ES2735289T3 - Proteínas de unión a cdim y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CDIM, que comprende: (a) una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable mostrada en la SEQ ID NO: 1; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable mostrada en la SEQ ID NO:24.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a cdim y usos de las mismas

LISTADO DE SECUENCIAS

La aplicación instantánea contiene un listado de secuencias que ha sido enviado en formato ASCII.

I. Campo

La presente descripción se refiere a proteínas de unión a la molécula inductora de muerte celular (en lo sucesivo, "CDIM") y a sus composiciones farmacéuticas. En particular, la descripción proporciona proteínas de unión a CDIM que son útiles en el agotamiento y la destrucción selectiva de células B, incluidas las células B neoplásicas, así como otras células neoplásicas que expresan antígenos similares a CDIM o CDIM. La descripción también proporciona polinucleótidos que codifican las proteínas de unión a CDIM descritas, y sistemas de expresión para producir las mismas. Además, en la presente descripción se abarcan las proteínas de unión a CDIM para su uso en procedimientos de tratamiento de pacientes con enfermedades proliferativas de células B y mediadas por células B mediante la administración de las proteínas de unión a CDIM. La descripción contempla además ensayos de diagnóstico para identificar poblaciones de pacientes que pueden tratarse con las proteínas de unión a CDIM.

II. Antecedentes

La principal responsabilidad de llevar a cabo las funciones del sistema inmune es de los glóbulos blancos llamados linfocitos. Los linfocitos se pueden clasificar en dos clases principales, es decir, células T y células B. Las células T (es decir, los linfocitos T) se originan a partir de células madre en la médula ósea, se desarrollan en la glándula del timo y secretan linfoquinas. Las células B (es decir, los linfocitos B) se originan a partir de células madre en la médula ósea y son la fuente de anticuerpos. De hecho, las células B generan cinco tipos diferentes de anticuerpos que incluyen IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. Estos anticuerpos pueden neutralizar sustancias que pueden desencadenar una respuesta inmune, es decir, antígenos, al unirse a sitios específicos en los antígenos para bloquearlos. IgM es el anticuerpo más grande y el anticuerpo primario contra los antígenos A y B en los glóbulos rojos. Estructuralmente, la IgM forma polímeros donde múltiples inmunoglobulinas están unidas covalentemente con enlaces disulfuro, principalmente como un pentámero pero también como un hexámero. IgM tiene una masa molecular de aproximadamente 900 kDa en su forma pentamérica. Debido a que cada monómero tiene dos sitios de unión a antígeno, una IgM pentamérica tiene diez (10) sitios de unión.

Numerosas enfermedades están asociadas con células B alteradas o disfuncionales que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades autoinmunes y cáncer. La proliferación y diferenciación de las células B está regulada por receptores localizados en la superficie celular. El compromiso de estos receptores induce la activación de proteínas de señalización intracelular que transmiten las señales del receptor a objetivos específicos dentro de la célula que controlan las respuestas celulares. Muchas proteínas de señalización son los productos de los oncogenes y muchos oncogenes están asociados con la tumorgénesis. Los mecanismos moleculares de las vías de señalización que controlan la proliferación y diferenciación de las células B todavía se están estudiando (Jumaa y col. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23:415-445).

Un ejemplo de una enfermedad que implica los linfocitos B neoplásicos es la leucemia linfoplástica aguda (LLA). Algunos avances en la lucha contra esta enfermedad se deben a la intensificación de la quimioterapia, así como a mejores cuidados paliativos para la LLA tanto pediátrica como en adultos. Si bien el riesgo de recaída es menor en la población pediátrica, tanto los pacientes pediátricos como los adultos se enfrentan a resultados terribles si la enfermedad reaparece. Menos de un tercio de los niños y pocos adultos con LLA recidivante sobreviven a esta enfermedad a pesar del uso de regímenes agresivos y el trasplante de células madre. Por lo tanto, se necesitan nuevas terapias que vayan más allá de la quimioterapia convencional. Para la LLA, hay datos clínicos preclínicos y tempranos con una diversidad de anticuerpos monoclonales que incluyen rituximab, epratuzumab y gemtuzumab, lo que sugiere que el uso de anticuerpos monoclonales solos o en combinación con quimioterapia estándar es una opción de tratamiento viable.

La patente de los EE. UU. n.° 5.593.676 describe formas de inducir la muerte celular en células B neoplásicas mediante el uso de reactivos que se unen a un epítopo específico de células B llamado molécula inductora de muerte celular (CDIM). En este documento, el epítopo de oligosacárido específico de células B CDIM se usa como un marcador de células B neoplásicas. Los anticuerpos IgM específicos para este marcador se administran a un huésped. in vivo para inducir la muerte en las células B neoplásicas. El mismo concepto se puede aplicar en situaciones clínicas ex vivo para eliminar selectivamente las células B. Un anticuerpo monoclonal humano (es .decir, MAb 216), que reconoce el epítopo de células B CDIM es citotóxico para las células B neoplásicas y normales y se une a todos los linfocitos CD19+ y CD20+ B en la sangre periférica humana y el bazo. Además, el MAb 216 no distingue las células B por el isotipo expresado, uniéndose a las células IgG+ e IgM+ con igual intensidad. MAb 216 también se une a todas las células B, independientemente de su expresión de CD5. Por lo tanto, MAb 216, es útil en el diagnóstico y la terapia. Véase, también Bhat y col. (2000), Scand. J. Immunol. 51:134-140 y Bhat y col. (2001), Critical Reviews in Oncology/Hematology 39: 59-68 y Bhat y col. (2000), Blood 96: 731a.

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad en la técnica de identificar anticuerpos que sean específicos para que las células B los maten y/o eliminen de forma selectiva del huésped con una reducción de la unión inespecífica y/o los efectos secundarios que dañan el tejido. La terapia del cáncer todavía tiene una gran necesidad de tales anticuerpos terapéuticos. La presente solicitud aborda esta necesidad.

III. Breve descripción de las figuras

La presente descripción se entiende mejor cuando se lee junto con las figuras adjuntas, que sirven para ilustrar las realizaciones. Sin embargo, se debe comprender que la descripción no se encuentra limitada a las realizaciones específicas descritas en las figuras.

Las figuras 1A-D representan las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada (SEQ ID NO:1-22) que son representativas de las proteínas de unión a CDIM descritas en este documento. Se muestran las tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y las regiones marco de la región variable de la cadena pesada (FR1, FR2 y FR3), y J^h (región de unión).

La figura 1E representa las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera (SEQ ID NO:23 y 24) que son representativas de las proteínas de unión a CDIM descritas en este documento. Se muestran las tres regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) y las regiones marco de la región variable de la cadena ligera (FR1, FR2 y FR3), y J^l (región de unión).

La figura 1F representa las secuencias de aminoácidos de una región constante de la cadena pesada (Igp) (SEQ ID NO:25) y dos regiones constantes de la cadena ligera (IgA e IgK, respectivamente) (SEQ ID NO:26 y 27) utilizadas en los ejemplos representativos descritos en este documento.

Las figuras 2A-2V representan las secuencias de aminoácidos completas de los 44 anticuerpos anti-CDIM descritos en este documento, designados de IGM1 a IGM44. Los 44 anticuerpos descritos se forman combinando cada una de las 22 cadenas pesadas descritas (SEQ ID NO:28-49) con cada una de las dos cadenas ligeras descritas (SEQ ID NO:50 y 51).

La figura 3 representa las secuencias CDR3 de las proteínas de unión a CDIM representativas de H1 a H22 descritas en este documento. Los restos de arginina de las diversas secuencias están subrayados.

Las figuras 4A-K representan las secuencias de polinucleótidos ejemplares (SEQ ID NO:52-73) que codifican las 22 cadenas pesadas de las proteínas de unión a antígeno descritas en este documento.

La figura 4L representa las secuencias de polinucleótidos ejemplares (SEQ ID NO:74 y 75) que codifican las dos cadenas ligeras, lambda y kappa, de las proteínas de unión a antígeno descritas en este documento.

La figura 5 representa geles de SDS nativos de extractos celulares brutos de células CHO que expresan de H1 a H7 (panel A) y de H9 a H21 (panel B), respectivamente. La banda a 1.048 kD representa pentámeros IgM, mientras que la banda a 1.236 kD representa hexámeros IgM.

La figura 6 ilustra la unión de las proteínas de unión a CDIM a CDIM expresada en una línea de células B humanas y los resultados de citotoxicidad posteriores para los anticuerpos descritos. Los cultivos celulares se recolectaron y analizaron por citometría de flujo utilizando (1) la intensidad de fluorescencia media para cuantificar la unión y (2) la absorción de yoduro de propidio para distinguir las células vivas de las células muertas. Como se muestra en la figura 6A, todos los anticuerpos probados se unen a la línea de células B humanas que expresan CDIM, NALM-6 en un amplio intervalo de dosis. La figura 6B muestra los resultados de la citotoxicidad después de la unión de los anticuerpos al epítopo CDIM.

La figura 7muestra los resultados de la citotoxicidad después de la unión de los anticuerpos al epítopo CDIM. La figura 8, paneles A-E representan datos de unión basados en ELISA que son representativos de las proteínas de unión a CDIM a antígenos distintos de CDIM. Los resultados utilizando los antígenos ADN monocatenario (ss ADN), ADN bicatenario (dsADN), lípido A, cardiolipina y LDL maleonaldehído (MDA-LDL) se muestran en los paneles A-E, respectivamente. Como se muestra, el MAb 216 se une a todos los antígenos en un amplio intervalo de dosis en comparación con todos los anticuerpos descritos que demuestran una unión marcadamente reducida o una falta total de unión a estos antígenos seleccionados.

La figura 9, paneles A-F representan datos de unión basados en ELISA que son representativos de las proteínas de unión a CDIM a antígenos distintos de CDIM. Los resultados utilizando los antígenos ADN monocatenario (ssADN), ADN bicatenario (dsADN), lipopolisacárido, cardiolipina, condoitrina y heparán se muestran en los paneles A-F, respectivamente. Como se muestra, el MAb 216 se une a todos los antígenos en un amplio intervalo de dosis en comparación con todos los anticuerpos descritos que demuestran una unión marcadamente reducida o una falta total de unión a estos antígenos seleccionados.

IV. Descripción detallada de la invención

Los encabezados de sección utilizados en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita

A menos que se indique lo contrario en este documento, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente solicitud tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de ácidos nucleicos y proteínas e hibridación descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Los procedimientos y técnicas de la presente solicitud se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(1990). Las técnicas de purificación y reacciones enzimáticas se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante, tal como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en este documento. La terminología utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y medicinal descritas en este documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se pueden usar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro y tratamiento de pacientes.

Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares, etc., descritos en este documento y como tales pueden variar. La terminología usada en este documento tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de lo descrito, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Aparte de en los ejemplos operativos, o cuando se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en este documento deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente", cuando se utiliza en relación con porcentajes, puede significar /-1 %.

Descripción general

La presente descripción proporciona materiales y procedimientos relacionados con el tratamiento o el diagnóstico de enfermedades proliferativas que implican células que expresan el antígeno CDIM. En particular, la descripción proporciona proteínas de unión a CDIM con un rendimiento ex vivo e in vivomejorado que son útiles en la destrucción selectiva y/o el agotamiento de las células B neoplásicas, específicamente en pacientes que padecen una afección caracterizada por enfermedades proliferativas de células B y mediadas por células B. Además, las proteínas de unión a CDIM son útiles para tratar tumores sólidos que expresan el antígeno CDIM. Las proteínas de unión a CDIM descritas pueden usarse solas, o en combinación con moléculas quimioterapéuticas pequeñas. Como resultado de un efecto inductor de poro único de las proteínas de unión a CDIM descritas, es decir, la herida de membrana, las células objetivo se vuelven más accesibles a las moléculas quimioterapéuticas. Por lo tanto, las proteínas de unión descritas son particularmente adecuadas para tratar células por lo demás resistentes a compuestos de moléculas pequeñas en combinación con las mismas.

Definiciones

Los siguientes términos utilizados en este documento tendrán el significado que se indica a continuación.

El término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmune específica y de reaccionar con un anticuerpo específico.

La "proteína de unión a antígeno" o "proteína de unión a CDIM", como se usa en este documento, es una proteína de andamiaje que tiene una actividad de unión similar a un anticuerpo o un anticuerpo, es decir, un anticuerpo anti-CDIM.

El término "CDIM" ("molécula inductora de muerte celular"), como se usa en este documento, se refiere a un glicoformo de poli n-acetil lactosamina unido a moléculas de superficie celular. El epítopo CDIM se encuentra en casi todos los linfocitos B periféricos y linfocitos B esplénicos y en determinadas líneas de linfoma de células B cultivadas. El epítopo también se encuentra en los linfomas primarios de células B de diversas clasificaciones histopatológicas y en las células de algunos tumores sólidos.

En términos más específicos, el epítopo CDIM es un antígeno de lactosamina de células B lineales (es decir, un determinante de poli-N-acetil lactosamina tipo 2, con o sin un ácido siálico terminal) que tiene una conformación estructural tridimensional y es sensible a la enzima endo-beta-galactosidasa. El epítopo no tiene ramificaciones ni sustituciones y se puede unir a un glicolípido o una glicoproteína. En las glicoproteínas, el epítopo podría ramificarse de un marco de manosa (por ejemplo, la enzima MGAT4), o podría ser una cadena larga que se ramifica de una estructura "I grande", pero normalmente es al menos aproximadamente cuatro restos hexosa en una cadena lineal (es decir, tipo 2) después de la rama Gal (31-4 GlcNac (31-3 Gal (31-4 Glc (31; al menos aproximadamente seis hexosas para una buena afinidad; y al menos aproximadamente doce hexosas en la forma más larga. La cadena está hecha por enzimas. (por ejemplo , B3GNT1, B4GALT1), que agregan azúcares alternos al epítopo. En particular, el epítopo glicosilado C^{d i}M está presente en múltiples proteínas que van desde pesos moleculares de aproximadamente 20KD a más de aproximadamente 200KD de proteínas.

El epítopo CDIM se ha dilucidado aún más porque la glicoforma del antígeno está cubierta con ácido siálico, lo que lo convierte en un tipo de glicosilación más maduro.

El término "epítopo" generalmente se refiere a parte de un antígeno (es decir, el determinante antigénico de una molécula), que es reconocido por el sistema inmune. Un epítopo puede estar compuesto de azúcares, lípidos y/o aminoácidos o mezclas de los mismos. El epítopo es reconocido por las células inmunes, como las células T específicas, las células B y/o los anticuerpos producidos por las células B. Cuando las células inmunes reconocen y son activadas por epítopos específicos, producen una respuesta inmune. Alternativamente, cuando los anticuerpos reconocen y se unen a epítopos específicos, las células que llevan los epítopos se pueden agotar, matar, desactivar, herir, eliminar y/o alterar.

El término "proteína de andamiaje" o "proteína de unión a antígeno", como se usa en este documento, significa un polipéptido o proteína con áreas de superficie expuestas en las que las inserciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos son altamente tolerables. Los ejemplos de proteínas de andamiaje que pueden usarse según la presente invención son la proteína A de Staphylococcus aureus, la proteína de unión de bilina de Pieris brassicae u otras lipocalinas, proteínas de repetición de anquirina y fibronectina humana (revisado en Binz y Plückthun (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16:459-69). La ingeniería de una proteína de andamiaje se puede considerar como injertar o integrar una función de afinidad en o dentro del marco estructural de una proteína plegada de forma estable. La función de afinidad significa una afinidad de unión a proteínas según la presente invención. Un andamio puede ser estructuralmente separable de las secuencias de aminoácidos que confieren especificidad de unión. En general, las proteínas que parecen adecuadas para el desarrollo de dichos reactivos de afinidad artificial pueden obtenerse mediante técnicas de ingeniería de proteínas racionales, o más comúnmente, combinadas, tales como la exploración contra CDIM, ya sea proteína purificada o proteína expuesta en la superficie celular, para agentes aglutinantes en una biblioteca artificial de andamios mostrada in vitro, habilidades que se conocen en la técnica (Skerra, A. (2000) J. Mol. Recog. 13:167-187; Binz y Plückthun, mencionado anteriormente).Además, una proteína de andamiaje que tiene una actividad de unión similar a un anticuerpo puede derivarse de un polipéptido aceptor que contiene el dominio de andamio, que puede injertarse con dominios de unión de un polipéptido donante para conferir la especificidad de unión del polipéptido donante sobre el dominio de andamio que contiene el polipéptido aceptor. Dichos dominios de unión insertados pueden ser, por ejemplo, la región determinante de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo, en particular un anticuerpo anti-CDIM. La inserción puede lograrse mediante diversos procedimientos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo, por ejemplo, síntesis de polipéptidos, síntesis de ácidos nucleicos de un aminoácido codificante, así como mediante diversas formas de procedimientos recombinantes bien conocidos por los expertos en la materia. De manera importante, el término "cadena pesada" o "cadena ligera" debe entenderse en términos generales como una proteína de andamiaje, que incluye una o varias de las CDR descritas, en lugar de limitarse al significado tradicional del término en el contexto de la tecnología de anticuerpos.

Además, el término "anticuerpo" o "anticuerpo de unión a CDIM", como se usa en este documento, significa un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humanizado (Jones y col. (1986) Nature 321:522-525 ; Riechmann y col. (1988) Nature 332:323-329 ; y Presta (1992) Curr. Op. Struct.

Biol. 2:593-596), un anticuerpo quimérico (Morrison y col. (1984) Proc. Natl Acad Sci. USA 81:6851-6855), un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo un anticuerpo biespecífico) formado a partir de al menos dos anticuerpos, o un fragmento de anticuerpo del mismo. La expresión "fragmento de anticuerpo" comprende cualquier porción de los anticuerpos mencionados anteriormente, preferentemente su unión a antígeno o regiones variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')² , fragmentos Fv, diacuerpos (Hollinger y col. (1993) Proc. Natl Acad Sci. USA 90:6444-6448), moléculas de anticuerpo de cadena única (Plückthun en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg y Moore, EDS, Springer Verlag,

NY (1994), 269-315) y otros fragmentos, siempre y cuando presenten la capacidad deseada de unirse a CDIM.

Además, el término "anticuerpo" o "anticuerpo de unión a CDIM", como se usa en este documento, puede incluir moléculas similares a anticuerpos que contienen subdominios de anticuerpos diseñados por ingeniería genética o variantes de anticuerpos naturales. Estas moléculas similares a anticuerpos pueden ser anticuerpos de un solo dominio, V ^h o V^l derivados ya sea de fuentes naturales como los camélidos (Muyldermans y col. (2001) Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302) o a través de la presentación de bibliotecas in vitro de seres humanos, camélidos u otras especies (Holt y col. 2003 T rends Biotechnol. 21:484-90).

Según la presente invención, el "fragmento Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de antígenos y de unión. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación fuerte, no covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio variable (CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de cadena pesada; CDRL1, CDRL2 y CDRL3 de cadena ligera) interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero de V^h-V^l. De forma conjunta, las seis

CDR confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno. El "fragmento Fab" contiene además el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. El "fragmento Fab" se diferencia del "fragmento Fab'" por la adición de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. El "fragmento F(ab')²" originalmente se produce como un par de "fragmentos Fab''" que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. Los expertos en la materia conocen procedimientos para preparar tales fragmentos de anticuerpos, como la digestión con papaína o pepsina.

En alguna realización de la presente invención, el anticuerpo anti-CDIM es del tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, preferentemente del tipo IgG o IgM, que incluye, pero no se limita al tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 e IgM2. En la mayoría de las realizaciones, el anticuerpo es del tipo IgM. La cadena ligera puede ser una lambda-1, lambda-2 o una kappa. Una cadena J puede ser incluida u omitida.

IgG tiene varios subtipos, incluidos, pero no se limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los subtipos de IgA incluyen IgA1 e IgA2. En los seres humanos, el isotipo IgA contiene cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos

IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene diez o doce cadenas pesadas y diez o doce cadenas ligeras (pentamérico o hexamérico). En las moléculas de IgM de origen natural, la cadena J estabiliza la configuración pentamérica.

La región C de la cadena pesada comprende típicamente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. La cantidad de dominios de la región constante de la cadena pesada dependerá del isotipo. En una realización, las proteínas de unión a CDIM son del subtipo IgM. Dentro de las cadenas ligera y pesada de longitud completa, las regiones variable y constante pueden unirse por una región "J" de aproximadamente doce o más aminoácidos, e incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más.

(Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., Cap. 7 (Paul, W., ed.) (1989) Nueva York: Raven Press).

Las proteínas de unión a CDIM

Un primer aspecto de la presente descripción se refiere a una proteína de unión aislada que se une al epítopo CDIM en linfocitos B periféricos humanos, linfocitos B esplénicos, linfocitos B neoplásicos y algunos tumores sólidos.

La presente invención se refiere en una realización a una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CDIM, que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable mostrada en la SEQ ID NO: 1; y

(b)

una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable mostrada en la SEQ ID N 24.

En la presente descripción, se describen proteínas de unión a antígeno adicionales que comprenden una cadena pesada que comprende a al menos una de una CDRH1, CDRH2 y CDRH3 que tienen una secuencia que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO:1-22, y/o una cadena ligera que comprende al menos una de una CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que se muestran en la SEQ ID NO:23 o 24. Por ejemplo, (a) la proteína de unión a antígeno comprende una cadena pesada que comprende al menos una CDRH3 que se muestra en la SEQ ID NO:1-22, y una cadena ligera, o, (b) la proteína de unión a antígeno comprende cada una una CDRH1, CDRH2, y CDRH3 que se muestra en la SEQ ID NO:1-22, y una cadena ligera, o (c) la proteína de unión a antígeno comprende además una CDRL1, una CDRL2 y una CD^r L3 de la SEQ ID NO:23 o 24, incrustadas en la cadena ligera, o (d) la proteína de unión a antígeno tiene además una FR1 que se muestra en la SEQ ID NO:1-22, incrustada en la cadena pesada.

Por ejemplo, la proteína de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena pesada que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO:1-22. Además, la descripción incluye una realización donde la proteína de unión a antígeno comprende una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO:23 o 24. Además, la descripción contempla una proteína de unión a antígeno que comprende una región variable de la cadena pesada que se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO:1-22, y una región variable de la cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO:23 o 24.Las figuras 1A-D ilustran las 22 regiones variables de la cadena pesada únicas ejemplares de las proteínas de unión a CDIM descritas en este documento. La figura 1E representa dos regiones variables de la cadena ligera (SEQ ID NO:23 y 24). La figura 1F muestra una región constante para la cadena pesada (Igp) (SEQ ID NO:25), así como regiones constantes para las cadenas ligeras (IgA e IgK) (SEQ ID NO:26 y 27). SEQ ID NO: 108 representa el MAb 216 (Bhat y col, 2000, mencionado anteriormente), un anticuerpo de unión a CDIM, que se usó como anticuerpo de referencia experimental para evaluar la potencia y la especificidad. Véase, los Ejemplos a continuación

Cada una de las regiones variables de la cadena pesada se puede unir a una región constante de la cadena pesada para formar una cadena pesada completa, y cada región variable de la cadena ligera se puede unir a una región constante de la cadena ligera para formar una cadena ligera completa, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas completas ejemplares descritas en este documento tienen una secuencia que se muestra en la SEQ ID NO:28-49. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras ejemplares descritas en este documento tienen una secuencia que se muestra en la SEQ ID NO:50 y 51. Como se explica, anteriormente dos secuencias de cadena pesada y dos de cadena ligera pueden formar un tetrámero de anticuerpos completo. A continuación se describen en este documento, entre otros, los tetrámeros de anticuerpos de unión a CDIM ejemplares, designados como IGM1, IGM2, IGM3, IGM4, IGM5, IGM6, IGM7, IGM8, IGM9, IGM10, IGM11, IGM12, IGM13, IGM14, IGM15, IGM16, IGM17, IGM18, IGM19, IGM20, IGM21, IGM22, IGM23, IGM24, IGM25, IGM26, IGM27, IGM28, IGM29, IGM30, IGM31, IGM32, IGM33, IGM34, IGM35, IGM36, IGM37, IGM38, IGM39, IGM40, IGM41, IGM42, IGM43, e IGM44 también denominados colectivamente en este documento "IGM1-IGM44"). Como se muestra en las figuras 2A-2V, estas 44 proteínas de unión a CDIM descritas comprenden las cadenas pesadas de la SEQ ID NO:28-49, cada una combinada con cualquiera de las cadenas ligeras de la SEQ ID NO:50-51. Las Tablas 3, a continuación, muestran la correlación entre los diversos polipéptidos y polinucleótidos de la SEQ ID NO y las proteínas de unión al antígeno IGM1-IGM44.

En la presente descripción, la proteína de unión a antígeno aislada se une a CDIM y comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada X¹X²X³AX⁴GX⁵SX⁶X⁷, donde:

X¹ es una G A o una R;

X2 es una R, una G o una A;

X3 es una M, una T o una R;

X₄ es una R, una W o una Y;

X5 es una A, una S o una G;

X6 es una I, una V o una Y; y

X7 es una N, o ningún aminoácido:

y donde hay una arginina, y no más de una, dentro de las posiciones 1 a 3 (en relación con la región variable de la cadena pesada, las posiciones 98 a 100, siendo la posición 97 la arginina invariable que precede a la región CDR3.

En otra realización de la descripción, la proteína de unión a antígeno aislada se une a CDIM y comprende una secuencia de CDR3 de cadena pesada X¹X²X³AX⁴GX⁵SX⁶X⁷ , donde:

X1 es una G A o una R;

X2 es una R, una G o una A;

X3 es una M, una T o una R;

X4 es una R, o una W;

X5 es una A o una S;

X6 es una I, o una V; y

X7 es una N, o ningún aminoácido:

y donde hay una arginina, y no más de una, dentro de las posiciones 1 a 3 (en relación con la región variable de la cadena pesada, las posiciones 98 a 100, siendo la posición 97 la arginina invariable que precede a la región CDR3. Según la presente invención, debe entenderse que la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión de la invención no está limitada a los veinte aminoácidos convencionales (Véase, Immunology-A Synthesis (2a edición, ES Golub y D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)),). Por ejemplo, los aminoácidos pueden incluir estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a, a-disustituidos, aminoácidos N-alquilo, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales, que también pueden ser componentes adecuados para la proteína de unión de la invención, incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares, por ejemplo, 4-hidroxiprolina.

Además, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO:1-51 que están incluidas en la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan al menos el 75 %, más preferentemente al menos el 80 %, el 90 %, el 95 %, y lo más preferentemente, el 99 % de las secuencias que se muestran en las SEQ ID NO:1-51. Las variaciones pueden producirse dentro de las regiones marco (es decir, fuera de las CDR), dentro de las CDR, o dentro de las regiones marco y las CDR. Las variaciones preferidas en las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO:1-51, es decir, las deleciones, inserciones y/o reemplazos de al menos un aminoácido, se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse mediante la comparación de los datos de secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o privadas. Preferentemente, se utilizan procedimientos de comparación informáticos para identificar motivos de secuencias o dominios previstos de conformación de las proteínas que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Se conocen procedimientos para identificar secuencias proteicas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, por ejemplo, Bowie y col. (1991) Science 253:164; Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton y col. 1991 Nature 354: 105. Por lo tanto, los expertos en la materia pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden utilizarse para definir dominios estructurales y funcionales según la invención.

Las variaciones especialmente preferidas en las secuencias de aminoácidos que se muestran en las SEQ ID NO:1-51, son aquellas que conducen a una susceptibilidad reducida a la proteólisis u oxidación, alteran los patrones de glicosilación o alteran las afinidades de unión o confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de la proteína de unión. En particular, se contemplan reemplazos conservadores de aminoácidos. Los reemplazos conservadores son aquellos que se llevan a cabo dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados respecto a sus cadenas laterales. Las familias de aminoácidos preferidas son las siguientes: familia ácida = aspartato, glutamato; familia básica = lisina, arginina, histidina; familia no polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y familia polar sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Las familias más preferidas son: familia alifática-hidroxi = serina y treonina; familia que contiene amida = asparagina y glutamina; familia alifática = alanina, valina, leucina e isoleucina; y familia aromática = fenilalanina, triptófano y tirosina. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente no tendrá un efecto importante sobre la unión o propiedades de la proteína de unión resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio de marco. Si un cambio de aminoácido da como resultado una proteína de unión funcional, es decir, en una proteína de unión a antígeno que se une a CDIM se puede determinar fácilmente mediante el ensayo en ELISA o FACS.

En algunas realizaciones, la proteína de unión a CDIM es una "proteína de andamiaje" que tiene una actividad de unión similar a un anticuerpo, donde una o varias CDR de las SEQ ID NO:1-24 están incrustadas en un andamio como se define, anteriormente. En algunas realizaciones, al menos CDRH3 y CDRL3 están incrustadas en el andamio. En algunas realizaciones, las seis CDR están incrustadas en el andamio. Si la proteína de andamiaje tiene actividad de unión a CDIM se puede determinar fácilmente mediante el ensayo en ELISA o la competencia FACS para la unión con MAb 216, que es un anticuerpo de unión a CDIM de origen natural, o ensayos funcionales in vitro o in vivo.

Además, según la presente invención, se aprecia que el anticuerpo de unión a CDIM de la invención es un anticuerpo completamente humano o humanizado. Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos xenogénicos, por ejemplo, los anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables murinas o de rata. La presencia de proteínas derivadas de xenogénicos tales como proteínas derivadas de ratas o murinas puede conducir a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por parte de un paciente, lo que posteriormente conduce a la rápida eliminación de los anticuerpos, pérdida de utilidad terapéutica a través de la neutralización del anticuerpo /o reacciones alérgicas graves, incluso potencialmente mortales.

Las proteínas de unión a antígeno descritas en este documento pueden ser anticuerpos o pueden derivarse de anticuerpos. En determinadas realizaciones, la estructura polipeptídica de las proteínas de unión a antígeno se basa en anticuerpos, que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en este documento "compuestos miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (a veces denominados en este documento "conjugados de anticuerpos"), y fragmentos de los mismos. Se ha demostrado que las proteínas de unión a antígeno proporcionadas en este documento se unen a epítopos CDIM en todas las células B, incluidas las células B neoplásicas y algunas células tumorales sólidas. Como se demuestra en los ejemplos, la capacidad de las células B lesionadas para repararse y sobrevivir se reduce o inhibe. Como consecuencia, las proteínas de unión a antígeno descritas son capaces de agotar y destruir las células B, incluidas las células tumorales. Las proteínas de unión a antígeno que se describen en este documento tienen una diversidad de utilidades. Algunas de las proteínas de unión a antígeno son, por ejemplo, útiles en ensayos de unión específica, purificación por afinidad de células que expresan CDIM, y en ensayos de selección para identificar células que expresan CDIM incluyendo células tumorales sólidas, células de origen B. Además, las proteínas de unión a antígeno descritas pueden usarse para el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades, tales como trastornos proliferativos de células B y enfermedades autoinmunes. Para este fin, las proteínas de unión a antígeno descritas pueden usarse solas, o en combinación con moléculas quimioterapéuticas pequeñas.

En una realización, la proteína de unión a antígeno es una proteína de unión a CDIM polivalente (es decir, proteínas de unión a CDIM con dos o más sitios de unión para el epítopo de CDIM). Como tales, las proteínas de unión funcionan como receptores con una afinidad y avidez específicas para el epítopo CDIM, generalmente al menos aproximadamente 10-6M, y más preferentemente al menos aproximadamente 10-7M. La naturaleza polivalente del receptor permite la unión simultánea de al menos dos epítopos CDIM en la superficie de la membrana celular. Se pueden usar anticuerpos de cualquiera de las familias de inmunoglobulinas, como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM; no es un requisito que el anticuerpo esté asociado con diversos procedimientos citotóxicos asociados con procedimientos particularmente iniciados por Fc. En una realización, el anticuerpo será IgM, ya que la estructura pentamérica o hexamérica de esta molécula permite la reticulación sin trabas por la interferencia estérica. En algunas realizaciones, la composición del anticuerpo es una mezcla de pentámeros IgM y hexámeros IgM, que incluyen al menos un 20 % de hexámeros, o al menos un 30 % de hexámeros, al menos un 40 % de hexámeros, al menos un 50 % de hexámeros o al menos un 60 % de hexámeros, o al menos un 70 % de hexámeros, o al menos un 80 % de hexámeros. Alternativamente, pueden usarse fragmentos de anticuerpos o alternativas sintéticas de los mismos que actúan como anticuerpos. Por ejemplo, pueden idearse pequeñas moléculas sintéticas que permitirán la unión específica y la reticulación del epítopo CDIM.

En una realización, el anticuerpo tiene la cadena J, en otra realización el anticuerpo carece de la cadena J.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo recombinante construido sobre la base de la secuencia de la línea germinal VH4-34. El gen VH4-34 (región pesada variable) es uno de los 53 genes de línea germinal de anticuerpos funcionales humanos identificados. El gen VH4-34 está presente en todos los haplotipos y no se encontró variación de secuencia en el ADN de la línea germinal que se aisló de individuos no relacionados. Los anticuerpos anti-células B VH4-34 son citotóxicos para las células B (Bhat y col. (1997) Clin. Exp. Immunol.

108:151 y Bhat y col. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 3959). Como se mencionó anteriormente, los defectos o poros de la membrana plasmática inducidos por los anticuerpos son más grandes que los formados por otras proteínas formadoras de poros bien conocidas. Al permeabilizar las células, las proteínas de unión a CDIM descritas producen un agotamiento significativo de las células seleccionadas. (véase, también la publicación de patente n.° 20100322849). Las células B que han sido permeabilizadas son más susceptibles a la acción de agentes citotóxicos adicionales, incluidos, pero sin limitarse a, isótopos radiactivos, anticuerpos citotóxicos, inmunoconjugados, conjugados de ligando, inmunosupresores, reguladores del crecimiento celular y/o inhibidores, toxinas y/o mezclas de los mismos. La membrana celular comprometida permite la entrada de agentes citotóxicos, como los agentes quimioterapéuticos, lo que aumenta la eficacia de los agentes quimioterapéuticos, incluso en células que son resistentes o impermeables a tales agentes. Cualquier célula B o célula cancerosa que exprese el epítopo CDIM o el epítopo similar a CDIM, respectivamente, puede tratarse con las proteínas de unión a CDIM y está sujeta a agotamiento y destrucción a través de las proteínas de unión a antígeno descritas.

Las proteínas de unión a CDIM de la presente descripción reconocen el epítopo CDIM en linfocitos B periféricos humanos, linfocitos B esplénicos y en linfocitos B neoplásicos, y algunos tumores sólidos. Muchos anticuerpos IgM son polirreactivos, es decir, pueden unirse a una diversidad de antígenos extraños propios y ajenos diferentes y estructuralmente no relacionados. Sin embargo, se descubrió que las proteínas de unión a antígeno descritas en este documento tienen menos reactividad a la polinización que algunos anticuerpos CDIM naturales. Como tales, las proteínas de unión a antígeno descritas están sujetas a una unión menos inespecífica, lo que las hace mejores candidatos terapéuticos y de diagnóstico para aplicaciones in vivo. Su reducida reactividad a la polinización se ilustra en las figuras 5A-5E, que muestra ejemplos de las proteínas de unión a antígeno descritas que han reducido o perdido su afinidad de unión por múltiples antígenos no CDIM, específicamente ssADN, dsADN, lípido A, cardiolipina y MDA-LDL. Esto sugiere que las proteínas de unión a CDIM descritas son más seguras para aplicaciones terapéuticas debido a que la dosis requerida para unirse a las células objetivo será menor, ya que no existe un "sumidero de antígenos" para el anticuerpo (unión a antígenos distintos de CDIM). La afinidad de un anticuerpo polirreactivo para diferentes antígenos varía hasta 1000 veces y es generalmente más baja que la de un anticuerpo monorreactivo para su antígeno. Muchos de los anticuerpos polirreactivos suelen ser de línea germinal o cerca de la línea germinal, aunque algunos tienen un pequeño número de sustituciones. Los anticuerpos polirreactivos pueden eliminarse de la circulación más rápido que los anticuerpos monorreactivos. La rápida eliminación de los anticuerpos polirreactivos puede deberse a la unión de estos anticuerpos a antígenos del huésped endógeno (véase, también Zhou y col. (2007) J. Autoimmun. 29(4):219-228). Muchos de los anticuerpos naturales son anticuerpos polireactivos, que tienen una amplia actividad antibacteriana. Esto explica en parte la actividad antibacteriana en los sueros de los recién nacidos en ausencia de estimulación antigénica conocida (véase también Zhou y col. (2007), mencionado anteriormente). Sin embargo, para fines terapéuticos, generalmente es deseable emplear anticuerpos que sean monoespecíficos y que no se eliminen con demasiada rapidez para lograr la unión y destrucción de las células B y las células cancerosas que expresan el epítopo CDIM.

En aplicaciones terapéuticas específicas, por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, es deseable que las proteínas de unión a CDIM se unan a las células B y las maten selectivamente, ya que las células B contribuyen a múltiples enfermedades autoinmunes por una diversidad de mecanismos (Browning, JL (2006) Nature (Reviews) 5:564-576). El rápido agotamiento de las células B reduce la actividad del sistema inmune, lo que a su vez reduce muchos efectos secundarios asociados, como la inflamación y el daño tisular. En el tratamiento del cáncer es deseable destruir poblaciones de células selectivas, como las células B neoplásicas o las células cancerosas para detener la hiperproliferación de estas células y la propagación del cáncer a otros órganos. En este documento, la terapia de combinación con otros agentes y fármacos contra el cáncer puede ser beneficiosa para dirigir la destrucción de células específicas. Por lo tanto, las proteínas de unión a CDIM encuentran aplicación terapéutica tanto en la enfermedad autoinmune como en el tratamiento del cáncer.

Como se analizó anteriormente, la unión de las proteínas de unión a antígeno descritas a su ligando de lactosamina lineal conduce a la ruptura de la membrana plasmática y la formación de grandes poros de membrana que resultan en la lisis celular. La combinación de vincristina, por ejemplo, y las proteínas de unión a antígeno descritas dan como resultado un mayor grado de citotoxicidad para las células B cuando se compara con el efecto aditivo de cada agente individual solo. Por lo tanto, las proteínas de unión a CDIM pueden administrarse a pacientes solas y en combinación con otro agente y/o fármacos contra el cáncer para evaluar la orientación y la eficacia del tumor. Además, las proteínas de unión a CDIM pueden administrarse a pacientes solas y en combinación con otros agentes y/o fármacos contra el cáncer para tratar y/o diagnosticar diversas enfermedades, como el cáncer y las enfermedades autoinmunes. Los ejemplos de otros agentes que podrían usarse en combinación con proteínas de unión a CDIM se muestran en la Tabla 1 a continuación:

En algunas realizaciones, una proteína de unión a antígeno de la invención está acoplada a un grupo de etiquetado. Dicha proteína de unión es particularmente adecuada para aplicaciones de diagnóstico. Como se usa en este documento, la expresión "grupo de etiquetado" se refiere a un marcador detectable, por ejemplo, un aminoácido marcado radiactivamente o un resto biotinilo que puede ser detectado por avidina conjugada (por ejemplo, estreptavidina unida a un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede ser detectada por procedimientos ópticos o colorimétricos). Diversos procedimientos para marcar polipéptidos y glicoproteínas, tales como anticuerpos, son conocidos en la técnica y pueden usarse para realizar la presente invención. Los ejemplos de grupos de etiquetado adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H,14C,15N,35S,90Y,99Tc,111 In, 125I,131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un informador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo). En determinados aspectos, puede ser deseable que los grupos de etiquetado estén unidos por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.

Alternativamente, una proteína de unión a antígeno descrita en este documento puede acoplarse a un grupo efector en otra realización preferida de la invención. Dicha proteína de unión es especialmente adecuada para aplicaciones terapéuticas. Como se usa en este documento, el término "grupo efector" se refiere a un grupo citotóxico tal como un radioisótopo o radionúclido, una toxina, un grupo terapéutico u otro grupo efector conocido en la técnica. Los ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H,14C,15N,35S,90Y,99Tc,111In,125I,131 I), caliqueamicina, análogos de dolastatina, como las auristatinas, y agentes quimioterapéuticos, como la geldanamicina y derivados de la maitansina, incluida la DM1. En determinados respectos, puede ser deseable que los grupos efectores estén unidos por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el potencial impedimento estérico.

Polinucleótidos que codifican las proteínas de unión a CDIM y sistemas de expresión

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de unión de la invención. En el contexto de la presente invención, la expresión "molécula de ácido nucleico aislada" significa un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen, la "molécula de ácido nucleico aislada" (1) no está asociada con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está unido de forma operacional a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Además, la expresión "molécula de ácido nucleico", como se menciona en este documento, significa una forma polimérica de nucleótidos de al menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido, como nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos. La expresión también incluye formas de ADN monocatenario y bicatenario.

Las secuencias de ácido nucleico completos ejemplares que codifican las secuencias de la cadena pesada de IGM1-IGM44 (SEQ ID NO:52-73) se proporcionan en las figuras 3A-K. Las secuencias de ácido nucleico completos ejemplares que codifican las secuencias de la cadena ligera de IGM1-IGM44 (SEQ ID NO:74 y 75) se proporcionan en la figura 3L. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, se pueden contemplar otros ácidos nucleicos que codifican las proteínas de unión a CDIM descritas en este documento.

En una realización de la presente invención, una molécula de ácido nucleico de la invención está unida de forma operacional a una secuencia de control. La expresión "secuencia de control", como se usa en este documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para llevar a cabo la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están unidas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotores, sitios de unión ribosomal y secuencias de terminación de la transcripción. En eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. Según la presente invención, la expresión "secuencia de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de pareja de fusión. Además, la expresión "unida de forma operacional", como se usa en este documento, se refiere a las posiciones de los componentes descritos de esta manera que están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Además, según la presente invención, una secuencia de control de expresión unida de forma operacional a una secuencia de codificación se une de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra en condiciones compatibles con la secuencia de control de expresión.

Un aspecto adicional de la presente invención es un vector que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de unión de la invención. La molécula de ácido nucleico puede unirse de forma operacional a una secuencia de control. Además, el vector puede contener adicionalmente un origen de replicación o un gen marcador de selección. Los ejemplos de vectores que pueden usarse según la presente invención son, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagos, virus, etc.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula huésped transformada con una molécula de ácido nucleico o vector de la invención. La transformación podría realizarse mediante cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como lo ejemplifican las patentes de los EE. UU. n.° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. Los procedimientos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación, encapsulación del o los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN dentro de los núcleos. Los ejemplos de células huésped que pueden usarse según la presente invención son células eucariotas de hibridomas, tales como células de mamíferos, por ejemplo, células de hámster, conejo, rata, cerdo, ratón u otros animales; células vegetales y células fúngicas, por ejemplo, maíz, tabaco, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; células procariotas tales como E. coli; y otras células utilizadas en la técnica para la producción de anticuerpos. Las líneas celulares especialmente de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluidas, pero sin limitarse a, las células de ovario de hámster chino (CHO), las células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y varias otras.

Composiciones farmacéuticas de proteínas de unión a CDIM y procedimientos de tratamiento y diagnóstico

Un aspecto adicional de la presente descripción son las composiciones farmacéuticas y de las proteínas de unión a CDIM. Las proteínas de unión se formulan como productos farmacéuticos para ser utilizados en los procedimientos de la descripción. Cualquier composición o compuesto que pueda estimular una respuesta biológica asociada con la unión de las proteínas de unión a CDIM al epítopo CDIM de los linfocitos B puede usarse como un producto farmacéutico en la descripción. Los detalles generales sobre las técnicas de formulación y administración están bien descritos en la bibliografía científica (véase," Remington's Pharmaceutical Sciences", Maack Publishing Co, Easton Pa.). Las formulaciones farmacéuticas de proteínas de unión a CDIM se pueden preparar según cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de productos farmacéuticos. Las proteínas de unión a CDIM pueden formularse para su administración de cualquier manera convencionalmente aceptable, incluyendo por inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, oral, tópica o por otras vías. A continuación se presentan algunos ejemplos ilustrativos.

Las formulaciones farmacéuticas para su administración oral pueden formularse usando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para su administración oral. Dichos vehículos permiten que las formulaciones farmacéuticas se formulen en formas de dosificación unitaria como comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas, líquidos, pastillas, geles, jarabes, pastas o suspensiones adecuadas para la ingestión por parte del paciente. Las preparaciones farmacéuticas para su uso oral se pueden obtener a través de la combinación de las proteínas de unión a CDIM con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de agregar compuestos adicionales adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o píldoras. Los excipientes sólidos adecuados son cargas de carbohidratos o proteínas que incluyen, pero no se limitan a, azúcares, incluidos lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas incluyendo arábica y tragacanto; así como proteínas como la gelatina y el colágeno. Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico o una sal de los mismos, tal como alginato de sodio. Las preparaciones farmacéuticas de la presente descripción que también pueden usarse por vía oral son, por ejemplo, cápsulas de ajuste por presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un recubrimiento tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener las proteínas de unión a CDIM mezcladas con una carga o aglutinantes como la lactosa o los almidones, lubricantes como el talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, las proteínas de unión a CDIM pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicol líquido con o sin estabilizadores.

Las suspensiones acuosas de la descripción contienen las proteínas de unión a CDIM en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen un agente de suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia, y agentes dispersantes o humectantes tales como un fosfátido natural (por ejemplo, lecitina), un producto de condensación de un óxido de alquileno con un ácido graso (por ejemplo, polioxietilenestearato), un producto de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetileno oxietanol), un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitol), o un producto de condensación de óxido de etileno con un éster parcial derivado de ácido graso y un anhídrido de hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitán). La suspensión acuosa también puede contener uno o más conservantes tales como etilo o n-propil p-hidroxi-benzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa, aspartamo o sacarina. Las formulaciones se pueden ajustar por osmolaridad.

Las suspensiones de aceite pueden formularse suspendiendo las proteínas de unión a CDIM en un aceite vegetal, como el aceite de cacahuete, el aceite de oliva, el aceite de sésamo o el aceite de coco, o en un aceite mineral como la parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante tal como cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes para proporcionar una preparación oral sabrosa. Estas formulaciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante como el ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables de la descripción adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua pueden formularse a partir de las proteínas de unión a CDIM en mezcla con un agente dispersante, de suspensión y/o humectante, y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ejemplifican a través aquellos que se describieron anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes.

Las formulaciones farmacéuticas de la proteína de unión a CDIM también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, tal como, aceite de oliva o aceite de cacahuete, un aceite mineral, tales como parafina líquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen gomas de origen natural, tales como la goma acacia y goma tragacanto, fosfatidas de origen natural, tales como lecitina de soja, ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, tales como monooleato de sorbitán, y productos de condensación de estos ésteres parciales con óxido de etileno, tales como monooleato de polioxietileno sorbitán. La emulsión también puede contener agentes edulcorantes y saborizantes. Los jarabes y elíxires se pueden formular con agentes edulcorantes, tales como, glicerol, sorbitol o sacarosa. Dichas formulaciones pueden contener también un emoliente, un conservante, un agente saborizante y un agente colorante.

Cuando las proteínas de unión a CDIM se suministran mediante inyección intravenosa, las formulaciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular según la técnica conocida con agentes de suspensión y agentes humectantes o dispersantes adecuados, que se mencionaron anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y parenteralmente aceptable. Entre los disolventes y vehículos aceptables que pueden ser empleados se encuentran el agua y la solución de Ringer, una solución isotónica de cloruro de sodio. Además, pueden emplearse convencionalmente aceites no volátiles estériles como un disolvente o medio de suspensión. A tales efectos, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico también se pueden utilizar en la preparación de inyectables.

Los procedimientos de la presente descripción tratan a pacientes humanos y no humanos que padecen cáncer linfoide o leucemia (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de células B o LLA), cualquier forma de enfermedad autoinmune que involucre células B (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico o LES), cualquier forma de hiperproliferación de células B, como linfomas y mielomas (por ejemplo, linfomas no Hodgkin), determinadas formas de tumores sólidos que expresan el antígeno CDIM y/o afecciones relacionadas. La cantidad de proteína de unión a CDIM que es adecuada para lograr esto se considera la dosis terapéuticamente efectiva. Alternativamente, la cantidad de proteína de unión a CDIM en combinación con otro agente u otro fármaco que sea adecuada para lograr esto también se considera una dosis terapéuticamente efectiva. Otros agentes son, por ejemplo, agentes citotóxicos que incluyen, pero no se limitan a, un isótopo radioactivo, un anticuerpo citotóxico, un inmunoconjugado, un conjugado de ligando, un inmunosupresor, un regulador del crecimiento celular y/o un inhibidor, una toxina, o mezclas de los mismos. Un agente o compuesto quimioterapéutico (véase, también la Tabla 1) es a menudo un agente que interfiere con la polimerización o despolimerización de microtúbulos como un taxano, alcaloide de la vinca o colchicina, o mezclas de los mismos. El alcaloide de la vinca incluye vinblastina, vincristina, vindesina o vinorelbina, o mezclas de los mismos. El taxano incluye, pero no se limita a, paclitaxel, docetaxel o mezclas de los mismos. El anticuerpo citotóxico que se puede administrar en combinación con las proteínas de unión a antígeno descritas generalmente tiene una unión específica para un receptor de superficie celular en una célula B, que incluye CD11a, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD34, CD37, CD38, CD40, CD45, CD52, CD80, CD 86, IL-4R, IL-6R, IL-8R, IL-13, IL-13R, integrina a-4/p-1 (VLA4), receptor BLYS, Ig idiotípica de superficie celular, factor de necrosis tumoral (TNF), o mezclas de los mismos. Como tal, el anticuerpo citotóxico puede ser efalizumab (RAPTIVA), rituximab (RITUXAN), daclizumab (ZENAPAX), epratuzumab, basiliximab (SIMULECT), anti-CD52 (CAMPATH), natalizumab o infliximab (REMICADE). El inmunosupresor incluye, pero no se limita a, un glucocorticoide, un inhibidor de la calcineurina, un agente antiproliferativo/antimetabólico, o un anticuerpo inmunosupresor. En una realización, los agentes son etopósido (VP-16), paclitaxel (taxol), ara-C (citarabina), vincristina, nocodazol, colchisina, daunorubicina, citocalasina o jasplakinolide.

En una realización de la presente invención, al menos una proteína de unión descrita en este documento contenida en la composición farmacéutica está acoplada a un efector, tal como caliqueamicina, auristatina-PE, un radioisótopo o un agente quimioterapéutico tóxico tal como geldanamicina y maitansina. En particular, estos conjugados de proteínas de unión son útiles para dirigirse a células, por ejemplo, células cancerosas, que expresan CDIM para su eliminación.

Además, la unión de las proteínas de unión descritas en este documento a los radioisótopos proporciona ventajas para los tratamientos de tumores. A diferencia de la quimioterapia y otras formas de tratamiento contra el cáncer, la radioinmunoterapia o la administración de una combinación de proteínas de unión a radioisótopos se dirigen directamente a las células cancerosas con un daño mínimo en el tejido normal y sano circundante. Con esta "bala mágica", el paciente puede ser tratado con cantidades mucho menores de radioisótopos que otras formas de tratamiento disponibles en la actualidad. Determinados radioisótopos incluyen el itrio 90 (90Y), indio111 (111In), 131I,99 mTc, plata radioactiva-111, oro radiactivo-199 y bismuto 213 El enlace de los radioisótopos a las proteínas de unión puede realizarse por ejemplo, con quelatos bifuncionales convencionales. Como la plata y el oro pueden existir en un estado monovalente, para la plata radioactiva-111 y el oro radioactivo-199 pueden utilizar enlazadores a base de azufre (Hazra y col. (1994) Cell Biophys. 24-25:1-7). El enlace de los radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Además, tiuxetan es un quelante de enlazador MX-DTPA unido a ibritumomab para formar ibritumomab tiuxetan (Zevalin) (Witzig, T.E. (2001) Cancer Chemother. Pharmacol.

48 Suppl 1:91-5). Ibritumomab tiuxetan puede reaccionar con radioisotipos como el indio111 (111In) o 90Y para formar 111In-ibritumomab tiuxetan y 90 Y-ibritumomab tiuxetan, respectivamente.

Además, una proteína de unión descrita en este documento, particularmente cuando se usa para tratar el cáncer, puede conjugarse con fármacos quimioterapéuticos tóxicos como la caliqueamicina (Hamann y col. (2002) Bioconjug. Chem. 13:40-46 , geldanamicina (Mandler y col., (2002) J. Natl. Cancer Inst., 92:1549-1951) y la maitansina, por ejemplo, el fármaco maitansinoide, DM1 (Liu y col. (1996) Proc. Natl Acad Sci. USA 93:8618-8623). Con esta tecnología se pueden emplear diferentes enlazadores que liberan los fármacos en condiciones ácidas o reductoras o tras la exposición a proteasas específicas. Según la presente invención, una proteína de unión descrita en este documento puede conjugarse como se describe en la técnica.

Auristatina-PE, por ejemplo, es un agente antimicrotúbulo que es una modificación estructural del péptido de molusco marino, sin cáscara, constitutivo dolastatin 10. La auristatina-PE tiene actividad antitumoral y actividad vascular antitumoral (Otani y col. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:837-44). Por ejemplo, la auristatina-PE inhibe el crecimiento celular e induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en líneas celulares de cáncer pancreático (Li y col. (1999) Int. J. Mol. Med. 3:647-653). En consecuencia, para dirigir específicamente la actividad antitumoral y las actividades vasculares antitumorales de auristatina-PE a tumores particulares, la auristatina-PE puede conjugarse con la proteína de unión descrita en este documento.

El esquema de dosificación y las cantidades efectivas para este uso, es decir, el "régimen de dosificación" dependerá de una diversidad de factores, que incluyen la etapa de la enfermedad o afección, la gravedad de la enfermedad o afección, la gravedad de los efectos secundarios adversos, el estado general de la salud del paciente y el estado físico del pacienteo o la edad. Al calcular el régimen de dosificación para un paciente, también se tiene en cuenta el modo de administración. El régimen de dosificación también debe tener en cuenta la farmacocinética, es decir, la velocidad de absorción, biodisponibilidad, metabolismo o eliminación (véase, por ejemplo, Liedtke y col. (2012) Haematologica 97 (1):30-37).

El estado de la técnica permite al médico determinar el régimen de dosificación para cada paciente individual. Las proteínas de unión a CDIM pueden administrarse solas o en combinación con otros compuestos. Si se administra en combinación con otros compuestos, se esperarán mejores respuestas de los pacientes y resultados más duraderos. Los compuestos combinados pueden actuar de forma sinérgica o aditiva.

Como ejemplo ilustrativo, las pautas proporcionadas a continuación para las proteínas de unión a CDIM se pueden usar como guía para determinar el régimen de dosificación, es decir, el esquema de dosis y los niveles de dosificación, de cualquier proteína de unión a CDIM administrada cuando se practican los procedimientos descritos en este documento. La eficacia clínica de las proteínas de unión a CDIM puede mejorarse mediante la administración conjunta de un segundo compuesto como la vincristina o un agente similar. Del mismo modo, la eficacia de una pequeña molécula quimioterapéutica puede mejorarse mediante la administración conjunta con la proteína de unión al antígeno CDIM. Las proteínas de unión a CDIM son eficaces en un intervalo de dosis de aproximadamente entre 0,25 mg/kg y 100 mg/kg. Las administraciones únicas o múltiples de formulaciones de proteínas de unión a CDIM pueden administrarse dependiendo de la dosis y la frecuencia según lo requiera y tolere el paciente que padece cáncer linfoide o leucemia (por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda de células B o LLA), cualquier forma de enfermedad autoinmune que involucre células B (por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico o LES), o cualquier forma de hiperproliferación de células B, como linfomas y mielomas (por ejemplo, linfomas no Hodgkin) y/o afecciones relacionadas. Las formulaciones deben proporcionar una cantidad suficiente de proteína de unión a CDIM para mejorar efectivamente la afección. Por ejemplo, una cualquiera de las 44 proteínas de unión a antígeno descritas en este documento puede administrarse a un paciente mediante monoterapia (es decir, sin otros medicamentos) o en terapia de combinación con, por ejemplo, vincristina u otros agentes, véase, los mencionados anteriormente). Las proteínas de unión a antígeno que tienen unión específica para el epítopo CDIM en una célula B pueden administrarse en una dosis de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 3000 mg/m 2, o más preferentemente, de aproximadamente 25 a 1000 mg/m 2, o en particular, aproximadamente de 75, 150, 300 o 600 mg/m2. En aspectos adicionales, el anticuerpo se administra a una dosis de aproximadamente 0,25 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, y más preferentemente, a aproximadamente 1,25, 2,5, 5, 10 o 20 mg/kg. El anticuerpo anti-CDIM se administra típicamente una vez a la semana, y en algunas realizaciones, más frecuentemente que una vez por semana, tan a menudo como una vez por día. Se pueden administrar anticuerpos citotóxicos adicionales en una cantidad de 10-375 mg/m2 por semana durante cuatro semanas, o 0,4-20mg/kg por semana durante 2 a 10 semanas en forma de terapia de combinación. En una realización, las proteínas de unión a CDIM se administran actualmente a un paciente diariamente como monoterapia en una cantidad de aproximadamente 0,25 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En otra realización, las proteínas de unión a CDIM se administran a un paciente diariamente en terapia de combinación con un segundo agente seleccionado de entre el grupo que consiste en vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina o mezclas de las mismas en una cantidad de aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.

En particular, las dosis de proteínas de unión a CDIM selectivas administradas a un paciente pueden variar dependiendo de la edad, el grado de enfermedad, la tolerancia a los fármacos y los medicamentos y afecciones concomitantes. Las proteínas de unión a CDIM pueden administrarse al paciente en combinación con otro fármaco para potenciar el efecto de las proteínas de unión a CDIM y para reducir los efectos secundarios adversos. Usando un segundo fármaco, la actividad de administración conjunta de las proteínas de unión a CDIM puede aumentar entre un 10 % y un 90 % y la terapia de combinación continuará hasta que el tratamiento de combinación ya no se considere beneficioso o necesario. Las proteínas de unión a CDIM pueden administrarse a un paciente simultáneamente o dentro de marcos de tiempo específicos entre sí. Se pueden administrar diferentes proteínas de unión a CDIM al paciente simultáneamente en píldoras o comprimidos separados o en forma de una píldora combinada.

Trastornos y enfermedades

Las proteínas de unión a CDIM de la presente descripción pueden usarse para tratar pacientes que padecen cáncer linfoide o leucemia, cualquier forma de enfermedad autoinmune que implique células B, o cualquier forma de hiperproliferación de células B como leucemia aguda o crónica, linfomas y mielomas, y o trastornos relacionados. Cualquier afección que se caracteriza por una hiperproliferación de células B, incluido el cáncer linfoide, la infección viral, la inmunodeficiencia o la enfermedad autoinmune, puede tratarse con las proteínas de unión a CDIM. De manera similar, cualquier célula tumoral o célula cancerosa que exprese el epítopo CDIM o un antígeno similar a CDIM se puede tratar con las proteínas de unión a CDIM.

La descripción proporciona proteínas de unión a CDIM mejoradas para la destrucción y agotamiento selectivos de células B en trastornos relacionados con la autoinmunidad, incluidos, pero sin limitarse a, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (LES), miastenia gravis, pénfigo vulgar, enfermedad de Grave y trombocitopenia autoinmune. Las células B autorreactivas secretan autoanticuerpos dirigidos contra auto-proteínas. Los linfocitos B no solo producen autoanticuerpos, sino que también desempeñan un importante papel regulador independientemente de su función como células productoras de anticuerpos. Esto es relevante con respecto a la autoinmunidad, ya que las células B autorreactivas tienen la capacidad de activar las células T patógenas para producir citocinas proinflamatorias. La miastenia gravis, el pénfigo vulgar, la enfermedad de Grave y la trombocitopenia autoinmune son buenos ejemplos de afecciones en las que los anticuerpos patógenos impulsan el fenotipo clínico (véase, Browning, J.F., mencionado anteriormente). Además, los trastornos autoinmunes conducen a un exceso de actividad y a un mayor número de células B que deben eliminarse para impedir una inflamación masiva y daños en los tejidos. Por lo tanto, el agotamiento de los linfocitos B es útil en el tratamiento de tales enfermedades autoinmunes. Dado que el tratamiento de muchas enfermedades autoinmunes reumáticas, como la artritis reumatoide, se basa principalmente en el uso de inmunosupresores citotóxicos y corticosteroides, los pacientes a menudo sufren efectos secundarios graves adicionales. Además, las tasas de recaída del paciente siguen siendo altas. Existe la necesidad de fármacos más seguros y efectivos, tales como las proteínas de unión a CDIM de la presente descripción.

Un cáncer linfático es cualquier leucemia o linfoma agudo o crónico de origen de células B, que incluye,pero no se limita a, leucemia linfocítica aguda (LLA), linfoma no Hodgkin (LNH), linfoma de Burkitt, LLA de progenitor B, LLA en adultos, leucemia linfocítica crónica (LLC) y macroglobulinemia de Waldenstrom. Las proteínas de unión a CDIM se unen al epítopo CDIM, que se encuentra en las células B cancerosas.

Con el fin de permitir la predicción de pacientes que responderán al tratamiento con las proteínas de unión al antígeno CDIM descritas, se pueden realizar análisis in vitrooin vivo.Las imágenesin vivo pueden realizarse antes del tratamiento administrando proteínas de unión al antígeno CDIM como un conjugado que permite la visualización del antígeno CDIM en el tejido de interés. Se puede establecer un nivel particular de reactividad que permita predecir la respuesta del paciente a la terapia. Alternativamente, este tipo de análisis puede ayudar a establecer parámetros de dosificación basados en la carga tumoral.El análisis in vitro se puede realizar en muestras de células linfoides del paciente (sangre periférica, médula ósea u otras) antes del tratamiento. Las células se teñirán con proteínas de unión al antígeno CDIM utilizando un análisis de citometría de flujo estándar. Se establecerá un corte que permita la predicción de un resultado positivo después de la terapia. Por ejemplo, se puede establecer una intensidad de fluorescencia media mínima que predice un resultado positivo.

V. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos pretenden ilustrar la descripción y no deben interpretarse como limitantes del alcance de las reivindicaciones.

Ejemplo 1: Generación y determinación de la secuencia de proteínas de unión a CDIM ejemplares Construcción de ADN plásmido. Todas las regiones pesadas variables de las construcciones de cadena mu de la serie H, (designadas H1-H22) fueron sintetizadas por Genscript con los sitios Xba1-Kpn1 en los extremos 5' y 3' respectivamente. Todas las construcciones de la cadena Mu de la serie H se ensamblaron aislando cada una de las regiones variables de la cadena pesada como fragmentos Xba1-Kpn1 y uniéndolos en una ligación de tres partes con un fragmento Kpn1-BamH1 que abarca la región mu constante junto con el vector de expresión AB11 que había sido digerido con Xba1 y BamH1. Los plásmidos ligados se transformaron en bacterias competentes. Los plásmidos clonados resultantes se confirmaron mediante secuenciación directa. Las preparaciones de plásmido midi se generaron utilizando Qiagen, para proporcionar cantidades adecuadas de ADN para la transfección en células CHO-S.

El plásmido de cadena ligera se construyó de una manera similar. El inserto lambda se clonó en una ligadura de tres partes; la región lambda variable se diseñó como un fragmento XbaI-EcoRI, que se mezcló con el fragmento de la región constante lambda EcoRI-BamHI y se ligó en el vector AB2 entre los sitios XbaI y BamHI. El inserto L2 kappa se aisló como un fragmento Xbal-BamHI y se ligó en el vector AB2-Kappa.

Transfección de células CHO-S con el ADN plásmido H1-H22/L2.

El ADN correspondiente a las cadenas pesadas y ligeras, se preparó para la cotransfección (cantidades iguales de L2 y de H1-22) utilizando la técnica PEI. Las células CHO-S (1E 8 de crecimiento en fase logarítmica) utilizadas para la transfección se hicieron crecer en medios RPMI1640. El ADN:PEI se mezcló 1:2 y esta mezcla de ADN:PEI se añadió a las células CHO-S en CD OptiCHO complementado con 0,5x Pen/Strep, Glutamax y HT. Después de la incubación durante la noche en un matraz agitador, los medios se intercambiaron en CD OptiCHO con 0,5x P/S, Glu. En el día 7 posterior a la transfección, el sobrenadante del cultivo celular (100 ml) se recogió mediante centrifugación de las células. Para la caracterización de estos ejemplos de IgM, 15 ml de sobrenadante de cultivo celular se concentraron 10 veces con Centricon.

Las secuencias de aminoácidos de las 22 regiones variables distintas de la cadena pesada se representan en las figuras 1A-D. Las secuencias de aminoácidos de las 2 regiones variables distintas de la cadena ligera se representan en la figura 1E. Las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera se muestran en la figura 1F. Se entiende que pueden utilizarse regiones constantes kappa o lambda. Las secuencias de aminoácidos que son representativas de las proteínas de unión a CDIM identificadas y aisladas, IGM1-IGM44, se muestran en las figuras 2A-2V. Las secuencias CDR3 de H1 a H22 se representan en la figura 3.

Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que podrían usarse para codificar las 44 proteínas de unión a CDIM descritas se representan en las figuras 4A-L. Se entiende que, debido a la degeneración en el código genético, podrían utilizarse otras secuencias para codificar la secuencia exacta de aminoácidos. Las secuencias de las diversas regiones determinantes de la complementariedad (CDRH) y las regiones del marco (FR) de la región variable de la cadena pesada de los anticuerpos se determinaron incluyen el marco 1 (FR1), la región determinante de la complementariedad 1 (CDRH1), el marco 2 (FR2), la región determinanate de la complementariedad 2 (CDRH2), el marco 3 (FR3) y la región determinante de la complementariedad 3 (CDRH3).

Ejemplo 2: Fabricación de proteínas de unión a CDIM

Este ejemplo describe cómo se fabricaron algunas de las proteínas de unión descritas. Las secuencias consistieron en variantes de la región variable de la cadena pesada y ligera (se codificaron las regiones constantes de kappa y lambda). Se transfectaron combinaciones específicas de las variantes de la cadena pesada y ligera en células CHO, es decir, se realizaron células DG44 CHO y transfecciones transitorias. Se obtuvieron niveles de expresión de 10­ 100 |jg/ml a partir de las transfecciones iniciales. Los anticuerpos IgM se purificaron mediante cromatografía de afinidad, se evaluaron mediante electroforesis en gel y se analizaron para determinar la bioactividad mediante la unión celular, los ensayos de citotoxicidad y las pruebas ELISA para determinar la unión a múltiples biomoléculas. Los resultados obtenidos de los ensayos funcionales se utilizaron para guiar la selección del candidato principal. Una vez seleccionados, los candidatos principales se transfectaron de manera estable en células c Ho y se subclonaron en 20 placas (aproximadamente 2000 pocillos) y se seleccionaron mediante ELISA para determinar el nivel más alto de secreción. Los 50 clones superiores se expandieron a matraces T75, seguido de la expansión de los mejores 24 clones que se transfirieron a matraces de agitación. Las IgM de estos 24 clones se purificaron y cuantificaron y los seis clones principales (seleccionados por los niveles de secreción de anticuerpos IgM) se cultivaron bajo una selección adicional en metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) para facilitar el crecimiento de líneas celulares de alta secreción.

Ejemplo 3: Evaluación de la expresión de IgM usando SDS-PAGE no reducida

La electroforesis en gel no reductor es un procedimiento de separación que se usa típicamente en proteómica y resuelve proteínas basadas en masa molecular y estructuras oligoméricas. En condiciones no reductoras, los enlaces disulfuro de proteínas se dejan intactos y, por lo tanto, el oligómero IgM se puede resolver como estructuras pentaméricas o hexaméricas.

Para confirmar la expresión del anticuerpo IgM mediante transfección transitoria del sobrenadante de células CHO-S, se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida no reductora de SDS como se describe en Vorauer-Uhl, y col, J Immunol. Methods 359 (2010): 21-27. Este ejemplo describe cómo se investigaron los mAbs IgM transfectados transitoriamente para determinar su pureza y estructura multimérica. La muestra de proteína de interés se incuba con el tampón de muestra NuPage SDS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los estándares de peso molecular y las muestras de prueba se cargan en el gel y se ejecutan a un voltaje constante de 100 V durante aproximadamente 2 horas hasta que el frente de colorante alcance la parte inferior del gel. Después de la electroforesis, el gel se elimina del aparato XCell Mini-Cell, se fija y se tiñe con colorante azul coloidal.

Para demostrar la formación de pentámero y hexámero, se realizó una SDS PAGE no reductora del sobrenadante concentrado de células CHO, transfectadas con las diversas muestras de proteínas de unión a CDIM (L1-L7 y L9-L21, respectivamente), utilizando geles Native Page Novex 3-12 % Bis-Tris Life Technologies' (Carlsbad, CA) utilizando SDS PAGE,

La figura 5 muestra el gel SDS teñido según el protocolo de tinción azul coloidal (Life Technologies, Carlsbad, CA), con una banda prominente a 1.048 kD, que representa los pentámeros IgM, y una banda prominente a 1.236 kD, que representa los hexámeros IgM. Como se puede ver en la figura, la formación de pentámeros para los ejemplos de IgM (flecha continua) es más dominante en comparación con la formación de hexámeros. De manera similar, la IgM 216 humana aislada es predominantemente de forma pentamérica (flecha discontinua), sin embargo, aparece como un peso molecular más bajo debido a las cadenas ligeras lambda más pequeñas incluidas en este formato de IgM.

Ejemplo 4: Unión de proteínas de unión a CDIM al antígeno CDIM

Este ejemplo describe cómo se investigaron las propiedades de unión de los anticuerpos descritos. Los anticuerpos se prepararon mediante cromatografía de afinidad. En la figura 6A, la línea celular pro-B humana, NALM-6, que expresa el antígeno CDIM en la superficie celular se tiñó con la serie de anticuerpos IgM recombinantes. Los anticuerpos se usaron para determinar la respuesta a la dosis que comenzó a 20 jg/tubo diluido por etapas en 2, hasta una concentración final de 0,039 jg. Las células se tiñeron en un volumen de 100 j l en FBS al 3 %/PBS en hielo durante 1 hora, seguido de una tinción posterior con DyLight-488 anti-IgM humana conjugada (Jackson Immuno), 1 jg/ml durante 20 minutos a 4 C.

El análisis de la unión a CDIM se realizó en un citómetro de flujo FACScan utilizando el software de análisis CellQuest. Los resultados se muestran como puntos de datos sin procesar con intensidad de fluorescencia media (IFM) en el eje Y y la concentración del anticuerpo primario (jg/100 jl) en el eje X.

Los datos se volvieron a analizar utilizando el programa de análisis GraphPad para ajustar los resultados utilizando el ajuste de curva de regresión no lineal. La CE⁵⁰ (jg/100 jl) para cada anticuerpo fue (a) 10,6 para IGM1, (b) 2,2 para IGM23, (c) 2,2 para IGM34, y (d) 1,7 para IGM36.

Ejemplo 5: Citotoxicidad resultante de la unión celular de proteínas de unión a CDIM

Este ejemplo describe cómo se investigó la citotoxicidad de las proteínas de unión a CDIM. La línea de células pro-B humanas NALM-6 se tiñó de manera idéntica a la descrita en la figura 6A anterior. En la figura 6B, la muerte celular se evaluó midiendo la viabilidad celular después de 1 hora de tinción. Al cuantificar la proporción de células que no absorbieron yoduro de propidio, se calculó el porcentaje de células viables. Los resultados se muestran como datos sin procesar con % de viabilidad en el eje Y y concentración (jg/100 jl) en el eje X.

Los resultados idénticos se graficaron utilizando el programa de análisis GraphPad y los datos se ajustaron utilizando el ajuste de curva de regresión no lineal. La CE⁵⁰ se calculó para cada anticuerpo usando el mismo enfoque descrito anteriormente. La CE⁵⁰ (jg/100 jl) para cada anticuerpo fue (a) 3,0 para IGM1, (b) 0,6 para IGM23, (c) 0,6 para IGM34, y (d) 0,3 para IGM36.

Los resultados de las figuras 6Ay6B muestran que los anticuerpos descritos se unen a las células B humanas en un amplio intervalo de dosis y que estos anticuerpos son citotóxicos para las células B que causan la muerte celular.

Ejemplo 6: Citotoxicidad resultante del ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento humano de las proteínas de unión a CDIM

"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la vía de complemento clásica comienza mediante la unión del primer componente del sistema de complementos (CIq) a anticuerpos (de la subclase adecuada), que se unen a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, como se describe en Hinton y col., J. Immunol. 20061 de enero; 176 (1):346-56 . En resumen,este ejemplo describe cómo se investigó la citotoxicidad de las proteínas de unión a CDIM. Las células pro-B NALM-6 humanas (50.000) se colocaron en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos. El complemento humano se agrega a la dilución analizada óptima con o sin una dilución en serie del sobrenadante que contiene el anticuerpo expresado de interés. Después de 24 horas, se añadió un sustrato colorimétrico CCK8 durante 3 horas y luego se midió la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de 450 nm en un lector de placas de microtitulación. La cuantificación del aumento en DO es directamente proporcional a las células NALM-6 de proliferación viable. La DO de Nalm6 sin tratar sin sobrenadante se usa para calcular el 100 %, con los valores de DO sobrenadantes normalizados en consecuencia para obtener los porcentajes de viabilidad. En la figura 8, los resultados se muestran como porcentaje de viabilidad en el gráfico del eje Y frente al anticuerpo que contiene la concentración de sobrenadante (ug/ml) en el eje X. Estos resultados se analizaron utilizando el programa GraphPad y los datos se modelaron utilizando un ajuste de curva de regresión no lineal de cuatro parámetros. La CI50 se calculó para cada anticuerpo usando el mismo enfoque descrito anteriormente.

Ejemplo 7: Unión de proteínas de unión a CDIM a antígenos no CDIM

Este ejemplo describe la especificidad de unión de las proteínas de unión a CDIM para antígenos distintos de CDIM. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de afinidad. Los anticuerpos se probaron en un amplio intervalo de dosis contra un panel de antígenos disponibles en kits ELISA disponibles en el mercado. Las placas ELISA pre-recubiertas con los antígenos, ssADN (Inova Diagnostics, Inc. San Diego, CA), dsDNA (Inova Diagnostics, Inc., San Diego, CA.), cardiolipina (Inova Diagnostics, Inc., San Diego, California.) MDA-LDL (lipoproteínas de baja densidad modificadas con malondialdehído) (Rocky Mountain Diagnostics, Colorado Springs, CO) se compraron a diversos proveedores. El lípido A (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) se compró como un antígeno, se disolvió en etanol y se diluyó en tampón de carbonato de Na 100 mM a pH 9,5 antes de recubrir las placas ELISA. Se utilizaron anticuerpos anti-CDIM en las concentraciones indicadas y se realizó ELISA según las recomendaciones del fabricante. En resumen, las placas se bloquearon con leche en polvo BSA durante 1 hora, seguido de lavado. Los anticuerpos descritos se añadieron a las concentraciones indicadas. Se dejó que los anticuerpos se unieran durante 1,5 horas a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado. Se añadió el anticuerpo anti-IgM humano conjugado con HRP, seguido de la adición de sustrato.

Los resultados se cuantificaron utilizando la absorbancia a 450 nm (Bio-Tek Synergy HT). Como se muestra en las figuras 8y9, el MAb 216 se une a todos los antígenos analizados, mientras que cada uno de los anticuerpos descritos muestra una unión disminuida (es decir, ssADN) o eliminación completa de especificidad para el antígeno (es decir, cardiolipina). Estos resultados demuestran que los anticuerpos descritos tienen especificidades de unión a antígeno más restringidas que el MAb 216.

La Tabla 2 resume las características de potencia y especificidad de las diversas proteínas de unión a CDIM descritas en este documento.

Tabla 2

La tabla 2 resume los datos que se muestran en la figura 6yla figura 7 para las proteínas de unión a CDIM que comprenden las cadenas pesadas variables H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18, H19, H20 y H21, respectivamente. El valor de ELISA se refiere a la concentración de IgM determinada en los medios condicionados después de la transfección transitoria de cadenas pesadas y ligeras de IgM. La CI⁵⁰ de citotoxicidad es la concentración máxima media de anticuerpo IgM que produce una muerte celular del 50 % al incubar los anticuerpos, con complemento humano y células Nalm-6 (véase, también la figura 6). El valor de CI⁵⁰ representa la potencia de las diversas proteínas de unión a CDIM descritas en este documento.

La unión adicional a otros antígenos (LPS, ssADN, dsADN, etc.) es la unión observada en formato ELISA (véase, también, las figuras 9A-9F). La reactividad relativa de las muestras de IgM a diversos antígenos se basa en la reacción máxima (DO ⁴⁵⁰ nm) cuando la IgM está a 10 pg/ml. Los valores mostrados representan los valores de no especificidad de las diversas proteínas de unión a CDIM. La puntuación de la reactividad relativa es la siguiente: DO⁴⁵⁰ es de 0 a 0,3, la puntuación se da como (-) menos. Las puntuaciones (+), (++), (+++) y (++++) se dan para valores ELISA máximos de 0,3 a 1, 1 a 2, 2 a 3 y más de 3, respectivamente.

Tabla 3C: SECUENCIAS CDR DE LA CADENA LIGERA

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CDIM, que comprende:

(a) una cadena pesada que comprende una secuencia de la región variable mostrada en la SEQ ID NO: 1; y (b) una cadena ligera que comprende una secuencia de la región variable mostrada en la SEQ ID NO:24.

2. La proteína de unión a antígeno aislada de la reivindicación 1, donde dicha proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo de los mismos.

3. La proteína de unión a antígeno aislada de la reivindicación 2, donde dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena única.

4. La proteína de unión a antígeno aislada de la reivindicación 3, donde dicha proteína de unión a antígeno se selecciona de entre el grupo que consiste en IgA, IgD, IgM, IgG e IgE, preferentemente donde dicha proteína de unión a antígeno es una IgM.

5. La proteína de unión a antígeno aislada de la reivindicación 4, donde dicha proteína de unión a antígeno está acoplada a un grupo de etiquetado, preferentemente donde dicho grupo de etiquetado es un radioisótopo, un radionúclido, un grupo fluorescente, un grupo enzimático, un grupo quimioluminiscente, un grupo biotinilo, o un grupo polipeptídico predeterminado.

6. La proteína de unión a antígeno aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde dicha proteína de unión a antígeno está acoplada a un grupo efector, preferentemente donde dicho grupo efector es un radioisótopo, un radionucleótido, una toxina, un grupo terapéutico o un grupo quimioterapéutico, preferentemente donde el grupo terapéutico o quimioterapéutico se selecciona de entre el grupo que consiste en caliqueamicina, auristatina-PE, geldanamicina, maitansina y derivados de los mismos.

7. Una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende como agente activo al menos una proteína de unión aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

8. Un kit que comprende la proteína de unión aislada de la reivindicación 1, y que comprende preferentemente un agente terapéutico adicional, preferentemente donde el agente terapéutico adicional es un anticuerpo antitumoral o un agente quimioterapéutico.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad relacionada con la proliferación anormal de células B.

10. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 9, donde la enfermedad se selecciona de entre el grupo que consiste en leucemia aguda o crónica, linfoma, mieloma, linfoma no Hodgkin, cáncer linfoide, infección viral, inmunodeficiencia y una enfermedad autoinmune que involucra a las células B.

11. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 9 o 10, donde un compuesto quimioterapéutico seleccionado de entre el grupo que consiste en Etopósido (VP-16), Paclitaxel (Taxol), Ara-C (Citarabina), Vincristina, Nocodazol, Colchicina, Daunorubicina, Citocalasina y Jasplakinolide se administra conjuntamente con dicha composición farmacéutica.

12. La composición de diagnóstico de la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento para el diagnóstico de una enfermedad relacionada con la proliferación anormal de células B.

13. Un polinucleótido que codifica la proteína de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1­ 6.

14. Un sistema de expresión recombinante que comprende el polinucleótido codificador de la reivindicación 13, unido de forma operacional a secuencias eficaces para su expresión.