BR112014019459B1 - Proteínas de ligação à cdim e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO À CDIM E USOS DAS MESMAS. A presente divulgação refere-se às proteínas de ligação à molécula de indução de morte celular ("CDIM") e às composições farmacêuticas da mesma. Particularmente, a divulgação fornece proteínas de ligação à CDIM que são úteis para o seletivo esgotamento e morte das células B, incluindo células B neoplásicas e células neoplásicas que não são originárias de células B e que expressam antígenos tipo CDIM. Além disso, a divulgação abrange polinucleotídeos que codificam as proteínas de ligação ao antígeno divulgadas, e sistemas de expressão para produzir as mesmas. Além disso, a presente divulgação engloba métodos de tratamento de pacientes com doenças mediadas e proliferativas de células B pela administração de proteínas de ligação à CDIM, bem como ensaios de diagnósticos para a identificação de proteínas que se ligam à CDIM. A divulgação contempla adicionalmente ensaios de diagnóstico para identificar populações de pacientes que podem ser tratadas com as proteínas de ligação à CDIM.

Description

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e é por meio deste documento incorporada por referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 7 de fevereiro de 2013, é nomeada como 0155-005WO1_SL.txt e tem tamanho de 225.619 bytes.

I. CAMPO

[0002] A presente divulgação refere-se às proteínas de ligação à molécula de indução de morte celular (doravante "CDIM") e às composições farmacêuticas das mesmas. Particularmente, a divulgação fornece proteínas de ligação à CDIM que são úteis para o seletivo esgotamento e morte das células B, incluindo células B neoplásicas e outras células neoplásicas que expressam CDIM ou antígenos tipo CDIM. A divulgação também fornece polinucleotídeos que codificam as proteínas de ligação à CDIM divulgadas e sistemas de expressão para produzir as mesmas. São adicionalmente englobados na presente divulgação os métodos de tratamento de pacientes com células B proliferativas e doenças mediadas por células B pela administração de proteínas de ligação à CDIM. A divulgação contempla adicionalmente ensaios de diagnóstico para populações de pacientes que podem ser tratados com as proteínas de ligação à CDIM.

II. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] A principal responsabilidade para a realização das funções do sistema imunológico é originada dos glóbulos brancos, chamados linfócitos. Os linfócitos podem ser classificados em duas classes principais, ou seja, células T e células B. As células T (ou seja, linfócitos T) originam-se de células tronco na medula óssea, se desenvolvem na glândula do timo e secretam linfocinas. As células B (ou seja, linfócitos B) originam- se das células tronco na medula óssea e são fontes de anticorpos. Na realidade, as células B geram cinco tipos diferentes de anticorpos, incluindo IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. Esses anticorpos podem neutralizar substâncias que podem desencadear uma resposta imune, ou seja, antígenos, por ligação a sítios específicos nos antígenos para bloqueá-los. IgM é o maior anticorpo e o anticorpo primário contra os antígenos A e B nas hemácias. Estruturalmente, a IgM forma polímeros onde várias imunoglobulinas são covalentemente unidas por ligações dissulfeto, principalmente como um pentâmero, mas também como um hexâmero. A IgM tem uma massa molecular de cerca de 900 KDa na forma pentamérica. Devido ao fato de cada monômero possuir dois sítios de ligação ao antígeno, uma IgM pentamérica tem dez (10) sítios de ligação.

[0004] Várias doenças estão associadas com células B alteradas ou disfuncionais incluindo, mas sem se limitar a doenças autoimunes e ao câncer. A proliferação e diferenciação das células B é regulada por receptores localizados na superfície celular. A ligação desses receptores induz a ativação de proteínas de sinalização intracelulares que transmitem os sinais do receptor para alvos específicos dentro da célula que controlam as respostas celulares. Muitas proteínas de sinalização são os produtos de oncogenes, e muitos oncogenes estão associados com tumorigênese. Os mecanismos moleculares das vias de sinalização que controlam a proliferação e diferenciação das células B ainda estão sendo estudados (Juma et al. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23:415-445).

[0005] Um exemplo de uma doença que envolve os linfócitos B neoplásicos é a leucemia linfoblástica aguda (ALL). Certo nível de progresso no combate à doença ocorre devido à intensificação da quimioterapia, bem como a melhores cuidados de apoio para ALL pediátrica e adulta. Enquanto o risco de recaída é menor na população pediátrica, tanto pacientes pediátricos quanto adultos enfrentam terríveis resultados se a doença se repete. Menos de um terço das crianças e alguns adultos com recaída de ALL sobrevivem a essa doença, apesar do uso de regimes agressivos e transplante de células tronco. Novas terapias são, portanto, necessárias que vão além da quimioterapia convencional. Para ALL, há dados pré-clínicos e clínicos iniciais com uma variedade de anticorpos monoclonais, incluindo rituximabe, epratuzumabe e gemtuzumabe, sugerindo que o uso de anticorpos monoclonais sozinhos ou em combinação com a quimioterapia padrão, é uma opção viável de tratamento.

[0006] A Patente Norte-Americana No. 5.593.676 descreve maneiras de induzir a morte celular em células B neoplásicas usando reagentes que se ligam a um epítopo de célula B específico chamado molécula de indução de morte celular (CDIM). Na presente invenção, o epítopo de oligossacarídeo específico de células B CDIM é usado como um marcador de células B neoplásicas. Anticorpos IgM específicos para esse marcador são administrados a um hospedeiro in vivo para induzir a morte em células B neoplásicas. O mesmo conceito pode ser aplicado em situações clínicas ex vivo para remover seletivamente as células B. Um anticorpo monoclonal humano (ou seja, MAb 216), que reconhece o epítopo de célula B CDIM, é citotóxico para as células B normais e neoplásicas e se liga a todos os linfócitos B CD19+ e CD20+ no sangue periférico humano e no baço. Além disso, MAb 216 não faz distinção de células B pelo isotipo expresso, se ligando às células IgG+ e IgM+ com igual intensidade. MAb 216 também se liga a todas as células B, independentemente de sua expressão de CD5. Portanto, MAb 216 é útil no diagnóstico e na terapia. Consulte também Bhat et al. (2000), Scand. J. Immunol.. 51:134-140.

[0007] No entanto, ainda há uma necessidade na técnica de identificar anticorpos que sejam específicos para as células B para matá-las e/ou removê-las seletivamente do hospedeiro com reduzidos efeitos colaterais de ligação fora do alvo e/ou danos ao tecido. A terapia de câncer ainda tem uma grande necessidade de tais anticorpos terapêuticos. O presente pedido aborda essa necessidade.

III. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0008] A presente divulgação é melhor compreendida quando lida em conjunto com as figuras em anexo, que servem para ilustrar as modalidades. Entende-se, no entanto, que a divulgação não se limita às modalidades específicas divulgadas nas figuras.

[0009] As figuras 1A a D retratam sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NOs: 1 a 22) que são representativas das proteínas de ligação à CDIM divulgadas na presente invenção. As três cadeias pesadas das regiões determinantes de complementaridade (CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e as regiões de estrutura da cadeia pesada da região variável (FR1, FR2 e FR3) e JH (região de junção) são mostradas.

[0010] A figura 1E representa sequências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve (SEQ ID NOs: 23 e 24) que são representativas das proteínas de ligação à CDIM divulgadas na presente invenção. As três regiões determinantes de complementaridade de cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e CDRL3) e as regiões de estrutura da região variável da cadeia leve (FR1, FR2 e FR3) e JL (região de junção) são mostradas.

[0011] A figura 1F representa as sequências de aminoácidos de uma região constante da cadeia pesada (Igμ) (SEQ ID NO: 25) e duas regiões constantes de cadeia leve (IgÀ e IgK, respectivamente) (SEQ ID NOs: β6 e β7) utilizadas nos exemplos representativos divulgados na presente invenção.

[0012] As figuras 2A a 2V representam as sequências de aminoácidos completas dos 44 anticorpos anti-CDIM divulgados na presente invenção, designadas IGM1 a IGM44. Os 44 anticorpos divulgados são formados pela combinação de cada uma das 22 cadeias pesadas divulgadas (SEQ ID NOs: 28 a 49) com cada uma das duas cadeias leves divulgadas (SEQ ID NOs: 50 e 51).

[0013] A figura 3 representa as sequências CDR3 das proteínas de ligação à CDIM H1 a H22 representativas divulgadas na presente invenção. Os resíduos de arginina de várias sequências estão sublinhados.

[0014] As figuras 4A a K relatam sequências de polinucleotídeo exemplares (SEQ ID NOs: 52 a 73) que codificam as 22 cadeias pesadas das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas na presente invenção.

[0015] A figura 4L representa sequências de polinucleotídeo exemplares (SEQ ID NOs: 74 e 75) que codificam as duas cadeias leves, lambda e kappa, das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas na presente invenção.

[0016] A figura 5 representa géis de SDS nativos de extratos celulares brutos de células CHO que expressam de H1 até H7 (quadro A) e de H9 até H21 (quadro B), respectivamente. A banda em 1.048 KD representa os pentâmeros de IgM, enquanto que a banda em 1.236 KD representa os hexâmeros de IgM.

[0017] A figura 6 ilustra a ligação das proteínas de ligação à CDIM expressas em uma linhagem de células B humanas e os subsequentes resultados de toxicidade para os anticorpos divulgados. As culturas de células foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo utilizando intensidade de fluorescência média (1) para quantificar a ligação (2) e a absorção de iodeto de propídio para distinguir as células vivas das células mortas. Conforme ilustrado na Figura 6A, todos os anticorpos testados se ligam à linhagem celular de células B humanas que expressa a CDIM, NALM-6 através de uma ampla variação de dose. A figura 6B mostra os resultados de citotoxicidade após a ligação dos anticorpos ao epítopo da CDIM.

[0018] A figura 7 mostra os resultados de citotoxicidade após a ligação dos anticorpos ao epítopo da CDIM.

[0019] A figura 8, tabelas A a E, representam os dados de ligação baseados em ELISA que são representativos das proteínas de ligação à CDIM aos antígenos diferentes de CDIM. Os resultados usando os antígenos de DNA de fita simples (ssDNA), DNA de fita dupla (dsDNA), lipídio A, cardiolipina e maleonaldeído LDL (MDA-LDL) são mostrados nos quadros A e E, respectivamente. Como mostrado, MAb 216 se liga a todos os antígenos através de uma ampla variação de dose em comparação com todos os anticorpos divulgados que demonstram ligação acentuadamente reduzida ou total ausência de ligação para esses antígenos selecionados.

[0020] A figura 9, painéis A a F, representam os dados de ligação baseados em ELISA que são representativos das proteínas de ligação à CDIM aos antígenos diferentes de CDIM. Os resultados usando os antígenos de DNA de fita simples (ssDNA), DNA de fita dupla (dsDNA), lipopolissacarídeo, cardiolipina, condroitina e heparano são mostrados, respectivamente, nas tabelas A e F. Como mostrado, MAb 216 se liga a todos os antígenos através de uma ampla variação de dose em comparação com todos os anticorpos divulgados que demonstram ligação acentuadamente reduzida ou total ausência de ligação para esses antígenos selecionados.

IV. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

[0021] Os títulos das seções empregados neste documento possuem apenas fins organizacionais e não devem ser interpretados como limitantes à matéria descrita.

[0022] A menos que seja definido de outra forma na presente invenção, termos científicos e técnicos usados juntamente com a presente invenção devem ter os significados que são comumente compreendidos pelas pessoas normalmente versadas na técnica. Além disso, a menos que seja exigido pelo contexto de outra forma, termos no singular deverão incluir pluraridades e termos no plural deverão incluir o singular.

[0023] Em geral, as nomenclaturas usadas juntamente com, e técnicas de cultura de células e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteínas e química de ácidos nucleicos e hibridização descritas na presente invenção são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e as técnicas do presente pedido geralmente são realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e conforme descritos em várias referências gerais e mais específicas, que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, a menos que seja indicado de outra forma. Consulte, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que são incorporados na presente invenção por referência. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como é comumente realizado na técnica ou como descrito neste documento. A terminologia usada juntamente com, e os procedimentos de laboratório e técnicas de química analítica, química orgânica sintética e química farmacêutica e medicinal aqui descritos são aqueles bem conhecidos e comumente usados na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparações farmacêuticas, formulações e administração, e tratamento dos pacientes.

[0024] Deve ser compreendido que essa invenção não se limita à metodologia, protocolos e reagentes, etc., particulares descritos na presente invenção e, como tais, podem variar. A terminologia usada na presente invenção tem apenas o propósito de descrever modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo daquelas divulgadas, que é definido unicamente pelas reivindicações.

[0025] Além dos exemplos de manipulação, ou onde indicação de outra forma, todos os números expressando quantidades de ingredientes ou condições reacionais aqui usados devem ser considerados como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". O termo "cerca de", quando usado juntamente com porcentagens, pode significar +/-1%.

Visão Geral

[0026] A presente divulgação fornece materiais e métodos relacionados ao tratamento ou diagnóstico de doenças proliferativas envolvendo células que expressam o antígeno CDIM. Em particular, a divulgação fornece proteínas de ligação à CDIM com desempenho ex vivo e in vivo melhorado, que são úteis para matar e/ou esgotar seletivamente as células B neoplásicas, especificamente em pacientes que são afligidos por uma condição caracterizada por doenças de células B proliferativas ou mediadas por células B. Além disso, as proteínas de ligação à CDIM são úteis no tratamento de tumores sólidos que expressam o antígeno CDIM. As proteínas de ligação à CDIM divulgadas podem ser usadas sozinhas ou juntamente com pequenas moléculas quimioterapêuticas. Como resultado de um efeito indutor de poro único das proteínas de ligação à CDIM divulgadas, ou seja, ferimento de membrana, as células alvo tornam-se mais acessíveis às moléculas quimioterápicas. Portanto, as proteínas de ligação divulgadas são particularmente adequadas para tratar células, de outro modo, resistentes aos compostos de molécula pequena em combinação com os mesmos. Definições

[0027] Os seguintes termos usados na presente invenção devem ter o significado conforme indicado abaixo.

[0028] O termo "antígeno" refere-se a qualquer substância capaz de induzir uma resposta imunológica específica e de reagir com um anticorpo específico.

[0029] A "proteína de ligação ao antígeno" ou "proteína de ligação à CDIM", como usado na presente invenção, é uma proteína estrutural que tem uma atividade de ligação tipo anticorpo ou um anticorpo, isto é, um anticorpo anti-CDIM.

[0030] O termo "CDIM" (molécula indutora de morte celular), como usado na presente invenção, refere-se a uma glicoforma da poli-n-acetil-lactosamina ligada às moléculas da superfície celular. O epítopo CDIM é encontrado em quase todos os linfócitos B periféricos e linfócitos B esplênicos e em algumas linhagens de linfoma de células B cultivadas. O epítopo também é encontrado em linfomas de células B primários de várias classificações histopatológicas e nas células de alguns tumores sólidos.

[0031] Em termos mais específicos, o epítopo CDIM é um antígeno da lactosamina de célula B linear (ou seja, um determinante da poli-N-acetil-lactosamina tipo 2, com ou sem um ácido siálico terminal) que tem uma conformação estrutural tridimensional e é sensível à enzima endo-beta- galactosidase. O epítopo não tem nenhuma ramificação ou substituição e pode ser ligado a um glicolipídio ou uma glicoproteína. Nas glicoproteínas, o epítopo poderia se soltar de uma ramificação de uma estrutura da manose (por exemplo, a enzima MGAT4), ou poderia se soltar de uma ramificação de uma estrutura "large I” de cadeia longa de uma, mas é normalmente pelo menos cerca de quatro porções de hexose em uma cadeia linear (ou seja, tipo 2) após a ramificação Gal β1-4 GlcNac βl-3 Gal βl-4 Glc βl; pelo menos cerca de seis hexoses para uma boa afinidade; e pelo menos cerca de doze hexoses na forma mais longa. A cadeia é feita por enzimas (por exemplo, B3GNT1, B4GALT1), que adicionam açúcares alternados ao epítopo. Notavelmente, o epítopo da CDIM glicosilado está presente em várias proteínas que variam de pesos moleculares de cerca de 20 KD até proteínas com peso molecular maior que cerca de 200 KD.

[0032] O epítopo da CDIM foi adicionalmente elucidado em função da glicoforma do antígeno ser coberto com ácido siálico, tornando-se um tipo mais maduro de glicosilação.

[0033] O termo "epítopo" geralmente refere-se a parte de um antígeno (isto é, o determinante antigênico de uma molécula), que é reconhecido pelo sistema imunológico. Um epítopo pode ser composto de açúcares, lípidos e/ou aminoácidos, ou misturas dos mesmos. O epítopo é reconhecido pelas células do sistema imunológico, como células B, células T específicas e/ou anticorpos produzidos pelas células B. Quando as células do sistema imunológico reconhecem e são ativadas por epítopos específicos, elas montam uma resposta imunológica. Alternativamente, quando os anticorpos reconhecem e se ligam a epítopos específicos, as células que carregam os epítopos podem ser esgotadas, mortas, desativadas, feridas, removidas e/ou alteradas.

[0034] O termo "proteína estrutural", ou "proteína de ligação ao antígeno", como usado na presente invenção, significa um polipeptídeo ou proteína com áreas superficiais expostas, nas quais as inserções, substituições ou deleções de aminoácidos são altamente toleráveis. Exemplos de proteínas estruturais que podem ser usadas de acordo com a presente invenção são proteínas A de Staphylococcus aureus, proteína de ligação à bilina, de Pieris brassicae ou outras lipocalinas, proteínas de repetição de anquirina e fibronectina humana (revisto em Binz e Pluckthun (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16:459-69). A manipulação de uma proteína estrutural pode ser considerada como o enxerto ou integração de uma função de afinidade sobre ou dentro da armação estrutural de uma proteína estavelmente dobrada. A função de afinidade significa uma afinidade de ligação à proteína de acordo com a presente invenção. Uma estrutura pode ser estruturalmente separável das sequências de aminoácidos que conferem especificidade de ligação. Em geral, proteínas que parecem adequadas para o desenvolvimento de tais reagentes de afinidade artificial podem ser obtidas de maneira lógica, ou mais comumente, por técnicas de manipulação de proteína combinatórias tais como panning contra CDIM, de proteína purificada ou proteína exibida na superfície celular, por agentes ligantes em uma biblioteca de estrutura artificial exibida in vitro, habilidades que são conhecidas na técnica (Skerra, A. (2000) J. Mol. Recog. 13:167-187; Binz e Pluckthun, supra). Além disso, uma proteína estrutural que tem uma atividade de ligação tipo anticorpo pode ser derivada de um polipeptídeo aceptor contendo o domínio estrutural, que pode ser enxertado com domínios de ligação de um polipeptídeo doador para conferir a especificidade de ligação do polipeptídeo doador sobre o domínio estrutural contendo o polipeptídeo aceptor. Os ditos domínios de ligação inseridos podem ser, por exemplo, a região determinante de complementaridade (CDR) de um anticorpo, em particular, de um anticorpo anti-CDIM. A inserção pode ser realizada por vários métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica incluindo, por exemplo, a síntese de polipeptídeos, síntese de ácido nucleico de um aminoácido codificante, bem como por diversas formas de métodos recombinantes bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. De modo importante, o termo "cadeia pesada" ou "cadeia leve" deve ser compreendido amplamente como sendo uma proteína estrutural, incorporando uma ou várias das CDRs divulgadas, ao invés de limitado ao significado tradicional do termo no contexto da tecnologia de anticorpo.

[0035] Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo ligado à CDIM", como usado na presente invenção, significa um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humanizado (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596), um anticorpo quimérico (Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851-6855), um anticorpo multiespecífico (por exemplo, um anticorpo biespecífico) formado a partir de pelo menos dois anticorpos, ou um fragmento de anticorpo dos mesmos. O termo "fragmento de anticorpo" compreende qualquer porção dos anticorpos acima mencionados, preferencialmente as suas regiões de ligação ao antígeno ou variáveis. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, diacorpos (Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-6448), moléculas de anticorpo de cadeia única (Pluckthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg e Moore, EDS, Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) e outros fragmentos, contanto que eles exibam a capacidade desejada de ligação à CDIM.

[0036] Além disso, o termo "anticorpo" ou "anticorpo de ligação à CDIM", como usado na presente invenção, pode incluir moléculas tipo anticorpo que contêm subdomínios manipulados de anticorpos ou variantes de anticorpo de ocorrência natural. Essas moléculas tipo anticorpo podem ser anticorpos de domínio único, como domínios somente de VH ou somente de VL derivados de fontes naturais, como camelídeos (Muyldermans et al. (2001) Reviews in Molecular Biotechnology 74:277-302) ou através de exposição in vitro de bibliotecas de seres humanos, camelídeos ou outras espécies (Holt et al. 2003 Trends Biotechnol. 21:484-90).

[0037] De acordo com a presente invenção, o “fragmento Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação e reconhecimento de antígeno completo. Esta região consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia leve e outro de cadeia pesada em associação forte e não covalente. É nessa configuração que as três CDRs de cada domínio variável (CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada; CDRL1, CDRL2 e CDRL3 de cadeia leve) interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antígeno. Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno. O “fragmento Fab” também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. O “fragmento Fab” difere do “fragmento Fab’” pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região da dobradiça do anticorpo. O “fragmento F(ab')2" é originalmente produzido como um par de “fragmentos Fab’” que têm cisteínas da dobradiça entre eles. Métodos de preparação de tais fragmentos de anticorpos, como digestão com papaína ou pepsina, são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

[0038] Em algumas modalidades da presente invenção, o anticorpo anti-CDIM é do tipo IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, preferencialmente do tipo IgG ou IgM incluindo, mas sem se limitar, ao do tipo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 e IgM2. Na maioria das modalidades, o anticorpo é do tipo IgM. A cadeia leve pode ser uma do tipo lambda-1, lambda-2 ou kappa. Uma cadeia J pode ser incluída ou omitida.

[0039] IgG tem vários subtipos, incluindo, mas sem se limitar, à IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Os subtipos de IgA incluem IgA1 e IgA2. Em seres humanos, o isotipo IgA contém quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves; os isotipos IgG e IgE contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; e o isotipo IgM contém dez ou doze cadeias pesadas e dez ou doze cadeias leves (pentaméricas ou hexaméricas). Em moléculas de IgM de ocorrência natural, a cadeia J estabiliza a configuração pentamérica.

[0040] A região de cadeia pesada C tipicamente compreende um ou mais domínios que podem ser responsáveis pela função efetora. O número de domínios da região constante da cadeia pesada dependerá do isotipo. Em uma modalidade, as s proteínas de ligação à CDIM são do subtipo IgM. Nas cadeias leve e pesada completas, as regiões variável e constante podem ser unidas por uma região "J" de cerca de doze ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região "D" de cerca de dez ou mais aminoácidos. (Consulte, por exemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., Cáp. 7 (Paul, W., ed.) (1989) New York: Raven Press).

As proteínas de ligação à CDIM

[0041] Um primeiro aspecto da presente divulgação refere-se a uma proteína de ligação isolada que se liga ao epítopo da CDIM em linfócitos B periféricos humanos, linfócitos B esplênicos, linfócitos B neoplásicos e alguns tumores sólidos.

[0042] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 com uma sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 22, e/ou uma cadeia leve que compreende pelo menos uma de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 mostrada nas SEQ ID NOs: 23 ou 24. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma cadeia pesada composto pelo menos uma CDRH3 mostrada nas SEQ ID NOs: 1 a 22 e uma cadeia leve. Em ainda outra modalidade, a proteína de ligação ao antígeno compreende as CDRH1, CDRH2 e CDRH3 mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 22 e uma cadeia leve. Em outras modalidades, a proteína de ligação ao antígeno compreende adicionalmente uma CDRL1, uma CDRL2 e uma CDRL3 da SEQ ID NO: 23 ou 24, incorporadas na cadeia leve. Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno tem, adicionalmente, uma FR1 mostrada nas SEQ ID NOs: 1 a 22, incorporada na cadeia pesada.

[0043] Em ainda outra modalidade, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 22. Além disso, a divulgação inclui uma modalidade onde a proteína de ligação ao antígeno compreende uma região variável da cadeia leve que tem a sequência mostrada na SEQ ID NO: 23 ou 24. Além disso, a divulgação contempla uma proteína de ligação ao antígeno que compreende uma região variável da cadeia pesada mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 22, e uma região variável da cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 23 ou 24. As figuras 1A a D ilustram 22 exemplares das regiões variáveis da cadeia pesada únicas das proteínas de ligação à CDIM divulgadas na presente invenção. A figura 1E retrata duas regiões variáveis da cadeia leve (SEQ ID NOs: 23 e 24). A figura 1F mostra uma região constante da cadeia pesada (Igμ) (SEQ ID NO: 25), bem como regiões constantes para as cadeias leves (IgÀ e IgK) (SEQ ID NOs: β6 e β7). A SEQ ID NO: 108 representa MAb 216 (Bhat et al., 2000, supra), um anticorpo de ligação à CDIM que foi usado como anticorpo de referência experimental na avaliação da potência e especificidade. Consulte a seção Exemplos abaixo.

[0044] Cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada pode ser ligada a uma região constante da cadeia pesada para formar uma cadeia pesada completa, e cada região variável da cadeia leve pode ser ligada a uma região constante da cadeia leve para formar uma cadeia leve completa, respectivamente. As sequências de aminoácidos dos exemplares das cadeias pesadas completas divulgadas na presente invenção têm uma sequência mostradas nas SEQ ID NOs: 28 a 49. As sequências de aminoácidos dos exemplares das cadeias leves divulgadas na presente invenção têm uma sequência de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 50 e 51. Como explicado acima, duas sequências de cadeias pesadas e duas de cadeia leve podem formar um tetrâmero de anticorpo completo. São divulgados na presente invenção, nomeadamente, exemplares de tetrâmeros do anticorpo de ligação à CDIM designados IGM1, IGM2, IGM3, IGM4, IGM5, IGM6, IGM7, IGM8, IGM9, IGM10, IGM11, IGM12, IGM13, IGM14, IGM15, IGM16, IGM17, IGM18, IGM19, IGM20, IGM21, IGM22, IGM23, IGM24, IGM25, IGM26, IGM27, IGM28, IGM29, IGM30, IGM31, IGM32, IGM33, IGM34, IGM35, IGM36, IGM37, IGM38, IGM39, IGM40, IGM41, IGM42, IGM43 e IGM44 (coletivamente também referidos na presente invenção como "IGM1-IGM44"). Conforme ilustrado nas figuras 2A a 2V, essas 44 proteínas de ligação à CDIM divulgadas são compreendidas das cadeias pesadas das SEQ ID NOs: 28 a 49, cada uma combinada com qualquer uma das cadeias leves das SEQ ID NOs: 50 a 51. As tabelas 3, abaixo, mostram a correlação entre as várias SEQ ID NOs: de polipeptídeo e polinucleotídeo e as proteínas de ligação ao antígeno IGM1-IGM44.

[0045] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno isolada se liga à CDIM e compreende uma sequência CDR3 de cadeia pesada X1X2X3AX4GX5SX6X7, em que: X1 é um G, um A ou um R; X2 é um R, um G ou um A; X3 é um M, um T ou um R; X4 é um R, um W ou um Y; X5 é um A, um S ou um G; X6 é um I, um V ou um Y; e X7 é um N ou nenhum aminoácido.

[0046] e em que há uma, e não mais de uma arginina nas posições 1 a 3 (em relação à região variável da cadeia pesada, posições 98 a 100, a posição 97 sendo a arginina invariável que precede a região CDR3.

[0047] Em outra modalidade, a proteína de ligação ao antígeno isolada se liga à CDIM e compreende uma sequência CDR3 de cadeia pesada X1X2X3AX4GX5SX6X7, em que: X1 é um G, um A ou um R; X2 é um R, um G ou um A; X3 é um M, um T ou um R; X4 é um R ou um W; X5 é um A ou um S; X6 é um I ou um V; e X7 é um N ou nenhum aminoácido;

[0048] e em que há uma, e não mais de uma arginina nas posições 1 a 3 (em relação à região variável da cadeia pesada, posições 98 a 100, a posição 97 sendo a arginina invariável que precede a região CDR3.

[0049] De acordo com a presente invenção, também deve ser compreendido que a sequência de aminoácidos da proteína de ligação da invenção não se limita aos vinte aminoácidos convencionais (consulte Immunology - A Synthesis (2a Edição, E.S. Golub e D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é incorporada neste documento por referência). Por exemplo, os aminoácidos podem incluir estereoisômeros (por exemplo, D- aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos artificiais como aminoácidos α,α- dissubstituídos, N-alquilaminoácidos, ácido lático e outros aminoácidos não convencionais. Exemplos de aminoácidos não convencionais que também podem ser componentes adequados para a proteína de ligação da invenção incluem: 4- hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil- lisina, ε-N-acetil-lisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, u-N- metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes, por exemplo, 4-hidroxiprolina.

[0050] Além disso, de acordo com a presente invenção, variações menores nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 51 são contempladas como sendo abrangidas pela presente invenção, contanto que as variações na sequência de aminoácidos mantenham pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80%, 90%, 95% e, mais preferencialmente, 99% das sequências mostradas nas SEQ ID NOS: 1 a 51. As variações podem ocorrer dentro das regiões de estrutura (ou seja, fora das CDRs), dentro das CDRs, ou nas regiões de estrutura e nas CDRs. Variações preferenciais nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 51, ou seja, deleções, inserções e/ou substituições de pelo menos um aminoácido, ocorrem perto dos limites dos domínios funcionais. Os domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação dos dados das sequências de nucleotídeos e/ou aminoácidos com bases de dados de sequências públicos ou proprietários. Métodos de comparação informatizados podem ser usados para identificar as porções das sequências ou domínios de conformação de proteína previstos que ocorrem em outras proteínas de ligação de estrutura e/ou função conhecidas. Métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos. Consulte, por exemplo, Bowie et al. (1991) Science 253:164; Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al. 1991 Nature 354: 105, que são todos incorporados por referência na presente invenção. Assim, as pessoas versadas na técnica podem reconhecer porções de sequência e conformações estruturais que podem ser usadas para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção.

[0051] Variações especialmente preferenciais nas sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 51 são aquelas que levam a uma reduzida suscetibilidade à proteólise ou oxidação, alteram os padrões de glicosilação ou alteram as afinidades de ligação, ou conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais da proteína de ligação. Em particular, substituições de aminoácidos conservadoras são contempladas. Substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionadas em suas cadeias laterais. Famílias de aminoácidos preferenciais são as seguintes: família acídica = aspartato, glutamato; família básica = lisina, arginina, histidina; família apolar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e família polar sem carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina e tirosina. Famílias mais preferenciais são: família hidroxialifática = serina e treonina; família asparagina e glutamina; família alifática = alanina, valina, leucina e isoleucina; e família aromática = fenilalanina, triptofano e tirosina. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, de um aspartato com um glutamato, de uma treonina com uma serina ou uma substituição semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não tenha um efeito importante sobre a ligação ou propriedades da proteína de ligação resultante, especialmente se a substituição não envolve um aminoácido em um sítio estrutural. Se uma alteração de aminoácido resulta em uma proteína de ligação funcional, ou seja, em uma proteína de ligação ao antígeno que se liga à CDIM, pode ser prontamente determinada por análise de ELISA ou FACS.

[0052] Em algumas modalidades, a proteína de ligação à CDIM é uma "proteína estrutural", que tem uma atividade de ligação similar a anticorpo, onde uma ou várias CDRs das SEQ ID NOs: 1 a 24 são incorporadas em uma estrutura, conforme definido acima. Em algumas modalidades, pelo menos CDRH3 e CDRL3 são incorporadas na estrutura. Em algumas modalidades, todas as seis CDRs são incorporadas na estrutura. Pode-se prontamente verificar se a proteína estrutural tem atividade de ligação à CDIM por ensaio de ELISA ou competição de FACS por ligação com MAb 216, que é um anticorpo de ligação à CDIM de ocorrência natural, ou ensaios funcionais in vitro ou in vivo.

[0053] Além disso, de acordo com a presente invenção, observa-se que o anticorpo de ligação à CDIM da invenção é um anticorpo completamente humano ou humanizado. Anticorpos humanos evitam alguns dos problemas associados com anticorpos xenogênicos, por exemplo, com anticorpos que possuem regiões variáveis e/ou constantes de murino ou rato. A presença de proteínas derivadas xenogênicas, como proteínas derivadas de murino ou rato, pode levar à geração de uma resposta imunológica contra o anticorpo por um paciente, levando posteriormente à rápida remoção dos anticorpos, perda de utilidade terapêutica através da neutralização do anticorpo e/ou reações alérgicas graves, ou até mesmo fatais.

[0054] As proteínas de ligação ao antígeno descritas na presente invenção podem ser anticorpos ou podem ser derivados de anticorpos. Em determinadas modalidades, a estrutura de polipeptídeo das proteínas de ligação ao antígeno baseia-se nos anticorpos incluindo, mas sem se limitar, aos anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio, anticorpos sintéticos (às vezes chamados na presente invenção como "anticorpos miméticos"), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, invenção como "conjugados de anticorpo") e fragmentos dos mesmos. As proteínas de ligação ao antígeno fornecidas na presente invenção demonstraram se ligar aos epítopos da CDIM em todas as células B, incluindo células B neoplásicas e algumas células de tumor sólido. Conforme demonstrado nos exemplos, a capacidade das células B lesadas de se autorreparar e sobreviver é reduzida ou inibida. Como consequência, as proteínas de ligação ao antígeno divulgadas são capazes de esgotar e matar as células B, incluindo as células tumorais. As proteínas de ligação ao antígeno que são divulgadas na presente invenção têm várias utilidades. Algumas das proteínas de ligação ao antígeno são, por exemplo, úteis em ensaios de ligação específicos, purificação por afinidade de células expressando CDIM e em ensaios de varredura para identificar células que expressem CDIM, incluindo células sólidas tumorais, células de origem de células B. Além disso, as proteínas de ligação ao antígeno divulgadas podem ser utilizadas para o diagnóstico e/ou tratamento de doenças, tais como distúrbios proliferativos de células B e doenças autoimunes. Para este efeito, as proteínas de ligação ao antígeno podem ser usadas sozinhas ou juntamente com pequenas moléculas quimioterapêuticas.

[0055] Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno é uma proteína de ligação à CDIM polivalente (ou seja, proteínas de ligação à CDIM com dois ou mais sítios de ligação para o epítopo da CDIM). Como tais, as proteínas de ligação funcionam como receptores com uma afinidade e avidez específicas pelo epítopo da CDIM, geralmente de pelo menos cerca de 10-6 M e, mais preferencialmente, de pelo menos cerca de 10-7 M. A natureza polivalente do receptor permite a ligação simultânea de pelo menos dois epítopos da CDIM na superfície da membrana celular. Os anticorpos podem ser usados de qualquer uma das famílias da imunoglobulina, tais como IgA, IgD, IgE, IgG e IgM; não é um requisito que o anticorpo esteja associado a vários processos citotóxicos associados aos processos particularmente iniciados por Fc. Em uma modalidade, o anticorpo será IgM, pois a estrutura pentamérica ou hexamérica dessa molécula permite a ligação cruzada desimpedida por interferência estérica. Em algumas modalidades, a composição de anticorpo é uma mistura de pentâmeros de IgM e hexâmeros de IgM, incluindo pelo menos 20% de hexâmeros, ou pelo menos 30% de hexâmeros, pelo menos 40% de hexâmeros, pelo menos 50% de hexâmeros ou pelo menos 60% de hexâmeros, ou pelo menos 70% de hexâmeros, ou pelo menos 80% de hexâmeros. Alternativamente, fragmentos de anticorpos podem ser utilizados ou alternativas sintéticas dos mesmos que atuam como anticorpos. Por exemplo, moléculas sintéticas pequenas podem ser concebidas, que permitirão ligação específica e ligação cruzada do epítopo CDIM.

[0056] Em uma modalidade, o anticorpo tem a cadeia J, em outra modalidade, o anticorpo não possui a cadeia J.

[0057] Em um aspecto, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo recombinante construído com base na sequência da linhagem germinativa VH4-34. O gene VH4-34 (região pesada variável) é um dos 53 genes da linhagem germinativa do anticorpo funcional humano identificados. O gene VH4-34 está presente em todos os haplótipos e nenhuma variação de sequência foi encontrada no DNA da linhagem germinativa que foi isolado de indivíduos sem parentesco. Anticorpos VH4-34 anti célula B são citotóxicos para as células B (Bhat et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 108:151 e Bhat et al. (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:59). Como aludido acima, os defeitos da membrana plasmática ou poros induzidos por anticorpos são maiores do que aqueles formados por outras proteínas formadoras de poros bem conhecidas. Ao permeabilizar as células, as proteínas de ligação à CDIM divulgadas realizam significativo esgotamento das células alvo (consulte também a Publicação de Patente Número 20100322849). As células B que foram permeabilizadas são mais suscetíveis à ação dos agentes citotóxicos adicionais, incluindo, mas sem se limitar, aos isótopos radioativos, anticorpos citotóxicos, imunoconjugados, conjugados ligantes, imunossupressores, reguladores e/ou inibidores do crescimento celular, toxinas ou misturas dos mesmos. A membrana celular comprometida permite a entrada de agentes citotóxicos, tais como agentes quimioterapêuticos, aumentando assim a eficácia dos agentes quimioterapêuticos, até mesmo em células que são resistentes ou impermeáveis a tais agentes. Qualquer célula B ou célula cancerosa que expresse o epítopo CDIM, ou um epítopo tipo CDIM, respectivamente, pode ser tratada com as proteínas de ligação à CDIM e está sujeita ao esgotamento e morte por meio das proteínas de ligação ao antígeno.

[0058] As proteínas de ligação à CDIM da presente divulgação reconhecem o epítopo da CDIM em linfócitos B periféricos humanos, linfócitos B esplênicos e em linfócitos B neoplásicos, e alguns tumores sólidos. Muitos anticorpos IgM são polirreativos, ou seja, eles podem ser ligar a uma variedade de antígenos diferentes e estruturalmente não relacionados, do próprio organismo e de organismos diferentes. No entanto, verificou-se que as proteínas de ligação ao antígeno divulgadas na presente invenção têm menos polirreatividade do que alguns anticorpos de CDIM de ocorrência natural. Como tais, as proteínas de ligação ao antígeno são submetidas a menos ligações fora do alvo, tornando-as melhores candidatas terapêuticas e de diagnóstico para aplicações in vivo. A sua reduzida polirreatividade é ilustrada nas figuras 5A a 5E, que mostram exemplos das proteínas de ligação ao antígeno que apresentam afinidade de ligação reduzida, ou perda de afinidade de ligação, por múltiplos antígenos diferentes de CDIM, especificamente ssDNA, dsDNA, lipídio A, cardiolipina e MDA-LDL. Isso sugere que as proteínas de ligação à CDIM divulgadas são mais seguras para aplicações terapêuticas porque a dose necessária para ligar as células alvo será mais baixa, uma vez que não há um “escoadouro” de antígeno para o anticorpo (ligação a antígenos diferentes de CDIM). A afinidade de um anticorpo polirreativo para antígenos diferentes varia por tanto quanto mil vezes e é geralmente menor do que a de um anticorpo monorreativo para o seu antígeno. Muitos dos anticorpos polirreativos são geralmente de linhagem germinativa ou próximos aos de linhagem germinativa, embora alguns tenham um número menor de substituições. Anticorpos polirreativos podem ser retirados da circulação mais rápido do que os anticorpos monorreativos. A rápida remoção dos anticorpos polirreativos pode ocorrer devido à ligação desses anticorpos aos antígenos do hospedeiro endógenos (consulte também Zhou et al. (2007) J. Autoimmun. 29(4):219-228). Muitos dos anticorpos naturais são anticorpos polirreativos, que apresentam ampla atividade antibacteriana. Isso explica, em parte, a atividade antibacteriana no soro dos recém-nascidos na ausência de estimulação antigênica conhecida (consulte também Zhou et al. (2007), supra). No entanto, para fins terapêuticos, é geralmente desejável utilizar anticorpos que sejam monoespecíficos e que não sejam removidos tão rapidamente de modo a realizar a ligação e a morte das células B e células cancerosas que expressam o epítopo CDIM.

[0059] Em aplicações terapêuticas específicas, por exemplo, no tratamento de uma doença autoimune, é desejável que as proteínas de ligação à CDIM se liguem às células B e as matem seletivamente, uma vez que as células B contribuem para várias doenças autoimunes por uma variedade de mecanismos (Browning, J. L. (2006) Nature (Reviews) 5:564-576). O rápido esgotamento das células B reduz a atividade do sistema imunológico que, por sua vez, reduz muitos efeitos colaterais associados, como inflamação e danos teciduais. No tratamento do câncer, é desejável matar populações de células selecionadas, tais como células B neoplásicas ou células cancerosas a fim de interromper a hiperproliferação dessas células e a propagação do câncer para outros órgãos. Na presente invenção, a terapia de combinação com outros agentes e fármacos contra o câncer pode ser benéfica para direcionar a morte de células específicas. Assim, as proteínas de ligação à CDIM encontram aplicação terapêutica no tratamento da doença autoimune e do tratamento do câncer.

[0060] Como discutido acima, a ligação das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas ao seu ligante de lactosamina linear leva à ruptura da membrana plasmática e à formação de poros de membrana grandes, resultando em lise celular. A combinação de vincristina, por exemplo, e das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas resulta em um grau mais elevado de citotoxicidade para as células B, em comparação com o efeito aditivo de cada agente individual isoladamente. Dessa forma, as proteínas de ligação à CDIM podem ser administradas aos pacientes sozinhas e em conjunto com outro agente e/ou fármacos contra o câncer para avaliar o direcionamento e eficácia tumoral. Além disso, as proteínas de ligação à CDIM podem ser administradas a pacientes sozinhas ou em combinação com outros agentes e/ou fármacos contra o câncer para tratar e/ou diagnosticar várias doenças, incluindo câncer e doenças autoimunes. Exemplos de outros agentes que poderiam ser usados em combinação com proteínas de ligação à CDIM são mostrados na tabela 1 abaixo: TABELA 1

[0061] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação ao antígeno da invenção é acoplada a um grupo marcador. Tal proteína de ligação é particularmente adequada para aplicações de diagnóstico. Como usado na presente invenção, o termo "grupo marcador" refere-se a um marcador detectável, por exemplo, um aminoácido radiomarcado ou porção botinila que pode ser detectada pela avidina conjugada (por exemplo, estreptavidina ligada a um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos colorimétricos ou ópticos). Vários métodos para marcar polipeptídeos e glicoproteínas, tais como anticorpos, são conhecidos na técnica e podem ser usados para realizar a presente invenção.

[0062] Exemplos de grupos marcadores adequados incluem, mas não se limitam, aos seguintes: radioisótopos 3 14 15 35 90 99 ou radionuclídeos (por exemplo, H, C, N, S, Y, Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), grupos enzimáticos (por exemplo, horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimiluminescentes, grupos biotinila ou epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíper de leucina, sítios de ligação a anticorpos secundários, domínios de ligação a metal e etiquetas de epítopos). Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos marcadores sejam ligados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico.

[0063] Alternativamente, uma proteína de ligação ao antígeno divulgada na presente invenção pode ser acoplada a um grupo efetor em outra modalidade preferencial da invenção. Tal proteína de ligação é especialmente adequada para aplicações terapêuticas. Como usado na presente invenção, o termo "grupo efetor" refere-se a um grupo citotóxico, como um radioisótopo ou radionuclídeo, uma toxina, um grupo terapêutico ou outro grupo efetor conhecido na técnica. Exemplos para grupos efetores adequados são radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H 14C 15N 35S 90Y 99T 111I 125I 131I) li i i H, C, N, S, Y, Tc, In, I, I), caliqueamicina, análogos da dolastatina como auristatinas e agentes quimioterapêuticos, como derivados de geldanamicina e de maitansina, incluindo DM1. Em certos aspectos, pode ser desejável que os grupos efetores sejam ligados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico. Polinucleotídeos que Codificam as Proteínas de Ligação à CDIM e Sistemas de Expressão

[0064] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica uma proteína de ligação da invenção. Dentro do âmbito da presente invenção, o termo "molécula de ácido nucleico isolada" significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA ou sintética, ou alguma combinação dos mesmos que, em virtude de sua origem, a “molécula de ácido nucleico” isolada (1) não está associada com todo ou uma parte de um polinucleotídeo no qual o “polinucleotídeo isolado” é encontrado na natureza, (2) é operavelmente ligada a um polinucleotídeo com o qual ela não se liga na natureza ou (3) que não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. Além disso, o termo "molécula de ácido nucleico", referido na presente invenção, significa uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, seja ribonucleotídeo ou desoxinucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo, como nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos, e similares. O termo também inclui as formas de fita simples e dupla de DNA.

[0065] Exemplares de sequências de ácidos nucleicos completas que codificam as sequências de cadeia pesada de IGM1 a IGM44 (SEQ ID NOs: 52 a 73) são fornecidas nas Figuras 3A a K. Exemplares de sequências de ácidos nucleicos completas que codificam as sequências de cadeia leve de IGM1 a IGM44 (SEQ ID NOs: 74 e 75) são fornecidas na Figura 3L. Obviamente, devido à degeneração do código proteínas de ligação à CDIM descritas na presente invenção podem ser contempladas.

[0066] Em uma modalidade da presente invenção, uma molécula de ácido nucleico da invenção é operacionalmente ligada a uma sequência controle. O termo "sequência controle", como usado na presente invenção, refere-se às sequências de polinucleotídeos que são necessárias para realizar a expressão e o processamento das sequências codificantes às quais elas são ligadas. A natureza de tais sequências controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Em procariotos, tais sequências controle geralmente incluem promotores, sítios de ligação ribossomais e sequências de terminação de transcrição. Em eucariotos, geralmente, tais sequências controle incluem promotores e sítios de terminação de transcrição. De acordo com a presente invenção, o termo "sequência controle" destina-se a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências do parceiro de fusão. Além disso, o termo "operacionalmente ligado", como usado na presente invenção, refere-se às posições dos componentes assim descritos que estão relacionados de modo que os permite funcionar de sua forma pretendida. Além disso, de acordo com a presente invenção, uma sequência controle de expressão operacionalmente ligada a uma sequência codificante é ligada de tal forma que a expressão da sequência codificante é alcançada sob condições compatíveis com a sequência controle de expressão.

[0067] Um outro aspecto da presente invenção é um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação da invenção. A molécula de ácido nucleico pode ser operacionalmente ligada a uma sequência controle. Além disso, o vetor pode adicionalmente conter uma origem de replicação ou um gene marcador de seleção. São exemplos de vetores que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus, etc.

[0068] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ácido nucleico ou vetor da invenção. A transformação poderia ser feita por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, empacotar o polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetor viral) e transduzir uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor), ou por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado pelas Patentes Norte-Americanas Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e 4.959.455, as quais são, por meio desse documento, incorporadas por referência. Particularmente, métodos para a introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrana, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Exemplos das células hospedeiras que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção são células eucarióticas de hibridomas, tais como células de mamíferos, por exemplo, de hamster, coelho, rato, porco, camundongo ou outras células animais; células vegetais e células fúngicas, por exemplo, milho, tabaco, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris; células procarióticas, tais como E. coli; e outras células utilizadas na técnica para a produção de anticorpos. Especialmente, linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiras para a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens celulares imortalizadas disponíveis junto à Coleção Americana de Cultura de Células (ATCC), incluindo, mas sem se limitar, às células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2) e várias outras células.

[0069] Composições farmacêuticas de Proteínas que se Ligam à CDIM e Métodos de Tratamento e Diagnóstico

[0070] Um aspecto adicional da presente divulgação são composições farmacêuticas e das proteínas de ligação à CDIM. As proteínas de ligação são formuladas como produtos farmacêuticos para serem usadas nos métodos da divulgação. Qualquer composição ou composto que pode estimular uma resposta biológica associada com a ligação das proteínas de ligação à CDIM ao epítopo da CDIM dos linfócitos B pode ser usado como um medicamento na divulgação. Detalhes gerais sobre as técnicas para a formulação e administração estão bem descritos na literatura científica (consulte "Remington Pharmaceutical Sciences", Maack Publishing Co, Easton PA.). As formulações farmacêuticas da proteína de ligação à CDIM podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação de produtos farmacêuticos. As proteínas de ligação à CDIM podem ser formuladas para administração de qualquer maneira convencionalmente aceitável, incluindo através de injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por via oral, tópica ou por meio de outras vias. Exemplos ilustrativos são definidos abaixo.

[0071] Formulações farmacêuticas para administração oral podem ser formuladas usando veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em doses adequadas para administração oral. Tais veículos permitem que as formulações farmacêuticas sejam formuladas em formas de dosagem unitária, como comprimidos, pílulas, pó, cápsulas, líquidos, pastilhas, géis, xaropes, pastas, suspensões, suspensões e similares, adequadas para ingestão pelo paciente. Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas através da combinação das proteínas de ligação à CDIM com um excipiente sólido, opcionalmente, triturando uma mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adicionar mais compostos adequados adicionais, se desejado, para obter comprimidos ou pílulas. Excipientes sólidos adequados são preenchedores de carboidratos ou proteínas que incluem, mas não se limitam, a açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outros vegetais; celulose, como metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose de sódio; e gomas, incluindo goma arábica e tragacanto; assim como proteínas, como gelatina e colágeno. Se desejado, agentes desintegrantes ou solubilizantes podem ser adicionados, como polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou um sal dos mesmos, como alginato de sódio. Preparações farmacêuticas da presente divulgação que também podem ser usadas por via oral são, por exemplo, cápsulas duras feitas de gelatina, bem como as cápsulas moles seladas, feitas de gelatina e um revestimento, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter as proteínas de ligação à CDIM misturadas com um enchimento ou ligantes, como lactose ou amidos, lubrificantes, como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Nas cápsulas moles, as proteínas de ligação à CDIM podem ser dissolvidas ou suspensas em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietilenoglicol líquido, com ou sem estabilizantes.

[0072] As suspensões aquosas da divulgação contêm proteínas de ligação à CDIM misturadas com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Tais excipientes incluem um agente de suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia, e agentes dispersantes ou umidificantes, como fosfatídeo de ocorrência natural (por exemplo, lecitina), um produto de condensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo (por exemplo, estearato de polioxietileno), um produto de condensação do óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa (por exemplo, heptadecaetileno-oxietanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um hexitol (por exemplo, mono-oleato de polioxietilenossorbitol), ou um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de ácidos graxos e um anidrido de hexitol (por exemplo, mono-oleato de polioxietilenossorbitano). A suspensão aquosa também pode conter um ou mais conservantes, como p-hidroxibenzoato de etila ou n-propila, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes flavorizantes e um ou mais agentes adoçantes, como sacarose, sacarina ou aspartame. As formulações podem ser ajustadas quanto à osmolaridade.

[0073] Suspensões oleosas podem ser formuladas pela suspensão de proteínas de ligação à CDIM em um óleo vegetal, como óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco, ou em óleo mineral, como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, como cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes podem ser adicionados para fornecer uma preparação oral palatável. Essas composições podem ser preservadas pela adição de um antioxidante, como ácido ascórbico.

[0074] Pós e grânulos dispersáveis da divulgação adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água podem ser formulados a partir das proteínas de ligação à CDIM em mistura com um agente dispersante, de suspensão e/ou umidificante, e um ou mais conservantes. Agentes de dispersão ou umidificantes e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles acima. Excipientes adicionais, por exemplo, agentes adoçantes, flavorizantes e corantes, também podem estar presentes.

[0075] As formulações farmacêuticas de proteína de ligação à CDIM também podem estar sob a forma de emulsões óleo em água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por exemplo, óleo de oliva ou óleo de amendoim, um óleo mineral, como parafina líquida ou uma misturas dos mesmos. Agentes emulsificantes adequados incluem gomas de ocorrência natural, como goma acácia e goma tragacanto, fosfatídeos de ocorrência natural, como lecitina de soja, ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos hexitol, tais como mono-oleato de sorbitano e produtos de condensação desses ésteres parciais com óxido de etileno, como mono-oleato de polioxietilenossorbitano. A emulsão também pode conter adoçantes e agentes flavorizantes. Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçantes, como glicerol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações também podem conter um emoliente, um conservante, um flavorizante ou um agente corante.

[0076] Quando as proteínas de ligação à CDIM são administradas por injeção intravenosa, as formulações farmacêuticas podem estar sob a forma de uma preparação injetável estéril, como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida, usando aqueles agentes dispersantes ou umidificantes e agentes de suspensão adequados, que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água e a solução de Ringer, um cloreto de sódio isotônico. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser convencionalmente utilizados como um meio solvente ou de suspensão. Para essa finalidade, pode ser utilizado qualquer óleo fixo suave, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos graxos, como o ácido oleico, podem ser, da mesma forma, utilizados na preparação dos injetáveis.

[0077] Os métodos da presente divulgação tratam pacientes humanos e não humanos que sofrem de câncer linfoide ou leucemia (por exemplo, leucemia linfoblástica aguda de células B ou ALL), qualquer forma de doença autoimune que envolve as células B (por exemplo, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico ou SLE), qualquer forma de hiperproliferação de células B, como linfomas e mielomas (por exemplo, linfomas não Hodgkin), certas formas de tumores sólidos que expressam o antígeno da CDIM e/ou condições relacionadas. A quantidade de proteína de ligação à CDIM que é adequada para realizar essa tarefa é considerada a dose terapeuticamente eficaz. Alternativamente, a quantidade de proteína de ligação à CDIM, em combinação com outro agente ou outro fármaco que é adequada para realizar isso também é considerada uma dose terapeuticamente eficaz. Outros agentes são, por exemplo, agentes citotóxicos, incluindo, mas sem se limitar, a um isótopo radioativo, um anticorpo citotóxico, um imunoconjugado, um conjugado ligante, um imunossupressor, um regulador e/ou inibidor do crescimento celular, uma toxina ou misturas dos mesmos. Um agente ou composto quimioterapêutico (consulte também a TABELA 1) é muitas vezes um agente que interfere com a polimerização ou despolimerização dos microtúbulos como um taxano, alcaloide da vinca ou colchicina, ou misturas dos mesmos. O alcaloide da vinca inclui vimblastina, vincristina, vindesina ou vinorrelbina, ou misturas dos mesmos. O taxano inclui, mas não se limita, ao paclitaxel, docetaxel ou misturas dos mesmos. O anticorpo citotóxico que pode ser administrado juntamente com as proteínas de ligação ao antígeno divulgadas normalmente tem ligação específica por um receptor de superfície celular em uma célula B, incluindo CD11a, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD34, CD37, CD38, CD40, CD45, CD52, CD80, CD 86, IL-4R, IL-6R, IL-8R, IL-13, IL-13R, integrina α-4/β-1 (VLA4), receptor BLYS, Ig idiotípica da superfície celular, fator de necrose tumoral (TNF) ou misturas dos mesmos. Como tal, o anticorpo citotóxico pode ser efalizumabe (RAPTIVA), rituximabe (RITUXAN), daclizumabe (ZENAPAX), epratuzumabe, basiliximabe (SIMULECT), anti-CD52 (CAMPATH), natalizumabe, infliximabe (REMICADE) e similares. O imunossupressor inclui, mas não se limita, a um glicocorticoide, um inibidor da calcineurina, um agente antiproliferativo/antimetabólico ou um anticorpo imunossupressor. Em uma modalidade, os agentes são etoposídeo (VP-16), paclitaxel (taxol), ara-C (citarabina), vincristina, nocodazol, colchicina, daunorrubicina, citocalasina, jasplaquinolide e similares.

[0078] Em uma modalidade da presente invenção, pelo menos uma proteína de ligação divulgada na presente invenção contida na composição farmacêutica é acoplada a um efetor, tal como uma caliqueamicina, auristatina-PE, um radioisótopo ou um agente quimioterapêutico tóxico, como geldanamicina e maitansina. Em particular, esses conjugados da proteína de ligação são úteis para alvejar células, por exemplo, células cancerosas, que expressam CDIM para eliminação.

[0079] Além disso, a ligação das proteínas de ligação divulgadas na presente invenção aos radioisótopos fornece vantagens para tratamentos de tumor. Ao contrário da quimioterapia e outras formas de tratamento do câncer, a radio-imunoterapia ou a administração uma combinação de proteínas de ligação de radioisótopo alveja diretamente as células cancerosas com danos mínimos ao tecido normal saudável circundante. Com esse "projétil mágico", o paciente pode ser tratado com quantidades muito menores de radioisótopos do que outras formas de tratamento disponíveis atualmente. Certos radioisótopos incluem ítrio 90 (90Y), índio 111 (111In), 131I, 99mTc, prata radioativa- 111, ouro radioativo-199 e bismuto 213. A ligação dos radioisótopos às proteínas de ligação pode, por exemplo, ser realizada com quelatos bifuncionais convencionais. Tendo em vista que a prata e o ouro podem existir em um estado monovalente, para a prata radioativa-111 e o ouro radioativo-199, pode-se utilizar ligantes à base de enxofre (Hazra et al. (1994) Cell Biophys. 24-25:1-7). A ligação dos radioisótopos de prata pode envolver a redução da imunoglobulina com ácido ascórbico. Além disso, tiuxetana é um quelante ligante de MX-DTPA ligado ao ibritumomabe para formar ibritumomabe tiuxetana (Zevalin) (Witzig, T.E. (2001) Cancer Chemother. Pharmacol. 48 Suppl 1:91-5). Ibritumomabe tiuxetana pode reagir com radioisótopos, como índio 111 (111In) ou 90Y para formar 111In-ibritumomabe tiuxetana e 90Y-ibritumomabe tiuxetana, respectivamente.

[0080] Além disso, uma proteína de ligação divulgada na presente invenção, particularmente quando usada para tratar o câncer, pode ser conjugada com quimioterápicos tóxicos, como caliqueamicina (Hamann et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13:40-46, geldanamicina (Mandler et al., (2002) J. Natl. Cancer Inst., 92:1549-1951) e maitansina, por exemplo, o fármaco maitansinoide, DM1 (Liu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:8618-8623). Ligantes diferentes que liberam os fármacos sob condições ácidas ou redutoras, ou mediante exposição a proteases específicas, podem ser utilizados com essa tecnologia. De acordo com a presente invenção, uma proteína de ligação divulgada na presente invenção pode ser conjugada conforme descrito na técnica.

[0081] Auristatina-PE, por exemplo, é um agente antimicrotúbulo que é uma modificação estrutural do constituinte peptídico de molusco sem concha dolastatina 10. A auristatina-PE tem atividade antitumoral e atividade vascular antitumoral (Otani et al. (2000) Jpn. J. Cancer Res. 91:837-44). Por exemplo, a auristatina-PE inibe o crescimento celular e induz a interrupção do ciclo celular e apoptose nas linhagens e células cancerosas pancreáticas (Li et al. (1999) Int. J. Mol. Med. 3:647-653). Por conseguinte, para alvejar especificamente a atividade antitumoral e as atividades vasculares antitumorais da auristatina-PE para tumores particulares, a auristatina-PE pode ser conjugada com a proteína de ligação divulgada na presente invenção.

[0082] O regime de dosagem e as quantidades eficazes para esse uso, ou seja, o “regime de dosagem”, dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o estágio da doença ou condição, a gravidade da doença ou condição, a gravidade dos efeitos colaterais adversos, o estado geral de saúde do paciente, o estado físico do paciente, a idade e similares. Para calcular o regime de dosagem para um paciente, o modo de administração é também levado em consideração. O regime de dosagem também deve levar em consideração a farmacocinética, ou seja, a taxa de absorção, biodisponibilidade, metabolismo, remoção e similares (consulte, por exemplo, Liedtke et al. (2012) Haematologica 97(1):30-37).

[0083] O estado da técnica permite ao clínico determinar o regime de dosagem para cada paciente individual. As proteínas de ligação à CDIM podem ser administradas sozinhas ou em combinação com outros compostos. Se administrada em combinação com outros compostos, melhores respostas do paciente e resultados mais duráveis poderiam ser esperados. Os compostos combinados podem agir sinergicamente, ou aditivamente.

[0084] Como um exemplo ilustrativo, as diretrizes fornecidas abaixo para as proteínas de ligação à CDIM podem ser usadas como orientação para determinar o regime de dosagem, ou seja, o cronograma de dosagem e os níveis de dosagem, ou qualquer proteína de ligação à CDIM administrada ao praticar os métodos divulgados na presente invenção. A eficácia clínica das proteínas de ligação à CDIM pode ser melhorada pela coadministração de um segundo composto, como vincristina ou um agente semelhante. Da mesma forma, a eficácia de uma pequena molécula de agente quimioterapêutico pode ser reforçada através da coadministração com a proteína de ligação ao antígeno da CDIM. As proteínas de ligação à CDIM são eficazes em um intervalo de dosagem entre 0,25 mg/Kg e 100 mg/Kg. Administrações simples ou múltiplas das formulações de proteína de ligação à CDIM podem ser feitas dependendo da dosagem e da frequência, conforme necessário e tolerado pelo paciente que sofre de câncer linfoide ou leucemia (por exemplo, leucemia linfoblástica aguda de células B ou ALL), qualquer forma de doença autoimune que envolve as células B (por exemplo, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico ou SLE), ou qualquer forma de hiperproliferação de células B como linfomas e mielomas (por exemplo, linfomas não Hodgkin) e/ou condições relacionadas. As formulações devem fornecer uma quantidade suficiente de proteína de ligação à CDIM para melhorar efetivamente a condição. Por exemplo, qualquer uma das 44 proteínas de ligação ao antígeno divulgadas na presente invenção pode ser administrada a um paciente pela monoterapia (ou seja, com nenhum outro medicamento) ou em terapia combinada com, por exemplo, vincristina ou outros agentes, consulte acima). As proteínas de ligação ao antígeno com ligação específica pelo epítopo da CDIM em uma célula B podem ser administradas na dose de cerca de 2,5 a cerca de 3000 mg/m2,ou mais preferencialmente, de cerca de 25 a 1000 mg/m2, ou particularmente, cerca de 75, 150, 300 ou 600 mg/m2. Em aspectos adicionais, o anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 0,25 mg/Kg a cerca de 100 mg/Kg e, mais preferencialmente, a cerca de 1,25, 2,5, 5, 10 ou 20 mg/Kg. O anticorpo anti-CDIM é normalmente administrado semanalmente e, em algumas modalidades, com frequência maior que uma vez por semana, tal como uma vez por dia. Anticorpos citotóxicos adicionais podem ser administrados em uma quantidade de 10 a 375 mg/m2 por semana durante quatro semanas, ou 0,4 a 20 mg/Kg por semana, durante 2 a 10 semanas, sob a forma de uma terapia de combinação. Em uma modalidade, as proteínas de ligação à CDIM são atualmente administradas ao paciente diariamente, como uma monoterapia, em uma quantidade de cerca de 0,25 mg/Kg a cerca de 100 mg/Kg. Em outra modalidade, as proteínas de ligação à CDIM são administradas ao paciente diariamente em uma terapia de combinação com um segundo agente selecionado vindesina, vinorrelbina ou misturas dos mesmos em uma quantidade de cerca de 0,15 mg/Kg a cerca de 50 mg/Kg.

[0085] Notavelmente, as dosagens das proteínas de ligação à CDIM seletivas administradas a um paciente podem variar dependendo da idade, grau de doença, tolerância ao fármaco e medicamentos concomitantes e condições. As proteínas de ligação à CDIM podem ser administradas ao paciente juntamente com outro fármaco para potencializar o efeito das proteínas de ligação à CDIM e para reduzir os efeitos colaterais adversos. Usando um segundo fármaco, a atividade da coadministração das proteínas de ligação à CDIM pode ser reforçada entre 10% e 90%, e a terapia de combinação irá continuar até que o tratamento combinado já não seja mais considerado benéfico ou necessário. As proteínas de ligação à CDIM podem ser administradas a um paciente simultaneamente, ou em períodos de tempo específicos uma da outra. Diferentes proteínas de ligação à CDIM podem ser administradas ao paciente simultaneamente em pílulas ou comprimidos separados, ou sob a forma de uma pílula combinada. Distúrbios e Doenças

[0086] As proteínas de ligação à CDIM da presente divulgação podem ser usadas para tratar pacientes que sofrem de câncer linfoide ou leucemia, qualquer forma de doença autoimune que envolve células B ou qualquer forma de hiperproliferação de células B, como leucemia aguda ou crônica, linfomas e mielomas, e/ou distúrbios relacionados. Qualquer condição que seja caracterizada por uma hiperproliferação de células B, incluindo câncer linfoide, infecção viral, imunodeficiência ou doença autoimune pode ser tratada com as proteínas de ligação à CDIM. Da mesma forma, qualquer célula tumoral ou célula cancerosa que expressa o epítopo da CDIM, ou um antígeno tipo CDIM, pode ser tratada com as proteínas de ligação à CDIM.

[0087] A divulgação fornece proteínas de ligação à CDIM melhoradas para matar e esgotar as células B seletivas em distúrbios relacionados com a autoimunidade incluindo, mas sem se limitar, a esclerose múltipla, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), miastenia grave, pênfigo vulgar, doença de Grave e trombocitopenia autoimune. As células B autorreativas secretam autoanticorpos direcionados contra proteínas do próprio organismo. Os linfócitos B não apenas produzem autoanticorpos, mas também desempenham uma função reguladora importante, independente da sua função como células produtoras de anticorpo. Isso é relevante em relação à autoimunidade, uma vez que células B autorreativas têm a capacidade de ativar células T patogênicas para produzir citocinas pró-inflamatórias. Miastenia grave, pênfigo vulgar, doença de Grave trombocitopenia autoimune são bons exemplos de condições nas quais os anticorpos patogênicos determinam o fenótipo clínico (consulte Browning, J.F, supra). Além disso, distúrbios autoimunes induzem a quantidades crescentes e hiperativas de células B que devem ser removidas para evitar a inflamação e dano tecidual maciços. Assim, a depleção dos linfócitos B é útil no tratamento de tais doenças autoimunes. Uma vez que o tratamento de muitas doenças autoimunes reumáticas, como artrite reumatoide, baseia-se principalmente no uso de imunossupressores citotóxicos e corticosteroides, os pacientes frequentemente sofrem efeitos colaterais graves adicionais. Além disso, as taxas de reincidência dos paciente permanecem altas. Há uma necessidade por fármacos mais seguros e eficazes, como as proteínas de ligação à CDIM da presente divulgação.

[0088] Um câncer linfoide é qualquer leucemia aguda ou crônica ou linfoma de origem de célula B, incluindo, mas sem se limitar, a leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma de Burkitt, B progenitora de ALL, ALL adulta, leucemia linfocítica crônica (CLL) e macroglobulinemia de Waldenstrom. As proteínas de ligação à CDIM se litam ao CDIM epítopo, que é encontrada em células B cancerosas.

[0089] A fim de permitir a previsão de pacientes que responderão ao tratamento com as proteínas de ligação ao antígeno de CDIM divulgadas, a análise in vitro ou in vivo pode ser realizada. A visualização in vivo pode ser realizada antes do tratamento, mediante a administração de proteínas de ligação ao antígeno de CDIM como um conjugado que permite a visualização do antígeno CDIM no tecido de interesse. Um nível particular de reatividade pode ser estabelecido que permitisse a previsão da resposta do doente à terapia. Alternativamente, esse tipo de análise pode ajudar no estabelecimento de parâmetros de dosagem com base na carga tumoral. A análise in vitro pode ser realizada em amostras de células linfoides do paciente (sangue periférico, medula óssea ou outros) antes do tratamento. As células serão marcadas com as proteínas de ligação ao antígeno de CDIM usando análise de citometria de fluxo padrão. Será estabelecido um limite que permite a previsão do resultado positivo após a terapia. Por exemplo, pode ser estabelecida uma intensidade mínima média de fluorescência, que prediz o resultado positivo. V. EXEMPLOS

[0090] Os exemplos específicos a seguir destinam-se a ilustrar a divulgação e não devem ser interpretados como sendo limitantes do escopo das reivindicações. Exemplo 1: Geração e Determinação da Sequência de Exemplares das Proteínas de Ligação à CDIM

[0091] Construção de DNA do plasmídeo. Todas as regiões pesadas variáveis dos constructos da cadeia mu da série H (designadas H1-H22) foram sintetizadas por Genscript com sítios Xba1-Kpn1 nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Todos os constructos da cadeia Mu da série H foram montados por isolamento de cada uma das regiões variáveis da cadeia pesada como fragmentos e Xba1-Kpn1, e unidos em uma ligação tripartite com um fragmento Kpn1- BamH1 abrangendo a região mu constante juntamente com o vetor de expressão AB11 que foi digerido com Xba1 e BamH1. Os plasmídeos ligados foram transformados em bactérias competentes. Os plasmídeos clonados resultantes foram confirmados por sequenciamento direto. Plasmídeos midipreps foram gerados usando Qiagen, para fornecer as quantidades adequadas de DNA para transfecção em células CHO-S.

[0092] Os plasmídeos da cadeia leve foram construídos de forma semelhante. A inserção de lambda foi clonada em uma ligação tripartite; a região lambda variável foi designada como um fragmento XbaI-EcoRI, que foi misturado com o fragmento da região constante lambda EcoRI- BamHI e ligado no vetor AB2 entre os sítios XbaI e BamHI. A inserção L2 kappa foi isolada como um fragmento XbaI-BamHI e foi ligada no vetor AB2-Kappa. Transfecção das células CHO-S com o DNA do plasmídeo H1- H22/L2.

[0093] O DNA correspondente às cadeias pesada e leve foi preparado por co-transfecção (quantidades iguais de L2 e de H1-22) utilizando a técnica PEI. Células CHO-S (1E8 de crescimento de fase logarítmica) usadas para transfecção foram cultivadas em meio RPMI1640. DNA:PEI foi misturado em 1:2 e essa mistura DNA:PEI foi adicionada às células CHO-S em CD OptiCHO suplementado com 0,5x Pen/Strep, Glutamax e HT. Após a incubação de um dia para o outro em um agitador fraco, o meio foi trocado em CD OptiCHO com 0,5x P/S, Glu. No dia 7 após a transfecção, o sobrenadante da cultura de células (100 mL) foi coletado por centrifugação das células. Para a caracterização desses exemplos de IgM, 15 mL do sobrenadante de cultura de células foi concentrado 10x usando o Centricon.

[0094] As sequências de aminoácidos das 22 regiões variáveis de cadeia pesada distintas são representadas nas figuras 1A a D. As sequências de aminoácidos das 2 regiões variáveis de cadeia leve distintas estão representadas na figura 1E. As sequências de aminoácidos das regiões constantes das cadeias pesada e leve são mostradas na figura 1F. Entende-se que as regiões constantes kappa ou lambda podem ser utilizadas. As sequências de aminoácidos que são representativas das proteínas de ligação à CDIM isoladas e identificadas, IGM1-IGM44, estão mostradas nas figuras 2A a 2V. As sequências da CDR3 de H1 até H22 estão representadas na figura 3.

[0095] Exemplos das sequências de polinucleotídeo que poderiam ser usadas para codificar as 44 proteínas de ligação à CDIM estão representados nas figuras 4A-L. Entende-se que, devido à degeneração no código genético, outras sequências poderiam ser utilizadas para codificar a sequência exata de aminoácidos. As sequências das várias regiões determinantes de complementaridade (CDRHs) e estrutura (FR) da região variável da cadeia pesada dos anticorpos que foram determinadas incluem a estrutura 1 (FR1), a região determinante de complementaridade 1 (CDRH1), a estrutura 2 (FR2), a região determinante de complementaridade 2 (CDRH2), a estrutura 3 (FR3) e a região determinante de complementaridade 3 (CDRH3).

Exemplo 2: Produção das Proteínas de Ligação à CDIM

[0096] Esse exemplo descreve como algumas das proteínas de ligação divulgadas foram feitas. As sequências consistiam em variantes da região variável da cadeia pesada e leve (regiões constantes kappa e lambda foram codificadas). Combinações específicas de variantes da cadeia pesada e leve foram transfectadas em células CHO, isto é, células DG44 CHO e transfecções transitórias foram realizadas. Níveis de expressão de 10 a 100 μg/mL foram obtidos a partir das transfecções iniciais. Os anticorpos IgM foram purificados por cromatografia por afinidade, avaliados por eletroforese em gel e testados quanto à bioatividade por ligação celular, ensaios de citotoxicidade e testes com ELISA para ligação a várias biomoléculas. Os resultados obtidos a partir dos ensaios funcionais foram utilizados para orientar a seleção do principal candidato. Uma vez selecionados, os candidatos principais foram transfectados estavelmente em células CHO e subclonados em 20 placas (cerca de 2000 poços) e testados, por ELISA quanto ao nível mais alto de secreção. Os 50 clones principais foram expandidos para frascos T75, após expansão dos 24 melhores clones transferidos para frascos agitadores. A IgM desses 24 clones foi purificada e quantificada, e os seis principais clones (selecionados pelos níveis de secreção do anticorpo IgM) foram cultivados em mais uma seleção de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) para facilitar o desenvolvimento de linhagens celulares com alto nível de secreção.

Exemplo 3: Avaliação da Expressão de IgM usando SDS-PAGE não redutor

[0097] A eletroforese em gel não redutora é um método de separação, normalmente usado em proteômica e separa proteínas com base nas estruturas oligoméricas e na massa molecular. Sob condições não redutoras, as ligações dissulfeto da proteína são deixadas intactas e, dessa forma, o oligômero IgM pode ser separado como estruturas pentaméricas ou hexaméricas.

[0098] Para confirmar a expressão do anticorpo IgM por transfecção transitória do sobrenadante de célula CHOS, realizamos a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS não redutora conforme descrito por em Vorauer-Uhl, et al, J Immunol. Methods 359 (2010): 21-27. Esse exemplo descreve como as mAbs de IgM transitoriamente transfectadas foram investigadas quanto à pureza e estrutura multimérica. A amostra da proteína de interesse é incubada com tampão de amostra SDS NuPage durante 5 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, os padrões de peso molecular e as amostras de teste são carregados no gel e analisados sob uma tensão constante de 100 V durante cerca de 2 horas até a parte frontal atingir a parte inferior do gel. Após a eletroforese, o gel é removido do aparelho XCell Mini-Cell, fixado e corado com corante azul coloidal.

[0099] Para demonstrar a formação de pentâmero e hexâmero, SDS PAGE não redutora do sobrenadante concentrado de células CHO, transfectada com as várias amostras da proteína de ligação à CDIM (L1 a L7 e L9 a L21, respectivamente), foi realizada utilizando os géis Bis-Tris de 3 a 12% Native Page novex da Life Technologies (Carlsbad, CA).

[0100] A Figura 5 mostra o gel de SDS corado de acordo com o protocolo de coloração azul coloidal (Life Technologies, Carlsbad, CA), com uma banda proeminente a 1.048 kD, que representa os pentâmeros de IgM, e uma banda proeminente a 1.236 KD, que representa os hexâmeros da IgM. Como pode ser observado na figura, a formação do pentâmero para os exemplos de IgM (seta sólida) é mais dominante em comparação com a formação do hexâmero. Da mesma forma, a IgM 216 humana isolada encontra-se predominantemente sob a forma pentamérica (seta tracejada), no entanto, ela aparece como um peso molecular mais baixo devido às menores cadeias leves de lambda menores incluídas nesse formato de IgM. Exemplo 4: Ligação das Proteínas de Ligação à CDIM ao antígeno da CDIM

[0101] Esse exemplo descreve como as propriedades de ligação dos anticorpos divulgados foram investigadas. Os anticorpos foram preparados por cromatografia por afinidade. Na figura 6a, a linhagem celular pro-B humana, NALM-6, que expressa o antígeno CDIM na superfície celular, foi marcada com uma série de anticorpos de IgM recombinantes. Os anticorpos foram usados para determinar o início de resposta à dose em 20 μg/tubo diluído em etapas, até uma concentração final em 0, 039 μg. As células foram marcadas em um volume de 100 μL em FBS/PBS a 3% em gelo durante 1 hora, seguido por uma marcação subsequente com IgM anti-humana conjugada DyLight-488 (Jackson Immuno), 1 μg/mL durante 20 minutos a 4 °C.

[0102] A análise da ligação à CDIM foi realizada em um citômetro de fluxo FACScan usando o software de análise CellQuest. Os resultados são mostrados como pontos de dados brutos com intensidade de fluorescência média (MFI) sobre o eixo Y e a concentração do anticorpo primário (μg/100 mL) sobre o eixo x.

[0103] Os dados foram reanalisados usando o programa de análise GraphPad para ajustar os resultados usando o ajuste de curva de regressão não linear. EC50 (mg/100 μl) para cada anticorpo foi igual a (a) 10,6 para IGM1, 2,2 (b) para IGM23, (c) 2,2 para IGM34 e 1,7 (d) para IGM36.

Exemplo 5: Citotoxicidade resultante da ligação celular das proteínas de ligação à CDIM

[0104] Esse exemplo descreve como a citotoxicidade das proteínas de ligação à CDIM foi investigada. A linhagem celular pro-B humana NALM-6 foi marcada de maneira idêntica como descrito na figura 6A acima. Na figura 6B, a morte celular foi avaliada pela medição da viabilidade celular após 1 hora de marcação. Através da quantificação da proporção de células que não absorveu iodeto de propídio, a porcentagem de células viáveis foi calculada. Os resultados são mostrados como dados brutos com a % de viabilidade sobre o eixo Y e a concentração (μg/100 μL) sobre o eixo x.

[0105] Resultados idênticos foram representados graficamente usando o programa de análise GraphPad, e os dados foram ajustados por meio do ajuste de curva de regressão não linear. A EC50 foi calculada para cada anticorpo usando a mesma abordagem descrita acima. EC50 (μg/100 μl) para cada anticorpo foi (a) 3,0 para IGM1, (b) 0,6 para IGM23, (c) 0,6 para IGM34 e 0,3 (d) para IGM36.

[0106] Os resultados das figuras 6A e 6B mostram que os anticorpos divulgados se ligam às células humanas B através de uma ampla faixa de doses e que esses anticorpos são citotóxicos para as células B, resultando em morte celular.

Exemplo 6: Citotoxicidade resultante do Ensaio de Citotoxicidade Dependente do Complemento Humano das Proteínas de Ligação à CDIM

[0107] a "citotoxidade dependente do complemento", ou "CDC", refere-se à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A ativação da via clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (CIq) aos anticorpos, que estão ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, conforme descrito em Hinton et al., J. Immunol. 1° de janeiro de 2006; 176(1): 346-56, pode ser realizado. Em resumo, esse exemplo descreve como a citotoxicidade das proteínas de ligação à CDIM foi investigada. As células pro-B-6 NALM humanas (50.000) foram plaqueadas em uma placa de microtitulação de fundo plano de 96 poços. O complemento humano é adicionado na diluição ideal testada com ou sem uma diluição em série do sobrenadante contendo os anticorpos de interesse expressos. Após 24 horas, um substrato colorimétrico CCK8 foi adicionado durante 3 horas e, em seguida, a densidade óptica (OD) foi medida no comprimento de onda de 450 nm em um leitor de placas de microtitulação. A quantificação do aumento na OD é diretamente proporcional à proliferação de células NALM-6 viáveis. A OD de Nalm6 não tratadas sem sobrenadante é, em seguida, usada para calcular 100%, com os valores de OD do sobrenadante normalizados adequadamente, para obter as porcentagens de viabilidade. Na figura 8, os resultados são mostrados como a viabilidade porcentual no gráfico sobre o eixo y versus o anticorpo contendo a concentração de sobrenadante (μg/mL) no eixo x. Esses resultados foram analisados usando o programa GraphPad e os dados foram modelados usando o ajuste da curva de regressão não linear de quatro parâmetros. A IC50 foi calculada para cada anticorpo usando a mesma abordagem descrita acima.

Exemplo 7: Ligação das proteínas de ligação à CDIM aos antígenos que não são da CDIM

[0108] Esse exemplo descreve a especificidade de ligação das proteínas de ligação à CDIM para os antígenos diferentes de CDIM. Os anticorpos foram purificados por cromatografia por afinidade. Os anticorpos foram testados através de uma ampla faixa de doses contra um painel de antígenos disponíveis em kits de ELISA comercialmente disponíveis. As placas de ELISA pré-revestidas com os antígenos, ssDNA (Inova Diagnostics, Inc., San Diego, CA), dsDNA (Inova Diagnostics, Inc., San Diego, CA.),cardiolipina (Inova Diagnostics, Inc., San Diego, CA.) MDA-LDL (lipoproteína de baixa densidade modificada por malondialdeído) (Rocky Mountain Diagnostics, Colorado Springs, CO.) foram adquiridas de vários fornecedores. Lipídio A (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) foi comprado como um antígeno, dissolvido em etanol e diluído em tampão carbonato de Na 100 mM em pH 9,5 antes do revestimento sobre as placas de ELISA. Anticorpos anti-CDIM foram usados nas concentrações indicadas e o ELISA foi realizado de acordo com as recomendações do fabricante. Em suma, as placas foram bloqueadas com BSA-leite em pó durante 1 hora, seguido de lavagem. Os anticorpos divulgados foram adicionados nas concentrações indicadas. Os anticorpos foram deixados se ligar durante 1,5 hora em temperatura ambiente, seguido por uma etapa de lavagem. O anticorpo IgM anti-humano conjugado com HRP foi adicionado, seguido pela adição de substrato. Os resultados foram quantificados usando absorvância a 450 nm (Bio-Tek Synergy HT). Conforme ilustrado nas figuras 8 e 9, MAb 216 se liga a todos os antígenos testados, enquanto cada um dos anticorpos divulgados apresenta ,menos ligação (ou seja, ssDNA) ou completa eliminação de especificidade pelo antígeno (ou seja, cardiolipina). Esses resultados demonstram que os anticorpos divulgados apresentam especificidades de ligação ao antígeno mais restritas do que o MAb 216.

[0109] A tabela 2 resume as características de potência e especificidade das várias proteínas de ligação à CDIM divulgadas na presente invenção.

[0110] A tabela 2 resume os dados mostrados na figura 6 e na figura 7 a partir das proteínas de ligação à CDIM, compreendendo as cadeias pesadas variáveis H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18, H19, H20 e H21, respectivamente. O valor de ELISA refere-se à concentração da IgM determinada no meio condicionado após a transfecção transitória das cadeias pesada e leve da IgM. A citotoxicidade IC50 é a metade da concentração máxima do anticorpo IgM que resulta em 50% de morte celular após incubação dos anticorpos, com o complemento humano e as células Nalm-6 (consulte também a figura 6). O valor de IC50 representa a potência das várias proteínas de ligação à CDIM divulgadas na presente invenção.

[0111] A ligação adicional aos outros antígenos (LPS, dsDNA, ssDNA, etc.) é a ligação observada no formato de ELISA (consulte também as figuras 9A-9F). A reatividade relativa das amostras de IgM aos vários antígenos baseia-se na reação máxima (OD450 nm) quando a IgM está na concentração de 10 mg/mL. Os valores mostrados representam os valores da inespecificidade das várias proteínas de ligação à CDIM. A pontuação da reatividade relativa é a seguinte: se OD450 fica entre 0 a 0,3, a pontuação atribuída é (-) menos. As pontuações (+), (++), (+++) e (++++) são atribuídas para valores máximos de ELISA de 0,3 a 1, 1 a 2, 2 a 3 e acima de 3, respectivamente.

[0112] Várias modificações e variações da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica sem se afastar do escopo e do espírito da divulgação. Embora a divulgação tenha sido descrita juntamente com as modalidades específicas, deve-se ter em mente que as reivindicações não devem ser indevidamente limitadas por tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a divulgação, que são compreendidos pelas pessoas versadas na técnica, destinam- se a estar compreendidos dentro do escopo das reivindicações.

Claims (22)

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo isolado que se liga ao antígeno da lactosamina de célula B linear CDIM caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma cadeia pesada que compreende uma CDRH1 com a sequência, como mostrada na SEQ ID NO: 76 e uma CDRH2 com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 77, e uma CDRH3 com a sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 78 a 90, 92 a 98 ou 99; (b) uma cadeia leve que compreende (i) uma CDRL1 com a sequência mostrada na SEQ ID NO:100, uma CDRL2 com a sequência mostrada nas SEQ ID NO: 102 e uma CDRL3 com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 104, ou (ii) uma CDRL1 com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 101, uma CDRL2 com a sequência mostrada nas SEQ ID NO: 103, e uma CDRL3 com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 105; e (c) uma cadeia pesada que compreende uma estrutura 1 (FR1) mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 22.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de não reagir substancialmente de forma cruzada com DNA de fita simples (ssDNA), DNA de fita dupla (dsDNA), lipopolissacarídeo, cardiolipina, condoitrina e heparano.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado que se liga ao antígeno da lactosamina de célula B linear CDIM caracterizado pelo fato de compreender uma sequência da região variável de cadeia pesada selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 e 22 e uma sequência da região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 23 ou 24.

4. Proteína de ligação ao antígeno isolada que se liga ao antígeno da lactosamina de célula B linear CDIM caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma região variável da cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:12; e (b) uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo na SEQ ID NO: 23 e na SEQ ID NO: 24.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo multiespecífico.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab)2, um fragmento Fv, um diacorpo ou uma molécula de anticorpo de cadeia única.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui um isotipo selecionado do grupo consistindo em IgA, IgD, IgM, IgG e IgE.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é uma IgM.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é acoplado a um grupo marcador.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito grupo marcador é um radioisótopo, um radionuclídeo, um grupo fluorescente, um grupo enzimático, um grupo quimiluminescente, um grupo biotinila ou um grupo de polipeptídeo predeterminado.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é acoplado a um grupo efetor.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito grupo efetor é um radioisótopo, um radionucleotídeo, uma toxina, um grupo terapêutico ou um grupo quimioterapêutico.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o grupo terapêutico ou quimioterapêutico é selecionado do grupo consistindo em caliqueamicina, auristatina-PE, geldanamicina e maitansina.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem como característica a (a) presença de uma cadeia J; ou (b) ausência de uma cadeia J.

17. Mistura do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado, como definido na reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a dita mistura é uma mistura que compreende pentâmeros e hexâmeros.

18. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender como um agente ativo de pelo menos anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno isolado como definido na reivindicação 1, e um veículo, diluente ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

19. Kit caracterizado pelo fato de compreender anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo isolado como definido na reivindicação 1.

20. Kit, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender um agente terapêutico adicional.

21. Kit, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico adicional é um agente antineoplásico.

22. Kit, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente antineoplásico é um anticorpo antitumor ou um agente quimioterapêutico.

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