KR20230107636A - 식품 및 기타 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 생성하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

식품 및 기타 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 생성하기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20230107636A
KR20230107636A KR1020237019701A KR20237019701A KR20230107636A KR 20230107636 A KR20230107636 A KR 20230107636A KR 1020237019701 A KR1020237019701 A KR 1020237019701A KR 20237019701 A KR20237019701 A KR 20237019701A KR 20230107636 A KR20230107636 A KR 20230107636A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ffa
recombinant
releasing
uniprot
activity
Prior art date
Application number
KR1020237019701A
Other languages
English (en)
Inventor
티모시 가이스트링거
헤더 젠센
라비라신 잘라
헨드릭 미어만
타이 와고너
티모시 스콧 존슨
빈센트 웨이-시앙 우
프란체스카 마네아
발라크리쉬난 라메시
Original Assignee
퍼펙트 데이, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 퍼펙트 데이, 인크. filed Critical 퍼펙트 데이, 인크.
Publication of KR20230107636A publication Critical patent/KR20230107636A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
    • A23J1/202—Casein or caseinates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/20—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey
    • A23J1/205—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from milk, e.g. casein; from whey from whey, e.g. lactalbumine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Abstract

본 개시는 식품 또는 다른 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한, 이러한 방법 및 조성물에 의해 제조되는 재조합 성분을 포함한 조성물에 관한 것이다.

Description

식품 및 기타 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 생성하기 위한 방법 및 조성물
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 13일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/113,729호 및 2021년 4월 15일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/175,278호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
기술분야
본 개시는 일반적으로 식품 또는 다른 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 또한, 일반적으로 이러한 방법에 의해 제조되는 재조합 성분 및 조성물을 포함한 조성물에 관한 것이다.
동물-유래 식품(예, 육류, 우유, 난)은 대중적인 영양 공급원이다. 이는 고품질 단백질, 필수 미네랄(예, 칼슘, 인, 아연, 마그네슘), 및 비타민(예, 리보플라빈, 비타민 A, 비타민 B12)을 포함한다. 추가적으로, 다수의 이러한 식품은, 광범위한 파생 식품 (예, 요거트, 치즈, 크림, 아이스크림, 버터, 마요네즈)의 제조를 허용하는 기능적 특성을 유리하게 보유한다.
그러나, 동물-유래 식품은 사람 건강에 좋지 않은 반응을 야기할 수 있는 성분(예, 락토스, 알레르겐, 포화 지방, 콜레스테롤)을 포함한다. 또한, 이러한 식품의 제조는 축산을 수반하고, 이는 동물 복지 및 환경에 상당한 영향을 미치고, 살충제 잔류물, 중금속 및 아플라톡신 M1, 및 병원체로 오염될 가능성이 있다.
이러한 우려는 동물-유래 식품 및 기타 제품(예, 화장품, 개인 위생 제품)에 대한 대안물의 개발을 촉진한다. 일부 이러한 대안물은 식물-유래 성분(예, 단백질, 지질, 비타민)을 포함한다. 그러나, 점차적으로, 동물-유래 식품 및 기타 제품에 대한 대안물은 재조합으로 (예를 들어, 재조합 숙주 세포를 사용하여) 생성된 성분(예, 단백질, 지질)으로부터 제조된다.
식품 및 기타 제품에서 재조합 성분을 사용하는 것은 새로운 문제를 제기한다. 이러한 문제 하나는, 재조합 성분으로부터 제조된 식품 또는 기타 제품이 종종 상당량의 이러한 재조합 성분을 함유하고(재조합 성분이 이용된 이전 제품에서 전형적인 것보다 더 많음), 다량의 재조합 성분의 사용이 때때로 바람직하지 않는 다른 성분(이는 재조합 성분이 수득되는 재조합 숙주 세포에 의해 동시에 생성되고 잠재적으로 재조합 성분과 잠재적으로 공동 정제됨)에 영향을 받을 수 있다는 것이다.
이러한 하나의 다른 성분은 유리 지방산(FFA; 즉, FFA 방출 효소)의 방출을 유도하는 활성 효소이다. FFA 방출 효소는 디글리세리드, 중성지방, 인지질, 지단백질 및 기타 분자에서 결합을 가수분해하여 FFA를 방출할 수 있다. FFA 방출 효소를 위한 기질은, 재조합 성분이 사용될 수 있는 다양한 식품 및 다른 제품에 포함된다. 일부 이러한 식품 및 기타 제품에서, FFA의 방출은, 예를 들어 산패된 향 및/또는 맛을 생성하고, 에멀션 형성을 방해하고, 질감에 대한 바람직하지 않은 효과를 갖고, 필수 영양소(예, 비타민)와 상호작용함으로써 영양 함량을 줄이고, 저장 수명을 감소시키는 것에 의해, 해로운 효과를 가질 수 있다. 식품 및 기타 제품에서의 FFA 생성은, 예를 들어 원하는 풍미 프로파일 및/또는 향(예, 숙성 치즈의 풍미 프로파일)을 생성하거나, 또는 가공 치즈에서 사용하기 위한 효소-변형 치즈를 제조하는 것에 의해, 이로운 효과를 가질 수도 있다. 따라서, 특히 FFA 방출 효소 활성과 관련하여, 동물-유래 식품 및 다른 제품에 대한 대안물의 제조를 위한 재조합 성분의 생성, 가공, 및 사용에서, 예를 들어 랜시드 향 및 맛의 생성이 지연되고, 유화액 형성이 영향을 받지 않고, 영양 함량이 유지되고, 질감이 조절되지 않고, 저장 수명이 단축되지 않고/않거나, 원하는 향미 및/또는 향 프로파일이 생성되도록 도전을 극복해야 한다.
따라서, 동물-유래 식품 및 기타 제품에 대한 대안물이 재조합 성분으로부터 제조될 수 있는 방법뿐만 아니라 이러한 방법에서 사용되고 이러한 방법으로부터 수득되는 조성물이 요구된다.
참조에 의한 통합
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 서열, 데이터베이스 엔트리, 과학 문헌, 및 기타 참고문헌은 각각의 개별적인 간행물, 특허, 특허 출원, 서열, 데이터베이스 엔트리, 과학 문헌 또는 기타 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로, 그리고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 그 전체가 참조로 포함된다. 참고로 포함된 물질이 본 개시와 모순되거나 일치하지 않는 한, 본 개시는 정의를 포함하여 임의의 이러한 물질을 대체할 것이다.
다양한 양태에서, 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포가 본원에 제공되며, 여기서 재조합 숙주 세포는 상응하는 재조합 숙주 세포에 포함된 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성과 비교하여 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성을 포함한다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, G0RVD2, 또는 G0R8A6, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 또는 G0RKH7, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, 또는 G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RLH4, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, R0RVD2, 또는 G0R8A6, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 또는 G0RKH7, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, G0RMI3, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0RFT3, G0RG60, G0RGD5, G0RI29, G0RIJ9, G0RKH7, G0RKL4, G0RL87, G0RLL0, G0RLR3, G0RME5, G0RQJ5, G0RRK3, G0RSK7, G0RWT9, 또는 G0RX82, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, 또는 G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RLH4, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; UniProt 서열# G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; UniProt 서열# G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RLH4, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; UniProt 서열# G0RGQ0, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RLH4, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소; UniProt 서열# G0RMI3, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소; UniProt 서열# G0RGQ0, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소; 및 UniProt 서열# G0RLH4, 또는 이의 상동체, 또는 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된 제4 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 이루어진다.
단락 [0010-0028] 중 어느 한 단락의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성의 감소를 포함한다.
단락 [0029]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성의 감소는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 생성 및/또는 활성의 감소이다.
단락 [0010-0030] 중 어느 한 단락의 재조합 숙주 세포로서, 상기 재조합 숙주 세포는 박테리아, 효모 또는 사상 진균류로부터 유래된다.
단락 [0031]의 재조합 숙주 세포로서, 상기 사상 진균류는 아스페르길루스(예, 아스페르길루스 니게르), 트리코데르마(예, 트리코데르마 리세이, 트리코데르마 시트리노비라이드), 또는 미셀리오프토라(예, 미셀리오프토라 써모필라)로부터 선택된다.
단락 [0010-0032] 중 어느 한 단락의 재조합 숙주 세포로서, 재조합 성분은 재조합 단백질이다.
단락 [0033]의 재조합 숙주 세포로서, 재조합 단백질은 재조합 우유 단백질이다.
단락 [0034]의 재조합 숙주 세포로서, 재조합 우유 단백질은 재조합 카제인이다.
단락 [0034]의 재조합 숙주 세포로서, 재조합 우유 단백질은 재조합 유청 단백질이다.
단락 [0034]의 재조합 숙주 세포로서, 재조합 우유 단백질은 소, 인간, 양, 염소 또는 말로부터 유래된다.
다양한 양태에서, 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 성분을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 FFA 방출 효소의 생성 및 활성을 조절하는 단계를 포함한다.
단락 [0038]의 방법으로서, 상기 재조합 숙주 세포는 단락 [0010-0037] 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포이다.
단락 [0038]의 방법으로서, FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 조절하는 단계는, FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 감소시키는 단계를 포함한다.
단락 [0040]의 방법으로서, FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 감소시키는 단계는, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 100%의 생성 및/또는 활성의 감소이다.
단락 [0040] 또는 [0041]의 방법으로서, FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 감소시키는 단계는 발효 배지, 제제, 또는 조성물에 FFA 방출 효소의 억제제를 첨가하는 단계를 포함한다.
단락 [0042]의 방법으로서, FFA 방출 효소의 억제제는, 그의 촉매 도메인에 세린 잔기를 포함하는 FFA 방출 효소의 억제제이다.
단락 [0040] 또는 [0041]의 방법으로서, FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 감소시키는 단계는, FFA 방출 효소 활성으로부터 재조합 성분을 정제하는 단계 및/또는 재조합 성분으로부터 FFA 방출 효소를 정제하는 단계를 포함한다.
단락 [0044]에 있어서, 재조합 성분으로부터 FFA 방출 효소를 정제하는 단계는, 활성-기반 단백질 프로파일링(ABPP) 소분자 프로브의 사용을 포함한다.
다양한 양태에서, 재조합 성분을 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 재조합 성분의 생성에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 단락 [0010-0037] 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포를 발효시키는 단계를 포함한다.
단락 [0046]의 방법으로서, 상기 방법은 상기 재조합 성분을 정제하여 상기 재조합 성분을 포함한 제제를 수득하는 단계; 및/또는 상기 재조합 성분을 후가공하는 단계를 추가로 포함한다.
단락 [0047]의 방법으로서, 상기 정제하는 단계는, 상기 재조합 성분을 포함한 제제를 90% 초과의 순도로 수득하기 위해 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
단락 [0047]의 방법으로서, 상기 후가공은 상기 재조합 성분을 분무 건조시키거나 농축시켜 분말을 수득하는 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 재조합 성분을 포함하는 조성물이 본원에 제공되며, 상기 조성물은 단락 [0038-0045] 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된다.
단락 [0050]의 조성물로서, 상기 조성물은 상기 재조합 성분의 건조 질량 기준 약 0.1% 내지 약 100%를 포함한다.
단락 [0050]의 조성물로서, 상기 조성물은 식품이다.
단락 [0052]의 조성물로서, 상기 조성물은 보충 식품이다.
단락 [0053]의 조성물로서, 상기 조성물은 보충 유제품이다.
단락 [0053]의 조성물로서, 상기 조성물은 보충 달걀 제품이다.
단락 [0052]의 조성물로서, 상기 조성물은 대체 식품이다.
단락 [0056]의 조성물로서, 상기 조성물은 대체 유제품이다.
단락 [0057]의 조성물로서, 상기 조성물은 대체 달걀 제품이다.
단락 [0050]의 조성물로서, 상기 조성물은 미용 또는 개인 위생 제품이다.
단락 [0050-0059] 중 어느 한 단락의 조성물로서, 재조합 성분은 재조합 단백질이다.
단락 [0060]의 조성물로서, 상기 조성물은 재조합 단백질 이외의 임의의 단백질은 본질적으로 없다.
단락 [0060]의 조성물로서, 상기 조성물은 재조합 단백질 이외의 임의의 재조합 단백질은 본질적으로 없다.
단락 [0060]의 조성물로서, 상기 재조합 단백질은 재조합 우유 단백질이다.
단락 [0063]의 조성물로서, 상기 조성물은 재조합 우유 단백질 이외의 임의의 단백질은 본질적으로 없다.
단락 [0063]의 조성물로서, 상기 조성물은 재조합 우유 단백질 이외의 임의의 재조합 단백질은 본질적으로 없다.
다양한 양태에서, FFA 방출 효소를 암호화하는 재조합 발현 작제물을 포함하고, 상응하는 숙주 세포와 비교하여 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 증가시키는 재조합 발현 작제물을 포함하는, 재조합 숙주 세포가 본원에 제공된다.
단락 [0066]의 재조합 숙주 세포로서, FFA 방출은, UniProt 서열# G0RH85, G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, G0RVD2, 또는 G0R8A6, 또는 이의 상동체를 포함한 FFA 방출 효소로부터 선택된다.
단락 [0066] 또는 [0067]의 재조합 숙주 세포로서, 상기 재조합 숙주 세포는 박테리아, 효모, 또는 사상 진균류로부터 유래된다.
단락 [0068]의 재조합 숙주 세포로서, 상기 사상균 진균은 아스페르길루스(예, 아스페르길루스 니게르), 트리코데르마(예, 트리코데르마 리세이, 트리코데르마 시트리노비어이드), 또는 미셀리오프토라(예, 미셀리오프토라 써모필라)로부터 선택된다.
단락 [0066-0069] 중 어느 한 단락의 재조합 숙주 세포로서, 상기 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성 증가는 적어도 50%의 생성 및/또는 활성의 증가이다.
다양한 양태에서, FFA 방출 효소를 생성하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 단락 [0066-0070] 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계, 상기 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 분비에 적합한 조건 하에서 재조합 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 선택적으로 FFA 방출 효소를 정제하는 단계를 포함한다.
예시적인 구현예가 하기 내용의 첨부된 도면의 사용을 통해 추가적으로 구체적이고 상세하게 기술되고 설명될 것이다:
도 1a 및 1b는 G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 전사체의 존재에 대해 재조합 단백질(즉, 재조합 β-락토글로불린)을 생성하는 트리코데르마 리세이 숙주 세포의 RNAseq 분석의 결과를 나타낸 박스-및-위스커 플롯을 제공하고, 도 1b는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 도 1a에 나타낸 G0RGQ0 플롯의 상세도를 제공한다. FPKM = 매핑된 판독 백만 개당 전사체의 킬로베이스당 단편.
도 2는, Thermo ActivX TAMRA-FP 플루오로포스포네이트(그의 촉매 도메인에 세린 잔기를 포함하는 가수분해 효소의 억제제) 부재(샘플 1) 또는 존재(샘플 2) 상태에서 재조합 단백질(즉, 재조합 β-락토글로불린) 제제에 포함된 파라-페닐(pNP) 아실 에스테르 가수분해 활성을 보여주는 막대 플롯으로, 본 발명의 다양하고 대표적인 구현예에 따른 FFA 방출 활성을 나타낸다. 활성 단위 U/g = 재조합 단백질의 그램 당 마이크로몰 pNP 형성(시간); 아실기: C4 = 부티레이트, C8 = 옥타노에이트, C12= 라우레이트, 및 C16 = 팔미테이트.
도 3은 본 발명의 다양하고 대표적인 구현예에 따라, G0RGQ0, G0RLH4, 또는 G0RMI3 단백질을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포의 생성에 사용된 재조합 벡터의 맵이다.
도 4는 본 발명의 다양하고 대표적인 구현예에 따라, G0RGQ0, G0RLH4, 또는 G0RMI3 단백질을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포의 생성에 사용된 재조합 벡터의 맵이다.
본 발명의 다양하고 대표적인 구현예에 따라, 도 5a는 4개의 독립적인 재조합 피키아 파스토리스 형질전환체의 발효 배지에 포함된 재조합 G0RMI3 단백질의 웨스턴 블롯을 나타내고, 도 5b는 본 발명의 다양한 구현예에 따라 3개의 독립적인 재조합 트리코데르마 리세이 형질전환체에 의해 생성된 재조합 G0RGQ0의 SDS PAGE 겔을 나타내고, 도 5c는 3개의 독립적인 재조합 트리코데르마 리세이 형질전환체에 의해 생성된 재조합 G0RLH4의 SDS PAGE 겔을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 다양하고 대표적인 구현예에 따라, G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질의 존재(박스) 또는 부재(비박스) 하에 로다민 B를 포함한 24-웰 플레이트의 UV-조사 웰의 사진이다.
도 7은 본 발명의 다양하고 대표적인 구현예에 따라, G0RH85, G0RMI3, G0RGQ0, 및/또는 G0RLH4 단백질의 제거된 FFA 방출 활성을 포함한 재조합 숙주 세포의 생성에 사용된 표적화 벡터의 맵이다.
본 발명의 후속 논의는 예시 및 설명의 목적으로 제시되며, 본 발명의 범주를 본원에 개시된 구현예로 제한하고자 하는 것은 아니다. 이와 같이, 개시된 구현예의 변화 및 변형은, 예를 들어 본 개시를 이해한 후 당업자의 기술 및 지식 내에 있을 수 있는 바와 같이, 본 발명의 범주 내에 있다. 이는, 특허 출원 가능한 주제를 공개적으로 전용할 의도 없이, 본원에 개시된 것에 대한 대안적이고, 상호 교환 가능하고/가능하거나 동등한 구조, 기능, 범위 또는 단계를 포함하여, 허용된 정도까지 대안적인 구현예를 포함하는 권리를 획득하기 위한 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가로, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다.
정의
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "하나" 및 "일" 및 "특정한 하나" 및 유사한 언급은 본원에서 달리 지시되거나 또는 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한 단수 및 복수 둘 다를 지칭(예, "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미)한다. 예를 들어, 용어 "화합물"은 용어 "적어도 하나의 화합물" 및 "하나 이상의 화합물"과 동의어이며, 단일 화합물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는"은 조합되거나 또는 서로 배타적인 다중 성분을 지칭한다. 예를 들어, "x, y, 및/또는 z"는 "x" 단독, "y" 단독, "z" 단독, "x, y, 및 z", "(x 및 y) 또는 z", "(x 및 z) 또는 y", "(y 및 z) 또는 x", "x 및 z" 단독, "x 및 z" 단독, 또는 "y 및 z" 단독, 또는 "x 또는 y 또는 z"를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "적어도" 또는 "하나 이상"은 후속하여 열거된 요소 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 또는 그 이상 또는 모두를 지칭한다.
폴리뉴클레오티드의 맥락에서 본원에서 사용되는 용어 "암호화"는, 적절한 조절 서열의 제어 하에 배치될 경우에 폴리펩티드로 번역될 수 있는 mRNA로 전사되는 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 코딩 서열은 일반적으로 시작 코돈(예, ATG)에서 시작되고 정지 코돈(예, UAA, UAG 및 UGA)에서 종료된다. 코딩 서열은 단일 개방 판독 프레임, 또는 여러 개의 개방 판독 프레임을 포함할 수 있다(예를 들어, 인트론에 의해 분리됨).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "내인성"은, 설명된 맥락에서 천연적으로 존재하는 것을 지칭한다. 세포에 의해 생성되는 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 이러한 용어는 단백질이 세포에 의해 천연적으로 생성됨을 의미한다. 세포에 포함된 폴리뉴클레오티드를 참조하여 사용될 경우, 상기 용어는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 천연적으로 포함(예, 천연 세포에 존재하거나 천연 세포 내의 동일 게놈 위치에 위치)되는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "FFA 방출 효소 활성" 또는 "FFA 방출 효소의 활성"은 유리 지방산(FFA)의 방출을 유도하는 결합을 가수분해(예, 에스테르 결합을 가수분해)할 수 있는 효소의 활성을 지칭한다. FFA 방출 효소는 효소 커미션 번호(EC 번호) 3.1로 지정된다. 이들 용어는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 없는"은 지시된 성분이 통상적인 분석 방법에 의해 지시된 조성물에서 검출가능하지 않거나 또는 지시된 성분이 기능적이지 않도록 미량으로 존재하는 것을 지칭한다. 이러한 문맥에서 사용된 바와 같은 용어 "기능적"은 미량의 지시된 성분을 포함하는 조성물의 성질에 상당히 기여하지 않거나, 또는 미량의 지시된 성분을 포함하는 지시된 조성물에서 상당한 활성(예, 화학적 활성 효소 활성)을 갖지 않거나, 또는 미량의 지시된 성분을 포함하는 조성물의 사용 또는 소비 시 건강에 유해한 효과를 갖지 않는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상당히 기여하는"은, (표시된 성분이 결여된 것을 제외하고는 조성물과 동일한 기준 조성물에서) 성분의 부재 시, 속성이 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 덜 존재/활성/측정 가능한 정도로, 조성물의 속성에 기여하는 표시된 성분을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "발효 배지"는 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 포함하는 배양물을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "사상 진균류"는 유미코타(Eumycota) 및 오오미코타(Oomycota) 아문의 사상 형태의 유기체를 지칭한다 (문헌 [Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의된 바와 같음). 사상 진균류는 무성생식 성장 동안의 그의 균사 신장에 의해 효모와 구별된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "진균류"는 아스코미코타(Ascomycota), 바시디오미코타(Basidiomycota), 자이고미코타(Zygomycota), 및 키트리디오미코타(Chythridiomycota), 오오미코타(Oomycota), 및 글로메로미코타(Glomeromycota) 문의 생물을 지칭한다. 그러나, 진균 분류가 계속 진화 중이고, 따라서 진균계의 이러한 특정한 정의는 미래에 조정될 수 있다는 것이 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "이종성"은 이것이 기술되는 맥락에서 천연적으로 존재하지 않는 것을 지칭한다. 세포에 의해 생성되는 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 이러한 용어는 단백질이 세포에 의해 천연적으로 생성되지 않음을 의미한다. 세포에 포함된 폴리뉴클레오티드를 참조하여 사용되는 경우, 상기 용어는, 이종 폴리뉴클레오티드가 그 자체가 내인성(동일한 세포 또는 이의 후대로부터 기원함)이거나 외인성(다른 세포 또는 이의 후대로부터 기원함)인지 여부와 상관없이, 폴리뉴클레오티드가 세포 내에 천연적으로 포함되지 않음(예, 천연 세포에 존재하지 않거나 또는 천연 세포 내의 게놈 위치에 위치하지 않음)을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "상동성"은 적어도 40%(예, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%)가 유사한 길이의 기준 단백질에 포함된 유사한 길이(즉, 쿼리 아미노산 서열 길이의 +/- 20% 이내인 길이)의 아미노산 서열과 동일하고, 기준 단백질의 것과 유사한 기능적 특성(예. 이의 50% 이내, 40% 이내, 30% 이내, 20% 이내 또는 10% 이내) 또는 동일한 기능적 특성을 갖는다. 상기 용어는 다형성 변이체, 종간 상동체(예, 오소로그), 파라로그, 및 단백질의 대립유전자뿐만 아니라 유전자 조작 기술을 사용하여 인공적으로 만든 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 대상 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일성" 또는 "동일함"은, 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 최대 상응을 위해 각각 정렬될 경우에 동일한, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 지칭한다. 응용에 따라, "동일성"은 비교되는 서열의 영역에 걸쳐(예, 기능적 도메인의 길이에 걸쳐) 또는 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다. "영역"은 적어도 6, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 또는 적어도 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30 또는 그 이상의 아미노산의 연속된 신장으로 간주된다. 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은, 하나 이상의 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 테스트 및 기준 서열이 컴퓨터 내로 입력되고, 필요한 경우 하위 서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 그 다음, 서열 비교 알고리즘은, 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여 기준 서열에 대해 시험 서열(들)을 위한 서열 동일성 백분율을 계산한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 스미스 & 워터만의 국부 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), 니들만 & 번쉬의 상동성 정렬 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), 피어슨 & 립만의 유사성 방법 연구(Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)), 이들 알고리즘의 전산화된 구현(위스콘신 바이오기술 센터, 유전자 컴퓨터 그룹(GCG)의 서열 분석 소프트웨어 패키지 내 GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA, 이는 디폴트 파라미터와 사용될 수 있음), 또는 비주얼 검사(일반적으로 Ausubel et al., 이하 참조)에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하는 데 적합한 알고리즘의 일례는 BLAST 알고리즘(예, 문헌 [Altschul et al. [1990] J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish & States. [1993] Nature Genet. 3:266-272; Madden et al. [1996] Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul et al. [1997] Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang 7 Madden. [1997] Genome Res. 7:649-656])이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는, 국립 생명공학 정보 센터를 통해 공개적으로 이용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포함하는", "포함하다", "갖는", "갖는다", "갖는/있는", 또는 그의 변형은 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적이도록 의도된다.
FFA 방출 효소 활성과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절되지 않은"은 FFA 방출 효소의 활성 및/또는 발현의 변화 결여를 지칭한다(예, FFA 방출 효소의 농도 변화 또는 기질을 향한 효소 활성의 변화 없음).
FFA 방출 효소 활성과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "조절된"은 FFA 방출 효소의 활성의 임의의 변경을 지칭한다. 이렇게 조절된 FFA 방출 효소 활성은, 전형적으로 FFA 방출 효소 농도의 증가 또는 감소, 또는 기질을 향한 FFA 방출 효소의 효소 활성의 증가 또는 감소로 인한 것이다. 예를 들어, 상기 용어는 활성이 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%만큼 감소하는 것을 지칭할 수 있다. 대안적으로, 상기 용어는 활성이 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%만큼 증가하는 것을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연"은 자연에서 그의 비변형 상태에서 발견되는 것(예, 인간에 의해 유전 조절되지 않고, 인간에 의해 정의되지 않은 상태[예, 산소화 수준, pH, 염 농도, 온도, 및 영양소(예, 탄소, 질소, 황) 가용성]에서 유지되는 세포)을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 이들이 기능적으로 관련시키는 요소의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열의 전사를 제어하는 경우, 프로모터 서열은 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고, 분비 신호 서열이 세포의 분비 시스템을 통해 단백질을 유도하는 경우, 분비 신호 서열은 단백질에 작동 가능하게 연결된다. "작동 가능하게 연결된" 요소는 다른 요소와 인접하게 연결되거나, 트랜스로 또는 다른 요소와 일정 거리에서 작용할 수 있다. 작동 가능하게 연결될 수 있는 기능의 비제한적인 예는, 전사 제어, 번역 제어, 단백질 접힘, 및 단백질 분비를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하나 이상"은 하나, 적어도 하나, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 또는 후속하여 열거된 모든 요소를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "선택적인" 또는 "선택적으로"는 특색 또는 구조가 존재하거나 또는 그렇지 않은 것, 또는 이벤트 또는 상황이 발생하거나 또는 그렇지 않은 것을 지칭한다. 이러한 설명은 특징 또는 구조가 존재하는 경우 및 특징 및 구조가 부재하는 경우, 또는 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우 및 이벤트 또는 상황이 발생하지 않는 경우를 포함한다.
용어 "식물 단백질"은, "동물 단백질", 및 본원에서 사용되는 "미생물 단백질"은 식물, 동물, 또는 미생물(즉, 단세포 유기체, 모든 박테리아, 고세균, 단세포 원생동물, 단세포 동물, 단세포 식물, 단세포 진균, 단세포 조류, 원생동물, 및 색조류계) 각각에서 천연적으로 발견되는 단백질(즉, 식물 세포, 동물 세포, 또는 미생물 세포 각각에 천연인 단백질) 내 아미노산 서열과 적어도 80%(예, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 100%) 동일한 아미노산의 적어도 20(예, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 또는 적어도 150, 및 일반적으로 250 이하)의 아미노산의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 적어도 2(예, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000)의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 용어는 DNA 분자(예, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA) 및 RNA 분자(예, mRNA, 합성 RNA)의 센스 및 안티센스 가닥뿐만 아니라, 비-천연 뉴클레오티드 유사체, 비-천연 인터뉴클레오시드 결합, 및/또는 화학적 변형을 함유하는 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환; 뉴클레오티드간 변형 예컨대 하전되지 않은 연결(예, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트), 하전된 연결(예, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트), 펜던트 모이어티(예, 폴리펩티드), 인터칼레이터(예, 아크리딘, 소랄렌), 킬레이터, 알킬화제, 및 변형 연결(예, 알파 아노머 핵산)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 예가 관련 기술 분야에 설명된다(예, 문헌 [Malyshev et al. 2014. Nature 509:385]; 문헌 [Li et al. 2014. J. Am. Chem. Soc. 136:826]을 참조). 수소 결합 또는 다른 화학적 상호작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 능력 면에서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 또한 포함된다. 이러한 분자는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 펩티드 연결이 분자의 백본 내의 포스페이트 연결을 치환하는 분자를 포함한다. 다른 변형은, 예를 들어, 리보스 고리가 가교 모이어티 또는 다른 구조 예컨대 "잠금" 폴리뉴클레오티드에서 발견되는 변형을 함유하는 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 토폴로지 형태일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥, 이중-가닥, 삼중-가닥, 사중-가닥, 부분 이중-가닥, 분지형, 헤어핀형, 원형, 또는 패드록형 형태일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드에 포함되거나 폴리뉴클레오티드가 구성하는 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환될 수 있고, 적어도 2(예, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100)의 아미노산의 천연 발생 또는 천연적으로 발생하지 않는 중합체 형태를 지칭한다. "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 활성 구조를 갖거나 기능적 구조가 결여될 수 있고, 암호화 및/또는 비-암호화된 아미노산을 포함하고, 천연에서 발생하는 아미노산 및/또는 천연에서 발생하지 않는 아미노산을 포함하고, 화학적으로 변형 및/또는 생화학적으로 변형되고/변형되거나 유도체화된 아미노산을 포함하고, 변형되지 않고/않거나 변형된 펩티드 골격을 포함하고/포함하거나 단량체(즉, 단일 사슬) 또는 중합체(즉, 둘 이상의 사슬을 갖고, 이는 공유적으로 또는 비공유적으로 결합됨)일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산 서열"은 "폴리펩티드" 또는 "단백질"에 포함되거나 "폴리펩티드" 또는 "단백질"이 구성하는 아미노산의 서열을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "제제"는, 발효 배지의 하나 이상의 다른 성분으로부터의 재조합 성분의 분리 시에 수득된 제제를 지칭한다. 예를 들어, 제제는, 정화된 발효 배지(즉, 세포 및 세포 잔해물이 제거된 발효 배지)일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터 서열"은 세포에서 하류 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 프로모터 서열은, 중합효소 II형 프로모터의 경우, TATA 요소와 같은, 전사 시작 부위 근처에 필요한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 또한, 선택적으로 원위 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있으며, 이는 전사의 시작 부위로부터 수천 염기 쌍만큼 많이 위치할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정제" 또는 "정제됨" 또는 "단리" 또는 "단리됨"은, 성분이 유래된 공급원의 화학물질, 세포 성분, 및 세포(예, 세포벽, 막 지질, 염색체, 다른 단백질, 유기체 내의 다른 세포)로부터 실질적으로 분리되는 성분을 지칭한다. 성분은 적어도 60%, 예를 들어 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 순수할 수 있다. 상기 용어는 성분이 모든 화학물질, 세포 성분, 및 세포로부터 분리될 것을 요구하지 않는다(그러나 허용됨).
본원에서 사용되는 용어 "재조합 성분"은 재조합으로 생성되는(즉, 재조합 숙주 세포에서 생성되거나, 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 합성되는) 성분을 지칭한다. 재조합 성분의 비제한적인 예시는 재조합 단백질(예, 미생물 단백질, 식물 단백질(예, 완두콩 단백질(예, 레구민, 비실린, 코비실린), 감자 단백질(예, 튜베린, 프로테아제 억제제 노테이트 II)), 동물 단백질(예, 구조 단백질(예, 콜라겐, 트로포엘라스틴, 엘라스틴), 우유 단백질, 달걀 단백질(예, 오브알부민, 이소성핵종, 오브알부민, 난보트랜스페린, G162M F167A 난주막, 난글로불린 G2, 난글로불린 G3, α-오보무신, β-오보무신, 리소자임, 난자 억제제, 난당단백질, 플라보단백질, 난자글로불린, 오보스타틴, 시스타틴, 아비딘, 오브알부민 관련 단백질 X, 오브알부민 관련 단백질 Y)), 지질, 탄수화물, 소분자, 식품 첨가제(예, 감미제), 식품 보충제(예, 비타민), 뉴트라슈티컬 및 프로바이오틱스를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 단백질"은 재조합 숙주 세포에서 생성되는 단백질, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 합성되는 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 재조합 숙주 세포는 숙주 세포의 천연(비-재조합) 형태에서 발견되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있거나, 재조합 숙주 세포는, 숙주 세포의 천연(비-재조합) 형태와 상이한 수준으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 지칭하도록 의도된다는 것을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 대상 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "재조합 숙주 세포"의 범주 내에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포는 배양물에서 성장된 단리된 세포 또는 세포주일 수 있거나, 살아있는 조직 또는 유기체에 상주하는 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 천연적으로 발생하는 환경으로부터 제거되는 폴리뉴클레오티드를 지칭하고, 또는 폴리뉴클레오티드가 천연에서 발견될 경우에 폴리뉴클레오티드에 접경하거나 이에 근접하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 연관되지 않는 폴리뉴클레오티드를 지칭하거나, 또는 천연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 지칭하거나, 또는 천연 폴리뉴클레오티드에서 발견되지 않는 변형(예, 삽입, 결실, 또는 인공적으로, 예를 들어 인간 개입에 의해 도입된 점 돌연변이)을 함유한 폴리뉴클레오티드를 지칭하거나, 또는 이종 부위에서 염색체에 통합된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 용어는, 예를 들어 클로닝된 DNA 단리물, 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 설명하는 데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 천연적으로 발생하지 않는 유전자 변형을 함유하는 경우에 "재조합"으로 간주된다. 예를 들어, 내인성 폴리뉴클레오티드가 인공적으로(예를 들어, 인간의 개입에 의해) 도입된 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 함유하면, 이는 "재조합 폴리뉴클레오티드"로 간주된다. 이러한 변형은 폴리뉴클레오티드 내로 점 돌연변이, 치환 돌연변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전위 돌연변이, 또는 역전 돌연변이를 도입할 수 있다. 이러한 용어는 숙주 세포의 염색체 내의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 숙주 세포의 염색체 내에 있지 않은 폴리뉴클레오티드(예, 에피솜 내에 포함된 폴리뉴클레오티드)를 포함한다. 숙주 세포 또는 유기체 내의 재조합 폴리뉴클레오티드는, 숙주 세포의 생체내 세포 기계를 사용하여 복제할 수 있으나, 이러한 재조합 폴리뉴클레오티드는, 후속하여 세포내에서 복제되지만, 본 발명의 목적을 위해 여전히 재조합된 것으로 간주된다.
본원에 사용된 용어 "조절 요소"는, 조절 요소가 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현(예, 전사, 전사후 이벤트, 번역)을 매개하거나, 조절하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 요소의 비제한적인 예시는, 프로모터 서열, 종결 서열, 전사 시작 서열, 번역 시작 서열, 번역 정지 서열, 인핸서 서열, 활성화제 서열, 응답 요소, 단백질 인식 부위, 유도 가능한 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 미번역 영역, 상류 활성화 서열(UAS), 인트론, 작동자(즉, 억제자 단백질이 결합하여 프로모터의 활성을 감소시키거나 제거할 수 있는 단백질 결합 도메인을 포함하는 프로모터에 인접한 핵산의 서열); 효율적인 RNA 처리 신호(예, 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호), 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 번역 효율을 향상시키는 서열(예, 리보솜 결합 부위[예, 샤인-달가노 서열]), 단백질 안정성을 향상시키는 서열, 단백질 분비를 향상시키는 서열, 및 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "분비하다", "분비", 및 "분비된"은 단백질을 세포외 환경으로 생성하는 세포의 세포막 및/또는 세포벽을 가로지르는 단백질의 분비 과정을 지칭한다. 본원에서 제공되는 바와 같이, 이러한 분비는 능동적으로 또는 수동적으로 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "분비 신호"는, 단백질의 N-말단에 작동 가능하게 연결되고 단백질이 숙주 세포의 외부로 생성되는(즉, 합성되는) 숙주 세포의 세포내 분비 경로를 통해 단백질의 전달을 매개하는, 펩티드를 지칭한다. 일반적으로, 재조합 단백질을 분비 신호와 작동 가능하게 연결하려면, 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 시작 코돈을 제거해야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "둘 이상"은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 또는 후속하여 열거된 모든 요소를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는, 숙주 세포 내로 도입될 폴리뉴클레오티드 서열을 운반할 수 있는 핵산을 지칭한다. 벡터의 비제한적인 예시는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 벡터, 코스미드, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 바이러스 입자(예, 이종 폴리뉴클레오티드를 포함함), DNA 작제물(예, 클로닝 또는 PCR 증폭에 의해 생성됨), 및 선형 이중-가닥 분자(예, PCR 단편)을 포함한다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제될 수 있다(예, 숙주 세포에서 기능하는 복제 기원을 갖는 벡터). 다른 벡터는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효모"는 사카로미세탈레스의 임의의 유기체를 지칭한다. 효모의 무성생식 성장은 단세포 탈러스의 발아/출포에 의하고, 탄소 이화대사는 발효성일 수 있다.
본원에서 값의 범위의 인용은, 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 인용된 최소 및 최대 값을 포함하는 범위 내에 속하는 각각의 별도의 값(분획 또는 적분)을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서의 역할을 하도록 의도되며, 각각의 별도의 값은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 또한, 본원에 인용된 임의의 수치 범위는 그 안에 포함되는 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, "1 내지 10"의 범위는 인용된 최소값 1과 인용된 최대값 10, 즉 최소값 1 이상 및 최대값 10 이하의 모든 하위 범위를 포함하도록 의도된다. 이하에서 설명되는 모든 범위 및 양은 근사치이며 본 발명을 제한하려는 것이 아님을 더 이해해야 한다.
본원에 개시된 임의의 방법에서, 본 발명이 작동 가능하게 유지되는 한, 특정 조치를 수행하기 위한 단계 또는 순서의 순서는 중요하지 않음을 이해해야 한다. 또한, 둘 이상의 단계 또는 동작이 동시에 수행될 수 있다.
재조합 성분을 포함한 조성물을 제조하기 위한 방법
다양한 양태에서, 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 성분(예, 본원에 개시된 임의의 재조합 성분)을 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, FFA 방출 효소의 활성(예, 본원에 개시된 임의의 하나의 FFA 방출 효소의 활성 또는 본원에 개시된 둘 이상의 FFA 방출 효소의 활성)을 조절하는 단계를 포함한다.
본원에 제공된 방법에서 FFA 방출 효소의 활성을 조절하는 단계는, 조절된 FFA 방출 효소 활성을 제공하는 임의의 단일 단계 또는 둘 이상의 임의의 단계 조합으로 발생할 수 있다. 적절한 단계의 비제한적인 예시는 다음을 포함한다: i) FFA 방출 효소 활성을 조절하기에 적합한 발효 조건 하에서 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; ii) 발효 배지, 제제, 또는 조성물에서 FFA 방출 효소 활성을 조절하는 단계; iii) 상기 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 FFA 방출 효소 활성으로부터 상기 재조합 성분을 정제하는 단계 및/또는 상기 재조합 성분으로부터 방출 효소 활성을 정제하는 단계; 및/또는 iv) 조절된 FFA 방출 효소 활성을 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 성분을 수득하는 단계.
FFA 방출 효소 활성을 조절하는 데 적합한 발효 조건
상기 중 어느 하나에 따른 방법은 다음을 포함할 수 있다: a) 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 b) 재조합 성분의 생성 및/또는 분비에 적합하고 FFA 방출 효소 활성을 조절하기에 적합한 발효 조건 하에 재조합 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계.
FFA 방출 효소 활성을 조절하기에 적합한 조건은, 예를 들어 재조합 숙주 세포가 FFA 방출 효소 활성의 생성을 조절하는 조건일 수 있다. 이러한 조건의 비제한적인 예는 적절한 pH, 적절한 온도, 적절한 공급 속도, 적절한 압력, 적절한 유체 전단 응력, 영양분의 적절한 유형 및/또는 함량(예, 적절한 탄소 함량, 적절한 질소 함량, 적절한 인 함량), 적절한 유형 및/또는 함량의 배양 보충물, 적절한 유형 및/또는 함량의 미량 금속, 및/또는 적절한 산소화 수준을 포함한다.
적절한 pH는 2 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2.5; 2.5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4, 3.5, 또는 3; 3 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4, 또는 3.5; 3.5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5, 4; 4 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5, 4.5; 4.5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5, 5; 5 내지 7.5, 6.5, 6, 5,5; 5.5 내지 7.5, 6.5, 6; 6 내지 7.5, 6.5; 6.5 내지 7.5, 또는 7; 또는 7 내지 7.5의 pH일 수 있다.
적절한 유형의 배양 보충제는 소포제일 수 있다. 적절한 소포제의 비제한적인 예시는 스트룩톨 J 673 A(쉴&사일라커 게엠베하, 독일 함부르크), 인더스트롤 DF204(BASF 캐나다 인크, 캐나다 미시소거), 폴리글리콜 P-2000(다우, 미시건주 미들랜드), 호닥 K-60K(호닥 케미컬 코포레이션, 일리노이주 시카고), 및 에롤(Erol) DF6000K(PMC 우브리, 프랑스 꺄흐방), ACP 1500(다우 케미컬 컴퍼니, 미시건주 미들랜드), 안티폼 204(시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스), SAG 471(모멘티브 퍼포먼스 머티리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), SAG 5693(모멘티브 퍼포먼스 머티리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), SAG 710(모멘티브 퍼포먼스 머티리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), SAG 730(모멘티브 퍼포먼스 머티리얼스 인크, 뉴욕주 워터포드), 실리콘 안티폼, 스트룩톨 J647 (쉴&사일라커, 독일 함부르크), 및 해바라기 오일을 포함한다.
발효 배지, 제제, 또는 조성물에서 FFA 방출 효소 활성을 조절하는 단계
상기 중 어느 하나에 따른 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: i) 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; ii) 재조합 숙주 세포를 재조합 성분의 생성 및/또는 분비에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 배양하여 재조합 성분을 포함한 발효 배지를 수득하는 단계; iii) 선택적으로 상기 재조합 성분을 상기 발효 배지로부터 정제하여, 상기 재조합 성분을 포함한 제제를 수득하는 단계; 및 iv) 상기 재조합 성분을 포함한 발효 배지, 제제, 또는 조성물에서 FFA 방출 효소 활성을 조절하는 단계.
발효 배지, 제제, 또는 조성물 중의 FFA 방출 효소 활성은, 예를 들어 발효 배지, 제제, 또는 조성물에 FFA 방출 효소 억제제를 첨가함으로써 조절될 수 있다. 적절한 FFA 방출 효소 억제제의 비제한적인 예시는 합성 억제제(예, 포스포네이트, 보론산, 지질 유사체), 및 예컨대 주니페루스 콤무니스, 일리시움 렐리지오숨, 파낙스 자포니쿠스 근경, 파낙스 진셍, 파낙스 퀸퀘폴리우스, 아칸토파낙스 센티코수스, 카멜리아 시넨시스 변종 시넨시스, 카멜리아 시넨시스 변종 아사미카, 코키아 스코파리아, 플라티코디 라딕스, 살라시아 레티쿨레이트, 넬룸보 누시페라, 살릭스 마츠다나, 에리오클로아 빌로사, 살라시아 레티쿨레이트, 스카비오사 츠칠리엔시스 그룬, 및 아칸토파낙스 세실리풀로루스와 같은 공급원으로부터 단리된 천연 억제제(예, β-락톤(예컨대 발리락톤, 에베락톤 A & B, 및 비브라락톤), 만노-올리고사카라이드, 아세틸콜린 에스테라제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 폴리페놀, 사포닌, 판클리신, 헤스페리딘, 콜러페닌, 프로안토시아니딘, 오를리스탯(제니칼), 카르노스산, 에스신, 크로신, 크로세틴, 클로로겐산, 네오클로로겐산, 페룰로이퀸산, e-폴리라이신, 키토산, 키틴)를 포함한다. 일부 구현예에서, FFA 방출 효소 활성은, 그들의 촉매 도메인에 세린 잔기를 포함한 FFA 방출 효소의 억제제(예, 억제제 Thermo ActivX TAMRA-FP 플루오로포스포네이트)의 발효 배지, 제제, 또는 조성물에 첨가됨으로써 조절된다. 촉매 도메인에 세린 잔기를 포함한 FFA 방출 효소의 비제한적인 예시는, G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 및 G0RKH7을 포함한다.
발효 배지, 제제, 또는 조성물 중의 FFA 방출 효소 활성은 또한, 예를 들어 발효 배지, 제제, 또는 조성물에 FFA 방출 효소 활성에 필요한 보조 인자 및/또는 FFA 방출 효소 억제제의 활성에 필요한 보조 인자 각각을 첨가함으로써 조절될 수 있다. 이러한 보조 인자의 비제한적인 예시는 금속(예, 칼슘과 같은 2가 양이온)을 포함하며, 이는, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트화제로 제거될 수 있다.
발효 배지, 제제, 또는 조성물 내 FFA 방출 효소 활성은, 예를 들어 열적 또는 비-열적 처리에 의해 조절될 수도 있다. 열적 처리의 비제한적인 예시는 저온살균 및 살균을 포함한다. 비-열적 처리의 비제한적인 예시는 고압 저온살균 (즉, 고압 처리, HPP), 초음파처리, 펄스 전기장 처리, 및 조사를 포함한다. 일부 구현예에서, 발효 배지 또는 제제 또는 조성물 내 FFA 활성 효소 활성은, 발효 배지, 제제, 또는 조성물을 고온에서 비교적 짧은 기간 동안(예, 85℃ 내지 90℃의 온도에서 5 내지 10분 동안) 인큐베이션하는 것에 의해 본질적으로 제거되거나 또는 감소된다.
FFA 방출 효소 활성으로부터 재조합 성분을 정제하는 단계
상기 중 어느 하나에 따른 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다: i) 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; ii) 재조합 숙주 세포를 재조합 성분의 생성 및/또는 분비에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 배양하여 재조합 성분을 포함한 발효 배지를 수득하는 단계; 및 iii) 상기 재조합 성분을 FFA 방출 효소 활성으로부터 정제하고/정제하거나, 상기 재조합 성분으로부터 상기 FFA 방출 효소를 정제하여 상기 재조합 성분을 포함한 제제를 수득하는 단계.
FFA 방출 효소 활성으로부터 재조합 성분을 정제하는 단계는, 재조합 성분을 FFA 방출 효소로부터 구별하는 임의의 하나의 특성에 기초하여 달성될 수 있고, 또는 연속으로 사용된 두 개 이상의 이러한 특성의 조합(예, 전하에 기초한 분리 후 소수성에 기초한 분리, 소수성에 기초한 분리 후 pH 안정성에 기초한 분리) 또는 병렬로 사용된 두 개이 상의 이러한 특성의 조합(예, pH 안정성 및 열분해성/열안정성에 기초한 분리, 특정 분자에 대한 pH 안정성 및 친화도에 기초한 분리, 용해도 및 pH 안정성 및/또는 열분해성/열분해성 및/또는 pI에 기초한 분리)에 기초하여 달성될 수 있다.
예를 들어, 재조합 성분을 포함한 발효 배지 또는 제제는, FFA 방출 효소가 변성되고 용액으로부터 침전되지만 재조합 성분이 구조적으로 온전하고 가용성인 온도로 가열될 수 있다. 후속적으로, 침전된 FFA 방출 효소를, 1-g 침강, 원심분리를 통한 가속 침강, 및/또는 필터 패드, 시트 또는 막을 사용하는, 심층 여과 또는 접선 유동 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 여과 기술을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해, 가용성 재조합 성분으로부터 분리할 수 있다.
추가 예시로서, 적절한 크로마토그래피 지지체가 재조합 성분을 포함한 발효 배지 또는 제제에 첨가될 수 있고, (예를 들어, pH 및/또는 이온 강도의) 조건은, FFA 방출 효소 또는 재조합 성분(하지만 둘 다는 아님)이 크로마토그래피 지지체에 (예를 들어 전하 또는 소수성에 기초하여) 결합하도록 조절되어, 가용성 재조합 성분 또는 FFA 방출 효소를 각각 미결합 부분에 남길 수 있다. 적절한 크로마토그래프 지지체의 비제한적인 예시는 페닐 세파로스, 부틸 세파로스, 및 옥틸 세파로스를 포함한다. 후속적으로, FFA 방출 효소 또는 재조합 성분이 결합되어 있는 크로마토그래프 지지체가 1-g 침강, 원심분리, 또는 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 가용성 재조합 성분 또는 FFA 방출 효소로부터 각각 분리될 수 있다. 대안적으로, 크로마토그래프 지지체는 재조합 성분을 포함하는 발효 배지 또는 제제가 이를 통과하여 이동하도록 만들어지는 고정 지지체(예, 칼럼 내의 흡착제)일 수 있고, 재조합 성분은 미결합 부분에서 수득되는 반면 FFA 방출 효소는 크로마토그래프 지지체에 결합하거나, 또는 재조합 성분은 크로마토그래프 지지체에 결합하는 반면 FFA 방출 효소는 미결합 부분에 남고, 결합된 재조합 성분이 후속적으로 조건을 조절하는 것에 의해 크로마토그래프 지지체로부터 방출된다.
추가 예시에서, 반대 이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨 산 염이 재조합 성분을 포함하는 발효 배지 또는 제제에 첨가되고, 반대 이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨 산 염이 재조합 성분 또는 FFA 방출 효소와 복합체를 형성하도록 발효 배지 또는 제제의 pH 및/또는 이온 강도가 조절되어, 가용성 FFA 방출 효소 또는 재조합 성분을 각각 남길 수 있다. 후속적으로, 복합체를, 1-g 침강, 원심분리를 통한 가속 침강, 및/또는 필터 패드, 시트 또는 막을 사용하는, 심층 여과 또는 접선 유동 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 여과 기술을 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 단리시킬 수 있다. 재조합 성분이 반대이온 또는 이온-교환 수지 또는 나트륨산 염에 대해 복합체화되는 구현예에서, 재조합 성분은 조건을 조절(예, pH 및/또는 이온 강도 조절)함으로써 복합체로부터 추출될 수 있다.
추가 예시로서, FFA 방출 효소가 변성되고 용액으로부터 침전되어 가용성 재조합 성분을 남기도록, 재조합 성분을 포함하는 발효 배지 또는 제제의 pH가 조절될 수 있다. 후속적으로, 침전된 FFA 방출 효소를, 1-g 침강, 원심분리를 통한 가속 침강, 및/또는 필터 패드, 시트 또는 막을 사용하는, 심층 여과 또는 접선 유동 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 여과 기술을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적절한 방법에 의해, 가용성 재조합 성분으로부터 분리할 수 있다.
추가 예시로서, 활성-기반 단백질 프로파일링(ABPP) 소분자 프로브를, 재조합 성분을 포함한 발효 배지 또는 제제에 첨가할 수 있다. 프로브는 그의 촉매 도메인에서 세린 잔기를 포함한 FFA 방출 효소에 결합할 수 있다. FFA 방출 효소에 대한 ABPP의 결합 시, 결합된 FFA 방출 효소는, 제2 특이적 친화도 결합을 통해 고정될 수 있으며, 이는 재조합 성분으로부터 FFA 방출 효소를 제거할 수 있다. ABPP의 비제한적인 예시는 비오틴화 플루오로포스포네이트(예, ActivXTM 데티오비오틴-플루오로포스포네이트 세린 가수분해 효소 프로브(DTB-FP))를 포함하고, 상기 포스포네이트 모이어티는 FFA 방출 효소의 촉매 도메인에서 친핵성 세린에 공유 결합할 수 있고, 비오틴 모이어티는 아비디닐화된 아가로오스와 상호 작용하고, 이에 의해 반응된 FFA 방출 효소의 (예를 들어, 아가로오스 비드로) 고정시키고, 원심분리를 통한 물리적 분리, 여과, 및/또는 다른 가용성-불용성 분리 방법을 포함한다.
FFA 방출 효소 활성
본원에 제공된, 조절된 FFA 방출 효소 활성(예, 재조합 성분을 포함한 발효 배지 또는 제제에 포함되는 조절된 FFA 방출 효소 활성, 또는 재조합 성분을 생성할 수 있는 본원에 제공된 재조합 숙주 세포에 포함되는 조절된 FFA 방출 효소 활성)은 임의의 하나의 FFA 방출 효소 또는 두 개 이상의 FFA 방출 효소의 임의의 조합의 조절된 활성일 수 있다.
적절한 FFA 방출 효소의 비제한적인 예시는 카르복시 에스테르 가수분해 효소(EC 번호 3.1.1), 인산 디에스테르 가수분해효소(EC 번호 3.1.4), 엑소리보뉴클레아제(EC 번호 3.1.13), 카르복실에스테라아제(EC 번호 3.1.1.1), 아릴에스테라아제(EC 번호 3.1.1.2), 트리아실글리세롤 리파아제(EC 번호 3.1.1.3), 포스포리파아제 A2(EC 번호 3.1.1.4), 리소포스포리파아제(EC 번호 3.1.1.5), 아세틸에스테라아제(EC 번호 3.1.1.6), 아세틸콜린에스테라아제(EC 번호 3.1.1.7), 글리세로포스포콜린 포스포디에스테라아제(EC 번호 3.1.4.2), 포스포리파아제 C(EC 번호 3.1.4.3), 포스포리파아제 D(EC 번호 3.1.4.4), 포스포이노시티드 포스포리파아제 C(EC 번호 3.1.4.11), 글리코실포스파티딜이노시톨 포스포리파아제 D(EC 번호 3.1.4.50), N-아세틸포스파티딜에탄올아민-가수분해 포스포리파아제 D(EC 번호 3.1.4.54), 펙틴에스테라아제(EC 번호 3.1.1.11), 글루코노락토나아제(EC 번호 3.1.1.17), 아실글리세롤 리파아제(EC 번호 3.1.1.23), 3-옥소아디페이트 에놀-락토나아제 (EC 번호 3.1.1.24), 1,4-락토나아제 (EC 번호 3.1.1.25), 갈락톨리파아제(EC 번호 3.1.1.26), 포스포리파아제 A1(EC 번호 3.1.1.32), 리포단백질 리파아제(EC 번호 3.1.1.34), 세팔로스포린-C 탈아세틸화효소(EC 번호 3.1.1.41), 카르복시메틸렌부테놀리다아제(EC 번호 3.1.1.45), 2-피론-4,6-디카르복실레이트 락토나아제(EC 번호 3.1.1.57), 아세틸크실란 에스테라아제(EC 번호 3.1.1.72), 페룰로일 에스테라아제(EC 번호 3.1.1.73), 큐티나아제(EC 번호 3.1.1.74), 호르몬 민감성 리파아제(EC 번호 3.1.1.79), 팔미토일-단백질 가수분해효소(EC 번호 3.1.2.22), 에폭시드 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.3), 세라미다아제(EC 번호 3.5.1.23), 류코트리엔-A4 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.6), 헤폭실린-에폭시드 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.7), 리모넨-1,2-에폭시드 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.8), 마이크로솜 에폭시드 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.9), 가용성 에폭시드 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.10), 콜레스테롤-5,6-옥사이드 가수분해효소(EC 번호 3.3.2.11), 지방산 아미드 가수분해 효소(EC 번호 3.5.1.99), 및 리폭시게나아제(E.C. 1.13.11.)를 포함한다.
적절한 FFA 방출 효소의 비제한적인 예시는, 표 1에 열거된 임의의 FFA 방출 효소, 및 이의 상동체, 및 표 2에 열거된 InterPro 도메인 중 어느 하나를 포함한 FFA 방출 효소를 포함한다.
예시적인 FFA 방출 효소(UniProt 서열 ID)
A0A2T4AZ21 A2QUQ1 G0R733 G0RES5 G0RL78 G0RSX2
A0A2T4B235 A2QV27 G0R765 G0REU9 G0RL87 G0RT28
A0A2T4BBP9 A2QV39 G0R7A1 G0REV0 G0RLA5 G0RT33
A0A2T4BCL7 A2QV40 G0R7C6 G0REW1 G0RLB0 G0RT48
A0A2T4BFY3 A2QV44 G0R7E2 G0REZ4 G0RLB7 G0RT83
A0A2T4BJB5 A2QVF5 G0R7I3 G0RF39 G0RLF0 G0RTA0
A0A2T4BJD9 A2QVJ4 G0R7I6 G0RF50 G0RLF5 G0RTF8
A0A2T4BNI9 A2QW25 G0R7K1 G0RF55 G0RLH4 G0RTH0
A2Q818 A2QW83 G0R7K4 G0RF60 G0RLJ6 G0RTI0
A2Q8F7 A2QX56 G0R7P7 G0RFF4 G0RLL0 G0RTJ0
A2Q8R7 A2QX92 G0R7T1 G0RFG1 G0RLR3 G0RTK4
A2Q8U6 A2QXD2 G0R7V3 G0RFK7 G0RLW2 G0RTR6
A2Q9L0 A2QY19 G0R810 G0RFN9 G0RM14 G0RTT4
A2QAC4 A2QYC0 G0R858 G0RFR3 G0RM75 G0RTU6
A2QAD7 A2QYF0 G0R862 G0RFT3 G0RME1 G0RTX4
A2QAH7 A2QYK5 G0R882 G0RFV5 G0RME5 G0RUB4
A2QBC9 A2QYS7 G0R8A6 G0RFW1 G0RMI3 G0RUF0
A2QBG8 A2QYU7 G0R8F3 G0RFX4 G0RMI7 G0RUF6
A2QBH3 A2QZ17 G0R8H0 G0RFY5 G0RMJ0 G0RUH2
A2QBH5 A2QZ72 G0R8H3 G0RFZ5 G0RMK6 G0RUI0
A2QBH8 A2QZB2 G0R8N5 G0RG04 G0RMN0 G0RUL0
A2QBK3 A2QZB7 G0R8Z3 G0RG60 G0RMS9 G0RUQ7
A2QBP1 A2QZE3 G0R908 G0RG87 G0RMU2 G0RUS8
A2QC75 A2QZI3 G0R932 G0RGA2 G0RMV2 G0RUU0
A2QCM0 A2QZK9 G0R976 G0RGD5 G0RMW2 G0RUX0
A2QCT1 A2QZN6 G0R9B7 G0RGG2 G0RMX3 G0RUY2
A2QE05 A2QZR0 G0R9D1 G0RGK1 G0RMZ1 G0RUZ9
A2QE77 A2QZW3 G0R9F9 G0RGL4 G0RN71 G0RV27
A2QEH4 A2QZX0 G0R9J9 G0RGN7 G0RNC1 G0RV66
A2QEJ2 A2QZX4 G0R9K4 G0RGQ0 G0RNE8 G0RV80
A2QEW9 A2QZY6 G0R9R2 G0RGQ7 G0RNF6 G0RV93
A2QF42 A2R032 G0R9S9 G0RGR3 G0RNF8 G0RV93
A2QF54 A2R088 G0R9U0 G0RGU9 G0RNI2 G0RVC2
A2QF64 A2R098 G0R9X3 G0RGV1 G0RNI4 G0RVD2
A2QFE9 A2R0H9 G0R9X6 G0RGW7 G0RNL1 G0RVJ5
A2QG33 A2R0P4 G0RA08 G0RH18 G0RNL9 G0RVK4
A2QG70 A2R0Z6 G0RA23 G0RH28 G0RNP0 G0RVK8
A2QGD9 A2R199 G0RA68 G0RH34 G0RNR1 G0RVN2
A2QH22 A2R1N7 G0RAB1 G0RH85 G0RNS6 G0RVN3
A2QH76 A2R1P3 G0RAC5 G0RHA2 G0RNS9 G0RVR8
A2QHB7 A2R1R5 G0RAE0 G0RHA7 G0RNV2 G0RVT9
A2QHE2 A2R1X8 G0RAQ0 G0RHB2 G0RNV2 G0RVW2
A2QHE9 A2R234 G0RAQ2 G0RHB9 G0RNX7 G0RVW9
A2QI32 A2R256 G0RAQ9 G0RHG1 G0RNX9 G0RVY3
A2QIA0 A2R273 G0RB17 G0RHG3 G0RNY4 G0RVZ5
A2QIE4 A2R274 G0RB25 G0RHH9 G0RP27 G0RW00
A2QII0 A2R2I5 G0RB33 G0RHJ4 G0RPQ8 G0RW44
A2QIR3 A2R2M3 G0RB46 G0RHL8 G0RPU6 G0RW65
A2QK82 A2R2W3 G0RB49 G0RHQ7 G0RPX6 G0RW73
A2QK84 A2R350 G0RB72 G0RHZ4 G0RQB2 G0RW77
A2QK90 A2R496 G0RBA4 G0RI29 G0RQD1 G0RW78
A2QKQ5 A2R4Z2 G0RBA7 G0RI53 G0RQE9 G0RW83
A2QKZ8 A2R502 G0RBB4 G0RIB6 G0RQF9 G0RWB8
A2QL89 A2R5R4 G0RBC8 G0RID1 G0RQG3 G0RWC3
A2QL90 A2R5R5 G0RBG0 G0RIE0 G0RQJ5 G0RWG2
A2QLA0 A2R5V7 G0RBH2 G0RIF0 G0RQJ7 G0RWH5
A2QM14 A2R689 G0RBJ0 G0RIF9 G0RQJ8 G0RWI8
A2QMI7 A2R6H5 G0RBJ9 G0RIJ9 G0RQJ9 G0RWN3
A2QMK5 A2R6I6 G0RBK0 G0RIL6 G0RQL6 G0RWP3
A2QN29 A2R6I8 G0RBL2 G0RIU1 G0RQM0 G0RWS1
A2QN56 A2R6L8 G0RBM4 G0RIV5 G0RQN5 G0RWT9
A2QNF0 A2R709 G0RBR4 G0RIW0 G0RQW6 G0RWW6
A2QNW9 A2R775 G0RBV8 G0RIY7 G0RQY3 G0RWY5
A2QPC2 A2R780 G0RBZ6 G0RJ62 G0RR02 G0RX05
A2QPJ6 A2R7H4 G0RC98 G0RJ65 G0RR03 G0RX23
A2QPY4 A2R7J0 G0RCA4 G0RJ76 G0RR14 G0RX29
A2QRK1 A2R835 G0RCD0 G0RJ81 G0RR30 G0RX49
A2QRK3 A2R845 G0RCG3 G0RJC6 G0RR42 G0RX82
A2QRP8 A2R8C2 G0RCI8 G0RJK1 G0RR69 G0RX90
A2QS21 A2R8M8 G0RCP2 G0RJP3 G0RR96 G0RXG3
A2QS22 A2R8R3 G0RCV0 G0RJQ1 G0RRB6 G0RXI5
A2QS33 A2R8R4 G0RCV3 G0RJW8 G0RRD1 G0RXL4
A2QS46 A2R8Z3 G0RCY9 G0RJY0 G0RRG3 G0RXP9
A2QS56 A2R9C0 G0RD04 G0RK83 G0RRH7 G2Q0K1
A2QS66 A2RAP4 G0RD16 G0RK88 G0RRJ7 G2Q379
A2QSJ9 A2RBF9 G0RD43 G0RK89 G0RRK3 G2QH51
A2QST4 A5ABC0 G0RD44 G0RKE6 G0RRL3 G2QL32
A2QSX2 A5ABC3 G0RDB2 G0RKG4 G0RRQ1 O32129
A2QSY5 A5ABE5 G0RDB5 G0RKH6 G0RRQ4 P37957
A2QT47 A5ABE6 G0RDD0 G0RKH7 G0RRR1 P37967
A2QT57 A5ABE8 G0RDE1 G0RKI9 G0RRS5 P42969
A2QT66 A5ABH9 G0RDJ1 G0RKJ8 G0RRS8 Q79F14
A2QT70 A5ABK1 G0RDK5 G0RKL2 G0RRV4
A2QT75 A5ABZ1 G0RDN5 G0RKL4 G0RRZ7
A2QT90 E2PSR0 G0RDU7 G0RKL9 G0RS43
A2QTI0 E2PT14 G0RDV8 G0RKQ8 G0RS48
A2QTI9 E2PT22 G0RDW0 G0RKT8 G0RSC7
A2QTZ0 G0R6T6 G0RE70 G0RKT9 G0RSK7
A2QUA5 G0R6X2 G0REE8 G0RKW8 G0RSM4
A2QUC1 G0R6X7 G0REM1 G0RKX7 G0RSP4
A2QUD7 G0R6Z2 G0REM4 G0RL22 G0RSS3
A2QUE3 G0R707 G0REM9 G0RL38 G0RSW4
예시적인 FFA 분리 효소 촉매 도메인의 InterPro 번호
IPR002168 IPR017915 IPR003187 IPR038885 IPR008265
IPR033140 IPR001087 IPR004961 IPR039097 IPR033112
IPR000675 IPR001531 IPR007000 IPR039180 IPR033113
IPR002641 IPR003633 IPR007942 IPR008947 IPR001423
IPR002642 IPR007751 IPR009613 IPR036541 IPR009535
IPR002921 IPR008475 IPR010711 IPR033560 IPR026605
IPR001711 IPR010468 IPR011402 IPR033562 IPR028382
IPR001736 IPR013818 IPR012354 IPR033902 IPR028407
IPR000909 IPR014815 IPR016272 IPR034315 IPR032075
IPR005592 IPR015359 IPR016338 IPR037737 IPR032588
IPR006693 IPR016090 IPR016445 IPR038875 IPR033556
IPR025202 IPR017913 IPR016674 IPR001211 IPR033903
IPR003140 IPR017914 IPR017186 IPR001981 IPR033906
IPR011150 IPR024632 IPR017766 IPR002330 IPR035547
IPR015679 IPR025920 IPR017767 IPR002331 IPR035669
IPR016555 IPR029002 IPR017769 IPR002333 IPR000734
IPR021771 IPR032093 IPR020009 IPR002334 IPR001028
IPR001192 IPR032341 IPR025483 IPR036444 IPR036691
IPR024884 IPR016035 IPR002918 IPR005152 IPR015141
IPR001446 IPR004126 IPR001885 IPR000801 IPR027433
IPR020833 IPR020834 IPR013819 IPR000907 IPR001246
두 개 이상의 FFA 방출 효소의 조합의 비제한적인 예시는 다음을 포함한다: 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해 효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제; 하나 이상의 아세틸크실란스테라아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해 효소; 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 알파/베타 가수분해 효소 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 GDSL 리파아제, 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 아세틸에스테라아제 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해효소; 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 알파/베타 가수분해 효소 및 FFA 방출 효소 및 하나 이상의 다른 카르복시 에스테르 가수분해 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 리소포스포리파아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 트리아실글리세롤 리파아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 포스포리파아제 C; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 A2 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 아세틸에스테라제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 포스포리파아제 C 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸크실란에스테라아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 아세틸에스테라아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 세포외 리파아제-유사 단백질 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 아세틸에스테라제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해 효소; 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 GDSL 리파아제 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자; 및 하나 이상의 큐티나아제 및 하나 이상의 알파/베타 가수분해효소 접힘 도메인-함유 단백질 및 FFA 방출 효소의 발현을 조절하는 하나 이상의 전사 인자를 포함한다.
상기 중 어느 하나에 따른 방법에서, 재조합 성분, 또는 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 포함하는 발효 배지 또는 제제는, 원하는 조성물의 제조에 유용한 FFA 방출 효소 활성의 원하는 프로파일(즉, FFA 방출 효소 활성 프로파일)을 제공하는 FFA 방출 효소 활성의 조합 및/또는 수준일 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 조성물의 원하는 풍미, 향, 질감, 에멀션화, 영양 함량 및/또는 저장 수명을 제공하도록 FFA 방출 효소 활성 프로파일이 최적화될 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 방법으로 활성을 조절해야 하는 FFA 방출 효소의 적절한 수 및/또는 조합은, 당업계에 공지된 방법에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, FFA 방출 효소를 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 (예를 들어, 친화력 크로마토그래피, 자이모그램 검정법, 겔 전기영동을 사용하여) 단리하고, 어떤 것이 또는 적어도 두 개의 FFA 방출 효소의 어떤 조합이 특정한 디글리세리드, 트리글리세리드, 인지질, 또는 지질단백질의 실질적인 양의 분해를 제공하는지를 결정하도록 시험관 내에서 테스트할 수 있다. 또한, 임의의 하나의 FFA 방출 효소 또는 적어도 두 개의 FFA 방출 효소의 임의의 조합에서 조절된 활성을 포함하는, 재조합 성분(예, 임의의 본원에 개시된 재조합 성분)을 생성할 수 있는 재조합 미생물 숙주 세포를 수득할 수 있고, 각각의 이러한 재조합 미생물 숙주 세포에 의해 생성된 재조합 성분을 포함하는 조성물의 지질 분해의 감소 또는 제거의 정도를 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다.
FFA 방출 효소 활성은 효소 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 비색 반응 생성물 또는 예를 들어 PAGE 겔, 분광광도계, 영상화, UV/Vis, 빛, 및 HPLC를 사용하여 검출될 수 있는 생성물(예, 트리글리세리드의 에스테라제-촉매 가수분해로부터 생성된 FFA 및/또는 글리세롤)의 생성에 의해 효소 활성을 결정할 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85, G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, G0RVD2, 및 G0R8A6, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열#, G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 및 G0RKH7, 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열#, G0RH85, G0RGQ0, G0RLH4, 및 G0RMI3, 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열#, G0RH85 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열#, G0RGQ0 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열#, G0RLH4 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열#, G0RMI3 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, R0RVD2, 및 G0R8A6, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 및 G0RKH7, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, G0RMI3, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0RFT3, G0RG60, G0RGD5, G0RI29, G0RIJ9, G0RKH7, G0RKL4, G0RL87, G0RLL0, G0RLR3, G0RME5, G0RQJ5, G0RRK3, G0RSK7, G0RWT9, 및 G0RX82, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, 및 G0RMI3, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, G0RMI3, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0RFT3, G0RG60, G0RGD5, G0RI29, G0RIJ9, G0RKH7, G0RKL4, G0RL87, G0RLL0, G0RLR3, G0RME5, G0RQJ5, G0RRK3, G0RSK7, G0RWT9, 및 G0RX82, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, UniProt 서열# G0R6T6, G0R6X2, G0R8N5, G0R9D1, G0R9X3, G0RBJ0, G0RBM4, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RHJ4, G0RIU1, G0RJY0, G0RR42, G0RV93, G0RRQ4, G0RX90, 및 G0RW77, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 미조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RIU1 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RHJ4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RR42, G0RQJ5, G0RQD1, G0REZ4, G0RSK7, G0RV93, G0R9D1, G0R6T6, G0RLL0, G0RGD5, G0RFR3, G0RHQ7, G0RG60, G0R810, G0RL87, G0RIJ9, G0RME5, G0RRQ4, G0RX82, G0RGQ0, G0RLR3, G0RLH4, G0RFT3, G0RWY5, G0R9F9, G0RVD2, G0R8A6, G0R9X3, G0RBM4, G0RHJ4, G0REM9, G0RIU1, G0RX90, G0R8N5, G0R6X2, G0RK83, G0RKH7, G0RI29, G0RKI9, G0RJ76, G0RBJ0, G0RJY0, G0RMI3, G0RW77, G0RRK3, 및 G0RLB0, 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제4 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제4 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제4 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른, 조절된 FFA 방출 효소 활성은, UniProt 서열# G0RH85, G0RGQ0, G0RLH4, 및 G0RMI3, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RT83, G0RRR1, G0RIF9, G0R765, G0RRJ7, G0R932, G0RBV8, G0REE8, G0RLF0, 및 G0RBH2, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 전사 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자의 조절된 생성 및 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 전사 인자의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
조절된 FFA 방출 효소 활성을 포함한 재조합 숙주 세포
상기 중 어느 하나에 따른 방법은, i) 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 수득하되 상기 재조합 숙주 세포는 상응하는 재조합 숙주 세포에 포함된 FFA 방출 효소 활성에 비교하면 조절된 FFA 방출 효소 활성을 포함하는 단계(즉, "상응하는 재조합 숙주 세포"의 FFA 방출 효소 활성이 조절되지 않는 점을 제외하고, "상응하는 재조합 숙주 세포"와 비교되는 재조합 숙주 세포와 동일한 재조합 숙주 세포); 및 ii) 재조합 숙주 세포를 재조합 성분의 생성 및/또는 분비에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
따라서, 다양한 양태에서, 재조합 성분(즉, 본원에 제공되어 작제된 발현을 포함함)을 생성할 수 있고 상응하는 재조합 숙주 세포에 포함된 FFA 방출 효소 활성외 비교하면 조절된 FFA 방출 효소 활성(예, 본원에 개시된 임의의 FFA 방출 효소의 활성 또는 본원에 개시된 둘 이상의 FFA 방출 효소의 임의의 조합의 활성)을 포함하는, 재조합 숙주 세포가 본원에 제공된다.
재조합 숙주 세포에 포함된 FFA 방출 효소 활성은 임의의 수단에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FFA 방출 효소 활성은, FFA 방출 효소의 발현(즉, 활성 단백질의 생성)을 조절하거나 본질적으로 제거하거나, FFA 방출 효소의 활성을 조절하거나 본질적으로 제거하는, 재조합 숙주 세포에서의 유전적 변형에 의해 조절될 수 있다. 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에 포함될 수 있는 유전적 변형의 비제한적인 예시는 다음을 포함한다: i) 내인성 FFA 방출 효소 또는 이의 기능적 부분(예, 촉매 도메인)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 유전적 변형(상기 유전적 변형은 상기 내인성 FFA 방출 효소의 활성을 조절하거나 필수적으로 제거함); ii) 이종 FFA 방출 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 유전자 변형(상기 유전자 변형은 이종 FFA 방출 효소의 활성을 조절하거나 본질적으로 제거함); iii) FFA 방출 효소의 발현을 유도하는 조절 요소 또는 이의 기능적 부분(즉, 조절 요소의 기능에 충분한 부분)에서의 유전적 변형(상기 유전자 변형은 FFA 방출 효소의 발현을 조절하거나 본질적으로 제거함); iv) FFA 방출 효소(예, 전사 인자[예, 표 3에 나타낸 전사 인자 중 어느 하나, 및 이의 상동체], FFA 방출 효소의 활성 형태 생성을 위해 요구되는 번역후 변형 효소)의 발현을 위해, 또는 FFA 방출 효소(예, 억제제, 활성화제, 코엔자임)나 그의 기능적 부분(예, 전사 인자의 DNA 결합 도메인, 번역후 변형 효소의 촉매 도메인)의 활성을 위해 요구되는 단백질을 암호화하는 코딩 서열의 유전자 변형(상기 유전자 변형은 FFA 방출 효소의 발현 또는 활성에 필요한 단백질의 활성을 조절하거나 필수적으로 제거함으로써 FFA 방출 효소의 발현을 조절하거나 필수적으로 제거함); v) FFA 방출 효소의 발현 또는 활성에 필요한 단백질의 발현을 유도하는 조절 요소 또는 이의 기능적 부분의 유전적 변형(상기 유전자 변형은 FFA 방출 효소의 발현 또는 활성에 필요한 단백질의 발현을 조절하거나 필수적으로 제거함으로써 FFA 방출 효소의 발현을 조절하거나 필수적으로 제거함); 및/또는 vi) FFA 방출 효소(예, 전사 인자[예, 표 3에 나타낸 전사 인자 중 어느 하나, 및 이의 상동체], FFA 방출 효소의 활성 형태 생성을 위해 요구되는 번역후 변형 효소)의 발현, 또는 FFA 방출 효소(예, 억제제, 활성화제, 코엔자임)의 활성을 조절하는 이종 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 유전자 변형(상기 유전자 변형은 상기 이종 단백질의 생성을 제공하고, 이에 의해 상기 FFA 방출 효소의 활성을 조절하거나 필수적으로 제거함).
예시적인 전사 인자(UniProt 서열 ID)
G0RX49 G0RRJ7 A2R2J1 G2Q2Z5
G0RHG1 G0R932 A2R903 G2Q8I6
G0RBV8 G0REE8 G0RLF0 G0RBH2
G0RT83 G0RIF9 G0RRR1 G0R765
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는 임의의 야생형 단세포 유기체로부터 유래될 수 있으며, 이는 임의의 박테리아, 효모, 사상균, 고세균, 단세포 원생 생물, 단세포 동물, 단세포 식물, 단세포 조류, 원생동물 및 색조류계를 포함할 수 있고, 유전자 변이체(예, 돌연변이)로부터 유래될 수 있을 뿐만 아니라, 안전한 (GRAS) 산업 숙주 세포로서 일반적으로 인식되는 임의의 야생형 단세포로부터 유래될 수 있다.
적절한 박테리아의 비제한적인 예시는 피르미큐테스, 시아노박테리아(청록색 조류), 오실리오피데아, 바실레아, 락토바실레, 오실리알레아, 바실라세아, 락토바실라세아, 및 하기 속 중 어느 하나의 구성원, 및 이의 유도체 및 교배를 포함한다: 아시네토박터, 아세토박터(예, 아세토박터 서브옥시단, 아세토박터 자일리눔), 악티노플레인(예, 악티노플레인 미스우리엔시스), 아트로우스피나(예, 스피루리나 원료, 스피루리나 맥시마), 간균(예, 바실루스 세레우스, 바실러스 코아글란스, 간균 태선모양, 바실루스 스테아로모필루스, 바실루스 서브틸리스), 대장균(예, 대장균), 락토바실러스(예, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 불가리쿠스), 락토코쿠스(예, 락토코쿠스 락티스, 락토코쿠스 락티스 란스필드 그룹 N, 락토바실러스 레테리), 류코노스톡(예, 류코노스톡 시트로보룸, 류코노스톡 덱스트라니쿰, 류코노스톡 장간막), 마이크로코쿠스(예, 마이크로코쿠스 리소데이크티쿠스), 로도코쿠스(예, 로도코쿠스 오파쿠스, 로도코쿠스 오파쿠스 균주 PD630), 스피룰리나, 스트렙토코쿠스(예, 스트렙토코쿠스 크레모리스, 스트렙토코쿠스 락티스, 스트렙토코쿠스 락티스 아종 디아세틸락티스, 스트렙토코쿠스 써모필루스), 스트렙토미세스(예, 스트렙토미세스 채트타노게네시스, 스트렙토미세스 그리세우스, 산전연쇄근, 스트렙토미세스 올리바세우스, 스트렙토미세스 올리보크로모게네스, 스트렙토미세스 루비지노수스), 테트라히메나(예, 테트라히메나 써모필, 테트라히메나 헤게위스키, 테트라히메나 항신경절, 테트라히메나 말라센시스, 색소성 테트라히메나, 테트라히메나 피리폼, 테트라히메나 보락스), 및 잔토모나스(예, 잔토모나스 캄페스트리스).
적절한 효모의 비제한적인 예시는 하기 유전자 중 어느 하나의 구성원, 및 이의 유도체 및 교배를 포함한다: 칸디다(예, 칸디다 알비칸스, 칸디다 에첼시, 칸디다 길레르몬디, 칸디다 휴밀리스, 칸디다 리포리티카, 칸디다 오르토프실로시스, 칸디다 팔미오필라, 칸디다 수도트로피칼리스, 칸디다 종, 칸디다 유틸리스, 칸디다 베르사틸리스), 클라도스포륨, 크립토코쿠스(예, 크립토코쿠스 테리콜루스, 크립토코쿠스 커바투스), 데바리오미세스(예, 데바리오미세스 한세니), 엔도미세스(예, 엔도미세스 베르날리스), 엔도미콥시스(예, 엔도미콥시스 베르날리스), 에레모테시움(예, 에레모테시움 애쉬비이), 한센울라(예, 한세눌라 종, 한세눌라 폴리모르파), 클루이베로미세스(예, 클루이베로미세스 종, 클루이베로미세스 라티스, 클루이베로미세스 마르시아누스 변종 락티스, 클루이베로미세스 마르시아누스, 클루이베로미세스 써모톨레란스), 리포미세스(예, 리포미세스 스타키, 리포미엑스 리포퍼), 오가타에아(예, 미누타 오가테에아), 피키아(예, 피키아 종, 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카, 피키아 틀레할로필라, 피키아 코클라마에, 피키아 멤브라네파시엔, 피키아 미누타 피키아, 피키아 린드네리, 피키아 오푸니에, 피키아 터모톨레란, 피키아 살릭타리아, 피키아 구에르쿰, 피키아 피페리, 피키아 스팁티스, 피키아 메탄올리카), 로도스포리듐(예, 로도스포리듐 토루로이드), 로도토룰라(예, 로도토룰라 종, 로도토룰라 그라실리스, 로도토룰라 글루티니스, 로도토룰라 그라피니스), 사카로미세스(예, 사카로미세스 종, 사카로미세스 바야뉴스, 사카로미세스 베티쿠스, 사카로미세스 세레비시아에, 사카로미세스 체발리에리, 사카로미세스 다이아티쿠스, 사카로미세스 엘립소이더스, 엑시구우스 사카로미세스, 사카로미세스 플로렌티누스, 사카로미세스 프라질리스, 사카로미세스 파스토리아누스, 사카로미세스 폼베, 사카로미세스 사케, 사카로미세스 우바룸), 스포로볼로미세스(예, 스포로볼로미세스 로제우스), 스포리디오볼루스(예, 스포리디오볼루스 존슨소니, 스포리디오볼루스 살모니컬러), 트리코스포론(예, 트리코스포론 카카올리포시밀리스, 트리코스포론 올레아지노수스 종 nov., 트리코스포론 카카오리포시밀리스 종 nov., 트리코스포론 그라실레, 트리코스포론 달시텀, 트리코스포론 지로베시, 트리코스포론 인섹토럼), 잔토필로미세스(예, 잔토필로미세스 덴드로로우스), 예로위아(예, 예로위아 리포리티아), 및 지고사카로미세스(예, 지고사카로미세스 룩시).
적절한 사상균류의 비제한적인 예시는 사상균류의 홀로모픽, 텔레모픽 및 아나모픽 형태를 포함하고, 다음 속 중 어느 하나의 구성원, 및 이의 유도체 및 교배를 포함한다: 아크레모늄(예, 아크레모늄 알라바멘세), 아스페르길루스(예, 아스페르길루스 아큘레투스, 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 클라바투스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 포에티두스, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 자포니쿠스, 아스페르길루스 니둘란, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 니게르 변종 아와모리, 아스페르길루스 오크라세우스, 아스페르길루스 오리제, 아스페르길루스 소재, 아스페르길루스 테레우스뿐만 아니라 에메리셀라, 네오사르토리아, 및 페트로미세스 종), 오레오바시듐, 카나리오미세스, 채토미움, 채토미듐, 코리나스쿠스, 크리소스포륨(예, 크리소스포륨 보트리오이드, 크리소스포륨 카르미하엘리, 크리소스포륨 크라시투니카툼, 크리소스포륨 유로페, 크리소스포륨 에볼세아뉴이, 크리소스포륨 파리니콜라, 크리소스포륨 패스티디움, 크리소스포륨 필리로름, 크리소스포륨 지오르기아, 크리소스포륨 글로비페룸, 크리소스포륨 글로비페름 변종 아티쿨라툼, 크리소스포륨 글로비페름 변종 니베움, 크리소스포륨 히룬도, 크리소스포륨 히스패니쿰, 크리소스포륨 홀미, 크리소스포륨 인디쿰, 크리소스포륨 이오프스, 크리소스포륨 케라티노필룸, 크리소스포륨 리그노룸, 크리소스포륨 오바툼, 크리소스포륨 루크노웬스 Garg 27K, 크리소스포륨 미디움, 크리소스포륨 미디움 변종 스파이세센스, 크리소스포륨 메피티쿰, 크리소스포륨 메르다리움, 크리소스포륨 메리다리움 변종 로제움, 크리소스포륨 마이너, 크리소스포륨 패니콜라, 크리소스포륨 파르븀, 크리소스포륨 파르븀 변종 크레센스, 크리소스포륨 필로썸, 크리소스포륨 수도메르다리움, 크리소스포륨 피리포르미스, 크리소스포륨 퀸스랜디쿰, 크리소스포륨 시슬레리, 크리소스포륨 설푸레움, 크리소스포륨 싱크로눔, 크리소스포륨 트로피쿰, 크리소스포륨 언듈라툼, 크리소스포륨 발레라렌스, 크리소스포륨 베스페르틸룸, 크리소스포륨 조나텀) 쿠네메리아, 쿠닝가멜라(예, 쿠닝가멜라 이히눌레이트), 닥틸로미세스, 에메리셀라, 필리바시둠, 푸사리움(예, 푸사리움 모니리포르미, 푸사리움 베네나툼, 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 그라미네아룸, 푸사리움 베르티콜리오이드, 푸사리움 쿨모룸, 푸사리움 크록웰렌시스, 푸사리움 포에, 푸사리움 스포르토트리히오이드, 푸사리움 삼푸키눔, 푸사리움 토룰로솜뿐만 아니라 관련된 기브렐라 텔레모픽 형태), 기브렐라, 휴미콜라, 하이포크레아, 렌티눌라, 말브란키아(예, 말브란키아 필라멘토사, 마그나포트, 말브란키움, 멜라노카푸스, 모르티에렐라(예, 모르티에렐라 알피나 1S-4, 모르티에렐라 이사벨린, 모르티에렐라 비나세, 모르티에렐라 비나세 변종 라피노세우틸리제르),무코(예, 무코 미에헤이 쿠니에 에머슨(리조무코미에헤이 쿠니 & R. 에머슨)) 쉬퍼, 무코푸실러스 린트, 무코서시넬로이드 무코 무세도), 미셀리오프토라(예, 미셀리오프토라 써모필라), 미로테슘, 네오칼리마스틱스, 뉴로스포라(예, 뉴로스포라 크라사), 페실로미세스, 페니실륨(예, 페니실륨 크리소게눔, 페니실륨 일라시눔, 페니실륨 로케포르티), 페네로카에테, 플레비아, 피로미세스, 피티움, 리조푸스(예, 리조푸스 니베우스), 시조필룸, 스키탈리듐, 스포로트리슘(예, 스포로트리슘 셀로필룸), 스테레움, 탈라로미세스, 테르모아스쿠스, 테르모미세스, 티에라비아(예, 티에라비아 테레스트리스), 톨리포클라듐, 및 트리코데르마(예, 트리코데르마 하르지아눔, 트리코데르마 코닝지, 트리코데르마 롱이브라키아툼, 트리코데르마 리세이, 트리코데르마 아트로비리데, 트리코데르마 비렌스, 트리코데르마 시트리노비리데, 트리코데르마 비리데).
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: FFA 방출 효소 또는 두 개 이상의 FFA 방출 효소의 조합의 조절된 활성을 포함한 재조합 트리고데르마 리세이 숙주 세포(즉, 트리코데르마 리세이 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포), FFA 방출 효소 또는 두 개 이상의 FFA 방출 효소의 조합의 조절된 활성을 포함한 재조합 아스페르길루스 니게르 숙주 세포(즉, 아스페르길루스 니게르 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포), FFA 방출 효소 또는 두 개 이상의 FFA 방출 효소의 조합의 조절된 활성을 포함한 재조합 트리코데르마 시트리노비리데 숙주 세포(즉, 트리코데르마 시트리노비리데 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포), 및 FFA 방출 효소 또는 두 개 이상의 FFA 방출 효소의 조합의 조절된 활성을 포함한 재조합 마이셀리오포라 테르모필라 숙주 세포(즉, 마이셀리오포라 테르모필라 균주로부터 유래된 재조합 숙주 세포).
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85, G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, G0RVD2, 및 G0R8A6, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열#, G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 및 G0RKH7, 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열#, G0RH85, G0RGQ0, G0RLH4, 및 G0RMI3, 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열#, G0RH85 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열#, G0RGQ0 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열#, G0RLH4 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열#, G0RMI3 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, R0RVD2, 및 G0R8A6, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RH85, G0RMI3, G0RLH4, G0RIU1, G0RBM4, G0R9D1, G0RFR3, G0RG60, G0R6T6, G0R8N5, G0RBJ0, G0RRQ4, G0REZ4, G0RIJ9, G0R6X2, G0RJY0, G0RR42, G0RW77, G0RQJ5, G0RFT3, G0R810, G0RI29, G0RL87, G0RLL0, G0RGD5, 및 G0RKH7, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, G0RMI3, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0RFT3, G0RG60, G0RGD5, G0RI29, G0RIJ9, G0RKH7, G0RKL4, G0RL87, G0RLL0, G0RLR3, G0RME5, G0RQJ5, G0RRK3, G0RSK7, G0RWT9, 및 G0RX82, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, 및 G0RMI3, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, G0RMI3, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0RFT3, G0RG60, G0RGD5, G0RI29, G0RIJ9, G0RKH7, G0RKL4, G0RL87, G0RLL0, G0RLR3, G0RME5, G0RQJ5, G0RRK3, G0RSK7, G0RWT9, 및 G0RX82, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, UniProt 서열# G0R6T6, G0R6X2, G0R8N5, G0R9D1, G0R9X3, G0RBJ0, G0RBM4, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RHJ4, G0RIU1, G0RJY0, G0RR42, G0RV93, G0RRQ4, G0RX90, 및 G0RW77, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 미조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RIU1 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RHJ4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RR42, G0RQJ5, G0RQD1, G0REZ4, G0RSK7, G0RV93, G0R9D1, G0R6T6, G0RLL0, G0RGD5, G0RFR3, G0RHQ7, G0RG60, G0R810, G0RL87, G0RIJ9, G0RME5, G0RRQ4, G0RX82, G0RGQ0, G0RLR3, G0RLH4, G0RFT3, G0RWY5, G0R9F9, G0RVD2, G0R8A6, G0R9X3, G0RBM4, G0RHJ4, G0REM9, G0RIU1, G0RX90, G0R8N5, G0R6X2, G0RK83, G0RKH7, G0RI29, G0RKI9, G0RJ76, G0RBJ0, G0RJY0, G0RMI3, G0RW77, G0RRK3, 및 G0RLB0, 및 이의 상동체, 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제4 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성을 포함하거나 이로 이루어질 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제4 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제4 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85, G0RGQ0, G0RLH4, 및 G0RMI3, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RT83, G0RRR1, G0RIF9, G0R765, G0RRJ7, G0R932, G0RBV8, G0REE8, G0RLF0, 및 G0RBH2, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 전사 인자로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 전사 인자의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RGQ0 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RMI3 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성; 및 UniProt 서열# G0RLH4 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, 제1 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제2 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이고, 제3 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 조절된 생성 및/또는 활성의 감소이다.
재조합 숙주 세포를 수득하는 방법
다양한 양태에서, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포를 수득하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 다음 중 어느 순서로 임의의 조합을 포함한다: i) 하기 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 하기 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물, 또는 하기 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터를 수득하는 단계; ii) 폴리뉴클레오티드, 발현 작제물, 또는 재조합 벡터를 숙주 세포(예, 본원에 개시된 임의의 숙주 세포)를 도입하여 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; iii) 숙주 세포(예, 본원에 개시된 임의의 숙주 세포)를 FFA 방출 효소(예, 본원에 개시된 FFA 방출 효소 중 어느 하나 또는 본원에 개시된 두 개 이상의 FFA 방출 효소의 조합)의 생성 및/또는 활성을 조절하거나 본질적으로 제거하기 위해 유전적으로 변형시켜 변형 또는 본질적으로 제거된 FFA 방출 효소 활성을 포함한 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; iv) 폴리뉴클레오티드, 발현 작제물, 또는 재조합 벡터를, 변형되거나 본질적으로 제거된 FFA 방출 효소 활성을 포함한 재조합 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및/또는 v) FFA 방출 효소(예, 본원에 개시된 FFA 방출 효소 중 어느 하나 또는 본원에 개시된 두개 이상의 FFA 방출 효소의 임의의 조합)의 생성 및/또는 활성을 조절하거나 본질적으로 제거하기 위해 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포를 유전적으로 변형시키는 단계.
폴리뉴클레오티드
폴리뉴클레오티드, 발현 작제물, 및/또는 재조합 벡터는, 직접적인 화학적 합성 및 클로닝을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 수득될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 다음을 포함할 수 있다: i) 선택적인 분비 신호 서열(즉, 펩티드에 부착된 초기 단백질을 상기 초기 단백질이 합성되는 세포의 외부로 전달하도록 매개하는 펩티드를 암호화하는 서열; 예, 본원에 개시된 분비 신호 중 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), 및 ii) 재조합 단백질 코딩 서열(즉, 태그 폴리펩티드(예, 본원에 개시된 태그 폴리펩티드 중 어느 하나)를 선택적으로 포함한 재조합 단백질(예, 본원에 제공된 재조합 단백질 중 어느 하나)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열), 여기서 a) 상기 선택적인 분비 신호 서열은 재조합 단백질 코딩 서열에 센스 배향으로 작동 가능하게 연결된다(즉, 상기 선택적 분비 신호 서열 및 상기 재조합 단백질 코딩 서열은, 전사 및 번역이 상기 선택적 분비 신호를 포함한 재조합 단백질을 생성하도록, 위치함).
분비 신호 서열
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물은, 하기 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서 활성인 임의의 분비 신호 서열을 선택적으로 포함할 수 있다.
선택적 분비 신호 서열은, 초기 재조합 단백질의, 번역 후(즉, 초기 재조합 단백질이 ER로의 번역 전에 세포 세포질에 존재하도록 단백질 합성이 전좌에 선행함) 또는 동시 번역(즉, 단백질 합성 및 ER로의 전좌가 동시에 발생함)으로, ER로의 전좌를 매개하는 분비 신호를 암호화할 수 있다.
적절한 분비 신호 서열의 비제한적인 예시는 박테리아 숙주 세포에서 기능적인 분비 신호 서열을 포함하며, 상기 분비 신호 서열은 다음 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 유전자의 분비 신호 서열을 포함한다: PelB, OmpA, Bla, PhoA, PhoS, MalE, LivK, LivJ, MglB, AraF, AmpC, RbsB, MerP, CpdB, Lpp, LamB, OmpC, PhoE, OmpF, TolC, BtuB, 및 LutA, 및 이들의 기능적 부분 및 조합.
적절한 분비 신호 서열의 비제한적인 예시는 진균 숙주 세포에서 기능적인 분비 신호 서열을 포함하며, 상기 분비 신호 서열은 다음 단백질 중 어느 하나를 암호화하는 유전자의 분비 신호 서열을 포함한다: CBH1, CBH2, EGL1, EGL2, XYN1, XYN2, BXL1, HFB1, HFB2, GLAA, AMYA, AMYA, AMYC, AAMA, 알파 교배 인자, SUC2, PHO5, INV, AMY, LIP, PIR, OST1, 및 β-글루코시다아제, 및 이들의 기능적 부분 및 조합.
재조합 단백질 코딩 서열
재조합 단백질 코딩 서열은 임의의 재조합 단백질을 암호화할 수 있다.
재조합 단백질의 비제한적인 예시는 우유 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "우유 단백질"은 유청 단백질 또는 카제인을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "카제인"은 적어도 20(예, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150)의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 지칭하고, 상기 아미노산은, 포유동물이 생성한 우유에서 발견된 천연 카제인(예, 포유동물이 생성한 우유에 고유한 카제인; 예, 천연 카제인)의 아미노산 서열과 적어도 40%(예, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%) 동일하다. 카제인의 비제한적인 예는 β-카제인, k-카제인, α-S1-카제인, 및 α-S2-카제인을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "β-카제인", " k-카제인", "α-S1-카제인", 및 "α-S2-카제인"은 적어도 20(예, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150)인 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 지칭하고, 상기 아미노산은, 포유동물이 생성한 우유에서 천연으로 발견된 각각의 β-카제인, k-카제인, α-S1-카제인, 및 α-S2-카제인(예, 보스 타우루스 β-카제인(예, 각각 보스 타우루스 β-카제인(UniProt 서열 P02666의 아미노산 16 내지 224), 보스 타우루스 k-카제인(UniProt 서열 P02668의 아미노산 22 내지 190), 보스 타우루스 α-S1-카제인(UniProt 서열 P02662의 아미노산 16 내지 214), 및 보스 타우루스 α-S2-카제인(UniProt 서열 P02663의 아미노산 16 내지 222))의 아미노산 서열과 적어도 40%(예, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%) 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 "유청 단백질"은 적어도 20(예, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150)의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 지칭하고, 상기 아미노산은, 포유동물이 생성한 우유에서 발견된 천연 유청 단백질(예, 포유동물이 생성한 우유에 고유한 유청 단백질; 예, 천연 유청 단백질)의 아미노산 서열과 적어도 40%(예, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%) 동일하다. 유청 단백질의 비제한적인 예시는 α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토트랜스페린, 락토페리신, 혈청 알부민 단백질, 락토페록시다제 단백질, 및 글리코마크로펩티드를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "α-락트알부민", "β-락토글로불린", "락토트랜스페린", "락토페리신", "혈청 알부민", "락토퍼옥시다아제", 및 "글리코마크로펩티드"는 적어도 20(예, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 70, 적어도 80, 적어도 90, 적어도 100, 적어도 150)의 아미노산 서열 을 포함한 폴리펩티드를 지칭하고, 상기 아미노산은, 포유동물이 생성한 우유에서 천연으로 발견된 각각의 α-락트알부민, β-락토글로불린, 락토트랜스페린, 락토페리신, 혈청 알부민, 락토페록시다아제, 및 글리코매크로펩티드(GMP)(예, 각각 보스 타우루스 α-락트알부민(UniProt 서열 P00711의 아미노산 20-142), 보스 타우루스 β-락토글로불린(UniProt 서열 P02754의 아미노산 17-178), 보스 타우루스 락토트랜스페린(UniProt 서열 P24627의 아미노산 20 내지 708), 보스 타우루스 락토페리신(UniProt 서열 P24627의 아미노산 36 내지 60), 보스 타우루스 혈청 알부민(UniProt 서열 P02769의 아미노산 25 내지 607), 보스 타우루스 락토페록다아제(UniProt 서열 P80025의 아미노산 101 내지 712), 및 보스 타우루스 글리코매크로펩티드(GMP; UniProt 서열 P02668의 아미노산 127 내지 190))의 아미노산 서열과 적어도 40%(예, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 100%) 동일하다.
우유 단백질은 임의의 포유류 종에서 발견되는 천연 우유 단백질의 아미노산 서열과 동일하거나 이의 상동체인 아미노산 서열을 가질 수 있고, 상기 포유류 종은 젖소, 인간, 양, 무플론, 염소, 버팔로, 낙타, 말, 당나귀 알파카, 야크, 라마, 레무르, 판다, 기니피그, 다람쥐, 곰, 마카크, 고릴라, 침팬지, 산 염소, 원숭이, 유인원, 고양이, 개, 왈라비, 랫트, 마우스, 코끼리, 주머니, 토끼, 고래, 개코원숭이, 지브본, 오랑우탄, 맨드릴, 돼지, 늑대, 여우, 사자, 호랑이, 및 바늘두더지를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
재조합 발현 작제물
재조합 발현 작제물은 다음을 포함할 수 있다: i) 프로모터 서열(예, 본원에 개시된 프로모터 중 어느 하나에 대한 폴리뉴클레오티드 서열), ii) 상기 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 및 iii) 종결 서열(예, 본원에 개시된 종결자 중 어느 하나에 대한 폴리뉴클레오티드 서열); 여기서, a) 상기 프로모터 서열은 상기 선택적 분비 신호 서열 및 상기 폴리뉴클레오티드의 재조합 단배질 코딩 서열에 센스 배향으로 작동 가능하게 연결되고(즉, 상기 프로모터 서열 및 상기 선택적인 분비 신호 서열 및 상기 다핵체의 재조합 단백질 코딩 서열은, 상기 프로모터 서열이 상기 선택적인 분비 신호 서열 및 상기 재조합 단백질 코딩 서열의 전사를 매개하거나 조절하는 데 효과적이도록 위치함), b) 상기 하나 이상의 종결자 서열은 재조합 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다(즉, 상기 재조합 단백질 코딩 서열 및 상기 하나 이상의 종결자 서열은, 상기 하나 이상의 종결자 서열이 상기 재조합 단백질 코딩 서열의 전사를 종결하는데 효과적이도록 위치함).
재조합 발현 작제물은, 친화도 정제 태그를 암호화하는, 작동가능하게 연결된 서열을 추가로 포함할 수 있어서, 발현된 재조합 단백질은 친화도 정제용 펩티드 서열을 포함한다. 이러한 친화도 정제 태그는, 발현될 경우에 친화도 정제 태그가 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 존재하거나 이를 향해 존재하도록, 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 친화도 정제 태그는 말토오스 결합 단백질(MBP) 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST) 태그, 폴리(His) 태그, 헥사(His) 태그, FLAG-태그, V5-태그, VSV-태그, E-태그, NE-태그, 헤마글루티닌(Ha)-태그, 및 Myc-태그일 수 있다.
재조합 발현 작제물은 상동성(즉, 표적화된 통합) 또는 비상동성 재조합에 의한 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 위한 서열을 추가로 포함할 수 있다. 재조합 발현 작제물은, 재조합 발현 작제물의 상동성 재조합 확률을 향상시키기 위해 숙주 세포의 게놈 내 표적 서열과 충분한 동일성을 갖는, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 250개, 적어도 500개, 적어도 750개, 적어도 1,000개, 또는 적어도 10,000개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 이러한 상동성 서열은 비-코딩 또는 코딩일 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물에 포함된 선택적 분비 신호 서열 및/또는 재조합 단백질 코딩 서열은, 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물은 재조합 발현 작제물의 단편이 숙주 세포의 게놈(예, 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포의 게놈)에 통합시, 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드는, 내인성 유전자좌의 하나 이상의 조절 요소가 재조합 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되도록 숙주 세포의 게놈 내에 안정적으로 통합될 수 있고, 이에 의해 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물을 생성할 수 있다.
프로모터 서열
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물은, 하기 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서 활성인 임의의 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
프로모터 서열은 구성적 프로모터 서열(즉, 대부분의 환경 및 발달 조건 하에서 활성인 프로모터 서열), 유도성 또는 억제성 프로모터 서열(즉, 특정 환경 또는 발달 조건 하에서만 활성인 프로모터 서열[예, 특정 요인의 존재 또는 부재시, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, 탄소(예, 포도당, 갈락토오스, 락토오스, 수크로오스, 셀룰로오스, 소포로오스, 겐티오비오스, 소르보오스, 상기 셀룰라아제 프로모터를 유도하는 이당류, 전분, 트립토판, 티아민, 메탄올), 인산염, 질소, 또는 다른 영양소; 온도; pH; 삼투압농도; 중금속 또는 중금속 이온; 억제제; 응력; 이화대사물; 및 이들의 조합을 참조)일 수 있다.
프로모터 서열은 단일 프로모터 서열, 또는 두 개 이상의 프로모터 서열(예, 서열로 배열된 두 개 이상의 프로모터 또는 이의 기능적 부분의 조합, 유도성 및 구성적 프로모터의 조합)로 이루어질 수 있다. 두 개 이상의 프로모터 서열은 동일할 수 있거나, 두 개 이상의 프로모터 서열 중 적어도 두 개는 동일할 수 없다.
프로모터 서열은 양방향 프로모터 서열(즉, 예를 들어 두 개의 동일하거나 상이한 프로모터를 반대 방향으로 융합함으로써 생성된 전사 인자를 동원함으로써 두 배향으로 전사를 개시하는 폴리뉴클레오티드)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
적절한 프로모터 서열의 비제한적인 예시는 박테리아 숙주 세포에서 기능적인 프로모터 서열을 포함하고, T7 프로모터, T5 프로모터, Tac 프로모터, pL/pR 프로모터, phoA 프로모터, lacUV5 프로모터, trc 프로모터, trp 프로모터, cstA 프로모터, xylA 프로모터, manP 프로모터, malA 프로모터, lacA 프로모터, aprE 프로모터, ΔaprE 프로모터, srfA 프로모터, p43 프로모터, ylbA 프로모터, σB 프로모터, veg 프로모터, PG1 프로모터, PG6 프로모터, λPL 프로모터, λPR 프로모터, 및 스파 프로모터, 및 기능적 부분 및 이들의 조합을 포함한다.
적절한 프로모터 서열의 비제한적인 예시는 진균 숙주 세포에서 기능적인 프로모터 서열을 포함하고, xlnA 프로모터, xyn1 프로모터, xyn2 프로모터, xyn3 프로모터, xyn4 프로모터, bxl1 프로모터, cbh1 프로모터, cbh2 프로모터, egl1 프로모터, egl2 프로모터, egl3 프로모터, egl4 프로모터, egl5 프로모터, glaA 프로모터, agdA 프로모터, gpdA 프로모터, gpd1 프로모터, AOX1 프로모터, GAP1 프로모터, MET3 프로모터, ENO1 프로모터, GPD1 프로모터, PDC1 프로모터, TEF1 프로모터, AXE1 프로모터, CIP1 프로모터, GH61 프로모터, PKI1 프로모터, RP2 프로모터, ADH1 프로모터, CUP1 프로모터, GAL1 프로모터, PGK1 프로모터, YPT1 프로모터, LAC4 프로모터, LAC4-PB1 프로모터, FLD1 프로모터, MOX 프로모터, DAS1 프로모터, DAS2 프로모터, GAP1 프로모터, STR3 프로모터, ADH3 프로모터, GUT2 프로모터, CYC1 프로모터, TDH3 프로모터, PGL1 프로모터, ADH2 프로모터, HXT7 프로모터, CLB1 프로모터, 및 PHO5 프로모터, 및 기능적 부분 및 이들의 조합을 포함한다.
종결 서열
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물은, 하기 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서 활성인 임의의 종결 서열을 포함할 수 있다.
적절한 종결 서열의 비제한적인 예시는 adh1, amaA, amdS, amyA, aox1, cbh1, cbh2, cyc2, egl1, egl2, gal1, gap1, glaA, gpd1, gpdA, pdc1, pgk1, tef1, tps1, trpC, xyn1, xyn2, xyn3, 및 xyn4 유전자의 종결 서열 및, 기능적 부분과 이들의 조합을 포함한다.
종결 서열은 단일 종결 서열, 또는 두 개 이상의 종결 서열로 이루어질 수 있으며, 여기서 두 개 이상의 종결 서열은 동일할 수 있거나, 두 개 이상의 종결 서열 중 적어도 두 개는 동일하지 않을 수 있다. 종결 서열은 양방향 종결 서열로 구성될 수 있다.　
추가 규제 요소
상기 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물은 추가 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.
조절 요소의 비제한적인 예시는, 프로모터 서열, 종결 서열, 전사 시작 서열, 번역 시작 서열, 번역 정지 서열, 인핸서 서열, 활성화제 서열, 응답 요소, 단백질 인식 부위, 유도 가능한 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 미번역 영역(예, 폴리아데닐화 신호를 포함한 3' 미번영 영역), 상류 활성화 서열(UAS), 인트론, 작동자(즉, 억제자 단백질이 결합하여 프로모터의 활성을 감소시키거나 제거할 수 있는 단백질 결합 도메인을 포함하는 프로모터에 인접한 핵산의 서열); 효율적인 RNA 처리 신호(예, 스플라이싱 신호, 폴리아데닐화 신호), 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 번역 효율을 향상시키는 서열(예, 리보솜 결합 부위[예, 샤인-달가노 서열]), 단백질 안정성을 향상시키는 서열, 단백질 분비를 향상시키는 서열, 및 이들의 조합을 포함한다.
재조합 벡터
재조합 벡터는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물을 포함할 수 있다.
재조합 벡터는, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 단일 재조합 발현 작제물, 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 두 개 이상의 재조합 발현 작제물을 포함할 수 있으며, 이들은 동일할 수 있거나 이들 중 적어도 두 개는 동일하지 않을 수 있다(예, 프로모터 서열, 분비 신호, 단백질 코딩 서열, 종결 서열, 및/또는 추가 조절 요소에서 서로 상이함). 재조합 벡터가 두 개 이상의 재조합 발현 작제물을 포함하는 구현예에서, 두 개 이상의 재조합 발현 작제물은 동일한 재조합 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 동일한 재조합 단백질을 암호화하는 두 개 이상의 재조합 발현 작제물은 프로모터 서열, 분비 신호 서열, 종결 서열, 및/또는 추가 조절 요소에서 서로 상이하다.
재조합 벡터는, 재조합 숙주 세포에서 재조합 벡터의 전파에 적합한 하나 이상의 다른 요소를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 다른 요소의 비제한적인 예시는 복제의 기원 및 선택 마커를 포함한다. 복제의 기원 및 선택 마커는 당업계에 공지되어 있고, 복제의 박테리아 및 진균 기원(예, AMA1, ANSI)을 포함한다. 선택 마커는 내성 유전자(즉, 숙주 세포가 외생적으로 부가된 화합물을 해독할 수 있게 하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드[예, 항생제 화합물]), 영양 요구성 마커(즉, 숙주 세포가 필수 성분(일반적으로 아미노산)을 합성하는 반면에 필수 성분이 결여된 배지에서 성장될 수 있게 하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드), 또는 컬러 마커(즉, 색상을 생성할 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자)일 수 있다. 적합한 선택 마커의 비제한적인 예시는 amdS(아세타미다아제), argB(오르니틴 카르바모일트랜스퍼라아제), 바(포스포이노트리신 아세틸트랜스퍼라아제), hph(히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제), 니아D(질산염 환원효소), pyrG(오로티딘 5'-포스페이트 데카르복실라아제), sC (황산염 아데닐트랜스퍼라아제), trpC(안트라닐레이트 합성효소), 및 ble(블레오마이신형 항생제 내성), 및 이의 유도체를 포함한다. 선택 마커는 선택적 마커의 생성을 감소시키는 변경을 포함할 수 있어서, 선택 하에서 재조합 벡터를 포함한 재조합 숙주 세포를 생존시키는 데 필요한 복제의 수를 증가시킬 수 있다. 선택은 또한, 공-형질 전환에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 형질전환은 두 개의 벡터의 혼합물로 수행되며, 하나의 벡터에 대해서만 선택된다.　
재조합 벡터는 상동성(즉, 표적화된 통합) 또는 비상동성 재조합에 의한 숙주 세포의 게놈 내로의 통합을 위한 서열을 추가로 포함할 수 있다. 재조합 발현 작제물은, 재조합 발현 작제물의 상동성 재조합 확률을 향상시키기 위해 숙주 세포의 게놈 내 표적 서열과 충분한 동일성을 갖는, 적어도 10개, 적어도 25개, 적어도 50개, 적어도 100개, 적어도 250개, 적어도 500개, 적어도 750개, 적어도 1,000개, 또는 적어도 10,000개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 이러한 상동성 서열은 비-코딩 또는 코딩일 수 있다.　
유전자 변형
유전자 변형은, 예를 들어 세포의 게놈에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 복제, 재배열 및/또는 결실로 이루어질 수 있다. 유전자 변형은, 예를 들어, 정지 코돈을 도입하거나, 시작 코돈을 제거하거나, 오픈 리딩 프레임의 프레임 이동을 삽입하거나, 또는 점 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 치환 돌연변이, 결실 돌연변이, 프레임 이동 돌연변이, 삽입 돌연변이, 중복 돌연변이, 증폭 돌연변이, 전위 돌연변이, 또는 역전 돌연변이를 생성시킬 수 있다.
숙주 세포를 유전자 변형시키는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 비제한적으로, 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝, 부위-지정 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 삽입 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발 (예를 들어, 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (MNNG), N-메틸-N'-니트로소구아니딘 (NTG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS), 중아황산나트륨, 포름산, 뉴클레오티드 유사체를 사용함), 조사 (예를 들어, 자외선 (UV) 조사), 코딩 또는 비-코딩 뉴클레오티드 서열의 결실, 상동 재조합, FLP/FRT 재조합, 유전자 파괴, CRISPR 유전자 편집, 및 유전자 전환을 포함한다. 이러한 방법은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 폴리 뉴클레오티드 서열은, 관심 단백질(예, FFA 방출 효소, FFA 방출 효소의 발현을 유도하고/유도하거나 활성을 조절하는 단백질)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 관심 단백질에 특이적인 RNAi 작제물을 암호화하거나, FFA 방출 효소의 이종 억제제 또는 활성화제를 암호화한다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서 FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성은, RNA 수준에서 그리고 가장 적합한 단백질 수준에서 수행되는 검정과 같이 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하거나, 분비 관련 단백질의 생성 또는 활성을 측정하는 기능적 생물검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정의 비제한적인 예시는, 노던 블롯팅, 도트 블롯팅(DNA 또는 RNA), RT-PCR(역전사효소 중합효소 연쇄 반응), 인시츄 혼성화, 서던 블롯팅, 효소 활성 검정, 면역학적 검정(예, 면역염색 염색, 면역분석법, 웨스턴 블롯팅, ELISA), 및 (예를 들어, 유리 시스테인 잔기를 포함하는 단백질의 생성을 측정하기 위한) 유리 티올 검정을 포함한다. 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서의 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성은, 동일한 방법에 의해 평가된 상응하는 재조합 숙주 세포(즉, 재조합 성분을 또한 생성할 수 있지만(즉, 동일한 발현 작제물을 포함함), FFA 방출 효소 활성을 조절하거나 필수적으로 제거하는 유전적 변형을 포함하지 않는 동일한 재조합 숙주 세포)의 것과 비교될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 재조합 발현 작제물, 또는 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계
폴리뉴클레오티드, 재조합 발현 작제물, 또는 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예시는 인산칼슘 형질감염, 덴드리머 형질감염, 리포솜 형질감염(예, 양이온성 리포솜 형질감염), 양이온성 중합체 형질감염, DEAE-덱스타란 형질감염, 세포 압착, 초음파 천공, 광학적 형질감염, 원형질체 융합, 원형질체 형질감염, 임질감염, 수력학적 전달, 유전자 총, 마그네토펙션, 바이러스 형질도입, 전기천공 및 화학적 형질전환(예, PEG를 사용함)을 포함한다.　
재조합 숙주 세포를 식별하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 폴리뉴클레오티드, 재조합 발현 작제물, 또는 세포의 성장을 위한 또는 세포의 성장에 대한 선택을 허용하는 재조합 벡터에 의해, 또는 다른 수단(예, 상기 폴리뉴클레오티드에 포함된 발광 펩티드의 검출, 재조합 발현 작제물, 또는 재조합 벡터, 개별 재조합 숙주 세포 콜로니의 분자 분석[예, 제한 효소 맵핑, PCR 증폭, 남부 분석, 또는 단리된 염색체 외 벡터 또는 염색체 통합 부위의 서열 분석에 의한 분석 참조)에 의해 암호화된 약물 내성 또는 영양요구성 마커의 발현에 대한 스크리닝을 포함한다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생성은, RNA 수준에서 그리고 가장 적합한 단백질 수준에서 수행되는 검정과 같이 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법을 사용하거나, 재조합 단백질의 생성 또는 활성을 측정하는 기능적 생물검정을 사용하여 평가될 수 있다. 이러한 검정의 비제한적인 예시는, 노던 블롯팅, 도트 블롯팅(DNA 또는 RNA), RT-PCR(역전사효소 중합효소 연쇄 반응), RNA-서열, 인시츄 혼성화, 서던 블롯팅, 효소 활성 검정, 면역학적 검정(예, 면역염색 염색, 면역분석법, 웨스턴 블롯팅, ELISA), 및 (예를 들어, 유리 시스테인 잔기를 포함하는 단백질의 생성을 측정하기 위한) 유리 티올 검정을 포함한다.
재조합 성분을 생성하는 방법
다양한 양태에서, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 성분을 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 재조합 성분의 생성에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 전술한 것 중 어느 하나의 재조합 숙주 세포를 발효시키는 단계를 포함한다.
상기 방법은, 재조합 성분을 발효 배지로부터 정제하여 상기 재조합 성분을 포함한 제제를 수득하는 단계; 및/또는 상기 재조합 성분을 후가공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
발효
재조합 성분을 생성하기에 적합한 조건은, 전형적으로 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포가 성장 및/또는 생존 가능하게 유지될 수 있고, 재조합 성분을 생성할 수 있는 조건 하에 있다.
적절한 조건의 비제한적인 예시는 적절한 배양 배지(예, 적절한 영양소 함량[예, 적절한 탄소 함량, 적절한 질소 함량, 적절한 인 함량], 적절한 보충 콘텐츠, 적절한 미량 금속 함량, 적절한 pH를 갖는 배양 배지), 적절한 온도, 적절한 이송속도, 적절한 압력, 적절한 수준의 산소화, 적절한 발효 기간(즉, 상기 재조합 숙주 세포를 포함하는 배양 배지의 부피), 적절한 발효 부피(즉, 상기 재조합 숙주 세포를 포함하는 배양 배지의 부피), 및 적절한 발효 용기를 포함한다.
적절한 배양 배지는, 재조합 숙주 세포가 성장 및/또는 생존 가능하게 유지될 수 있고 재조합 성분을 생성할 수 있는, 모든 배양 배지를 포함한다. 통상적으로, 배양 배지는 수성 배지이고, 이는 탄소 공급원, 동질화 가능한 질소 공급원(즉, 재조합 숙주 세포에 의한 대사 이용에 적합한 형태로 질소를 방출할 수 있는 질소 함유 화합물), 및 인산염 공급원을 포함한다.
탄소 공급원의 비제한적인 예시는 단당류, 이당류, 다당류, 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 글리세롤, 메탄, 및 그의 조합을 포함한다. 단당류의 비제한적인 예시는 덱스트로스(글루코스), 프룩토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 및 그의 조합을 포함한다. 이당류의 비제한적인 예시는 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 및 그의 조합을 포함한다. 다당류의 비제한적인 예시는 전분, 글리코겐, 셀룰로스, 아밀로스, 헤미셀룰로스, 말토덱스트린, 및 그의 조합을 포함한다.
동질성 질소 공급원의 비제한적인 예시는 무수 암모니아, 황산암모늄, 수산화암모늄, 질산암모늄, 디암모늄 포스페이트, 모노암모늄 포스페이트, 암모늄 파이로포스페이트, 염화암모늄, 질산나트륨, 우레아, 펩톤, 단백질 가수분해물, 콘 스티프 리큐어, 콘 스티프 고형분, 스펜트 그레인, 스펜트 그레인 추출물, 및 효모 추출물을 포함한다. 암모니아 가스의 사용은 대규모 작업에 편리하며, 적절한 양으로 수성 발효물(발효 배지)을 통해 버블링함으로써 사용될 수 있다. 동시에, 이러한 암모니아는 pH 조절을 돕기 위해 사용될 수도 있다.　
배양 배지는 무기 염, 미네랄(예, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 나트륨; 예, 적합한 가용성 동화성 이온 및 조합된 형태), 금속 또는 전이 금속(예, 구리, 망간, 몰리브덴, 아연, 철, 붕소, 요오드; 예, 적절한 가용성 동화성 형태), 비타민, 및 임의의 다른 영양소 또는 기능성 성분(예, 재조합 성분의 분해를 방지할 수 있는 프로테아제[예, 식물계 프로테아제], 상기 재조합 성분을 분해할 수 있는 프로테아제의 활성을 감소시킬 수 있는 프로테아제 억제제, 및/또는 프로테아제 활성, 소포제, 항균제, 계면활성제, 유화 오일을 사이펀할 수 있는 희생 단백질)을 추가로 포함할 수 있다.　
적절한 배양 배지가 상업적 공급업체에서 입수가능하거나, 또는 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션의 카탈로그의) 공개된 조성물에 따라 제조될 수 있다.
적절한 pH는 약 2 내지 약 8의 pH(예, 2 내지 8의 pH, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4, 3.5, 3, 또는 2.5; 2.5 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4, 3.5, 또는 3; 3 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4, 또는 3.5; 3.5 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 또는 4; 4 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 또는 4.5; 4.5 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 4.7, 또는 4.6; 4.6 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 4.8, 또는 4.7; 4.7 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 4.9, 또는 4.8; 4.8 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5, 또는 4.9; 4.9 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 또는 5; 5 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 또는 5.1; 5.1 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 5.3, 또는 5.2; 5.2 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 5.4, 또는 5.3; 5.3 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 5.5, 또는 5.4; 5.4 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 6, 또는 5.5; 5.5 내지 8, 7.5, 7, 6.5, 또는 6; 6 내지 8, 7.5, 7, 또는 6.5; 6.5 내지 8, 7.5, 또는 7; 7 내지 8, 또는 7.5; 또는 7.5 내지 8)일 수 있다.
적절한 온도는 약 20℃ 내지 약 46℃의 온도(예, 20℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 34℃, 32℃, 30℃, 28℃, 26℃, 24℃, 또는 22℃; 22℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 34℃, 32℃, 30℃, 28℃, 26℃, 또는 24℃; 24℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 34℃, 32℃, 30℃, 28℃, 또는 26℃; 26℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 34℃, 32℃, 30℃, 또는 28℃; 28℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 34℃, 32℃, 또는 30℃; 30℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 34℃, 또는 32℃; 32℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 38℃, 36℃, 또는 34℃; 36℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 40℃, 또는 38℃; 38℃ 내지 46℃, 44℃, 42℃, 또는 40℃; 40℃ 내지 46℃, 44℃, 또는 42℃, 42℃ 내지 46℃ 또는 44℃; 또는 44℃ 내지 46℃)일 수 있다.
적절한 공급 속도는 시간 당 건조 세포 중량(DCW) g 당 약 0.01 g 내지 약 0.2 g의 글루코스 당량의 공급 속도일 수 있다.
적절한 압력은 0 psig 내지 약 50 psig의 압력(예, 0 psig 내지 50 psig, 40 psig, 30 psig, 20 psig, 또는 10 psig; 10 psig 내지 50 psig, 40 psig, 30 psig; 또는 20 psig; 20 psig 내지 50 psig, 40 psig, 또는 30 psig; 30 psig 내지 50 psig, 또는 40 psig; 또는 40 psig 내지 50 psig)일 수 있다.
적절한 산소화는 분당 발효기 내 액체 부피당 산소 약 0.1 부피(vvm) 내지 약 2.1 vvm의 통기 속도 일 수 있다(예, 0.1 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 1.5 vvm, 1.3 vvm, 1.1 vvm, 0.9 vvm, 0.7 vvm, 0.5 vvm, 또는 0.3 vvm; 0.3 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 1.5 vvm, 1.3 vvm, 1.1 vvm, 0.9 vvm, 0.7 vvm, 또는 0.5 vvm; 0.5 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 1.5 vvm, 1.3 vvm, 1.1 vvm, 0.9 vvm, 또는 0.7 vvm; 0.7 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 1.5 vvm, 1.3 vvm, 1.1 vvm, 또는 0.9 vvm; 0.9 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 1.5 vvm, 1.3 vvm, 또는 1.1 vvm; 1.1 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 1.5 vvm, 또는 1.3 vvm; 1.3 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 1.7 vvm, 또는 1.5 vvm; 1.5 vvm 내지 2.1 vvm, 1.9 vvm, 또는 1.7 vvm; 1.7 vvm 내지 2.1 vvm 또는 1.9 vvm; 또는 1.9 vvm 내지 2.1 vvm).
적절한 발효 지속 시간은 약 10시간 내지 약 500시간의 발효 지속 시간(예, 10시간 내지 500시간, 400시간, 300시간, 200시간, 100시간, 50시간, 40시간, 30시간, 또는 20시간; 20시간 내지 500시간, 400시간, 300시간, 200시간, 100시간, 50시간, 40시간, 또는 30시간; 30시간 내지 500시간, 400시간, 300시간, 200시간, 100시간, 50시간, 또는 40시간; 40시간 내지 500시간, 400시간, 300시간, 200시간, 100시간, 또는 50시간; 50시간 내지 500시간, 400시간, 300시간, 200시간, 또는 100시간; 100시간 내지 500시간, 400시간, 300시간, 또는 200시간; 200시간 내지 500시간, 400시간, 또는 300시간; 300시간 내지 500시간, 또는 400시간; 또는 400시간 내지 500시간)일 수 있다.
적절한 발효 부피는 약 1 L 내지 약 10,000,000 L(예, 1 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 10, 000 L, 5,000 L, 1,000 L, 500 L, 100 L, 50 L, 또는 10 L; 10 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 10, 000 L, 5,000 L, 1,000 L, 500 L, 100 L, 또는 50 L; 50 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 10, 000 L, 5,000 L, 1,000 L, 500 L, 또는 100 L; 100 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 10, 000 L, 5,000 L, 1,000 L, 또는 500 L; 500 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 10, 000 L, 5,000 L, 또는 1,000 L; 1,000 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 10, 000 L, 또는 5,000 L; 5,000 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 50,000 L, 또는 10, 000 L; 10,000 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 100,000 L, 또는 50,000 L; 50,000 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 500,000L, 또는 100,000 L; 100,000 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 1,000,000 L, 또는 500,000L; 500,000 L 내지 10,000,000 L, 5,000,000 L, 또는 1,000,000 L; 1,000,000 L 내지 10,000,000 L, 또는 5,000,000 L; 또는 5,000,000 L 내지 10,000,000 L)일 수 있다.
적절한 발효 용기는 당업계에 공지된 임의의 발효 용기일 수 있다. 적절한 발효 용기의 비제한적인 예시는, 임의의 적절한 규모(예, 작은 규모, 큰 규모)로, 그리고 임의의 공정(예, 고체 배양, 침지 배양, 배치, 공급 배치, 또는 연속 흐름)에서 사용된, 배양 플레이트, 진탕 플라스크, 발효기(예, 교반된 탱크 발효기, 에어리프트 발효기, 버블 컬럼 발효기, 고정 베드 생물반응기, 실험실 발효기, 산업 발효기, 또는 이들의 임의의 조합)를 포함한다.　
정제 및 후처리　
재조합 성분을 (예를 들어, 발효 배지로부터) 정제하여 재조합 성분을 포함한 제제를 수득하는 방법은, 당업계에 잘 알려져 있고, 상기 중 어느 하나에 따라 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 재조합품을 정제하도록 구성될 수 있다.
재조합 성분을　그의 분자량을 기초로,　예를 들어, 크기 배제/교환 크로마토그래피, 막을 통한 초여과, 겔 투과 크로마토그래피(예, 분취용 디스크-겔 전기영동), 또는 밀도 원심분리에 의해 정제할 수 있다.
또한 재조합 성분을　그의 표면 전하 또는 또는 소수성/친수성을 기초로,　예를 들어, 등전 침전, 음이온/양이온 교환 크로마토그래피, 등전 포커싱(IEF), 또는 역상 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
또한 재조합 성분을 그의 용해도를 기초로, 예를 들어, 황산암모늄 침전, 등전 침전, 계면활성제, 세제, 또는 용매 추출에 의해 정제할 수 있다.
또한 재조합 성분을 또 다른 분자에 대한 그의 친화력을 기초로, 예를 들어, 친화력 크로마토그래피, 반응성 염료, 또는 히드록시아파타이트에 의해 정제할 수 있다. 친화력 크로마토그래피는 재조합 성분에 대한 특이적인 결합 친화력을 갖는 항체, 또는 His-태그부착된 재조합 단백질에 대한 니켈 NTA, 또는 재조합 단백질 상의 당 모이어티에 결합하는 렉틴, 또는 재조합 성분에 특이적으로 결합하는 임의의 기타 분자의 사용을 포함할 수 있다. 재조합 성분은 정제를 용이하게 하는 에피토프 또는 펩티드 태그를 운반할 수 있다. 에피토프 또는 펩티드 태그는 재조합 성분의 단리 후에 (예를 들어, 프로테아제 절단을 통해) 제거될 수 있다.　
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 성분이 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포에 의해 분비되는 구현예에서, 재조합 성분은 배양 배지로부터 직접 정제될 수 있다. 다른 구현예에서, 재조합 성분은 세포 용해물로부터 정제될 수 있다.
재조합 성분은 정제되어, 발효 액체 배지에 포함된 다른 성분에 비해 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 97% 초과, 또는 99% 초과의 순도로 재조합 성분을 포함하는 제제를 수득할 수 있고; 또는 발효 액체 배지에 포함된 다른 성분에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배까지 더 큰 순도로 재조합 성분을 포함한 제제를 수득할 수 있고; 또는 질량 기준 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 97% 초과, 또는 99% 초과의 순도로 재조합 성분을 포함한 제제를 수득할 수 있다.
재조합 성분의 신원을 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 웨스턴 블롯 분석, 이스턴 블롯 분석, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 효소 생성물의 형성, 효소 기질의 소멸, 및 2차원 질량 분광법 (2D-MS/MS) 서열 확인에 의해 확인 및/또는 정량할 수 있다.
재조합 성분은 (예를 들어, 분말을 얻기 위해) 분무 건조되거나 증발을 통해 농축될 수 있다.
재조합 성분을 포함하는 조성물
다양한 양태에서, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포 및/또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 생성된 재조합 성분을 포함하거나 이로 필수적으로 구성되는 조성물이 본원에 제공되며, 상기 조성물은 조절된 FFA 방출 효소 활성(예, 본원에 개시된 둘 이상의 FFA 방출 효소의 임의의 조합의 활성 또는 본원에 개시된 임의의 하나의 FFA 방출 효소의 활성)을 포함하며, 이는 상응하는 조성물(즉, "상응하는 조성물"이 생성되는 방법을 제외하고는 "상응하는 조성물"과 비교되는 조성물과 동일한 조성물로서, FFA 방출 효소 활성이 본원에 제공된 바와 같이 조절되는 적어도 하나의 단계를 포함하지 않는 조성물)에서의 FFA 방출 효소 활성과 비교된다.
조성물은 약 0.1% 내지 약 100%(예, 0.1% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 또는 0.2%; 0.2% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 또는 0.3%; 0.3% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 또는 0.4%; 0.4% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 또는 0.5%; 0.5% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 또는 0.6%; 0.6% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 또는 0.7%; 0.7% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 또는 0.8%; 0.8% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.9%; 0.9% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%; 1% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 또는 2%; 2% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 또는 3%; 3% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 또는 4%; 4% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5%; 5% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 또는 6%; 6% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 또는 7%; 7% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 또는 8%; 8% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 또는 9%; 9% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 또는 10%; 10% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 또는 11%; 11% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 또는 12%; 12% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 14%, 또는 13%; 13% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 또는 14%; 14% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 또는 15%; 15% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 또는 20%; 20% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 또는 25%; 25% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 또는 30%; 30% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 또는 35%; 35% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 또는 40%; 40% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 또는 45%; 45% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 또는 50%; 50% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 또는 55%; 55% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 또는 60%; 60% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 또는 65%; 65% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 또는 70%; 70% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 또는 75%; 75% 내지 100%, 95%, 90%, 85%, 또는 80%; 80% 내지 100%, 95%, 90%, 또는 85%; 또는 85% 내지 100%, 95%, 90%; 90% 내지 100% 또는 95%, 또는 95% 내지 100%)로 재조합 성분의 건조 질량을 포함할 수 있다.
표준 주변 온도 및 조건(즉, 20-30℃ 및 0.95-1.05 기압)에서, 상기 중 어느 하나에 따른 조성물은 유체, 반고체(예, 젤라틴), 고형분, 또는 분말일 수 있다. 분말은 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 3% 미만, 또는 1% 미만; 또는 약 0.1% 내지 약 20%(예, 0.1% 내지 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1%; 1% 내지 20%, 15%, 10%, 또는 5%; 5% 내지 20%, 15%, 또는 10%; 10% 내지 20%, 또는 15%; 또는 15% 내지 20%)의 수분 함량을 포함할 수 있다. 분말은 분말 형태로 사용될 수 있거나, 분말은 사용 전에 수화제로 재구성될 수 있거나, 분말은 수화제가 혼합물에 첨가되기 전에 다른 건조 성분(예, 밀가루, 설탕, 무기질, pH 또는 이온 강도 조절제)과 혼합될 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 조성물은 다양한 제품일 수 있고, 예를 들어 캡슐화(예, 전달을 위해 치료제 또는 영양제[예, 마이크로 입자 또는 나노 입자(예, 비드, 미셀, 캡슐, 하이드로겔)를 캡슐화하는 제품), 공업용조성물(예, 유전체), 접착제(즉, 접착 접합을 형성하는 재료; 예, 글루, 벽지 접착제, 목재 접착제, 종이 접착제, 코르크 접착제, 칩보드 접착제, 수술용/의료용 글루, 시멘트, 점액, 페이스트), 코팅 또는 페이싱(예, 광택 코팅, 보호 코팅, 바니시, 의료용 정제 코팅, 종이 코팅, 페인팅, 가죽 마감, 섬유 코팅), 분무, 잉크용 페인트 또는 잉크 또는 안료 바인더, 경질 플라스틱(예, 병, 버튼, 윈도우, 펜), 중간 경질 플라스틱(예, 병, 섬유[예, 실]), 연질 플라스틱(예, 백, 랩, 식용 필름, 방수 필름, 콘택트 렌즈, 포장 재료), 직물(예, 섬유, 카펫, 커튼, 의류), 산업 중합체(즉, 합성 산업 재료의 제조에 사용되는 화합물), 의료 진단(예를 들어, 문헌 [J. Berger et al. 2004. Europ J of Pharm and Biopharm 57:19] 각각 참조), 겔(예, 치료제의 방출을 제어하기 위한 하이드로겔, 단백질(예, 효소)을 고정하기 위한 하이드로겔), 임플란트(예, 골-교체 복합체, 신경 복구 지지 물질, 세포 성장을 위한 스캐폴드, 인공 삽입물), 의복(예, 신발), 윤활제, 가구, 종이(예, 종이 시트, 종이 라벨, 포장지, 사진 지지부), 가정용 물품(예, 포트, 볼, 플레이트, 컵), 및 생물학적 스캐폴드(즉, 생물학적 매트릭스를 모방하는 구조, 봉합사, 골-교체 물질, 신경 복구 지지 물질, 세포 성장을 위한 스캐폴드, 인공 삽입물, 상처 치유 촉진을 위한 막, 상처 드레싱, 조직 엔지니어링 스캐폴드)를 포함한다.
식품
전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물은 식품일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식품"은 식이 목적(즉, 건강상의 악영향이 없지만 위장관에서 소화된 물질의 흡수로 인해 상당한 영양 및/또는 칼로리 섭취를 갖는 목적)으로 인간 또는 동물에 의해 섭취될 수 있는 조성물을 지칭하며, 이는 가축(예, 개, 고양이), 농장 동물(예, 소, 돼지, 말), 및 야생형 동물(예, 비가축 포식 동물)을 포함한다. 이러한 용어는 인간 또는 동물이 섭취할 수 있는 식품을 제조하기 위해 하나 이상의 다른 성분과 조합되거나 이에 첨가될 수 있는 조성물을 포함한다.
식품은 보충 식품(즉, 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 성분이 보충된 종래의 식품)일 수 있거나, 대체 식품(즉, 종래의 식품과 유사하고 종래의 식품을 대신하여 사용될 수 있는 식품)일 수 있고, 국가 건강 및 영양 시험 설문 조사(NHANES)에 의해 정의된 임의의 식품 범주로부터 선택될 수 있다.
이같은 NHANES 식품 카테고리의 비제한적인 예시는 스낵 식품 및 검(예, 스낵바, 크래커, 곡물 제품으로부터의 짭짤한 스낵, 츄잉 검); 빵, 곡물 및 파스타(예, 귀리 빵 및 롤, 옥수수 빵, 옥수수 머핀, 토르티야, 밀가루 및 건조 믹스, 비스킷, 혼합곡 빵 및 롤, 통밀 빵 및 롤, 파스타, 호밀 빵 및 롤, 크랙 밀 빵 및 롤, 흰 빵 및 롤); 음료(예, 맥주 및 에일, 음료 농축물, 음료, 에너지 음료, 스포츠 음료, 체액 보충물, 청량 음료, 탄산 음료, 주스, 와인, 맥주, 칵테일, 영양 음료, 영양 분말, 단백질 풍부 음료 커피, 차); 과자 및 디저트(예, 케이크, 사탕, 칩, 쿠키, 코블러, 페이스트리, 빙과 또는 아이스 캔디, 머핀, 파이, 설탕 대체물 또는 대용물, 시럽, 꿀, 젤리, 잼, 보존물, 샐러드, 크레이프, 데니시, 아침 식사용 페이스트리, 도넛); 아침 식사 식품(예, 시리얼 곡물, 시리얼, 쌀, 프렌치 토스트, 팬케이크, 와플, 커피 케이크); 유제품; 샐러드 드레싱, 오일, 소스, 양념(예, 요리용 지방, 식물성 오일, 샐러드 드레싱, 토마토 소스, 그레이비); 감자(예, 감자 샐러드, 감자 수프, 칩 및 스틱, 튀긴 감자, 으깬 감자, 스터프 감자, 퍼프); 및 수프(예, 야채 수프, 야채 브로스), 식사, 메인 요리, 단백질(예, 육류 대용물), 및 해산물을 포함한다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은 보충 유제품(즉, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 성분이 보충된 종래의 유제품) 또는 대체 유제품(즉, 종래의 유제품과 유사한 식품)일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유제품"은 우유(예, 전유[적어도 3.25%의 유지방], 부분적 탈지유[1% 내지 2% 유지방], 탈지유[0.2% 미만의 유지방], 조리용 우유, 가당 연유, 풍미 우유, 염소 우유, 양 우유, 건조 우유, 무가당 연유, 우유 폼), 및 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 우유로부터 유래된 제품을 지칭한다: 요거트(예, 전유 요거트[170 g 당 적어도 6 그램의 지방], 저지방 요거트[170 g 당 2 내지 및 5 그램의 지방], 무지방 요거트[170 g 당 0.5 그램 이하], 그릭 요거트[유청이 제거된 변형 요거트], 휩 요거트, 염소 우유 요거트, 라브네[Labneh], 양 우유 요거트, 요거트 음료(예, 전유 케퍼[Kefir], 저지방유 케퍼), 라시(Lassi)), 치즈(예, 유청 치즈 예컨대 리코타; 파스타 필라타 치즈 예컨대 모짜렐라; 반-연성 치즈 예컨대 하바티(Havarti) 및 뮌스터(Muenster); 중간-경성 치즈 예컨대 스위스(Swiss) 및 얄스베르그(Jarlsberg) 및 할로우미(halloumi); 경성 치즈 예컨대 체다 및 파마산; 워시드 커드 치즈 예컨대 콜비(Colby) 및 몬테레이 잭(Monterey Jack); 연성 숙성 치즈 예컨대 브리(Brie) 및 까망베르); 생치즈 예컨대 코티지 치즈, 페타 치즈, 크림 치즈, 및 커드; 가공 치즈; 가공 치즈 식품; 가공 치즈 제품; 가공 치즈 스프레드; 효소-조정 치즈; 콜드-팩 치즈), 유제품-기반 소스(예, 샐러드 드레싱, 베차멜 소스, 신선 소스, 냉동, 냉장, 또는 상온 안정 소스), 유제품 스프레드(예, 저지방 스프레드, 저지방 버터), 크림(예, 드라이 크림, 헤비 크림, 라이트 크림, 휘핑 크림, 하프-앤-하프, 커피 화이트너, 커피 크리머, 사우어 크림, 크렘 프레쉬), 빙과(예, 아이스크림, 스무디, 밀크 쉐이크, 프로즌 요거트, 선데이, 젤라토, 커스타드), 유제품 디저트(예, 신선, 냉장, 또는 냉동), 버터(예, 휩 버터, 발효 버터), 유제품 분말(예, 전유 분말, 탈지 분유, 지방 충전 분유(즉, 동물 지방 전체 또는 일부를 대신하여 식물 지방을 포함하는 분유), 유아용 조제 분유, 우유 단백질 농축물 (예, 우유 단백질 농축물, 유청 단백질 농축물, 탈염 유청 단백질 농축물, β-글루글로불린 농축물, α-글루알부민 농축물, 글리코마크롭티드 농축물, 카제인 농축물), 우유 단백질 단리물(예, 우유 단백질 단리물, 유청 단백질 단리물, 탈염화 유청 단백질 단리물, β-글루글로불린 단백질 단리물, α-글루알부민 단백질 단리물, 글리코마크롭티드 단백질 단리물, 카제인 단백질 단리물), 영양 보충제, 텍스처링 블렌드, 향료 블렌드, 착색 블렌드, 바로 마실 수 있는 제품 또는 바로 혼합할 수 있는 제품(예, 신선, 냉장 또는 상온 안정 유제품 음료, 체중 감량 음료, 영양 음료, 스포츠 회복 음료, 에너지 음료), 푸딩, 젤, 츄어블, 크리스피, 바(예, 영양 바, 단백질 막대) 및 발효 유제품(예, 요구르트, 치즈, 사워 크림, 배양 버터 우유, 배양 버터, 배양 버터 오일).
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은 보충된 동물 육류 또는 동물 육류 제품(즉, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포 및/또는 전술한 것 중 어느 하나에 딸ㄴ 방법에 의해 생성된 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 성분이 보충된 통상적인 동물 육류 또는 동물 육류 제품) 또는 대체 동물 육류 또는 동물 육류 제품(즉, 통상적인 동물 육류 또는 동물 육류와 유사한 식품)일 수 있다. 동물 육류 및 동물 육류 제품의 비제한적인 예시는, 동물로부터 수득된 골격근 또는 다른 기관(예, 신장, 심장, 간, 담낭, 장, 위, 골수, 뇌, 흉선, 폐, 혀) 또는 이의 일부로부터 수득된 살코기를 포함한다. 동물 육류는 짙은 색 또는 연한색 육류일 수 있다. 동물 육류 또는 동물 육류 생성물을 수득할 수 있는 동물의 비제한적인 예시는 소, 양, 말, 가금류(예, 닭, 오리, 거위, 칠면조), 가금류(예, 피전, 도우브, 그라우스, 파트리지, 타조 가죽, 에뮤, 꿩, 메추라기), 민물 또는 바다 생선(예, 메기, 참치, 창어, 상어, 넙치, 철갑상어, 연어, 베스, 머스크, 파이크, 보핀, 가, 장어, 패들피쉬, 도미, 잉어, 송어, 월레아이, 스네이크헤드, 크레이피, 시스터, 홍합, 가리비, 전복, 오징어, 문어, 성게, 갑오징어, 커티피시, 투니케이트), 갑각류(예, 게, 랍스터, 새우, 바나클), 사냥 동물(예, 사슴, 여우, 야생형 돼지, 엘크, 무스, 순록, 카리부, 안텔로프, 얼룩말, 다람쥐, 마못, 토끼, 곰, 비버, 머스크랫, 오포섬, 너구리, 아르마딜로, 고슴도치, 비슨, 버팔로, 돼지, 스라소니, 보브캣, 박쥐), 파충류(예, 뱀, 거북이, 도마뱀, 앨리게이터, 크로코다일), 모든 곤충 또는 기타 절지동물, 설치류(호중구, 기니피그, 랫트, 마우스, 볼, 그라운드호그, 카피바라), 캥거루, 고래, 및 물개를 포함한다. 동물 육류 또는 동물 육류 제품은 갈거나, 다지거나, 파쇄하거나, 달리 가공되고, 조리되지 않거나, 조리중이거나, 조리된 것일 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은 보충 달걀 제품(즉, 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 성분이 보충된 종래의 달걀 또는 달걀 제품) 또는 대체 달걀 제품(즉, 종래의 달걀 또는 달걀 제품과 유사한 식품)일 수 있다. 달걀 또는 달걀 제품의 비제한적인 예시는 전란(예, 액체 전란, 분무 건조 전란, 냉동 전란), 달걀 흰자(예, 액체 달걀 흰자, 분무 건조 달걀 흰자, 냉동 달걀 흰자), 달걀 노른자, 달걀 요리, 달걀 수프, 달걀 흰자로 만들어진 혼합물, 달걀 대용품으로 만들어진 혼합물, 마요네즈, 커스터드 및 샐러드 드레싱을 포함한다.
종래의 식품에 대해 본원에서 제공된 대체 식품의 유사성은, 임의의 물리적 속성, 화학적/생물학적 속성, 감각적 속성, 및 기능적 속성, 및 이들의 임의의 조합으로 인한 것일 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 식품은 애완동물 사료 또는 동물 사료일 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은, 재조합 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 포함된 재조합 단백질 이외의 임의의 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은, 재조합 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 함유된 재조합 단백질 이외의 임의의 재조합 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은, 재조합 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 함유된 재조합 단백질 이외의 임의의 재조합 우유 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 식품은 포유동물이 생성하는 우유에서 발견되는 성분(예, 젖소유, 염소유, 양유, 인간 우유, 버팔로 우유, 야크유, 낙타유, 라마유, 알파카유, 마유, 당나귀 우유)이 본질적으로 없을 수 있거나, 포유 동물이 생성하는 우유에서 발견되는 적어도 하나의 저 농도 성분을 포함할 수 있다. 포유동물 유래 우유에서 발견되는 성분의 비제한적인 예시는 락토오스, 포화 지방, 콜레스테롤, 천연 우유 단백질, 및 천연 우유 지질을 포함한다. 식품은, 재조합 우유 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 함유된 재조합 우유 단백질 이외의 임의의 우유 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 식품은 동물(즉, 동물에게 고유한 성분, 동물성 제품[즉, 소모품이거나 일반적으로 인간에 의해 소비되도록 제조되는 동물의 일부; 예, 동물 고기, 동물성 지방, 동물 혈액], 동물 부산물[즉, 일반적으로 그 자체로는 소모되지 않지만 소비를 위한 도축 동물의 부산물인 제품; 예, 동물 뼈, 동물 사체, 및 이로부터 단리된 성분], 동물에 의해 생산된 제품[예, 포유동물 유래 우유, 닭 달걀, 벌꿀], 및 이로부터 생산된 소모품[예, 젤라틴, 렌넷, 포유동물 유래 우유로부터 추출된 유청 단백질, 포유동물 유래 우유로부터 추출한 카제인, 포유동물 유래 우유로부터 추출한 우유 지질, 동물 지질, 동물 단백질])로부터 수득된 성분이 본질적으로 없을 수 있거나, 또는 이러한 성분의 질량이 2% 이하를 포함할 수 있다.
식품을 제조하기 위한 다양한 레시피가 존재하며, 임의의 이러한 레시피는 전술한 어느 하나에 따른 식품을 제조하는 데 사용될 수 있다. 재조합 성분은 정제/단리 형태로 이러한 레시피에 사용되거나, 상기 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 발효 배지 또는 제제에 포함될 수 있다.
미용 또는 개인 위생 제품
상기 중 어느 하나에 따른 조성물은 미용 또는 개인 위생 제품일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "미용 또는 개인 위생 제품"은, 신체 표면(즉, 피부, 모발, 손발톱, 치아, 구강의 조직[예를 들어, 잇몸]과 같은 인체의 노출된 영역)에 적용시 인지되거나 실제적인 미용 또는 위생 효과를 부여하는 조성물을 지칭한다. 미용 또는 개인 위생 제품의 비제한적인 예시는 주름 방지 치료(즉, 장력 부여에 사용되는 조성물[예, 피부를 부드럽게 하고, 피부 내 주름 감소, 피부 내 잔주름 제거]), 노화 방지 치료제(즉, 노화의 징후를 제거하는 데 사용되는 조성물[예, 주름, 잔주름, 광손상의 발현(예, 선 스팟)], 자외선 차단(즉, UV 노출로부터 보호하는 데 사용되는 조성물), 항-화상 치료(즉, 화상을 진정시키기 위해 사용되는 조성물[예, 햇볕 화상]), 항여드름 치료제(즉, 여드름 및/또는 이와 관련된 증상의 치료에 효과적인 조성물), 피부 세정제(즉, 피부 및/또는 피부 기공[예, 모공 청소용 노즈 스트립])을 세정하도록 사용되는 조성물), 비듬 치료제(즉, 비듬을 감소시키거나 제거하는 데 사용되는 조성물), 전신 냄새 처리(즉, 체취를 감소시키거나 제거하기 위해 사용되는 조성물), 셀프 태닝 처리(즉, 피부색을 짙게 하기 위해 사용되는 조성물), 피부 미백 치료(즉, 표백/탈색에 사용된 조성물, 염색 치료(즉, 염색에 사용된 조성물), 로션(예, 피부 로션, 바디 케어 로션, 워시 로션, 모이스처 리텐션 로션, 면도 이전 로션, 애프터 쉐이브 로션), 페이스트(예, 세정 페이스트), 연고, 밤, 고약, 마스크, 크림(예, 오일 크림 내 물, 유분 함유, 데이 크림, 나이트 크림, 아이 크림, 피부 크림, 페이스 크림, 안티-링클 크림, 자외선 차단 크림, 수분 유지 크림, 애프터 쉐이브 크림, 피부 표백 크림, 셀프 태닝 크림, 비타민 크림, 모이스처라이징 크림, 마사지 크림) 우유(예, 체유, 세정 우유), 겔(예, 무수 겔, 샤워 젤), 오드뚜왈렛, 비누(예, 투명 비누, 고급 비누, 데오드란트 비누, 크림 비누, 아기 비누, 피부 보호 비누, 연마 비누, 신데트, 패스트리 비누, 부드러운 비누, 필링 비누), 피부 박리 치료, 액체 세척, 샤워 및 목욕 준비(예, 워시 로션, 수조, 샤워 젤, 수조, 오일 배스, 스크럽 준비), 발포체(예를 들어, 면도 폼, 거품 수조), 데오도란트, 제모 제품(예, 샴푸, 개량제, 헤어 무스, 염색제, 헤어 스프레이, 린스오프 로션, 헤어 젤, 유화액, 헤어 라커, 헤어 토닉), 립글로스, 분무(예, 헤어 스프레이, 펌프 스프레이, 발포제를 함유하는 분무제), 피부 결함에 대한 치료(예, 피부염, 재벌, 챕스, 블레미쉬, 균열, 흉터, 주근깨, 모반, 발진, 수포, 농포), 토너, 세정 조직, 위생 수건, 탐폰, 기저귀, 기피제, 메이크업 제품(예, 스튜디오 색소, 마스카라, 눈 그림자, 아이라이너, 아이라이너 펜, 루그, 페이스 파우더, 눈썹 펜슬, 립스틱, 재단, 틴티드 크림, 컨실러 스틱, 블레미쉬 스틱, 블러쉬), 스틱(예, 립스틱, 컨실러 스틱, 블레미쉬 스틱), 제모제, 핸드 클리닝 제품, 개인 위생 제품, 발 관리 제품, 유아용품, 구강 위생 제품(예, 껌, 구강 청결제, 치약, 검-세척제, 의치 접착제, 의치 고정제)을 포함한다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 미용 또는 개인 위생 제품은, 재조합 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 함유된 재조합 단백질 이외의 임의의 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 미용 또는 개인 위생 제품은, 재조합 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 함유된 재조합 단백질 이외의 임의의 재조합 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 미용 또는 개인 위생 제품은, 재조합 단백질 또는 전술한 것 중 어느 하나에 따른 조성물에 함유된 재조합 단백질 이외의 임의의 재조합 우유 단백질이 본질적으로 없을 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 미용 또는 개인 위생 제품은 포유동물이 생성하는 우유에서 발견되는 성분(예, 젖소유, 염소유, 양유, 인간 우유, 버팔로 우유, 야크유, 낙타유, 라마유, 알파카유, 마유, 당나귀 우유)이 본질적으로 없을 수 있거나, 포유 동물이 생성하는 우유에서 발견되는 적어도 하나의 저 농도 성분을 포함할 수 있다. 포유동물 유래 우유에서 발견되는 성분의 비제한적인 예시는 락토오스, 포화 지방, 콜레스테롤, 천연 우유 단백질, 및 천연 우유 지질을 포함한다. 미용 또는 개인 위생 제품은, 상기 임의의 것에 따른 조성물에 함유된 재조합 단백질 또는 재조합 단백질에 포함된 우유 단백질 이외의 임의의 우유 단백질을 본질적으로 없을 수 있다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 미용 또는 개인 위생 제품은 동물(즉, 동물에게 고유한 성분, 동물성 제품[즉, 소모품이거나 일반적으로 인간에 의해 소비되도록 제조되는 동물의 일부; 예, 동물 고기, 동물성 지방, 동물 혈액], 동물 부산물[즉, 일반적으로 그 자체로는 소모되지 않지만 소비를 위한 도축 동물의 부산물인 제품; 예, 동물 뼈, 동물 사체, 및 이로부터 단리된 성분], 동물에 의해 생산된 제품[예, 포유동물 유래 우유, 닭 달걀, 벌꿀], 및 이로부터 생산된 소모품[예, 젤라틴, 렌넷, 포유동물 유래 우유로부터 추출된 유청 단백질, 포유동물 유래 우유로부터 추출한 카제인, 포유동물 유래 우유로부터 추출한 우유 지질, 동물 지질, 동물 단백질])로부터 수득된 성분이 본질적으로 없을 수 있거나, 또는 이러한 성분의 질량이 2% 이하를 포함할 수 있다.
상기 중 어느 하나에 따른 미용 또는 개인 위생 제품은 석유로부터 유래된 성분이 본질적으로 없을 수 있다.
FFA 방출 효소 활성을 생성하는 재조합 숙주 세포
다양한 양태에서, FFA 방출 효소를 암호화하는 재조합 발현 작제물을 포함하고, 상응하는 숙주 세포(즉, FFA 방출 효소를 암호화하는 재조합 발현 작제물을 포함하지 않는 것을 제외하고, 재조합 숙주 세포와 본질적으로 동일한 숙주 세포)와 비교하여 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성을 증가시키는 재조합 발현 작제물을 포함하는, 재조합 숙주 세포가 본원에 제공된다.
재조합 숙주 세포는 임의의 야생형 단세포 유기체로부터 유래될 수 있고, 모든 박테리아, 효모, 사상균 진균, 고세균, 단세포 원생동물, 단세포 동물, 단세포 식물, 단세포 진균, 단세포 조류, 원생동물, 및 색조류계를 포함하거나 또는 유전자 변이체(예, 돌연변이체) 또한 일반적으로 안전한 (GRAS) 산업용 숙주 세포로서 인식되는 임의의 것로부터 유래될 수 있고, 본원에 개시된 임의의 유기체(예, 피부 다모증, 아스페르길루스 니게르, 시트리노비어화물, 미셀리오프토라 써모필라)를 포함한다.
전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 숙주 세포는, UniProt 서열# G0RH85, G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, G0RVD2, 및 G0R8A6, 및 이의 상동체 및 이들의 조합을 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 FFA 방출 효소의 증가된 생성 및 활성을 포함할 수 있고, FFA 방출 효소의 조절된 생성 및/또는 활성 증가는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%의 조절된 생성 및/또는 활성의 증가이다.
다양한 양태에서, FFA 방출 효소를 암호화하는 재조합 발현 작제물을 포함한 재조합 숙주 세포를 수득하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, i) 전술한 것 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물, 또는 상기 중 어느 하나에 따른 재조합 벡터를 수득하는 단계를 포함하되, 상기 폴리뉴클레오티드, 재조합 발현 작제물, 또는 재조합 벡터의 재조합 단백질 코딩 서열은 UniProt 서열# G0RH85, G0R6T6, G0R6X2, G0R707, G0R7K1, G0R810, G0R9D1, G0R9F9, G0R9J9, G0R9X3, G0RBG0, G0RBJ0, G0RBM4, G0RBZ6, G0RD16, G0RDK5, G0RDU7, G0REM9, G0REZ4, G0RFR3, G0RFT3, G0RG04, G0RG60, G0RGD5, G0RGN7, G0RGQ0, G0RGQ7, G0RHJ4, G0RI29, G0RIJ9, G0RIU1, G0RIV5, G0RJ76, G0RJC6, G0RJY0, G0RK83, G0RKE6, G0RKH7, G0RKI9, G0RKL4, G0RL87, G0RLB0, G0RLB7, G0RLH4, G0RLL0, G0RLR3, G0RM14, G0RME5, G0RMI3, G0RNF8, G0RPQ8, G0RQD1, G0RQG3, G0RQJ5, G0RQN5, G0RR42, G0RRK3, G0RRQ4, G0RSK7, G0RTR6, G0RTT4, G0RUI0, G0RUZ9, G0RV93, G0RW73, G0RW77, G0RWS1, G0RWT9, G0RWY5, G0RX82, G0RX90, G0RHQ7, G0RVD2, 및 G0R8A6, 및 이의 상동체를 포함한 FFA 방출 효소로 이루어진 군으로부터 FFA 방출 효소의 활성을 암호화하는 단계; 및 ii) 폴리뉴클레오티드, 발현 작제물, 또는 재조합 벡터를 숙주 세포(예, 본원에 개시된 임의의 숙주 세포; 본원에 개시된 임의의 방법을 사용함)에 도입하여 상기 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성 증가를 포함하는 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, FFA 방출 효소를 생성하기 위한 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은, 상기 FFA 방출 효소를 암호화하는 재조합 발현 작제물을 포함하고 상응하는 숙주 세포와 비교하면 FFA 방출 효소의 증가된 생성 및/또는 활성을 포함한 재조합 숙주 세포를 수득하는 단계; 상기 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 분비에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 상기 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 선택적으로 FFA 방출 효소를 정제하는 단계를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 개시의 구체적인 구현예를 예시하도록 포함된다. 실시예에 개시된 기법은 본 개시의 방법 및 공정에서 잘 기능하는 것으로 본 발명가에 의해 발견된 기법을 나타낸다; 그러나, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 본 개시내용의 견지에서, 본 개시의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 개시된 구체적인 실시양태에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 여전히 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 실시예에서 기재되거나 제시된 모든 내용은 예시적이고, 제한적이지 않은 의미로 해석되어야 한다.
실시예 1: 재조합 단백질 제제의 발현 분석
다양한 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포(즉, 보스 타우루스 β-락토글로불린을 암호화하는 재조합 발현 작제물을 포함하는 다양한 트리코데르마 리세이 숙주 세포)에서 G0RMI3, G0RGQ0 및 G0RLH4 mRNA 전사체의 존재는, 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포를 2 L 탱크에서 재조합 β-글로불린의 생성 및 분비에 적합한 다양한 조건 하에 발효시킴으로써 결정하였다. 바이오매스 샘플을 발효 동안 다양한 시점에 채취하고, 액체 질소에서 급속 냉동시켰다. RNA를 샘플로부터 추출하고, RNA 품질을 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하고, RNA를 RNA 시퀀싱 및 판독 처리/분석을 위해 제출하였다. G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질을 암호화하는 전사체에 대해 발현 수준을 평가하였다.
도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, 재조합 단백질을 생성하는 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포의 발효는, G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 전사체의 검출 가능한 발현을 나타냈다.
실시예 2: 억제를 통한 FFA 방출 활성의 제거
재조합 β-락토글로불린을 생성할 수 있고 본질적으로 제거된 큐티나아제(예, cut1(UniProt# G0RH85)) 활성을 포함하는 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포("큐티나아제 녹아웃 재조합 숙주 세포")를 PCT 특허 공개 WO2020/081789에 설명된 바와 같이 생성하고 발효시켰다. 재조합 β-락토글로불린을 전하(즉, 정전기 상호작용)에 기초하여 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포의 정제된 발효 배지로부터 단리하고, 분무 건조시켜 β-락토글로불린 분말 제제를 수득하였다.
G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질과 같은 세린 잔기를 포함하는 FFA 방출 효소의 활성을 β-락토글로불린 분말 제제로부터 제거하기 위해, 분말 제조를 40 g/L 단백질의 최종 농도까지 물에 용해시켰다. 용액의 1-mL 두 샘플을 샘플 1 및 샘플 2로서 취하였다. 샘플 1에 20 μL의 디메틸 설폭시드(DMSO)를 2%의 최종 농도로 첨가하였다. 샘플 2에 20 μL의 0.1 mM 포스폰산염 기질 억제제 Thermo ActivX TAMRA-FP 플루오로포스포네이트(ThermoFisher Scientific 카탈로그 번호 88318; 가수분해제의 포스폰산염 억제제의 구성 요소는 이들의 활성 부위에 친핵성 세린을 포함함(Simon & Cravatt. 2010. J. Biol. Chem. 285(15):11051-11055))를 DMSO에 첨가하여, 2 μM Thermo ActivX TAMRA-FP 플루오로포스포네이트 및 2% DMSO의 최종 농도가 되었다. 샘플을 21oC에서 18.5시간 동안 인큐베이션하였다.
샘플 1 및 샘플 2에 포함된 파라-페닐(pNP) 아실 에스테르 가수분해 효소 활성을, 먼저 0.4 M 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산(HEPES)의 동일한 부피 pH 7로 각 샘플을 희석한 다음, 이어서 0.2 M HEPES pH7에서 1/128배까지 연속 희석하고, 0.3 mM pNP 아실 에스테르(pNP-부티레이트, pNP옥타노에트, pNP-라우레이트, 또는 pNP-팔미테이트)의 동일한 부피로 10% DMSO에 혼합하고, 30oC에서 인큐베이션함으로써 결정하였다. 반응 혼합물을 Greiner Bio-one(Monroe, North Carolina; 카탈로그 번호 G55801)의 UV-스타 플레이트 내에서 Molecular Devices(San Jose, California)의 SpectraMax M3 플레이트 판독기로 348 nm에서 매시간(1 내지 6시간) 흡광도를 측정하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 샘플 1은 네 개의 pNP 아실 에스테르의 가수분해로부터 파라-니트로페놀을 생성하였는데, 이는 상응하는 FFA를 공동 생성하고 샘플 1에서 리파아제(에스테라아제로서) 활성의 존재를 나타낸다. 이러한 FFA의 생성(즉, 지방산 에스테르 가수분해 효소 활성)은 본질적으로 샘플 2에서 제거되었다.
실시예 3: 정제를 통한 에스테라제 활성의 제거
재조합 β-락토글로불린을 생성할 수 있고 본질적으로 제거된 큐티나아제(예, cut1(UniProt# G0RH85)) 활성을 포함하는 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포("큐티나아제 녹아웃 재조합 숙주 세포")를 PCT 특허 공개 WO2020/081789에 설명된 바와 같이 생성하고 발효시켰다. 재조합 β-락토글로불린을 전하(즉, 정전기 상호작용)에 기초하여 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포의 정제된 발효 배지로부터 단리하고, 분무 건조시켜 재조합 β-락토글로불린 분말 제제를 수득하였다.
재조합 β-락토글로불린 분말 제제를 물에 재용해시켜, 각각 40 또는 200 g/L의 농도로 만들고, 2.5 또는 7.5 mL의 용액을, 21℃에서 DMSO 내 80 또는 20 μL의 0.1 mM ActivXTM 데스티오비오틴-플루오로포스포네이트 세린 가수분해효소 프로브(DTB-FP, 카탈로그 번호 88317, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)와 반응시켰다. DTB-FP는, 인 및 세린의 측쇄 산소에 결합함으로써, 활성 부위에서 친핵성 세린을 포함한 FFA 방출 효소에 공유 결합한다. 8시간 후, 100 μL의 수화된 PierceTM 고용량 스트렙타비딘 아가로오스(SA-A; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)를 첨가하고, 반응 현탁액을 21oC에서 인큐베이션하였다(비오틴-아비딘 결합을 통해 부착된 DTB-FP가 SA-A에 결합하는 FFA 방출 효소). 21시간 후, 현탁액을 1,000 상대 원심력(rcf)에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액(재조합 β-락토글로불린을 포함함)을 펠릿(G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질과 같은 촉매 도메인에 세린 잔기를 포함하는 결합된 FFA 방출 효소를 포함함)으로부터 분리하였다.
실시예 4: 재조합 G0RMI3, G0RGQ0 및 G0RLH4 단백질의 생성
트리코데르마 리세이의 재조합 G0RLH4 및 G0RGQ0 단백질 생성의 경우, 당업계에 공지된 유전자 조작 방법을 사용하여 재조합 벡터를 작제하였다. 재조합 벡터의 일반적인 구조가 도 3에서 나타나 있다. 재조합 벡터는, pSES 프로모터 및 pdc1 종결자의 조절 하에, N-종결 G0RLH4 또는 G0RGQ0 고유 분비 신호 서열에 작동가능하게 연결된, G0RLH4 또는 G0RGQ0 단백질을 암호화하는 단백질 코딩 서열을 포함한 재조합 발현 작제물을 포함하였다. 재조합 발현 작제물은, G0RLH4 또는 G0RGQ0 발현 작제물의 발현을 유도하기 위해, 합성 전사 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하였다. 재조합 벡터는 추가적으로, 트리코데르마 리세이 숙주 세포의 게놈 내 egl1 유전자좌에서 재조합 발현 작제물의 통합을 유도할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 박테리아 및/또는 진균 형질전환체의 선택을 위한 선택 마커, 및 박테리아 복제 기점을 포함하였다. 박테리아 선택 마커 및 복제 기점은, 재조합 벡터가 트리고데르마 리세이 숙주 세포로 형질전환되기 전에 제한 효소 소화를 통해 재조합 벡터로부터 제거되었다.　
피키아 파스토리스에서 재조합 G0RMI3 단백질을 생성하는 경우, 당업계에 공지된 유전자 조작 방법을 사용하여 재조합 벡터를 작제하였다. 재조합 벡터의 일반적인 구조가 도 4에서 나타나 있다. 재조합 벡터는, AOX1 메탄올 유도성 프로모터 및 종결자의 조절 하에, 알파 교배 인자인 사카로미세스 세레비시아에 대한 N-종결 사전-사후 분비 신호 서열 및 C-종결 6x-His 태그에 작동가능하게 연결된, G0RMI3 단백질을 암호화하는 단백질 코딩 서열을 포함한 재조합 발현 작제물을 포함하였다. 재조합 벡터는, 박테리아 및/또는 진균 형질전환체의 선택을 위한 선택 마커, 및 박테리아 복제 기점을 추가로 포함하였다. 박테리아 선택 마커 및 복제 기점은, 재조합 벡터가 피키아 파스토리스 숙주 세포로 형질전환되기 전에 제한 효소 소화를 통해 재조합 벡터로부터 제거되었다.　
재조합 벡터를 (예를 들어, 열충격 프로토콜을 사용하여) 트리코데르마 리세이 또는 피키아 파스토리스 숙주 세포로 형질전환시키고, 양성 선택을 위한 최소 배지 또는 항생제 상에서의 성장에 의해 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체를 24-웰 플레이트 내 발현 배지에서 성장시키고, 추가 분석을 위해 상청액을 수확하였다. 전술한 것 중 어느 하나에 따른 재조합 발현 작제물의 통합된 복제를 포함하고 재조합 G0RMI3, G0RLH4, 또는 G0RGQ 단백질을 분비한 재조합 숙주 세포를, 발효 배지 샘플의 SDS-PAGE 또는 웨스턴 블롯 겔 분석에 의해 식별하였다.　
재조합 G0RMI3 단백질을 친화성 컬럼(예, HisTrap HP 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ))을 사용하여 발효 배지로부터 정제한 다음, pH8에서 50 mM 트리스-HCL, 150 mM NaCL, 10% 글리세롤의 버퍼 용액 중에서 (Bradford 검정에 의해 결정된 바와 같이) 0.16 mg/mL 농도로 용리하였다.
재조합 G0RGQ0 및 G0RLH4 단백질은 정제되지 않았지만, 오히려 5일령 진탕 플라스크로부터의 상청액을 후속 실험에 사용하였다. 1x108 포자를 진탕 플라스크에 100 ml의 최소 배지에 접종하였다.
도 5a-5c에 나타낸 바와 같이, 재조합 균주는 G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질을 생성하였다.
실시예 5: 지질분해 분석을 사용하여 G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질의 FFA 방출 활성 분석
G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질의 FFA 방출 활성은, FFA 결합 및 로다민 B의 농도에 의해 야기되는 형광 신호의 검출에 기초한 방법을 사용하여 설명하고 있다(Kouger & Jaeger. 1987. Appl Env Microbiol. 53(1):211-213). 이를 위해 24-웰 배양 플레이트의 웰을 각각 1 부피%의 한천을 포함하는 3 mL의 한천 겔, 해바라기 코코넛 오일 블렌드 10 mL/L, 및 5 mg/L 로다민 B로 충진한다. 그 다음, 실시예 3의 G0RMI3 단백질 제제의 10 uL 샘플. 실시예 3의 G0RGQ0 또는 G0RLH4 배양 상청액의 20 uL 샘플, 또는 동등한 부피의 음성 대조군(즉, 실시예 3의 발현 작제물 중 어느 하나를 포함하지 않은 트리코데르마 리세이 균주의 상청액)을 한천에 피펫팅하였다. 24-웰 플레이트를 30℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 다음, UV 투과기로 조사하여 FFA가 존재했는지 여부를 결정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군 웰에서 유래하지는 않지만, G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질을 함유하는 웰에 대해 형광 신호가 관찰되었는데, 이는 G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4 단백질이 해바라기/코코넛 오일 기질로부터 FFA의 효소 방출을 야기할 수 있음을 나타낸다.
실시예 6: 아이스크림 산패도 분석을 이용한 G0RMI3 단백질의 FFA 방출 활성 분석
G0RMI3 단백질의 FFA 방출 활성은 산패도용 단백질을 포함한 제제로부터 생성된 아이스크림을 평가함으로써 설명하였다. 이를 위해, 설탕, 말토덱스트린, 염, 무기질, 검, 및 물에 용해된 보스 타우루스 유청 단백질 단리물을 포함한 아이스크림 혼합물을 생성하였다. 이 혼합물에, 16 질량%의 지질(즉, 대두, 용융된 코코넛 오일 및 용융된 해바라기 오일로부터 수득된 유화 모노- 및 디글리세리드)을 첨가하고, 혼합물을 Ultraturrax(IKA Works, Wilmington, NC)에서 20,000 rpm으로 30초 동안 혼합하였다. 긁어내는 표면 패들이 구비된 Hot Mix Pro 용기로 혼합물을 옮기고, 82℃의 유지 온도 및 25초의 유지 시간, 90 rpm으로 인큐베이션하였다. 완성된 아이스크림 베이스를 저온 살균하고 균질화시키고(2-단계: 180/30 기압 = 210 기압), 대략 207 g을 250 mL 쇼트 병에 첨가하고, 55℃의 수조에서 인큐베이션하였다. 혼합물에 15 ug의 G0RMI3 단백질을 첨가하고, 혼합물을 16,000 rpm의 Ultraturrax를 사용하여 적어도 60초 동안 혼합한 다음, 55℃의 수조에서 인큐베이션하였다. 4시간 후, 샘플을 냉각시키고 4℃에서 7-8일 동안 보관하였다. 0시간, 4시간, 24시간, 및 6-8일의 시점에 감각 전문가에 의해 아이스크림을 평가하였다. G0RMI3 단백질을 포함한 샘플은 산패 냄새 및/또는 맛을 가진 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 요거트 산패도 분석을 사용한 G0RMI3 단백질의 FFA 방출 활성 분석
G0RMI3 단백질의 FFA 방출 활성은 산패도용 단백질을 포함한 제제로부터 생성된 요거트를 평가함으로써 설명하였다. 이를 위해, 50 mg의 YCX-11 요구르트 배양물(Chr. Hansen Inc., Hørsholm, 덴마크) 및 80 g의 전유를 교반 플레이트 상에서 적어도 10분 동안 또는 과립이 완전히 수화될 때까지 저속으로 혼합하였다. 24 ug의 정제된 G0RMI3 단백질 및 30 g의 전유의 제2 혼합물을 2,000 rpm에서 3분 동안 IKA Ultra Turrax TubeDrive(IKA Works, Wilmington, NC)에서 혼합하였다. 제1 혼합물의 18.5 g 분취액을 제2 혼합물에 첨가하고(최종 농도 0.025% w/w/ 요구르트 배양), 합쳐진 혼합물을 IKA Ultra Turrax TubeDrive에서 2000 rpm으로 1분 동안 혼합하였다. 그 다음, 샘플을 깨끗한 80 mL 유리 Weck 병에 붓고, 60 mm 뚜껑 및 개스킷을 이용해 밀봉하였고, 44℃에서 4시간 동안 (또는 4.6 +/- 0.1의 pH에 도달할 때까지) 인큐베이션하여 요구르트를 수득하였다. 24시간 후, 3-4일 후, 및 6-8일 후에, 감각 전문가에 의해 산패도 냄새 및/또는 맛의 존재에 대해 요거트를 평가하였다. 24시간 시점부터 계속, G0RMI3 단백질 분말을 사용하여 생성된 요거트를 산패한 것으로 판단하였다.
실시예 8: 유전자 변형을 통한 에스테라제 활성의 제거
재조합 β-락토글로불린을 생성할 수 있고 G0RH85 및 G0RMI3(이중 결핍); G0RH85, G0RMI3, 및 G0RGQ0 (삼중 결핍); G0RH85, G0RMI3, 및 G0RLH4(삼중 결핍); G0RH85, G0RMI3 및 G0RLH4 (삼중 결핍); 및 G0RH85, G0RMI3, G0RGQ0, 및 G0RLH4(사중 결핍)의 본질적으로 제거된 FFA 방출 활성을 포함한 재조합 트리코데르마 리세이 숙주 세포는, G0RH85, G0RMI3, G0RGQ0, 및/또는 G0RLH4 단백질을 암호화하는 유전자에 선택성 마커를 상동성 재조합하여 통합하도록 조작된 폴리뉴클레오티드(표적화 벡터)를 이용해 재조합 β-락토글로불린("상응하는 재조합 숙주 세포")을 생성할 수 있는 트리코데르마 리세이 균주의 원형질을 형질전환함으로써 생성되었다. 표적화 벡터의 일반적인 구조가 도 7에서 나타나 있다. 표적화 벡터는 트리코데르마 리세이 게놈 내의 유전자 오픈 리딩 프레임에 플랭킹된 상류 및 하류 폴리뉴클레오티드 서열에 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열이 플랭킹된 선별 마커(우라실 보충 없이 성장할 수 있게 하는 pyr4 유전자)를 포함하였다. 다수의 유전자 치환은 유전자좌를 순차적으로 표적화하고, 각각의 라운드 후에 마커를 재활용함으로써 완료되었다.
형질전환체를 최소 배지에서 선별한 후, PCR로 스크리닝하여, 리파아제 녹아웃 재조합 숙주 세포를 확인하였다. 세포를 5-플루오로오로틱산 함유 배지에 플레이팅함으로써, 리파아제 녹아웃 재조합 숙주 세포는 선택적 마커를 "경화"시켰다. 네 개의 모든 유전자 개방 리딩 프레임이 녹아웃된 균주를 수득할 때까지 순차적 변환/경화 라운드를 위해 "경화된" 세포를 취하였다.
최종 녹아웃 재조합 숙주 세포 및 상응하는 재조합 숙주 세포를 재조합 숙주 세포의 성장 및 재조합 β-락토글로불린의 생성 및 분비에 적절한 배양 배지에서 발효시켰다.

Claims (44)

  1. 재조합 성분을 생성할 수 있는 재조합 숙주 세포로서, 상응하는 재조합 숙주 세포와 비교하면, 상기 재조합 숙주 세포는 FFA 방출 효소의 생성 및/또는 활성 감소를 포함하되, 상기 FFA 방출 효소는 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소를 포함하거나 이로 구성되며, 이는 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, 또는 G0RMI3, 또는 UniProt 서열# G0RGQ0, G0RLH4, 또는 G0RMI3#의 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는, 재조합 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RLH4또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RH85 또는 UniProt 서열# G0RH85에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 제2 FFA 방출 효소를 추가로 포함하는, 재조합 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  11. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  12. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  13. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  14. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  15. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  16. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 FFA 방출 효소는, UniProt 서열# G0RGQ0 또는 UniProt 서열# G0RGQ0에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, UniProt 서열# G0RLH4 또는 UniProt 서열# G0RLH4에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소, 및 UniProt 서열# G0RMI3 또는 UniProt 서열# G0RMI3에 대해 적어도 70%의 아미노산 동일성을 갖는 상동체를 포함하는 FFA 방출 효소로 구성되는, 재조합 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 숙주 세포는 박테리아, 효모 또는 사상 진균류로부터 유래되는, 재조합 숙주 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 사상 진균류는 아스페르길루스(예, 아스페르길루스 니게르), 트리코데르마(예, 트리코데르마 리세이, 트리코데르마 시트리노비라이드), 또는 미셀리오프토라(예, 미셀리오프토라 써모필라)로부터 선택되는, 재조합 숙주 세포.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 성분이 재조합 단백질인, 재조합 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 재조합 우유 단백질인, 재조합 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재조합 우유 단백질이 재조합 카제인인, 재조합 숙주 세포.
  22. 제20항에 있어서, 상기 재조합 우유 단백질이 재조합 유청 단백질인, 재조합 숙주 세포.
  23. 제20항에 있어서, 상기 재조합 우유 단백질은 소, 인간, 양, 염소 또는 말에서 발견되는 천연 우유 단백질의 아미노산 서열과 동일하거나 이의 상동체인 아미노산 서열을 갖는, 재조합 숙주 세포.
  24. 재조합 성분을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 재조합 성분의 생성에 적합한 조건 하에서 배양 배지에서 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포를 발효시키는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 재조합 성분을 포함한 조성물을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제24항의 방법에 의해 상기 재조합 성분을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 재조합 성분을 포함한 조성물을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 촉매 도메인에 세린 잔기를 포함한 FFA 방출 효소의 억제제를 발효 배지, 제제, 또는 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 재조합 성분을 포함한 조성물을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은, 활성 기반 단백질 프로파일링(ABPP) 소분자 프로브를 사용하여, 상기 재조합 성분으로부터 FFA 방출 효소를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 재조합 성분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 상기 재조합 성분의 건조 질량 기준 약 0.1% 내지 약 100%를 포함하는, 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 식품인, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 식품은 보충 식품인, 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 보충 식품은 보충 유제품인, 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 보충 식품은 보충 달걀 제품인, 조성물.
  34. 제30항에 있어서, 상기 식품은 대체 식품인, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 대체 식품은 대체 유제품인, 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 대체 식품은 대체 달걀 제품인, 조성물.
  37. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 미용 또는 개인 위생 조성물인, 조성물.
  38. 제28항에 있어서, 상기 조성물은 분말인, 조성물.
  39. 제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 성분이 재조합 단백질인, 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 상기 재조합 단백질 이외의 임의의 단백질이 본질적으로 없는, 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 상기 조성물은 상기 재조합 단백질 이외의 임의의 재조합 단백질이 본질적으로 없는, 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 재조합 우유 단백질인, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 조성물은 상기 재조합 우유 단백질 이외의 임의의 단백질이 본질적으로 없는, 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 상기 조성물은 상기 재조합 우유 단백질 이외의 임의의 재조합 단백질이 본질적으로 없는, 조성물.
KR1020237019701A 2020-11-13 2021-11-15 식품 및 기타 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 생성하기 위한 방법 및 조성물 KR20230107636A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063113729P 2020-11-13 2020-11-13
US63/113,729 2020-11-13
US202163175278P 2021-04-15 2021-04-15
US63/175,278 2021-04-15
PCT/US2021/059413 WO2022104227A1 (en) 2020-11-13 2021-11-15 Methods and compositions for producing recombinant components for use in food and other products

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230107636A true KR20230107636A (ko) 2023-07-17

Family

ID=81601768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237019701A KR20230107636A (ko) 2020-11-13 2021-11-15 식품 및 기타 제품에 사용하기 위한 재조합 성분을 생성하기 위한 방법 및 조성물

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240026279A1 (ko)
EP (1) EP4244354A1 (ko)
JP (1) JP2023549610A (ko)
KR (1) KR20230107636A (ko)
AU (1) AU2021377901A1 (ko)
CA (1) CA3198703A1 (ko)
MX (1) MX2023005582A (ko)
WO (1) WO2022104227A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL301396A (en) 2020-09-30 2023-05-01 Nobell Foods Inc Recombinant milk proteins and food compositions containing them
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
WO2023242273A1 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Newmilkbuzz B.V. Expression of milk caseins in filamentous fungi
WO2024020592A1 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Perfect Day, Inc. Cosmetic or personal care composition comprising recombinant milk protein

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112021007367A2 (pt) * 2018-10-17 2021-08-10 Perfect Day, Inc componentes e composições recombinantes para uso em produtos alimentares

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022104227A9 (en) 2023-04-20
MX2023005582A (es) 2023-07-18
US20240026279A1 (en) 2024-01-25
WO2022104227A1 (en) 2022-05-19
AU2021377901A1 (en) 2023-06-22
EP4244354A1 (en) 2023-09-20
JP2023549610A (ja) 2023-11-28
CA3198703A1 (en) 2022-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240026279A1 (en) Methods and compositions for producing recombinant components for use in food and other products
US20230106635A1 (en) Hypoallergenic recombinant milk proteins and compositions comprising the same
JP2021141901A (ja) 卵白タンパク質産生のための方法および組成物
US20240034760A1 (en) Fusion proteins comprising milk proteins and compositions thereof
US20080038404A1 (en) Protein
EA018153B1 (ru) Липидацилтрансфераза и содержащая ее пищевая или кормовая композиция
JP2022547562A (ja) 乳脂質のサブセットを含む組成物、およびその製造方法
CN102439143B (zh) 用于生产脂解酶的方法
CN104017782A (zh) 用于酶漂白食品的新颖酶
US4579660A (en) Method for treatment of biomass
CN116648509A (zh) 生产用于食品和其他产品的重组组分的方法和组合物
CN106061287A (zh) 海洋肽乳液
WO2023150696A2 (en) Compositions and methods for delivering hydrophobic bioactive agents
Mayta Apaza Utilization of Acid Whey as a Fermentation Aid to Process Fish Waste and Develop an Enriched Feed Ingredientf
JP2006230259A (ja) 乳酸菌の生育促進方法
Apaza Utilization of Acid Whey as a Fermentation Aid to Process Fish Waste and Develop an Enriched Feed Ingredient
KORKMAZ et al. MINI-REVIEW: SOME ARTICLES IN THE FIELD OF BIOTECHNOLOGY
JP2006081446A (ja) 酵母増殖の促進方法