ES2628219T3

ES2628219T3 - Métodos para proporcionar ensayos de medicina personalizada ex vivo para neoplasias hematológicas

Info

Publication number: ES2628219T3
Application number: ES10721223.5T
Authority: ES
Inventors: Juan Ballesteros; Teresa Bennett; Daniel Primo; Alberto Orfao; Coyt Jackson; Santiago Lago; María MATOSES; Lilia Suárez; Sandra Sapia; Andrew Bosanquet; Julián GORROCHATEGUI; Consuelo Tudela; Pilar Hernández; Luis Ignacio Caveda
Original assignee: Vivia Biotech SL
Current assignee: Vivia Biotech SL
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2010-05-19
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2030-05-19
Also published as: JP5851984B2; JP2012527627A; RU2636614C2; CL2011002905A1; AU2010249593A1; SG176571A1; CA2762783C; RU2011148289A; IL216419A; DK2433124T3; EP2433124B1; US20170205395A1; TW201043955A; SG10201402346UA; CN102460165B; IL216419A0; CN102460165A; US20100298255A1; EP2433124A1; BRPI1012980A2

Abstract

Un método para analizar la sensibilidad celular a fármacos, que comprende: a. obtener una muestra de sangre entera, sangre periférica entera o médula ósea entera que se ha extraído de un paciente con una neoplasia hematológica; b. dividir la muestra completa en al menos 35 alícuotas; c. combinar cada una de las 35 alícuotas con al menos con una composición de fármacos; y e. medir la apoptosis o la depleción celular en cada una de las al menos 35 alícuotas por citometría de flujo.

Description

imagen1

16:223-232) utilizando electroforesis o etiquetado con naranja de acridina (Tabrizi et al,. Leukemia 2002, 16(6):11549; Kim et al., Exp Mol Med 2000, 32:197-203; Konstantinov et al., J Cancer Res Clin Oncol 2002, 128:271-278; Ofir et al., Cell Death Differ 2002, 9:636-642); o 3) identificación de fragmentos proteolíticos de polimerasa poli-ADPribosa (PPAR) o caspasa-3 utilizando anticuerpos específicos (Konstantinov et al., J Cancer Res Clin Oncol 2002,

5 128(5):271-8; Ofir et al., Cell Death Differ 2002, 9(6): 636-42; Byrd et al., Blood 2002, 99:1038-1043; Hasenjäger et al., Oncogene 2004, 23:4523-4535; Prokop et al., Oncogene 2003, 22:9107-9120).

Otra prueba de apoptosis se basa en la detección por citometría de flujo de anexina V conjugada a un marcador fluorescente (es decir, un fluorocromo). La anexina V se une a los residuos de fosfatidilserina externalizados que 10 aparecen solo en la membrana de la superficie de las células sometidas a apoptosis (Tabrizi et al., Leukemia 2002, 16(6):1154-9; Nimmanapalli et al., Cancer Res 2002, 62:5761-5769). La medición de la apoptosis puede evaluarse de acuerdo con el porcentaje de células que se unen a un conjugado fluorescente de anexina V, como se detecta por citometría de flujo. Adicionalmente, se conocen en el estado de la técnica varias combinaciones de anticuerpos monoclonales utilizados para la identificación de células tumorales (frente a las células normales). La Tabla 1

15 resume varias combinaciones de anticuerpos monoclonales que, cuando se conjugan a un fluorocromo, podrían utilizarse para identificar células tumorales hematológicas utilizando varios métodos de detección espectroscópica.

Tabla 1: Combinaciones de anticuerpos monoclonales para la identificación de células tumorales

Neoplasia hematológica: Conjugado de AcM a fluorocromo

LLA, LLC, LNH: CD19-PE, CD45-APC

MM: CD38-PE, CD45-APC

LMA: CD34-PE, CD45-APC

LLA= leucemia linfocítica aguda; LLC= leucemia linfocítica crónica; LNH= linfoma no Hodgkin; MM= mieloma múltiple; LMA= leucemia mieloide aguda

20 Algunos ERTIs, particularmente, las pruebas de CTDi y RTCA, permiten la medición simultánea de la citotoxicidad en células tumorales y en células normales, lo que permite la determinación de un índice terapéutico (Bosanquet et al., Leuk. Res. 1996; 20: 143-53; Bosanquet et al., J Exp Ther Oncol 2004; 4: 145-54).

Los investigadores han demostrado la capacidad predictiva de ERTIs en varios estudios científicos. Un estudio

25 realizado en 1929 de las correlaciones clínicas en neoplasias hematológicas (Bosanquet et al. en Kaspers et al. (eds.), 2008) y otros estudios (p. ej., Kaspers GJ., Methods Mol Med. 2005; 110:49-57) indican un alto porcentaje de eficacia predictiva positiva, particularmente con respecto a la resistencia a fármacos. Integrando los resultados de múltiples artículos (Tabla 2), Nagourney halló que la eficacia predictiva positiva con respecto a la sensibilidad a fármacos era del 81,8 %, y la eficacia predictiva negativa con respecto a la resistencia a fármacos era del 83,3 %

30 (adaptado de http://www.rationaltherapeutics.com/physicians/contentl.aspx?rid=35 y las referencias bibliográficas en la misma (visitado el 7 de mayo de 2010)).

Tabla 2: Listado de correlaciones clínicas publicadas que soportan la capacidad predictiva de ERTIs

Cáncer hematológico: N PV NV FP FN Ref.

LLA: 3 2 1 0 0 1

LLA: 17 14 2 1 0 2

LLA: 25 16 3 5 1 3

LLA: 130 90 18 20 2 4

LLA: 58 40 6 0 2 5

LLA: 4 1 2 1 0 6

LLA: 4 3 1 0 0 7

LLA: 29 18 5 2 4 8

LLA: 2 2 0 0 0 9

LLA/LLC: 55 38 7 10 0 10

LMA: 4 0 1 2 1 2

LMA: 11 6 5 0 0 11

LMA: 21 11 8 2 0 6

LMA: 83 74 9 0 0 12

LMA: 27 6 13 0 8 13

LMA: 21 10 9 2 0 14

Cáncer hematológico: N PV NV FP FN Ref.

LMA: 33 11 8 4 10 15

LMA/LLA/LNH: 73 45 16 9 3 16

LMA: 12 7 3 2 0 17

LMA: 14 9 1 2 2 3

LMA: 14 9 2 1 2 4

LMA: 17 11 4 1 1 7

LMA: 27 12 12 2 1 18

LMA: 34 20 11 2 1 19

LLC: 80 12 48 18 2 2

LLC: 34 26 6 2 0 20

LLC: 1 1 0 0 0 6

LLC: 15 11 3 0 1 21

LLC: 15 9 4 1 1 8

LLC: 3 2 1 0 0 9

LLC/LLA/LNH: 226 102 76 41 7 22

LLC (blástica): 9 2 6 1 0 8

LNH: 1 1 0 0 0 17

LNH: 10 3 3 3 1 2

LNH: 3 2 0 1 0 1

LNH: 50 27 10 11 2 23

LNH: 10 6 3 1 0 8

LNH: 3 0 3 0 0 9

Total: 1.178 659 310 147 62

N= número de casos; PV= positivos verdaderos; NV= negativos verdaderos; FP= falsos positivos; FN= falsos negativos; Ref.= bibliografía (véase las referencias al final de la memoria descriptiva); LLA= leucemia linfocítica aguda; LLC= leucemia linfocítica crónica; LMA= leucemia mieloide aguda; LNH= linfoma no Hodgkin

Un estudio clínico controlado aleatorio prospectivo se está llevando a cabo actualmente en el Reino Unido utilizando un gran número de pacientes con leucemia linfocítica crónica (estudio UK LRF LLC4, Catovsky et al., Lancet 2007,

370: 230-39). El estudio conlleva la evaluación de un ERTI como un factor del resultado relacionado con la

5 respuesta del paciente al tratamiento (Bosanquet et al: ASH Annual Meeting Abstracts Blood, 2006 108:94a: Abstract 303). El estudio comenzó en 1999 e incluyó a 777 pacientes con LLC no tratados previamente. Los pacientes se trataron con clorambucilo (ChI) o fludarabina +/- ciclofosfamida (Flu o FluCi). En este estudio, la prueba de RTCA se utilizó para evaluar la sensibilidad ex vivo a los fármacos antes de tratamiento del paciente. Para el análisis, los pacientes se dividieron en tres grupos en función de su resultado ERTI: resistente a fármacos (RF),

10 sensible a fármacos (SF), o grado intermedio a fármacos (IF). La Tabla 3 resume los resultados.

Tabla 3. Correlación de los resultados ERTI (SF, IF, y RF) y respuesta a los mismos fármacos en pacientes con leucemia linfocítica crónica

Resultado: Ch1 Flu FluCi Total

SF: 85,1 (94) 90,7 (54) 95,7 (70) 89,9 (218)

IF: 66,3 (92) 79,2 (53) 97,3 (37) 76,4(182)

RF: 37,6 (24) 21,4(14) 25,0 (4) 31,0 (42)

Total: 71,5 (210) 77,7 (121) 93,7 (111) 78,7 (442)

Los resultados se representan con el % de pacientes que responde (con el número de pacientes en paréntesis) a cada fármaco (ChI y Flu) y a cada combinación de fármacos (FluCi)

15 Como se muestra en la Tabla 3, los resultados de ERTI se correlacionan adecuadamente con las respuestas clínicas de los pacientes. Entre el 49 % de los pacientes que eran SF, la mayoría de ellos (90%), respondieron al tratamiento con quimioterapia, mientras que el 9,5% de los pacientes que eran RF, solo el 31% respondió a la quimioterapia. Entre los 24 pacientes que eran RF a ChI, el 71% era SF o IF a Flu, y todos mostraron SF o IF a la combinación de

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

puede completar con un manipulador de líquidos BIOMEK® 3000 (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Cualquier número de placas de pocillos puede ser utilizado, y una placa de pocillos particularmente útil es una placa de 96 pocillos. También se contemplan otros tamaños de placas, incluyendo aquellas con 24, 48, 384, 1.536, 3.456, o

9.600 pocillos. Las unidades de preparación de muestras pueden recubrirse en un armario de flujo que permite que

5 los compuestos y las muestras permanezcan estériles mientras se manipulan. Hasta la compleción del ajuste de la prueba, las placas se cargan en el sistema de análisis de muestras.

El citómetro de CYAN™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) es un instrumento que dispone de tres láseres y nueve detectores y las metodologías que se conocen en la materia se han desarrollado para aprovechar al máximo el multiláser y, en consecuencia, las capacidades de medición multiparamétricas de tales citómetros de flujo modernos. En una realización, un citómetro de flujo de láser único se utiliza para la etapa de análisis. En otra realización, un citómetro de flujo multiláser se utiliza para la etapa de análisis. El desarrollo y optimización de un amplio conjunto de fluorocromos y químicas de conjugación permite una variedad de ligandos, tales como inmunoglobulinas y moléculas pequeñas para ser conjugados con los fluorocromos. Los láseres con líneas de emisión que oscilan desde la región

15 ultravioleta a la roja del espectro de luz pueden excitar estos fluorocromos. En consecuencia, un gran número de reactivos espectralmente distintos puede utilizarse para etiquetar células para el estudio con instrumentación basada en fluorescencia, tal como la citometría de flujo. Estos reactivos se conocen adecuadamente en la materia. En una realización, uno o más fluorocromos se utilizan durante la etapa de análisis. En algunas realizaciones, una o más tinciones se utilizan en el análisis de las respuestas celulares a composiciones de fármacos.

Existen varios métodos conocidos en la materia que minimizan la mezcla de la muestra accidental en los tubos antes del análisis. Se sabe que uno de tales métodos que minimizan la mezcla de la muestra accidental durante el ensayo ex vivo es una bomba de desplazamiento positivo que permite que todos los tubos que se van a lavar entre pocillos eliminen el arrastre de células. Otro método que es útil para minimizar la mezcla de la muestra accidental es una

25 prueba de punto de equilibrio. Una prueba de punto de equilibrio resulta ventajosa porque el arrastre del compuesto no es un problema. En una realización, la prueba comprende una prueba de punto de equilibrio.

Existen varios métodos conocidos en la materia para recoger y almacenar datos obtenidos de ensayos que utilizan citómetros de flujo. En una realización, el software incorporado con el EPS registra la información de tiempos en los tiempos de inyección y de incubación para cada pocillo. Cuando se ejecuta una prueba de detección, dos archivos de adquisición pueden recogerse. En una realización, un archivo, situado en el software del citómetro, contiene datos reales de cada célula analizada por el instrumento. En otra realización, un segundo archivo es un archivo de temporización, que se encuentra en el software de EPS o en el software del citómetro, que contiene datos reales para cada célula analizada por el instrumento. Cada uno de estos archivos puede ser nombrado de acuerdo con un

35 código de barras escaneado de la placa del pocillo, p. ej., una placa de 96 pocillos, al inicio de una ejecución de prueba.

Un usuario puede cargar todos los archivos de ambos instrumentos en un programa de software de análisis, tal como un analizador de EPS. Este programa está diseñado para separar los datos adquiridos del citómetro en grupos y asignar los números de pocillos de los compuestos que se mezclan con las células en cada grupo. Otro uso del programa implica seleccionar poblaciones de las poblaciones individuales basándose en lecturas fluorescentes de manera que cada población individual se pueda analizar de forma discreta. También se evalúa un marcador de análisis, incluido en la configuración de prueba. En una realización, para los ensayos de detección y validación, se utiliza anexina V-FITC, un marcador de apoptosis conjugado con un fluoróforo, para discriminar células vivas de las

45 que entran en la vía apoptótica.

Una vez terminado el análisis, los archivos se suben a una base de datos. En una realización, la base de datos es ACTIVITYBASE™ de IDBS (Guildford, RU). La subida de archivos a una base de datos permite la rápida evaluación de los datos para determinar los compuestos que son activos para cada muestra del paciente. A medida que los datos se acumulan, pueden construirse y desarrollarse herramientas bioinformáticas para facilitar la interpretación de los datos. Como ejemplo, los criterios farmacológicos, tales como CE50, CE90, apoptosis máxima, etc., de los datos adquiridos pueden ser comparados a través de numerosas muestras de pacientes y se correlacionan con los resultados de inmunofenotipificación e información genética. Teniendo en cuenta las grandes cantidades de datos adquiridos con cada ensayo de detección, un sistema de gestión de base de datos flexible es importante para el

55 proceso de detección.

Este sistema puede determinar el índice terapéutico ex vivo mediante la medición de la capacidad de una composición de fármacos para inducir apoptosis. Las figuras 1 y 2 representan la capacidad de detectar células apoptóticas y diferenciar entre fenotipos normales y tumorales utilizando citometría de flujo. En una realización, el método utiliza citometría de flujo para distinguir entre fenotipos normales y tumorales. En otra realización, el método utiliza citometría de flujo y anticuerpos monoclonales para diferenciar entre fenotipos normales y tumorales. En otra realización, el método utiliza citometría de flujo para detectar células apoptóticas. En una realización específica, el método utiliza anexina V acoplada a fluoresceína isotiocianato (FITC) para detectar la expresión de fosfatidilserina en células apoptóticas. El uso simultáneo de las combinaciones apropiadas de anticuerpos monoclonales que se 65 conocen en la materia con estrategias de análisis multiparamétricos permite la discriminación de las células leucémicas de las células normales residuales presentes en muestras de pacientes con trastornos hematológicos.

En una realización, el método permite la discriminación entre células malignas y células normales, ya sea en muestras de sangre o de médula ósea. En otra realización, la discriminación entre células malignas y normales en sangre o médula ósea se realiza de acuerdo con la reciente metodología desarrollada por la normativa para Euroflow (EuroFlow Consortium, Cytometry A. septiembre de 2008; 73(9):834-46; van Dongen et al., 14º Congreso

5 EHA, Berlín, AL, 4 de junio de 2009: que se publicó en Leukemia en 2010 (en prensa)).

Un proceso de detección ex vivo para composiciones de fármacos se muestra esquemáticamente en la Figura 3. En la Figura 3, se evita que la muestra se coagule por la heparina, se immunofenotipifique y se recuente. Luego se diluye la muestra para conseguir una concentración de células leucémicas de aproximadamente 4.000 células/µl. 45 µl de la suspensión celular se añaden a placas de 96 pocillos que contienen los agentes farmacológicos en 5 concentraciones diferentes. Después de incubar los fármacos y las combinaciones de fármacos con la muestra durante aproximadamente 48 horas, los glóbulos rojos se lisan y se lavan para concentrar los leucocitos que contienen las células malignas. Esto acelera el proceso de detección reduciendo drásticamente el volumen y el número de células que necesitan ser evaluadas por el citómetro de flujo. Se añaden anticuerpos etiquetados con

15 fluorescencia para distinguir las células malignas de las sanas y se añade anexina V etiquetada con fluorescencia para medir el nivel de apoptosis en cada población de células, tal como en las células malignas. Se realiza entonces la detección y se analizan y notifican la actividad de cada composición de fármaco determinada y los resultados.

En una realización, el método comprende la división de una muestra en alícuotas y la distribución de las alícuotas en placas con pocillos. Estas placas con pocillos contienen fármacos individuales o combinaciones de fármacos en diversas concentraciones. En una realización, las placas con pocillos contienen fármacos individuales o combinaciones en varias concentraciones antes de la introducción de las muestras celulares. En otra realización, las muestras celulares se introducen en los pocillos antes de la introducción de los fármacos individuales o de las combinaciones en diversas concentraciones. En otra realización, una extensa biblioteca de compuestos puede

25 utilizarse, incluyendo aproximadamente 20, 30, 50, 75, 100, 200, 300, 500, 700, 1.000, o 2.000 compuestos, un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores precedentes, o un mayor número de compuestos.

En algunas realizaciones, las alícuotas contienen un número detectable de células enfermas por pocillo. En una realización, las alícuotas contienen aproximadamente 500 o más células enfermas o neoplásicas por pocillo. En otra realización, las alícuotas contienen aproximadamente 5.000 células enfermas o neoplásicas por pocillo. En otra realización, las alícuotas contienen aproximadamente 10.000 o más células enfermas o neoplásicas por pocillo. En otra realización, las alícuotas contienen aproximadamente 20.000 o más células enfermas o neoplásicas por pocillo. En otra realización, las alícuotas contienen aproximadamente 40.000 o más células enfermas o neoplásicas por pocillo. Los ensayos de las muestras pueden ejecutarse en paralelo. En una realización, al menos dos alícuotas se

35 ensayan en paralelo para permitir la identificación inmunofenotipificada. Además, los pocillos de control sin fármaco alguno pueden incluirse (no mostrado) para identificar el nivel espontáneo de apoptosis no asociada con el tratamiento de fármacos. En una realización, el método utiliza los pocillos de control para identificar el nivel espontáneo de apoptosis en una muestra.

El periodo de tiempo para la incubación de las diferentes composiciones de fármacos con las alícuotas puede variar. En una realización, el periodo de tiempo es de hasta aproximadamente 24 horas. En otra realización, el periodo de tiempo es de hasta aproximadamente 48 horas. En otra realización, el periodo de tiempo es de hasta aproximadamente 72 horas. En otra realización, el periodo de tiempo es de hasta aproximadamente 96 horas. En otra realización, el periodo de tiempo es de hasta aproximadamente 120 horas. Tras la incubación durante un tiempo

45 especificado, las alícuotas de la muestra expuestas a composiciones de fármacos pueden ser tratadas con un tampón para lisar la población de eritrocitos y concentrar la población de leucocitos. En una realización, un tampón conocido en la materia se utiliza para lisar la población de eritrocitos. Cada pocillo se incuba después con un reactivo para detectar la apoptosis utilizando citometría de flujo. En una realización, el reactivo es anexina V.

Es posible evaluar, utilizando citometría de flujo, el efecto de cada fármaco en cada tipo de célula y cuantificar el nivel de muerte celular selectiva inducida por cada fármaco. Los resultados se pueden evaluar entonces y, si se desea, un nuevo ensayo se puede iniciar con una muestra o alícuota adicional con el fin de confirmar los resultados más relevantes con más detalle, tales como las 10 mejores composiciones y concentraciones de fármacos previamente identificados. La selección del fármaco o de la composición de fármacos apropiada que puede inducir

55 selectivamente la apoptosis en células neoplásicas, tales como células de leucemia, se puede efectuar después de que la prueba se realice en una muestra del paciente. En una realización, se identifican aproximadamente 5-20 composiciones de fármacos y se vuelven a ensayar con una muestra reciente. En una realización específica, se identifican las cinco mejores composiciones de fármacos y se vuelven a ensayar con una muestra reciente. En otra realización específica, se identifican las diez mejores composiciones y se vuelven a ensayar con una muestra reciente. En otra realización específica, se identifican las 20 mejores composiciones de fármacos y se vuelven a ensayar con una muestra reciente.

Los métodos proporcionados en la presente memoria se han utilizado para analizar varios fármacos actualmente aprobados para la leucemia linfocítica crónica (LLC) en varios pacientes. Por ejemplo, la eficacia de los fármacos 65 citotóxicos aprobados individualmente en la inducción de apoptosis en las células malignas de muestras de pacientes ex vivo se proporciona en la Figura 4. La Figura 4 demuestra que hay una gran variabilidad de una

imagen7

Los ensayos de ERTI ex vivo utilizados previamente para guiar el tratamiento personalizado a pacientes estaban restringidos a los fármacos individuales, o a un número muy pequeño de combinaciones de fármacos. El beneficio significativo de la evaluación de múltiples combinaciones de fármacos, p. ej., utilizando la plataforma ExviTech, se demuestra en la Figura 22. Para la muestra del paciente con LLC en la Figura 22, los fármacos de un individuo con

5 LLC (izquierda) eran ineficaces, lo que sugiere un tratamiento ineficaz. No obstante, estos mismos fármacos produjeron tres combinaciones que eran muy eficaces en la eliminación de todas las células leucémicas (derecha), lo que sugiere un potencial como tratamiento sensible. De este modo, las predicciones opuestas se han hecho mediante la evaluación de solo fármacos individuales o solo combinaciones de fármacos utilizados en los protocolos de tratamiento actuales. La Figura 22 muestra información que podría ser de suma importancia para el tratamiento eficaz de los protocolos resistentes a neoplasias hematológicas que predicen la falta de respuesta clínica (centro) y de los protocolos altamente sensibles que podrían predecir una respuesta clínica favorable (derecha).

En algunas realizaciones, los ensayos de medicina personalizada descritos en la presente memoria evalúan cinco concentraciones diferentes de cada fármaco o combinación de fármacos. Esto permite que se determine una curva

15 de dosis-respuesta mínima que proporciona una determinación farmacológica más precisa de la eficacia que los datos de dosis individuales. También facilita un control de calidad mediante el análisis de si los cinco puntos se ajustan a una curva sigmoidea de dosis-respuesta. Los mismos datos descritos anteriormente en la Figura 22 para una muestra de LLC se muestran en las curvas de dosis-respuesta de 5 puntos en las Figuras 23-25.

En la evaluación de las combinaciones de fármacos ex vivo es importante determinar si existe cooperatividad positiva o negativa entre los fármacos combinados, también referida como sinergia. Es probable que dicha cooperación sea predictiva ex vivo de la cooperación in vivo en el paciente. La sinergia positiva entre fármacos indica un probable aumento en la eficacia relativa a la toxicidad que es un índice terapéutico superior. Dada la naturaleza altamente tóxica de los fármacos citotóxicos, aumentar su índice terapéutico podría ser terapéuticamente

25 importante. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para cuantificar la sinergia de fármacos, y el método más comúnmente utilizado es el de Chou y Talalay (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55). La Figura 26 muestra la combinación sinérgica de fludarabina y mafosfamida (el metabolito y el principio activo de la ciclofosfamida) en dos muestras de pacientes con LLC, en el que el índice cooperativo (IC) se calcula utilizando el programa Calcusyn (Chou et al., Adv Enzyme Regul 1984, 22:27-55) para caracterizar el potencial sinérgico de las combinaciones. La Figura 27 representa un cálculo más elaborado del sinergismo encontrado en un paciente P2.0149 de la Figura 26 utilizando el método de Chou y Talalay.

La eficacia de los fármacos y combinaciones de fármacos también puede verse afectada por su cinética. La Figura 28 muestra un comportamiento cinético diferente en una muestra de LLC con el fármaco citotóxico aprobado

35 fludarabina y el fármaco antidepresivo no citotóxico sertralina. La ssertralina (paneles de la derecha) elimina todas las células malignas en 24 horas (panel superior derecho), mientras que la fludarabina requiere 48 horas (panel inferior izquierdo). No obstante, ambos fármacos requieren solo 30 minutos de incubación con la muestra para inducir la apoptosis máxima. Esto indica que, aunque la apoptosis medida por anexina V requiere 24 o 48 horas para que sea completamente detectable, las células malignas están programadas para la apoptosis en un corto periodo de incubación. En una realización, las composiciones de fármacos se incuban en periodos de tiempo de aproximadamente 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores precedentes. En otra realización, la apoptosis se mide en puntos temporales en aproximadamente 24 horas, 48 horas, o 72 horas después del inicio de la incubación, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores precedentes.

45 Tal y como demuestra la metodología descrita en la presente memoria, esta plataforma permite la evaluación de cientos a miles de pocillos individuales que contienen muestras hematológicas mezcladas con medicamentos que representan diferentes composiciones y concentraciones. El límite de composiciones de fármacos es dictado por el volumen y celularidad de la muestra hematológica obtenida del paciente en lugar del rendimiento de la plataforma. Debido al pequeño volumen utilizado para cada composición de fármacos, tal como aproximadamente 20.000 células por pocillo, es posible evaluar hasta aproximadamente 10.000 o más composiciones de fármacos por muestra obtenida o hasta 20.000 o más composiciones de fármacos por muestra en muestras con volúmenes superiores que los volúmenes habituales de la muestra. Tal número de combinaciones es suficiente para evaluar las composiciones de fármacos de politerapia alternativas que pueden administrarse a un paciente individual. En una

55 realización, las detecciones se realizan con un mínimo de aproximadamente 500 células neoplásicas por pocillo. En otra realización, las detecciones se realizan con aproximadamente 1.000 células neoplásicas por pocillo. En otra realización, las detecciones se realizan con aproximadamente 20.000 células totales por pocillo. En otra realización, las detecciones se realizan con aproximadamente 50.000 células totales por pocillo. El número de células malignas por muestra del paciente puede variar de prácticamente cero a más de mil millones, y de este modo sus proporciones relativas al número total de células también pueden variar.

La Figura 5 ilustra el número de composiciones de fármacos potenciales que pueden ser exploradas para identificar un tratamiento óptimo de politerapia para un paciente individual. Hipotéticamente, hasta 15 fármacos aprobados para una indicación particular se consideran en la primera columna del lado izquierdo de la Figura 5. Existen 65 numerosos fármacos en la cartera de proyectos para neoplasias hematológicas, con varios fármacos más recientes que se espera que sean aprobados en los próximos años. Existe también un número de fármacos no citotóxicos

dados a pacientes de neoplasias hematológicas para paliar los efectos del tratamiento citotóxico (es decir, los medicamentos concomitantes) cuyo intervalo es comúnmente de 5 a 10 fármacos por paciente. Estos fármacos varían desde protectores gástricos a antieméticos para las náuseas a los antibióticos y antivirales para prevenir infecciones. Los 15 fármacos elegidos en la Figura 5 representan un alto número de fármacos citotóxicos aprobados

5 para considerarse para una indicación dada, y de este modo puede considerarse como representativo de ciertas prácticas clínicas. La selección de los 15 fármacos en la Figura 5 es meramente ilustrativa y de ninguna manera debe interpretarse como una limitación de la presente invención. En la Figura 5, una combinación de hasta 4 fármacos diferentes (2ª columna) se ha contemplado como un número medio representativo, aunque hay protocolos que combinan 5 y 6 fármacos. El diseño de placas de pocillos descritas en la presente memoria ilustra el uso de hasta 22 fármacos diferentes en una única placa de 96 pocillos. Además, diferentes números de fármacos pueden analizarse con placas que tienen diferentes números de pocillos. En una realización, aproximadamente 5 fármacos se seleccionan para su análisis. En otra realización, aproximadamente 10 fármacos se seleccionan para su análisis. En otra realización, aproximadamente 20 fármacos se seleccionan para su análisis. En otra realización, aproximadamente 40 fármacos se seleccionan para su análisis.

15 Como se ilustra en la Figura 5, el número de combinaciones diferentes para los 15 fármacos en la segunda columna es 1.940, y sería de 1.470 para 14 fármacos, etc. Debido a que estos resultados podrían ser utilizados para informar acerca de las decisiones de tratamiento, se realizan preferentemente en cinco concentraciones por fármaco o combinación de fármacos (3ª columna). Además, la evaluación de al menos 2 tiempos de incubación permitiría la evaluación de los parámetros cinéticos (4ª columna). No obstante, el rendimiento del análisis en cinco dosis y/o más de un tiempo de incubación no debe interpretarse como una limitación.

Incluso con todas las variables discutidas en el párrafo anterior (es decir, el número de diferentes fármacos, múltiples mediciones, variación de las concentraciones de fármacos y diversos tiempos de incubación), una 25 plataforma automatizada capaz de evaluar hasta aproximadamente 10.000 o 20.000 composiciones de fármacos cubriría todos los escenarios hipotéticos, ilustrada como la región no sombreada en la Figura 5. El espacio terapéutico permite que se explore el área sombreada en la Figura 5 con los métodos actuales. Las composiciones de fármacos que pueden explorarse con los métodos actuales, hasta 30 o 35, están sombreadas en gris. El resto de la tabla representa el espacio innovador de composiciones de fármacos que se pueden explorar permitido por la plataforma ExviTech. Debido a que las plataformas manuales disponibles en la actualidad solo son capaces de evaluar hasta aproximadamente 35 condiciones individuales, su uso potencial como un ensayo de medicina personalizada es limitado. De ello se desprende que la automatización de los efectos de fármacos en muestras hematológicas ex vivo es tanto favorable como innovadora para una aplicación de medicina personalizada. En una realización, el método analiza menos de 1.000 composiciones de fármacos. En otra realización, el método analiza

35 aproximadamente 10.000 composiciones de fármacos. En otra realización, el método analiza menos de 20.000 composiciones de fármacos. En algunas realizaciones, los métodos descritos en la presente memoria permiten el análisis de hasta aproximadamente 20.000 composiciones de fármacos, que incluyen 1, 2, 3, o 4 combinaciones de fármacos de hasta 15 fármacos. En algunas realizaciones, los tiempos de incubación también son variados. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 5 (4ª columna), incluyendo más de un tiempo de incubación aumenta el número de combinaciones ensayadas. En algunas realizaciones, el uso de ExviTech permite la medición del área no sombreada de la Figura 5, que representa la mayoría de las composiciones de fármacos requerida para individualizar el tratamiento a un paciente.

La plataforma ExviTech también se puede utilizar para detectar miles de fármacos y, en particular, aproximadamente

45 1.000 fármacos aprobados por muestra de paciente para la búsqueda de fármacos que inducen selectivamente apoptosis en las células malignas. Sorprendentemente, se demostró que un número significativo de fármacos no citotóxicos aprobados inducen apoptosis en células malignas con la misma eficacia que los fármacos citotóxicos aprobados para cada indicación. La Figura 6 muestra cómo 5 fármacos no citotóxicos (izquierda) no aprobados para tumores malignos hematológicos eliminan las células malignas de LLC con una eficacia similar a 3 fármacos citotóxicos de LLC aprobados (derecha). La Figura 7 muestra respuestas de dosis de uno de estos fármacos, el antidepresivo paroxetina, lo que demuestra que el fármaco induce apoptosis preferentemente en las células B malignas frente a las células T y CN sanas. La Figura 8 muestra cómo uno de estos fármacos no citotóxicos, sertralina, elimina las células malignas de LLC más rápido que los fármacos de LLC citotóxicos aprobados (24 frente a 48 horas) (izquierda). Tres de los cinco fármacos no citotóxicos más eficaces son los antidepresivos paroxetina,

55 fluoxetina y fármacos con sertralina que pertenecen a la misma familia farmacológica. La Figura 9 muestra cómo solo 3 de 6 inhibidores de la recaptación de serotonina son eficaces en la inducción de la apoptosis en células malignas de LLC. Esto demuestra que estos efectos no están necesariamente relacionados con una clase farmacológica de fármacos, y que el ensayo de medicina personalizada ex vivo propuesto en la presente memoria se puede utilizar para identificar estas actividades.

El descubrimiento inesperado de que múltiples fármacos aprobados no citotóxicos seguros podría ser eficaz contra las células tumorales provocó una evaluación más amplia. En primer lugar, solo unos pocos fármacos fueron eficaces en una muestra dada, descartando un efecto no selectivo. La Figura 10, derivada de una detección de

2.000 fármacos en 23 muestras de LLC, muestra cómo la eficacia de estos fármacos no citotóxicos aprobados

65 puede variar enormemente de un paciente a otro. Los fármacos se definen como eficaces si destruyen más del 80 % de las células malignas, un patrón similar a los fármacos citotóxicos más eficaces. Mientras que solo 3 fármacos

fueron eficaces en más del 80 % de los pacientes, 229 fármacos fueron eficaces en menos del 20 % de las muestras de pacientes. Esto indica que los fármacos no citotóxicos pueden ser eficaces contra las células malignas ex vivo, pero muestran un grado muy grande de variabilidad de un paciente a otro. No obstante, en casi todas las muestras de pacientes con LLC, se encontraron 5-10 fármacos no citotóxicos eficaces contra las células malignas ex vivo.

5 Aunque la previsibilidad de este efecto in vivo es desconocida, con la farmacocinética y otros factores, tales como la formulación desempeñan potencialmente un papel, el efecto de dichos 5-10 fármacos no citotóxicos administrados a un paciente podría representar un beneficio terapéutico significativo.

Algunos de los fármacos no citotóxicos que son eficaces ex vivo son fármacos utilizados para paliar los efectos de

10 los fármacos citotóxicos que se administran a pacientes con un tumor maligno hematológico (es decir, fármacos concomitantes). La Figura 12 muestra un ejemplo de una muestra de LLC para el cual el inhibidor de la bomba de protones, omeprazol y el antiviral aciclovir, mostraron una eficacia significativa contra las células malignas ex vivo similar a la eficacia de los fármacos citotóxicos. La Tabla 4 enumera algunos de estos fármacos concomitantes

15 Tabla 4. Fármacos concomitantes

Fármaco: Indicación

Hidrato de óxido de aluminio: Antiácido

Lorazepam: Agente anti-ansiedad

Amikacina: Antibiótico (aminoglucósido)

Meropenem: Antibiótico (Betalactámico)

Cefepima: Antibiótico (Cefalosporina)

Vancomicina: Antibiótico (Glicopéptido)

Teicoplanina: Antibiótico (Glicopéptido)

Ondasetrón: Antiemético

Dexametasona: Antiinflamatorio, inmunosupresor, glucocorticoides

Anfotericina B (liposómica): Antimicótico

Caspofungina: Antimicótico

Itraconazol: Antimicótico

Fluconazol: Antimicótico

Voriconazol: Antimicótico

Trimetoprima y sulfametoxazol: Bacteriostático

FECG: Factor estimulante de colonias de granulocitos

Ranitidina: Antagonista del receptor H2 de histamina

Rasburicasa: Tratamiento contra la hiperuricemia

Paracetamol: Antiinflamatorio no esteroideo

Metamizol: Antiinflamatorio no esteroideo

Cloruro de morfina: Analgésico opiáceo

Omeprazol: Inhibidor de la bomba de protones

Paroxetina: Antidepresivo

Fluotexina: Antidepresivo

Sertralina: Antidepresivo

Algunos de los fármacos aprobados no citotóxicos podrían ser terapéuticamente beneficiosos para potenciar el efecto de los fármacos citotóxicos (es decir, como agentes quimiosensibilizadores). Un ejemplo se muestra en la Figura 11, en la que las bajas concentraciones del antidepresivo sertralina potencian la eficacia de bajas

20 concentraciones del fármaco citotóxico clorambucilo.

Debido a que los presentes métodos tienen por objeto analizar grandes números de variables, se han diseñado placas de 96 pocillos para explorar las posibles variaciones en los tratamientos de politerapia. Otras placas, incluyendo las placas con números de pocillos más grandes o más pequeños, también se pueden utilizar. En una

25 realización, se utilizan placas de 1.536 pocillos. En otra realización, se utilizan placas de 384 pocillos. En otra realización, se utilizan placas de 96 pocillos.

Las Figuras 13-18 y los Ejemplos 9-14 ilustran el uso de un formato de placa de 96 pocillos para el análisis de

imagen8

imagen9

imagen10

(designada como ʺ50ʺ), hidrocortisona (designada como ʺ51ʺ), hidroxicarbamida (designada como ʺ52ʺ), idarrubicina (designada como ʺ53ʺ), ifosfamida (designada como ʺ54ʺ), imatinib (designado como ʺ55ʺ), interferón alfa-2a (designado como ʺ56ʺ), yodo 1131 anticuerpo monoclonal BC8 (designado como ʺ57ʺ), ifosfamida (designada como ʺ58ʺ), isotretinoína (designada como ʺ59ʺ), laromustina (designada como ʺ60ʺ), L-asparaginasa (designada como 5 ʺ61ʺ), lenalidomida (designada como ʺ62ʺ), lestaurtinib (designado como ʺ63ʺ), mafosfamida (designada como ʺ64ʺ), melfalán (designado como ʺ65ʺ), mercaptopurina (designada como ʺ66ʺ), metotrexato (designado como ʺ67ʺ), metilprednisolona (designada como ʺ68ʺ), metilprednisona (designada como ʺ69ʺ), midostaurina (designada como ʺ70ʺ), mitoxantrona (designada como ʺ71ʺ), nelarabina (designada como ʺ72ʺ), nilotinib (designado como ʺ73ʺ), oblimersen (designado como ʺ74ʺ), paclitaxel (designado como ʺ75ʺ), panobinostat (designado como ʺ76ʺ), 10 pegaspargasa (designada como ʺ77ʺ), pentostatina (designada como ʺ78ʺ), pirarrubicina (designada como ʺ79ʺ), PKC412 (designado como ʺ80ʺ), prednisolona (designada como ʺ81ʺ), prednisona, PSC-833 (designado como ʺ82ʺ), rapamicina (designada como ʺ83ʺ), rituximab (designado como ʺ84ʺ), rivabirina (designada como ʺ85ʺ), sapacitabina (designada como ʺ86ʺ), dinaciclib (designado como ʺ87ʺ), sorafenib (designado como ʺ88ʺ), sorafenib (designado como ʺ89ʺ), STA-9090 (designado como ʺ90ʺ), tacrolimus (designado como ʺ91ʺ), tanespimicina (designada como 15 ʺ92ʺ), temsirolimus (designado como ʺ93ʺ), tenipósido (designado como ʺ94ʺ), terameprocol (designado como ʺ95ʺ), talidomida (designada como ʺ96ʺ), tioguanina (designada como ʺ97ʺ), tiotepa (designada como ʺ98ʺ), tipifarnib (designado como ʺ99ʺ), topotecán (designado como ʺ100ʺ), treosulfán (designado como ʺ101ʺ), troxacitabina (designada como ʺ102ʺ), vinblastina (designada como ʺ103ʺ), vincristina (designada como ʺ104ʺ), vindesina (designada como ʺ105ʺ ), vinorelbina (designada como ʺ106ʺ), voreloxina (designada como ʺ107ʺ), vorinostat

20 (designado como ʺ108ʺ), etopósido (designado como ʺ109ʺ), y zosuquidar (designado como ʺ110ʺ).

Algunos ejemplos de compuestos no citotóxicos que se pueden utilizar solos o en combinación con otros compuestos incluyen hidrato de óxido de aluminio (designado como ʺ111ʺ), lorazepam (designado como ʺ112ʺ), amikacina (designada como ʺ113ʺ), meropenem (designado como ʺ114ʺ), cefepima (designada como ʺ115ʺ), 25 vancomicina (designada como ʺ116ʺ), teicoplanina (designada como ʺ117ʺ), ondansetrón (designado como ʺ118ʺ), dexametasona (designada como ʺ119ʺ), anfotericina B (liposómica) (designada como ʺ120ʺ), caspofugina (designada como ʺ121ʺ), itraconazol (designado como ʺ122ʺ), fluconazol (designado como ʺ123ʺ), voriconazol (designado como ʺ124ʺ), trimetoprima (designada como ʺ125ʺ), sulfametoxazol (designado como ʺ126ʺ), FECG (designado como ʺ127ʺ), ranitidina (designada como ʺ128ʺ), rasburicasa (designada como ʺ129ʺ), paracetamol (designado como

30 ʺ130ʺ), metamizol (designado como ʺ131ʺ), cloruro de morfina (designado como ʺ132ʺ), omeprazol (designado como ʺ133ʺ), paroxetina (designada como ʺ134ʺ), fluoxetina (designada como ʺ135ʺ), y sertralina (designada como ʺ136ʺ).

Además, en la mayoría de países, combinaciones particulares de fármacos representan las terapias citotóxicas preferentes o convencionales para el tratamiento de LMA, LLA, LLC y LNH. Estas terapias existentes pueden ser 35 designadores numéricos asignados, y en las siguientes combinaciones, se pueden utilizar en una combinación adicional con fármacos adicionales.

Utilizando las designaciones numéricas establecidas anteriormente en un formato nº.nº, los ejemplos de combinaciones de dos compuestos que comprenden al menos uno de los compuestos citotóxicos se enumeran a 40 continuación, que pueden o no pueden comprender además otros compuestos en la combinación:

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

Utilizando las designaciones numéricas establecidas anteriormente en un formato nºn.º, los ejemplos de combinaciones de dos compuestos que comprenden al menos uno de los compuestos no citotóxicos se enumeran a continuación, que pueden o no pueden comprender además otros compuestos en la combinación:

imagen22

Como indica la Figura 7, los métodos descritos en la presente memoria proporcionan la observancia de curvas de

10 dosis-respuesta óptimas. En una realización, los métodos descritos en la presente memoria utilizan una curva de dosis-respuesta para seleccionar concentraciones de fármacos para un paciente. En otra realización, las concentraciones de fármacos se seleccionan para inducir la apoptosis en más de aproximadamente el 75% de las células en la muestra. En otra realización, las concentraciones de fármacos se seleccionan para inducir la apoptosis

en más de aproximadamente el 50% de las células en la muestra. En otra realización, las concentraciones de fármacos se seleccionan para inducir la apoptosis en más de aproximadamente el 25% de las células en la muestra. Además, las concentraciones de fármacos convencionales, tales como valor CE50 de un fármaco, pueden no corresponder a la dosis deseada para administrar en un régimen de tratamiento de politerapia. En otra realización,

5 los métodos descritos en la presente memoria utilizan un valor óptimo para seleccionar concentraciones de fármacos para un paciente. En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria utilizan CE50 para seleccionar concentraciones de fármacos para un paciente. En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria utilizan CE90 para seleccionar concentraciones de fármacos para un paciente. En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria utilizan la respuesta celular de las células normales para seleccionar la composición de fármacos deseada y la concentración para una enfermedad neoplásica.

Los métodos descritos en la presente memoria también pueden utilizarse para evaluar el perfil cinético de las composiciones de fármacos tanto citotóxicos como no citotóxicos. Como indica la Figura 8, la cinética de un paciente individual puede variar para diferentes composiciones de fármacos. En una realización, los métodos descritos en la

15 presente memoria determinan un perfil cinético de un fármaco para una determinada indicación. En otra realización, los métodos descritos en la presente memoria determinan un perfil cinético de una composición de fármacos para una determinada indicación. En algunas realizaciones, se selecciona un régimen de fármacos sobre la base del perfil cinético de un fármaco para una determinada indicación.

La Figura 8 también indica que los métodos descritos en la presente memoria son útiles para medir la capacidad para inducir apoptosis de diferentes composiciones de fármacos en diferentes periodos de tiempo. Además, los métodos descritos en la presente memoria son útiles para evaluar las diferencias en la inducción de apoptosis entre las diferentes composiciones de fármacos después de que hayan transcurrido diferentes periodos de tiempo. En una realización, el método detecta la inducción de la apoptosis en aproximadamente 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, o 24

25 horas, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores precedentes. En otra realización, el método detecta la inducción de la apoptosis en aproximadamente 36 o 48 horas. En otra realización, el método detecta la inducción de la apoptosis en aproximadamente 72 horas.

Una medición relacionada es el tiempo mínimo que un fármaco necesita para ser incubado con las células para inducir eficazmente la muerte celular programada (es decir, apoptosis), como se muestra en la Figura 28. Para esta medición, un análisis similar se puede efectuar mediante la incubación de las composiciones de fármacos durante 15 minutos, seguido del lavado del fármaco y espera de 48 horas para medir la apoptosis. En una realización, el método detecta la inducción de la apoptosis después de incubarse antes del lavado del fármaco durante aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, o 4 horas, o un intervalo definido por dos cualesquiera de 35 los valores precedentes. En otra realización, el método detecta la inducción de la apoptosis en aproximadamente 24

o 48 horas. En otra realización, el método detecta la inducción de la apoptosis en aproximadamente 72 horas.

Ejemplos

EJEMPLO 1: Detección por citometría de flujo de células normales apoptóticas y neoplásicas

Un índice terapéutico ex vivo puede determinarse midiendo la capacidad de una composición de fármacos para inducir la apoptosis. Las Figuras 1 y 2 representan la capacidad para detectar células apoptóticas y diferenciar entre fenotipos normales y tumorales utilizando citometría de flujo. En la Figura 1, se utilizó el reactivo anexina V acoplado 45 a fluoresceína isotiocianato (FITC) para detectar la expresión de fosfatidilserina en células apoptóticas. La intensidad de la fluoresceína se muestra en el eje y, y el tamaño celular se muestra en el eje x. La Figura 1 ilustra la capacidad para identificar células apoptóticas (recuadro superior izquierdo) y células vivas (grupo inferior derecho) y demuestra que el uso simultáneo de combinaciones apropiadas de anticuerpos monoclonales y estrategias de análisis multiparamétricos puede permitir la discriminación de las células leucémicas de las células normales residuales presentes en muestras procedentes de pacientes con trastornos hematológicos. La Figura 2 representa un caso adulto con LLA B precursora que presenta reordenamientos del gen BCR/ABL [t (9;22)positivo]. Dos subconjuntos celulares, leucémicos (gris claro) y normales (gris oscuro), se detectaron entre las células positivas para CD19 utilizando tinción de anticuerpo monoclonal múltiple analizado por citometría de flujo cuantitativa. Las células leucémicas expresan un fenotipo único (expresión homogénea de CD34, pero expresión de CD38 baja y

55 relativamente heterogénea) asociado con la translocación.

EJEMPLO 2: Protocolo para la evaluación ex vivo de composiciones de fármacos

Un proceso de detección ex vivo para composiciones de fármacos se muestra esquemáticamente en la Figura 3. Una muestra de sangre puede dividirse en pequeñas alícuotas que se distribuyen en placas de pocillos de cualquier tamaño adecuado. Estas placas de pocillos contienen fármacos individuales o combinaciones de fármacos, cada uno en diversas concentraciones. Para facilitar el desarrollo de la prueba óptima, una muestra se diluyó en medio RPMI y se concentró a aproximadamente 20.000 células leucémicas por pocillo. En paralelo, otra alícuota es analizada para identificación inmunofenotípica utilizando citometría de flujo para la identificación de las células 65 normales y patológicas y la detección de la apoptosis basal. Los pocillos de control sin ningún fármaco se pueden incluir (no mostrado) para identificar el nivel espontáneo de la apoptosis no asociado con el tratamiento de fármacos.

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

Claims

imagen1

imagen2