CN111334541A - 一种β-半乳糖苷酶制备高纯度低聚半乳糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β‑半乳糖苷酶制备高纯度低聚半乳糖的方法。该方法步骤包括：(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备GOS；(2)乳酸克鲁维酵母全细胞发酵制备；(3)乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖。在GOS合成反应2h后，得到GOS收率为22.78％，乳酸克鲁维酵母全细胞处理15h后GOS纯度超过90％。该工艺为高纯度低聚糖的生产提供了一种简单、高效、廉价的方法。本发明生产GOS纯度高，生产工艺成本低，效率高，且绿色环保，有望得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种β-半乳糖苷酶制备高纯度低聚半乳糖的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术
随着中国经济社会快速发展，老龄化进程逐步加快，社会对发展保健食品、功能性食品的呼声也越来越高。低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides，简称GOS)，作为一种新型的功能性食品，在我国具有广阔的市场前景。因此，开发一种低成本、高效率、环境友好的、适合规模化生产的高纯度GOS绿色生产工艺，对我国GOS的工业化生产具有重要意义。
GOS具有热值低、保湿性强的特点，在pH为酸性及中性的条件下具有较高的热稳定性。作为一种低能量的碳水化合物，可以作为糖尿病人以及肥胖人群的食品甜味剂。同时能够促进双歧杆菌增殖，抑制有害菌，调节肠道菌落平衡，改善矿物质吸收，改善脂质代谢，提高免疫力等。
目前GOS主要生产方法包括天然原料提取，天然多糖的水解，化学合成法，直接发酵合成法和酶法合成等一系列方法。其中酶法合成由于反应条件温和，操作简单，效率高，被广泛认为是有效且可规模化生产的方法，并且也是目前工业上生产GOS的主要方法。当前，制约GOS产品应用的主要问题是酶法生产的GOS产品纯度不高，利用β-半乳糖苷酶合成GOS的制备过程中，乳糖的水解反应和转糖苷反应同时进行，使得反应合成的GOS初级产物中含有葡萄糖、半乳糖以及未反应的乳糖等副产物，对乳糖不耐受症人群和糖尿病人群的吸引力不大，制约了GOS在商业上的应用和发展。
目前对于GOS的纯化方法主要有膜分离法、色谱层析法、乙醇沉淀法，发酵法和超临界流体萃取法等。这些方法往往受限于高昂的成本，复杂的操作要求，且产品纯度通常低于70％。其中酶法处理纯化能力良好，但酶制剂价格昂贵，回收利用率低，且不易操作，难以实现进一步的工业化生产。
因此，目前急需一种操作简单，成本低廉，适合规模化生产的高纯度GOS生产工艺，为了解决现有工艺生产存在的一系列问题，基于常规发酵法低成本操作简单的特点，本发明提供了一种β-半乳糖苷酶制备高纯度GOS的方法，绿色经济，产物纯度高，适合规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于开发一种通过β-半乳糖苷酶生产高纯度GOS的方法。该方法低成本，高产率，环境友好且适宜规模化发展。
为了实现了上述目的，本发明是通过以下技术实现的。
一种β-半乳糖苷酶制备高纯度低聚半乳糖的方法，主要包括以下步骤：
(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备低聚半乳糖粗产品；
(2)制备乳酸克鲁维酵母全细胞发酵；
(3)通过乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖。
所述步骤(1)的方法是：使用pH＝5-9的50mM磷酸钠缓冲液将乳糖配置为100-500g/L的溶液，按1-45U/g乳糖的比例加入游离β-半乳糖苷酶酶液，在160-220rpm和25-40℃条件下，反应2-4h，获得GOS粗产品。
所述步骤(1)所用游离β-半乳糖苷酶为诺维信商业酶。
所述步骤2)的方法是：将乳酸克鲁维酵母菌株接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后以体积比为5％的接种量向乳糖培养基加酵母种子液，在温度为30℃，搅拌转速为200rpm，pH值为7.5的条件下发酵制备全细胞，发酵时间为48h，最终获得浓度约为20g/L的全细胞发酵液，离心弃去上清液，收集菌体沉淀，获得K.lactis全细胞。
所述步骤(2)中所用乳酸克鲁维酵母购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC1773。
所述步骤2)中所用的的种子液培养基是每升培养基中含有5g酵母膏，10g蛋白胨和10g氯化钠；所述的乳糖培养基是每升培养基中含有40g乳糖，10g酵母膏和10g蛋白胨。
所述步骤(3)的方法是：将步骤(1)的所得的GOS粗产品用纯水稀释到总糖浓度为40～200g/L，按照10～100g/L的终浓度向体系中加入步骤(2)所得的酵母全细胞沉淀，在温度为20～40℃，和搅拌转速为100～400rpm的条件下进行发酵培养，通过酵母发酵消耗乳糖、葡萄糖和半乳糖，以降低GOS粗产品中杂糖含量，纯化时间为10～30h，纯化结束后经过离心分离获得GOS上清液和酵母全细胞沉淀，GOS上清液经过蒸馏浓缩获得纯度为80％～99％的GOS终产品，即高纯度GOS产品，且纯化阶段分离出的酵母全细胞沉淀可重复用于步骤(3)。
所述的总糖浓度为溶液中乳糖，半乳糖，葡萄糖和低聚半乳糖的总质量浓度。
本发明提供的一种β-半乳糖苷酶制备高纯度GOS的方法，与现有GOS生产技术相比具有以下优点：
(1)为解决现有工艺中合成的GOS中含有大量副产物，应用受限的问题，提出了利用全细胞发酵纯化粗品获得高纯度GOS，纯化过程中无副产物生成，且纯化处理15h内即可得到纯度超过90％的高纯度GOS产品，发酵条件温和无污染，绿色环保。
(2)本发明纯化步骤中所使用的乳酸克鲁维酵母全细胞，由于发酵条件温和，对细胞活性破坏程度小，在一定时间内可多批次重复利用，减少湿细胞制备环节消耗，节约成本，简化工序。
附图说明
图1为本发明的利用β-半乳糖苷酶制备高纯度低聚半乳糖的流程图
具体实施方式
下面结合图1和实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备低聚半乳糖粗产品：
利用pH＝8的50mM磷酸缓冲液制备400g/L乳糖溶液，取20mL乳糖溶液置于50mL的广口瓶中，稀释1000倍后通过酶活检测方法测定游离β-半乳糖苷酶酶液的酶活为36U/mL，按照30U/g乳糖的比例加入游离β-半乳糖苷酶酶液，在37℃，160rpm的恒温振荡水浴中反应2h，待反应结束利用沸水灭活10min，获得GOS粗产品。GOS粗产品用纯水稀释适当倍数后，使用0.45μm的滤膜进行过滤后，依照HPLC检测条件用高效液相色谱法检测产物中各组分的含量，测得GOS收率为22.78％。
(2)制备乳酸克鲁维酵母全细胞发酵：
将乳酸克鲁维酵母菌株接种到含5g/L酵母膏，10g/L蛋白胨和10g/L氯化钠的种子液培养基中，在30℃、160rpm/min全温振荡培养箱中培养20h，制备酵母种子液，然后以体积比为5％的接种量向含40g/L乳糖，10g/L酵母膏和10g/L蛋白胨的乳糖培养基加入酵母种子液，在温度为30℃，搅拌转速为200rpm，pH值为7.5的条件下发酵制备，发酵时间为48h，获得浓度约为20g/L的全细胞发酵液，经10000rpm离心，弃去上清，收集沉淀，获得K.lactis全细胞。
(3)通过乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖:
将步骤(1)中得到的GOS粗产品用纯水稀释至总糖浓度为100g/L，取20mL置于50mL广口瓶中，加入15g/L(w/v)K.lactis全细胞，在30℃，160rpm下反应15h，终止反应，10000rpm条件下离心，分别收集GOS上清液与沉淀，取GOS上清液样品过0.45μm滤膜后，按照下述的HPLC检测条件方法进行检测，得到此时GOS纯度为91.02％。
酶活定义：一个酶活单位定义(U)为在37℃每分钟释放1μmol ONP所需的酶量。
酶活检测方法：取1mL游离β-半乳糖苷酶酶液，在37℃下水浴5min；加入1.0mL已预热至37℃的含20mmol/L ONPG磷酸盐缓冲液(pH＝7)，在37℃，搅拌200rpm条件下水浴10min，然后立即加入4mL 0.5mol/L Na2CO3来终止反应；离心除去透性化细胞后，以加热失活的酶液同样处理作为空白，在420nm处测定OD值，根据标准曲线和OD值计算酶活。
HPLC检测条件：Aminex HPX-87H色谱柱，使用的流动相为0.05mol/L H2SO4，示差检测器，流速为0.6mL/min，柱温设为65℃，进样量20μL。
实施例2
(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备低聚半乳糖粗产品：
利用pH＝8的50mM磷酸缓冲液制备400g/L乳糖溶液，取20mL乳糖溶液置于50mL的广口瓶中，稀释1000倍后通过酶活检测方法测定游离β-半乳糖苷酶酶液的酶活为36U/mL，按照25U/g乳糖的比例加入游离β-半乳糖苷酶酶液，在37℃，160rpm的恒温振荡水浴中反应2h，待反应结束利用沸水灭活10min，获得GOS粗产品。GOS粗产品用纯水稀释适当倍数后，使用0.45μm的滤膜进行过滤后，依照HPLC检测条件用高效液相色谱法检测产物中各组分的含量，测得GOS收率为21.04％。
(2)制备乳酸克鲁维酵母全细胞发酵：
将乳酸克鲁维酵母菌株接种到含5g/L酵母膏，10g/L蛋白胨和10g/L氯化钠的种子液培养基中，在30℃、160rpm/min全温振荡培养箱中培养20h，制备酵母种子液，然后以体积比为5％的接种量向含40g/L乳糖，10g/L酵母膏和10g/L蛋白胨的乳糖培养基加入酵母种子液，在温度为30℃，搅拌转速为200rpm，pH值为7.5的条件下发酵制备，发酵时间为48h，获得浓度约为20g/L的全细胞发酵液，经10000rpm离心，弃去上清，收集沉淀，获得K.lactis全细胞。
(3)通过乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖:
将步骤(1)中得到的GOS粗产品用纯水稀释至总糖浓度为100g/L，取20mL置于50mL广口瓶中，加入15g/L(w/v)K.lactis全细胞，在30℃，160rpm下反应30h，终止反应，10000rpm条件下离心，分别收集GOS上清液与沉淀，取GOS上清液样品过0.45μm滤膜后，按照下述的HPLC检测条件方法进行检测，得到此时GOS纯度为98.6％。
酶活的定义、测定方法及HPLC高效液相色谱条件如实施例1所述。
实施例3
(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备低聚半乳糖粗产品：
利用pH＝9的50mM磷酸缓冲液制备500g/L乳糖溶液，取20mL乳糖溶液置于50mL的广口瓶中，稀释1000倍后通过酶活检测方法测定游离β-半乳糖苷酶酶液的酶活为36U/mL，按照1U/g乳糖的比例加入游离β-半乳糖苷酶酶液，在25℃，160rpm的恒温振荡水浴中反应2h，待反应结束利用沸水灭活10min，获得GOS粗产品。GOS粗产品用纯水稀释适当倍数后，使用0.45μm的滤膜进行过滤后，依照HPLC检测条件用高效液相色谱法检测产物中各组分的含量，测得GOS收率为2.21％。
(2)制备乳酸克鲁维酵母全细胞发酵：
将乳酸克鲁维酵母菌株接种到含5g/L酵母膏，10g/L蛋白胨和10g/L氯化钠的种子液培养基中，在30℃、160rpm/min全温振荡培养箱中培养20h，制备酵母种子液，然后以体积比为5％的接种量向含40g/L乳糖，10g/L酵母膏和10g/L蛋白胨的乳糖培养基加入酵母种子液，在温度为30℃，搅拌转速为200rpm，pH值为7.5的条件下发酵制备，发酵时间为48h，获得浓度约为20g/L的全细胞发酵液，经10000rpm离心，弃去上清，收集沉淀，获得K.lactis全细胞。
(3)通过乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖:
将步骤(1)中得到的GOS粗产品用纯水稀释至总糖浓度为40g/L，取20mL置于50mL广口瓶中，加入10g/L(w/v)K.lactis全细胞，在20℃，300rpm下反应30h，终止反应，10000rpm条件下离心，分别收集GOS上清液与沉淀，取GOS上清液样品过0.45μm滤膜后，按照下述的HPLC检测条件方法进行检测，得到此时GOS纯度为87.35％。
酶活的定义、测定方法及HPLC高效液相色谱条件如实施例1所述。
实施例4
(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备低聚半乳糖粗产品：
利用pH＝5的50mM磷酸缓冲液制备100g/L乳糖溶液，取20mL乳糖溶液置于50mL的广口瓶中，稀释1000倍后通过酶活检测方法测定游离β-半乳糖苷酶酶液的酶活为36U/mL，按照45U/g乳糖的比例加入游离β-半乳糖苷酶酶液，在40℃，220rpm的恒温振荡水浴中反应2h，待反应结束利用沸水灭活10min，获得GOS粗产品。GOS粗产品用纯水稀释适当倍数后，使用0.45μm的滤膜进行过滤后，依照HPLC检测条件用高效液相色谱法检测产物中各组分的含量，测得GOS收率为16.18％。
(2)制备乳酸克鲁维酵母全细胞发酵：
将乳酸克鲁维酵母菌株接种到含5g/L酵母膏，10g/L蛋白胨和10g/L氯化钠的种子液培养基中，在30℃、160rpm/min全温振荡培养箱中培养20h，制备酵母种子液，然后以体积比为5％的接种量向含40g/L乳糖，10g/L酵母膏和10g/L蛋白胨的乳糖培养基加入酵母种子液，在温度为30℃，搅拌转速为200rpm，pH值为7.5的条件下发酵制备，发酵时间为48h，获得浓度约为20g/L的全细胞发酵液，经10000rpm离心，弃去上清，收集沉淀，获得K.lactis全细胞。
(3)通过乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖:
将步骤(1)中得到的GOS粗产品用纯水稀释至总糖浓度为200g/L，取20mL置于50mL广口瓶中，加入100g/L(w/v)K.lactis全细胞，在40℃，400rpm下反应10h，终止反应，10000rpm条件下离心，分别收集GOS上清液与沉淀，取GOS上清液样品过0.45μm滤膜后，按照下述的HPLC检测条件方法进行检测，得到此时GOS纯度为85.21％。
酶活的定义、测定方法及HPLC高效液相色谱条件如实施例1所述。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种β-半乳糖苷酶制备高纯度低聚半乳糖的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)游离β半乳糖苷酶通过转糖苷反应催化乳糖制备低聚半乳糖粗产品；
(2)制备乳酸克鲁维酵母全细胞发酵；
(3)通过乳酸克鲁维酵母全细胞纯化获得高纯度低聚半乳糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(1)的方法是：使用pH＝5-9的50mM磷酸钠缓冲液将乳糖配置为100-500g/L的溶液，按1-45U/g乳糖的比例加入游离β-半乳糖苷酶酶液，在160-220rpm和25-40℃条件下，反应2-4h，获得GOS粗产品。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所用游离β-半乳糖苷酶为诺维信商业酶。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤2)的方法是：将乳酸克鲁维酵母菌株接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后以1：20的体积比向乳糖培养基加酵母种子液，在温度为30℃，搅拌转速为200rpm，pH值为7.5的条件下发酵制备全细胞，发酵时间为48h，最终获得浓度约为20g/L的全细胞发酵液，离心弃去上清液，收集菌体沉淀，获得乳酸克鲁维酵母全细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是乳酸克鲁维酵母购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC1773。
6.如权利要求4所述的方法，其特征是所述的种子液培养基是每升培养基中含有5g酵母膏，10g蛋白胨和10g氯化钠。
7.如权利要求4所述的方法，其特征是所述的乳糖培养基是每升培养基中含有40g乳糖，10g酵母膏和10g蛋白胨。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤(3)的方法是：将步骤(1)的所得的GOS粗产品用纯水稀释到总糖浓度为40～200g/L，按照10～100g/L的终浓度向体系中加入步骤(2)所得的酵母全细胞沉淀，在温度为20～40℃，和搅拌转速为100～400rpm的条件下进行发酵培养，纯化时间为10～30h，纯化结束后经过离心分离获得GOS上清液和酵母全细胞沉淀，GOS上清液经过蒸馏浓缩获得纯度为80％～99％的GOS终产品。
9.如权利要求7所述的方法，其特征是纯化阶段分离出的酵母全细胞沉淀重复用于步骤(3)。
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