CN116648509A - 生产用于食品和其他产品的重组组分的方法和组合物 - Google Patents

生产用于食品和其他产品的重组组分的方法和组合物 Download PDF

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CN116648509A CN202180088101.7A CN202180088101A CN116648509A CN 116648509 A CN116648509 A CN 116648509A CN 202180088101 A CN202180088101 A CN 202180088101A CN 116648509 A CN116648509 A CN 116648509A
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H·詹森
R·贾拉
H·米尔曼
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V·W-X·吴
F·马内阿
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Abstract

本公开涉及生产用于食品或其他产品的重组组分的方法和组合物。本公开还涉及包含由此类方法和组合物生产的重组组分的组合物。

Description

生产用于食品和其他产品的重组组分的方法和组合物
相关申请
本申请要求于2020年11月13日提交的美国临时专利申请序列号63/113,729和于2021年4月15日提交的美国临时专利申请序列号63/175,278的优先权，所述申请以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及生产用于食品或其他产品的重组组分的方法和组合物。本公开总体上还涉及包含由此类方法和组合物生产的重组组分的组合物。
背景技术
动物源性食物产品(例如，肉、奶、蛋)是常见的营养来源。它们包含优质蛋白质、必需矿物质(例如，钙、磷、锌、镁)和维生素(例如，核黄素、维生素A、维生素B12)。另外，许多这样的食物产品具有允许产生广泛多样的衍生食物产品(例如，酸奶、奶酪、奶油、冰淇淋、黄油、蛋黄酱)的有利的功能特性。
然而，动物源性食物产品包含可能在人中引起不健康反应的组分(例如，乳糖、过敏原、饱和脂肪、胆固醇)。此外，这些食物产品的生产涉及畜牧业，这对动物福利和环境产生了重大影响，并且具有被农药残留、重金属、黄曲霉毒素M1和病原体污染的可能性。
这些担忧已推动动物源性食品和其他产品(例如，化妆品、个人护理产品)的替代品的开发。一些这样的替代品包括植物来源的组分(例如，蛋白质、脂质、维生素)。然而，越来越多地，动物源性食品和其他产品的替代品是从重组产生(例如，使用宿主细胞)的组分(例如，蛋白质、脂质)生产的。
重组组分在食品和其他产品中的使用带来了新的问题。一个这样的问题是由重组组分生产的食品和其他产品经常含有大量的此类重组组分(比以前利用重组组分的产品中典型的量更多)，并且大量重组组分的使用可能受到由从其获得重组组分的重组宿主细胞同时产生并且可能与该重组组分共同纯化的其他(有时是不期望的)组分的影响。
一种这样的其他组分是具有导致释放游离脂肪酸(FFA；即FFA释放酶)的活性的酶。FFA释放酶可以水解甘油二酯、甘油三酯、磷脂、脂蛋白和其他分子中的键来释放FFA。FFA释放酶的底物包含在其中可以使用重组组分的各种食品和其他产品中。在一些此类食品和其他产品中，FFA的释放可能通过例如产生酸败气味和/或味道、干扰乳剂的形成、对质地具有不希望的影响、与必需营养素(例如，维生素)相互作用和从而减少营养含量以及缩短保质期而具有有害的作用。在食品和其他产品中产生FFA也可以通过例如产生期望的风味和/或气味特征(例如，成熟奶酪的风味特征)或制备用于加工奶酪中的酶改性奶酪而具有有益的作用。因此，在生产、加工和使用重组组分来生产动物源性食品和其他产品的替代品中必须克服特别是关于FFA释放酶活性的挑战，从而例如延迟酸败气味和味道的产生，不影响乳液形成，保持营养含量，不调节质地，并且不缩短保质期；和/或产生期望的风味和/或气味特征。
因此，需要一种方法，通过该方法可以从重组组分产生动物源性食品和其他产品的替代品，以及需要用于这样的方法的组合物和从这样的方法获得的组合物。
以引用的方式并入
本文所提及的所有出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目、科学出版物和其他参考文献均以全文引用的方式并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、序列、数据库条目、科学出版物或其他参考文献均被明确并单独指出以通过引用并入。在以引用的方式并入的材料与本公开矛盾或不一致的程度上，本公开(包括定义)将替代任何这样的材料。
发明内容
在各个方面，本文提供了能够产生重组组分的重组宿主细胞，其中与对应重组宿主细胞中所包含的FFA释放酶的产量和/或活性相比，该重组宿主细胞包含经调节的FFA释放酶产量和/或活性。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RH85、G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、G0RVD2或G0R8A6、或它们的同源物、或它们的组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5或G0RKH7、或它们的同源物、或它们的组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4或G0RMI3、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RLH4、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由如下的FFA释放酶组成，该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RMI3、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、R0RVD2或G0R8A6、或它们的同源物、或它们的组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5或G0RKH7、或它们的同源物、或它们的组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4、G0RMI3、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0RFT3、G0RG60、G0RGD5、G0RI29、G0RIJ9、G0RKH7、G0RKL4、G0RL87、G0RLL0、G0RLR3、G0RME5、G0RQJ5、G0RRK3、G0RSK7、G0RWT9或G0RX82、或它们的同源物、或它们的组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4或G0RMI3、或它们的同源物、或它们的组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RMI3、或其同源物、或其组合的FFA释放酶。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RGQ0、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶和第二FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RLH4、或其同源物、或其组合。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶、第二FFA释放酶和第三FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RMI3、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RGQ0、或其同源物、或其组合的FFA释放酶。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶、第二FFA释放酶和第三FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RMI3、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RLH4、或其同源物、或其组合的FFA释放酶。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶、第二FFA释放酶和第三FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RGQ0、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RLH4、或其同源物、或其组合的FFA释放酶。
如段落[0010]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶包含或由第一FFA释放酶、第二FFA释放酶、第三FFA释放酶和第四FFA释放酶组成，该第一FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RH85、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RMI3、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RGQ0、或其同源物、或其组合的FFA释放酶；该第四FFA释放酶选自包含UniProt序列#G0RLH4、或其同源物、或其组合的FFA释放酶。
段落[0010-0028]中任一项所述的重组宿主细胞，其中经调节的FFA释放酶产量和/或活性包括降低的FFA释放酶产量和/或活性。
如段落[0029]所述的重组宿主细胞，其中该降低的FFA释放酶产量和/或活性是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％降低的产量和/或活性。
如段落[0010-0030]中任一项所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞来源于细菌、酵母或丝状真菌。
如段落[0031]所述的重组宿主细胞，其中该丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus)(例如，黑曲霉(Aspergillus niger))、木霉属(Trichoderma)(例如里氏木霉(Trichodermareesei)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride))或毁丝霉属(Myceliophthora)(例如，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))。
如段落[0010-0032]中任一项所述的重组宿主细胞，其中该重组组分是重组蛋白。
如段落[0033]所述的重组宿主细胞，其中该重组蛋白是重组乳蛋白。
如段落[0034]所述的重组宿主细胞，其中该重组乳蛋白是重组酪蛋白。
如段落[0034]所述的重组宿主细胞，其中该重组乳蛋白是重组乳清蛋白。
如段落[0034]所述的重组宿主细胞，其中该重组乳蛋白来源于牛、人、绵羊、山羊或马。
在各个方面，本文提供了一种用于生产包含重组组分的组合物的方法，该重组组分由能够产生重组组分的重组宿主细胞产生，其中该方法包括调节FFA释放酶的产量和/或活性。
如段落[0038]所述的方法，其中该重组宿主细胞是如段落[0010-0037]中任一项所述的重组宿主细胞。
如段落[0038]所述的方法，其中该调节FFA释放酶的产量和/或活性包括降低该FFA释放酶的产量和/或活性。
如段落[0040]所述的方法，其中该降低的该FFA释放酶产量和/或活性是降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的产量和/或活性。
如段落[0040]或[0041]所述的方法，其中该降低该FFA释放酶的产量和/或活性包括向发酵肉汤、制剂或组合物中添加FFA释放酶的抑制剂。
如段落[0042]所述的方法，其中该FFA释放酶的抑制剂是在其催化结构域中包含丝氨酸残基的FFA释放酶的抑制剂。
如段落[0040]或[0041]所述的方法，其中该降低该FFA释放酶的产量和/或活性包括从该FFA释放酶活性中纯化该重组组分和/或从该重组组分中纯化该FFA释放酶。
如段落[0044]所述的方法，其中从该重组组分中纯化该FFA释放酶包括使用基于活性的蛋白质谱分析(activity-based protein profiling，ABPP)小分子探针。
在各个方面，本文提供了一种用于生产重组组分的方法，其中该方法包括在适合于生产重组组分的条件下，在培养基中发酵如段落[0010-0037]中任一项所述的重组宿主细胞。
如段落[0046]所述的方法，其中该方法还包括纯化该重组组分以获得包含该重组组分的制剂；和/或后处理该重组组分。
如段落[0047]所述的方法，其中该纯化包括纯化以获得包含纯度大于90％的重组组分的制剂。
如段落[0047]所述的方法，其中该后处理包括喷雾干燥或浓缩该重组组分以获得粉末。
在各个方面，本文提供了一种包含重组组分的组合物，其中该组合物通过如段落[0038-0045]中任一项所述的方法生产。
如段落[0050]所述的组合物，其中该组合物包含以干质量计在约0.1％与约100％之间的重组组分。
如段落[0050]所述的组合物，其中该组合物是食物产品。
如段落[0052]所述的组合物，其中该组合物是补充的食物产品。
如段落[0053]所述的组合物，其中该组合物是补充的乳制品。
如段落[0053]所述的组合物，其中该组合物是补充的蛋制品。
如段落[0052]所述的组合物，其中该组合物是替代食物产品。
如段落[0056]所述的组合物，其中该组合物是替代乳制品。
如段落[0057]所述的组合物，其中该组合物是替代蛋制品。
如段落[0050]所述的组合物，其中该组合物是化妆品或个人护理产品。
如段落[0050-0059]中任一项所述的组合物，其中该重组组分是重组蛋白。
如段落[0060]所述的组合物，其中该组合物基本上不含除该重组蛋白之外的任何蛋白质。
如段落[0060]所述的组合物，其中该组合物基本上不含除该重组蛋白之外的任何重组蛋白。
如段落[0060]所述的组合物，其中该重组蛋白是重组乳蛋白。
如段落[0063]所述的组合物，其中该组合物基本上不含除该重组乳蛋白之外的任何蛋白质。
如段落[0063]所述的组合物，其中该组合物基本上不含除该重组乳蛋白之外的任何重组蛋白。
在各个方面，本文提供了一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码FFA释放酶的重组表达构建体，并且该重组宿主细胞与对应的宿主细胞相比包含增加的FFA释放酶产量和/或活性。
如段落[0066]所述的重组宿主细胞，其中该FFA释放酶选自包含以下的FFA释放酶：UniProt序列#G0RH85、G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、G0RVD2或G0R8A6、或它们的同源物。
如段落[0066]或[0067]所述的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞来源于细菌、酵母或丝状真菌。
如段落[0068]所述的重组宿主细胞，其中该丝状真菌选自曲霉属(例如，黑曲霉)、木霉属(例如，里氏木霉、桔绿木霉)或毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)。
如段落[0066-0069]中任一项所述的重组宿主细胞，其中该增加的该FFA释放酶产量和/或活性是产量和/或活性增加至少50％。
在各个方面，本文提供了一种用于产生FFA释放酶的方法，其中该方法包括：获得如段落[0066-0070]中任一项所述的重组宿主细胞，在适合于该FFA释放酶产生和/或分泌的条件下在培养基中培养该重组宿主细胞，以及任选地纯化该FFA释放酶。
附图说明
将通过使用附图，以附加的特性和细节来描述和说明示例性实施方案，其中：
图1A和1B提供了箱线图，其示出了根据本发明的各种实施方案对产生重组蛋白(即，重组β-乳球蛋白)的里氏木霉宿主细胞进行RNAseq分析以确定G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4转录物的存在的结果，其中图1B提供了图1A所示的G0RGQ0图的详细视图。FPKM＝片段数/千碱基转录物/百万作图读段。
图2是条形图，其示出了根据本发明的各种实施方案在不存在(样品1)或存在(样品2)Thermo ActivX TAMRA-FP氟膦酸盐(在其催化结构域中包含丝氨酸残基的水解酶的抑制剂)的情况下，在重组蛋白(即，重组β-乳球蛋白)制剂中所包含的对苯基(pNP)酰基酯水解活性，显示了FFA释放活性的去除。活性单位U/g＝微摩尔pNP形成/小时/克重组蛋白；酰基基团：C4＝丁酸酯，C8＝辛酸酯，C12＝月桂酸酯，以及C16＝棕榈酸酯。
图3是根据本发明的各种代表性实施方案，用于生产能够产生G0RGQ0、G0RLH4或G0RMI3蛋白的重组宿主细胞的重组载体的图。
图4是根据本发明的各种代表性实施方案，用于生产能够产生G0RGQ0、G0RLH4或G0RMI3蛋白的重组宿主细胞的重组载体的图。
图5A示出了根据本发明的各种代表性实施方案，在4个独立的重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)转化体的发酵液中包含的重组G0RMI3蛋白的Western印迹，图5B示出了由3个独立的重组里氏木霉转化体产生的重组G0RGQ0的SDS PAGE凝胶，并且图5C示出了由3个独立的重组里氏木霉转化体产生的重组G0RLH4的SDS PAGE凝胶。
图6是根据本发明的各种代表性实施方案，在存在(带框)或不存在(不带框)G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白的情况下包含罗丹明B的24孔板的UV照射孔的照片。
图7是根据本发明的各种代表性实施方案，用于生产重组宿主细胞的靶向载体的图，该重组宿主细胞包含消除的G0RH85、G0RMI3、G0RGQ0和/或G0RLH4蛋白的FFA释放活性。
具体实施方式
本发明随后的讨论是为了说明和描述的目的而呈现的，而不意图将本发明的范围限制于本文所公开的实施方案。因此，所公开的实施方案的变化和修改在本发明的范围内，例如，在理解本公开之后，可能在本领域技术人员的技能和知识范围内。意图获得在允许的程度上包括替代实施方案(包括与本文所公开的结构、功能、范围或步骤交替的、可互换的和/或等同的那些)的权利，并且不意图公开献出任何可专利的主题。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
定义
除非在此另外指出或与上下文明显矛盾，否则如本文所用的术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的参考词指单数和复数(例如，意指“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”)。例如，术语“化合物”与术语“至少一种化合物”和“一种或多种化合物”同义，并且可以指单一化合物或多种化合物(包括它们的混合物)。
如本文所用的术语“和/或”是指彼此组合或互斥的多个组分。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“(x和z)或y”、“(y和z)或x”、单独的“x和y”、单独的“x和z”、单独的“y和z”、或“x或y或z”。
如本文所用的术语“至少”或“一个/种或多个/种”是指一个/种、两个/种、三个/种、四个/种、五个/种、六个/种、七个/种、八个/种、九个/种、十个/种、至少一个/种、至少两个/种、至少三个/种、至少四个/种、至少五个/种、至少六个/种、至少七个/种、至少八个/种、至少九个/种、至少十个/种或更多个/种或所有随后列出的要素。
如本文在多核苷酸的上下文中使用的术语“编码”是指包含编码序列的多核苷酸，当该编码序列置于适当的调控序列的控制下时被转录成可翻译成多肽的mRNA。编码序列通常起始于起始密码子(例如，ATG)，并且终止于终止密码子(例如，UAA、UAG和UGA)。编码序列可以含有单个开放阅读框，或几个开放阅读框(例如，被内含子分开)。
如本文所用的术语“内源的”是指在所描述的上下文中天然存在的物质。当用于指由细胞产生的蛋白质时，该术语暗示该蛋白质是由该细胞天然产生的。当用于指在细胞中包含的多核苷酸时，该术语暗示该多核苷酸天然包含在该细胞中(例如，存在于天然细胞中；或者位于天然细胞中相同的基因组位置)。
如本文所用的术语“FFA释放酶活性”或“FFA释放酶的活性”是指能够水解导致游离脂肪酸(FFA)释放的键(例如，水解酯键)的酶的活性。FFA释放酶被指定为酶委员会编号(EC编号)3.1。这些术语在本文可互换使用。
如本文所用的术语“基本上不含”是指所指示的组分不能通过常规分析方法在所指示的组合物中被检测到，或者所指示的组分以不发挥功能的这样的痕量存在。如本文中所用的术语“功能”是指不实质上促成包含痕量的所指示的组分的组合物的性质，或在包含痕量的所指示的组分的所指示的组合物中不具有实质活性(例如，化学活性、酶活性)，或在使用或消耗包含痕量的所指示的组分的组合物后不具有对健康不利的影响。如本文所用的术语“实质上促成”是指所指示的组分促成组合物的属性达到这样的程度，即在不存在该组分的情况下(例如，在除了缺乏所指示的组分之外与该组合物相同的参考组合物中)，该属性的存在/活性/可测量值低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
如本文所用的术语“发酵液”是指包含能够产生重组组分的重组宿主细胞的培养物。
如本文所用的术语“丝状真菌”是指来自真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人,在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义的)亚门的丝状形式的生物体。丝状真菌与酵母的区别在于其在营养生长期间的菌丝伸长。
如本文所用的术语“真菌”是指子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及Chythridiomycota、卵菌门和球囊菌门(Glomeromycota)的生物。但是，可以理解的是，真菌分类法正在不断发展，因此将来可能会调整真菌界的这一特定定义。
如本文所用的术语“异源的”是指在所描述的上下文中不是天然存在的。当用于指由细胞产生的蛋白质时，该术语暗示该蛋白质不是由该细胞天然产生的。当用于指在细胞中包含的多核苷酸时，该术语暗示该多核苷酸不是天然包含在细胞中(例如，不存在于天然细胞中；或者不位于天然细胞中的基因组位置，无论异源多核苷酸本身是内源的(来源于相同细胞或其后代)还是外源的(来源于不同细胞或其后代)。
如本文所用的术语“同源物”是指如下蛋白质，该蛋白质包含与参考蛋白质中所包含的相似长度(即，长度在查询氨基酸序列的长度的+/-20％以内)的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％)相同的氨基酸序列，并且具有与参考蛋白质相似(例如，在50％以内、40％以内、30％以内、20％以内或10％以内)或相同的功能性质。该术语包括蛋白质的多态变体、种间同源物(例如，直系同源物)、旁系同源物和等位基因、以及使用基因工程技术人工制造的变体。
如本文所用的术语“宿主细胞”不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代实际上可能与受试细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用的在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的上下文中的术语“同一性”或“相同的”是指当两个或更多个多核苷酸或多肽序列分别进行最大对应比对时核苷酸或氨基酸残基是相同的。取决于应用,“同一性”可以存在于被比较序列的区域上(例如，在功能结构域的长度上)或在序列的全长上。“区域”被认为是至少6、9、14、19、24、29、34、39或更多个核苷酸或至少2、6、10、14、18、22、26、30或更多个氨基酸的连续区段。为了比较，通常一个序列充当参考序列，一个或多个测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于所指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方法来进行：例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(威斯康星大学生物技术中心(University of Wisconsin Biotechnology Center)的遗传计算机组(GCG)的序列分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，它们可以与默认参数一起使用)或通过视觉检查(一般参见Ausubel等人，见下文)。适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法(参见例如，Altschul等人[1990]J.Mol.Biol.215:403-410；Gish和States.[1993]Nature Genet.3:266-272；Madden等人[1996]Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul等人[1997]Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang 7Madden.[1997]Genome Res.7:649-656)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。
如本文所用的术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“携带”或它们的变体旨在以类似于术语“包含”的方式是包含性的。
在本文中与FFA释放酶活性一起使用的术语“未调节的”是指缺乏FFA释放酶活性和/或表达的改变(例如，FFA释放酶的浓度或其对底物的酶活性没有变化)。
本文中与FFA释放酶活性一起使用的术语“调节的”是指FFA释放酶活性的任何改变。这种调节的FFA释放酶活性通常是由于FFA释放酶浓度的增加或减少、或者FFA释放酶对底物的酶活性的增加或减少。例如，该术语可以指活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。可替代地，该术语可以指活性增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1,000％。
如本文所用的术语“天然的”是指在自然界中发现的其未修饰的状态(例如，未被人类遗传修饰并且被维持在人类未定义的条件下[例如，充氧水平、pH、盐浓度、温度和营养素(例如，碳、氮、硫)可用性]的细胞)。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指允许它们在功能上相关的元件排列。例如，如果启动子序列控制蛋白质编码序列的转录，则该启动子序列与该蛋白质编码序列可操作地连接，并且如果分泌信号序列指导蛋白质通过细胞的分泌系统，则该分泌信号序列与该蛋白质可操作地连接。“可操作地连接的”元件可以与另一个元件连续连接，或者与另一个元件以反式或间隔一定距离起作用。可以可操作地连接的功能的非限制性实例包括转录控制、翻译控制、蛋白质折叠和蛋白质分泌。
如本文所用的术语“一个/种或多个/种”是指一个/种、至少一个/种、两个/种、三个/种、四个/种、五个/种、六个/种、七个/种、八个/种、九个/种、十个/种或更多个/种或所有随后列出的要素。
如本文所用的术语“任选的”或“任选地”是指特征或结构存在或不存在，或者事件或情况发生或不发生。该描述包括其中存在特征或结构的实例以及其中不存在特征或结构的实例，或者其中事件或情况发生的实例以及其中事件或情况没有发生的实例。
如本文所用的术语“植物蛋白”、“动物蛋白”和“微生物蛋白”是指包含分别与植物、动物或微生物(即,单细胞生物体，包括所有细菌、古生菌、单细胞原生生物、单细胞动物、单细胞植物、单细胞真菌、单细胞藻类、原生动物和假菌界(chromista))中天然发现的蛋白质(即分别为植物细胞、动物细胞或微生物细胞天然的蛋白质)中的氨基酸序列至少80％(例如，至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的具有至少20个(例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个或至少150个，以及通常不超过250个)氨基酸的序列的多肽。
如本文所用的术语“多核苷酸”是指至少2个(例如，至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少500个、至少1,000个)核苷酸的聚合形式。该术语包括DNA分子(例如，cDNA、基因组DNA、合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA、合成RNA)以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键和/或化学修饰的DNA或RNA类似物的有义链和反义链。多核苷酸可被化学或生物化学修饰，或可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记；甲基化；用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯)、悬垂部分(例如，多肽)、嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素)、螯合剂、烷基化剂和经修饰的连接(例如，α异头核酸)。修饰的核苷酸的实例在本领域中已有描述(参见例如，Malyshev等人2014.Nature 509:385；Li等人2014.J.Am.Chem.Soc.136:826)。还包括了在其通过氢键合和其他化学相互作用与指定序列结合的能力的方面模拟多核苷酸的合成分子。这样的分子是本领域已知的，并且包括例如其中肽键联替代分子主链中的磷酸键联的分子。其他修饰可以包括例如其中核糖环含有桥接部分或其他结构(诸如在“锁式”多核苷酸中发现的修饰)的类似物。多核苷酸可以是任何拓扑构象的。例如，多核苷酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、分支的、发夹状的、环状的或呈挂锁构象。如本文所用的术语“多核苷酸序列”是指包含在多核苷酸中或组成多核苷酸的核苷酸序列。
如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”可以互换，并且是指至少2个(例如，至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个)氨基酸的天然存在的或天然不存在的聚合形式。“多肽”或“蛋白质”可以具有活性结构或缺乏功能结构，包含编码和/或非编码的氨基酸，包含天然存在的氨基酸和/或天然不存在的氨基酸，包含化学修饰的和/或生物化学修饰的和/或衍生的氨基酸，包含未修饰和/或修饰的肽主链，和/或为单体(即，具有单链)或聚合体(即，具有两条或更多条链，它们可以共价或非共价结合)。如本文所用的术语“氨基酸序列”是指包含在“多肽”或“蛋白质”中的氨基酸序列，或组成“多肽”或“蛋白质”的氨基酸序列。
如本文所用的术语“制剂”是指在将重组组分与发酵液的一种或多种其他组分分离后获得的制剂。例如，制剂可以是澄清的发酵液(即，去除了细胞和细胞碎片的发酵液)。
如本文所用的术语“启动子序列”是指在细胞中指导下游多核苷酸转录的多核苷酸。启动子序列可以包括转录起始位点附近的必需核苷酸，诸如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子序列也可以任选地包括远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于距离转录起始位点多至几千个碱基对的位置。
如本文所用的术语“纯化”或“纯化的”或“分离”或“分离的”是指基本上与该组分所来源的化学物质、细胞组分和细胞(例如，细胞壁、膜脂、染色体、其他蛋白质、生物体中的其他细胞)分离的组分。该组分可以是至少60％纯的，例如大于65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％纯的。该术语不要求(尽管允许)该组分与所有化学物质、细胞组分和细胞分离。
如本文所用的术语“重组组分”是指重组产生的组分(即，在重组宿主细胞中产生，或由重组多核苷酸合成)。重组组分的非限制性实例包括重组蛋白(例如，微生物蛋白、植物蛋白(例如，豌豆蛋白(例如，豆球蛋白、蚕豆球蛋白(vicillin)、covicillin))、马铃薯蛋白(例如，马铃薯球蛋白(tuberin)、蛋白酶抑制剂标记II)、动物蛋白(例如，结构蛋白(例如，胶原蛋白、原弹性蛋白、弹性蛋白)、乳蛋白、卵蛋白(例如，卵清蛋白、卵类粘蛋白(hereinovomucoid)、卵清蛋白、卵转铁蛋白、G162M F167A卵类粘蛋白、卵球蛋白G2、卵球蛋白G3、α-卵粘蛋白、β-卵粘蛋白、溶菌酶、卵类粘蛋白抑制剂、卵糖蛋白、黄素蛋白、卵巨球蛋白、卵固蛋白、胱抑素(cystatin)、抗生物素蛋白、卵清蛋白相关蛋白X、卵清蛋白相关蛋白Y))、脂质、碳水化合物、小分子、食品添加剂(例如，甜味剂)、食品补充剂(例如，维生素)、营养保健品(neutraceutical)和益生菌。
如本文所用的术语“重组蛋白”是指在重组宿主细胞中产生的蛋白质，或由重组多核苷酸合成的蛋白质。
如本文所用的术语“重组微生物宿主细胞”是指包含重组多核苷酸的微生物细胞。因此，例如，重组宿主细胞可以产生在宿主细胞的天然(非重组)形式中未发现的多核苷酸或多肽，或者重组宿主细胞可以产生与宿主细胞的天然(非重组)形式不同水平的多核苷酸或多肽。应当理解，这样的术语旨在不仅指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代可能与受试细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“重组宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是培养物中生长的分离细胞或细胞系，或者可以是属于活组织或生物体中的细胞。
如本文所用的术语“重组多核苷酸”是指从其天然存在的环境中移出的多核苷酸，不与全部或部分当在自然界中发现多核苷酸时与该多核苷酸邻接或邻近的多核苷酸相关联的该多核苷酸，与其在自然界中未连接的多核苷酸可操作地连接的多核苷酸，或在自然界中未发现的多核苷酸，或含有在天然多核苷酸中未发现的修饰的多核苷酸(例如，人工(例如，通过人为干预)引入的插入、缺失或点突变)，或在异源位点整合到染色体中的多核苷酸。该术语可以用于例如描述克隆的DNA分离物或包含化学合成的核苷酸类似物的多核苷酸。如果多核苷酸包含非天然存在的遗传修饰，则其也被视为“重组的”。例如，如果内源多核苷酸包含人工(例如，通过人为干预)引入的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代，则将其视为“重组多核苷酸”。这样的修饰可以将点突变、取代突变、缺失突变、插入突变、错义突变、移码突变、重复突变、扩增突变、易位突变或倒位突变引入多核苷酸。该术语包括宿主细胞染色体中的多核苷酸，以及不在宿主细胞染色体中的多核苷酸(例如，附加体中包含的多核苷酸)。宿主细胞或生物体中的重组多核苷酸可以使用宿主细胞的体内细胞机制进行复制；然而，这种重组多核苷酸尽管随后在细胞内复制，但出于本发明的目的仍被视为重组体。
如本文所用的术语“调控元件”是指介导、调节或调控与调控元件可操作地连接的多核苷酸的表达(例如，转录、转录后事件、翻译)的多核苷酸序列。调控元件的非限制性实例包括启动子序列、终止序列、转录起始序列、翻译起始序列、翻译终止序列、增强子序列、激活子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、上游激活序列(UAS)、内含子、操纵子(即，与启动子相邻的核酸序列，其包含阻遏蛋白可以结合并降低或消除启动子活性的蛋白质结合结构域)、有效的RNA加工信号(例如，剪接信号、聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点[例如，Shine-Dalgarno序列])、增强蛋白质稳定性的序列、增强蛋白质分泌的序列以及它们的组合。
如本文所用的术语“分泌(secrete/secretion)”和“分泌的”是指蛋白质穿过产生蛋白质的细胞的细胞膜和/或细胞壁输出到细胞外环境的过程。如本文所提供，这种分泌可以主动或被动发生。
如本文所用的术语“分泌信号”是指与蛋白质的N末端可操作地连接并且介导蛋白质通过产生(即，合成)蛋白质的宿主细胞的细胞内分泌途径递送到宿主细胞外部的肽。通常，重组蛋白与分泌信号的可操作连接需要去除编码重组蛋白的多核苷酸序列的起始密码子。
如本文所用的术语“两个/种或更多个/种”是指两个/种、三个/种、四个/种、五个/种、六个/种、七个/种、八个/种、九个/种、十个/种或更多个/种或所有随后列出的要素。
如本文所用的术语“载体”是指可以携带待引入宿主细胞中的多核苷酸序列的核酸。载体的非限制性实例包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、病毒载体、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒颗粒(例如，包含异源多核苷酸)、DNA构建体(例如，通过克隆或PCR扩增产生的)以及线性双链分子(例如，PCR片段)。某些载体能够在将它们引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有在宿主细胞中起作用的复制起点的载体)。其他载体可以在引入到宿主细胞中后被整合到宿主细胞的基因组中，并因此与宿主基因组一起复制。
如本文所用的术语“酵母”是指酵母菌目(Saccharomycetales)的任何生物体。酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽/起泡进行的，并且碳分解代谢可能是发酵性的。
除非本文中另有说明，否则本文中值的范围的叙述仅旨在用作单独提及落入包括所述最小值和最大值的范围内的每个单独值(分数或整数)的速记方法，并且每个单独值都被并入本说明书中，如同其在本文中被单独叙述一样。此外，应该理解，本文叙述的任何数值范围旨在包括其中所包含的所有子范围。例如,“1至10”的范围旨在包括在所述最小值1和所述最大值10之间的所有子范围，即，具有等于或大于1的最小值和小于或等于10的最大值。还应该理解，下面描述的所有范围和数量都是近似值，并且不旨在限制本发明。
应当理解，在本文所公开的任何方法中，只要本发明保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序并不重要。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。
用于生产包含重组组分的组合物的方法
在各个方面，本文提供了一种用于生产包含由能够产生重组组分的重组宿主细胞产生的重组组分(例如，本文所公开的任何重组组分)的组合物的方法，其中该方法包括调节FFA释放酶的活性(例如，本文所公开的任何一种FFA释放酶的活性或本文所公开的两种或更多种FFA释放酶的任何组合的活性)。
在本文所提供的方法中调节FFA释放酶的活性可以在任何单一步骤中或者在两个或更多个步骤的任何组合中进行，从而提供调节的FFA释放酶活性。合适步骤的非限制性实例包括：i)在适合于调节FFA释放酶活性的发酵条件下培养重组宿主细胞；ii)调节发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性；iii)从由重组宿主细胞产生的FFA释放酶活性中纯化重组组分，和/或从重组组分中纯化FFA释放酶活性；和/或iv)获得由重组宿主细胞产生的包含经调节的FFA释放酶活性的重组组分。
适合于调节FFA释放酶活性的发酵条件
根据以上任一项所述的方法可以包括：a)获得能够产生重组组分的重组宿主细胞；和b)在培养基中在适合于生产和/或分泌重组组分并适合于调节FFA释放酶活性的发酵条件下培养重组宿主细胞。
适合于调节FFA释放酶活性的条件可以是例如重组宿主细胞调节其FFA释放酶活性产生的条件。此类条件的非限制性实例包括合适的pH、合适的温度、合适的进料速率、合适的压力、合适的流体剪切力、合适的营养素类型和/或量(例如，合适的碳含量、合适的氮含量、合适的磷含量)、合适的培养补充物类型和/或量、合适的痕量金属类型和/或量和/或合适的充氧水平。
合适的pH可以是在2与7.5、6.5、6、5,5、5、4.5、4、3.5、3或2.5之间；在2.5与7.5、6.5、6、5,5、5、4.5、4、3.5或3之间；在3与7.5、6.5、6、5,5、5、4.5、4或3.5之间；在3.5与7.5、6.5、6、5,5、5、4.5、4之间；在4与7.5、6.5、6、5,5、5、4.5之间；在4.5与7.5、6.5、6、5,5、5之间；在5与7.5、6.5、6、5,5之间；在5.5与7.5、6.5、6之间；在6与7.5、6.5之间；在6.5与7.5或7之间；或在7与7.5之间的pH。
合适的培养补充物类型可以是消泡剂。合适的消泡剂的非限制性实例包括Struktol J 673A(Schill&Seilacher GmbH，Hamburg,Germany)，Industrol DF204(BASFCanada，Inc.，Mississauga,Canada)，聚乙二醇P-2000(Dow，Midland，MI)，Hodag K-60K(Hodag Chemical Corp.,Chicago,IL)和Erol DF6000K(PMC Ouvrie,Carvin,France)，ACP1500(Dow Chemical Company,Midland,MI)，消泡剂204(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)，SAG 471(Momentive Performance Materials Inc.,Waterford,NY)，SAG 5693(MomentivePerformance Materials Inc.,Waterford,NY)，SAG 710(Momentive PerformanceMaterials Inc.,Waterford,NY)，SAG 730(Momentive Performance Materials Inc.,Waterford,NY)，硅酮消泡剂，Struktol J647(Schill&Seilacher,Hamburg,Germany)和向日葵油。
调节发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性
根据以上任一项所述的方法可以包括：i)获得能够产生重组组分的重组宿主细胞；ii)在培养基中在适合于生产和/或分泌重组组分的条件下培养重组宿主细胞，以获得包含重组组分的发酵液；iii)任选地从发酵液中纯化重组组分，以获得包含重组组分的制剂；和iv)调节包含重组组分的发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性。
可以通过例如向发酵液、制剂或组合物中添加FFA释放酶抑制剂来调节发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性。合适的FFA释放酶抑制剂的非限制性实例包括合成抑制剂(例如，膦酸酯、硼酸、脂质类似物)；以及分离自例如来源诸如欧洲刺柏(Juniperuscommunis)、八角茴香(Illicium religiosum)、竹节参(Panax japonicus rhizome)、人参(Panax ginseng)、西洋参(Panax quinquefolius)、刺五加(Acanthopanax senticosus)、中华山茶中国变种(Camellia sinensis var.sinensis)、普洱茶阿萨姆变种(Camelliasinensis var.assamica)、地肤(Kochia scoparia)、桔梗(Platycodi radix)、网状五层龙(Salacia reticulate)、荷花(Nelumbo nucifera)、旱柳(Salix matsudana)、野黍(Eriochloa villosa)、网状五层龙(Salacia reticulate)、华北蓝盆花(Scabiosatschiliensis Grun)和短梗五加(Acanthopanax sessiliflorous)的天然抑制剂(例如，β-内酯(诸如缬氨内酯、厄比内酯(ebelactone)A和B、和韧革菌素(vibralactone))、甘露寡糖、乙酰胆碱酯酶抑制剂、胆碱酯酶抑制剂、多酚、皂苷、潘克里新(panclicins)、橙皮苷、蕨藻炔(caulerpenyne)、原花青素、奥利司他(Xenical)、鼠尾草酸、七叶素、藏红花素、藏红花酸、绿原酸、新绿原酸、阿魏酰奎尼酸、e-聚赖氨酸、壳聚糖、几丁质)。在一些实施方案中，通过向发酵液、制剂或组合物中添加在其催化结构域中包含丝氨酸残基的FFA释放酶的抑制剂(例如，抑制剂Thermo ActivX TAMRA-FP氟膦酸盐)来调节FFA释放酶活性。在其催化结构域中包含丝氨酸残基的FFA释放酶的非限制性实例包括G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5和G0RKH7。
也可以通过例如分别从发酵液、制剂或组合物中去除和/或向其中添加FFA释放酶活性所需的辅因子和/或FFA释放酶抑制剂活性所需的辅因子来调节发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性。此类辅因子的非限制性实例包括金属(例如，二价阳离子，诸如钙)，其可以例如用螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)去除。
也可以通过例如热处理或非热处理来调节发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性。热处理的非限制性实例包括巴氏灭菌(pasteurizing)和消毒(sterilizing)。非热处理的非限制性实例包括高压巴氏灭菌(即，高压处理，HPP)、超声处理、脉冲电场处理和辐照。在一些实施方案中，通过在高温下将发酵液、制剂或组合物孵育相对短的时间段(例如，在85℃与90℃之间的温度持续5与10分钟之间的时间)来基本上消除或降低发酵液、制剂或组合物中的FFA释放酶活性。
从FFA释放酶活性中纯化重组组分
根据以上任一项所述的方法可以包括：i)获得能够产生重组组分的重组宿主细胞；ii)在培养基中在适合于产生和/或分泌重组组分的条件下培养重组宿主细胞，以获得包含重组组分的发酵液；和iii)从FFA释放酶活性中纯化重组组分和/或从重组组分中纯化FFA释放酶，以获得包含重组组分的制剂。
从FFA释放酶活性中纯化重组组分可以基于将重组组分与FFA释放酶区分开的任何一种特性，或基于连续(例如，基于电荷的分离，然后基于疏水性的分离；基于疏水性的分离，然后基于pH稳定性的分离)或平行(例如，基于pH稳定性和不耐热性/热稳定性的分离，基于pH稳定性和对特定分子的亲和力的分离；基于溶解度和pH稳定性和/或不耐热性/热稳定性和/或pI的分离)使用的两种或更多种此类特性的组合来实现。
例如，可以将包含重组组分的发酵液或制剂加热至一定温度，在该温度下FFA释放酶变性并且从溶液中沉淀出来，但在该温度下重组组分保持结构完整和可溶。随后可以通过任何合适的方法将沉淀的FFA释放酶与可溶性重组组分分离，该方法包括1-g沉降、通过离心加速沉降、和/或多种过滤技术(包括但不限于深度过滤或切向流过滤、使用滤垫、片材或膜)。
作为另一个实例，可以将合适的色谱支持物添加到包含重组组分的发酵液或制剂中，并且可以调节条件(例如，pH和/或离子强度)，使得FFA释放酶或重组组分(但不是两者)结合色谱支持物(例如，基于电荷或疏水性)，分别在未结合的部分留下可溶性重组组分或FFA释放酶。合适的色谱支持物的非限制性实例包括苯基琼脂糖，丁基琼脂糖和辛基琼脂糖。随后可以通过本领域已知的任何合适的方法，包括但不限于1-g沉降、离心或过滤，分别将具有结合的FFA释放酶或重组组分的色谱支持物与可溶性重组组分或FFA释放酶分离。可替代地，色谱支持物可以是固定支持物(例如，柱中的吸附剂)，通过该固定支持物使包含重组组分的发酵液或制剂行进并且在未结合的部分中获得该重组组分，而FFA释放酶结合至色谱支持物；或者重组组分结合到色谱支持物上，而FFA释放酶保留在未结合的部分中，随后通过调节条件将结合的重组组分从色谱支持物上释放出来。
作为另一个实例，可以将抗衡离子或离子交换树脂或钠酸盐添加到包含重组组分的发酵液或制剂中，并且可以调节发酵液或制剂的pH和/或离子强度，使得抗衡离子或离子交换树脂或钠酸盐与重组组分或FFA释放酶形成复合物，分别留下可溶性FFA释放酶或重组组分。随后可以通过本领域已知的任何合适方法分离复合物，包括1-g沉降，通过离心加速沉降，和/或使用滤垫、片材或膜的多种过滤技术，包括但不限于深度过滤或切向流过滤。在重组组分与抗衡离子或离子交换树脂或钠酸盐复合的实施方案中，可以通过调节条件(例如，调节pH和/或离子强度)从复合物中提取重组组分。
作为另一个实例，可以调节包含重组组分的发酵液或制剂的pH，使得FFA释放酶变性并从溶液中沉淀出来，留下可溶性重组组分。随后可以通过任何合适的方法将沉淀的FFA释放酶与可溶性重组组分分离，该方法包括但不限于1-g沉降，通过离心加速沉降，和/或使用滤垫、片材或膜的多种过滤技术，包括但不限于深度过滤或切向流过滤。
作为另一个实例，可以将基于活性的蛋白质谱分析(ABPP)小分子探针添加到包含重组组分的发酵液或制剂中。探针可以结合在其催化结构域中包含丝氨酸残基的FFA释放酶。当ABPP与FFA释放酶结合时，结合的FFA释放酶可以通过第二种特异性亲和结合来固定，这可以导致从重组组分中去除FFA释放酶。ABPP的非限制性实例包括生物素化的氟膦酸盐(例如，ActivXTM脱硫生物素-氟膦酸盐丝氨酸水解酶探针(DTB-FP))，其中膦酸盐部分可以共价结合至FFA释放酶的催化结构域中的亲核丝氨酸，并且其中生物素部分可以与亲和素化的琼脂糖相互作用，从而允许反应的FFA释放酶的固定(例如，至琼脂糖珠)以及通过离心、过滤和/或其他可溶-不可溶分离方法的物理分离。
FFA释放酶活性
如本文所提供的经调节的FFA释放酶活性(例如，在包含重组组分的发酵液或制剂中包含或在本文所提供的能够产生重组组分的重组宿主细胞中包含的经调节的FFA释放酶活性)可以是任何一种FFA释放酶或两种或更多种FFA释放酶的任何组合的经调节的活性。
合适的FFA释放酶的非限制性实例包括羧酸酯水解酶(EC编号3.1.1)、磷酸二酯水解酶(EC编号3.1.4)、核糖核酸外切酶(EC编号3.1.13)、羧酸酯酶(EC编号3.1.1.1)、芳基酯酶(EC编号3.1.1.2)、三酰基甘油脂肪酶(EC编号3.1.1.3)、磷脂酶A2(EC编号3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC编号3.1.1.5)、乙酰酯酶(EC编号3.1.1.6)、乙酰胆碱酯酶(EC编号3.1.1.7)、甘油磷酰胆碱磷酸二酯酶(EC编号3.1.4.2)、磷脂酶C(EC编号3.1.4.3)、磷脂酶D(EC编号3.1.4.4)、磷酸肌醇磷脂酶C(EC编号3.1.4.11)、糖基磷脂酰肌醇磷脂酶D(EC编号3.1.4.50)、N-酰基磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D(EC编号3.1.4.54)、果胶酯酶(EC编号3.1.1.11)、葡糖酸内酯酶(EC编号3.1.1.17)、酰基甘油脂肪酶(EC编号3.1.1.23)、3-氧代已二酸烯醇内酯酶(EC编号3.1.1.24)、1,4-内酯酶(EC编号3.1.1.25)、半乳糖脂酶(EC编号3.1.1.26)、磷脂酶A1(EC编号3.1.1.32)、脂蛋白脂酶(EC编号3.1.1.34)、头孢菌素C去乙酰化酶(EC编号3.1.1.41)、羧甲烯丁烯羟酸内酯酶(EC编号3.1.1.45)、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶(EC编号3.1.1.57)、乙酰木聚糖酯酶(EC编号3.1.1.72)、阿魏酸酯酶(EC编号3.1.1.73)、角质酶(EC编号3.1.1.74)、激素敏感性脂肪酶(EC编号3.1.1.79)、棕榈酰蛋白水解酶(EC编号3.1.2.22)、环氧化物水解酶(EC编号3.3.2.3)、神经酰胺酶(EC编号3.5.1.23)、白三烯-A4水解酶(EC编号3.3.2.6)、肝氧蛋白-环氧化物水解酶(EC编号3.3.2.7)、柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶(EC编号3.3.2.8)、微粒体环氧化物水解酶(EC编号3.3.2.9)、水溶性环氧化物水解酶(EC编号3.3.2.10)、胆固醇-5,6-氧化物水解酶(EC编号3.3.2.11)、脂肪酸酰胺水解酶(EC编号3.5.1.99)和脂氧合酶(E.C.1.13.11)。
合适的FFA释放酶的非限制性实例包括表1中列出的任何FFA释放酶及其同源物、以及包含表2中列出的任何一个InterPro结构域的FFA释放酶。
表1–示例性FFA释放酶(UniProt序列ID)
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表2：示例性FFA释放酶催化结构域的InterPro编号
IPR002168 IPR017915 IPR003187 IPR038885 IPR008265
IPR033140 IPR001087 IPR004961 IPR039097 IPR033112
IPR000675 IPR001531 IPR007000 IPR039180 IPR033113
IPR002641 IPR003633 IPR007942 IPR008947 IPR001423
IPR002642 IPR007751 IPR009613 IPR036541 IPR009535
IPR002921 IPR008475 IPR010711 IPR033560 IPR026605
IPR001711 IPR010468 IPR011402 IPR033562 IPR028382
IPR001736 IPR013818 IPR012354 IPR033902 IPR028407
IPR000909 IPR014815 IPR016272 IPR034315 IPR032075
IPR005592 IPR015359 IPR016338 IPR037737 IPR032588
IPR006693 IPR016090 IPR016445 IPR038875 IPR033556
IPR025202 IPR017913 IPR016674 IPR001211 IPR033903
IPR003140 IPR017914 IPR017186 IPR001981 IPR033906
IPR011150 IPR024632 IPR017766 IPR002330 IPR035547
IPR015679 IPR025920 IPR017767 IPR002331 IPR035669
IPR016555 IPR029002 IPR017769 IPR002333 IPR000734
IPR021771 IPR032093 IPR020009 IPR002334 IPR001028
IPR001192 IPR032341 IPR025483 IPR036444 IPR036691
IPR024884 IPR016035 IPR002918 IPR005152 IPR015141
IPR001446 IPR004126 IPR001885 IPR000801 IPR027433
IPR020833 IPR020834 IPR013819 IPR000907 IPR001246
两种或更多种FFA释放酶的组合的非限制性实例包括：一种或多种角质酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种磷脂酶C；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种α/β水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种α/β水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种α/β水解酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种磷脂酶C和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种GDSL脂肪酶,和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶A2和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种磷脂酶C和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种乙酰酯酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种α/β水解酶和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种α/β水解酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子和一种或多种其他羧酸酯水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种溶血磷脂酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种磷脂酶A2；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种三酰基甘油脂肪酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种磷脂酶C；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶A2和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰木聚糖酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种磷脂酶C和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰木聚糖酯酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种乙酰酯酶；一种或多种角质酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种胞外脂肪酶样蛋白质和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种GDSL脂肪酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种乙酰酯酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种α/β水解酶；一种或多种角质酶和一种或多种GDSL脂肪酶和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子；以及一种或多种角质酶和一种或多种含有α/β水解酶折叠结构域的蛋白质和一种或多种调节FFA释放酶表达的转录因子。
在根据以上任一项所述方法中，包含重组组分的发酵液或制剂或能够产生重组组分的重组宿主细胞可以是FFA释放酶活性的组合和/或水平，其提供了可用于产生所需组合物的所需FFA释放酶活性谱(即，FFA释放酶活性谱)。在一些此类实施方案中，可以优化FFA释放酶活性谱，以提供组合物的期望的风味、气味、质地、乳化、营养含量和/或保质期。
通过本领域已知的方法可以鉴定出合适数量和/或组合的FFA释放酶，这些酶的活性必须在根据以上任一项所述方法中进行调节。例如，可以通过本领域已知的方法(例如，采用亲和色谱、酶谱测定、凝胶电泳)分离FFA释放酶，并且在体外进行测试，以确定哪一种FFA释放酶或两种或更多种FFA释放酶的哪种组合提供实质量的对特定的甘油二酯、甘油三酯、磷脂或脂蛋白的降解。此外，可以获得能够产生重组组分(例如，本文所公开的任何重组组分)的重组宿主细胞，该重组宿主细胞在两种或更多种FFA释放酶中的任何一种或任何组合中包含经调节的活性，并且可以通过本领域已知的方法测量包含由每种这样的重组宿主细胞产生的重组组分的组合物的脂质降解的减少或消除程度。
可以使用酶测定来测量FFA释放酶活性。例如，可以使用例如PAGE凝胶、分光光度计、成像、UV/Vis、光和HPLC，通过比色反应产物或可以被检测的产物(例如，由酯酶催化的甘油三酯水解产生的FFA和/或甘油)的产量来确定酶活性。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、G0RVD2和G0R8A6、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5和G0RKH7、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0RGQ0、G0RLH4和G0RMI3、、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、R0RVD2和G0R8A6、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5和G0RKH7、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4、G0RMI3、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0RFT3、G0RG60、G0RGD5、G0RI29、G0RIJ9、G0RKH7、G0RKL4、G0RL87、G0RLL0、G0RLR3、G0RME5、G0RQJ5、G0RRK3、G0RSK7、G0RWT9和G0RX82、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4和G0RMI3、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，并且包含第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4、G0RMI3、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0RFT3、G0RG60、G0RGD5、G0RI29、G0RIJ9、G0RKH7、G0RKL4、G0RL87、G0RLL0、G0RLR3、G0RME5、G0RQJ5、G0RRK3、G0RSK7、G0RWT9和G0RX82、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0R6T6、G0R6X2、G0R8N5、G0R9D1、G0R9X3、G0RBJ0、G0RBM4、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RHJ4、G0RIU1、G0RJY0、G0RR42、G0RV93、G0RRQ4、G0RX90和G0RW77、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第四FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RIU1、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RHJ4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第四FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RR42、G0RQJ5、G0RQD1、G0REZ4、G0RSK7、G0RV93、G0R9D1、G0R6T6、G0RLL0、G0RGD5、G0RFR3、G0RHQ7、G0RG60、G0R810、G0RL87、G0RIJ9、G0RME5、G0RRQ4、G0RX82、G0RGQ0、G0RLR3、G0RLH4、G0RFT3、G0RWY5、G0R9F9、G0RVD2、G0R8A6、G0R9X3、G0RBM4、G0RHJ4、G0REM9、G0RIU1、G0RX90、G0R8N5、G0R6X2、G0RK83、G0RKH7、G0RI29、G0RKI9、G0RJ76、G0RBJ0、G0RJY0、G0RMI3、G0RW77、G0RRK3和G0RLB0、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第四FFA释放酶的经调节的产量和/或活性组成，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第四FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第四FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的经调节的FFA释放酶活性可以包含或由FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及转录因子的经调节的产量和/或活性组成，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0RGQ0、G0RLH4和G0RMI3、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，该转录因子选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RT83、G0RRR1、G0RIF9、G0R765、G0RRJ7、G0R932、G0RBV8、G0REE8、G0RLF0和G0RBH2、以及它们的同源物、以及它们的组合的转录因子，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该转录因子的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
包含经调节的FFA释放酶活性的重组宿主细胞
根据以上任一项所述的方法可以包括：i)获得能够产生重组组分的重组宿主细胞，其中该重组宿主细胞与对应重组宿主细胞(即，除了“对应重组宿主细胞”的FFA释放酶活性不是经调节的之外，与“对应重组宿主细胞”进行比较的重组宿主细胞相同的重组宿主细胞)中所包含的FFA释放酶活性相比，包含经调节的FFA释放酶活性；和ii)在培养基中在适合于产生和/或分泌重组组分的条件下培养重组宿主细胞。
因此，在各个方面，本文提供了重组宿主细胞，其能够产生重组组分(即，包含本文所构建的表达)，并且其与对应重组宿主细胞中所包含的FFA释放酶活性相比包含经调节的FFA释放酶活性(例如，本文所公开的任何一种FFA释放酶的活性或本文所公开的两种或更多种FFA释放酶的任何组合的活性)。
可以通过任何方式调节重组宿主细胞中所包含的FFA释放酶活性。例如，可以通过重组宿主细胞中的遗传修饰来调节FFA释放酶活性，该遗传修饰调节或基本上消除FFA释放酶的表达(即，活性蛋白的产生)或者调节或基本上消除FFA释放酶的活性。可以在根据以上任一项所述的重组宿主细胞中包含的遗传修饰的非限制性实例包括：i)在编码内源FFA释放酶或其功能部分(例如，催化结构域)的多核苷酸序列中的遗传修饰，其中该遗传修饰调节或基本上消除该内源FFA释放酶的活性；ii)引入编码异源FFA释放酶的多核苷酸序列的遗传修饰，其中该遗传修饰调节或基本上消除异源FFA释放酶的活性；iii)在驱动FFA释放酶表达的调控元件或其功能部分(即，足以发挥调控元件功能的部分)中的遗传修饰，其中该遗传修饰调节或基本上消除FFA释放酶的表达；iv)在编码序列中的遗传修饰，该编码序列编码表达FFA释放酶所需的蛋白质(例如，转录因子[例如，表3中所示的任何转录因子及其同源物]，产生活性形式的FFA释放酶所需的翻译后修饰酶)或FFA释放酶活性所需的蛋白质(例如，抑制剂、激活剂、辅酶)，或其功能部分(例如，转录因子的DNA结合结构域、翻译后修饰酶的催化结构域)，其中该遗传修饰调节或基本上消除FFA释放酶的表达或活性所需的蛋白质的活性，从而调节或基本上消除FFA释放酶的表达；v)在驱动FFA释放酶的表达或活性所需的蛋白质的表达的调控元件或其功能部分中的遗传修饰，其中该遗传修饰调节或基本上消除FFA释放酶的表达或活性所需的蛋白质的表达，从而调节或基本上消除FFA释放酶的表达；和/或vi)引入编码异源蛋白质的多核苷酸序列的遗传修饰，该异源蛋白质调控FFA释放酶的表达(例如，转录因子[例如，表3中所示的任何转录因子及其同源物]，产生活性形式的FFA释放酶所需的翻译后修饰酶)或FFA释放酶的活性(例如，抑制剂、激活剂、辅酶)，其中该遗传修饰提供异源蛋白质的产生，从而调节或基本上消除FFA释放酶的活性。
表3–示例性转录因子(UniProt序列ID)
G0RX49 G0RRJ7 A2R2J1 G2Q2Z5
G0RHG1 G0R932 A2R903 G2Q8I6
G0RBV8 G0REE8 G0RLF0 G0RBH2
G0RT83 G0RIF9 G0RRR1 G0R765
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以来源于任何野生型单细胞生物体，包括任何细菌、酵母、丝状真菌、古细菌、单细胞原生生物、单细胞动物、单细胞植物、单细胞藻类、原生动物和假菌界，或来源于其遗传变异体(例如，突变体)，以及来源于任何普遍认为安全(GRAS)的工业宿主细胞。
合适的细菌的非限制性实例包括厚壁菌门(firmicutes)、蓝细菌(蓝藻)、颤藻亚目(oscillatoriophcideae)、芽孢杆菌目(bacillales)、乳杆菌目(lactobacillales)、颤藻目(oscillatoriales)、芽孢杆菌科(bacillaceae)、乳杆菌科(lactobacillaceae)和任何下列属的成员以及它们的衍生物和杂交体：不动杆菌属(Acinetobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)(例如，弱氧化醋杆菌(Acetobacter suboxydans)、木醋杆菌(Acetobacterxylinum))、游动放线菌属(Actinoplane)(例如，密苏里游动放线菌(Actinoplanemissouriensis))、节旋藻属(Arthrospira)(例如，钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、极大节旋藻(Arthrospira maxima))、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli))、乳杆菌属(Lactobacillus)(例如，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus))、乳球菌属(Lactococcus)(例如，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌兰斯菲尔德(Lancefield)第N组、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri))、明串珠菌属(Leuconostoc)(例如，噬柠檬酸明串珠菌(Leuconostoc citrovorum)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))、微球菌属(Micrococcus)(例如，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus))、红球菌属(Rhodococcus)(例如，浑浊红球菌(Rhodococcus opacus)、浑浊红球菌菌株PD630)、螺旋藻属(Spirulina)、链球菌属(Streptococcus)(例如，乳脂链球菌(Streptococcus cremoris)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、乳酸链球菌二乙酰乳酸亚种、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus))、链霉菌属(Streptomyces)(例如，恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoogensis)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)、橄榄链霉菌(Streptomyces olivaceus)、产橄榄色链霉菌(Streptomycesolivochromogenes)、锈棕色链霉菌(Streptomyces rubiginosus))、四膜虫属(Tetrahymena)(例如，嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophile)、黑格维施四膜虫(Tetrahymena hegewischi)、超角四膜虫(Tetrahymena hyperangularis)、马来四膜虫(Tetrahymena malaccensis)、色素四膜虫(Tetrahymena pigmentosa)、梨形四膜虫(Tetrahymena pyriformis)、贪吃四膜虫(Tetrahymena vorax))、和黄单胞菌属(Xanthomonas)(例如，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris))。
合适的酵母的非限制性实例包括任何下列属的成员以及它们的衍生物和杂交体：假丝酵母属(Candida)(例如，白色假丝酵母(Candida albicans)、埃切假丝酵母(Candidaetchellsii)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、扁平云假丝酵母(Candidahumilis)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、拟平滑假丝酵母(Candidaorthopsilosis)、棕榈油假丝酵母(Candida palmioleophila)、假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)、假丝酵母属物种、产朊假丝酵母(Candida utilis)、多变假丝酵母(Candida versatilis))、枝孢属(Cladosporium)、隐球酵母属(Cryptococcus)(例如，地生隐球酵母(Cryptococcus terricolus)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus))、德巴利酵母属(Debaryomyces)(例如，汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii))、内孢霉属(Endomyces)(例如，产脂内孢霉(Endomyces vernalis))、拟内孢霉属(Endomycopsis)(例如，产脂拟内孢霉(Endomycopsis vernalis))、假囊酵母属(Eremothecium)(例如，阿氏假囊酵母(Eremothecium ashbyii))、汉逊酵母属(Hansenula)(例如，汉逊酵母属物种、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如，克鲁维酵母属物种、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母乳酸变种(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans))、油脂酵母属(Lipomyces)(例如，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、产油油脂酵母(Lipomyecslipofer))、绪方酵母属(Ogataea)(例如，微小绪方酵母(Ogataea minuta))、毕赤酵母属(Pichia)(例如，毕赤酵母属物种、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichiaminuta)、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、松栎毕赤酵母(Pichia guercuum)、皮氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica))、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)(例如，圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides))、红酵母属(Rhodotorula)(例如，红酵母属物种、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis))、酵母属(Saccharomyces)(例如，酵母属物种、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、啤酒酵母(Saccharomyces beticus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、弗罗棱糖酵母(Saccharomyces florentinus)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、清酒酵母(Saccharomyces sake)、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum))、掷孢酵母属(Sporobolomyces)(例如，粉红掷孢酵母(Sporobolomycesroseus))、锁掷酵母属(Sporidiobolus)(例如，约翰逊锁掷酵母(Sporidiobolusjohnsonii)、鲑色锁掷酵母(Sporidiobolus salmonicolor))、丝孢酵母属(Trichosporon)(例如，解可可脂丝孢酵母(Trichosporon cacaoliposimilis)、油脂丝孢酵母新种(Trichosporon oleaginosus sp.nov.)、解可可脂丝孢酵母新种(Trichosporoncacaoliposimilis sp.nov.)、纤弱丝孢酵母(Trichosporon gracile)、卫矛丝孢酵母(Trichosporon dulcitum)、吉氏丝孢酵母(Trichosporon jirovecii)、昆虫丝孢酵母(Trichosporon insectorum))、叶黄素酵母(Xanthophyllomyces(例如，树状叶黄素酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous))、耶氏酵母属(Yarrowia(例如，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、和接合酵母(Zygosaccharomyces)(例如，鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。
合适的丝状真菌的非限制性实例包括真菌的全型、有性型和无性型形式，包括任何下列属的成员以及它们的衍生物和杂交体：枝顶孢属(Acremonium)(例如，亚拉巴马枝顶孢(Acremonium alabamense))、曲霉属(Aspergillus)(例如，棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉泡盛变种(Aspergillus niger var.awamori)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、土曲霉(Aspergillus terreus))、以及翘孢霉属(Emericella)、新萨托菌属(Neosartorya)、和石座菌属(Petromyces)物种、短梗霉属(Aureobasidium)、金丝雀霉属(Canariomyces)、毛壳菌属(Chaetomium)、闭毛壳属(Chaetomidium)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(Chrysosporium)(例如，葡萄金孢子菌(Chrysosporiumbotryoides)、附子金孢子菌(Chrysosporiumcarmichaeli)、厚壁金孢子菌(Chrysosporiumcrassitunicatum)、欧洲金孢子菌(Chrysosporium europae)、埃氏金孢子菌(Chrysosporium evolceannui)、弗氏金孢子菌(Chrysosporium farinicola)、厌食金孢子菌(Chrysosporium fastidium)、丝状金孢子菌(Chrysosporium filiforme)、乔格金孢子菌(Chrysosporium georgiae)、球状金孢子菌(Chrysosporium globiferum)、球状金孢子菌扁枝变种(Chrysosporium globiferum var.articulatum)、球状金孢子菌雪白变种(Chrysosporium globiferum var.niveum)、燕金孢子菌(Chrysosporium hirundo)、西班牙金孢子菌(Chrysosporium hispanicum)、霍氏金孢子菌(Chrysosporium holmii)、印蒂卡金孢子菌(Chrysosporium indicum)、狭边金抱子菌(Chrysosporium iops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、陀螺金孢子菌(Chrysosporium kreiselii)、库氏金孢子菌(Chrysosporium kuzurovianum)、木素金孢子菌(Chrysosporium lignorum)、裂叶金孢子菌(Chrysosporium obatum)、勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、勒克瑙金孢子菌Garg 27K、适中金孢子菌(Chrysosporium medium)、介质金孢子菌spissescens变种、恶臭金孢子菌(Chrysosporium mephiticum)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、粪状金孢子菌玫瑰变种(Chrysosporium merdariumvar.roseum)、微小金孢子菌(Chrysosporium minor)、潘氏金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、短小金孢子菌(Chrysosporium parvum)、短小金孢子菌克雷森斯变种(Chrysosporium parvum var.crescens)、多毛金孢子菌(Chrysosporium pilosum)、假粪状金孢子菌(Chrysosporium pseudomerdarium)、梨形金孢子菌(Chrysosporiumpyriformis)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、西格莱里金孢子菌(Chrysosporium sigleri)、硫磺金孢子菌(Chrysosporium sulfureum)、同步金孢子菌(Chrysosporium synchronum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、波状金孢子菌(Chrysosporium undulatum)、瓦氏金孢子菌(Chrysosporium vallenarense)、蝙蝠金孢子菌(Chrysosporium vespertilium)、环带金孢子菌(Chrysosporium zonatum))；Coonemeria；小克银汉霉属(Cunninghamella)(例如，刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaehinulata))、Dactylomyces、翘孢霉属(Emericella)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)(例如，串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、枯萎镰刀菌(Fusariumvenenatum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、轮枝镰刀菌(Fusarium verticiollioides)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sambuccinum、簇生镰刀菌(Fusarium torulosum)、以及其相关的赤霉属(Gibberella)有性型形式)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinula)、畸枝霉属(Malbranchea)(例如，丝状畸枝霉(Malbranchea filamentosa))、巨座壳属(Magnaporthe)、Malbranchium、Melanocarpus、被孢霉属(Mortierella)(例如，高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4、褐黄色被孢霉(Mortieralla isabelline)、葡酒色被孢霉(Mortierrla vinacea)、葡酒色被孢霉棉子糖利用者变种(Mortierrla vinaceavar.raffinoseutilizer))、毛霉属(Mucor)(例如，米赫毛霉-库尼爱默生(Mucor mieheiCooney et Emerson)(米赫根毛霉(Rhizomucor miehei(库尼(Cooney)和爱默生(R.Emerson)))Schipper))、微小毛霉(Mucor pusillus)Lindt、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、大毛霉(Mucor mucedo))、毁丝霉属(Myceliophthora)(例如，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))、漆斑菌属(Myrothecium)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢霉属(Neurospora)(例如，粗糙链孢霉(Neurospora crassa))、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)(例如，产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、意大利青霉(Pennicillium iilacinum)、娄地青霉(Penicilliumroquefortii))、平革菌属(Phenerochaete)、白腐菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、腐霉属(Pythium)、根霉属(Rhizopus)(例如，雪白根霉(Rhizopus niveus))、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、孢子丝菌属(Sporotrichum)(例如，嗜细胞孢子丝菌(Sporotrichum cellulophilum))、韧革菌属(Stereum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳霉属(Thielavia)(例如，太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris))、弯颈霉属(Tolypocladium)、以及木霉属(Trichoderma)(例如，哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、绿木霉(Trichodermavirens)、桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)、绿色木霉(Trichoderma viride)。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以选自由以下组成的组：包含FFA释放酶或两种或更多种FFA释放酶的组合的经调节的活性的重组里氏木霉宿主细胞(即，源自里氏木霉菌株的重组宿主细胞)；包含FFA释放酶或两种或更多种FFA释放酶的组合的经调节的活性的重组黑曲霉宿主细胞(即，源自黑曲霉菌株的重组宿主细胞；包含FFA释放酶或两种或更多种FFA释放酶的组合的经调节的活性的重组桔绿木霉宿主细胞(即，源自桔绿木霉菌株的重组宿主细胞)；和包含FFA释放酶或两种或更多种FFA释放酶的组合的经调节的活性的重组嗜热毁丝霉宿主细胞(即，源自嗜热毁丝霉菌株的重组宿主细胞)。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、G0RVD2和G0R8A6、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5和G0RKH7、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0RGQ0、G0RLH4和G0RMI3、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、R0RVD2和G0R8A6、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RH85、G0RMI3、G0RLH4、G0RIU1、G0RBM4、G0R9D1、G0RFR3、G0RG60、G0R6T6、G0R8N5、G0RBJ0、G0RRQ4、G0REZ4、G0RIJ9、G0R6X2、G0RJY0、G0RR42、G0RW77、G0RQJ5、G0RFT3、G0R810、G0RI29、G0RL87、G0RLL0、G0RGD5和G0RKH7、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4、G0RMI3、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0RFT3、G0RG60、G0RGD5、G0RI29、G0RIJ9、G0RKH7、G0RKL4、G0RL87、G0RLL0、G0RLR3、G0RME5、G0RQJ5、G0RRK3、G0RSK7、G0RWT9和G0RX82、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4和G0RMI3、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，并且包含第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4、G0RMI3、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0RFT3、G0RG60、G0RGD5、G0RI29、G0RIJ9、G0RKH7、G0RKL4、G0RL87、G0RLL0、G0RLR3、G0RME5、G0RQJ5、G0RRK3、G0RSK7、G0RWT9和G0RX82、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0R6T6、G0R6X2、G0R8N5、G0R9D1、G0R9X3、G0RBJ0、G0RBM4、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RHJ4、G0RIU1、G0RJY0、G0RR42、G0RV93、G0RRQ4、G0RX90和G0RW77、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第四FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RIU1、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RHJ4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第四FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RR42、G0RQJ5、G0RQD1、G0REZ4、G0RSK7、G0RV93、G0R9D1、G0R6T6、G0RLL0、G0RGD5、G0RFR3、G0RHQ7、G0RG60、G0R810、G0RL87、G0RIJ9、G0RME5、G0RRQ4、G0RX82、G0RGQ0、G0RLR3、G0RLH4、G0RFT3、G0RWY5、G0R9F9、G0RVD2、G0R8A6、G0R9X3、G0RBM4、G0RHJ4、G0REM9、G0RIU1、G0RX90、G0R8N5、G0R6X2、G0RK83、G0RKH7、G0RI29、G0RKI9、G0RJ76、G0RBJ0、G0RJY0、G0RMI3、G0RW77、G0RRK3和G0RLB0、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第四FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第四FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第四FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及转录因子的经调节的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0RGQ0、G0RLH4和G0RMI3、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，该转录因子选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RT83、G0RRR1、G0RIF9、G0R765、G0RRJ7、G0R932、G0RBV8、G0REE8、G0RLF0和G0RBH2、以及它们的同源物、以及它们的组合的转录因子，其中该FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该转录因子的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶，其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性、以及第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性，该第一FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RGQ0、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第二FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RLH4、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；该第三FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RMI3、及其同源物、及其组合的FFA释放酶；其中该第一FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；其中该第二FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％；并且其中该第三FFA释放酶的经调节的产量和/或活性是产量和/或活性降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
用于获得重组宿主细胞的方法
在各个方面，本文提供了一种用于获得根据以上任一项所述的重组宿主细胞的方法，其中该方法包括以下各项的以任何顺序的任何组合：i)获得根据下文任一项所述的多核苷酸、或根据下文任一项所述的重组表达构建体、或根据下文任一项所述的重组载体；ii)将多核苷酸、表达构建体或重组载体引入宿主细胞(例如，本文所公开的任何宿主细胞)中，以获得能够产生重组组分的重组宿主细胞；iii)遗传修饰宿主细胞(例如，本文所公开的任何宿主细胞)以调节或基本消除FFA释放酶(例如，本文所公开的任何一种FFA释放酶或本文所公开的两种或更多种FFA释放酶的任何组合)的产量和/或活性，以获得包含经修饰或基本上消除的FFA释放酶活性的重组宿主细胞；iv)将多核苷酸、表达构建体或重组载体引入重组宿主细胞中，该重组宿主细胞包含经修饰或基本上消除的FFA释放酶活性；和/或v)遗传修饰能够产生重组组分的重组宿主细胞，以调节或基本上消除FFA释放酶(例如，本文所公开的任何一种FFA释放酶或本文所公开的两种或更多种FFA释放酶的任何组合)的产量和/或活性。
多核苷酸
多核苷酸、表达构建体和/或重组载体可以通过本领域已知的任何合适的方法(包括但不限于直接化学合成和克隆)获得。
多核苷酸可以包含：i)任选的分泌信号序列(即，编码介导将附着于肽的新生蛋白递送到合成该新生蛋白的细胞外部的肽的序列；例如，编码本文所公开的任何分泌信号的多核苷酸序列)，和ii)重组蛋白编码序列(即，编码重组蛋白(例如，本文所提供的任何重组蛋白)的多核苷酸序列，任选地包含标签多肽(例如，本文所公开的任何标签多肽)，其中：a)任选的分泌信号序列以有义方向可操作地连接到重组蛋白编码序列(即，任选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列被定位成使得转录和翻译产生包含任选的分泌信号的重组蛋白)。
分泌信号序列
根据以上任一项所述的重组表达构建体可以任选地包含在根据下文任一项所述的重组宿主细胞中有活性的任何分泌信号序列。
任选的分泌信号序列可以编码分泌信号，该分泌信号介导新生重组蛋白在翻译后(即蛋白合成先于转运，使得新生重组蛋白在转运到ER中之前存在于细胞的胞质溶胶中)或在翻译的同时(即蛋白合成和转运到ER中同时发生)转运到ER中。
合适的分泌信号序列的非限制性实例包括在细菌宿主细胞中有功能的分泌信号序列，包括编码任何下列蛋白质的基因的分泌信号序列：PelB、OmpA、Bla、PhoA、PhoS、MalE、LivK、LivJ、MglB、AraF、AmpC、RbsB、MerP、CpdB、Lpp、LamB、OmpC、PhoE、OmpF、TolC、BtuB和LutA、以及它们的功能部分和组合。
合适的分泌信号序列的非限制性实例包括在真菌宿主细胞中有功能的分泌信号序列，包括编码任何下列蛋白质的基因的分泌信号序列：CBH1、CBH2、EGL1、EGL2、XYN1、XYN2、BXL1、HFB1、HFB2、GLAA、AMYA、AMYC、AAMA、α交配因子、SUC2、PHO5、INV、AMY、LIP、PIR、OST1和β-葡萄糖苷酶、以及它们的功能部分和组合。
重组蛋白编码序列
重组蛋白编码序列可以编码任何重组蛋白。
重组蛋白的非限制性实例包括乳蛋白。
如本文所用的术语“乳蛋白”是指乳清蛋白或酪蛋白。
如本文所用的术语“酪蛋白”是指包含与在哺乳动物产生的乳中天然发现的酪蛋白(即，由哺乳动物产生的乳中天然的酪蛋白；例如，天然酪蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20个(例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个)氨基酸的序列的多肽。酪蛋白的实例包括β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白。因此，如本文所用的术语“β-酪蛋白”、“κ-酪蛋白”、“α-S1-酪蛋白”和“α-S2-酪蛋白”是指包含分别与哺乳动物产生的乳中天然发现的β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-S1-酪蛋白和α-S2-酪蛋白(例如，分别为牛(Bos taurus)β-酪蛋白(UniProt序列P02666的氨基酸16至224)、牛κ-酪蛋白(UniProt序列P02668的氨基酸22至190)、牛牛α-S1-酪蛋白(UniProt序列P02662的氨基酸16至214)和牛α-S2-酪蛋白(UniProt序列P02663的氨基酸16至222)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20个(例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个)氨基酸的序列的多肽。
如本文所用的术语“乳清蛋白”是指包含与哺乳动物产生的乳中天然发现的乳清蛋白(即，由哺乳动物产生的乳中天然的乳清蛋白；例如，天然乳清蛋白)中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20个(例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个)氨基酸的序列的多肽。乳清蛋白的实例包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳转铁蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶蛋白和糖巨肽。因此，如本文所用的术语“α-乳白蛋白”、“β-乳球蛋白”、“乳转铁蛋白”、“乳铁蛋白”、“血清白蛋白”、“乳过氧化物酶”和“糖巨肽”是指包含分别与哺乳动物产生的乳中天然发现的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳转铁蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白、乳过氧化物酶和糖巨肽(GMP)(例如，分别为牛α-乳白蛋白(UniProt序列P00711的氨基酸20-142)、牛β-乳球蛋白(UniProt序列P02754的氨基酸17-178)、牛乳转铁蛋白(UniProt序列P24627的氨基酸20至708)、牛乳铁蛋白(Uniprot序列P24627的氨基酸36至60)、牛血清白蛋白(UniProt序列P02769的氨基酸25至607)、牛乳过氧化物酶(UniProt序列P80025的氨基酸101至712)和牛糖巨肽(GMP；UniProt序列P02668的氨基酸127至190))中的氨基酸序列至少40％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、100％)相同的至少20个(例如，至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个)氨基酸的序列的多肽。
乳蛋白可以具有如下的氨基酸序列，该氨基酸序列与在任何哺乳动物物种中发现的天然乳蛋白的氨基酸序列相同或是其同源物，该哺乳动物物种包括但不限于牛、人、绵羊、野生羊、山羊、水牛、骆驼、马、驴、羊驼、牦牛、美洲驼、狐猴、熊猫、豚鼠、松鼠、熊、猕猴、大猩猩、黑猩猩、山羊、猴子、猿、猫、狗、小袋鼠、大鼠、老鼠、大象、负鼠、兔子、鲸鱼、狒狒、长臂猿、猩猩、山魈、猪、狼、狐狸、狮子、老虎和针鼹鼠。
重组表达构建体
重组表达构建体可以包含：i)启动子序列(例如，本文所公开的任何启动子的多核苷酸序列)，ii)以上任一项所述的多核苷酸，和iii)终止序列(例如，本文所公开的任何终止子的多核苷酸序列)；其中：a)该启动子序列以有义方向与该多核苷酸的任选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列可操作地连接(即，该启动子序列和该多核苷酸的任选的分泌信号序列和重组蛋白编码序列被定位成使得该启动子序列可有效介导或调节该任选的分泌信号序列和该重组蛋白编码序列的转录)，和b)该一个或多个终止子序列可操作地连接到该重组蛋白编码序列上(即，该重组蛋白编码序列和该一个或多个终止子序列被定位成使得该一个或多个终止子序列可有效终止该重组蛋白编码序列的转录)。
重组表达构建体还可以包含编码亲和纯化标签的可操作连接的序列，使得所表达的重组蛋白包含用于亲和纯化的肽序列。这样的亲和纯化标签可以可操作地连接，使得当表达时，亲和纯化标签存在于或朝向氨基末端、羧基末端或两者。这样的亲和纯化标签可以是麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、聚(His)标签、六(His)标签、FLAG标签、V5标签、VSV标签、E标签、NE标签、血凝素(Ha)标签和Myc标签。
重组表达构建体还可以包含通过同源(即，靶向整合)或非同源重组整合到宿主细胞基因组中的序列。重组表达构建体可以包含至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1,000个或至少10,000个碱基对，这些碱基对与宿主细胞基因组中的靶序列具有足够的同一性以增强重组表达构建体同源重组的可能性。这样的同源序列可以是非编码或编码的。
在根据以上任一项所述的重组表达构建体中包含的任选的分泌信号序列和/或重组蛋白编码序列可以进行密码子优化，以便在根据以上任一项所述的重组宿主细胞中表达。
可以在将重组表达构建体的片段整合到宿主细胞的基因组(例如，根据以上任一项所述的重组宿主细胞的基因组)中后产生根据以上任一项所述的重组表达构建体。例如，根据以上任一项所述的多核苷酸可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，使得内源基因的基因座的一个或多个调控元件变得与重组蛋白编码序列可操作地连接，从而产生根据以上任一项所述的重组表达构建体。
启动子序列
根据以上任一项所述的重组表达构建体可以包含在根据下文任一项所述的重组宿主细胞中有活性的任何启动子序列。
启动子序列可以是组成型启动子序列(即，在大多数环境和发育条件下有活性的启动子序列)或诱导型或阻遏型启动子序列(即，仅在某些环境或发育条件下[例如，在存在或不存在某些因子的情况下，这些因子诸如但不限于碳(例如，葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、纤维素、槐糖、龙胆二糖、山梨糖、诱导纤维素酶启动子的二糖、淀粉、色氨酸、硫胺素、甲醇)、磷酸盐、氮或其他营养素；温度；pH；渗透压；重金属或重金属离子；抑制剂；胁迫；分解代谢物；以及它们的组合]有活性的启动子序列)。
启动子序列可以由单个启动子序列组成，或者由两个或更多个启动子序列组成(例如，两个或更多个启动子或它们的功能部分按顺序排列的组合、诱导型启动子和组成型启动子的组合)。两个或更多个启动子序列可以是相同的，或者两个或更多个启动子序列中的至少两个不能是相同的。
启动子序列可以包含或由双向启动子序列组成(即，通过募集转录因子在两个方向上启动转录的多核苷酸，例如通过在相反方向上融合两个相同或不同的启动子产生)。
合适的启动子序列的非限制性实例包括在细菌宿主细胞中有功能的启动子序列，包括T7启动子、T5启动子、Tac启动子、pL/pR启动子、phoA启动子、lacUV5启动子、trc启动子、trp启动子、cstA启动子、xylA启动子、manP启动子、malA启动子、lacA启动子、aprE启动子、ΔaprE启动子、srfA启动子、p43启动子、ylbA启动子、σB启动子、veg启动子、PG1启动子、PG6启动子、λPL启动子、λPR启动子和spa启动子、以及它们的功能部分和组合。
合适的启动子序列的非限制性实例包括在真菌宿主细胞中有功能的启动子序列，包括xlnA启动子、xyn1启动子、xyn2启动子、xyn3启动子、xyn4启动子、bxl1启动子、cbh1启动子、cbh2启动子、egl1启动子、egl2启动子、egl3启动子、egl4启动子、egl5启动子、glaA启动子、agdA启动子、gpdA启动子、gpd1启动子、AOX1启动子、GAP1启动子、MET3启动子、ENO1启动子、GPD1启动子、PDC1启动子、TEF1启动子、AXE1启动子、CIP1启动子、GH61启动子、PKI1启动子、RP2启动子、ADH1启动子、CUP1启动子、GAL1启动子、PGK1启动子、YPT1启动子、LAC4启动子、LAC4-PB1启动子、FLD1启动子、MOX启动子、DAS1启动子、DAS2启动子、GAP1启动子、STR3启动子、ADH3启动子、GUT2启动子、CYC1启动子、TDH3启动子、PGL1启动子、ADH2启动子、HXT7启动子、CLB1启动子和PHO5启动子、以及它们的功能部分和组合。
终止序列
根据以上任一项所述的重组表达构建体可以包含在根据下文任一项所述的重组宿主细胞中有活性的任何终止序列。
合适的终止序列的非限制性实例包括adh1、amaA、amdS、amyA、aox1、cbh1、cbh2、cyc2、egl1、egl2、gal1、gap1、glaA、gpd1、gpdA、pdc1、pgk1、tef1、tps1、trpC、xyn1、xyn2、xyn3和xyn4基因的终止序列、以及它们的功能部分和组合。
终止序列可以由单个终止序列组成，或者由两个或更多个终止序列组成，其中该两个或更多个终止序列可以是相同的，或者该两个或更多个终止序列中的至少两个可以是不同的。终止序列可以由双向终止序列组成。
其他调控元件
根据以上任一项所述的重组表达构建体还可以包含另外的调控元件。
调控元件的非限制性实例包括启动子序列、终止序列、转录起始序列、翻译起始序列、翻译终止序列、增强子序列、激活子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区(例如，包含聚腺苷酸化信号的3'非翻译区)、上游激活序列(UAS)、内含子、操纵子(即，与启动子相邻的核酸序列，其包含阻遏蛋白可以结合并降低或消除启动子活性的蛋白质结合结构域)、有效的RNA加工信号(例如，剪接信号、聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(例如，核糖体结合位点[例如，Shine-Dalgarno序列])、增强蛋白质稳定性的序列、增强蛋白质分泌的序列以及它们的组合。
重组载体
重组载体可以包含根据以上任一项所述的重组表达构建体。
重组载体可以包含根据以上任一项所述的单个重组表达构建体，或根据以上任一项所述的两个或更多个重组表达构建体，该两个或更多个重组表达构建体可以是相同的或该两个或更多个重组表达构建体中的至少两个可以是不相同的(例如，在启动子序列、分泌信号、蛋白质编码序列、终止序列和/或另外的调控元件方面彼此不同)。在重组载体包含两个或更多个重组表达构建体的实施方案中，该两个或更多个重组表达构建体可以编码相同的重组蛋白。在一些此类实施方案中，编码相同重组蛋白的两个或更多个重组表达构建体在启动子序列、分泌信号序列、终止序列和/或另外的调控元件方面彼此不同。
重组载体还可以包含一种或多种适合于重组载体在重组宿主细胞中增殖的其他元件。此类其他元件的非限制性实例包括复制起点和选择标记。复制起点和选择标记是本领域已知的，包括细菌和真菌复制起点(例如，AMA1、ANSI)。选择标记可以是抗性基因(即，编码使宿主细胞能够对外源添加的化合物[例如，抗生素化合物]解毒的蛋白质的多核苷酸)、营养缺陷型标记(即，编码允许宿主细胞在缺乏必需组分的培养基中生长时合成该必需组分(通常是氨基酸)的蛋白质的多核苷酸)、或颜色标记(即，编码可以产生颜色的蛋白质的基因)。合适的选择标记的非限制性实例包括amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、和ble(博来霉素型抗生素抗性)、以及它们的衍生物。选择标记可以包含减少选择标记产生的改变，从而增加允许包含重组载体的重组宿主细胞在选择下存活所需的拷贝数。选择也可以通过共转化来完成，其中该转化是用两种载体的混合物进行的，并且只对一种载体进行选择。
重组载体还可以包含用于通过同源(即，靶向整合)或非同源重组整合到宿主细胞基因组中的序列。重组表达构建体可以包含至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个、至少750个、至少1,000个或至少10,000个碱基对，这些碱基对与宿主细胞基因组中的靶序列具有足够的同一性以增强重组表达构建体同源重组的可能性。这样的同源序列可以是非编码或编码的。
遗传修饰
遗传修饰可以由例如细胞基因组中一个或多个核苷酸的插入、取代、复制、重排和/或缺失组成。遗传修饰可以例如引入终止密码子；去除起始密码子；插入开放阅读框的移码；或创建点突变，错义突变，取代突变，缺失突变，移码突变，插入突变，重复突变，扩增突变，易位突变或倒位突变。
用于遗传修饰宿主细胞的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于随机诱变和筛选，定点诱变，PCR诱变，插入诱变，化学诱变(使用例如羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、N-甲基-N'-亚硝基胍(NTG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲烷磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸、核苷酸类似物)，辐射(例如紫外线(UV)辐射)，编码或非编码核苷酸序列的缺失，同源重组，FLP/FRT重组，基因破坏，CRISPR基因编辑和基因转换。此类方法包括将重组多核苷酸引入宿主细胞中，其包含与编码感兴趣的蛋白质(例如，FFA释放酶、驱动FFA释放酶表达和/或调节其活性的蛋白质)的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列，其编码对感兴趣的蛋白质特异的RNAi构建体，或其编码FFA释放酶的异源抑制剂或激活剂。
可以使用本领域已知的任何合适的方法(诸如在RNA水平上，最合适的是在蛋白质水平上进行的测定)或者通过使用测量分泌相关蛋白质的产量或活性的功能性生物测定来评价根据以上任一项所述的重组宿主细胞中FFA释放酶的经调节的产量和/或活性。此类测定的非限制性实例包括Northern印迹、点印迹(DNA或RNA)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)、原位杂交、Southern印迹、酶活性测定、免疫学测定(例如，免疫组织化学染色、免疫测定、Western印迹、ELISA)和游离硫醇测定(例如，用于测量包含游离半胱氨酸残基的蛋白质的产量)。可以将根据以上任一项所述的重组宿主细胞中FFA释放酶的产量和/或活性与通过相同方法评价的对应重组宿主细胞(即，也能够产生重组组分(即，包含相同的表达构建体)、但不包含调节或基本上消除FFA释放酶活性的遗传修饰的相同重组宿主细胞)的产量和/或活性进行比较。
将多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞中
用于将多核苷酸、重组表达构建体或重组载体引入宿主细胞中的方法是本领域熟知的。此类方法的非限制性实例包括磷酸钙转染、树状大分子转染、脂质体转染(例如，阳离子脂质体转染)、阳离子聚合物转染、DEAE-葡聚糖转染、细胞挤压、声孔效应、光学转染、原生质体融合、原生质体转化、刺穿转染(impalefection)、热力学递送、基因枪、磁转染、病毒转导、电穿孔和化学转化(例如，使用PEG)。
用于鉴定重组宿主细胞的方法是本领域熟知的，并且包括筛选由多核苷酸、重组表达构建体或重组载体编码的药物抗性或营养缺陷型标记的表达，该药物抗性或营养缺陷型标记允许对细胞生长的选择或落选，或者通过其他手段(例如，检测在多核苷酸、重组表达构建体或重组载体中包含的发光肽，对单个重组宿主细胞集落进行分子分析[例如，通过限制性酶作图、PCR扩增、Southern分析或分离的染色体外载体或染色体整合位点的序列分析])。
可以使用本领域已知的任何合适的方法(诸如在RNA水平上，最合适的是在蛋白质水平上进行的测定)或者通过使用测量重组蛋白的产量或活性的功能性生物测定来评价根据以上任一项所述的重组宿主细胞对重组蛋白的产生。此类测定的非限制性实例包括Northern印迹、点印迹(DNA或RNA)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)、RNA-Seq、原位杂交、Southern印迹、酶活性测定、免疫学测定(例如，免疫组织化学染色、免疫测定、Western印迹、ELISA)和游离硫醇测定(例如，用于测量包含游离半胱氨酸残基的蛋白质的产量)。
用于生产重组组分的方法
在各个方面，本文提供了一种用于生产根据以上任一项所述的重组组分的方法，其中该方法包括：在培养基中在适合于生产重组组分的条件下发酵根据以上任一项所述的重组宿主细胞。
该方法还可以包括：从发酵液中纯化重组组分，以获得包含重组组分的制剂；和/或后处理重组组分。
发酵
用于生产重组组分的合适条件通常是根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以生长和/或保持存活并产生重组组分的条件。
合适条件的非限制性实例包括合适的培养基(例如，具有合适营养素含量[例如，合适的碳含量、合适的氮含量、合适的磷含量]、合适的补充物含量、合适的痕量金属含量、合适的pH的培养基)、合适的温度、合适的补料速率、合适的压力、合适的充氧水平、合适的发酵持续时间(即，包含重组宿主细胞的培养基的体积)、合适的发酵体积(即，包含重组宿主细胞的培养基的体积)和合适的发酵容器。
合适的培养基包括重组宿主细胞可以在其中生长和/或保持活力并产生重组组分的所有培养基。通常，培养基是包含碳源、可同化氮源(即，能够以适合于重组宿主细胞代谢利用的形式释放氮的含氮化合物)和磷酸盐来源的水性培养基。
碳源的非限制性实例包括单糖、二糖、多糖、乙酸盐、乙醇、甲醇、甘油、甲烷以及它们的组合。单糖的非限制性实例包括右旋糖(葡萄糖)、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖以及它们的组合。二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖以及它们的组合。多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、直链淀粉、半纤维素、麦芽糖糊精以及它们的组合。
可同化氮源的非限制性实例包括无水氨、硫酸铵、氢氧化铵、硝酸铵、磷酸二铵、磷酸一铵、焦磷酸铵、氯化铵、硝酸钠、尿素、蛋白胨、蛋白质水解产物、玉米浆、玉米浆固体、酒糟、酒糟提取物和酵母提取物。氨气的使用对于大规模操作是方便的，并且可以通过以合适的量鼓泡穿过含水发酵剂(发酵培养基)来使用。同时，这样的氨也可以用来帮助控制pH。
培养基还可以包含无机盐、矿物质(例如，镁、钙、钾、钠；例如，以合适的可溶性可同化离子和结合形式)、金属或过渡金属(例如，铜、锰、钼、锌、铁、硼、碘；例如，以合适的可溶性可同化形式)、维生素和任何其他营养或功能成分(例如，可以防止重组组分降解的蛋白酶[例如，基于植物的蛋白酶]、可以降低可降解重组组分的蛋白酶活性的蛋白酶抑制剂和/或可以吸走蛋白酶活性的牺牲蛋白、消泡剂、抗微生物剂、表面活性剂、乳化油)。
合适的培养基可以从商业供应商那里获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)进行制备。
合适的pH可以是在约2与约8之间的pH(例如，在2与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4、3.5、3或2.5之间；在2.5与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4、3.5或3之间；在3与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4或3.5之间；在3.5与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5或4之间；在4与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6或4.5之间；在4.5与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7或4.6之间；在4.6与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9、4.8或4.7之间；在4.7与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5、4.9或4.8之间；在4.8与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5或4.9之间；在4.9与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1或5之间；在5与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3、5.2或5.1之间；在5.1与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4、5.3或5.2之间；在5.2与8、7.5、7、6.5、6、5.5、5.4或5.3之间；在5.3与8、7.5、7、6.5、6、5.5或5.4之间；在5.4与8、7.5、7、6.5、6或5.5之间；在5.5与8、7.5、7、6.5或6之间；在6与8、7.5、7或6.5之间；在6.5与8、7.5或7之间；在7与8或7.5之间；或在7.5与8之间的pH)。
合适的温度可以是在约20℃与约46℃之间的温度(例如，在20℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃、26℃、24℃或22℃之间；在22℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃、26℃或24℃之间；在24℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃、28℃或26℃之间；在26℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃、30℃或28℃之间；在28℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃、32℃或30℃之间；在30℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃、34℃或32℃之间；在32℃与46℃、44℃、42℃、40℃、38℃、36℃或34℃之间；在36℃与46℃、44℃、42℃、40℃或38℃之间；在38℃与46℃、44℃、42℃或40℃之间；在40℃与46℃、44℃或42℃之间；在42℃与46℃或44℃之间；或在44℃与46℃之间的温度)。
合适的进料速率可以是约0.01g与约0.2g之间的葡萄糖当量/g干细胞重量(DCW)/小时的进料速率。
合适的压力可以是在0psig与约50psig之间的压力(例如，在0psig与50psig、40psig、30psig、20psig或10psig之间；在10psig与50psig、40psig、30psig或20psig之间；在20psig与50psig、40psig或30psig之间；在30psig与50psig或40psig之间；或在40psig与50psig之间的压力)。
合适的充氧可以是在约0.1体积氧气/发酵罐液体体积/分钟(vvm)与约2.1vvm之间的通气速率(例如，在0.1vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm、0.7vvm、0.5vvm或0.3vvm之间；在0.3vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm、0.7vvm或0.5vvm之间；在0.5vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm、0.9vvm或0.7vvm之间；在0.7vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm、1.1vvm或0.9vvm之间；在0.9vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm、1.3vvm或1.1vvm之间；在1.1vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm、1.5vvm或1.3vvm之间；在1.3vvm与2.1vvm、1.9vvm、1.7vvm或1.5vvm之间；在1.5vvm与2.1vvm、1.9vvm或1.7vvm之间；在1.7vvm与2.1vvm或1.9vvm之间；或在1.9vvm与2.1vvm之间的通气速率)。
合适的发酵持续时间可以是在约10小时与约500小时之间的发酵持续时间(例如，在10小时与500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时、40小时、30小时或20小时之间；在20小时与500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时、40小时或30小时之间；在30小时与500小时、400小时、300小时、200小时、100小时、50小时或40小时之间；在40小时与500小时、400小时、300小时、200小时、100小时或50小时之间；在50小时与500小时、400小时、300小时、200小时或100小时之间；在100小时与500小时、400小时、300小时或200小时之间；在200小时与500小时、400小时或300小时之间；在300小时与500小时或400小时之间；或在400小时与500小时之间的发酵持续时间)。
合适的发酵体积可以在约1L与约10,000,000L之间(例如，在1L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L、500L、100L、50L或10L之间；在10L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L、500L、100L或50L之间；在50L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L、500L或100L之间；在100L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L、1,000L或500L之间；在500L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L、5,000L或1,000L之间；在1,000L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L、10、000L或5,000L之间；在5,000L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L、50,000L或10、000L之间；在10,000L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L、100,000L或50,000L之间；在50,000L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L、500,000L或100,000L之间；在100,000L与10,000,000L、5,000,000L、1,000,000L或500,000L之间；在500,000L与10,000,000L、5,000,000L或1,000,000L之间；在1,000,000L与10,000,000L或5,000,000L之间；或在5,000,000L与10,000,000L之间)。
合适的发酵容器可以是本领域已知的任何发酵容器。合适的发酵容器的非限制性实例包括以任何合适的规模(例如，小规模、大规模)和在任何过程(例如，固体培养、深层培养、分批、补料分批或连续流)中使用的培养板、摇瓶、发酵罐(例如，搅拌罐发酵罐、气升式发酵罐、泡罩塔发酵罐、固定床生物反应器、实验室发酵罐、工业发酵罐或它们的任何组合)。
纯化和后处理
用于纯化重组组分(例如，从发酵液中)以获得包含重组组分的制剂的方法是本领域熟知的，并且可以适用于纯化由根据以上任一项所述的重组宿主细胞产生的重组体。
重组组分可以基于其分子量，例如通过尺寸排阻/交换色谱、通过膜的超滤、凝胶渗透色谱(例如，制备型盘状凝胶电泳)或密度离心来纯化。
重组组分还可以基于其表面电荷或疏水性/亲水性，通过例如等电沉淀、阴离子/阳离子交换色谱、等电聚焦(IEF)或反相色谱来纯化。
重组组分也可以基于其溶解度，通过例如硫酸铵沉淀、等电沉淀、表面活性剂、去污剂或溶剂萃取来纯化。
重组组分还可以基于其对另一分子的亲和力，通过例如亲和色谱、活性染料或羟基磷灰石来纯化。亲和色谱可以包括使用对重组组分具有特异性结合亲和力的抗体，或针对His标记的重组蛋白的镍NTA，或使用凝集素以结合重组蛋白上的糖部分或特异性结合重组组分的任何其他分子。重组组分可以携带有利于纯化的表位或肽标签。分离重组组分后(例如，通过蛋白酶切割)，可以去除表位或肽标签。
在其中根据以上任一项所述的重组组分由根据以上任一项所述的重组宿主细胞分泌的实施方案中，可以直接从培养基中纯化重组组分。在其他实施方案中，可以从细胞裂解物中纯化重组组分。
可以纯化重组组分以获得包含重组组分的制剂，该重组组分的纯度相对于发酵液中包含的其他组分大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％或大于99％；或者相对于发酵液中包含的其他组分，丰度增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍；或者以质量计达到大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于97％或大于99％的纯度。
重组组分的身份可以通过高效液相色谱(HPLC)、Western印迹分析、Eastern印迹分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、酶产物的形成、酶底物的消失和二维质谱(2D-MS/MS)序列鉴定来确认和/或定量。
可以将重组组分喷雾干燥或通过蒸发浓缩(例如，以获得粉末)。
包含重组组分的组合物
在各个方面，本文提供了包含或基本上由重组组分组成的组合物，该重组组分由根据以上任一项所述的重组宿主细胞和/或根据以上任一项所述的方法产生，其中该组合物包含与对应组合物(即，除了产生“对应组合物”的方法不包括如本文所提供的其中调节FFA释放酶活性的至少一个步骤之外，与“对应组合物”相比的组合物相同的组合物)中的FFA释放酶活性相比经调节的FFA释放酶活性(例如，本文所公开的任何一种FFA释放酶的活性或本文所公开的两种或更多种FFA释放酶的任何组合的活性)。
该组合物可以包含以干质量计在约0.1％与约100％之间的重组组分(例如，以干质量计在0.1％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％或0.2％之间；在0.2％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％或0.3％之间；在0.3％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或0.4％之间；在0.4％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％之间；在0.5％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％或0.6％之间；在0.6％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％或0.7％之间；在0.7％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％或0.8％之间；在0.8％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.9％之间；在0.9％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％之间；在1％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％之间；在2％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％之间；在3％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或4％之间；在4％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％或5％之间；在5％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％或6％之间；在6％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％或7％之间；在7％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％或8％之间；在8％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％、10％或9％之间；在9％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％、11％或10％之间；在10％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％、12％或11％之间；在11％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％、13％或12％之间；在12％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、14％或13％之间；在13％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或14％之间；在14％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％或15％之间；在15％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％之间；在20％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或25％之间；在25％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％或30％之间；在30％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％或35％之间；在35％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％之间；在40％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％或45％之间；在45％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％之间；在50％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或55％之间；在55％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％之间；在60％与100％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或65％之间；在65％与100％、95％、90％、85％、80％、75％或70％之间；在70％与100％、95％、90％、85％、80％或75％之间；在75％与100％、95％、90％、85％或80％之间；在80％与100％、95％、90％或85％之间；或在85％与100％、95％、90％之间；在90％与100％或95％之间，或在95％与100％之间的重组组分)。
在标准环境温度和条件下(即，20-30℃和0.95-1.05大气压)，根据以上任一项所述的组合物可以是流体、半固体(例如，凝胶状)、固体或粉末。粉末可以包含小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于3％或小于1％；或在约0.1％与约20％之间(例如，在在0.1％与20％、15％、10％、5％或1％之间；在1％与20％、15％、10％或5％之间；在5％与20％、15％或10％之间；在10％与20％或15％之间；或在15％与20％之间)的水分含量。该粉末可以以粉末形式使用，或者该粉末可以在使用前用水合剂重构，或者该粉末可以在将水合剂添加到混合物中之前与其他干组分(例如，面粉、糖、矿物质、pH或离子强度调节剂)混合。
根据以上任一项所述的组合物可以是多种产品，包括例如囊状物(例如，将用于递送的治疗剂或营养物[例如，微米或纳米颗粒]包封的产品(例如，珠、胶束、胶囊、水凝胶))；具有工业实用性的组合物(例如，电介质)、粘合剂(即，形成粘合剂粘结的材料；例如胶水、壁纸粘合剂、木材粘合剂、纸粘合剂、软木粘合剂、硬纸板粘合剂、外科/医用胶水、水泥、粘液、浆糊)；涂层或饰面(例如光泽涂层、保护涂层、清漆、医用片剂涂层、纸涂层、油漆、皮革涂饰、纺织品涂层)；喷雾、油漆或油墨或用于油墨的颜料粘结剂、硬塑料(例如，瓶子、钮扣、窗户、笔)；中硬塑料(例如，瓶子、纤维[例如，纱线])；软塑料(例如，袋子、包裹材料、可食用膜、防水膜、隐形眼镜、包装材料)；织物(例如，纺织品、地毯、窗帘、衣服)；工业聚合物(即，用于制造合成工业材料的化合物)；医疗诊断(分别参见例如，J.Berger等人2004.EuropJof Pharm and Biopharm 57:19)；凝胶(例如，用于治疗剂的受控释放的水凝胶、用于固定蛋白质(例如，酶)的水凝胶)；植入物(例如，骨替代复合材料、支持神经修复的材料、用于生长细胞的支架、假体植入物)；衣着类商品(例如，鞋)；润滑剂；一件家具；纸制品(例如，纸片、纸标签、包装纸、照片支持物)；家庭用品(例如，盆、碗、碟、杯)；和生物支架(即，模拟生物基质的结构、缝合线、骨替代材料、支持神经修复的材料、用于生长细胞的支架、假体植入物、用于促进伤口愈合的膜、伤口敷料、组织工程支架)。
食物产品
根据以上任一项所述的组合物可以是食物产品。
如本文所用的术语“食物产品”是指可以被人或动物出于饮食目的摄入的组合物(即，没有不良健康影响，但由于胃肠道中消化物质的吸收而具有显著的营养和/或热量摄入)，该动物包括驯养动物(例如，狗、猫)、农场动物(例如，牛、猪、马)和野生动物(例如，非驯养的捕食动物)。该术语包括可以与一种或多种其他成分组合或添加至一种或多种其他成分以制成可以被人或动物摄取的食物产品的组合物。
该食物产品可以是补充食物产品(即，补充有根据以上任一项所述的重组组分的常规食物产品)，或者可以是替代食物产品(即，类似于常规食物产品并且可以用于替代常规食物产品的食物产品)，选自由美国国家健康与营养调查(National Health andNutrition Examination Survey，NHANES)定义的任何食物产品类别。
NHANES食物产品类别的非限制性实例包括零食和口香糖(例如，零食棒、薄脆饼干、来自谷物制品的咸味零食、咀嚼口香糖)；面包，谷物和面食(例如，燕麦面包和面包卷、玉米面包、玉米松饼、玉米饼、面粉和干混合物、饼干、多谷物面包和面包卷、全麦面包和面包卷、意大利面、黑麦面包和面包卷、碎小麦面包和面包卷、白面包和面包卷)；饮料(例如，啤酒和麦芽啤酒、浓缩饮料、饮料、能量饮料、运动饮料、液体替代品、软饮料、碳酸饮料、果汁、葡萄酒、啤酒、鸡尾酒、营养饮料、营养粉、富含蛋白质的饮料、咖啡、茶)；甜品和甜点(例如，蛋糕、糖果、薯片、曲奇、果馅饼、糕点、冰或冰棍、松饼、馅饼、糖替代物或替代品、糖浆、蜂蜜、果冻、果酱、罐头、沙拉、薄煎饼、丹麦酥、早餐糕点、甜甜圈)；早餐食品(例如，粮谷、谷物、稻、法式吐司、烙饼、华夫饼、咖啡蛋糕)；色拉调味料、油、酱汁、调味品(例如，烹饪油脂、植物油、沙拉酱、番茄酱、肉汁)；土豆(例如，土豆沙拉、土豆汤、薯片和薯条、炸土豆、土豆泥、酿土豆、泡芙)；和汤(例如，蔬菜汤、蔬菜肉汤)、饭食、主菜、蛋白质(例如，肉类替代品)和海鲜。
根据以上任一项所述的食物产品可以是补充乳制品(即，补充有根据以上任一项所述的重组组分的常规乳制品)或替代乳制品(即，类似于常规乳制品的食物产品)。如本文所用的术语“乳制品”是指奶(例如，全脂奶[至少3.25％乳脂]、部分脱脂的奶[1％至2％乳脂]、脱脂奶[小于0.2％乳脂]、烹调用的奶、炼乳、调味奶、山羊奶、绵羊奶、奶粉、淡炼乳、泡沫奶)，以及源自奶的产品，包括但不限于酸奶(例如，全脂酸奶[每170克至少6克脂肪]、低脂酸奶[每170克2至5克脂肪]、脱脂酸奶[每170克0.5克或更少的脂肪]、希腊酸奶[除去乳清的分层酸奶]、搅打过的酸奶、山羊奶酸奶、浓缩酸奶(Labneh)(labne)、绵羊奶酸奶、酸奶饮品[例如，全脂奶开菲尔(Kefir)、低脂奶开菲尔]、拉西酸奶奶昔(Lassi)、奶酪(例如，乳清奶酪，诸如乳清干酪；帕斯塔菲拉塔奶酪，诸如马苏里拉奶酪；半软奶酪，诸如哈瓦蒂干酪(Havarti)和门斯特干酪(Muenster)；中硬奶酪，诸如瑞士干酪(Swiss)和雅兹伯格奶酪(Jarlsberg)和哈鲁米奶酪(halloumi)；硬奶酪，诸如切达奶酪(Cheddar)和帕尔玛奶酪(Parmesan)；水洗凝乳干酪，诸如科尔比干酪(Colby)和蒙特利杰克奶酪(Monterey Jack)；软质成熟奶酪，诸如布里奶酪(Brie)和卡蒙贝尔奶酪(Camembert)；新鲜奶酪，诸如茅屋奶酪(cottage cheese)、菲达奶酪、奶油奶酪、潘纳尔(paneer)和凝乳；加工奶酪；加工奶酪食品；加工奶酪产品；加工涂抹奶酪；酶调节奶酪；冷包装奶酪)、基于乳的调味料(例如，色拉调味料、白谐眉沙司(bechamel sauce)、新鲜酱汁、冷冻酱汁、冷藏酱汁、耐贮藏酱汁)、乳制品涂抹酱(例如，低脂涂抹酱、低脂黄油)、奶油(例如，干奶油、浓奶油、淡奶油、搅打奶油、半鲜奶油(half-and-half)、人造稀奶油(coffee whitener)、咖啡奶精、酸奶油、法式鲜奶油)、冷冻甜食(例如，冰淇淋、冰沙、奶昔、冷冻酸奶、圣代冰淇淋、意式冰淇淋、蛋奶沙司)、乳制品甜点(例如，新鲜的、冷藏的或冷冻的)、黄油(例如，打发黄油、发酵黄油)、奶粉(例如，全脂奶粉、脱脂奶粉、填充脂肪的奶粉(即，包含植物脂肪以取代全部或一些动物脂肪的奶粉)、婴儿配方奶粉、乳蛋白浓缩物(例如，乳蛋白浓缩物、乳清蛋白浓缩物、脱矿物质乳清蛋白浓缩物、β-乳球蛋白浓缩物、α-乳白蛋白浓缩物、糖巨肽浓缩物、酪蛋白浓缩物)、乳蛋白分离物(例如，乳蛋白分离物、乳清蛋白分离物、脱矿物质乳清蛋白分离物、β-乳球蛋白分离物、α-乳白蛋白分离物、糖巨肽分离物、酪蛋白分离物)、营养补充剂、质地化混合物、调味混合物、着色混合物、冷藏或货架稳定的乳蛋白饮料、减肥饮料、营养饮料、即饮或即混产品(例如，新鲜、冷藏或耐贮藏乳蛋白饮料、减肥饮料、营养饮料、运动恢复饮料和能量饮品)、布丁、凝胶、咀嚼片、炸薯片、能量棒(例如，营养棒、蛋白棒)和发酵乳制品(例如，酸奶、奶酪、酸奶油、发酵白脱牛奶、发酵黄油、发酵无水黄油(cultured butter oil))。
根据以上任一项所述的食物产品可以是补充的动物肉或动物肉制品(即，补充有由根据以上任一项所述的重组宿主细胞和/或根据以上任一项所述的方法产生的根据以上任一项所述的重组组分的常规动物肉或动物肉制品)或替代动物肉或动物肉制品(即，类似于常规动物肉或动物肉制品的食物产品)。动物肉和动物肉制品的非限制性实例包括从动物获得的骨骼肌其他器官(例如，肾、心脏、肝、胆囊、肠、胃、骨髓、脑、胸腺、肺、舌)或它们的部分获得的鲜肉。动物肉可以是深色肉或白肉。可以获得动物肉或动物肉制品的动物的非限制性实例包括牛、羔羊、绵羊、马、家禽(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡)、飞禽(例如，鸽子、斑鸠、松鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸸鹋、雉鸡、鹌鹑)、淡水鱼或咸水鱼(例如，鲶鱼、金枪鱼、四鳍旗鱼、鲨鱼、大比目鱼、鲟鱼、鲑鱼、鲈鱼、北美狗鱼、梭子鱼、弓鳍鱼、雀鳝、鳗鱼、白鲟、鲷鱼、鲤鱼、鳟鱼、碧古鱼、黑鱼、莓鲈、姊妹鱼、贻贝、海扇贝、鲍鱼、乌贼、章鱼、海胆、墨鱼、被囊动物)、甲壳类动物(例如，螃蟹、龙虾、虾、藤壶)、狩猎动物(例如，鹿、狐狸、野猪、麋鹿、驼鹿、驯鹿、北美洲驯鹿、羚羊、斑马、松鼠、旱獭、兔子、熊、河狸、麝鼠、负鼠、浣熊、犰狳、豪猪、野牛、水牛、公猪、猞猁、山猫、蝙蝠)、爬行动物(例如，蛇、龟、蜥蜴、短吻鳄、鳄鱼)、任何昆虫或其他节肢动物、啮齿动物(海狸鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、田鼠、土拨鼠、水豚)、袋鼠、鲸和海豹。动物肉或动物肉制品可以被磨碎、剁碎、撕碎或以其他方式加工，并且可以是未烹饪的、正在烹饪的或烹饪过的。
根据以上任一项所述的食物产品可以是补充蛋制品(即，补充有根据以上任一项所述的重组组分的常规蛋或蛋制品)或替代蛋或蛋制品(即，类似于常规蛋或蛋制品的食物产品)。蛋或蛋制品的非限制性实例包括全蛋(例如，液体全蛋、喷雾干燥全蛋、冷冻全蛋)、蛋白(例如，液体蛋白、喷雾干燥蛋白、冷冻蛋白)、蛋黄、蛋料理、蛋汤、用蛋白制成的混合物、用蛋替代品制成的混合物、蛋黄酱、蛋羹和沙拉酱。
本文所提供的替代食物产品与常规食物产品的相似性可归因于任何物理属性、化学/生物属性、感官属性和功能属性以及它们的任何组合。
根据以上任一项所述的食物产品可以是宠物食品或动物饲料。
根据以上任一项所述的食物产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中包含的一种或多种重组蛋白之外的任何蛋白质。
根据以上任一项所述的食物产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中所含的一种或多种重组蛋白之外的任何重组蛋白。
根据以上任一项所述的食物产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中所含的一种或多种重组蛋白之外的任何重组乳蛋白。
根据以上任一项所述的食物产品可以基本上不含在哺乳动物产生的奶(例如，牛奶、山羊奶、绵羊奶、人奶、水牛奶、牦牛奶、骆驼奶、驼羊奶、羊驼奶、马奶、驴奶)中发现的组分，或者可以包含在哺乳动物产生的奶中发现的较低浓度的至少一种组分。哺乳动物来源的奶中发现的组分的非限制性实例包括乳糖、饱和脂肪、胆固醇、天然乳蛋白和天然乳脂。食物产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中所含的一种或多种重组乳蛋白之外的任何乳蛋白。
根据以上任一项所述的食物产品可以基本上不含从动物获得的组分(即，动物天然的组分，包括动物产品[即，动物的可消费部分或通常为人类消费而制备的部分；例如，动物肉、动物脂肪、动物血]、动物副产品[即，通常它们自身不可消费但为消费而屠宰动物的副产品的产品；例如，动物骨骼、动物尸体和从其分离的组分]、由动物产生的产品[例如，哺乳动物来源的奶、鸡蛋、蜂蜜]和由其产生的消费品[例如，明胶、凝乳、从哺乳动物来源的奶中提取的乳清蛋白、从哺乳动物来源的奶中提取的酪蛋白、从哺乳动物来源的奶中提取的奶脂、动物脂质、动物蛋白])，或者包含2质量％或更少的这种组分。
存在多种用于制备食物产品的配方，并且任何这样的食谱都可以用于生产根据以上任一项所述的食物产品。重组组分可以以纯化/分离的形式用于这种配方中，或者包含在通过根据以上任一项所述的方法获得的发酵液或制剂中。
化妆品或个人护理产品
根据以上任一项所述的组合物可以是化妆品或个人护理产品。
如本文所用的术语“化妆品或个人护理产品”是指在施用到身体表面(即，人体的暴露区域，诸如皮肤、毛发、指甲、牙齿和口腔组织[例如，牙龈])后赋予感知或实际的美容或卫生效果的组合物。化妆品或个人护理产品的非限制性实例包括抗皱处理(即，用于紧致[例如，使皮肤光滑、减少皮肤皱纹、去除皮肤细纹]的组合物)、抗衰老处理(即，用于去除衰老迹象[例如，皱纹、细纹、光损伤表现(例如，晒斑)]的组合物)、防晒(即，用于抗紫外线暴露的组合物)、抗灼伤治疗(即，用于使灼伤[例如，晒伤]光滑的组合物)、抗痤疮处理(即，在治疗痤疮和/或与之相关的症状中有效的组合物)、皮肤清洁剂(即，用于清洁皮肤和/或皮肤毛孔的组合物[例如，用于毛孔清洁的鼻贴])、去头皮屑处理(即，用于减少或消除头皮屑的组合物)、去体味治疗(即，用于减少或消除体味的组合物)、仿晒处理(即，用于使皮肤颜色变黑的组合物)、皮肤增白处理(即，用于使皮肤颜色美白/去色素的组合物)、染发处理(即，用于染发的组合物)、洗剂(例如，皮肤洗剂、身体护理洗剂、洗涤洗剂、保湿洗剂、剃须前洗剂、剃须后洗剂)、糊剂(例如，洗涤糊剂)、软膏、香膏、油膏、面膜、乳霜(例如，油包水乳霜、水包油乳霜、日霜、晚霜、眼霜、皮肤乳霜、面霜、抗皱乳霜、防晒乳霜、保湿乳霜、剃须后乳霜、皮肤美白霜、仿晒乳霜、维生素乳霜、保湿乳霜、按摩霜)、乳液(例如，身体乳、清洁乳)、凝胶(例如，无水凝胶、沐浴露)、淡香水、肥皂(例如，透明皂、奢华皂、除臭皂、奶油皂、婴儿皂、护肤皂、擦洗皂、合成皂(syndets)、膏状皂(pasty soaps)、软皂、去角质皂)、皮肤去角质处理、液体洗涤剂、淋浴和沐浴制剂(例如，洗涤乳液、淋浴、沐浴露、泡沫浴、油浴、擦洗制剂)、泡沫(例如，剃须泡沫、泡沫浴)、除臭剂、护发产品(例如，洗发水、护发素、发用摩丝、染发剂、喷发剂、漂洗液、发胶、发乳、亮发剂、生发液)、润唇膏、喷雾剂(例如，喷发剂、泵式喷雾剂、含发泡剂的喷雾剂)、皮肤缺陷处理(例如，皮炎、伤痕、皲裂、创痂、裂纹、疤痕、雀斑、色素痣、皮疹、水疱、脓疱)、爽肤水、清洁纸巾、卫生巾、月经棉条、尿布、防水剂、化妆产品(例如，演播室颜料、睫毛膏、眼影、眼线、眼线笔、胭脂、扑面粉、眉笔、口红、粉底、粉霜、遮瑕棒、抗痘急救棒(blemish sticks)、腮红)、棒(例如，口红、遮瑕棒、抗痘急救棒)、脱毛剂、手部清洁产品、私处卫生产品、足部护理产品、婴儿护理产品和口腔卫生产品(例如，口香糖、漱口水、牙膏、牙龈清洁剂、义齿黏著剂、义齿固定剂)。
根据以上任一项所述的化妆品或个人护理产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中所含的一种或多种重组蛋白之外的任何蛋白质。
根据以上任一项所述的化妆品或个人护理产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中所含的一种或多种重组蛋白之外的任何重组蛋白。
根据以上任一项所述的化妆品或个人护理产品可以基本上不含除了根据以上任一项所述的组合物中所含的一种或多种重组蛋白之外的任何重组乳蛋白。
根据以上任一项所述的化妆品或个人护理产品可以基本上不含在哺乳动物产生的奶(例如，牛奶、山羊奶、绵羊奶、人奶、水牛奶、牦牛奶、骆驼奶、驼羊奶、羊驼奶、马奶、驴奶)中发现的组分，或者可以包含在哺乳动物产生的奶中发现的较低浓度的至少一种组分。哺乳动物来源的奶中发现的组分的非限制性实例包括乳糖、饱和脂肪、胆固醇、天然乳蛋白和天然乳脂。化妆品或个人护理产品可能基本上不含除了重组蛋白中包含的乳蛋白或根据以上任一项所述的组合物中包含的重组蛋白之外的任何乳蛋白。
根据以上任一项所述的化妆品或个人护理产品可以基本上不含从动物获得的组分(即，动物天然的组分，包括动物产品[即，动物的可消费部分或通常为人类消费而制备的部分；例如，动物肉、动物脂肪、动物血]、动物副产品[即，通常它们自身不可消费但为消费而屠宰动物的副产品的产品；例如，动物骨骼、动物尸体和从其分离的组分]、由动物产生的产品[例如，哺乳动物来源的奶、鸡蛋、蜂蜜]和由其产生的消费品[例如，明胶、凝乳、从哺乳动物来源的奶中提取的乳清蛋白、从哺乳动物来源的奶中提取的酪蛋白、从哺乳动物来源的奶中提取的奶脂、动物脂质、动物蛋白])，或者包含2质量％或更少的这种组分。
根据以上任一项所述的化妆品或个人护理产品可以基本上不含源自石油的组分。
产生FFA释放酶活性的重组宿主细胞
在各个方面，本文提供了一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码FFA释放酶的重组表达构建体，并且与对应的宿主细胞(即，除了不包含编码FFA释放酶的重组表达构建体之外，与该重组宿主细胞基本上相同的宿主细胞)相比包含增加的FFA释放酶产量和/或活性。
该重组宿主细胞可以来源于任何野生型单细胞生物体，包括任何细菌、酵母、丝状真菌、古细菌、单细胞原生生物、单细胞动物、单细胞植物、单细胞藻类、原生动物和假菌界，或来源于其遗传变异体(例如，突变体)，以及来源于任何普遍认为安全(GRAS)的工业宿主细胞，并且包括本文所公开的任何生物体(例如，里氏木霉、黑曲霉、桔绿木霉、嗜热毁丝霉)。
根据以上任一项所述的重组宿主细胞可以包含如下FFA释放酶活性的增加的产量和/或活性，该FFA释放酶选自由以下组成的组：包含UniProt序列#G0RH85、G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、G0RVD2和G0R8A6、以及它们的同源物、以及它们的组合的FFA释放酶，其中该FFA释放酶的增加的产量和/或活性是产量和/或活性增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％或至少1,000％。
在各个方面，本文提供了一种用于获得包含编码FFA释放酶的重组表达构建体的重组宿主细胞的方法，其中该方法包括：i)获得根据以上任一项所述的多核苷酸、或根据以上任一项所述的重组表达构建体、或根据以上任一项所述的重组载体，其中该多核苷酸、该重组表达构建体或该重组载体的重组蛋白编码序列编码选自由以下组成的组的FFA释放酶活性：包含UniProt序列#G0RH85、G0R6T6、G0R6X2、G0R707、G0R7K1、G0R810、G0R9D1、G0R9F9、G0R9J9、G0R9X3、G0RBG0、G0RBJ0、G0RBM4、G0RBZ6、G0RD16、G0RDK5、G0RDU7、G0REM9、G0REZ4、G0RFR3、G0RFT3、G0RG04、G0RG60、G0RGD5、G0RGN7、G0RGQ0、G0RGQ7、G0RHJ4、G0RI29、G0RIJ9、G0RIU1、G0RIV5、G0RJ76、G0RJC6、G0RJY0、G0RK83、G0RKE6、G0RKH7、G0RKI9、G0RKL4、G0RL87、G0RLB0、G0RLB7、G0RLH4、G0RLL0、G0RLR3、G0RM14、G0RME5、G0RMI3、G0RNF8、G0RPQ8、G0RQD1、G0RQG3、G0RQJ5、G0RQN5、G0RR42、G0RRK3、G0RRQ4、G0RSK7、G0RTR6、G0RTT4、G0RUI0、G0RUZ9、G0RV93、G0RW73、G0RW77、G0RWS1、G0RWT9、G0RWY5、G0RX82、G0RX90、G0RHQ7、G0RVD2和G0R8A6、以及它们的同源物的FFA释放酶；和ii)将该多核苷酸、该表达构建体或该重组载体引入宿主细胞(例如，本文所公开的任何宿主细胞；使用本文所公开的任何方法)中来获得包含增加的FFA释放酶产量和/或活性的重组宿主细胞。
在各个方面，本文提供了一种用于生产FFA释放酶的方法，其中该方法包括：获得重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码FFA释放酶的重组表达构建体，并且与对应的宿主细胞相比包含增加的FFA释放酶产量和/或活性；在培养基中在适合于生产和/或分泌FFA释放酶的条件下培养重组宿主细胞；以及任选地纯化FFA释放酶。
实施例
包括以下实施例来说明本公开的具体实施方案。实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开的方法和过程中发挥良好作用的技术；然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施方案中进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不脱离本公开的精神和范围。因此，实施例中阐述或示出的所有内容均应被解释为说明性的，而不是限制性的。
实施例1：重组蛋白制剂的表达分析
通过在适合于生产和分泌重组β-乳球蛋白的各种条件下在2L罐中发酵重组里氏木霉宿主细胞来确定在各种重组里氏木霉宿主细胞(即，包含编码牛β-乳球蛋白的重组表达构建体的各种里氏木霉宿主细胞)中G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4 mRNA转录物的存在。在发酵期间的不同时间点采集生物质样品，并在液氮中快速冷冻。从样品中提取RNA，用琼脂糖凝胶电泳检查RNA质量，并且提交RNA用于RNA测序和读段处理/分析。评估编码G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白的转录物的表达水平。
如图1A和1B所示，产生重组蛋白的重组里氏木霉宿主细胞的发酵显示可检测的G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4转录物的表达。
实施例2：通过抑制去除FFA释放活性
如PCT专利公开WO2020/081789中所述，产生并发酵能够产生重组β-乳球蛋白并且包含基本上消除的角质酶(例如，cut1(UniProt#G0RH85))活性的重组里氏木霉宿主细胞(“角质酶敲除重组宿主细胞”)。基于电荷(即，静电相互作用)从重组里氏木霉宿主细胞的澄清发酵液中分离重组β-乳球蛋白，并且喷雾干燥以获得β-乳球蛋白粉末制剂。
为了从β-乳球蛋白粉末制剂中去除包含丝氨酸残基的FFA释放酶(诸如G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白)的活性，将粉末制剂溶解在水中至40g/L蛋白质的最终浓度。取溶液的两个1-mL样品作为样品1和样品2。向样品1中添加20μL二甲亚砜(DMSO)至2％的最终浓度。向样品2中添加20μL的在DMSO中的0.1mM膦酸盐底物抑制剂Thermo ActivX TAMRA-FP氟膦酸盐(ThermoFisher Scientific目录号88318；一种在其活性位点包含亲核丝氨酸的水解酶膦酸盐抑制剂的成员(Simon和Cravatt.2010.J.Biol.Chem.285(15):11051-11055))至2μM Thermo ActivX TAMRA-FP氟膦酸盐和2％DMSO的最终浓度。将样品在21℃下孵育18.5小时。
样品1和样品2中包含的对苯基(pNP)酰基酯水解酶活性通过以下方式来确定：首先用等体积的0.4M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7)稀释每个样品，然后用0.2M HEPES pH7连续稀释至1/128倍，与等体积的在10％DMSO中的0.3mM pNP酰基酯(pNP-丁酸酯、pNP-辛酸酯、pNP-月桂酸酯或pNP-棕榈酸酯)混合，并且在30℃下孵育。通过来自Molecular Devices(San Jose,California)的SpectraMax M3板读数器在来自GreinerBio-one(Monroe,North Carolina；目录号G55801)的UV-star板中每小时(1至6小时)测量反应混合物在348nm的吸光度。
如图2所示，样品1由四种pNP酰基酯的水解产生对硝基苯酚，其共同产生对应的FFA并且指示样品1中存在脂肪酶(作为酯酶)活性。样品2中基本上消除了这种FFA产生(即，脂肪酸酯水解酶活性)。
实施例3：通过纯化去除酯酶活性
如PCT专利公开WO2020/081789中所述，产生并发酵能够产生重组β-乳球蛋白并且包含基本上消除的角质酶(例如，cut1(UniProt#G0RH85))活性的重组里氏木霉宿主细胞(“角质酶敲除重组宿主细胞”)。基于电荷(即，静电相互作用)从重组里氏木霉宿主细胞的澄清发酵液中分离重组β-乳球蛋白，并且喷雾干燥以获得重组β-乳球蛋白粉末制剂。
将重组β-乳球蛋白粉末制剂重新溶解在水中至40或200g/L的浓度，并且分别将2.5或7.5mL的溶液与80或20μL在DMSO中的0.1mM ActivXTM脱硫生物素-氟膦酸盐丝氨酸水解酶探针(DTB-FP，目录号88317，ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)在21℃下反应。DTB-FP通过与磷和丝氨酸的侧链氧结合共价地结合在其活性位点包含亲核丝氨酸的FFA释放酶。在8小时后，添加100μL水合PierceTM高容量链霉亲和素琼脂糖(SA-A；ThermoFisherScientific,Waltham,MA)，并且将反应悬浮液在21℃下孵育(附接有DTB-FP的FFA释放酶通过生物素-亲和素结合与SA-A结合)。在21小时后，将悬浮液在1,000相对离心力(rcf)下离心2分钟，并且将上清液(包含重组β-乳球蛋白)与沉淀(包含结合的在其催化结构域中包含丝氨酸残基的FFA释放酶，诸如G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白)分离。
实施例4：重组G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白的产生
为了在里氏木霉中产生重组G0RLH4和G0RGQ0蛋白，使用本领域已知的基因工程方法构建重组载体。在图3中显示了重组载体的一般结构。重组载体包含重组表达构建体，该重组表达构建体包含编码G0RLH4或G0RGQ0蛋白的蛋白质编码序列，该蛋白质编码序列分别与N末端G0RLH4或G0RGQ0天然分泌信号序列可操作地连接并且在pSES启动子和pdc1终止子的控制下。重组表达构建体还包含编码合成转录因子的多核苷酸，以驱动G0RLH4或G0RGQ0表达构建体的表达。重组载体还包含可以指导重组表达构建体在里氏木霉宿主细胞基因组中的egl1基因座处整合的多核苷酸、用于选择细菌和/或真菌转化体的选择标记和细菌复制起点。在将重组载体转化到里氏木霉宿主细胞中之前，通过限制性酶消化从重组载体中除去细菌选择标记和复制起点。
为了在巴斯德毕赤酵母中产生重组G0RMI3蛋白，使用本领域已知的基因工程方法构建重组载体。在图4中显示了重组载体的一般结构。重组载体包含重组表达构建体，该重组表达构建体包含编码G0RMI3蛋白的蛋白质编码序列，该蛋白质编码序列与酿酒酵母的α交配因子的N末端前原分泌信号序列和C末端6x-His标签可操作地连接，并且在AOX1甲醇诱导型启动子和终止子的控制下。重组载体还包含用于选择细菌和/或真菌转化体的选择标记和细菌复制起点。在将重组载体转化到巴斯德毕赤酵母宿主细胞中之前，通过限制性酶消化从重组载体中除去细菌选择标记和复制起点。
将重组载体转化到里氏木霉或巴斯德毕赤酵母宿主细胞中(例如，通过使用热休克方案)，并且通过在基本培养基或进行阳性选择的抗生素上生长来选择转化体。转化体在24孔板的表达培养基中生长，并且收集上清液用于进一步分析。通过发酵液样品的SDS-PAGE或Western印迹凝胶分析来鉴定包含根据以上任一项所述的重组表达构建体的整合拷贝并且分泌重组G0RMI3、G0RLH4或G0RGQ蛋白的重组宿主细胞。
使用亲和柱(例如，HisTrap HP柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ))从发酵液中纯化重组G0RMI3蛋白，并且然后在pH8的50mM Tris-HCL、150mM NaCL、10％甘油的缓冲溶液中以0.16mg/mL的浓度(如通过Bradford测定所确定)洗脱。
未纯化重组G0RGQ0和G0RLH4蛋白，而是将来自5天时间的摇瓶中的上清液用于随后的实验。将1x108个孢子接种到摇瓶的100ml摇瓶基本培养基中。
如图5A-5C中所示，重组菌株产生G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白。
实施例5：使用脂肪分解测定分析G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白的FFA释放活性
使用基于检测由FFA结合和罗丹明B浓度引起的荧光信号的方法来证明G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白的FFA释放活性(Kouger和Jaeger.1987.Appl Env Microbiol.53(1):211-213)。为此，在24孔培养板的孔中各自填充3mL琼脂凝胶，该琼脂凝胶包含1体积％重量的琼脂、10mL/L向日葵椰子油混合物和5mg/L罗丹明B。然后将实施例3的G0RMI3蛋白制剂的10uL样品、实施例3的G0RGQ0或G0RLH4培养上清液的20uL样品、或等体积的阴性对照(即，不包含实施例3的任何表达构建体的里氏木霉菌株的上清液)移液到琼脂上。将24孔板在30℃下孵育48小时，然后用紫外透照仪照射以确定是否存在FFA。
如图6中所示，在含有G0RMI3、G0RGQ0或G0RLH4蛋白的孔中观察到荧光信号，但在阴性对照孔中没有，表明G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4蛋白可能导致从向日葵/椰子油底物中酶促释放FFA。
实施例6：使用冰淇淋酸败测定来分析G0RMI3蛋白的FFA释放活性
通过评价由包含该蛋白质的制剂生产的冰淇淋的酸败来证明G0RMI3蛋白的FFA释放活性。为此，生产了一种冰淇淋混合物，其包含溶解在水中的糖、麦芽糖糊精、盐、矿物质、胶质和牛乳清蛋白分离物。向该混合物中添加16质量％的脂质(即，从大豆、熔化的椰子油和熔化的向日葵油中获得的乳化的甘油单酯和甘油二酯)，并且将混合物在Ultraturrax(IKA Works,Wilmington,NC)中以20,000rpm混合30秒。将混合物转移到配备有刮面桨的Hot Mix Pro容器中，并且在82℃的保持温度和25秒的保持时间下以90rpm孵育。将成品冰淇淋基料巴氏灭菌并且均质化(2阶段：180/30巴＝210巴)，然后将大约207g该冰淇淋基料添加到250mL Schott瓶中，并且在55℃水浴中孵育。向混合物中添加15ug的G0RMI3蛋白，并且使用Ultraturrax以16,000rpm混合混合物至少60秒，然后在55℃水浴中孵育。在4小时后，将样品冷却并在4℃下储存7-8天。由感官专家在0小时、4小时、24小时和6-8天的时间点评价冰淇淋。发现包含G0RMI3蛋白的样品具有酸败气味和/或味道。
实施例7：使用酸奶酸败测定来分析G0RMI3蛋白的FFA释放活性
通过评价由包含该蛋白质的制剂生产的酸奶的酸败来证明G0RMI3蛋白的FFA释放活性。为此，首先将50mg YCX-11酸奶培养物(Chr.Hansen Inc.,Denmark)和80g全脂奶在搅拌板上低速混合至少10分钟，或者直到颗粒完全水合。将24ug纯化的G0RMI3蛋白和30g全脂奶的第二混合物在IKA Ultra Turrax TubeDrive(IKA Works,Wilmington,NC)中以2,000rpm混合3分钟。将18.5g等分试样的第一混合物添加到第二混合物中(最终浓度为0.025％w/w/酸奶培养物)中，并且将合并的混合物在IKA Ultra Turrax TubeDrive中以2000rpm混合1分钟。然后将样品倒入干净的80mL玻璃Weck广口瓶中，并且用60mm盖子和垫圈密封，并且在44℃下孵育4小时(或直到pH达到4.6+/-0.1)以获得酸奶。在24小时后、在3-4天后和在6-8天后，由感官专家评价酸奶中酸败气味和/或味道的存在。从24小时时间点开始，使用G0RMI3蛋白粉生产的酸奶被判定为酸败。
实施例8：通过遗传修饰去除酯酶活性
通过用被工程化以通过同源重组将选择性标记整合到编码G0RH85、G0RMI3、G0RGQ0和/或G0RLH4蛋白的基因中的多核苷酸(靶向载体)转化能够产生重组β-乳球蛋白的里氏木霉菌株(“对应的重组宿主细胞”)的原生质体来产生能够产生重组β-乳球蛋白并且包含基本上消除的G0RH85和G0RMI3(双重缺乏)；G0RH85、G0RMI3和G0RGQ0(三重缺乏)；G0RH85、G0RMI3和G0RLH4(三重缺乏)；G0RH85、G0RMI3和G0RLH4(三重缺乏)；以及G0RH85、G0RMI3、G0RGQ0和G0RLH4(四重缺乏)的FFA释放活性的重组里氏木霉宿主细胞。在图7中显示了靶向载体的一般结构。靶向载体包含选择标记(pyr4基因，其使得能够在没有尿嘧啶补充的情况下生长)，其侧翼为与里氏木霉基因组中的侧接每个基因的基因开放阅读框的上游和下游多核苷酸序列同源的多核苷酸序列。通过依次靶向基因座，并且通过在每一轮后回收标记，完成多个基因置换。
在基本培养基上选择转化体，然后通过PCR筛选以鉴定脂肪酶敲除重组宿主细胞。通过将细胞接种到含有5-氟乳清酸的培养基中，固化了脂肪酶敲除重组宿主细胞的选择性标记。取“固化的”细胞进行连续几轮的转化/固化，直到获得所有四个基因开放阅读框都被敲除的菌株。
将最终的敲除重组宿主细胞和对应的重组宿主细胞在适合于重组宿主细胞的生长以及重组β-乳球蛋白的产生和分泌的培养基中发酵。

Claims (44)

1.一种能够产生重组组分的重组宿主细胞，其中与对应的重组宿主细胞相比，所述重组宿主细胞包含降低的FFA释放酶产量和/或活性，其中所述FFA释放酶包含一种或多种第一FFA释放酶或由其组成，所述一种或多种第一FFA释放酶包含UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4或G0RMI3、或者与UniProt序列#G0RGQ0、G0RLH4或G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物。
2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
3.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
4.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
5.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
6.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
7.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
8.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
9.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述FFA释放酶还包含第二FFA释放酶，所述第二FFA释放酶包含UniProt序列#G0RH85或者与UniProt序列#G0RH85具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶。
10.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
11.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
12.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
13.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
14.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
15.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
16.如权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种第一FFA释放酶由包含UniProt序列#G0RGQ0或者与UniProt序列#G0RGQ0具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、包含UniProt序列#G0RLH4或者与UniProt序列#G0RLH4具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶、以及包含UniProt序列#G0RMI3或者与UniProt序列#G0RMI3具有至少70％氨基酸同一性的同源物的FFA释放酶组成。
17.如权利要求1至16所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞来源于细菌、酵母或丝状真菌。
18.如权利要求17所述的重组宿主细胞，其中所述丝状真菌选自曲霉属(例如，黑曲霉)、木霉属(例如里氏木霉、桔绿木霉)或毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)。
19.如权利要求1至18所述的重组宿主细胞，其中所述重组组分是重组蛋白。
20.如权利要求19所述的重组宿主细胞，其中所述重组蛋白是重组乳蛋白。
21.如权利要求20所述的重组宿主细胞，其中所述重组乳蛋白是重组酪蛋白。
22.如权利要求20所述的重组宿主细胞，其中所述重组乳蛋白是重组乳清蛋白。
23.如权利要求20所述的重组宿主细胞，其中所述重组乳蛋白具有的氨基酸序列与在牛、人、绵羊、山羊或马中发现的天然乳蛋白的氨基酸序列相同或是其同源物。
24.一种用于生产重组组分的方法，其中所述方法包括在培养基中在适合于生产所述重组组分的条件下发酵如权利要求1至23中任一项所述的重组宿主细胞。
25.一种用于生产包含重组组分的组合物的方法，其中所述方法包括通过如权利要求24所述的方法生产所述重组组分。
26.一种用于生产包含重组组分的组合物的方法，其中所述方法包括向发酵液、制剂或组合物中添加在其催化结构域中包含丝氨酸残基的FFA释放酶抑制剂。
27.一种用于生产包含重组组分的组合物的方法，其中所述方法包括使用基于活性的蛋白质谱(ABPP)小分子探针从所述重组组分中纯化出FFA释放酶。
28.一种包含重组组分的组合物，其中所述组合物通过如权利要求25至27中任一项所述的方法生产。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述组合物包含以干质量计在约0.1％与约100％之间的重组组分。
30.如权利要求28所述的组合物，其中所述组合物是食物产品。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述食物产品是补充食物产品。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述补充食物产品是补充乳制品。
33.如权利要求31所述的组合物，其中所述补充食物产品是补充蛋制品。
34.如权利要求30所述的组合物，其中所述食物产品是替代食物产品。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述替代食物产品是替代乳制品。
36.如权利要求34所述的组合物，其中所述替代食物产品是替代蛋制品。
37.如权利要求28所述的组合物，其中所述组合物是化妆品或个人护理组合物。
38.如权利要求28所述的组合物，其中所述组合物是粉末。
39.如权利要求28至38所述的组合物，其中所述重组组分是重组蛋白。
40.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物基本上不含除所述重组蛋白之外的任何蛋白质。
41.如权利要求39所述的组合物，其中所述组合物基本上不含除所述重组蛋白之外的任何重组蛋白。
42.如权利要求39所述的组合物，其中所述重组蛋白是重组乳蛋白。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述组合物基本上不含除所述重组乳蛋白之外的任何蛋白质。
44.如权利要求42所述的组合物，其中所述组合物基本上不含除所述重组乳蛋白之外的任何重组蛋白。
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