CN105246911A - 用于产生唾液酸化聚糖之具有转唾液酸酶活性的突变体唾液酸酶 - Google Patents
用于产生唾液酸化聚糖之具有转唾液酸酶活性的突变体唾液酸酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了具有转唾液酸酶活性的突变体酶(EC？3.2.1.18)，其特征在于与其亲本唾液酸酶相比具有增加的转唾液酸酶∶唾液酸酶比。另外所述酶可用于使单糖和寡糖转唾液酸化的方法，所述寡糖包括半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、麦芽寡糖(MOS)、异麦芽寡糖(IMO)、乳果糖、蜜二糖、麦芽糖、糖基蔗糖、乳果寡糖和岩藻糖。用该突变体酶产生的转唾液酸化的单糖和寡糖可用于制备婴儿配方食品、益生元营养补充剂和食品补充剂。
Description
技术领域
本发明涉及具有转唾液酸酶(trans-sialidase)活性的酶(EC3.2.1.18)，其通过突变衍生自锥虫(Trypanosomal)唾液酸酶。通过突变获得的酶特别可用于产生多样的唾液酸化的半乳寡糖(galacto-oligosaccharide，GOS)和果寡糖(fructo-oligosaccharideFOS)，这些是婴儿配方食品(infantformula)、益生元营养补充剂和食品补充剂中的重要添加剂。
背景技术
益生元是促进结肠中选定组的微生物之生长的膳食物质并且另外可具有其他健康益处。半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、乳果糖(lactulose)和异麦芽寡糖(isomaltooligosaccharide，IMO)是少数经充分确定的益生元。在人乳中，寡糖构成第三大组分，在围产期以高达20g/l至25g/l的量存在，随后下降至5g/L至15g/L。除少数例外，所有已知的人乳寡糖(HMO)具有乳糖核心并通过与一个或更多个半乳糖和N-乙酰葡糖胺单元连接而延长，并且可用几个唾液酸和岩藻糖残基进行修饰。已经鉴定了超过100种不同的这类聚糖结构，这些中约10％至20％被唾液酸化(Bode，2012，Glycobiology22(9)：1147-1162)。许多这些HMO的唾液酸化和/或岩藻糖基化似乎传达重要的功能特性。例如，HMO可与人病原体结合，例如，大肠杆菌K1(EscherichiacoliK1)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)和无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，从而降低婴儿中腹泻和其他疾病的发病率。HMO作为人病原体的可溶性诱饵受体起作用的这种能力很可能通过其多样性而增强，因为含甘露糖的糖蛋白、唾液酸化的聚糖和岩藻糖基化的聚糖各自靶向病原体的不同亚群(Kunz等，2000Ann.Rev.Nutrition20：699-722)。此外，唾液酸化的HMO可调节免疫系统；例如T细胞细胞因子的产生受到体外唾液酸化的HMO的刺激(Eiwegger等，2004，PediatricRev.56：536-540)。在大多数情况下，尚未鉴定活性的HMO分子，但在坏死性小肠结肠炎(一种婴儿中频繁发生且常常是致命性的疾病)的情况下，最近使用大鼠模型显示了由于单个分子二唾液酸乳-N-四糖而产生的保护作用(Jantscher-Krenn等，2012，Gut61：1417-1425)。
与人乳相比，形成多数婴儿配方食品之基础的牛乳具有非常低的寡糖含量，具有不同的唾液酸化和岩藻糖基化谱。在模拟人乳的组成的尝试中，奶粉配方目前补充有(非HMO的)GOS和FOS。然而，由于其缺乏唾液酸残基，所添加的GOS和FOS不可能提供如上所述的HMO的治疗益处(Bode，2012，同上)。
试图使GOS和FOS唾液酸化依赖于聚糖唾液酸化，这可以化学地实现以及使用不同类型的酶以酶促法实现[1]。例如，来自克氏锥虫(Trypansomacruzi)(查加斯病(Chagasdisease)的病原体)的转唾液酸酶(trans-sialidaseenzyme)(TcTS)已用于将唾液酸从供体转移到接受体聚糖[2]。然而，在工业生产食品级HMO的情况下，克氏锥虫(T.cruzi)转唾液酸酶有一个主要的缺点，即它构成了克氏锥虫内的一种重要的毒力因子[3]。
在非致病性让氏锥虫(Trypanosomarangeli)中发现的天然唾液酸酶(TrSA)已用作生产具有转唾液酸酶活性的突变体酶的起点[4]。虽然该唾液酸酶与TcTS的序列共有70％的序列同一性并且具有相同的整体三级结构，但是它是严格的水解酶，具有不可检测的转唾液酸酶活性[4]。唾液酸酶TrSA以及转唾液酸酶TcTS与作为催化性亲核体的酪氨酸共享共同的双替换机制[5][6]。在TcTS中，接受体结合位点由与接受体糖形成堆积相互作用的Tyr119和Trp312组成[7]。在TrSA中，发现Trp313(对应于TcTS中的Trp312)由于在284位的Gln而以不同的构象存在，然而它在120位具有Ser残基，对应于TcTS中的Tyr119[8]。除了接受体结合位点的这些差异之外，在这两种酶中，对唾液酸保守的Asp96氢键有差异，这可能是由于两个残基Val96Met和Pro98Ala有差异。初步尝试基于TrSA单个点突变体，但未能产生具有任何转唾液酸酶活性的酶。随后的研究揭示了需要5个点突变TrSA的组合，其包括在接受体结合位点的Ser120Tyr、Gly249Tyr和Gln284Pro以及在唾液酸结合袋(pocket)的Met96Val和Ala98Pro来赋予TrSA转唾液酸酶活性(TcTS的1％)。另外的单个突变Ile37Leu将转唾液酸酶活性的水平提高至克氏锥虫转唾液酸酶的10％[4]。此外，动力学数据表明与TcTS相比，这些TrSA突变体对于乳糖显示出＞25倍更低的亲和力和对不期望的竞争性水解作用有＞100倍更高的转换(kcat)[4]，表明在这种酶对转唾液酸化有任何实际价值之前还需要相当大的改进。
尽管TrSA和TcTS之间有相对接近的序列同源性，但是没有证据表明由让氏锥虫表达的天然唾液酸酶具有任何转唾液酸酶活性。由Smith等报道了来自让氏锥虫的TrSA基因的分离和表达[31]。分离的TrSA基因编码无活性的蛋白质，可能是由于严格保守的精氨酸被半胱氨酸残基替换，其通过协调唾液酸的羧基而发挥功能[31]。Smith等还向GenBank提交了编码唾液酸酶(Q08672)的TrSA基因，预测该基因是脱水唾液酸酶[32]。除了缺乏协调唾液酸的羧基所需的Arg残基之外，这种唾液酸酶(Q08672)缺乏建立接受体结合位点所需的突变S119Y和Q284P，并且由于这个原因不能用作转唾液酸酶。
Buschiazzo等[33]报道了预计编码TrSA，UNIPROT：Q08672的让氏锥虫基因的分离，其与TcTS具有70％的序列同一性，这是仅具有水解活性的其他TrSA的共同特征。发现对于获得具有可测量转唾液酸酶活性的突变体TrSA所必需的TrSA一级序列中的一个氨基酸替换是Gly249-Tyr，这降低了水解活性[4]。与Tyr120组合的第二个突变Ile-37Leu显著增强了这个突变体中转唾液酸酶的活性[4]。在TrSA，UNIPROT：Q08672中没有发现这些突变。
在人乳中，多种长度的乳糖或HMO可在α2-3或α2-6键处被唾液酸化，然后可以添加至末端半乳糖或近末端N-乙酰基-葡糖胺，从而有助于存在的HMO的多样性。尝试模拟这类复杂的寡糖组合物需要可以将唾液酸转移至多种不同的接受体基团的转唾液酸酶。虽然公认TcTS可唾液酸化聚糖的末端半乳糖，但是没有文件记载可使用其他接受体基团的转唾液酸酶，如果经合成获得HMO的多样性，使用其他接受体基团的转唾液酸酶是必要的。
因此，仍然需要具有转唾液酸酶活性的酶，其既不是毒力因子，也不衍生自致病性生物体；并且还不具有显著的唾液酸酶水解活性，以及可将唾液酸部分转移至一系列存在于聚糖分子中的不同接受体基团。
发明内容
根据第一实施方案，本发明提供了突变体多肽，其与SEQIDNO：2的28至372位氨基酸残基具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且其中SEQIDNO.2的197至203位残基包含一个或更多个经替换的氨基酸残基，导致SEQIDNO.2的197至203位残基产生至少+3的净正电荷，并且其中所述突变体多肽的序列中的37、96、98、120、249、284位氨基酸残基与SEQIDNO.2中对应的氨基酸残基具有100％的序列同一性，其中所述多肽具有转唾液酸酶活性(EC3.2.1.18)。与具有SEQIDNO：2的28至372位氨基酸残基之序列的多肽相比，本发明的多肽中SEQIDNO.2的197至203位残基至少+2，优选+3的净正电荷赋予了降低的水解酶活性。可通过SEQIDNO：2的突变获得突变体多肽，并且所述多肽的氨基酸序列可与SEQIDNO：2具有序列同一性，不同之处在于SEQIDNO.2的197至203位残基包含一个或更多个经替换的氨基酸残基，导致197至203位残基产生至少+2，优选+3的净正电荷。
根据第二实施方案中，突变体多肽另外包含选自以下的C末端接头和碳水化合物结合结构域(carbohydrate-bindingdomain)：a)包含SEQIDNO.2的373至638位氨基酸残基的让氏锥虫转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽；b)克氏锥虫转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽(SEQIDNO.8)；c)刚果锥虫(Trypanosomacongolense)转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽(SEQIDNO.9)；d)布氏锥虫(Trypanosomabrucei)转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽(SEQIDNO.10)。
突变体多肽可表达为融合蛋白，其包含同源或异源氨基末端信号肽和/或用于多肽的纯化的具有选择性底物结合亲和力的异源氨基末端肽或羧基末端肽。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含具有编码根据第一或第二实施方案的突变体多肽的核酸序列之DNA正链的DNA分子。
根据另一个实施方案，DNA分子可具有编码具有选自以下氨基酸序列之突变体多肽的核苷酸序列：
a)SEQIDNO.4的48至372位氨基酸残基；b)SEQIDNO.4的21至372位氨基酸残基；c)SEQIDNO.4的48至638位氨基酸残基；和d)SEQIDNO.4的21至638位氨基酸残基。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含编码突变体多肽之DNA分子的重组宿主细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞并且选自细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。所述DNA分子可整合到宿主细胞的基因组中或者可整合到宿主细胞中自我复制的质粒中。
根据另一个实施方案，本发明提供了用于产生本发明的突变体多肽的方法，其包括以下步骤：
a)提供重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码本发明突变体多肽的核酸序列，和b)在宿主细胞能够表达所述突变体多肽的培养基中孵育所述宿主细胞，以及c)从所述培养基中回收步骤a)中由所述宿主细胞表达的所述突变体多肽。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含本发明突变体多肽的酶组合物，其中所述组合物被配制为干粉、片剂或作为液体。
根据另一个实施方案，本发明提供了用于产生唾液酸化的单糖和/或寡糖的方法，其包括以下步骤：
a)提供唾液酸供体分子和包含能够被转唾液酸化的接受体单糖和/或寡糖的分子；b)使(a)的分子与本发明突变体多肽在水性溶液中相接触。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含通过本发明方法产生的唾液酸化的单糖和寡糖的组合物，其中所述组合物选自婴儿配方食品、益生元营养补充剂和食品补充剂。
附图说明
图1.A.唾液酸酶(EC3.2.1.18)的结构域结构，以克氏锥虫转唾液酸酶(TcTS)为例。催化结构域位于左侧(浅灰色)，碳水化合物结合结构域在右侧(深灰色)，这两个结构域通过肽接头(黑色)连接在一起。结合在活性位点中的配体(唾液酸乳糖)以黑色棒示出。B.本发明的突变体转唾液酸酶的卡通，示出了结构域结构(催化结构域肽；接头肽；凝集素肽(碳水化合物结合结构域))和突变的基序(197至203位氨基酸)的一个实例以及关于SEQIDNO：2的氨基酸残基位置。
图2.来自Tr6(具有第六位点突变I37L的TrSA5mut[PDB：1WCS]；SEQIDNO.2的26至372位氨基酸残基)的唾液酸酶催化结构域与相关转唾液酸酶的序列比对。使用ClustalW比对了来自克氏锥虫(SEQIDNO.5)、刚果锥虫(SEQIDNO.6)和布氏锥虫(SEQIDNO.7)的Tr6和转唾液酸酶。唾液酸结合位点在内的氨基酸以粗体示出。用实心圆表示七个氨基酸基序，用三角形表示回复突变，而用星号表示其他突变的位点。
图3.Tr13(本发明的突变体转唾液酸酶)的同源模型。具有唾液酸乳糖停靠(dock)(深灰色)的活性位点的特写。以灰色示出接受体结合位点残基Tyr-120和Trp-313以及催化性亲核体Tyr-343侧链。以浅灰色示出七个引入的氨基酸。
图4.Tr6以及使用cGMP作为唾液酸供体和甲基伞形基-焦半乳糖苷(methylumbelliferyl-pyrogalactoside)作为接受体衍生的突变体的转唾液酸酶活性。以任意单位示出了产物的形成。
图5.Tr6以及选择的突变体Tr13和Tr6D363E的酶活性。A)对底物pNP-Neu5Ac、3’-唾液酸乳糖和cGMP的水解酶活性。B)使用cGMP作为唾液酸供体和MU-gal作为接受体的转唾液酸酶活性。
图6.由Tr13催化的转唾液酸化的时间进程。在25℃、pH3、351mM乳糖和8mMcGMP结合的唾液酸的条件下，3’-唾液酸乳糖随时间的累积。
图7.由Tr13催化的唾液酸化聚糖的阴离子交换分离谱。在SepharoseQ上分离并在210nm下检测从唾液酸和未使用接受体分离的唾液酸化聚糖。
发明详述
唾液酸酶(EC3.2.1.18)的共同结构特征是具有活性位点的六叶片β-螺旋桨状(sixbladedβ-propeller)催化结构域，所述活性位点包含通过羧酸酯基团协调唾液酸的催化性精氨酸三联体，作为酸/碱催化剂的Asp残基以及Tyr/Glu亲核体对(图1)。催化结构域可另外与非必需碳水化合物结合组件(carbohydrate-bindingmodule，CBM)功能性地连接，所述非必需碳水化合物结合组件可用于识别唾液酸和/或帮助酶靶向其在细胞表面上的底物。产绿小单胞菌(Micromonosporaviridifaciens)分泌来自相同基因的两种形式的唾液酸酶，仅具有催化结构域的短的形式以及具有半乳糖结合组件的较长的形式，这取决于食物来源[29]。
I.衍生自让氏锥虫唾液酸酶的突变体转唾液酸酶
I.i包含催化结构域的突变体转唾液酸酶的结构
本发明提供了与其直接亲本唾液酸酶相比，具有增强的转唾液酸酶：唾液酸酶活性比的突变体酶(EC3.2.1.18)，突变体最终衍生自让氏锥虫的唾液酸酶(GenBank登录号：U83180.1)。在第一实施方案中，突变体酶是包含具有转唾液酸酶活性的至少一个催化结构域的多肽。催化结构域的氨基酸序列与SEQIDNO.2的28至372位氨基酸残基具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，且SEQIDNO.2的197至203位氨基酸残基(氨基酸基序)的一个或更多个氨基酸残基被替换，从而产生具有至少+2，优选+3的净正电荷的突变体氨基酸基序。突变体酶的表达产生单独含有催化结构域，具有转唾液酸酶活性的成熟酶(图1)。使用NCBI保守结构域搜索http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi确认了在SEQIDNO：2中催化结构域的位置[10]。
由SEQIDNO：2的197至203位氨基酸残基组成的氨基酸基序具有序列IADMGGR，其具有一个带正电荷的氨基酸(R)和一个带负电荷的氨基酸(D)，产生的净电荷＝0。具有+2或+3净正电荷的突变体基序可通过替换选自SEQIDNO：2的198至203位的一个或更多个氨基酸残基来获得，其中用带正电荷的氨基酸残基替换所选择的残基和/或用中性或带正电荷的氨基酸替换残基199(D)。合适的带正电荷的氨基酸选自K或R。替换残基199(D)的合适的中性氨基酸可选自极性中性氨基酸，包括天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸，或者非极性(疏水的)氨基酸例如包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。
例如，突变体基序可具有选自以下的任意氨基酸序列：IAXMGGR；IXZMGGR；IAZXGGR；IAZMXGR；IAZMGXR，其中X是K或R并且其中z是中性氨基酸，例如N，其中所述基序具有+2的净正电荷。
或者，突变体基序可具有选自以下的任意氨基酸序列：IXDXGGR；IXDMXGR；IXDMGXR；IADXXGR；IADMXXR，其中X是K或R并且其中Z是中性氨基酸，例如N，其中所述基序具有+2的净正电荷。
此外，突变体基序可选自以下的任意氨基酸序列：IXZXGGR；IAZXXGR；IAZMXXR；IAXMGXR；IAXMXGR；IAXXGGR；和IAZXXXZ，其中X是K或R并且其中Z是中性氨基酸，例如N，其中所述基序具有+3的净正电荷。
此外，突变体基序可具有选自以下的任意氨基酸序列：VTNKKKQ、ARNKANR、IANKKKQ和IANRRRQ。因此，根据一个实例，突变体酶是包含对应于SEQIDNO：4的28至372位氨基酸残基之催化结构域的多肽，其中由197至203位氨基酸残基组成的基序具有+3的正电荷。
本发明的突变体酶与让氏锥虫的唾液酸酶(GenBank登录号U83180.1)的区别在于位于催化结构域内另外的6个点突变。之前由Paris等，2005公开了让氏锥虫(T.rangeli)唾液酸酶中的这6个点突变[4]。因此，衍生出本发明突变体酶的直接亲本酶具有TrSA5mut的蛋白质序列(蛋白质数据库文件：1WCS)，其还包含I37L作为第六位点突变(对应于SEQIDNO：2)。
I.ii包含通过接头肽连接的催化结构域和碳水化合物结合肽(凝集素结构域)之突变体转唾液酸酶的结构
在第二实施方案中，突变体酶是这样的多肽，其包含根据第一实施方案的催化结构域(对应于SEQIDNO：2的28至372位氨基酸残基，其中由SEQIDNO.2的197至203位氨基酸残基组成的基序内一个或更多个氨基酸残基被突变，其中突变体基序具有至少+2，优选+3的净正电荷)以及其中两个结构域通过接头肽连接的C末端碳水化合物结合结构域。碳水化合物结合结构域和接头肽(包含非催化区)的氨基酸序列与SEQIDNO：2的373至638位氨基酸残基具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的序列同一性。C末端碳水化合物结合结构域以β-夹心折叠(β-sandwichfold)的方式单独从催化结构域折叠，使得两个结构域通过疏水界面相互作用。
第二实施方案的实例包括其中C末端结构域衍生自锥虫转唾液酸酶或唾液酸酶的突变体酶。例如，所述C末端结构域可选自：衍生自Tr6突变体让氏锥虫唾液酸酶之SEQIDNO：2的373至638位C末端氨基酸残基；具有衍生自克氏锥虫转唾液酸酶[UniprotIDQ26966]的373至642位氨基酸残基之SEQIDNO.8的C末端接头肽和碳水化合物结合肽；具有衍生自刚果锥虫(T.congolense)转唾液酸酶[UniprotIDG0WJG3]的452至702位氨基酸残基之SEQIDNO.9的C末端接头肽和碳水化合物结合肽；具有衍生自布氏锥虫(T.brucei)转唾液酸酶(UniprotID[Q57XJ2]的373至642位氨基酸残基之SEQIDNO.10的C末端接头肽和碳水化合物结合肽。
任选地，根据第一或第二实施方案的突变体酶是包含与对应于SEQIDNO：2的1至372位氨基酸残基之催化结构域融合的N末端肽区域的多肽。根据第二实施方案的一个实例，突变体酶是包含SEQIDNO：4的28至638位氨基酸残基或SEQIDNO：4的1至638位氨基酸残基的多肽。
I.iii突变体转唾液酸酶中的突变体氨基酸基序赋予了增加的转唾液酸酶唾液酸酶活性比以及唾液酸化产物的产率
之前由Paris等，2005[4]描述的让氏锥虫唾液酸酶突变体酶具有重大的缺陷，即它们保留了衍生其的亲本让氏锥虫唾液酸酶的水解催化特性。根据第一或第二实施方案的本发明突变体酶包含具有至少+2净正电荷的突变体基序(如在I.i和I.ii所定义的)。突变使得这种突变体基序大大降低了亲本唾液酸酶的水解酶活性(参见实施例3.3；图5A)。
突变体基序的催化作用是出人意料的，原因是所述基序相对远离接受体结合位点并因此不太可能直接影响接受体结合。位于结合槽(cleft)边界的带净正电荷的基序可改变槽中的静电场，从而产生提高的氢键供体能力，这种能力可潜在地破坏甚至逆转活性位点中的水网络(waternetwork)。水解需要水网络与朝向唾液酸的氧孤对(oxygenlonepairs)对齐。因此，在结合槽的边缘引入强的正电荷(例如，至少+2)和氢供体倾向，可使得氧孤对转向赖氨酸的领域，并且相应地削弱了槽中水网络的亲核性。水网络的这种破坏可以为水解的精确猝灭提供理论解释，通过其他唾液酸酶突变体不能实现。
当在最佳条件下进行测定时，由于其非常低的水解酶活性，突变体转唾液酸酶具有高的转唾液酸化产物产率(参见实施例4)。
I.iv突变体转唾液酸酶具有广泛的接受体底物特异性
与天然TcTS(已知其只作用于包含末端半乳糖的接受体底物)相比[24]，本发明的突变体转唾液酸酶具有出乎意料的广泛的接受体底物特异性。突变体转唾液酸酶既能够转唾液酸化末端半乳糖以及末端葡萄糖二者，甚至也能转唾液酸化葡萄糖与岩藻糖的单体。重要的是，突变体酶还能够以合理的产量转唾液酸化GOS和IMO以及乳果糖制备物(实施例5，表2)。使用突变体转唾液酸酶获得的唾液酸化的GOS和IMO产物是复杂的，表明在GOS和IMO混合物中不同链长的寡糖被唾液酸化。鉴于其广泛的接受体底物特异性，突变体转唾液酸酶特别适合在制造功能性食品成分和益生元中用于广泛的聚糖的酶促唾液酸化。GOS和IMO以及乳果糖是充分证明的用作营养补充剂的益生元化合物。
此外，突变体转唾液酸酶能够使用酪蛋白糖巨肽(caseinglycomacropeptide，cGMP)(其来自乳品业的侧流(side-stream))作为唾液酸供体(实施例5，图5)。总之，本发明的突变体酶的特征在于既具有高的转唾液酸酶：唾液酸酶活性比和非常广泛的接受体底物特异性二者，又具有额外优点：不衍生自非致病性宿主，也不是毒力因子。
II用于生产本发明突变体转唾液酸酶(包括表达载体和宿主细胞)的方法
IIi用于生产突变体转唾液酸酶的表达构建体
本发明还提供了包含具有编码根据第一和第二实施方案的突变体转唾液酸酶的核酸序列之DNA正链的DNA分子。为了在选择的宿主细胞中进行表达的目的，突变体转唾液酸酶可表达为具有包含信号肽序列的N末端同源或异源氨基端末肽的N末端翻译融合蛋白，并任选地随后有蛋白酶切割位点。合适的N末端融合蛋白可包含α因子信号序列和Kex2和/或Ste3蛋白酶识别序列。
为了纯化所表达的蛋白质，突变体转唾液酸酶可表达为翻译融合蛋白，其包含适于纯化多肽的具有选择性底物结合亲和力的异源肽(例如c-myc和6×His标签)，如SEQIDNO.12中所示。所述异源肽可位于融合蛋白中突变体转唾液酸酶的N末端或羧基末端，无论是添加至N末端信号肽/或独立于N末端信号肽。
根据一个实施方案，本发明提供了编码突变体转唾液酸酶的DNA分子，其选自以下：编码包含SEQIDNO：4的28至372位氨基酸残基之催化结构域的核苷酸序列；编码与包含SEQIDNO：4的1至372位氨基酸残基之催化结构域融合的N末端肽区域的核苷酸序列；编码与包含SEQIDNO：4的28至638位氨基酸残基之碳水化合物结合结构域连接的催化结构域的核苷酸序列；以及编码这样的N末端肽区域的核苷酸序列，所述N末端肽区域与包含SEQIDNO：4的1至638位氨基酸残基之碳水化合物结合结构域连接的催化结构域融合。
例如，编码突变体转唾液酸酶的DNA分子可选自：编码包含SEQIDNO：4的28至372位氨基酸残基之催化结构域的SEQIDNO：3的84至1116位核苷酸序列；编码与包含SEQIDNO：4的1至372位氨基酸残基之催化结构域融合的N末端肽区域的SEQIDNO：3的1至1116位核苷酸序列；编码与包含SEQIDNO：4的28至638位氨基酸残基之碳水化合物结合结构域连接的催化结构域的SEQIDNO：3的84至1914位核苷酸序列；编码这样的N末端肽区域的SEQIDNO：3的1至1914位核苷酸序列：所述N末端肽区域与包含SEQIDNO：4的1至638位氨基酸残基之碳水化合物结合结构域连接的催化结构域融合。
将编码待表达的突变体转唾液酸酶的DNA分子克隆到合适的自我复制的载体(质粒)或基因组整合型载体(质粒)中或为了将DNA分子引入到合适的表达宿主细胞的目的而进行PCR扩增。当将DNA分子克隆到载体中，DNA分子将被克隆到DNA启动子后面，由此启动子的核苷酸序列与编码突变体转唾液酸酶的核酸序列有效连接。用于在酵母或其他真菌中表达的合适的启动子元件包括Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、醇氧化酶启动子(AOX)、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子，而用于原核表达载体的启动子包括p-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)。
IIii包含突变体转唾液酸酶表达构建体的表达宿主
合适的表达宿主包括细菌(例如，大肠杆菌(Escherichiacoli)；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis))；酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha))或真菌(黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、绿色木霉(Trichodermaviridae))宿主。可采用本领域中已知的标准方案(例如通过电穿孔)转化来将编码待表达的突变体转唾液酸酶的DNA分子引入到宿主细胞中。优选地，将突变体转唾液酸酶与信号肽融合，从而促进所表达的蛋白质的分泌以及从宿主培养基对其随后进行纯化。
本发明提供了用于产生突变体转唾液酸酶的方法，其包括以下步骤：提供重组的宿主细胞，其中所述细胞包含编码根据第一或第二实施方案的突变体转唾液酸酶的DNA分子，并且在所述细胞能够表达所述突变体转唾液酸酶的培养基(例如生长培养基)中孵育所述宿主细胞，然后从宿主细胞培养和/或孵育培养基中回收由所述宿主细胞表达的所述突变体转唾液酸酶。
IIiii用于检测和测量突变体转唾液酸酶之比活性的方法
本发明提供了用于测定本发明突变体转唾液酸酶(其例如可通过重组表达而获得)的方法。实施例2.1描述了采用cGMP结合的唾液酸(例如1mM)作为供体底物和甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)作为接受体(例如0.5mM)以荧光为基础的测定，其中反应是在30℃下于50mM的磷酸盐-柠檬酸盐(pH6)中进行。
可按照实施例2.1和2.2中所描述，通过测量和确定酶用于转唾液酸酶反应相对于唾液酸酶反应的初始反应速率之比来确定本发明酶的转唾液酸化：唾液酸酶活性比。
III用于产生包含唾液酸化的单糖或寡糖之产物的方法
本发明还提供了用于产生包含唾液酸化的单糖或寡糖(聚糖)之产物的方法，其包括以下步骤：提供唾液酸供体分子和包含能够转唾液酸化的接受体(例如聚糖)的分子；提供根据第一或第二实施方案的突变体转唾液酸酶；使所述突变体转唾液酸酶与供体和接受体分子两者在水性溶液中相接触。
合适的唾液酸供体分子包括cGMP结合的唾液酸。cGMP的一种来源是来自乳品业的侧流(例如，奶酪加工废流)。其他来源包括胎球蛋白、多聚乙酰神经氨酸和游离唾液酸。含有唾液酸的乳清是在从乳类(如牛奶、山羊奶、绵羊奶)中生产奶酪或凝乳酶干酪素(rennetcasein)时获得的副产物。例如，脱脂乳凝固以形成农夫奶酪(cottagecheese)时通过分离固体而产生酸乳清。奶酪加工废流是奶酪制造中在凝乳形成后没有为奶酪保留的部分。奶酪加工废流通常指的是从凝乳中排出的流体，其通常被丢弃。奶酪加工废流可以是全乳清、去矿化乳清渗透液、来自去矿化乳清渗透液的再生流、乳清渗透液、乳清粉。
能够转唾液酸化的合适的接受体聚糖包括半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、麦芽寡糖(MOS)、异麦芽寡糖(IMO)、乳果糖、蜜二糖、麦芽糖、糖基蔗糖、乳糖、乳果寡糖(lactosucrose)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LnNT)、乳-N-岩藻戊糖I(LNFPI)和乳-N-岩藻戊糖V(LNFPV)和岩藻糖。
对于每个选定的接受体底物，可确定使用本发明表达的转唾液酸酶用于产生唾液酸化的产物的最佳底物浓度。根据本发明的方法产生的唾液酸寡糖可使用本领域已知的方法回收，包括但不限于：超滤、渗滤、电渗析、离子交换色谱法和相分配化学法。
IV用于产生包含唾液酸化的半乳寡糖的产物的方法
本发明还提供了用于产生唾液酸化的GOS的两步法，其包括以下步骤：提供乳糖的来源，使乳糖与能够将半乳糖残基从乳糖转移到能够通过转移半乳糖基化延伸的接受体分子(例如，乳糖或GOS)的β-半乳糖基转移酶相接触；接着进行将转移半乳糖基化的产物与唾液酸供体分子组合(如本文所述)以提供混合物的步骤；然后使混合物与根据第一或第二实施方案的突变体转唾液酸酶相接触以产生唾液酸化的GOS产物。在用突变体转唾液酸酶进行转唾液酸化的步骤之前，可包括富集和纯化转移半乳糖基化的产物(即GOS)的另外步骤。合适的β-半乳糖基转移酶是催化半乳糖转移的一种类型的糖基转移酶(EC.2.4.1)，这种酶在本领域中是公知的[30]。
V唾液酸化的单糖或寡糖及其组合物
本发明还提供了通过用本发明的转唾液酸酶处理单糖和/或寡糖底物而获得的唾液酸化的单糖和/或寡糖产物或者包含所述产物的组合物。包含唾液酸化的单糖和/或寡糖产物的组合物可包括婴儿配方食品、益生元营养补充剂或食品补充剂。
在本发明的上下文中，婴儿配方食品意指包含通过本发明方法获得的或可获得的唾液酸化之单糖和/或寡糖的食品，其适合婴儿在最初的4至6个月或甚至4至12个月的生命期间内用于营养用途，并且其本身满足了婴儿的营养需求。
在本发明的上下文中，益生元食品补充剂使用通过本发明方法获得的或可获得的唾液酸化之单糖和/或寡糖产物以增强益生元(例如乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)物种)的有益作用和功效，例如通过促进婴儿中早期双歧杆菌肠道菌群的形成，降低婴儿发生过敏和/或哮喘的危险，防止和治疗婴儿中的病原体感染(例如腹泻)来实现。
在本发明的上下文中，食物补充剂是消化性健康功能食品，使用的目的在于增强和保护消化健康并避免消化病症，其通过利用由本发明方法获得的或可获得的唾液酸化之单糖和/或寡糖产物，以液体、片剂、胶囊剂、或粉末形式作为生理功能性成分或组分来实现。
实施例
实施例1在酵母中克隆并表达让氏锥虫唾液酸酶基因突变体
1.1构建含有亲本唾液酸酶基因的载体(pPICZα-Tr6)
通过DNA2.0(MenloPark，California，美国)合成并密码子优化编码包含让氏锥虫唾液酸酶(PDB1WCS；SEQIDNO.1)之多肽的基因，所述多肽具有以下突变：M96V、A98P、S120Y、G249Y、Q284P和I37L[12]。将合成的基因插入到PICZαC载体(Invitrogen)的XbaI和XhoI限制性位点之间以产生基因(SEQIDNO.11)，所述基因编码包含突变体转唾液酸酶的翻译融合蛋白(SEQIDNO.13)，所述突变体转唾液酸酶具有N末端α因子信号序列，随后是Kex2和Ste3蛋白酶识别位点(SEQIDNO.12)和C末端c-myc和6×His标签(SEQIDNO.14)。所编码的成熟多肽具有662个氨基酸，在除去信号肽和蛋白酶识别位点之后，理论分子质量为73kDa。于37℃下在补充有25μg/mLzeocin的低盐LB(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物和5g/LNaCl)中伴随振荡，使质粒载体在大肠杆菌NM522中繁殖生长。
1.2亲本基因(Tr6)的突变
载体pPICZα-Tr6用作采用标准PCR突变方案使用重叠引物(表1)通过PCR引入额外突变的模板。将PCR产物插入pPICZαC的XhoI和XbaI位点之间。对构建体进行测序以证实突变并确保通过PCR没有引入不期望的突变。通过与亲本相比的氨基酸变化来表示Tr6的突变体(例如Tr6Q123R)，例外是Tr13表示的多突变体，其中197至203位氨基酸从IADMGGR变为VTNKKKQ。
表1
对限制性位点加下划线并且突变的核苷酸以粗体示出。
1.3表达并纯化在酵母中表达的Tr6及其突变体
基本上如在[14]中所述进行表达Tr6及其突变体的zeocin抗性的巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)X-33菌株的转化和选择。对于低规模的蛋白质合成，使携带具有突变基因的pPICZα的巴斯德毕赤酵母X-33于30℃下在180mLBMMY(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，100mM磷酸钾(pH6)，13.4g/L酵母氮源，0.4mg/L生物素和0.5％甲醇)中振荡生长3天。每24小时通过添加甲醇至0.5％的最终浓度来诱导蛋白质合成。通过在3000g下离心5分钟来移出细胞，随后使用0.2μmMinisart过滤器(SartoriusAG)无菌过滤上清液。使用具有30kDa截断值的Vivaspin20浓缩器(SartoriusAG)将所述上清液浓缩约100倍。按照生产商的说明使用Ni-sepharose(GEHealthcare)柱从浓缩的样品中纯化6×His标记的蛋白质，用PD-10柱(GEHealthcare)将其脱盐到含有20mM磷酸钠(pH7.4)，100mMNaCl和10％甘油的缓冲液中，使用具有50kDa截断值的Vivaspin0.5浓缩器(SartoriusAG)最终浓缩至约200μL。
对于大规模生产，如先前所述，使携带具有突变基因的pPICZα的巴斯德毕赤酵母X-33在5LSartoriusBiostatAplus发酵罐进行生长[13]。如先前所述，使用ml管整体柱通过(BIASeparationsGmbH，Villach，Austria)通过Cu2+亲和柱色谱法纯化6×His标记的蛋白质[14]。使用BCA蛋白质测定(Thermoscientific)用牛血清白蛋白作为标准物确定蛋白质浓度。
实施例2用于测量转唾液酸酶和唾液酸酶之酶促活性的方法
2.1转唾液酸酶活性测定
如先前所述测定转唾液酸酶的活性[17]，但进行了如下修改。在30℃下使用2.9μg/mL酶在50mM磷酸盐-柠檬酸盐(pH6)中反应进行。测定采用1mMcGMP结合的唾液酸作为供体底物和MU-Gal作为接受体。由于MU-Gal在水性溶液中的低溶解度，MU-Gal在0.5mM时为最高的待测试最终浓度。在准备反应之前，立即将87mM在DMSO中的MU-Gal溶液在50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH6)中稀释至2mM。当测定来自巴斯德毕赤酵母的粗酶制备物时，观察到背景信号，这是由于内源性β半乳糖苷酶对MU-Gal的切割。可通过在样品施加后不使唾液酸化产物解吸附的情况下，用440μL的5mMHCl将柱洗涤八次来除去此背景信号，并因此常规地完成这个过程。
2.2唾液酸酶活性测定
在含有50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH7)、0.75mMpNP-NeuAc和3μg/mL唾液酸酶的反应中测量唾液酸酶活性。通过添加底物来起始反应，随后于30℃下在410nm处进行分光光度测定。选择pH7以使得能够以持续测定的方式检测释放的pNP。将反应速率归一化为Tr6亲本酶的活性的百分比。对于天然底物水解的测量，使用1μg/mL的酶在50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5)中用1mM3’-唾液酸乳糖、1mM6’-唾液酸乳糖或1mMcGMP结合的唾液酸进行测定。通过添加酶开始反应，并通过添加H2SO4至45mM的最终浓度停止反应。使用2-硫代巴比妥酸测定[15]进行游离唾液酸的量化，修改之处在于用二甲基亚砜(DMSO)进行混合代替丁醇提取[16]。
实施例3唾液酸酶的结合槽边界上带正电荷的基序猝灭其水解活性
3.1选择Tr6唾液酸酶中用于突变筛选的候选残基
使用NCBI保守结构域搜索鉴定唾液酸酶的催化结构域[10]。使用Pymolv1.3鉴定唾液酸结合位点内的氨基酸。使用ClustalW比对让氏锥虫唾液酸酶突变体Tr6(见下文)和来自克氏锥虫(TcTS)(UniprotIDQ26966)、刚果锥虫(UniprotIDG0WJG3)和布氏锥虫(UniprotIDQ57XJ2)的转唾液酸酶[11](图2)。基于相对于底物是第一或第二球体以及基于极性/非极性和小/大的区别，对在Tr6与TcTS中替换的氨基酸之间的化学差异进行了排序；这些基于性质的选择导致与标准的替换矩阵(BLOSUM62)有很好的相关性，即认为最不可能的替换是值得关注的。使用具有自动模板选择(1ms9_A)的HHpred[12]制成了一个突变体Tr13的三维模型(图3)。手动改变Tyr120侧链构象使得其类似于溶解的结构(PDB1WCS)。克氏锥虫转唾液酸酶(TcTS)和让氏锥虫唾液酸酶(TrSA)氨基酸序列的比较，特别是位于唾液酸结合位点内的那些残基，揭示了大量的候选氨基酸残基，其替换可能导致前者的转唾液酸酶活性。评估了候选氨基酸在对表面暴露程度、氢键、化学结构/性质的改变程度方面的影响以及它们与接受体结合位点之间的距离。在此基础上，选择在图2中示出的催化结构域一级序列中描绘的单个残基或残基的组合以用于诱变。
3.2测量通过Tr6唾液酸酶突变体的转唾液酸化产物的净产量
为了评估突变体酶的性能，通过在巴斯德毕赤酵母中重组表达，用各个突变基因转化，通过在摇瓶培养物中培养来产生所述突变体酶。使用cGMP作为唾液酸供体和甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)作为接受体基于荧光测定来测量表达的突变体酶的转唾液酸酶活性(图4)。因为检测到的产物是转唾液酸酶活性(产物形成)和水解酶活性(产物降解)两者的量度，所以该测定提供了对具有更高转唾液酸酶与水解酶活性比之突变体的有效筛选。
3.3选择的Tr6唾液酸酶突变体催化转唾液酸化的产物产量的净增长
示出所有Tr6的唾液酸酶突变体为有活性的酶(图4)。最初引入到Tr6亲本唾液酸酶中的两个回复突变(P98A和Y249G)导致转唾液酸酶的活性相对于Tr6亲本降低。这证实了Tr6中这两个残基(P98和Y249)有助于该酶的转唾液酸酶活性。在所有测试的突变体中，只有两个突变体(即Tr13(包含VTNKKKQ基序)和Tr6D363E)相对于Tr6增强了转唾液酸酶活性，而所有的其他突变体显示了降低的转唾液酸酶活性。当Tr6亲本唾液酸酶由单一的氨基酸替换来突变以使197至303位残基(IADMKGR)产生+1净电荷时，与Tr6亲本相比，这导致了显著的活性丧失。因此，相对于Tr6，Tr13突变体中相应基序的净+3电荷似乎提供了转唾液酸酶活性显著的和预料不到的改进。在5L发酵罐中产生了亲本酶Tr6和两种突变体Tr13和Tr6D363E并纯化至足以表征其催化特性的量。使用人工底物对硝基苯神经氨酸(PNP-Neu5Ac)以及天然底物3’-唾液酸乳糖、6’-唾液酸乳糖和cGMP来测量水解酶活性。α-2，6-连接的唾液酸构成cGMP中总唾液酸含量的约50％[21]。因为酶都没有表现出对6’-唾液酸乳糖的可检测活性(数据未示出)，所以将cGMP中该α-2，6-连接的唾液酸用作供体是不太可能的。
Tr13对于所有的3个底物都表现出大大降低的水解酶活性，而D363E仅对pNP-Neu5Ac表现出降低的水解酶活性(图5A)。
在转唾液酸酶活性的时间进程测定中，初始测量的产物形成表示转唾液酸酶反应速率，而最大的产物形成是转唾液酸酶活性(产物形成)和水解酶活性(产物降解)的量度。同时，Tr6和Tr13似乎具有类似的转唾液酸酶活性，在这些反应条件下，Tr13产生两倍的转唾液酸化的产物产率(图5B)，证实了该Tr13突变体转唾液酸酶之降低的水解活性。相比之下，Tr6D363E具有与Tr6同样低的产物形成谱，与使用cGMP作为供体之其类似的水解活性一致(图5A)。
包含VTNKKKQ基序的Tr13突变体引入了三个赖氨酸残基，其中K200和K201部分地屏蔽活性位点(图3)，而K202指向活性位点的中心。单个突变G202K(其是VTNKKKQ基序的一部分)的引入并不赋予相同的特性，原因是与亲本相比，该突变体表现出降低的转唾液酸酶活性。用Tr13突变体获得的最大产率提高表明VTNKKKQ基序不影响接受体结合亲和力，而是唯一地降低水解活性(水kcat和/或KM)。
假设VTNKKKQ基序发挥其作用的机制涉及削弱攻击唾液酸的水亲核性(通过水网络的部分破坏)以及通过缩短与接受体竞争的水在活性位点中的滞留时间。该作用可以是接受体依赖性的，因为水解的总延长不仅取决于受损的水网络，而且还取决于转唾液酸化期间接受体的KM，其影响接受体相比于水的滞留时间，从而影响了水解与转唾液酸化之间的竞争。
因此，Tr13突变体转唾液酸酶代表改造因水解受损的唾液酸酶中的一大进步。VTNKKKQ基序的插入足以赋予低的水解酶活性，接近TcTS对唾液酸酶特征性的非常低水平的水解酶活性。TcTS与Tr6相比的区别在于TcTS具有非常低的水解酶活性和较高的乳糖亲和力。在大规模的蛋白质工程中，大幅度偏离野生型之具有改进特性的活突变体(通过13个位点的变化，包括有+3电荷差异的7个氨基酸环结构)不常见(如果不是前所未有的)。
实施例4Tr13突变体转唾液酸酶催化之转唾液酸化的最佳反应条件和比活性
4.1.Tr13突变体转唾液酸酶的最佳反应条件
采用二次中心组合设计(quadraticcentralcompositedesign)确定最佳反应条件(pH、温度以及供体和接受体的浓度)。将MODDE7.0.0.1版(UmetricsAB，Sweden)用作工具来设计实验框架以及通过多元线性回归分析来拟合和分析数据。对pH方案3、4和5，孵育温度20℃、40℃和60℃以及117mM、234mM和351mM的接受体乳糖浓度进行了测试。反应使用15μg/mLTr13，在具有特定pH值的15mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中使用8mM固定浓度的cGMP结合唾液酸。将乳糖和cGMP溶于缓冲液中并在特定温度下预孵育，之后通过添加酶来起始反应。生物催化过程允许进行20分钟，之后通过在90℃下加热10分钟停止反应。如在4.2中所述，通过HPAEC确定唾液酸乳糖的浓度。
鉴定出最好的反应条件是使用8mMcGMP在351mM乳糖(最高的测试值)、pH3(最低的测试值)和20℃下(最低的测试值)进行(数据未示出)。
4.2.唾液酸乳糖的量化
使用由GS50梯度泵、ED50电化学检测器、与AS50自动进样器偶联的AS50色谱室组成的DionexBioLC系统(DionexCorp.，Sunnyvale，CA)通过高效阴离子交换色谱法(HPAEC-PAD)来量化唾液酸乳糖。将样品(10μL)以1mL/分钟的流量注射到CarboPacTMPA1(4mM×250mM)分析柱(DionexCorp.，Sunnyvale，CA)上。洗脱程序基于在[18]中描述的方法，不同之处在于在洗脱系统中进行了以下给出的修改。洗脱系统包括去离子水(A)、0.5MNaOH(B)、1MNaOAc(C)。对于最初的3分钟，应用80∶20(％A∶B)等度洗脱，随后在3至27分钟从80∶20(％A∶B)至60∶20∶20(％A∶B∶C)通过线性梯度洗脱。通过在27至31分钟以40∶20∶40(％A∶B∶C)的等度洗脱来除去柱中强滞留的阴离子。随后用80∶20(％A∶B)使柱重新平衡7分钟。
4.3.Tr13突变体唾液酸酶催化的转唾液酸化的比活性
在这些条件下进行了时间研究并测定了酶的转唾液酸酶比活性(图6)。反应后接着进行100分钟时间段的取样并如实施例5所述的通过LC/MS测定唾液酸乳糖的浓度。使用热灭活酶制造了在t＝0分钟的样品。进行了三次重复并将各个数据系列拟合为二阶多项式函数。每个系列t＝0分钟的斜率用来计算比活性和标准差。
以Tr13转移的唾液酸部分数目测量的转唾液酸酶比活性为cGMP上每微克酶的4.4+/-0.7nmol＊分钟-1。很明显，通过将反应时间从20分钟延长至100分钟可获得较高的产物产率而没有可检测的降解产物，因为通过LC/MS没有检测到游离唾液酸。通过外推法来预测至少约2.5mM3’-唾液酸乳糖的最大产率(未测定)。在cGMP中，唾液酸作为α-2，3-唾液酸和α-2，6-唾液酸以约1∶1的比结合[21]，因此8mMcGMP结合的唾液酸中仅4mM在理论上可达到产生约63％的产率。
实施例5Tr13催化之唾液酸化聚糖的产生和纯化
如下测试了Tr13转唾液酸化不同聚糖接受体分子(GOS、IMO、乳果糖、蜜二糖、麦芽糖和岩藻糖)的能力。在搅动的玻璃瓶中于50mL蜜二糖和麦芽糖、88mL岩藻糖、100mL乳果糖以及250mLGOS和IMO的反应体积中进行反应。使用15μg/mL酶，于25℃下在具有351mM唾液酸接受体(GOS、IMO、乳果糖、蜜二糖、麦芽糖和岩藻糖)以及8mMcGMP结合的唾液酸的15mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH3)中进行反应。在反应之前，将底物在缓冲液中预孵育。将反应进行20分钟，然后在90℃下加热10分钟通过使酶失活来停止反应。
5.1转唾液酸化产物的分离
然后将反应混合物施加到装有402mLSepharoseQFF的HiScale50/20(GEHealthcare)阴离子交换色谱柱。在环境温度下，用配有P-900泵、UV-900监视器和Frac-950级分收集器(全部都由UNICORN软件(GEHealthcare)控制)的purifier100工作站完成分离。以70mL/分钟的流量进行洗脱并在210nm处监测。注射前，用5柱体积(CV)的水平衡柱。注射后，用3CV的水洗涤柱，其洗脱了中性的未反应的接受体分子。然后用3.5CV的40mM甲酸铵洗脱带负电荷的化合物，即唾液酸化的产物和后来游离的唾液酸。然后用2CV的400mM的甲酸铵将柱冲洗干净，然后用3CV的水再生。自动地收集目的级分。将产物冻干并通过反复溶解和冻干来除去甲酸铵。如下所述，通过LC/MS来确定产物结构。根据LC/MS分析，阴离子交换步骤将唾液酸化化合物从在反应中使用的唾液酸和接受体两者中完全分离(参见图7)。
5.2.通过毛细管液相色谱法/质谱法(LC/MS)鉴定转唾液酸化的产物
使用Agilent1100LC/Agilent6340离子阱MS系统进行LC/MS分析。使用Hypercarb多孔石墨碳(PGC)柱(0.32×150mm，5μm，Thermoscientific)在30℃下分离寡糖。将样品(0.5μL)上样到10mM碳酸氢铵中的柱上。使用由用氢氧化铵调节至pH8.5的(A)10mM碳酸氢铵和(B)100％乙腈的二元溶剂系统以5μL/分钟的流量来实现梯度洗脱。梯度最初以98∶2(％A∶B)进行5分钟，接着在33分钟线性提高至42∶58(％A∶B)。将B的该浓度保持3分钟。随后在40分钟将洗脱液恢复至98∶2(％A∶B)，并在下一次注射之前，使系统平衡10分钟。使用的所有溶剂均是最高HPLC级别。使用PEEKTM管(30cm×65μmID，IDEXHealth&Science)作为向MS系统的电喷雾离子源的输送线。以负离子模式进行质谱法分析，并在m/z150-2200的范围中进行扫描(2次微扫描，最大累积时间为150ms，离子电流计数为200,000)，接着在每次MS1扫描中对4种丰度最大的离子进行数据依赖性MS2扫描。
示出通过Tr13转唾液酸化的所有聚糖底物(图7)。通过Tr13产生的GOS和IMO唾液酸化产物的组成是复杂的(表2)。分别得到四种和五种不同的唾液酸化的化合物。在GOS的情况下，最低分子量的产物是唾液酸乳糖(632的m/z)，而用cGMP孵育IMO还导致产生唾液酸化的葡萄糖(470的m/z)，原因是起始材料在该单体中丰富。
表2.通过LC/MS分析的多种聚糖的唾液酸化产物。
按照产物浓度以及按照由使用的接受体产生之产物的％(w/w)给出产率。
ND；不能计算唾液酸化的GOS和IMO的摩尔浓度，原因是没有测定不同链长度的分布。
在产生的化合物中，产生的唾液酸乳果糖的摩尔产率最高。半乳糖和乳果糖中半乳糖与果糖之间的1，4-β键可以是特别容易进入Tr13活性位点槽的结构。虽然接受体蜜二糖(1，6-α-结合的半乳糖)和麦芽糖(1，4-α-结合的葡萄糖)大小相似，但是它们的唾液酸化产率低40％以上。
实施例6多种唾液酸化聚糖的益生元作用
6.1用于测量在唾液酸化聚糖上细菌生长的方法
用以下菌株进行在唾液酸化聚糖上细菌生长的测定：长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongumlongum)(Danisco全球培养物保藏中心，DaniscoGlobalCultureCollection，DGCC232)、婴儿长双歧杆菌(Bifidobacteriumlonguminfantis)(DGCC233)、婴儿长双歧杆菌(DGCC1497)、婴儿长双歧杆菌(DGCC2238)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)(NCFM，ATCC700396)、长双歧杆菌(B1-05，DGCC9917)、乳双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)(HN019，DGCC2013)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)(ATCC13124)。将所测试的唾液酸化底物以10％(w/v)溶于水中，并通过无菌过滤灭菌(0.2μmMinisart，SartoriusAG，Germany)。将来自马铃薯的半乳聚糖(MegazymeInternationalLTD，Bray，Co.Wicklow，Ireland)用作益生元标准对照，由于其高粘度，通过UV-辐射30秒进行灭菌。在37℃厌氧条件下，将细菌菌株在不添加另外的糖的MRS培养基(不合葡萄糖的deMan，Rogosa和Sharpe培养基)中预培养24小时，之后用新鲜的MRS培养基稀释至1％(v/v)。通过在多孔板中添加20μL10％的测试底物溶液和180μL1％的细胞悬浮液进行在测试底物上的生长，在生长之后，如先前[19]所述，使用在系统(Labsystems，Helsinki，Finland)中的软件(Labsystems)在600nm(OD600)下测量光密度。使用在不添加碳水化合物的MRS培养基中的生长作为对照。对于每个菌株和碳水化合物底物，将实验重复进行三次并将生长确定为生长曲线下的面积。数据表示为平均值±标准误。
为了评估唾液酸化的影响，将涉及比较唾液酸化接受体分子和未唾液酸化接受体分子上的细菌生长。因为在GOS和IMO的情况下，未量化不同链长度的唾液酸化分子的分布，所以将来自马铃薯的半乳聚糖用作对照，原因是其具有证实的益生元特性[26]。
6.2.Tr13转唾液酸化的聚糖对细菌生长的作用
测试的所有长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)菌株都包含唾液酸酶(利用唾液酸化的化合物的先决条件)以及包含代谢唾液酸所必要之酶的产气荚膜梭菌(C.perfringens)[27]。虽然在不同的底物上可以看到生长的变化(即使是在物种内)，但是很明显大多数细菌在一定程度上都能够在唾液酸化的化合物上生长。
如表3所示，唾液酸化的蜜二糖和麦芽糖似乎并未促进益生元菌株组的生长。通过不同的唾液酸化的化合物以不同程度促进婴儿长双歧杆菌(B.infantis)233、婴儿长双歧杆菌1497和长双歧杆菌(B.longum)232的生长，而唾液酸化的岩藻糖促进了所有三者的生长。然而，唾液酸化的化合物都未促进婴儿长双歧杆菌2238、乳双歧杆菌(B.lactis)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)和长双歧杆菌9917的生长，而嗜酸乳杆菌在益生元对照底物半乳聚糖上生长良好。与在测试的唾液酸化的化合物上所有益生元菌株相比，产气荚膜梭菌显著地生长更好。混合的培养物更可能揭示唾液酸化对益生元细菌的选择性生长作用。
表3.在唾液酸化聚糖上的细菌生长。
＊在唾液酸化聚糖上生长的益生元菌株和致病产气荚膜梭菌的生长曲线下面积；半乳聚糖用作对照；示出了所有细菌菌株在10g/L的底物浓度下的底物生长响应。给出的数据为3次重复的平均值并显示为±s.d。没有测试婴儿长双歧杆菌1497、乳双歧杆菌和产气荚膜梭菌在唾液酸蜜二糖上的生长，也没有测试婴儿长双歧杆菌1497在唾液酸麦芽糖上的生长(ND)。
最近，三种岩藻糖基化的HMO均表现刺激双歧杆菌，而大肠杆菌和产气荚膜梭菌均无法利用HMO[28]，且有机酸发酵产物抑制其生长。此外，唾液酸化的HMO的一个主要功能更归因于其作为诱饵分子和在调节免疫系统中的作用。
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Claims (15)
1.突变体多肽，其与SEQIDNO：2的28至372位氨基酸残基具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且其中：
a.SEQIDNO.2的197至203位氨基酸残基包含经替换的氨基酸残基，导致SEQIDNO.2的197至203位残基产生至少+3的净正电荷，
b.37、96、98、120、249、284位氨基酸残基与SEQIDNO.2中对应的残基具有序列同一性，
其中所述多肽具有转唾液酸酶活性。
2.根据权利要求1所述的突变体多肽，其中SEQIDNO.2中197至203位残基的氨基酸序列选自IXZXGGR；IAZXXGR；IAZMXXR；IAXMGXR；IAXMXGR；IAXXGGR；IAZXXXZ；ARNKANR和VTNKKKQ，其中X是K或R且Z是中性氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的突变体多肽，其中所述多肽还包含选自以下的C末端接头和碳水化合物结合结构域：
a.包含SEQIDNO.2的373至638位氨基酸残基的让氏锥虫(Trypanosomarangeli)转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽；
b.克氏锥虫(Trypanosomacruzi)转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽(SEQIDNO.8)；
c.刚果锥虫(Trypanosomacongolense)转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽(SEQIDNO.9)；
d.布氏锥虫(Trypanosomabrucei)转唾液酸酶的C末端接头肽和碳水化合物结合肽(SEQIDNO.10)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的突变体多肽，其具有选自SEQIDNO：4的28至372位；1至372位、28至638位和1至638位氨基酸残基的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的突变体多肽，其中所述多肽表达为融合蛋白，其包含同源或异源氨基末端信号肽和/或用于所述多肽的纯化的具有选择性底物结合亲和力的异源肽。
6.DNA分子，其包含具有编码根据权利要求1至5中任一项所述的突变体多肽之核酸序列的DNA正链。
7.根据权利要求6所述的DNA分子，其中核苷酸序列选自：
a.编码SEQID4的28至372位氨基酸残基的核苷酸序列；
b.编码SEQID4的1至372位氨基酸残基的核苷酸序列；
c.编码SEQID4的28至638位氨基酸残基的核苷酸序列；和
d.编码SEQID4的1至638位氨基酸残基的核苷酸序列。
8.重组宿主细胞，其包含根据权利要求6或7所述的DNA分子，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞，并且优选地选自细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞。
9.用于产生根据权利要求1至5中任一项所述的突变体多肽的方法，其包括：
a.提供重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据权利要求1至5中任一项所述突变体多肽的核酸序列，
b.在适合表达所述突变体多肽的培养基中孵育所述宿主细胞，以及
c.从所述培养基中回收步骤b)中由所述宿主细胞表达的所述突变体多肽。
10.酶组合物，其包含根据权利要求1至5中任一项所述的突变体多肽，其中所述组合物被配制为干粉、片剂或作为液体。
11.用于产生唾液酸化的单糖和/或寡糖的方法，其包括以下步骤：
a.提供唾液酸供体分子和包含能够被转唾液酸化的接受体单糖和/或寡糖的分子；
b.使(a)的分子与根据权利要求1至5中任一项所述的突变体多肽在水性介质中相接触。
12.根据权利要求11所述的方法，其中以乳品侧流、乳清或酪蛋白糖巨肽的形式提供所述供体分子。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中接受体聚糖选自以下的一种或更多种：半乳寡糖、果寡糖、麦芽寡糖、异麦芽寡糖、乳糖、乳果寡糖、乳果糖、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻戊糖I、乳-N-岩藻戊糖V、蜜二糖、麦芽糖、糖基蔗糖和岩藻糖。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述接受体聚糖是一种或更多种半乳寡糖，所述方法还包括使乳糖与β-半乳糖基转移酶相接触以产生一种或更多种半乳寡糖的在先步骤。
15.组合物，其包含根据权利要求11至14中任一项所述的方法产生的唾液酸化的单糖和寡糖，其中所述组合物选自婴儿配方食品、益生元营养补充剂和食品补充剂。
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