ES2630809T3

ES2630809T3 - Método de inspección de alimentos y kit de inspección de alimentos

Info

Publication number: ES2630809T3
Application number: ES08853849.1T
Authority: ES
Inventors: Yuriko Oyama; Tsutomu Honjoh; Masatoshi Sakai; Eriko Watanabe; Kaori Ito; Rieko Tsuruma
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 2007-11-30
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2017-08-24
Anticipated expiration: 2028-11-28
Also published as: US8859212B2; US20100304499A1; EP2224239A1; EP2224239A4; JP2009133712A; AU2008330507B2; EP2224239B1; AU2008330507A1; JP5133663B2; WO2009069779A1

Abstract

Un método de inspección de alimentos para la inspección de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento, que comprende: poner un alimento en contacto con un agente de extracción que comprende un sulfito para preparar un extracto alimentario en el que se extrae un componente en el alimento; a continuación, poner en contacto el extracto alimentario con un anticuerpo específico que reconoce específicamente una sustancia comprendida en un ingrediente especificado de interés para su inspección; y la inspección de la presencia o ausencia y/o de la cantidad del ingrediente especificado en el alimento utilizando un método de medición inmunológico usando inmunocromatografía o ELISA.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Metodo de inspeccion de alimentos y kit de inspeccion de alimentos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo de inspeccion de alimentos, y un kit de inspeccion de alimentos cada uno de ellos utilizado para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento.

Antecedentes de la invencion

En los ultimos anos, en respuesta a la creciente preocupacion de los consumidores sobre los problemas de alergia a los alimentos, se recomienda proporcionar paquetes de alimentos o similares con etiquetas que indiquen que contienen ingredientes que causan alergia a los alimentos. En particular, en lo que respecta a siete elementos consistentes en trigo, trigo sarraceno, huevos, leche, cacahuetes, camarones y cangrejos, todos ellos que es muy necesario que se indiquen teniendo en cuenta el numero de casos de alergia y su gravedad, haciendo por tanto tambien obligatorio que se requiera a los fabricantes el etiquetado de los alimentos que contienen esos ingredientes bajo la Ley de Saneamiento de Alimentos.

Ademas, el etiquetado que indica "que contiene un ingrediente especificado", "que no contiene ningun ingrediente especificado", o similar tambien proporciona un beneficio para los fabricantes debido a que el etiquetado permite que los consumidores reciban sus productos sin ansiedad.

En un alimento procesado a fabricar mediante la mezcla de varios ingredientes, puesto que es complicado el rastreo de registros para los ingredientes individuales, es deseable poder inspeccionar directamente un producto fabricado. Ademas, en una lmea de fabricacion se puede producir la contaminacion de una sustancia, que no se utiliza como ingrediente. Por lo tanto, desde los puntos de vista operativo y de mantenimiento de un producto y de la prevencion de un accidente imprevisto, existe la exigencia de proporcionar un metodo de inspeccion de alimentos que se pueda utilizar de manera rapida y sencilla incluso en plantas de fabricacion y que se pueda detectar con exactitud si un alimento contiene o no un ingrediente especificado.

En el caso de un alimento procesado, incluso en un componente derivado del mismo ingrediente, existe el problema de que, en algunas condiciones de fabricacion, se insolubiliza una sustancia contenida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion y por lo tanto es diffcil de extraer. En confitena horneada y similar, apenas se extrae la protema porque el calentamiento desnaturaliza la protema y los grupos tiol forman un enlace S-S. Ademas, tambien es concebible que una sustancia contenida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion interactue con otros componentes compuestos en un alimento procesado, y se insolubilice, dando como resultado una pobre eficiencia de extraccion.

No se prefiere una pobre eficiencia de extraccion durante la preparacion de un extracto de un alimento al considerar una demanda para detectar un ingrediente especificado de interes para su inspeccion con una buena precision. Ademas, tambien es concebible que la pobre eficiencia de extraccion genere variaciones en los resultados de la inspeccion.

Con el fin de hacer frente a los problemas mencionados anteriormente, por ejemplo, el Documento de patente 1 a continuacion desvela una invencion de un agente de extraccion de componentes alimentarios caracterizado por que contiene un agente reductor y un agente solubilizante. Ademas, el documento de patente describe que la incorporacion de un agente reductor para cambiar una estructura proteica y un solubilizante constituido por un tensioactivo, urea y similares en un agente de extraccion permite extraer una protema desnaturalizada y/o no desnaturalizada con mayor eficiencia que nunca.

Ademas, en inmunocromatograffa de metodos de medicion inmunologicos, se conoce un fenomeno llamado "fenomeno de prozona" en el que se reduce el valor de una medida cuando una sustancia (antfgeno) de interes para su inspeccion existe en una cantidad excesiva con respecto a la cantidad de un anticuerpo a utilizar. Debido al fenomeno de prozona, ha habido un problema en el sentido de que, cuando una muestra contiene una sustancia (antfgeno) de interes para su inspeccion en gran cantidad, la muestra puede ser evaluada como falso negativo, con el resultado de que la evaluacion carece de fiabilidad.

Documento de patente 1: JP-A-2006-71509

El documento JP 55 026817 desvela un agente colorante rojo para la coloracion de caramelos. El documento US 4.302.200 desvela un proceso para la extraccion de un color de tipo antocianina a partir de un producto natural. El documento DE 10 2004 029 887 desvela un suplemento dietetico. El documento WO 2004/000032 desvela un proceso para obtener un aislado de protema de canola mas ligero y menos amarillo. El documento JP 2007 278773 desvela un metodo para detectar la presencia de alergenos. El documento JP 2006 317226 desvela un reactivo de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

deteccion para detectar la presencia de protema animal tratada termicamente en una muestra.

Descripcion de la invencion

Problemas a resolver mediante la invencion

Sin embargo, aunque el Documento de patente 1 anterior ejemplifica, como agente reductor, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, o tris (2-carboxietil) fosfina), el 2-mercaptoetanol o el ditiotreitol han sido diffciles de usar en plantas de fabricacion de alimentos procesados a causa de su olor irritante. Ademas, la tris (2-carboxietil) fosfina o su agente reductor analogo, la tris (3-hidroxipropil) fosfina, o similar es un reactivo relativamente caro y por lo tanto es desventajoso en terminos de coste. Ademas, dichos agentes reductores tienen una accion reductora relativamente fuerte, y por lo tanto, la adhesion de una solucion altamente concentrada de la misma a la mucosa de la piel provoca inflamacion y quemaduras. Por lo tanto, los agentes reductores tambien han sido diffciles de usar en plantas de fabricacion de alimentos procesados desde el punto de vista de la seguridad de los trabajadores.

Por lo tanto, son objetos de la presente invencion proporcionar una tecnica de extraccion de un componente en un alimento a partir de alimentos usando un agente reductor que es barato y tiene una accion reductora suave, y proporcionar una tecnica para suprimir el fenomeno de prozona en la medicion de alimentos para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento utilizando inmunocromatograffa.

Medios para resolver los problemas

Los inventores de la presente invencion han estudiado intensamente con el fin de conseguir los objetos anteriormente mencionados. Como resultado, los inventores han centrado su atencion en el uso, como agente reductor para extraer un componente de un alimento, de un sulfito tal como sulfito de sodio que es un aditivo alimentario de uso comun. Por lo tanto, la presente invencion ha sido completada.

Es decir, se proporciona un metodo de inspeccion de un componente alimentario de la presente invencion.

El metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion es un metodo de inspeccion de alimentos para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento, caracterizado porque incluye: poner un alimento en contacto con un agente de extraccion que incluye un sulfito para preparar un extracto alimentario en el que se extrae un componente alimentario; a continuacion, poner el extracto alimentario en contacto con un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una sustancia incluida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion; e inspeccionar la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento utilizando un metodo de medicion inmunologico usando inmunocromatograffa o ELISA.

Segun el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion, debido a que el agente de extraccion contiene un sulfito, incluso en un componente en un alimento fabricado de una protema o similar, que se ha desnaturalizado mediante coccion o similar para formar un enlace S-S, el sulfito puede aumentar la solubilidad del componente para mejorar la eficiencia de extraccion. Ademas, en el caso de un alimento en forma ffquida o en forma de emulsion, se puede promover la solubilizacion de contenidos solidos en el alimento. Ademas, el metodo se emplea facilmente incluso en plantas de fabricacion de alimentos procesados porque no hay olor.

En el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion, el metodo de medicion inmunologico preferentemente es un metodo que utiliza inmunocromatograffa. Por consiguiente, el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion se puede emplear muy facilmente sin necesidad de un dispositivo especial. Ademas, se prefiere que el anticuerpo espedfico se marque con un coloide metalico. Por consiguiente, los resultados de las mediciones inmunologicas pueden evaluarse visiblemente mediante el marcador de coloide metalico.

Ademas, un metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona, que incluye: poner un alimento en contacto con un agente de extraccion para preparar un extracto alimentario en el que se extrae un componente en el alimento; a continuacion, poner el extracto alimentario en contacto con un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una sustancia incluida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion; e inspeccionar la presencia o ausencia y/o la cantidad del ingrediente especificado en el alimento utilizando un metodo de medicion inmunologico, que se caracteriza porque: se usa inmunocromatograffa como metodo de medicion inmunologico; y se suprime el fenomeno de prozona durante la medicion de inspeccion de alimentos incorporando dodecilsulfato de sodio y un sulfito en el extracto alimentario. Segun el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona, cuando la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento se inspecciona utilizando inmunocromatograffa, al incorporar dodecilsulfato de sodio y un sulfito en un extracto alimentario, que se somete a inmunocromatograffa, la detectabilidad puede mantenerse en regiones de baja concentracion en las que existe una sustancia (anffgeno) de interes para su inspeccion en un extracto alimentario en una cantidad relativamente pequena, mientras que el fenomeno de prozona puede prevenirse en regiones altamente concentradas en las que existe una sustancia (anffgeno) de interes para su inspeccion en un extracto alimentario en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

una cantidad relativamente grande. Esto permite una medicion fiable de la inspeccion de alimentos en un amplio intervalo de regiones de concentracion.

Ademas, en el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona, el sulfito es preferentemente al menos un tipo seleccionado entre sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio, y sulfito de hierro.

Ademas, en el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona, se prefiere que el ingrediente especificado de interes para su inspeccion sea trigo, y el anticuerpo espedfico sea un anticuerpo espedfico para la gliadina. En este caso, el extracto alimentario, que se somete a inmunocromatograffa, contiene gliadina en una concentracion preferentemente de 10 ng/ml a 100 pg/ml.

Ademas, en el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona, se prefiere que el ingrediente especificado de interes para su inspeccion sea la leche, y el anticuerpo espedfico sea un anticuerpo espedfico para la casema. En este caso, el extracto alimentario, que se somete a inmunocromatograffa, contiene casema en una concentracion preferentemente de 50 ng/ml a 100 pg/ml.

Mientras tanto, un kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion es un equipo de inspeccion de alimentos para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento, y se caracteriza por incluir: (1) un agente de extraccion y un sulfito a anadir al agente de extraccion o un agente de extraccion que incluye un sulfito anadido; y (2) un anticuerpo que reconoce espedficamente una sustancia incluida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion.

De acuerdo con el kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion, la inspeccion de alimentos se puede llevar a cabo a un bajo coste usando, como agente reductor, un sulfito que es un aditivo alimentario.

En el kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion, se prefiere que el kit incluya, como sulfito, al menos un tipo seleccionado entre sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio, y sulfito de hierro. Ademas, se prefiere que el anticuerpo se fije a un inmunocromatografo. Ademas, se prefiere que el kit de inspeccion de alimentos incluya ademas dodecilsulfato de sodio como elemento constituyente del kit.

Efectos de la invencion

Segun la presente invencion, se usa un sulfito tal como sulfito de sodio, que es un aditivo alimentario utilizado comunmente como agente reductor para extraer un componente de un alimento, y por lo tanto el sulfito es seguro y facil de utilizar incluso en plantas de fabricacion de alimentos procesados. Ademas, se puede realizar la extraccion para la inspeccion de alimentos a un bajo coste porque el sulfito es un agente reductor barato. Ademas, incluso si un sulfito contenido en un agente de extraccion aun permanece durante la medicion de la formacion de un complejo inmunitario con un anticuerpo espedfico, la medida no se ve afectada negativamente. Ademas, en la medicion utilizando inmunocromatograffa, la detectabilidad se puede mantener en regiones de baja concentracion en las que existe una sustancia (anffgeno) de interes para su inspeccion en una cantidad relativamente pequena, mientras que puede evitarse un fenomeno de prozona en regiones altamente concentradas en las que existe una sustancia (anffgeno) de interes para su inspeccion en una cantidad relativamente grande. Esto permite una medicion fiable en un amplio intervalo de regiones de concentracion.

Mejor modo para llevar a cabo la invencion

El metodo de la presente invencion implica la mezcla de un alimento con un agente de extraccion que contiene un sulfito, y la extraccion de un componente en el alimento. Una sustancia contenida en un ingrediente especificado (en lo sucesivo, denominada "sustancia de interes para su inspeccion") se transfiere al agente de extraccion junto con otros componentes. La forma de un alimento a inspeccionar puede ser cualquiera de una forma solida, una forma semisolida, una forma de gelatina, una forma ffquida y una forma de emulsion. El sulfito en el agente de extraccion puede aumentar la solubilidad de un componente en un alimento para mejorar la eficiencia de extraccion porque el sulfito puede reducir los enlaces S-S en una protema o similar para producir un grupo SH libre. Ademas, en el caso de un alimento en forma ffquida o en forma de emulsion, se puede promover la solubilizacion de contenidos solidos en el alimento.

Un ejemplo preferido del sulfito a utilizar en el metodo de la presente invencion incluye sulfito de sodio, que es un aditivo alimentario de uso comun. El sulfito se puede usar en una combinacion de dos o mas tipos de los mismos.

La concentracion del sulfito a utilizar en el agente de extraccion puede ajustarse apropiadamente dependiendo de las caracteffsticas del alimento a inspeccionar o de una "sustancia de interes para su inspeccion". Por ejemplo, cuando se usa sulfito de sodio como agente reductor, se recomienda ajustar la concentracion de aproximadamente 0,0001 a 1 M, preferentemente de 0,005 a 0,5 M, o mas preferentemente de 0,05 a 0,2 M.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ademas, al agente de extraccion anteriormente mencionado puede anadirse un adyuvante de solubilizacion para ayudar a la solubilizacion de un componente en un alimento. Ejemplos del adyuvante de solubilizacion que se puede usar generalmente incluyen adyuvantes de solubilizacion usados habitualmente tales como dodecilsulfato de sodio (en lo sucesivo, denominado SDS), urea, y un tensioactivo no ionico. El adyuvante de solubilizacion se puede usar en una combinacion de dos o mas clases de los mismos.

La concentracion del adyuvante de solubilizacion anteriormente mencionado en el agente de extraccion puede ajustarse apropiadamente dependiendo de las caractensticas del alimento a inspeccionar o de una "sustancia de interes para su inspeccion". Por ejemplo, cuando se usa SDS como adyuvante de solubilizacion, se recomienda ajustar la concentracion de aproximadamente el 0,01 al 10% en p/v, preferentemente del 0,03 al 5% en p/v, o mas preferentemente del 0,1 al 1% en p/v.

El agente de extraccion anteriormente mencionado se puede preparar mediante la disolucion del sulfito anteriormente mencionado o tanto el sulfito anteriormente mencionado como el adyuvante de solubilizacion anteriormente mencionado en un disolvente acuoso. Para un medio acuoso, se puede usar, por ejemplo, tampon de Tris-HCl, agua o un tampon fosfato de uso general. Ademas, teniendo en cuenta la facilitacion de las operaciones despues de la extraccion, el pH del agente de extraccion anteriormente mencionado generalmente se ajusta preferentemente a un pH de 6 a 8,5.

Por ejemplo, medios bien conocidos, tales como agitacion, mezcla, centrifugacion y filtracion se pueden usar adecuadamente para la extraccion para preparar un extracto alimentario. En este caso, se desea que un alimento se pulverice o se forme en una pasta para aumentar el area de contacto con el agente de extraccion, y la mezcla se llevara a cabo en un estado de contacto. Esto permite aumentar la eficiencia de la extraccion. Ademas, en este caso, la relacion de masa de un alimento a un agente de extraccion preferentemente es de 10 a 100 del agente de extraccion con respecto a 1 del alimento. Esto permite preparar un extracto alimentario altamente concentrado. En el extracto alimentario extrafdo como se ha descrito anteriormente, una "sustancia de interes para su inspeccion" en un alimento se transfiere al extracto junto con otros componentes. En este caso, en la presente invencion, la sustancia de interes para su inspeccion no necesariamente es de una sola clase. En cambio, se pueden usar dos o mas sustancias de interes para su inspeccion con respecto a un ingrediente especificado.

Mientras tanto, el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion es un metodo de inspeccion de alimentos para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento usando un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una "sustancia de interes para su inspeccion".

En el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion, primero, se extrae un componente en un alimento de la comida por el metodo anteriormente mencionado para preparar un extracto alimentario. Debe observarse que, tal como se describe mas adelante, debe formarse un complejo inmunitario de una "sustancia de interes para su inspeccion" y un anticuerpo espedfico. Por lo tanto, deben fijarse varias condiciones tales como una concentracion salina, un pH, una temperatura y un tiempo durante la preparacion del extracto alimentario anteriormente mencionado en un intervalo tal que la "sustancia de interes para su inspeccion" no pierda la antigenicidad al anticuerpo espedfico.

A continuacion, el extracto alimentario obtenido se pone en contacto con un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una "sustancia de interes para su inspeccion". Como resultado, se forma un complejo inmunitario mediante un mecanismo de union de una reaccion antfgeno-anticuerpo bien conocida. En este caso, el extracto alimentario mencionado anteriormente es un concepto que incluye una preparacion que se somete apropiadamente a un tratamiento tal como dilucion, concentracion y ajuste del pH para conseguir una condicion optima para la formacion de un complejo inmunitario y para un metodo de medicion inmunologico como se describe mas adelante. El metodo de medicion inmunologico para medir la formacion del complejo inmunitario tal como se ha descrito anteriormente puede detectar la presencia de una "sustancia de interes para su inspeccion" y ademas puede inspeccionar la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento.

La preparacion de un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una sustancia especificada es bien conocida para un experto en la tecnica. Por ejemplo, el Documento de patente 1 (JP-A-2003-294737) anterior desvela "una fraccion de IgG o un anticuerpo policlonal de un suero obtenido a partir de un suero de un mairnfero inmunizado con un antfgeno formado principalmente por una fraccion proteica correspondiente de 70 a 500 kDa de trigo sarraceno", el Documento de patente 2 (JP-A-2003-294738) anterior desvela "una fraccion de IgG o un anticuerpo policlonal de un suero obtenido a partir de un suero de un mai^ero inmunizado con un antfgeno formado principalmente por una fraccion proteica correspondiente de 30 a 100 kDa de cacahuetes", y el Documento de patente 3 (JP-A-2003-294748) anterior desvela "un anticuerpo obtenido a partir de un suero de un mai^ero inmunizado con una protema derivada de albumina". Dicha tecnica bien conocida puede usarse para preparar un anticuerpo espedfico que reconozca espedficamente una "sustancia de interes para su inspeccion".

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

En el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion, se mide la formacion de un complejo inmunitario utilizando un anticuerpo espedfico por los metodos de medicion inmunologicos bien conocidos, un metodo de ELISA y inmunocromatograffa. De estos, preferentemente se usa inmunocromatograffa porque no hay necesidad de usar un instrumento de medicion, los resultados de la medicion inmunologica se pueden juzgar visualmente de una manera simple, y la velocidad es rapida y la sensibilidad tambien es alta. El principio de la inmunocromatograffa es bien conocido por un experto en la materia tal como se describe en los documentos JP-A-05-5743 y JP-A-2002- 202307.

Sin embargo, para su confirmacion se describe brevemente un ejemplo del principio. Un primer anticuerpo espedfico se inmoviliza en forma de banda en una region especificada (posicion de la ffnea de ensayo) en un soporte de peffcula delgada, tal como una membrana de celulosa, y se retiene un segundo anticuerpo espedfico marcado de manera movil en una porcion de goteo de la muestra o que esta adyacente aguas abajo en las otras regiones. En lo sucesivo, en la presente invencion, un vetffculo soportado con anticuerpo construido como se ha descrito anteriormente se denomina "inmunocromatografo".

Cuando se gotea un objetivo de analisis a una porcion de goteo de muestra junto con un disolvente para el objetivo de analisis, el objetivo de analisis y el segundo anticuerpo espedfico marcado se revelan en el soporte de peffcula delgada por un fenomeno capilar. Si el objetivo de analisis contiene una "sustancia de interes para su inspeccion", el segundo anticuerpo espedfico, que se ha revelado de la misma manera que el objetivo de analisis durante el revelado del objetivo de analisis en el soporte de peffcula delgada, se une a una "sustancia de interes para su inspeccion". En este caso, el segundo anticuerpo espedfico esta unido preliminarmente a una sustancia coloreada o colorante como marcador, y por lo tanto, la "sustancia de interes para su inspeccion" se une al marcador. Despues de esto, la "sustancia de interes para su inspeccion" se une a un primer anticuerpo espedfico inmovilizado en una posicion de la ffnea de ensayo, y el primer anticuerpo espedfico se une al segundo anticuerpo espedfico como un sandwich a traves de la "sustancia de interes para su inspeccion". Como resultado, debido a que los marcadores se reunen en la posicion de la ffnea de ensayo, parece que se forma una banda en la posicion de la ffnea de ensayo. Con la aparicion de la banda, se juzga que la "sustancia de interes para su inspeccion" existe en el objetivo de analisis. Mientras tanto, cuando el objetivo de analisis no contenga la "sustancia de interes para su inspeccion" o contenga una "sustancia de interes para su inspeccion" en una cantidad igual o inferior al ffmite de deteccion, no aparece una banda en la posicion de la ffnea de ensayo. La inmunocromatograffa es un metodo rapido y sencillo, que tarda aproximadamente de 5 a 15 minutos despues de que el objetivo de analisis se haya goteado a una porcion de goteo de muestra.

Los ejemplos del marcador anteriormente mencionado que se pueden usar incluyen un coloide metalico, un marcador enzimatico, parffculas de latex coloreadas, y parffculas de carbono, y en terminos de facilidad en el marcaje de un anticuerpo se prefiere un coloide de oro.

En este caso, la razon por la que se produce el fenomeno de prozona en la inmunocromatograffa probablemente se deba a que una sustancia (anffgeno) de interes existe en exceso, y por lo tanto se une al primer anticuerpo espedfico y al segundo anticuerpo espedfico mencionados anteriormente en un estado de sobresaturacion, que inhibe la formacion de una estructura en sandwich a traves de la "sustancia de interes para su inspeccion" en la posicion de la ffnea de ensayo.

En el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona, se prefiere incorporar preliminarmente dodecilsulfato de sodio y un sulfito en un agente de extraccion para su puesta en contacto con un alimento. Ademas, se recomienda incorporar dodecilsulfato de sodio y un sulfito en un extracto alimentario, que se somete a inmunocromatograffa.

Ademas, la cantidad de dodecilsulfato de sodio se ajusta para que la concentracion del mismo en el extracto alimentario, que se somete a la inmunocromatograffa, alcance preferentemente de aproximadamente el 0,01 al 5% en p/v, mas preferentemente de aproximadamente el 0,02 al 3% en p/v o, lo mas preferentemente, de aproximadamente el 0,02 al 1% en p/v. No se prefiere una concentracion inferior al intervalo mencionado anteriormente porque el efecto de supresion del fenomeno de prozona es pobre. Ademas, no se prefiere una concentracion superior al intervalo mencionado anteriormente, porque, por el contrario, la detectabilidad por inmunocromatograffa puede verse afectada. Para el ajuste a la concentracion anteriormente mencionada, se recomienda que el extracto anteriormente mencionado se diluya apropiadamente con, por ejemplo, medios acuosos tales como agua, un tampon fosfato usado habitualmente o un tampon de Tris-HCl. El aumento de la dilucion preferentemente es de 5 a 20 veces.

Mientras tanto, la cantidad del sulfito se ajusta para que la concentracion del mismo en un extracto alimentario, que se somete a la inmunocromatograffa, alcance preferentemente de aproximadamente 0,0001 a 1 M, mas preferentemente de aproximadamente 0,001 a 0,1 M, o mas preferentemente de aproximadamente 0,005 a 0,03 M. No se prefiere una concentracion inferior al intervalo mencionado anteriormente porque el efecto de solubilizacion de una sustancia (anffgeno) de interes para su inspeccion estable a partir de un alimento procesado es deficiente. Ademas, no se prefiere una concentracion superior al intervalo mencionado anteriormente, porque, por el contrario, la detectabilidad por inmunocromatograffa puede verse afectada. Para el ajuste a la concentracion anteriormente

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mencionada, se recomienda que el extracto anteriormente mencionado se diluya apropiadamente con, por ejemplo, medios acuosos tales como agua, un tampon fosfato usado habitualmente o un tampon de Tris-HCl. El aumento de la dilucion preferentemente es de 5 a 20 veces.

Entre los ejemplos de sulfito a utilizar en el metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime un fenomeno de prozona se incluyen sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio, y sulfito de hierro. Ademas, los ejemplos preferidos incluyen sulfito de sodio que es un aditivo alimentario de uso comun. Estos sulfitos se pueden usar en una combinacion de dos o mas tipos de los mismos.

El metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona se aplica preferentemente cuando un ingrediente especificado de interes para su inspeccion es el trigo, y se usa un anticuerpo espedfico para la gliadina como anticuerpo espedfico, por ejemplo. En este caso, el extracto alimentario sometido a inmunocromatograffa contiene gliadina a una concentracion preferentemente de 10 ng/ml a 100 pg/ml, mas preferentemente de 100 ng/ml a 100 pg/ml, o lo mas preferentemente de 10 pg/ml a 100 pg/ml. No se prefiere una concentracion inferior al intervalo mencionado anteriormente porque la deteccion se hace diffcil. Ademas, no se prefiere una concentracion superior al intervalo mencionado anteriormente, porque, por el contrario, la detectabilidad por inmunocromatograffa puede verse afectada.

El metodo de inspeccion de alimentos de la presente invencion en el que se suprime el fenomeno de prozona preferentemente se aplica cuando un ingrediente especificado de interes para su inspeccion es la leche, y se utiliza un anticuerpo espedfico para la casema como anticuerpo espedfico, por ejemplo. En este caso, el extracto alimentario sometido a inmunocromatograffa contiene casema en una concentracion preferentemente de 50 ng/ml a 100 pg/ml, o mas preferentemente de 10 pg/ml a 100 pg/ml. No se prefiere una concentracion inferior al intervalo mencionado anteriormente porque la deteccion se hace diffcil. Ademas, no se prefiere una concentracion superior al intervalo mencionado anteriormente, porque, por el contrario, la detectabilidad por inmunocromatograffa puede verse afectada.

Mientras tanto, el kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion puede utilizarse adecuadamente para un metodo para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento. En particular, el kit de inspeccion de alimentos se puede usar preferentemente para el metodo de inspeccion de alimentos anteriormente mencionado de la presente invencion.

Entre los ejemplos de sulfito a utilizar en el kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion se incluyen sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio, y sulfito de hierro. Se prefiere el sulfito de sodio que es un aditivo alimentario de uso comun. El sulfito se puede usar en una combinacion de dos o mas tipos de los mismos. El sulfito, que se ha disuelto en un disolvente tal como agua o un tampon, se puede suministrar al kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion.

El kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion ademas puede incluir dodecilsulfato de sodio como elemento constitutivo del kit. El dodecilsulfato de sodio, que se ha disuelto en un disolvente tal como agua o tampon, se puede suministrar al kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion.

En el kit de inspeccion de alimentos de la presente invencion, un anticuerpo que reconoce espedficamente una sustancia contenida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion esta fijado deseablemente a un inmunocromatografo. En este caso, el termino "fijado" significa que dos o mas objetos estan unidos entre sf y estan en tal estado que su separacion solamente se puede conseguir por destruccion o pago de gastos excesivos. Es decir, el termino significa que un anticuerpo que reconoce espedficamente una sustancia contenida en un ingrediente espedfico de interes para su inspeccion esta soportado, se retiene o se inmoviliza en un inmunocromatografo, por ejemplo. A continuacion, cuando el anticuerpo anteriormente mencionado esta fijado a un inmunocromatografo, el anticuerpo se mantiene, por ejemplo, o se inmoviliza directamente sobre un soporte de peffcula delgada, tal como una membrana de celulosa que forma el inmunocromatografo, o se retiene, por ejemplo, en una pieza porosa pequena como papel de filtro unido a un soporte de peffcula delgada.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invencion se describe espedficamente a modo de ejemplos, pero estos ejemplos no tienen la intencion de limitar el alcance de la presente invencion.

<Ejemplo de ensayo 1> (Deteccion de gliadina de trigo)

Cada alimento procesado como se describe en la Tabla 1 a continuacion se homogeneizo con un mezclador. A 1 g del producto homogeneizado se le anadieron 19 ml de un agente de extraccion como se muestra en la Tabla 2 a continuacion y la mezcla se agito a un ciclo de aproximadamente 100 rpm durante 12 a 16 horas. La mezcla agitada se centrifugo a 3000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se filtro con papel de filtro (ADVANTEC n.° 5A) para preparar un extracto alimentario.

5

10

15

20

25

30

35

40

El extracto alimentario se midio con el kit de medicion de trigo de Morinaga FASPEK (gliadina) (fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.). El extracto alimentario se diluyo 20 veces con el diluyente de muestra I en el kit. Debe tenerse en cuenta que cuando la concentracion total de protema de trigo en el extracto alimentario diluido es superior a 50 ng/ml, el extracto alimentario se diluye adicionalmente para ajustar la concentracion total de protema de trigo en el extracto alimentario diluido a 1 a 50 ng/ml. Despues de eso, se vierten 100 |jl del extracto alimentario diluido en un pocillo de plastico que tiene un anticuerpo primario inmovilizado, y se incuba durante 1 hora. El pocillo de plastico se lavo con una solucion de lavado preparada preliminarmente y despues se realizo una reaccion con un anticuerpo marcado con enzima durante 30 minutos. Despues de eso, el pocillo de plastico se lavo con una solucion de lavado preparada preliminarmente, y se suplemento con una solucion de sustrato enzimatico. Despues de una reaccion durante 10 minutos, la reaccion se termino con una solucion de reaccion final. Las absorbancias a una longitud de onda principal de 450 nm y una longitud de subfrecuencia de 620 nm se midieron en los 30 minutos siguientes a la terminacion de la reaccion. La concentracion total de protema de trigo en una dilucion de la muestra se determino mediante la aplicacion de las absorbancias medidas a una curva de calibracion, que se habfa preparado mediante una medicion paralela. Ademas, la concentracion total de protema de trigo en una muestra se determino multiplicando la concentracion total de protema de trigo en una dilucion de la muestra por el aumento de la dilucion. En este caso, la protema total de trigo se midio dos veces en cada condicion, y los valores de la Tabla 1 a continuacion son valores medios de las mediciones (en adelante, todos los resultados de los ejemplos de ensayo descritos en esta descripcion se expresan cada uno como un promedio de los valores obtenidos de la medicion por duplicado).

Tabla 1

Alimentos procesados: Ejemplo 1 Ejemplo comparativo 1-1 Ejemplo comparativo 1-2

Galletas “cookie Kyoro-chan (Nombre comercial)” fabricado por Morinaga & CO., LTD.: 36.817 31.504 6073

Pan (producto disponible en el mercado): 72.425 81.709 16.190

Artmulos de chocolate “Chocoball” fabricado por Morinaga & CO., LTD.: 1450 1522 683

Stew (roux) (producto disponible en el mercado): 20.066 16.752 7967

Curry (retorta) (producto disponible en el mercado): 3326 3228 3,72

Hamburguesas (retorta) (producto disponible en el mercado): 5103 4663 9,59

Unidad: ppm

Tabla 2

N° de agente de extraccion: Composicion

Ejemplo 1: Diluyente de muestra2 que contiene SDS1 al 0,5% y Na2SO3 0,1 M

Ejemplo comparativo 1-1: Diluyente de muestra que contiene SDS al 0,5% y 2-ME3 al 2%

Ejemplo comparativo 1-2: Diluyente de muestra

1: dodecilsulfato de sodio

2: preparado por dilucion de un diluyente de muestra (concentrado 20 veces) incluido en el “kit de medicion del ingrediente especificado de Morinaga FASPEK” fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc. a 1 vez (correspondiente al “Diluyente de muestra I” en el kit) 3: 2-mercaptoetanol

Como se muestra en la Tabla 1, se aclaro que un agente de extraccion que contiene sulfito de sodio y SDS presentaba una alta eficiencia de extraccion en comparacion con un agente de extraccion sin ambos agentes. Ademas, la eficacia de la extraccion con el agente de extraccion que contiene sulfito de sodio y SDS fue casi el mismo valor que con el agente de extraccion que contiene 2-mercaptoetanol y SDS.

<Ejemplo de ensayo 2> (Deteccion de la protema soluble de trigo sarraceno)

Con la misma operacion que en el Ejemplo de ensayo 1, se utilizo cada uno de los alimentos procesados que se describe en la Tabla 3 a continuacion para preparar un extracto alimentario de la comida procesada. Se han usado agentes de extraccion cada uno que tiene la composicion mostrada en la Tabla 2.

El extracto alimentario se midio con el kit de medicion de trigo sarraceno Morinaga FASPEK (fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.) para determinar la concentracion de una protema de trigo sarraceno de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 3

Trigo sarraceno hervido (producto disponible en el mercado): 17.799 12.660 10.762

Fideos instantaneos de olla (trigo sarraceno) (producto disponible en el mercado): 14.589 12.821 7051

Confitena horneada que contiene harina de trigo sarraceno (producto disponible en el mercado): 1175 1306 254

Refresco (te de trigo sarraceno) (producto disponible en el mercado): 2,9 2,7 *

* Por debajo del ffmite de medicion Unidad: ppm

Como se muestra en la Tabla 3, se aclaro que el agente de extraccion que contiene sulfito de sodio y SDS presentaba una alta eficiencia de extraccion en comparacion con un agente de extraccion sin ambos agentes. Ademas, la eficacia de la extraccion con el agente de extraccion que contiene sulfito de sodio y SDS fue casi el mismo valor que con el agente de extraccion que contiene 2-mercaptoetanol y SDS.

<Ejemplo de ensayo 3> (Deteccion de casema de la leche por inmunocromatograffa)

Se preparo un alimento procesado modelo que contiene casema de leche mezclando 10 |jg de leche liofilizada por g de un ingrediente de alimentos procesados como se describe a continuacion. Cada alimento procesado se preparo de acuerdo con un metodo convencional.

• Mermelada de fresa: 58 partes de fresa, 41 partes de azucares, 0,8 partes de pectina, y 0,2 partes de acido dtrico

• Zumo: 9 partes de zumo de naranja concentrado, 9 partes de azucar, 0,16 partes de acido dtrico, 0,02 partes de acido ascorbico, y 81,8 partes de agua

• Galleta: 67 partes de harina de trigo, 6,7 partes de materia grasa, 13,4 partes de azucar, 0,5 partes de sal, 0,9 partes de un agente de crecimiento, 0,1 partes de acido, 0,07 partes de un emulsionante, y 0,01 partes de una proteasa

De la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 1, cada extracto de muestra se preparo a partir del modelo de alimentos procesados anteriormente mencionado que contiene casema de leche utilizando el agente de extraccion del Ejemplo 1 o Ejemplo comparativo 1-1 anterior. La casema de la leche en el extracto se detecto mediante inmunocromatograffa. La medicion se realizo mediante inmunocromatograffa usando un kit para la deteccion de la gliadina del trigo, "kit de inspeccion de alergenos alimentarios del trigo Nanotrap (gliadina)" (nombre comercial, fabricado por ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.) y un kit para la casema de la leche, "kit de inspeccion de alergenos alimentarios de la leche Nanotrap (casema)" (nombre comercial, fabricado por ROHTO Pharmaceutical Co., Ltd.). Espedficamente, se gotearon 200 jl de cada extracto de muestra diluida 20 veces a una porcion de la muestra de goteo en una placa de ensayo inmunocromatografico, y despues de 15 minutos, la presencia o ausencia de aparicion de la banda o la densidad de contraste de la banda se observo a una posicion de la lmea de ensayo que soporta un anticuerpo espedfico para la gliadina o casema. La Tabla 4 muestra los resultados.

Tabla 4


: Ejemplo 1 Ejemplo comparativo 1-1

Inmunocromatografo (Gliadina): Mermelada de fresa - + +

Zumo: - + +

Galleta: + + +

Inmunocromatografo (Casema): Mermelada de fresa + + +

Zumo: + + +

Galleta: + + +

(En la tabla, -, +, ++ y significa, en base a la densidad de contraste de una banda que ha aparecido en una posicion de aparicion de la lmea de ensayo inmunocromatografica, -: sin aparicion de banda, +: banda debil, y ++: banda fuerte)

Como se muestra en la Tabla 4, en la inmunocromatograffa para cada extracto de la muestra preparada usando un agente de extraccion (Ejemplo comparativo 1-1) que contiene 2-mercaptoetanol (2-ME) como agente reductor, con respecto tanto de una placa de ensayo que tiene un anticuerpo espedfico para la gliadina soportada en una posicion de aparicion de la lmea de ensayo como de una placa de ensayo con un anticuerpo espedfico para la casema soportada en una posicion de aparicion de la lmea de ensayo, se observo una banda fuerte en la posicion de aparicion de la lmea de ensayo. Se aclaro que esta banda se produjo por una reaccion de falso positivo puesto que dicha banda tambien se observo solo en la medida en que un agente de extraccion que contiene 2-mercaptoetanol (2-ME) se goteo a una porcion de goteo de la muestra.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Mientras tanto, en el caso de utilizar un agente de extraccion (Ejemplo 1) que contiene sulfito de sodio (Na2SO3) como agente reductor, se observo una banda positiva en una posicion de aparicion de la lmea de ensayo solamente en la placa de ensayo con un anticuerpo espedfico para la casema soportado en una posicion de aparicion de la lmea de ensayo, y no se presento ninguna reaccion de falso positivo.

Por lo tanto, en un metodo de medicion utilizando inmunocromatograffa (flujo lateral) con un anticuerpo unido a un coloide de oro, era concebible que un agente reductor (2-mercaptoetanol) que tiene un grupo tiol causase una agregacion de parffculas de un coloide de oro, latex, o similar con el que se hada marcado un anticuerpo, lo que resulta en una reaccion de falso positivo. Ademas, se revelo que el uso de sulfito de sodio (Na2SO3) permite evitar la reaccion de falso positivo, lo que lleva a una deteccion precisa.

Los resultados de los Ejemplos de ensayo 1 a 3 anteriores revelaron que un sulfito que era barato y tema una accion reductora suave era util como agente reductor para extraer un componente de un alimento.

<Ejemplo de ensayo 4> (Deteccion de gliadina de trigo)

Con el fin de evaluar, durante la medicion de la gliadina de trigo por inmunocromatograffa, como se ve afectada la medicion por la presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) y sulfito de sodio en una solucion de ensayo, se realizo el siguiente ensayo.

En primer lugar, a 1 g de harina de trigo se le anadio 19 pl de un agente de extraccion como se muestra en la Tabla 5 a continuacion, y la mezcla se agito con un mezclador de vortice a su velocidad maxima durante 1 minuto. El producto resultante se hierve a 100 °C durante 10 minutos, se devolvio a una temperatura normal, y despues se centrifugo a 3000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se filtro con papel de filtro (ADVANTEC n.° 5A) para preparar un extracto de harina de trigo. Con respecto al extracto de harina de trigo, la concentracion se determino por separado por un metodo de ELISA usando el kit de medicion de trigo de Morinaga FASPEK (gliadina) (fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.). Un procedimiento espedfico es como se describe a continuacion.

Es decir, el extracto de harina de trigo se diluyo 20 veces con diluyente de muestra I en el kit. Cabe senalar que, cuando la concentracion total de protema de trigo en la dilucion es superior a 50 ng/ml, el extracto de harina de trigo se diluyo adicionalmente a fin de ajustar la concentracion total de protema de trigo de 1 a 50 ng/ml. Despues de eso, se vertieron 100 pl de la muestra objeto en un pocillo de plastico que tiene un anticuerpo primario inmovilizado, y se incubaron durante 1 hora. El pocillo de plastico se lavo con una solucion de lavado preparada previamente y, a continuacion se realizo una reaccion con un anticuerpo marcado con enzima durante 30 minutos. Despues de eso, el pocillo de plastico se lavo con una solucion de lavado preparada previamente, y se suplemento con una solucion de sustrato enzimatico. Despues de una reaccion durante 10 minutos, la reaccion se termino con una solucion de terminacion de la reaccion. Las absorbancias a una longitud de onda principal de 450 nm y una sublongitud de onda de 620 nm se midieron en los 30 minutos siguientes a la terminacion de la reaccion. La concentracion total de protema de trigo en la muestra objeto se determino mediante la aplicacion de las absorbancias medidas a una curva de calibracion, que se hada preparado mediante una medicion en paralelo utilizando la protema total de trigo como sustancia patron. Ademas, la concentracion total de protema de trigo en el extracto de harina de trigo se determino multiplicando la concentracion total de protema de trigo en la muestra objeto por la ampliacion de la dilucion.

De aqrn en adelante, el extracto de harina de trigo se utilizo como patron.

El patron del extracto de harina de trigo como se describe anteriormente se diluyo en serie en el intervalo de 1 ng a 100 pg usando un diluyente convencional (dilucion de 5 veces de agente de extraccion) del Ejemplo 2 que contiene SDS y un sulfito como se muestra en la Tabla 5 a continuacion. Ademas, con el fin de comparar, tambien se prepararon diluciones en serie utilizando un diluyente convencional del Ejemplo comparativo 2 y sin SDS y sulfito como se muestra en la Tabla 5 a continuacion.

Tabla 5

: Composicion

Agente de extraccion: Diluyente de muestra2 que contiene SDS1 al 0,6% y Na2SO3 0,1 M

Diluyente convencional

Ejemplo 2: Diluyente de muestra2 que contiene SDS1 al 0,12% y Na2SO3 0,02 M

Ejemplo comparativo 2: Diluyente de muestra2

1: dodecilsulfato de sodio

2: preparado por dilucion de un diluyente de muestra (concentrado 20 veces) incluido en el “kit de medicion del ingrediente especificado de Morinaga FASPEK” fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc. a 1 vez (correspondiente al “Diluyente de muestra I” en el kit)

Esas diluciones en serie se midieron con un kit para la medicion inmunocromatografica de la gliadina del trigo, "kit

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

del metodo inmunocromatografico para un ingrediente espedfico de la serie Nanotrap de Morinaga (trigo)" (nombre comercial, fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.). Es dedr, 200 |jl de cada una de las diluciones en serie mencionadas anteriormente como soluciones de ensayo se gotearon a una porcion de la muestra de goteo en un palo, y despues de unos 15 minutos, se observo visualmente la presencia o ausencia de aparicion de la banda o la densidad de contraste de la banda en una posicion de la lmea de ensayo que soporta un anticuerpo espedfico para la gliadina. Ademas, la intensidad de la banda se midio usando un instrumento de medicion que utiliza reflexion optica, "Immunochromato Reader C10066" (nombre del producto, fabricado por Hamamatsu Photonics KK) y se expreso como valor numerico, es decir, un valor de mABS (absorbancia). La Tabla 6 muestra los resultados colectivamente. Ademas, la Fig. 1 es un grafico que ilustra, como valor numerico, la intensidad de la banda.

Tabla 6

: Diluyente convencional

SDS/sulfito: que contiene SDS/sulfito (Ejemplo 2) SDS/sulfito (Ejem plo comparativo 2)

Concentracion de gliadina (ng/ml): mABS Observacion visual mABS Observacion visual

blanco: 0,0 - 7,0 -

1 ng/ml: 5,2 - 4,0 -

10 ng/ml: 42,1 ± 38,3 ±

50 ng/ml: 115,8 + 98,8 +

100 ng/ml: 157,6 + 58,6 + *

1 jg/ml: 192,6 + 70,0 + *

10 jg/ml: 92,6 + 30,7 ± *

100 jg/ml: 48,2 ± 7,0 -

* Fue diffcil hacer una evaluacion debido a una membrana de color rojo

Como se muestra en la Tabla 6 o la Figura 1, en un sistema (Ejemplo comparativo 2) que utiliza una solucion de ensayo sin SDS y sulfito de sodio, cuando la concentracion de gliadina alcanzo aproximadamente de 50 a 100 ng/ml, se redujo el valor de mABS, se observo un fenomeno de prozona, y se hizo diffcil hacer una evaluacion de la densidad de contraste de la banda debido a una membrana que en sf era de color rojo. Ademas, cuando la concentracion de gliadina alcanzo 100 jg/ml, se hizo imposible reconocer la banda, dando lugar a resultados de falso negativo. Por otro lado, en un sistema (Ejemplo 2) que utiliza una solucion de ensayo que contiene SDS y sulfito de sodio, fue posible reconocer la banda cuando la concentracion de gliadina alcanzo aproximadamente 10 ng/ml, no se produjo fenomeno de prozona incluso cuando la concentracion de gliadina alcanzo aproximadamente 1 jg/ml, y ademas, no fue diffcil hacer una evaluacion de la densidad de contraste de la banda antes de que la concentracion de gliadina alcanzase 100 jg/ml.

Por lo tanto, se aclaro que, durante la deteccion de la gliadina de trigo por inmunocromatograffa, se puede realizar la medicion mas fiable en un sistema de SDS/sulfito en un amplio intervalo de regiones de concentracion.

<Ejemplo de ensayo 5> (Deteccion de la casema de la leche)

Con el fin de evaluar, durante la medicion de la casema de leche por inmunocromatograffa, como se ve afectada la medicion por la presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) y sulfito de sodio en una solucion de ensayo, se realizo el siguiente ensayo.

En primer lugar, a 1 g de leche se le anadio 19 jl de un agente de extraccion como se muestra en la Tabla 7 a continuacion, y la mezcla se agito con un mezclador de vortice a su velocidad maxima durante 1 minuto. El producto resultante se hierve a 100 °C durante 10 minutos, se devolvio a una temperatura normal, y despues se centrifugo a 3000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se filtro con papel de filtro (ADVANTEC n.° 5A) para preparar un extracto de leche. Con respecto al extracto de leche, la concentracion se determino por separado por un metodo de ELISA usando el kit de medicion de la leche de Morinaga FASPEK (casema) (fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.). Un proceso espedfico es como se describe a continuacion.

Es decir, el extracto de leche se diluyo 20 veces con diluyente de muestra I en el kit. Cabe senalar que, cuando la concentracion total de protema de la leche en la dilucion es superior a 50 ng/ml, el extracto de leche se diluyo adicionalmente a fin de ajustar la concentracion total de protema de la leche de 1 a 50 ng/ml. Despues de eso, de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 4, se determino la protema total de la leche en una muestra objeto, y, ademas, se determino la protema total de la leche en el extracto de leche multiplicando la protema total de la leche en la muestra objeto por la ampliacion de la dilucion.

De aqu en adelante, el extracto de leche se utiliza como patron.

5

10

15

20

25

30

35

40

El patron del extracto de la leche como se describe anteriormente se diluyo en serie en el intervalo de 1 ng a 100 |jg usando un diluyente convencional (dilucion de 5 veces de agente de extraccion) del Ejemplo 3 que contiene SDS y un sulfito como se muestra en la Tabla 7 a continuacion. Ademas, con el fin de comparar, tambien se prepararon diluciones en serie utilizando un diluyente convencional del Ejemplo comparativo 3 sin SDS y sulfito como se muestra en la Tabla 7 a continuacion.

Tabla 7

: Composicion

Diluyente convencional

Ejemplo 3: Diluyente de muestra2 que contiene SDS1 al 0,12% y Na2SO3 0,02 M

Ejemplo comparativo 3: Diluyente de muestra2

1: dodecilsulfato de sodio

Esas diluciones en serie se midieron con un kit para la medicion inmunocromatografica de la casema de la leche, "kit del metodo inmunocromatografico para un ingrediente espedfico de la serie Nanotrap de Morinaga (leche)" (nombre comercial, fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.). Es decir, 200 jl de cada una de las diluciones en serie mencionadas anteriormente como soluciones de ensayo se gotearon a una porcion de la muestra de goteo en un palo, y despues de unos 15 minutos, se observo visualmente la presencia o ausencia de aparicion de la banda o la densidad de contraste de la banda en una posicion de la lmea de ensayo que soporta un anticuerpo espedfico para la casema. Ademas, la intensidad de la banda se midio usando un instrumento de medicion que utiliza reflexion optica, "Immunochromato Reader C10066" (nombre del producto, fabricado por Hamamatsu Photonics KK) y se expreso como valor numerico, es decir, un valor de mABS (absorbancia). La Tabla 8 muestra los resultados colectivamente. Ademas, la Fig. 2 es un grafico que ilustra, como valor numerico, la intensidad de la banda.

Tabla 8

: Diluyente convencional

SDS/sulfito: que contiene SDS/sulfito (Ejemplo 3) SDS/sulfito (Ejem plo comparativo 3)

blanco: - -

1 ng/ml: 4,6 - 12,9 -

10 ng/ml: 15,1 - 37,1 ±

50 ng/ml: 88,9 + 185,7 +

100 ng/ml: 129,0 + 243,5 +

1 jg/ml: 174,1 + 233,5 +

10 jg/ml: 149,6 + 51,7 ±

100 jg/ml: 131,2 + 7,0 +

Como se muestra en la Tabla 8 o la Figura 2, en un sistema (Ejemplo comparativo 3) que utiliza una solucion de ensayo sin SDS y sulfito de sodio, cuando la concentracion de casema alcanzo aproximadamente de 1 a 10 jg/ml, se redujo el valor de mABS, y se observo un fenomeno de prozona. Ademas, cuando la concentracion de casema alcanzo 100 jg/ml, se hizo imposible reconocer la banda, dando lugar a resultados de falsos negativos. Por otro lado, en un sistema (Ejemplo 3) que utiliza una solucion de ensayo que contiene SDS y sulfito de sodio, se hizo posible reconocer la banda cuando la concentracion de gliadina alcanzo aproximadamente 50 ng/ml, no se produjo fenomeno de prozona incluso cuando la concentracion de casema alcanzo aproximadamente 100 jg/ml, y ademas, no fue diffcil hacer una evaluacion de la densidad de contraste de la banda antes de que la concentracion de casema alcanzase 100 jg/ml.

Por lo tanto, se aclaro que, durante la deteccion de la casema de la leche por inmunocromatograffa, la medicion mas fiable se puede realizar en un sistema de SDS/sulfito en un amplio intervalo de regiones de concentracion.

<Ejemplo de ensayo 6> (Deteccion de trigo gliadina contenida en los alimentos)

Cada uno de los alimentos que se describe en la Tabla 9 a continuacion se homogeneizo con un mezclador.

Tabla 9


: Etiquetado del ingrediente de trigo en el producto

Harina blanda: Alimento positivo (sin calentar) o

Curry roux (producto disponible en el mercado): Alimento positivo (calentado) o

Roux para arroz con carne picada (retorta) (producto disponible en el mercado): o

Salteado de pollo con anacardos (retorta) (producto disponible en el mercado): o

Galleta (producto disponible en el mercado): o

Cubo de consome (producto disponible en el mercado): o

Pudm (producto disponible en el mercado): o

Albondiga (retorta) (producto disponible en el mercado): Alimentos negativos -

Caldo de arroz (replica) (producto disponible en el mercado): -

Salsa napolitana (retorta) (producto disponible en el mercado): -

Torta de pasta de pescado el horno en forma de tubo (producto disponible en el mercado)

Huevos crudos: Ingrediente negativo (cinco artfculos) -

Leche: -

Trigo sarraceno: -

Cacahuetes: -

A 1 g de la comida homogeneizada se le anadio 19 |jl del agente de extraccion del Ejemplo 4 como se muestra en la Tabla 10 a continuacion, y la mezcla se agito con un mezclador de vortice a su velocidad maxima durante 1 minuto.

5 El producto resultante se hierve a 100 °C durante 10 minutos, se devolvio a una temperatura normal, y despues se centrifugo a 3000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se filtro con papel de filtro (ADVANTEC n.° 5A) para preparar un extracto alimentario. Ademas, con el fin de comparar, tambien se prepararon los extractos alimentarios utilizando un agente de extraccion del Ejemplo comparativo 4 sin SDS y sulfito como se muestra en la Tabla 10 a continuacion.

10

Cada uno de los extractos alimentarios que se ha descrito anteriormente se diluyo en 5 veces con un diluyente de solucion de ensayo sin SDS y sulfito como se muestra en la Tabla 10 a continuacion (que es el mismo que el diluyente convencional utilizado en Ejemplo de ensayo 4 o 5) para preparar una solucion de ensayo, que se somete a la siguiente inmunocromatograffa. Ademas, con respecto a los extractos alimentarios, la concentracion se 15 determino por separado por el metodo de ELISA usando el kit de medicion de trigo de Morinaga FASPEK (gliadina) (fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.) de la misma manera que en el Ejemplo de ensayo 4.

Tabla 10

: Composicion

Ejemplo comparativo 4: Diluyente de muestra 2 que contiene SDS1 al 0,12% y Na2SO3 0,02 M

(Diluyente de solucion de ensayo): Diluyente de muestra 2

1: dodecilsulfato de sodio

Las soluciones de ensayo preparadas como se ha descrito anteriormente se midieron con un kit para la medicion inmunocromatografica de la gliadina del trigo, "Kit del metodo inmunocromatografico para un ingrediente espedfico de la serie Nanotrap de Morinaga (trigo)" (nombre comercial, fabricado por el Instituto de Ciencias Biologicas Morinaga, Inc.). Es decir, 200 jl de cada una de las soluciones de ensayo mencionadas anteriormente se gotearon a 5 una porcion de la muestra de goteo, y despues de unos 15 minutos, se observo visualmente la presencia o ausencia de aparicion de la banda o la densidad de contraste de la banda en una posicion de la lmea de ensayo que soporta un anticuerpo espedfico para la gliadina. La Tabla 11 muestra colectivamente los resultados de medicion de la concentracion de gliadina medida por el metodo de ELISA y los resultados de la medicion inmunocromatografica.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de inspeccion de alimentos para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento, que comprende: poner un alimento en contacto con un agente de extraccion que comprende un sulfito para preparar un extracto alimentario en el que se extrae un componente en el alimento; a continuacion, poner en contacto el extracto alimentario con un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una sustancia comprendida en un ingrediente especificado de interes para su inspeccion; y la inspeccion de la presencia o ausencia y/o de la cantidad del ingrediente especificado en el alimento utilizando un metodo de medicion inmunologico usando inmunocromatograffa o ELISA.
2. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo espedfico esta marcado con un coloide metalico.
3. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que se suprime el fenomeno de prozona durante la medicion de inspeccion de alimentos, comprendiendo el metodo: poner un alimento en contacto con un agente de extraccion para preparar un extracto alimentario en el que se extrae un componente en el alimento; a continuacion, poner en contacto el extracto alimentario con un anticuerpo espedfico que reconoce espedficamente una sustancia comprendida en un ingrediente especificado de interes para su inspeccion; y la inspeccion de la presencia o ausencia y/o de la cantidad del ingrediente especificado en el alimento utilizando un metodo de medicion inmunologico, en el que: se utiliza la inmunocromatograffa como metodo de medicion inmunologico; y se suprime el fenomeno de prozona durante la medicion de inspeccion de alimentos al incorporar dodecilsulfato de sodio y un sulfito en el extracto alimentario.
4. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el sulfito comprende al menos un tipo seleccionado entre sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio y sulfito de hierro.
5. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que: el ingrediente especificado de interes para su inspeccion comprende trigo; y el anticuerpo espedfico comprende un anticuerpo espedfico para la gliadina.
6. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que el extracto alimentario, que se somete a inmunocromatograffa, comprende gliadina en una concentracion de 10 ng/ml a 100 pg/ml.
7. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que: el ingrediente especificado de interes para su inspeccion comprende leche; y el anticuerpo espedfico comprende un anticuerpo espedfico para la casema.
8. Un metodo de inspeccion de alimentos de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el extracto alimentario, que se somete a inmunocromatograffa, comprende casema en una concentracion de 50 ng/ml a 100 pg/ml.
9. Un kit de inspeccion de alimentos para la inspeccion de la presencia o ausencia y/o de la cantidad de un ingrediente especificado en un alimento, que comprende (1) un agente de extraccion y un sulfito a anadir al agente de extraccion, o un agente de extraccion que comprende un sulfito anadido; y (2) un anticuerpo que reconoce espedficamente una sustancia comprendida en un ingrediente especificado de interes para su inspeccion.
10. Un kit de inspeccion de alimentos de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que el kit comprende, como sulfito, al menos un tipo seleccionado entre sulfito de sodio, hidrogenosulfito de sodio, sulfito de potasio, sulfito de amonio y sulfito de hierro.
11. Un kit de inspeccion de alimentos de acuerdo con la reivindicacion 9 o 10, en el que el anticuerpo se une a un inmunocromatografo.
12. Un kit de inspeccion de alimentos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende ademas dodecilsulfato de sodio.

Valor del lector (mABS)

FIG. 1

imagen1

Valor del lector (mABS)

FIG. 2

imagen2

Concentracion del patron de caseina (ng/ml)