ES2685786T3 - Cepa de levadura Kluyveromyces lactis y procedimientos de obtención de azúcares, etanol, beta-galactosidasa y biomasa - Google Patents

Cepa de levadura Kluyveromyces lactis y procedimientos de obtención de azúcares, etanol, beta-galactosidasa y biomasa Download PDF

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Abstract

La presente invención es una cepa de levadura

Description

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DESCRIPCIÓN
Cepa de levadura Kluyveromyces lactis y procedimientos de obtención de azúcares, etanol, p-galactosidasa y biomasa.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una cepa de levadura Kluyveromyces lactis modificada mediante integración genómica capaz de secretar p-galactosidasa al medio. Dicha cepa de levadura se utiliza en procedimientos de obtención de azúcares, biomasa, etanol y p-galactosidasa en medios que comprenden lactosa, como leche o suero lácteo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El suero de leche es el líquido remanente tras la precipitación y separación de la caseína de la leche durante la elaboración del queso. Este suero de leche retiene el 55% de los nutrientes de la leche (es el 85-90% del volumen de la leche) y tiene una alta demanda biológica y química de oxígeno de manera que es considerado un subproducto contaminante, y un problema medioambiental importante para las queserías.
Hasta el momento no se ha desarrollado ninguna tecnología que haya demostrado ser suficientemente rentable para el procesado de grandes volúmenes de suero. El principal inconveniente es el reducido número de microorganismos capaces de crecer en el suero de leche. Las cepas silvestres de levaduras respiradoras, como es el caso de Kluyveromyces lactis, no logran conseguir concentraciones de alcohol suficientes para rentabilizar la inversión
El problema que plantea la técnica es proporcionar una cepa de Kluyveromyces lactis capaz de secretar p- galactosidasa al medio en forma nativa y activa y capaz de conseguir concentraciones de alcohol mayores que la cepa silvestre. La solución que propone la presente invención es una cepa de levadura Kluyveromyces lactis depositada en la Colección de Cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el número de depósito DSM 24900, que comprende la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1.
La WO2009126623 describe la expresión de una p-galactosidasa (en el documento denominada lactasa) aislada de Kluyveromyces lactis en células huésped, y la GB2178431 refiere a una cepa recombinante de Kluyveromyces lactis que sobreexpresa una p-galactosidasa.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención es una cepa de levadura Kluyveromyces lactis depositada en la Colección de Cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el número de depósito DSM 24900, que comprende la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1.
La cepa de levadura Kluyveromyces lactis de la invención, se depositó el 06/06/2011 en la Colección de Cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) en InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig (Alemania), por el depositante Queizúar, SL, A Silva-Bama, s/n, 15822 Touro, A Coruña (España).
La cepa de levadura Kluyveromyces lactis recibió el número de depósito DSM 24900 después de que la Autoridad Internacional de Depósito declarase que la cepa era viable.
La cepa de la invención comprende una construcción de ADN identificada por la SEQ ID NO: 1, que comprende la secuencia señal del preprofactor a de Kluyveromyces lactis fusionada en la misma pauta de lectura con la forma madura de la p-galactosidasa de Kluyveromyces lactis. La secuencia señal del preprofactor a de Kluyveromyces lactis es capaz de promover la secreción de la p-galactosidasa de la cepa de la invención. Se ha encontrado sorprendentemente que la cepa de levadura que contiene dicha construcción, aunque tiene unos niveles de crecimiento inferiores a los de las cepa nativa, secreta p-galactosidasa al medio en su forma activa con rendimientos hasta 113% superiores a la misma cepa K. lactis sin modificar. La cepa se puede utilizar para la producción de azúcares, biomasa, etanol y p-galactosidasa a partir de un medio de cultivo rico en lactosa.
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La construcción identificada por la secuencia SEQ ID NO: 1 comprende también la secuencia que codifica para el péptido FLAG, reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad. Dicha secuencia puede ser sustituida por secuencias que codifican para péptidos etiqueta que cumplen una función equivalente como tales como, c-myc, HA, E. También puede ser sustituida por secuencias peptídicas que permitan el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia de polihistidina.
Preferiblemente, el péptido etiqueta es el epítopo FLAG, y se encuentra conectado al extremo C-terminal de la p- galactosidasa.
Una realización es una cepa de la invención que comprende además las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 3, 4 y 5.
Esta cepa comprende un promotor para la expresión de la proteína. Dicho promotor es el promotor del gen LAC4, que está identificado por las secuencias SEQ ID NO: 3 y 4. Dicha cepa comprende también un terminador transcripcional. Dicho terminador transcripcional es el terminador del gen LAC4, que está identificado por la secuencia SEQ ID NO: 5.
Otra realización es una cepa de la invención que comprende una secuencia que tiene una identidad del 95% respecto a SEQ ID NO: 1. Y otra realización es que dicha identidad sea del 90%.
En la presente solicitud, dicho porcentaje de identidad en una secuencia determinada se calcula teniendo en cuenta que un 95% de identidad significa que un 95% de residuos de la secuencia completa de la construcción de ADN identificada por la secuencia SEQ ID NO: 1 son idénticos a los residuos de la secuencia determinada.
Otra realización más es una proteína obtenida de la cepa de la invención, cuya secuencia de aminoácidos está identificada por la secuencia SEQ ID NO: 2. Otra realización es un vector que comprende las secuencias identificadas por SEQ ID NO: 1, 3, 4 y 5.
Dicho vector se utiliza para introducir dichas secuencias en la cepa de la invención. Existen distintos métodos adecuados para introducir una molécula de ADN en la cepa de la invención:
- Transformación de esferoplastos, lo que implica eliminar la pared celular de la levadura y poner en contacto las esferoplastos con el plásmido en presencia de PEG.
- Transformación con Li+, que implica el tratamiento de células de levadura con cationes alcalinos monovalentes (Na+, K+, Rb+, Cs+ y Li+) en combinación con PEG para estimular la captación del ADN por las células intactas.
- Electroporación, que implica la administración de pulsos eléctricos a las levaduras lo que resulta en la apertura de poros en la membrana de esferoplastos y de células de levadura intactas.
Las cepas de la invención son capaces de crecer en un medio rico en lactosa, que es degradada y forma glucosa y galactosa. De forma que una realización de la invención es un procedimiento de obtención de azúcares, en que se cultiva una cepa de levadura Kluyveromyces lactis que comprende la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1 en presencia de un medio que comprende lactosa. Una realización preferible es el procedimiento de obtención de azúcares de la invención en que dicho medio que comprende lactosa está seleccionado entre el grupo compuesto por leche, suero lácteo, suero resultante de la preparación de mantequilla, suero resultante después de la precipitación de la caseína, permeado de leche, permeado de suero, suero ácido y medio de cultivo YPL.
Una realización preferible es un procedimiento de obtención de azúcares de la invención, en que dichos azúcares son glucosa y/o galactosa.
Otra realización preferible es un procedimiento de obtención de azúcares de la invención, en que dicha cepa de levadura comprende una secuencia que tiene una identidad del 95% respecto a SEQ ID NO: 1. En otra realización más preferible, dicha identidad es del 90%.
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En el procedimiento de obtención de azúcares se fuerza la respiración celular de la cepa de la invención mediante una agitación y aireación altas, evitando de esta manera las pérdidas de rendimiento por fermentación de parte de los azúcares a etanol.
Los medios que comprenden lactosa que pueden ser utilizados como fuente de carbono en el contexto de la presente invención incluyen tanto medios sintéticos como productos naturales y sus derivados. Medios sintéticos o semi-sintéticos que pueden ser usados en el contexto de la presente invención incluyen YPL; que contiene 1% extracto de levadura, 2% de bactopeptona y una cantidad de lactosa que varía entre el 0,5% y el 6%.
Productos naturales ricos en lactosa que se pueden usar como medio de cultivo para la cepa de la invención incluyen la leche y derivados de la misma, tales como, leche desnatada, el suero resultante de la preparación de mantequilla (buttermilk), el suero resultante después de la precipitación de la caseína o el permeado de un producto lácteo, que puede ser un permeado de leche o un permeado de suero. La presente invención contempla el uso de leche de prácticamente cualquier origen, incluyendo, sin estar limitado, la leche de vaca, humana, de cabra, de oveja, de camello, de búfala y similares. Preferiblemente, la leche es sometida a tratamiento con cuajo de origen animal (extracto obtenido del cuajar del estómago de rumiantes), de origen vegetal o recombinante y a temperaturas de entre 30 y 40°C, lo que da lugar a la coagulación de la caseína de la leche, que arrastra la mayor parte de la fracción grasa de la misma. Tras la eliminación del coágulo, se obtiene el suero, que puede ser usado tal cual (el llamado “suero dulce”) o puede ser sometido a un proceso de desproteinización adicional, por ejemplo, mediante ultrafiltración u otras técnicas de separación basadas en membranas porosas con un límite de separación de 17-20 kDa. Asimismo, la invención contempla el uso del llamado suero ácido, resultante de la precipitación de las proteínas de la leche en medio ácido.
El suero de la leche puede ser concentrado mediante pulverización en aerosol para dar lugar a fracciones con un mayor contenido en materia sólida seca que el suero original, incluyendo un producto sólido denominado permeado de suero. Contenidos típicos en materia sólida seca varían desde un 5 a 6% en el suero, pasando por valores superiores a 30%, en particular, entre 50 y 60% de los concentrados. La concentración de lactosa varía entre 70 y 75% del total de materia sólida seca en el caso del suero dulce y llega hasta valores de entre 82 y 86% en el caso de los permeados de suero.
La glucosa y galactosa que se forman como resultado de la hidrólisis de la lactosa se pueden recuperar del medio de cultivo usando técnicas ampliamente conocidas por el experto en la materia. Preferiblemente, la glucosa y galactosa se purifican mediante adsorción con preparaciones de carbón activo con distintas propiedades o usando membranas de cerámica.
La lactosa del medio de cultivo es digerida por las cepas de la invención para dar glucosa y galactosa que, a su vez, son sustratos adecuados para la fermentación alcohólica produciéndose alcoholes. De forma que una realización de la invención es un procedimiento de obtención de etanol en que se cultiva una cepa de levadura Kluyveromyces lactis que comprende la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1 en presencia de un medio que comprende lactosa.
Otra realización más es un procedimiento de obtención de etanol de la invención, en que dicho medio que comprende lactosa está seleccionado entre el grupo compuesto por leche, suero lácteo, suero resultante de la preparación de mantequilla, suero resultante después de la precipitación de la caseína, permeado de leche, permeado de suero, suero ácido y medio de cultivo YPL.
Otra realización preferible es un procedimiento de obtención de etanol de la invención, en que dicha cepa de levadura comprende una secuencia que tiene una identidad del 95% respecto a SEQ ID NO: 1. En otra realización más preferible, dicha identidad es del 90%.
El etanol puede ser usado como combustible, en bebidas o a nivel industrial. Normalmente, la fermentación alcohólica para producir etanol se lleva a cabo durante 30-60 horas, a una temperatura en torno a 32°C. El etanol se recupera del medio usando técnicas convencionales, como la destilación.
La cepa de la invención es capaz de producir y secretar al medio p-galactosidasa. De forma que una realización preferible de la invención es un procedimiento de obtención de la proteína identificada por la secuencia SEQ ID NO: 2, en que se cultiva una cepa de levadura Kluyveromyces lactis que comprende la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1 en presencia de un medio que comprende lactosa.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una cepa de levadura Kluyveromyces lactis depositada en la Colección de Cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) con el número de depósito DSM 24900, que comprende la secuencia identificada por SEQ ID NO: 1.
    5 2. Cepa de levadura según la reivindicación 1, en que dicha cepa de levadura comprende además las secuencias
    identificadas por SEQ ID NO: 3, 4 y 5.
    o -i hi v u *. en <n n
    imagen1
    Etanol (g/l)
    Tiempo (horas)
    imagen2
    OMíkOJeooM*.
    imagen3
    Actividad p-galactosidasa intraceluiar (nmol/mrmin)
    — i i i i • - i
    O U. N (d VI O
    Actividad p-galactosidasa extracelular (nmol/mrmin)
    Tiempo (horas)

    Etanol (g/l) —+—

    O O KJ KJ co _W 4*- ^ pi y\ 05 O) -*J

    o en o en o en o en o en o en o en o

    Lactosa (g/t) - ■ ■
    ■4 hA wh «X mA ni
    oooooooocaoooooooo
    imagen4
    imagen5
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