BR112020007770A2 - anticorpo anti-cd3, uso do mesmo para prevenção ou tratamento de câncer, composição farmacêutica compreendendo dito anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira e método para produção de um anticorpo que se liga especificamente ao cd3 - Google Patents
anticorpo anti-cd3, uso do mesmo para prevenção ou tratamento de câncer, composição farmacêutica compreendendo dito anticorpo, polinucleotídeo, vetor de expressão, célula hospedeira e método para produção de um anticorpo que se liga especificamente ao cd3 Download PDFInfo
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Abstract
A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-CD3 e uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer compreendendo o mesmo. O anticorpo, de acordo com a presente invenção, possui alta afinidade e especificidade para CD3 e, portanto, pode ser efetivamente usado na prevenção ou tratamento do câncer.
Description
“ANTICORPO ANTI-CD3, USO DO MESMO PARA PREVENÇÃO OU TRATAMENTO DE CÂNCER, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO DITO ANTICORPO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE AO CD3"
[001] A presente invenção refere-se a um anticorpo anti-CD3 e a uma composição farmacêutica para o tratamento do câncer compreendendo o mesmo.
[002] Entre as várias causas de morte, a morte por câncer ocorre fre células imunes sejam ativadas e, em seguida, readministrar as células imunes resultantes ao paciente.
[004] A presente invenção foi desenvolvida para resolver os problemas do estado da arte mencionados acima. Um objetivo da presente invenção é proporcionar um anticorpo com alta afinidade de ligação a CD3 e uma composição farmacêutica com excelente eficácia no tratamento do câncer utilizando o mesmo.
[005] No entanto, o problema a ser resolvido pela presente invenção não se limita aos problemas mencionados acima, e outros problemas que não são mencionados serão claramente entendidos pelos técnicos no assunto a partir da descrição seguinte.
[006] Em um aspecto da presente invenção, um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve (domínio VL) que consiste em uma sequência com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 15, ou 16 e um domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) que consiste em uma sequência com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18 a 25 é proporcionado.
[007] Em outro aspecto da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica o domínio variável de cadeia leve (domínio VL) e o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) do anticorpo é proporcionado.
[008] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo é proporcionado.
[009] Ainda em outro aspecto da presente invenção, uma célula hospedeira transformada com o vetor de expressão é proporcionada.
[001] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um método para a produção de um anticorpo que se liga especificamente a CD3 é proporcionado, o qual compreende cultivar a célula hospedeira.
[002] Ainda em outro aspecto da presente invenção, uma composição farmacêutica para prevenção ou tratamento do câncer compreendendo o anticorpo ou um fragmento do mesmo é proporcionada.
[003] Devido à alta afinidade e especificidade ao CD3, um anticorpo da presente invenção pode ser efetivamente usado para prevenção ou tratamento do câncer.
[004] Deve ser entendido que o efeito da presente invenção não se limita aos efeitos descritos acima e inclui todos os efeitos dedutíveis a partir da configuração da invenção descrita na descrição detalhada ou nas reivindicações da presente invenção.
[005] Fig. 1 ilustra os resultados obtidos da análise de afinidade de ligação dos anticorpos às células T humanas de acordo com uma forma de realização da presente invenção.
[006] Fig. 2 ilustra os resultados obtidos da análise de afinidade de ligação dos anticorpos às células T de macaco de acordo com uma forma de realização da presente invenção.
[007] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.
[008] Em um aspecto da presente invenção, um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia leve (domínio VL) que consiste em uma sequência com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 15 ou 16 e um domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) que consiste em uma sequência com pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18 a 25 é proporcionado.
[009] O domínio variável de cadeia leve pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e prioritariamente pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 15 ou 16.
[0010] Além disso, o domínio variável de cadeia pesada pode consistir em uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% e prioritariamente pelo menos 99% de identidade com uma sequência de aminoácidos de qualquer um das SEQ ID NOs: 18 a 25.
[0011] O anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia leve e o domínio variável de cadeia pesada pode se ligar especificamente ao Cluster de Diferenciação 3 (CD3). Aqui, o anticorpo pode ter reatividade cruzada ao CD3 de humano e macaco. Ou seja, o CD3 pode incluir, mas não está limitado ao CD3 derivado de humano e CD3 derivado de macaco.
[0012] Conforme utilizado neste documento, o termo "CD3" pode se referir a um conceito que coletivamente se refere ao próprio CD3 e a qualquer variante, isotipo e parálogo do mesmo, que estão presentes em um animal, mais preferencialmente em um humano e um macaco. Além disso, conforme utilizado neste documento, o termo "CD3 humano" refere-se a CD3 derivado de humanos. Conforme utilizado neste documento, o termo "CD3 de macaco" refere-se a CD3 derivado de macaco.
[0013] Conforme utilizado neste documento, o termo "anticorpo" refere-se a uma molécula de imunoglobulina (Ig) que é imunologicamente reativa a um antígeno específico, isto é, uma molécula de proteína que atua como um receptor que reconhece especificamente um antígeno. Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo completo ou um fragmento de anticorpo.
[0014] Nos domínios variáveis das deias leve e pesada, alguns aminoácidos podem ser substituídos, inseridos B/ou excluídos, desde que sejam mantidas as propriedades consistentes com o obj&o da presente invenção, tais como a afinidade e especificidade ao CD3. Por exemfllo, substituições conservativas de aminoácidos podem ocorrer nos domínios variágs de cadeia leve e/ou pesada. À substituição conservativa significa uma suba&Btuição de uma sequência de aminoácidos original por outro resíduo de aminoádiilo que apresenta uma propriedade semelhante.
[0015] Por exemplo, lisina, argininafle histidina têm propriedades semelhantes, pois possuem uma cadeia lateral bifbica, e o ácido aspártico e o ácido glutâmico têm propriedades semelhantes, pois Alêssuem uma cadeia lateral ácida. Além disso, glicina, asparagina, glutamina, seliha, treonina, tirosina, cisteína e triptofano têm propriedades semelhantes, pois poffuem uma cadeia lateral polar sem carga; alanina, valina, leucina, treonina, isoleucirilf, prolina, fenilalanina e metionina têm propriedades semelhantes, pois possuem umáicadeia lateral não polar; e tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina têm propriedaddil semelhantes, pois possuem uma cadeia lateral aromática.
[0016] Portanto, é evidente para os técniflbs no assunto que as substituições de aminoácidos dentro do grupo dos aminoácidoslitom propriedades semelhantes às descritas acima não causarão nenhuma alteraçâdBignificativa nas propriedades. Por esse motivo, os anticorpos que sofreram variadão causada por uma substituição conservativa dentro do domínio variável tamb estão incluídos no escopo da presente invenção, desde que tais anticorpos mallenham propriedades do anticorpo da presente invenção.
[0017] Por outro lado, o anticorpo pode s&-
Aqui, as células T podem incluir, mas não estão limitadas às células T derivadas de humano e células T derivadas de macaco.
[0018] Ou seja, quando o anticorpo está presente no corpo, esse anticorpo pode atrair as células T através da ligação específica ao CD3. Por conseguinte, as células T atraídas podem induzir respostas imunes na vizinhança das mesmas e podem atacar ainda os tumores, como as células cancerosas e semelhantes.
[0019] Os domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo podem consistir nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e nas regiões de estrutura ou framework (FRs). Tipicamente, as CDRs conferem especificidade de ligação a antígenos específicos, e as FRs funcionam para formar a estrutura dobrada do anticorpo, de modo a ajudar a ligação das CDRs ou similares.
[0020] O anticorpo pode ser um anticorpo que mantém as CDRs do anticorpo anti-CD3 de camundongo existente, SP34, no qual os aminoácidos do domínio constante (Fc) e as FRs do domínio variável de SP34 são parcial ou totalmente substituídos por seus homólogos humanos.
[0021] O anticorpo pode compreender uma CDR1 de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; uma CDR?2 de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; uma CDR3 de cadeia leve incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; uma CDR1 de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; uma CDR?2 de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; e uma CDR3 de cadeia pesada incluindo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[0022] Por conseguinte, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado que se liga especificamente ao CD3 humano. Conforme utilizado neste documento, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico que contém uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina de um anticorpo não-humano, como um anticorpo de camundongo, e pode significar um anticorpo no qual todas as partes, exceto uma sequência correspondente a uma região hipervariável, são substituídas pelos seus homólogos humanos.
[0023] Além disso, o termo "região hipervariável (HVR)" refere-se a uma região de um domínio variável que exibe hipervariabilidade ou forma um loop ou alça estruturalmente definida na sequência de um anticorpo. Entre as definições que identificam a mesma, a definição da região determinante de complementaridade (CDR) de acordo com Kabat é a mais comumente usada para classificar as regiões com base na variabilidade da sequência.
[0024] Quanto ao anticorpo, um fragmento de anticorpo do mesmo pode ser utilizado também desde que o fragmento de anticorpo mantenha a função do anticorpo. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode incluir, mas não está limitado aos anticorpos de cadeia única, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fd's, scFv's, domínios de anticorpos, minicorpos, scAb's, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgM, anticorpos IgG1, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3, anticorpos IgG4, derivados de domínios constantes de anticorpos, anticorpos artificiais com base em arcabouços proteicos, e semelhantes, que mantêm uma função de ligação ao CD3.
[0025] Enquanto isso, o anticorpo pode ser utilizado também sob a forma de um conjugado anticorpo-droga (ADC) obtido pela ligação do anticorpo a uma droga anticâncer com eficácia na inibição da proliferação de células tumorais. Conforme utilizado neste documento, o termo "anticâncer" inclui efeitos de "prevenção" e "tratamento" do câncer, e a "prevenção" significa qualquer ato de inibição ou atraso do câncer. Além disso, o "tratamento" significa qualquer ato de melhoria ou alteração benéfica dos sintomas do câncer.
[0026] A droga que pode ser utilizada no conjugado anticorpo-droga inclui qualquer composto com efeito citotóxico ou citostático e uma parte ou grupo funcional do composto. Exemplos de drogas incluem os inibidores de formação de estrutura de microtubulina, inibidores de meiose, inibidores de RNA polimerase, inibidores de topoisomerase, intercalantes de DNA, alquilantes de DNA, inibidores ribossômicos, MIRNAs, shRNAs, siRNAs, radioisótopos e toxinas, entre os quais pelo menos um composto pode ser utilizado.
[0027] A droga pode incluir, mas não está limitada a maitansinoide, auristatina, dolastatina, tricoteceno, CC1065 (NSC 298223), caliqueamicina, taxanos, antraciclinas, metotrexato, adriamicina, vindesina, alcaloides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina, daunomicina, etoposídeo, teniposídeo, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, bleomicinas, esperamicinas, outros antibióticos de enediina, 5-fluorouracil, outras mostardas de nitrogênio e estereoisômeros, isósteros, homólogos, ou derivados do mesmo, cis-platina e homólogos de cis-platina, outras enzimas intercalantes e fragmentos das mesmas, por exemplo, nucleases, antibióticos, toxinas (toxinas enzimaticamente ativas ou toxinas de molécula pequena de origem fúngica, bacteriana, vegetal ou animal), e vários agentes antitumorais ou anticâncer, como cisplatina, CPT-11, paclitaxel e docetaxel.
[0028] Além disso, o radioisótopo (radionuclídeo) inclui 3H, 14C, 32P, 35S, 36CI, S1Cr, Co, *Co, Co, *ºFe, ºY, 125], 131), 1868Re e similares. MicroRNAs (mIRNAs), SIRNAs, shRNAs e similares que podem inibir a expressão de certos oncogenes podem ser utilizados também.
[0029] A ligação do anticorpo anti-CD3 a uma droga é conseguida por meio da conjugação com um grupo funcional, tal como um grupo tiol de um resíduo de aminoácido, tal como lisina ou cisteína no anticorpo. Se necessário, também é possível realizar a conjugação em uma forma mediada por ligante comumente utilizada. Um ligante à base de maleimida ou iodo acetamida pode ser utilizado também.
[0030] Quando uma droga é conjugada ao anticorpo ou a um fragmento do mesmo, a droga pode ser conjugada ao sítio C-terminal, que está do lado oposto ao sítio de ligação ao antígeno, do ponto de vista de diminuir um efeito na capacidade e especificidade de ligação do anticorpo ou fragmento ao CD3. Quando o anticorpo completo, em vez de um fragmento do mesmo, é usado, a droga pode ser conjugada a uma região Fc.
[0031] Além disso, o anticorpo pode ser usado também como um agente terapêutico baseado no receptor de antígeno quimérico (CAR) contendo o mesmo. Exemplos de um tal agente terapêutico incluem preferencialmente, mas não estão limitados à terapia de receptor de antígeno quimérico de células T (CAR-célula T) ou receptor de antígeno quimérico de célula natural killer (CAR-célula NK).
[0032] O anticorpo pode ser utilizado também na forma de um anticorpo biespecífico contendo um anticorpo anti-CD3. O anticorpo biespeciífico é um anticorpo que tem capacidade de ligação a dois antígenos ao mesmo tempo e pode existir tipicamente sob uma forma na qual pares de cadeias pesada e leve que se ligam a antígenos diferentes estejam conectados entre si.
[0033] Além disso, o anticorpo biespecífico está disponível em uma forma, tal como um anticorpo biespecífico de cadeia única, onde fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFv's), nos quais VL e VH estão ligados entre si por um peptídeo ligante curto, estão conectados na forma scFv1-scFv2(-Fc), um anticorpo duplo baseado em anticorpo de domínio único (sdAb) usando VH e um anticorpo biespecífico gerado usando a tecnologia BITE (vide http://www.micromet.de) da Micromet, Alemanha.
[0034] O anticorpo biespecífico pode existir em uma forma, na qual o anticorpo anti-CD3 está ligado a um anticorpo ou a um fragmento do mesmo com capacidade de ligação a uma molécula-alvo específica de célula imunopotente. À molécula-alvo específica de célula imunopotente pode ser preferencialmente selecionada de, mas não está limitada ao TOR/CD3, CD16 (FeyRllla), CD44, CD56, CD69, CD64 (FcyRI), CD89 e CD11b/CD18 (CR3).
[0035] Em outro aspecto da presente invenção, um polinucleotídeo que codifica o domínio variável de cadeia leve (domínio VL) e o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) do anticorpo de acordo com a presente invenção e um vetor de expressão compreendendo o mesmo são proporcionados.
[0036] O polinucleotídeo que codifica o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo ou um fragmento de anticorpo, ou seja, genes, podem ser facilmente derivados pelos técnicos no assunto a partir da sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD3.
[0037] Conforme utilizado neste documento, o termo "vetor de expressão" refere-se a um vetor recombinante capaz de expressar uma proteína-alvo em uma célula hospedeira e significa uma construção genética que contém elementos reguladores essenciais operacionalmente ligados à mesma, de modo que um gene inserido seja expresso. O gene que codifica o anticorpo anti-CD3 pode ser inserido em um vetor separado ou pode ser usado em uma forma em que seja inserido no mesmo vetor.
[0038] Especificamente, o polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos do anticorpo anti-CD3 pode ser utilizado em uma forma em que seja inserido em um vetor separado ou no mesmo vetor, e o polinucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou um domínio variável de mesma pode ser usado em uma forma em que seja inserido em um vetor separado ou no mesmo vetor.
[0039] Conforme utilizado neste documento, o termo "operacionalmente ligado" significa que uma sequência reguladora da expressão de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína desejada estão operacionalmente ligadas para desempenhar uma função desejada. A ligação operacional com um vetor recombinante pode ser alcançada utilizando-se técnicas de recombinação genética bem conhecidas no estado da arte, e a clivagem e ligação de DNA sítio-específicas podem ser facilmente alcançadas utilizando-se enzimas e similares comumente conhecidas no estado da arte.
[0040] Os vetores de expressão adequados para a produção do anticorpo anti-CD3 podem conter sequências-sinal para o direcionamento à ou secreção da membrana, além de elementos reguladores de expressão, como promotores, códons de iniciação, códons de parada, sinais de poliadenilação e intensificadores. Os códons de iniciação e os códons de parada são geralmente considerados parte de uma sequência nucleotídica que codifica uma proteína-alvo imunogênica. Tais códons devem ser funcionais em um indivíduo quando uma construção genética é administrada e devem estar no mesmo quadro (de leitura) de uma sequência codificante. Em geral, os promotores podem ser constitutivos ou induzíveis. O promotor pode incluir, mas não está limitado aos promotores procarióticos, como lac, tac, T3 e T7, promotores do vírus símio 40 (SV40), promotores do vírus de câncer de mama de camundongo (MMTV), promotores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), por exemplo, repetição de terminal longo (LTR) do HIV, promotores do vírus Moloney, promotores do citomegalovírus (CMV), promotores do vírus Epstein bar (EBV), promotores do vírus do sarcoma de Rous (RSV), bem como promotores de B- actina, promotores eucarióticos derivados de hemoglobina humana, creatina muscular humana, metalotiona humana, e semelhantes.
[0041] O vetor de expressão pode conter ainda um marcador selecionável que permite a seleção de células hospedeiras contendo o mesmo. O marcador selecionável serve para selecionar as células transformadas com o vetor. Quanto ao marcador selecionável, marcadores que conferem um fenótipo selecionável, como resistência a drogas, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou expressão de proteínas de superfície podem ser utilizados. Em um ambiente tratado com um agente seletivo, apenas as células que expressam um marcador de seleção sobrevivem, o que permite a seleção das células transformadas. Além disso, quando o vetor é um vetor de expressão replicável, esse vetor pode conter uma origem de replicação que é uma sequência específica de ácido nucleico a partir da qual a replicação é iniciada.
[0042] Como um vetor de expressão recombinante para inserção de um gene estranho, várias formas de vetores, como plasmídeos, vírus e cosmídeos, podem ser utilizadas. O tipo de vetor recombinante não está particularmente limitado, desde que o vetor funcione para expressar um gene desejado e produzir uma proteína desejada em várias células hospedeiras, incluindo células procarióticas e/ou eucarióticas. O vetor pode ser preferencialmente um vetor capaz de produzir uma grande quantidade de proteína estranha que está em uma forma semelhante ao seu estado natural enquanto possui um promotor com forte atividade e forte capacidade de expressão.
[0043] Várias combinações de hospedeiro/vetor de expressão podem ser usadas para expressar o anticorpo anti-CD3. O vetor de expressão adequado para hospedeiros eucarióticos inclui, mas não está limitado às sequências reguladoras de expressão derivadas de SV40, papilomavírus bovino, adenovírus, vírus adenoassociado, citomegalovírus e retrovírus. O vetor de expressão que pode ser utilizado em hospedeiros bacterianos inclui plasmídeos bacterianos obtidos a partir de Escherichia coli, tal como PET, pRSET, pBluescript, DGEX2T, vetor puUC, colE1, pCR1, pPBR322, pMB9, e seus derivados; plasmídeos com uma ampla gama de hospedeiros, como RP4; DNAs de fago que podem ser exemplificados por uma grande variedade de derivados de fago lambda, tais como Agt 10, Agt11 e NM989; e outros fagos de DNA, tais como M13 e fagos filamentosos de DNA de fita simples. O vetor de expressão útil para células de levedura pode incluir plasmídeos de 2 micra e seus derivados. O vetor útil para células de inseto pode ser pVL941.
[0044] Ainda em outro aspecto da presente invenção, uma célula hospedeira é proporcionada e transformada com o vetor de expressão de acordo com a presente invenção. O vetor de expressão pode ser inserido em uma célula hospedeira para gerar um transformante. Uma célula hospedeira adequada para o vetor pode incluir células procarióticas como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis ou Staphylococcus sp. Além disso, a célula hospedeira pode incluir células eucarióticas, incluindo células eucarióticas inferiores de fungos, como Aspergillus sp., leveduras como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. e Neurospora crassa e outros eucariotos inferiores e células eucarióticas superiores, como células de inseto. Além disso, a célula hospedeira pode ser derivada também de plantas ou mamíferos. De preferência, a célula hospedeira que pode ser usada inclui, mas não está limitada às células de rim de macaco (células COS7), células NSO (células de mieloma de origem murina), células SP2/0 (células de mieloma de origem murina), outras linhagens celulares de mieloma, células de ovário de hamster chinês (CHO), células W138 (cultura de células humanas diplóides), células de rim de hamster bebê (BHK), células MDCK, células HuT 78, células HEK293 e similares, sendo as células CHO as preferenciais.
[0045] Conforme utilizado neste documento, o termo "transformação em células hospedeiras" pretende incluir qualquer método para introduzir um ácido nucleico em um organismo, célula, tecido ou órgão e, e essa transformação pode ser realizada utilizando-se uma técnica-padrão conhecida no estado da arte selecionada dependendo do tipo de célula hospedeira. Especificamente, a eletroporação, fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO34), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl2), agitação utilizando fibra de carbeto de silício, transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por PEG, sulfato de dextrano, lipofectamina ou dessecação/inibição ou semelhante pode ser usada. No entanto, a presente invenção não está limitada às mesmas.
[0046] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um método para a produção de um anticorpo que se liga especificamente ao CD3 é proporcionado, o qual compreende cultivar a célula hospedeira. Especificamente, o método para a produção de um anticorpo pode compreender as etapas de: inserir uma sequência nucleotídica que codifica o anticorpo anti-CD3 em um vetor para a construção de um vetor recombinante; transformar uma célula hospedeira com o vetor recombinante e realizar sua cultura; e uma etapa de separar e purificar um anticorpo humanizado do transformante cultivado.
[0047] Os anticorpos humanizados podem ser produzidos em grande quantidade através da cultura do transformante, no qual o vetor recombinante é expresso, em um meio nutriente, e as condições do meio e da cultura podem ser adequadamente selecionadas dentre aquelas conhecidas no estado da arte, dependendo do tipo de célula hospedeira. Na cultura, condições como temperatura, pH de um meio e tempo de cultura podem ser ajustadas adequadamente de forma a estarem adequadas ao crescimento celular e produção em massa de uma proteína.
[0048] Os anticorpos anti-CD3 produzidos de forma recombinante, como descrito acima, podem ser recuperados a partir de um meio ou de um lisado celular. Quando o anticorpo está em uma forma ligada à membrana, tal anticorpo pode ser liberado da membrana utilizando-se uma solução tensoativa adequada (por exemplo, Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células usadas para a expressão dos anticorpos humanizados podem ser rompidas por vários meios físicos e químicos, tais como ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, ruptura mecânica ou agentes de lise celular, e a separação e a purificação podem ser realizadas utilizando- se técnicas bioquímicas de separação convencionais. A técnica de separação bioquímica que pode ser utilizada inclui, mas não está limitada a eletroforese, centrifugação, filtração em gel, precipitação, diálise, cromatografia (cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia imunoabsorvente, cromatografia por exclusão de tamanho, ou semelhantes), foco isoelétrico e similares.
[0049] Além disso, ainda em outro aspecto da presente invenção, uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento do câncer compreendendo um anticorpo de acordo com a presente invenção ou um fragmento do mesmo é proporcionada.
[0050] O tipo de câncer que pode ser tratado com a composição farmacêutica pode incluir o câncer sólido e o câncer hematológico, pode incluir preferencialmente qualquer tipo de câncer que expressa CD3. Aqui, o anticorpo pode atrair as células T por meio da ligação específica a CD3, e, deste modo, induzir a morte das células cancerosas.
[0051] Especificamente, o câncer pode ser, mas não está limitado ao câncer pancreático, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer retal, câncer de tireoide, câncer esofágico, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de colo de útero, câncer de mama, câncer hematológico, câncer de pele, câncer epitelial, câncer cerebral, câncer do sistema nervoso central ou câncer ovariano.
[0052] A composição farmacêutica pode compreender ainda um carreador farmaceuticamente aceitável. Como carreador farmaceuticamente aceitável, um ligante, um agente deslizante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizante, um dispersante, um estabilizante, um agente de suspensão, um pigmento, um aromatizante, e semelhantes podem ser utilizados para administração oral; um tampão, um agente conservante, um agente de alívio da dor, um solubilizante, um agente isotônico, um estabilizante e similares podem ser usados em uma mistura para injeções; e uma base, um excipiente, um lubrificante, um agente conservante e semelhantes podem ser utilizados para administração tópica.
[0053] As formulações da composição farmacêutica da presente invenção podem ser preparadas de várias maneiras por estarem misturadas com o carreador farmaceuticamente aceitável, tal como descrito acima. Por exemplo, para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada sob a forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, Wwafers ou semelhantes. Para injeções, a composição farmacêutica pode ser formulada sob a forma de ampolas de dosagem única ou formas de dosagem múltipla.
[0054] Além disso, a composição farmacêutica pode conter um tensoativo que pode melhorar a permeabilidade da membrana. Esses tensoativos podem ser derivados de esteroides ou podem incluir lipídeos catiônicos, como cloreto de N-[1- (2,3-dioleoil) propil-N,N N-trimetilamônio (DOTMA) ou vários compostos como hemisuccinato de colesterol e fosfatidilglicerol. No entanto, o tensoativo não está limitado aos mesmos.
[0055] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um método para o tratamento ou inibição do crescimento do câncer é proporcionado, o qual compreende administrar uma composição farmacêutica a um indivíduo. A composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-CD3 pode ser administrada em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para tratar as células cancerosas ou suas metástases ou para inibir o crescimento do câncer. A quantidade efetiva pode variar dependendo de vários fatores, como tipo de câncer, idade, peso do paciente, natureza e gravidade dos sintomas, tipo de terapia atual, número de tratamentos, forma de dosagem e via de administração, e pode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto correspondente.
[0056] A composição farmacêutica pode ser administrada em conjunto ou sequencialmente com os componentes farmacológicos ou fisiológicos acima mencionados, e pode ser administrada também em combinação com agentes terapêuticos convencionais adicionais, sendo que, neste caso, a composição farmacêutica pode ser administrada sequencial ou simultaneamente com os agentes terapêuticos convencionais. Essa administração pode ser única ou múltipla. Levando- se em consideração todos os fatores acima, é importante administrar uma quantidade mínima e permitir que o efeito máximo seja obtido sem efeitos colaterais, e essa quantidade pode ser facilmente determinada pelos técnicos no assunto.
[0057] Conforme utilizado neste documento, o termo "indivíduo" refere-se a um mamífero, preferencialmente humano, sofrendo de ou em risco de desenvolver uma condição ou doença que pode ser aliviada, inibida ou tratada pela administração da composição farmacêutica.
[0058] Conforme utilizado neste documento, o termo "administração" significa introduzir uma substância predeterminada em um indivíduo de qualquer maneira adequada, e a composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via, desde que a via permita que a composição farmacêutica alcance um tecido-alvo. Esse método de administração pode incluir, mas não está limitado à administração intraperitoneal, administração intravenosa, administração intramuscular, administração — subcutânea, administração intradérmica, administração oral, administração tópica, administração intranasal, administração pulmonar ou administração retal. Aqui, no caso de ser administrado por via oral, do ponto de vista de que as proteínas são digeridas, pode ser desejável formular uma composição para uso oral em que um agente ativo seja revestido ou a composição seja protegida da digestão no estômago. Além disso, a composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer dispositivo, de modo que um ingrediente ativo possa migrar para sua célula-alvo.
[0059] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um uso do anticorpo da presente invenção para prevenção ou tratamento do câncer é proporcionado.
[0060] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um uso do anticorpo da presente invenção para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento do câncer é proporcionado.
[0061] Ainda em outro aspecto da presente invenção, um método para prevenção ou tratamento do câncer é proporcionado, o qual compreende administrar o anticorpo da presente invenção a um indivíduo.
[0062] A seguir, a presente invenção será descrita detalhadamente a título de exemplos. Os exemplos a seguir são descritos com o objetivo de ilustrar a presente invenção, e o escopo da presente invenção não está limitado a isso.
[0063] Exemplo 1. Produção de candidatos a anticorpos humanizados anti- CD3
[0064] Exemplo 1.1 Seleção de anticorpos candidatos para humanização
[0065] As sequências de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve (domínio VL) e do domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) de SP34 de camundongo, conhecido como anticorpo anti-CD3, foram inseridas em um banco de dados baseado na web (IG9BLAST) e, em seguida, as sequências de anticorpo embrionário humano mais semelhantes foram pesquisadas. Como resultado, a similaridade mais alta da sequência de aminoácidos foi mostrada entre a região variável da cadeia leve de SP34 de camundongo e o Homo sapiens IGLV7-46*01 (nome do gene no IMGT) e entre o domínio variável de cadeia pesada de SP34 de camundongo e do Homo sapiens IGHV3-73*02 (nome do gene no IMGT).
[0066] Exemplo 1.2 Humanização do domínio variável de cadeia leve
[0067] A sequência de aminoácidos da CDR do Homo sapiens IGLV7-46*01 (nome do gene no IMGT), um anticorpo embrionário humano com uma sequência mais semelhante ao domínio variável de cadeia leve de SP34, foi substituída pela sequência CDR de SP34 de camundongo, para preparar um domínio variável de cadeia leve parcialmente humanizada de SP34.
[0068] A fim de melhorar as propriedades de ligação ao antígeno do domínio variável de cadeia leve parcialmente humanizado de SP34, os resíduos de aminoácidos nas sequências da região estrutural (FR), que supostamente desempenham uma função importante nas propriedades de ligação ao antígeno, foram substituídos pelos mesmos resíduos de aminoácido do SP34 de camundongo.
A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve humanizado de SP34 então preparada está ilustrada na Tabela 1 abaixo.
[0069] Com referência à Tabela 1, modificações aleatórias foram feitas nos resíduos de aminoácidos 38, 48, 51 e 71 do domínio variável de cadeia leve do SP34 de camundongo para preparar um total de 16 domínios variáveis de cadeia leve humanizados de SP34. Aqui, o domínio variável de cadeia leve do SP34 de camundongo foi utilizado como controle para comparação da afinidade a um antígeno CD3.
TABELA 1 Sequência de aminoácidos SEQ ID Clone |Domínio Variável (As letras em negrito indicam CDR1, CDR?2, NO CDR3 da cadeia leve nesta ordem
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QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSN 16 Cadeia Leve YANWVOQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFS 16
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FGGGTKLTVLG Exemplo 1.3 Humanização do domínio variável de cadeia pesada
[0070] A sequência de aminoácidos da CDR do Homo sapiens IGLV3-73*02 (nome do gene no IMGT), um anticorpo embrionário humano com uma sequência mais semelhante ao domínio variável de cadeia pesada de SP34, foi substituída pela sequência CDR do SP34 de camundongo, para preparar um domínio variável de cadeia pesada parcialmente humanizado de SP34.
[0071] Afim de melhorar as propriedades de ligação ao antígeno do domínio variável de cadeia pesada parcialmente humanizado de SP34, os resíduos de aminoácidos nas sequências da região estrutural (FR), os quais se acredita que desempenhem uma função importante nas propriedades de ligação ao antígeno, foram substituídos pelos mesmos resíduos de aminoácido que o SP34 de camundongo. A sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada humanizado de SP34 então preparado está ilustrada na Tabela 2 abaixo.
[0072] Com referência à Tabela 2, modificações aleatórias foram feitas nos resíduos de aminoácidos 49, 78, 79 e 81 do domínio variável de cadeia pesada do SP34 de camundongo, para preparar um total de 8 domínios variáveis de cadeia pesada humanizados do SP34. Aqui, o domínio variável de cadeia pesada do SP34 de camundongo foi usado como controle para comparação da afinidade a um antígeno CD3.
TABELA 2 Sequência de aminoácidos SEQ ID Clone | Domínio Variável | (As letras em negrito indicam CDR1, CDR2, CDR3 NO da cadeia pesada nesta ordem
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM A Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKD 18
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKD 19
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM Cc Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKD 20
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKD 21
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM E Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKD 22
Sequência de aminoácidos SEQ ID Clone | Domínio Variável | (As letras em negrito indicam CDR1, CDR2, CDR3 NO da cadeia pesada nesta ordem
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM FE Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKD 23
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM G Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKD 24
EVOLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAM H Cadeia Pesada NWVRQASGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKD 25
EVOLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAM SP34 | Cadeia Pesada NWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKD 26
FGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS Exemplo 1.4 Clonagem de candidatos a anticorpos humanizados anti-CD3
[0073] Cada um dos genes para os 16 domínios variáveis de cadeia leve, como preparados acima, foi inserido no vetor de expressão em células animais pPcDNA3.4 contendo um domínio constante de cadeia leve lambda (A-CL), e cada um dos genes para os 8 domínios variáveis de cadeia pesada foi inserido no vetor de expressão de células animais pcDNA3.4 contendo domínios constantes de IgG1 (CH1, dobradiça, CH2, CH3).
[0074] As respectivas sequências de aminoácidos específicas para o domínio constante da cadeia leve lambda e o domínio constante da cadeia pesada de IgG1 estão ilustradas na Tabela 3 abaixo.
TABELA 3
QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFY R Cadeia Leve PGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNK 27
FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYS : LSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK Ig61 | Cadeia Pesada | yEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPP| — 28
TQOKSLSLSPGK Exemplo 1.5. Transfecção de candidatos a anticorpos humanizados anti-CD3
[0075] Vinte quatro horas antes da transfecção, as células Expi293F a uma densidade de 2,0 x 10º células/mL foram passadas com meio Expi293 a 125 + 10 rom em uma incubadora com agitação a uma condição de 37ºC e 8% de CO>2. Quando a transfecção foi realizada, o número de células e a viabilidade celular foram medidas para identificar se a viabilidade celular de 95% ou mais foi apresentada.
[0076] As células foram dispensadas a 7,5 x 107 células em um frasco de cultura de 125 mL, e, em seguida, o meio Expi293 foi adicionado para ajustar o volume final para 25 mL (com base em 30 mL). Usando o meio Opti-MEM |, 30 ug do vetor que expressa anticorpo foram misturados ao mesmo a um total de 5 mL ea incubação foi realizada por 5 minutos à temperatura ambiente. Para os vetores de anticorpos, um total de 128 anticorpos SP34 IgG1 humanizados, obtidos pela combinação dos vetores de expressão para 8 domínios variáveis de cadeia pesada com os vetores de expressão para 16 domínios variáveis de cadeia leve foram utilizados. O anticorpo quimérico SP34 IgG1 de humano e camundongo foi usado como um vetor de anticorpo controle. As combinações específicas dos anticorpos estão ilustradas na Tabela 4 abaixo.
TABELA 4 Clone Cadeia Pesada (VH) 1 A ]B |] Cc] pD|/E| FG | hn | Cadeia reve »
[A | B]|c] DpD|E| FG n| [—o6 | ao6 | Bos | cos | Dos | Eos | Fos | cos | mos | [ o8 | aos | Bos | cos | Dos | Eos | Fos | Gos | mos | [oa [ros | Bog | cos | Dos | Eo9 | Fos | eos | mos |
[0077] Usando o meio Opti-MEM |, 80 uL de reagente de transfecção foram misturados ao mesmo a um total de 1,5 mL e a incubação foi realizada à temperatura ambiente por 5 minutos. Os meios Opti-MEM | contendo, respectivamente, o vetor e o reagente de transfecção, foram suavemente misturados e deixados reagir à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, o resultante foi colocado no frasco contendo as células Expi293F. A incubação foi realizada a 125 + 10 rom durante 16 a horas em uma incubadora com agitação a uma condição de 37ºC e 8% de CO». Em seguida, 1,5 mL de intensificador de transfecção | e 150 uL de intensificador de transfecção Il foram adicionados, e a incubação foi realizada por 6 dias para a obtenção dos anticorpos candidatos.
Exemplo 1.6 Purificação dos anticorpos
[0078] A incubação foi centrifugada a 4.000 rpm por 30 minutos, filtrada através de um filtro de 0,22 um e, em seguida, os detritos celulares foram removidos para se obter o sobrenadante. 0,2 mL de resina Mabselect Xtra foi adicionado a uma coluna e o equilíbrio foi realizado usando tampão de ligação de Proteína A em um volume correspondente a 10 vezes o volume da resina.
[0079] Posteriormente, o sobrenadante foi carregado na coluna pelo uso da gravidade. Após o carregamento estar completo, a coluna foi lavada com tampão de ligação de Proteína A em um volume correspondente a 10 vezes o volume da resina.
[0080] Subsequentemente, o tampão de eluição de IgG foi adicionado à coluna e a eluição foi realizada. O eluato foi neutralizado pela adição de 25 uL de Tris- Cl a 1,5 M por 1 mL do eluato. Em seguida, a concentração de eluato foi medida a uma DO de 280 nm. O eluente para o qual a concentração foi medida foi submetido a troca de tampão com PBS por meio de diálise.
Exemplo 2. Seleção de anticorpos anti-CD3 humanizados
[0081] O ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA) foi usado para selecionar anticorpos que apresentam afinidade ao CD3 humano e CD3 de macaco dentre um total de 128 combinações de anticorpos anti-CD3 (SP34).
[0082] Especificamente, o heterodímero CD3e£/5 humano ou de macaco cinomolgo recombinante foi diluído em um tampão de revestimento e utilizado para tratar uma placa de 96 poços. A placa foi armazenada a 4ºC por 12 horas ou mais. Posteriormente, o tampão foi removido e o tratamento com uma solução de PBS/albumina de soro bovino (BSA) a 1% foi realizado à temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, a solução foi removida. Os poços revestidos com CD3 recombinante foram então tratados com soluções de cultura que expressam anticorpos por cerca de 1 hora.
[0083] Os poços foram lavados com uma solução de PBS/Tween 20 a 0,05% e, em seguida, o tratamento com o anticorpo IgG humano conjugado com peroxidase de rábano silvestre, que foi diluído em uma solução de PBS/BSA a 1%, foi realizado à temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, a solução foi removida e os poços foram lavados com uma solução de Tween 20/PBS a 0,05%.
[0084] Uma solução de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) foi usada para tratar a placa de 96 poços, e a placa de 96 poços foi deixada em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, o tratamento com uma solução de parada foi realizado, e o grau de desenvolvimento de cor foi determinado imediatamente a um comprimento de onda de absorbância de 450 nm. Entre os candidatos de anticorpos humanizados SP34, somente as amostras que desenvolveram cor foram os clones que mantiveram afinidade ao CD3 do anticorpo SP34 de camundongo.
Os resultados específicos obtidos pela medição de afinidade estão ilustrados na Tabela 5 abaixo.
TABELA 5 humano | cinomolgo humano | cinomolgo B11 0,074 0,132 0,107 FI 0,071 0,138 0,104 humano | cinomolgo humano | cinomolgo c1i5 0,098 2,454 2,813 G15 0,091 2,415 2,694 DO3 0,073 0,159 0,130 Ho3 0,068 0,113 0,085 | Dos | 0092 | o136 | 0170 | mos | 0086 | of | 0107 | [ Dos | 0,083 | o122 | 0068 | Ho | 0085 | om | om | D15 0,108 2,529 3,006 H15 0,067 2,436 2,836
[0085] Como pode ser observado a partir dos resultados da Tabela 5 acima, demonstrou-se que 24 clones, A7, A8, A15, A16, B7, B8, B15, B16, C7, C8, C15, C16, D7, D8, D15, D16, E15, E16, F15, F16, G15, G16, H15 e H16, mantiveram a afinidade ao CD3 humano e CD3 de macaco. Assim, esses 24 clones foram selecionados como anticorpos anti-CD3 humanizados (SP34).
Exemplo 3. Medição da afinidade dos anticorpos anti-CD3 humanizados ao CD3 recombinante
[0086] O sistema Octet foi usado para medir a afinidade ao CD3 recombinante dos anticorpos anti-CD3 humanizados (SP34) selecionados de acordo com o Exemplo 2.
[0087] Especificamente, CD3e/5 humano ou macaco recombinante foi preparado a uma concentração de 5 ug/mL em tampão cinético 1x e usado para tratar uma placa de 96 poços a 200 ul/poço. O CD3e/5 após o tratamento foi fixado no sensor anti-Penta His (HIS1K, Cat fé 18-5121, Fortebio).
[0088] Os clones que apresentam afinidade de ligação ao CD3e/5 humano ou de macaco recombinante nos resultados de ELISA foram preparados a uma concentração de 50 nM em tampão cinético 1x, e o tratamento com os mesmos foi realizada a 200 ul/poço. O tampão cinético 1x foi obtido pela diluição do tampão cinético 10x (ForteBio, Cat % 18-1092) 10 vezes com PBS e usado.
[0089] A interação entre o CD3e/5 fixado ao sensor e o anticorpo a uma concentração de 50 nM foi analisada para se calcular a afinidade antígeno-anticorpo, e os resultados estão ilustrados na Tabela 6 abaixo.
TABELA 6 B7 2,14E-08 1,98E+05 | 4,23E-03 3,09E-08 | 2,08E+05 | 6,42E-03 c7 2,30E-08 | 1,52E+05 | 3,49E-03 2,75E-08 | 1,94E+05 | 5,35E-03 EE PE EPA rm ram Tm
Ag CD3E/D Humano CD3E/D de Cinomolgo Ko (M) Kon(1/Ms) | Kas(1/S) Ko (M) Kkon(1VMs) | Kkais(1/S) 5,21E-10 | 3,71E+05 | 1,93E-04 | 6,27E-10 | 5,23E+05 | 3,28E-04 4,30E-10 | 3,76E+05 | 1,62E-04 | 6,53E-10 3,43E-04 1,59E-09 | 2,09E+05 | 3,32E-04 | 1,72E-09 | 2,69E+05 | 4,61E-04 9,53E-10 | 1,99E+05 | 1,89E-04 | 1,17E-09 | 2,30E+05 | 2,69E-04 2,93E-10 8,07E-05 6,57E-10 | 3,70E+05 | 2,43E-04 4,45E-10 | 3,22E+05 | 1,44E-04 | 6,60E-10 | 4,66E+05 | 3,08E-04 E16 1,76E-09 1,62E+05 | 2,84E-04 2,19E-09 2,20E+05 | 4,82E-04 1,32E-09 | 1,53E+05 | 2,01E-04 | 1,75E-09 | 1,95E+05 | 3,40E-04 8,81E-10 | 1,36E+05 | 1,20E-04 1,13E-09 | 1,82E+05 | 2,06E-04
[0090] Como pode ser observado a partir dos resultados da Tabela 6, identificou-se que todos os clones mostram excelente afinidade ao CD3e/5 humano e de macaco; e entre estes, os clones A15, B15, C15, D15, A16, B16, C16 e D16 mostram a melhor afinidade.
Exemplo 4. Medição da afinidade dos anticorpos anti-CD3 humanizados às células T humanas
[0091] A citometria de fluxo foi utilizada para medir a afinidade às células T humanas dos anticorpos anti-CD3 humanizados (SP34) selecionados de acordo com o Exemplo 2.
[0092] Especificamente, as células H9 (ATCCO HTB-176TM) foram preparadas a 2 x 105 células em 100 ul de tampão FACS (cobertura de 1% de SFB/FACS) por amostra de anticorpo, e, em seguida, 1 ug de anticorpo foi utilizado para tratar as células. O resultante foi armazenado por 25 minutos no escuro a 4ºC.
Posteriormente, o tratamento com 3 mL de tampão FACS foi realizado e a centrifugação foi realizada a 2.000 rpm por 3 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado.
[0093] Em seguida, 100 ul de tampão FACS contendo 1 ug de anticorpo IgG humano conjugado com fitoeritrina (PE) foram utilizados para tratar as células, e o resultante foi armazenado por 25 minutos no escuro a 4ºC. Posteriormente, o tratamento com 3 mL de tampão FACS foi realizado e a centrifugação foi realizada a
2.000 rpm por 3 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado.
[0094] As células foram tratadas com uma solução de formaldeído a 4%, armazenadas no escuro a 4ºC por 30 minutos e depois tratadas com 3 mL de tampão FACS. A centrifugação foi realizada a 2000 rom por 3 minutos, e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. O tratamento com 350 ul de tampão FACS foi realizado e um citômetro de fluxo foi utilizado para realizar a análise de afinidade dos anticorpos às células T humanas. Os resultados da análise estão ilustrados na Fig. 1.
[0095] Referindo-se à Fig. 1, verificou-se que todos os anticorpos, que se ligaram ao CD3e/5 humano recombinante, se ligaram especificamente também às células T humanas.
Exemplo 5. Medição da afinidade dos anticorpos anti-CD3 humanizados às células T de macaco
[0096] A citometria de fluxo foi utilizada para medir a afinidade às células T de macaco dos anticorpos anti-CD3 humanizados (SP34) selecionados de acordo com o Exemplo 2.
[0097] Especificamente, os esplenócitos de macaco foram preparados a 10º células em 100 uL de solução FACS por amostra de anticorpo e, em seguida, 1 ug de anticorpo foi usado para tratar as células. O resultante foi armazenado por 25 minutos no escuro a 4ºC. Posteriormente, o tratamento com 3 mL de tampão FACS foi realizado e a centrifugação foi realizada a 2.000 rpm por 3 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado.
[0098] Em seguida, 100 ul de tampão FACS contendo 1 ug de anticorpo IgG humano conjugado a PE foram usados para tratar as células, e o resultante foi armazenado por 25 minutos no escuro a 4ºC. Posteriormente, o tratamento com 3 mL de tampão FACS foi realizado e a centrifugação foi realizada a 2.000 rom por 3 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado.
[0099] As células foram tratadas com anticorpo anti-CD20 conjugado a FITC, anticorpo anti-CD14 conjugado a PE-Cy5, anticorpo 7-AAD, anticorpo anti-CD16 conjugado a APC-Cy7 ou anticorpo anti-CD45 conjugado a V450, e o resultante foi armazenado durante 25 minutos no escuro a 4ºC. Posteriormente, o tratamento com 3 mL de tampão FACS foi realizado, e a centrifugação foi realizada a 2000 rpm por 3 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado.
[00100] As células foram tratadas com uma solução de formaldeído a 4%, armazenadas no escuro a 4ºC por 30 minutos e depois tratadas com 3 mL de tampão FACS. A centrifugação foi realizada a 2000 rom por 3 minutos, e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. O tratamento com 350 uL de tampão FACS foi realizado e um citômetro de fluxo foi utilizado para realizar a análise de afinidade dos anticorpos às células T humanas. Os resultados da análise estão ilustrados na Fig. 2.
[00101] Referindo-se à Fig. 2, verificou-se que todos os anticorpos, que se ligaram ao CD3e/5 de macaco recombinante, se ligaram especificamente também às células T de macaco.
[00102] Embora as formas de realização tenham sido descritas por um número limitado de exemplos e desenhos, tais como os descritos acima, será evidente para os técnicos no assunto que várias alterações e modificações podem ser realizadas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção. Por exemplo, é possível alcançar os resultados desejados, mesmo em um caso em que as técnicas,
como as descritas, sejam realizadas em uma ordem diferente da do método descrito, e/ou os componentes, como descritos, sejam montados ou combinados de uma forma diferente da do método descrito, ou trocados ou substituídos por outros componentes ou equivalentes.
[00103] Portanto, outras implementações, outras formas de realização e equivalentes das reivindicações anexas encontram-se dentro do escopo das reivindicações anexas.
Claims (13)
1. Anticorpo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: um domínio variável de cadeia leve (domínio VL) que consiste em uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 8, 15o0u 16; e um domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) que consiste em uma sequência que possui pelo menos 80% de identidade com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18 a 25.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente ao Cluster de Diferenciação 3 (CD3).
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o CD3 inclui CD3 derivado de humano e CD3 derivado de macaco.
4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente às células T.
5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que as células T incluem células T derivadas de humano e células T derivadas de Macaco.
6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado.
7. Polinucleotideo CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o domínio variável de cadeia leve (domínio VL) e o domínio variável de cadeia pesada (domínio VH) do anticorpo como definido na reivindicação 1.
8. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 7.
9. Célula hospedeira CARACTERIZADA pelo fato de que é transformada com o vetor de expressão como definido na reivindicação 8.
10. Método para produção de um anticorpo que se liga especificamente ao CD3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 9.
11. Composição farmacêutica para prevenção ou tratamento de câncer, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo como definido na reivindicação 1, ou um fragmento do mesmo.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o câncer é câncer pancreático, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer retal, câncer de tireoide, câncer esofágico, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer de colo de útero, câncer de mama, câncer hematológico, câncer de pele, câncer epitelial, câncer cerebral, câncer do sistema nervoso central ou câncer ovariano.
13. Uso do anticorpo como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de câncer.
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