌体内の生産量に比べ、約７倍であることが示された。ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株では、培養約１週間で、菌体外に１５０ｍｇ／Ｌ、菌体内に５０ｍｇ／Ｌのシノリンが生産された。培養約２週間では、菌体外に５１０ｍｇ／Ｌ、菌体内に１０５ｍｇ／Ｌのシノリンが生産された。

（実施例２）
２．新規ＭＡＡ（マイコスポリン−グリシン−アラニン）の産生
２−１．実施例１と同様にして、ＭＡＡを生産するストレプトマイセス・エバメチルスを２週間培養した。但し、初期グルコース濃度は１００ｇ／Ｌとした。その結果、菌体外培養液中に、シノリンおよびポルフィラ−３３４に加え、新規ＭＡＡとしてマイコスポリン−グリシン−アラニンが生産された。得られたマイコスポリン−グリシン−アラニンの生産量は２５ｍｇ／Ｌであった。表５に示す条件でＨＰＬＣ分析すると、保持時間は１５分付近であった。

２−２．新規ＭＡＡ（マイコスポリン−グリシン−アラニン）の同定
上記新規ＭＡＡの同定は、以下の様に行った。分析には、フォトダイオードアレイ検出器とＨＲ−ＭＳ検出器を備えたＨＰＬＣを用い、紫外吸収スペクトルと精密質量を測定した。ＨＰＬＣ測定条件は、以下の表の通りである。

９分付近に溶出されるピークの紫外吸収スペクトルは、３３３ｎｍ付近に吸収極大を持ち、シノリン、ポルフィラ−３３４と同様の形状であった。またこのピークをＥＳＩ（フラグメンター電圧２００．０Ｖ）でイオン化し、ＴＯＦ検出器で精密質量を測定した。ｍ／ｚ（［Ｍ＋Ｈ］^＋）：３１７．１３３８（Ｃ_１３Ｈ_２１Ｎ_２Ｏ_７ ^＋に対する計算値：３１７．１３４９）。

（実施例３）
３．コリネバクテリウムを用いたＭＡＡの産生
本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いて、ＭＡＡを産生した。

３−１．ＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
３−１−１．コリネバクテリウム・グルタミカムへのＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
ＭＡＡ生合成酵素遺伝子として、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）ＤＳＭ４３８２７由来のａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）遺伝子を用いた。これらの遺伝子を、ｇａｐＡプロモーター（ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００８）８１：２９１−３０１を参照のこと）の制御下にてｐＢＬ１の複製起点を有するベクターに連結し、遺伝子発現ベクターを作製した。この遺伝子発現ベクターを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１２１６８、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）、特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）をエレクトロポレーション法によって形質転換し、ＭＡＡ生産株を得た。エレクトロポレーション法は、従来公知の方法に従って行った。

３−２．コリネバクテリウム・グルタミカムの前培養
５０ｍＬのＢＨＩ培地（以下、表７を参照のこと）に、上記３−１で作製したＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株のグリセロールストックを添加した。３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間、これらのコリネバクテリウム・グルタミカムを振盪培養した。

３−３．コリネバクテリウム・グルタミカムの本培養
３％量の前培養液を、坂口フラスコ中の５０ｍＬのＢＨＩ培地に添加した。なお、グルコン酸ナトリウムの初期濃度が２０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＢＨＩ培地へ４００ｇ／Ｌのグルコン酸ナトリウムを５ｍＬ追加した。ｐＨ調整のため、１０％炭酸カルシウム溶液を５ｍＬ添加した。３０℃、１８０ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。

３−４．ＭＡＡの測定
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。採取した培養液を１５０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。分離した菌体外培養液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過し、ろ液を菌体外培養液サンプルとして用いた。菌体外培養液サンプルにおける、シノリンおよびポルフィラ−３３４の生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は表５に記載する条件と同じである。

３−５．結果
結果を図２に示す。シノリンおよびポルフィラ−３３４のいずれについても、菌体外培養液中に存在することが確認された。

（実施例４）
４．酵母を用いたＭＡＡの産生
本発明者らは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて、ＭＡＡを産生した。

４−１．ＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
４−１−１．ＹＰＨ４９９ＸＷ株の構築
プラスミドｐＷＸ１Ｘ２ＸＫ（ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００４Ｓｅｐ；７０（９）：５４０７−１４を参照のこと）から、キシロース資化性遺伝子をコードするＸＹＬ１（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓｓｔｉｐｉｔｉｓ由来キシロースレダクダーゼ）（配列番号１３）、ＸＹＬ２（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓｓｔｉｐｉｔｉｓ由来キシリトールデヒドロゲナーゼ）（配列番号１４）、およびＸＫＳ１（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来キシルロキナーゼ）（配列番号１５）をＴＤＨ３プロモーターの制御下にてそれぞれ発現するカセットを、ＢｓｓＨＩＩで切断した。これらのカセットを、ＢｓｓＨＩＩで切断したＴＲＰ１選択マーカーを有するｐＲＳ４０４ベクター（ＡＴＣＣ寄託番号：ＡＴＣＣ８７５１５）に連結し、ゲノム組込み用ベクターｐＩＷＸ１Ｘ２ＸＫを作製した。このゲノム組込み用ベクターｐＩＷＸ１Ｘ２ＸＫをＥｃｏＲＶで処理した。得られた断片を用いて、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９株（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１９８９Ｍａｙ；１２２（１）：１９−２７）を形質転換し、キシロース資化性を有するＹＰＨ４９９ＸＷ株を得た。サッカロミセス・セレビシエの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。

４−１−２．サッカロミセス・セレビシエＹＰＨ４９９ＸＷ株へのＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
ＭＡＡ生合成酵素遺伝子ａｍｉｒ４２５６（配列番号１）およびａｍｉｒ４２５７（配列番号２）を、ＴＤＨ３プロモーターおよびＡＤＨ１プロモーターの制御下にて発現するよう、２μの複製起点およびＵＲＡ３選択マーカーを有するｐＡＴ４２６ベクター（ＦＥＭＳＹｅａｓｔＲｅｓ．２０１４Ｍａｙ；１４（３）：３９９−４１１）に連結し、遺伝子発現ベクターｐＡＴ４２６-ａｍｉｒ４２５６-７を作製した。また、ＭＡＡ生合成酵素遺伝子ａｍｉｒ４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ４２５９（配列番号４）を、ＴＤＨ３プロモーターおよびＡＤＨ１プロモーターの制御下にて２μの複製起点を有するｐＡＴ４２５ベクター（ＦＥＭＳＹｅａｓｔＲｅｓ．２０１４Ｍａｙ；１４（３）：３９９−４１１）に連結し、遺伝子発現ベクターｐＡＴ４２５-ａｍｉｒ４２５８-９を作製した。これらの遺伝子発現ベクターｐＡＴ４２６-ａｍｉｒ４２５６-７およびｐＡＴ４２５-ａｍｉｒ４２５８-９を用いて、ＹＰＨ４９９ＸＷ株を形質転換し、ＭＡＡ生産株であるＹＰＨ４９９ＸＷＭＡＡ株を得た。サッカロミセス・セレビシエの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。

４−２．ＹＰＨ４９９ＸＷＭＡＡ株の前培養
上記５−１で作製したＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する、ＹＰＨ４９９ＸＷＭＡＡ株のグリセロールストックを、ＳＤ-ＬＵＷ寒天培地（以下、表８を参照のこと）上で培養した。その後、５ｍＬのＳＸ-ＬＵＷ液体培地（以下、表９を参照のこと）に得られたコロニーを植菌した。３０℃、１５０ｏｐｍで１３日間、振盪培養した。

４−３．ＹＰＨ４９９ＸＷＭＡＡ株の本培養
２％量の前培養液を、３００ｍＬバッフル付フラスコ中の１００ｍＬのＳＤ-ＬＵ液体培地に添加した。３０℃、１５０ｒｐｍで４８時間、振盪培養した。

４−４．ＭＡＡの測定
１３日間培養後、培養液４ｍＬを採取し、６００ｎｍでの濁度を測定した。採取した培養液を３，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。分離した菌体外培養液をＰＴＦＥフィルター（０．４５μｍ）に通し、得られた溶液を菌体外培養液サンプルとして用いた。

４−５．結果
菌体外培養液のＭＡＡ濃度を測定した。結果、０．１９ｍｇ／Ｌのシノリンが菌体外に生産された。

（実施例５）
５．ラビリンチュラ類を用いたＭＡＡの産生
本発明者らは、ラビリンチュラ類を用いて、ＭＡＡを産生した。

５−１．ＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
５−１．ラビリンチュラ類へのＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍｓｐ．）ＳＡＭ２１７９株（ＦＥＲＭＢＰ−５６０１）用に、上記遺伝子ａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）のコドンを改変した（それぞれ、配列番号９〜１２）。改変したこれらの遺伝子を相同組換えによってオーランチオキトリウムＳＡＭ２１７９株に導入し、ＭＡＡ生産株を得た。ラビリンチュラ類の相同組換えは、従来公知の方法に従って行った。

５−２．オーランチオキトリウムの前培養
１．５％寒天を含むＧＹ海水培地プレート（以下、表１０を参照のこと）に、上記５−１で作製したＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する、オーランチオキトリウムＳＡＭ２１７９株のグリセロールストックを添加した。２８℃で２日間、このオーランチオキトリウムを培養した。

５−３．オーランチオキトリウムの本培養
１０ｍＬのＧＹ海水培地（以下、表１１を参照のこと）で、上記５−２で前培養したオーランチオキトリウムを２８℃、３００ｒｐｍで５日間、振盪培養した。

５−４．ＭＡＡの測定
本培養の後、培養液を１５０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。分離した菌体外培養液を孔径０．２μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過し、得られた溶液を菌体外培養液サンプルとして用いた。菌体外培養液サンプルにおける、シノリンの生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は表５に記載する条件と同じである。

５−５．結果
菌体外に１．５ｍｇ／Ｌのシノリンが生産された。

（実施例６）
６．大腸菌を用いたＭＡＡの生産
本発明者らは、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）を用いて、ＭＡＡを産生した。

６−１．ＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
６−１−１．エシェリヒア・コリへのＭＡＡ生合成酵素遺伝子の導入
上記ＭＡＡ生合成酵素遺伝子として、ａｍｉｒ＿４２５６（配列番号１）、ａｍｉｒ＿４２５７（配列番号２）、ａｍｉｒ＿４２５８（配列番号３）およびａｍｉｒ＿４２５９（配列番号４）を用いた。これらの遺伝子を、ｔａｃプロモーターの制御下にてｐＢＲ３２２の複製起点を有するベクターｐｋｋ２２３−３（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．Ｍ７７７４９）に連結し、遺伝子発現ベクターを作製した。この遺伝子発現ベクターを用いて、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製、製品コード：９０５２）を形質転換し、ＭＡＡ生産株を得た。エシェリヒア・コリの形質転換は、従来公知の方法に従って行った。

６−２．エシェリヒア・コリの前培養
５ｍＬのＬＢ培地（以下、表１２を参照のこと）に、上記６−１で作製したＭＡＡ生合成酵素遺伝子を有する、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株のグリセロールストックを添加した。３７℃、１６０ｒｐｍで１８時間、これらのエシェリヒア・コリを振盪培養した。

６−３．エシェリヒア・コリの本培養
２％量の前培養液を、５００ｍＬバッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＬＢ培地へ植菌した。なお、グルコン酸ナトリウムの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＬＢ培地へグルコン酸ナトリウムを追加し（終濃度５０ｇ/Ｌ）、炭酸カルシウムを終濃度０．５％となるようにさらに追加した。３０℃、１６０ｒｐｍで１週間、振盪培養した。

６−４．ＭＡＡの測定
本培養の開始から２４時間後に培養液１ｍＬを採取し、１４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。分離した菌体外培養液を、菌体外培養液サンプルとして用いた。菌体外培養液サンプルにおける、シノリンの生産量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は表５に記載する条件と同じである。

６−５．結果
菌体外培養液のＭＡＡ濃度を測定した。結果、０．８２ｍｇ／Ｌのシノリンが菌体外に生産された。

以上より、微生物を用いてＭＡＡを産生させ、菌体外培養液からＭＡＡを回収できることが示された。また、新規ＭＡＡであるマイコスポリン−グリシン−アラニンを取得できることが示された。本方法によれば、菌体外培養液からＭＡＡを得ることができるため、その後の精製工程との関連で非常に有利である。

本発明の方法によれば、微生物を用いて安定的かつ大量にＭＡＡを生産することができる。また、そのようにして得られたＭＡＡは、紫外線吸収用組成物の有効成分として利用可能である。従って、本発明は、化粧品および医薬品などの分野において利用可能である。

SEQ ID NO:9: Codon-optimized amir_4256 for SAM2179
SEQ ID NO:10: Codon-optimized amir_4257 for SAM2179
SEQ ID NO:11: Codon-optimized amir_4258 for SAM2179
SEQ ID NO:12: Codon-optimized amir_4259 for SAM2179

Claims

マイコスポリン様アミノ酸を生産する方法であって、
マイコスポリン様アミノ酸を菌体外に産生する微生物を培養する工程、
菌体と菌体外培養液を分離する工程、および
菌体外培養液からマイコスポリン様アミノ酸を回収する工程
を含む、方法。
回収したマイコスポリン様アミノ酸を精製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
微生物が大腸菌、酵母、放線菌、微細藻類またはラビリンチュラ類に属する微生物である、請求項１または２に記載の方法。
微生物が放線菌である、請求項３に記載の方法。
放線菌が、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノシネマ（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ）属、シュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属またはコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属である、請求項４に記載の方法。
微生物がラビリンチュラ類であって、該ラビリンチュラ類がオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属である、請求項３に記載の方法。
微生物が酵母であって、該酵母がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属である、請求項３に記載の方法。
微生物が異種由来のマイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子群を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
マイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子群が、アクチノシネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍ）由来のａｍｉｒ＿４２５６、ａｍｉｒ＿４２５７、ａｍｉｒ＿４２５８およびａｍｉｒ＿４２５９遺伝子である、請求項８に記載の方法。
マイコスポリン様アミノ酸生合成酵素遺伝子群の少なくとも１つの遺伝子のコドンが、導入される微生物用に改変されている、請求項８に記載の方法。
微生物が、ストレプトマイセス・エバメチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１４８９３）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１５６７５）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株）（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ１２１６８）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ＳＡＭ２１７９株（ＦＥＲＭＢＰ−５６０１）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰＨ４９９ＸＷ株である、請求項９または１０に記載の方法。
下記、式１で表されるマイコスポリン様アミノ酸。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生産される、請求項１２に記載のマイコスポリン様アミノ酸。
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生産されるマイコスポリン様アミノ酸、または請求項１２もしくは１３に記載のマイコスポリン様アミノ酸と、化粧品、医薬部外品もしくは医薬品に許容される成分とを含む、紫外線吸収用組成物。
急性皮膚反応、皮膚老化および皮膚癌からなる群から選択される一以上の症状または疾患を予防するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生産されるマイコスポリン様アミノ酸、または請求項１２もしくは１３に記載のマイコスポリン様アミノ酸と、化粧品、医薬部外品もしくは医薬品に許容される成分とを含む、組成物。