CN111295588A - 确定测试化合物选择性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定测试化合物的选择性的方法以及相关的方法，诸如用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物或包含多于一种测试化合物的组合物的治疗或对所述治疗有响应的方法。

Description

确定测试化合物选择性的方法
本发明涉及用于确定测试化合物选择性的方法和相关方法，例如用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法。具体地，包括以下步骤的方法：(a)提供样品，其包含在总细胞群中的至少两个可区分的细胞亚群；(b)将所述样品分成至少两部分；(c)在不存在测试化合物的情况下孵育(b)中获得的至少一个部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育(b)中获得的至少一个部分；(d)在(i)存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一个部分中以及(ii)不存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一个部分中，确定表现出可区分的表型的所述至少两个亚群中的一个中的细胞数量，其是相对于表现出相同表型的细胞的总群体中的细胞数量而言的；和(e)通过(i)除以(ii)确定测试化合物在步骤(d)中提及的一个亚群中诱导(d)中提及的表型相对于所有其他表型的选择性，其中如果(i)除以(ii)大于1，优选大于1.05、1.1、1.5、2、3，最优选大于5，则测试化合物选择性诱导(d)中提及的表型，并且如果(i)除以(ii)小于1，优选小于0.95、0.9、0.7、0.5、0.3，最优选小于0.2，则测试化合物选择性抑制或减少(d)中提及的表型。本发明还提供了用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法，其中所述方法包括(a)提供来自受试者的样品，所述样品包含总群体细胞中的至少两个细胞亚群，其中至少一个亚群对应于癌细胞，并且至少一个亚群对应于非癌细胞；(b)将所述样品分成至少两部分；(c)在不存在测试化合物的情况下孵育(b)中获得的至少一个部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育至少一个部分；(d)(i)在所述测试化合物的存在下孵育的所述至少一部分中以及(ii)在所述测试化合物的不存在下孵育的所述至少一部分中，确定在对应于癌细胞的所述亚群中的至少一个中的活细胞的数量，其是相对于所述总细胞群中的活细胞的数量而言的；和(e)通过(i)除以(ii)确定受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应，其中如果得到的值小于1，优选小于0.95、0.9、0.8、0.6、0.4，最优选小于0.2，则受试者将响应于治疗或对治疗有响应。
用于治疗人和/或动物疾病的药物的鉴定，需要鉴定在特定细胞类型中选择性诱导所需生物学效应而不会影响其他细胞从而不引起不希望的副作用的分子。反过来说，能够在个体患者的期望的细胞类型中选择性诱导所需生物学效应的药物很可能为所述患者提供医学益处。具有较低选择性的药物可能引起严重的副作用，可能需要减少治疗剂量，并可能因此不能产生期望的医疗结果。
过去，药物发现严重依赖于细胞系模型系统的使用。然而，人们越来越理解这些模型仅仅不完全地重演高级生物体的复杂过程，后者通常涉及不同细胞类型的相互作用。特别是，在这样的系统中，不能研究作为仅在期望的靶细胞类型中诱导作用的能力的选择性。本领域可行的解决方案是独立地测试不同细胞系中的分子。然而，这没有考虑不同细胞类型的可能的相互作用。替代方案是建立共培养模型系统，其中混合不同的细胞系以重演更现实的环境。另外，化学物质也可在原始材料如PBMC或由多种细胞类型组成的骨髓中离体直接测试。因此在药物发现和开发的背景下需要有效的方法来确定化学物质如何在包含至少两种不同细胞类型的细胞混合物中相对于其他细胞类型选择性地影响一种细胞类型。
还变得越来越清楚的是，患有相同医学病症的不同患者可能对相同药物具有非常不同的反应。据估计，所有处方药中高达90％仅对25％的患者有益。用很可能无效的药物治疗患者不仅可能由于副作用和缺乏医疗益处而引起不必要的痛苦，而且还将浪费宝贵的保健财政资源。因此，需要准确预测个体患者的治疗结果的方法，以便使医师能够在正确的时间将正确的药物给予正确的患者。
用于个体化预测治疗响应的本领域方法可大致分为从间接生物标志物推断治疗响应的方法(例如从BCR-ABL中的突变推断患者将很可能不响应于伊马替尼)和直接测定原始患者材料中的药物作用以预测治疗结果的方法(即功能性离体药物测试)。
本领域已知的功能性离体药物测试包括MiCK测定法(Kravtsov等人,Blood.92(3):968–80)、US20100298255A1中描述的方法或Promega Coporation的Cell Titer Glo测定法。这些方法集中于测试从患者提取的靶细胞群在合适的离体孵育条件下是否对特定药物有响应。这里，我们提出了证据，即，与本领域的现有认知不同，仅仅测定靶细胞群中的药物反应是不够的，事实上，与对脱靶细胞的影响相反的、药物影响靶细胞的选择性对于预测治疗结果是至关重要的(实施例2-4)。因此，同样对于使用功能性离体药物反应测试预测临床药物反应，需要有效的手段来测定化学物质(例如FDA批准的药物)在包含至少两种不同细胞亚群的细胞混合物中如何相对于其他细胞群选择性地影响一种细胞群。
药物相对于另一种细胞群影响一种细胞群的选择性传统上通过比较在目的细胞群中达到50％的所需或中靶效应的浓度(EC50)与在脱靶细胞群中达到50％的相同效应的浓度来测定。
本领域实施的一种方法是分离靶细胞群和脱靶细胞群，或提供代表靶细胞群和脱靶细胞群的分离的细胞系，并在这些分离的细胞群中以各不同浓度分别测定药物响应。这种方法的缺点是，不能在靶细胞的自然环境中分析靶细胞，这可能以多种方式影响结果。此外，如果需要从复杂的细胞混合物(例如PBMC)中分离靶细胞，这种操作会对系统引入额外的干扰，这可能影响测定结果。此外，依赖于通过直接物理相互作用的细胞-细胞相互作用或通过可溶性信使在一定距离处的作用(例如，免疫系统的细胞清除受损的但不清除凋亡的癌细胞)的效应不能在分离的细胞模型系统中再现。
为了确定药物或其他化学测试化合物在由两种或更多种细胞类型组成的复杂混合物中的选择性，需要新方法来区分不同的细胞群，并选择性地测定对每个细胞群各自的药效。本领域分析复杂细胞混合物的标准方法是流式细胞术。在此，可以区分单个细胞群，并且可以使用荧光染料和标志物(例如，通过用荧光标记的抗体来染色，荧光活-死亡染色)测定测试化合物的效果。另一种方法已描述于WO2016/046346中。
为了使用流式细胞术测定化学测试化合物(例如作用于复杂细胞混合物中特定细胞亚群的药物)的EC50，本领域技术人员将对显示期望表型的目标亚群细胞在用化学化合物处理(通常为4个或更多个浓度的化学化合物)后进行计数(即测定绝对细胞数)，绘制显示期望表型的细胞在用化学化合物处理后的数量与化学化合物浓度的图，并拟合4参数Logistic或其他S形模型以测定EC50。或者，可以使用与表型成正比的作为代表的测定，例如测定ATP水平用于活细胞总数。这从以下各项得到了证明：大量现有技术文献和申请说明(如Hernandez等人,SLAS Technology 2017,第22(3)卷,325–337(这里表型是活的白血病细胞)或Ross等人,Cancer Research 49,3776-3782.1989年7月15日)以及为验证和优化使用流式细胞术对绝对细胞数量计数的能力所投入的相当大的努力。
为了确定测试化合物影响复杂细胞混合物中一种细胞类型相对于另一种细胞类型的选择性，本领域技术人员将因此测定测试化合物对两种细胞群的EC50，取EC50值的比率或log EC50值的差作为选择性的量度(参见，FDA所用治疗指数的定义)。
然而，这种方法受到以下主要限制：绝对细胞数本身难以使用流式细胞术和其他单细胞分析技术来测定。接种到测定板中的绝对细胞数可能显著变化，特别是当使用自动化细胞分配机器时。在随后的染色和洗涤步骤中，细胞可能从不同的测定孔中有差别地丢失。此外，绝对细胞定量通常需要针对珠粒标准设定基准，这引入了另一种误差来源并且代表需要额外的努力。最后，选择性的测定需要在不同测试化合物浓度下测定测试化合物的作用，这极大地增加了样品需求和测定时间。
鉴于上述，本领域需要用于在复杂细胞混合物中测定化学化合物的选择性的方法。
因此，本发明要解决的技术问题是提供用于确定一种或多种测试化合物的选择性的改进方法和基于该改进的测定选择性的相关方法。
因此，在第一个实施方案中，本发明涉及确定测试化合物选择性的方法，该方法包括以下步骤:
(a)提供样品，其包含在总细胞群中的至少两个可区分的细胞亚群；
(b)将所述样品分成至少两部分；
(c)在不存在测试化合物的情况下孵育步骤(b)中获得的至少一个部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育步骤(b)中获得的至少一个部分；
(d)在
(i)存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一部分中以及
(ii)不存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一部分中，
确定表现出可区分表型的至少两个亚群中的一个中的细胞数量，其是相对于表现出相同表型的细胞的总群体中的细胞数量而言的；
(e)通过(i)除以(ii)确定测试化合物在步骤(d)中提及的一个亚群中诱导(d)中提及的表型相对于所有其他表型的选择性，其中如果(i)除以(ii)大于1，优选大于1.05、1.1、1.5、2、3，最优选大于5，则测试化合物选择性诱导(d)中提及的表型，并且如果(i)除以(ii)小于1，优选小于0.95、0.9、0.7、0.5、0.3，最优选小于0.2，则测试化合物选择性抑制或减少(d)中提及的表型。
与本领域实施的用于确定测试化合物在总细胞群中诱导或抑制一种可区分的细胞群相对于其他细胞群的表型的选择性的方法不同，本发明的方法不需要测定绝对细胞数，而是依赖于测定具有期望表型的细胞占表现出相同表型的总细胞群的分数。因此，本发明的方法对于接种到测定板中的精确细胞数量的变化具有稳健性，所述细胞数量尤其在使用自动化细胞分配机器时可能显著变化。本发明的方法对于在随后的染色和洗涤步骤中细胞丢失是更是具有稳健性，其中细胞可能从不同的测定孔中有差别地丢失。该方法还不需要针对珠粒标准设定基准，所述设定基准引入了另一误差源并代表需要额外的努力。因此，本发明的方法是内部控制的。此外，本发明的方法在测试化合物的浓度点少至一个时也能获得选择性信息，而竞争方法需要测定多个浓度点；参见例如实施例8。
此外，与本领域实施的方法不同，本发明的方法不需要在确定测试化合物对包含在总细胞群的细胞群的选择性之前分离包含在总细胞群的细胞群。因此，本发明的方法不是仅依赖于测试化合物对分离的靶细胞群的作用以确定其选择性，而且考虑了复杂细胞群中包括的细胞的相互作用。因此，本发明的方法令人惊讶地使得可以确定细胞混合物中测试化合物的选择性，由此得到的选择性对于不同测定之间的细胞数变化是具有固有稳健性的，是内部控制的，并且考虑了包含在总细胞群中的不同细胞群之间的相互作用。
此外，本发明的方法不依赖于从剂量-响应曲线测定EC50。这与现有技术中需要测定EC50以测定选择性的方法相反。EC50是获得由化合物诱导或受测试化合物抑制的半数最大效应时的化合物浓度。EC50通常也称为IC50(“抑制浓度50％”)或GI50(“生长抑制50％”)，这取决于上下文。或者，有时也使用达到或抑制其他百分比效果的浓度(例如EC90、EC80等)。EC50通常通过测定细胞对4个或更多个浓度的测试化合物的响应，并用合适的S形曲线拟合数据来获得。为了确定化合物影响一种细胞群相对于另一种细胞群的选择性，必须独立地确定化合物影响两种细胞群的EC50，并且将log EC50的差异作为选择性的量度。为了确定EC50，需要与测试化合物的响应成正比的测定手段，例如具有特定表型的细胞数量或效应的大小。所述测定手段对在测定期望表型之前与测试化合物一起孵育的绝对细胞数的变化具有固有的敏感性。相反，本发明的方法依赖于表现出特定表型的一个群体的细胞占具有相同表型的细胞总数的分数，来确定选择性。因此，本发明的方法不依赖于绝对细胞数的定量，而是内部控制的，并且允许通过在比本领域方法所需的更少的浓度点测定对测试化合物的响应，来定量测试化合物的选择性，所述本领域方法需要确定EC50并因此需要确定全剂量-响应曲线(实施例1)。当提供的样品量有限时本发明的方法是特别有利的，因为初级患者样品通常是这种情况。
如实施例12中所述，在实施所关注的方法中对确定选择性关键的EC50值，不能从表现出表型细胞亚组占表现出该期望表型的细胞总数中的分数来确定。因此，对于本领域技术人员来说，使用表现出特定表型的细胞占表现相同表型细胞总数的分数来获得关于选择性的信息，是非显而易见的。
与现有技术的方法相反，在本发明的方法中，为了评价测试化合物影响一个细胞亚群相对于另一个细胞亚群的选择性，基于表现出所关注的特定表型的特定细胞亚群的细胞数量相对于表现出相同表型的总细胞群中的细胞数量，来确定测试化合物的选择性。因此，所得选择性对于不同测定之间的绝对细胞数的变化具有固有的稳健性，如实施例13中所示，是内部控制的并且考虑了包含在总细胞群中的不同细胞群之间的相互作用。此外，选择性可以通过在比本领域方法所需的浓度点更少的浓度点测定细胞对测试化合物的响应来确定。
与现有技术中用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗由响应的方法不同，本发明的方法将测试化合物对来自患者的各种细胞群体的复杂群体中包含的癌细胞群体的作用与相同测试化合物对作为整体的该复杂细胞群体的作用联系起来。因此，本发明的方法不是仅依赖于测试化合物对靶癌细胞群的作用来确定其选择性、并得出关于用测试化合物治疗的患者是否响应的结论，而且还考虑了测试化合物对复杂细胞群体中包含的其他细胞的不期望的作用。换言之，本发明的方法定量抗癌药物杀死癌细胞相对于非癌细胞的选择性能力，以便确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物或药物的治疗或对所述治疗有响应。与现有技术中描述的仅测定测试化合物对癌细胞的作用的方法相比，本发明的方法给出了关于患有癌症的受试者是否将响应于用如实施例2-4中所述的测试化合物的治疗或对其有响应的更准确的信息。具体地，如所附实施例所示，使用本发明的方法，作为性能(quality)的量度的ROC曲线下面积(AUROC)值(由此，一种方法可以区分两类)为0.97，而使用根据WO2016/046346的方法得到的AUROC仅为0.91，并且基于细胞数量得到的AUROC为0.86(见图5)。类似地，在实施例2和3中观察到降低的分类准确度，导致图4。照此，本发明的方法产生0.85的分类准确度，而如果仅基于癌细胞的敏感性或总细胞群体的敏感性来确定药物响应，则获得0.65或更小的分类准确度(图4，分别是中和下图)。基于本申请中提供的比较数据，因此显然本发明的方法提供了改进的准确度。
此外，与现有技术中用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法不同，本发明的方法不依赖于绝对细胞数的定量、剂量响应曲线或包含在总细胞群的细胞群的分离，因此本发明的方法对于不同测定之间的总细胞数的变化、对于来自各个测定的细胞的选择性损失更具有稳健性，本发明的方法能够考虑可能影响细胞群对测试化合物的响应的不同细胞群的相互作用(例如，由免疫系统的细胞识别受损而非死亡的癌细胞)，且需要测定浓度点更少。
本发明的方法在步骤(a)中包括提供样品，其包含在总细胞群中的至少两个可区分的细胞亚群。在本发明中，术语“可区分的亚群”是指作为较大群体的一部分并且可以通过细胞标志物与群体中的其他细胞区分开的细胞。即，两个可区分的亚组的细胞可以属于相同或不同的细胞类型，只要细胞显示细胞标志物的不同表达属性，这使得它们可以使用成像技术如共焦显微术来区分即可。为了容易地确定细胞是否属于一种细胞亚群，优选提供单层形式的细胞。如所附实施例所示，单层的形成可以使用本领域已知的方法进行。对于仅包含非贴壁细胞或者贴壁和非贴壁细胞的混合物的样品，优选通过WO2016/046346中教导的方法进行单层形成。因此，在一个本发明的优选实施方案中，本发明的方法在步骤(b)之后和进一步分析之前还包括形成包含所用细胞样品的细胞的单层。在这方面，用于本发明方法的细胞样品的类型没有特别限制，只要其包含至少两个可区分的细胞亚群即可。然而，在一个本发明的优选实施方案中，所用的细胞样品是PBMC样品或骨髓样品。
细胞标志物是由特定类型的细胞表达的蛋白质，其单独或与其他蛋白质组合允许将这种类型的细胞与其他细胞类型区分开来。即，通过使用在细胞表面上或细胞内(包括在细胞质内或在内膜内)表达的细胞标记，可以区分包含在如本文所用的总细胞群体中的细胞，例如包含在获自供体的样品中的细胞，并因此可被归为可区分的亚群。因此，所述两个或更多个可区分的细胞亚群不限于属于不同细胞类型的细胞。反而两个或更多个可区分的亚组的细胞可以是相同的细胞类型，只要所述亚组可以使用细胞标志物来区分即可，例如在它们的表面上表达的那些细胞标志物，例如相同细胞类型的处于不同疾病阶段的细胞，和/或具有相同类型但具有不同活化状态的细胞和/或具有相同类型但处于不同分化阶段的细胞。
外周血单核细胞(PBMC)是具有圆核(与叶核相对)的血细胞。PBMC包括淋巴细胞(B细胞、T细胞(CD4或CD8阳性)和NK细胞)、单核细胞(树突细胞和巨噬细胞前体)、巨噬细胞和树突细胞。这些血细胞是免疫系统中对抗感染和适应入侵者的关键组分。在本发明的一些实施方案中，优选使用Ficoll密度梯度纯化的PBMC，优选人PBMC，用于产生本发明的PBMC单层或包含PBMC单层的细胞培养装置，或用于本发明的一些方面中提供的方法中。本发明可以使用任何单核细胞。在一个优选的实施方案中，本发明可以确定，但不限于确定测试化合物相对于PBMC或骨髓细胞样品中包含的靶细胞的选择性，即对以下细胞组中的细胞和细胞谱系中的细胞的选择性(包括终末细胞状态)：造血干细胞(包括但不限于，共同淋巴前体细胞、共同骨髓前体细胞，及其成熟谱系和终末状态，包括祖B细胞、B细胞、双阴性T细胞、阳性T细胞、浆B细胞、NK细胞、单核细胞(巨噬细胞、树突细胞))。这些可以在外周血、骨髓(局部扁平骨)、脐带血、脾、胸腺、淋巴组织和疾病的任何液体积聚结果如胸膜液中发现，但不限于此。细胞可以处于任何健康或疾病状态。
用于本文所述方法的PBMC细胞可以使用本领域已知的或本文所述的任何合适方法从全血中分离。例如，可以使用Panda等人描述的方案(Panda,S.和Ravindran,B.(2013).Isolation of Human PBMCs.Bio-protocol 3(3):e323)。优选地，使用密度梯度离心来分离。这种密度梯度离心将全血分离成由层分开的组分，例如，上层血浆，接着是PBMC层和底部多形核细胞(如嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)和红细胞部分。多形核细胞可以通过裂解红细胞即无核细胞进一步分离。用于这种离心的常见密度梯度包括但不限于Ficoll(一种亲水性多糖，例如，
Figure BDA0002476505890000091
-Paque(GE Healthcare,Upsalla,瑞典)和SepMateTM(StemCellTechnologies,Inc.,
Figure BDA0002476505890000092
德国)。
用于本文所述方法的骨髓细胞可以使用本领域已知的任何合适的方法从骨髓分离。特别是，密度梯度离心和磁珠可用于将骨髓细胞与这些样品的其他组分分离。例如，可以使用MACS细胞分离试剂(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,德国)。
如本领域已知的，这种分离的培养物可以含有小百分比的一种或多种其他细胞类型的群体，例如，无核细胞如红细胞。可以进一步将PBMC从这些本领域已知和/或本文所述的其他细胞群中分离和/或纯化；例如，裂解红细胞的方法通常用于从分离的PBMC中除去这些细胞。然而，本发明的方法不依赖于进一步的纯化方法，并且可以直接使用本文分离的PBMC。因此，本文公开的方法可以包括或不包括裂解来自分离的PBMC样品中的红细胞。然而，当存在时，据信存在的无核细胞例如红细胞(通常小于PBMC)停留在PBMC之下和之间的培养表面上，并且潜在地干扰适于成像的单层的形成。因此，优选的是，相对于PMBC，无核细胞例如红细胞的浓度为约500至1，更优选约250至1，最优选约100至1，优选浓度尽可能低。也就是说，最优选地，用于本文公开的方法的分离的PBMC样品含有少于约100个无核细胞，例如红细胞，对每个PBMC而言。
在提供样品，特别是如上所述包含在总细胞群中至少两个可区分的细胞亚群的样品，特别是包含PBMC或骨髓细胞的样品之后，将样品分成至少两个部分。或者，不将(a)中提供的样品分开，而是可以提供至少两个相同来源和类型的样品，即不需要进一步分开的样品。这两个部分可以具有相同的尺寸或不同的尺寸。然而，优选的是，所述至少两个部分中的每一个包含相似的、优选相同的比率的各可区分的细胞亚群的细胞。
在将样品分成至少两部分之后，在不存在测试化合物(即其选择性待确定的测试化合物)的情况下孵育至少一个部分。即，将该部分用作对照/参照部分。
在测试化合物的存在下孵育步骤(b)中获得的至少一个剩余部分。在这方面，对测试化合物或多个测试化合物没有特别限制，只要它/它们通常适合用作药物即可。然而，优选所述测试化合物选自已知在疾病治疗中有效的化合物，所述疾病特别是血液学恶性肿瘤和/或骨髓和/或淋巴组织的恶性肿瘤、炎性疾病和自身免疫疾病。已知有效治疗这些疾病的化合物包括化学化合物和生物化合物，例如抗体。已知有效治疗这些疾病的化合物的实例包括但不限于阿仑单抗、阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺酶、ATRA、阿扎胞苷、苯达莫司汀(Bendamustin)、博纳吐单抗、硼替佐米、波舒替尼、本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、白消安、二盐酸组胺制剂(Ceplene)、苯丁酸氮芥、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、地尼白介素-毒素连接物(Denileukin diftitox)、地塞米松、多柔比星、Duvelisib、EGCG＝表没食子儿茶素没食子酸酯、依托泊苷、非格司亭、氟达拉滨、吉妥珠单抗奥佐米星、二盐酸组胺、高三尖杉酯碱、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉里斯、异环磷酰胺、伊马替尼、干扰素Α-2a、重组体、干扰素Α-2b、重组体、静脉注射免疫球蛋白、L-天冬酰胺酶、来那度胺、马赛替尼、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、米哚妥林、米托蒽醌、MK-3475＝派姆单抗、尼洛替尼、培门冬酶、聚乙二醇干扰素α-2a、普乐沙福、普纳替尼、泼尼松龙、泼尼松、R115777、RAD001(依维莫司)、利妥昔单抗、Ruxolotinib、Selinexor(KPT-330)、索拉非尼、舒尼替尼、沙立度胺、拓扑替康、维甲酸、长春碱、长春新碱、伏立诺他、唑来膦酸盐、ABL001、ABT-199＝维奈托克、ABT-263＝Navitoclax、ABT-510、ABT-737、ABT-869＝利尼伐尼、AC220＝奎扎替尼、AE-941＝新伐司他、AG-858、AGRO100、氨蝶呤、菊欧文氏菌门冬酰胺酶、AT7519、AT9283、AVN-944、巴非替尼、贝妥莫单抗、贝他定、betaalethine、贝沙罗汀、BEZ235、BI 2536、Buparlisib(BKM120)、卡非佐米、卡莫司汀、色瑞替尼、CGC-11047、CHIR-258、CHR-2797、CMC-544＝伊珠单抗奥佐米星、CMLVAX100、CNF1010、CP-4055、Crenolanib、克唑替尼、鞣花酸、依沙芦星、Epoetin Zeta、依帕珠单抗、FAV-201、FavId、黄酮吡多、G4544、Galiximab、gallium maltolate、硝酸镓、Givinostat、GMX1777、GPI-0100、Grn163l、GTI 2040、IDM-4、复合α干扰素(Interferon alfacon-1)、IPH 1101、ISS-1018、伊沙匹隆、JQ1、来他替尼、氮芥、MEDI4736、MGCD-0103、MLN-518＝坦度替尼、莫特沙芬钆、天然α干扰素、奈拉滨、奥巴克拉、奥滨尤妥珠单抗、OSI-461、帕比司他、PF-114、PI-88、Pivaloyloxymethyl butyrate、匹蒽醌、泊马度胺、PPI-2458、普拉曲沙、Proleukin、PU-H71、雷诺嗪、雷巴替尼(Rebastinib)、Samarium(153sm)lexidronam、SGN-30、骨骼靶向放疗、他地那兰、他米巴罗汀、坦罗莫司、硫鸟嘌呤、曲沙他滨、长春地辛、VNP 40101M、Volasertib、XL228、羟氯喹(Plaquenil)、来氟米特(Arava)、甲氨蝶呤(Trexall)、柳氮磺吡啶(Azulfidine)、米诺环素(Minocin)、阿巴西普(Orencia)、利妥昔单抗(Rituxan)、托珠单抗(Actemra)、阿那白滞素(Kineret)、阿达木单抗(Humira)、依那西普(Enbrel)、英利昔单抗(Remicade)、赛妥珠单抗、pegol(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、托法替尼(Xeljanz、Xeljanz XR)、巴瑞克替尼、塞来考昔(Celebrex)、布洛芬(prescription-strength)、萘丁美酮(Relafen)、萘普生钠(Anaprox)、萘普生(Naprosyn)、吡罗昔康(Feldene)、双氯芬酸(Voltaren、Diclofenac Sodium XR、凯扶兰、Cambia)、二氟尼柳、吲哚美辛(Indocin)、酮基布洛芬(Orudis、Ketoprofen ER、Oruvail、Actron)、依托度酸(Lodine)、非诺洛芬(Nalfon)、氟比洛芬、酮咯酸(Toradol)、甲氯芬那酸盐、甲芬那酸(Ponstel)、美洛昔康(Mobic)、奥沙普秦(Daypro)、舒林酸(Clinoril)、双水杨酯(Disalcid、Amigesic、Marthritic、Salflex、Mono-Gesic、Anaflex、Salsitab)、托美丁(Tolectin)、倍他米松、泼尼松(Deltasone、Sterapred、Liquid Pred)、地塞米松(Dexpak、Taperpak、Decadron、Hexadrol)、可的松、氢化可的松(Cortef、A-Hydrocort)、甲泼尼龙(Medrol、Methacort、Depopred、Predacorten)、泼尼松龙、环磷酰胺(Cytoxan)、环胞素(Gengraf、Neoral、Sandimmune)、硫唑嘌呤(Azasan、Imuran)和羟氯喹(Plaquenil)。
因此，在本发明的方法中，在不存在测试化合物的情况下孵育细胞样品的至少一部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育至少一个样品。
在这方面，在本发明方法的一些实施方案中，随后将细胞、特别是PBMC以约100个细胞/平方毫米生长区至约30000个细胞/平方毫米生长区的密度进行孵育以进行分离。优选地，将细胞、特别是PBMC以约500个细胞/平方毫米生长区至约20000个细胞/平方毫米生长区、约1000个细胞/平方毫米生长区至约10000个细胞/平方毫米生长区、约1000个细胞/平方毫米生长区至约5000个细胞/平方毫米生长区、或约1000个细胞/平方毫米生长区至约3000个细胞/平方毫米生长区的密度进行孵育。最优选地，将细胞、特别是PBMC以约2000个细胞/平方毫米生长区的密度进行孵育。术语“约”应具有在给定值或范围的10％内，更优选在5％内的含义。因此，在一些实施方案中，将细胞、特别是PBMC在本发明方法中孵育以在培养装置中具有约100(即90至110)个细胞/平方毫米生长区至约30000(即27000至33000)个细胞/平方毫米生长区的密度。更优选地，将细胞、特别是PBMC以下列密度孵育：约500(即450至550)个细胞/平方毫米生长区至约20000(即18000至22000)个细胞/平方毫米生长区，约1000、即900至1100个细胞/平方毫米生长区至约10000、即9000至11000个细胞/平方毫米生长区、约1000、即900至1100个细胞/平方毫米生长区至约5000、即4500至5500个细胞/平方毫米生长区，或约1000、即900至1100个细胞/平方毫米生长区至约3000、即2700至3300个细胞/平方毫米生长区。最优选地，将细胞、特别是PBMC以约2000、即1800至2200个细胞/平方毫米生长区的密度孵育。
细胞、特别是PBMC的数量可以使用本领域已知的标准方法测定。特别是，PBMC的数量可以通过使用血细胞计数器或Chan等人(Chan等人(2013)J.Immunol.Methods 388(1-2),25-32)描述的方法进行细胞计数来测定。骨髓细胞的数量也可以使用本领域熟知的方法来测定。特别是，骨髓细胞可以使用细胞计数来确定。也可使用本领域熟知的方法计数其他细胞。
在培养基中进行孵育。本领域技术人员熟知维持细胞特别是PBMC或骨髓细胞成活力的方法。然而，用于本发明方法的培养基没有特别限制。在这方面，培养基代表具有培养细胞所必需的营养物和物质的液体。用于培养真核细胞的液体培养基是本领域技术人员已知的(例如DMEM、RPMI1640等)。合适的培养基可以根据待培养的细胞类型来选择。例如，PBMC或骨髓细胞可以在RPMI 1640 10％FCS中培养。可以选择任何合适的培养基，然而，应该选择已知不会人为影响PBMC响应和/或骨髓细胞响应的培养基成分。补充物描述的是为了诱导或改变细胞功能而加入培养基中的物质(例如细胞因子、生长和分化因子、促细胞分裂剂、血清)。补充剂是本领域技术人员已知的。通常与真核细胞一起使用的血清的一个实例是胎牛血清。培养基中还可补充抗生素，如青霉素、链霉素、环丙沙星等。在一个实施方案中，测试物质和/或刺激剂可以分别加入到每个单独单元中的活细胞材料中。测试物质可以是药物或药物成分。刺激剂可以包括支持细胞的维持、生长或分化的任何物质。在一个具体的实施方案中，刺激物是作用于免疫细胞的物质，例如通过激活免疫细胞而作用于免疫细胞。用于激活免疫细胞的刺激剂是现有技术中已知的。这些活性剂可以是多肽、肽或抗体和其他刺激物。例如，OKT-3、干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ、寡CPGs、促细胞分裂剂(例如PWM、PHA、LPS)等。可将测试物质和刺激剂注射到细胞培养基中。优选地，将PBMC在补充有10％FBS/FCS(优选但不是必须具有低内毒素等级以使活化最小化)的RPMI中培养。PBMC培养物还可以包含来自PBMC供体的人血清。
本发明含义中使用的术语“生长区”是指细胞在其上停留的培养装置内的表面。本发明含义中使用的“密度”是细胞在其上停留的装置内表面的每单位面积的细胞数量。培养装置可以由与细胞培养物相容的任何材料制成，特别是非细胞毒性细胞培养试验材料。所述的实例是塑料材料，例如热塑性或硬质塑料材料。合适的塑料的实例是聚乙烯、聚丙烯、聚砜、聚碳酸酯、聚醚醚酮(PEEK)或聚四氟乙烯(PTFE)。特别是，所述装置适用于PBMC的培养和/或维持。本领域已知的和用于本发明的典型培养装置包括培养瓶、皿、板和多孔板。特别使用的是多孔板，其提供了以最低的材料要求(例如最低的培养基要求)，分别维持多个培养物的能力，例如，用于多种扰动(perturbation)。优选的培养装置包括96孔板、384孔板和1536孔板。如本领域已知的，关于培养物的成像分析，特别是荧光成像，特别优选使用特别设计用于成像的黑色壁板，其减少背景荧光/背景光学干扰，同时具有最小的光散射和减少的串扰。培养装置可以是无菌的。在一个最优选的实施方案中，使用多孔成像板，所述板包括多个孔，其中至少一些孔包括第一室，所述第一室由一个或多个第一侧壁和底壁形成；第二室，所述第二室由一个或多个第二侧壁形成并且包括用于引入液体的开口，其中所述第二室布置在所述第一室的顶部上；设置在第一室和第二室之间的中间底板，其形成干扰阻挡结构；其中，所述中间底板设置有至少一个通孔，其提供所述第一室与所述第二室之间的液体连接；其中，所述通孔被配置用于将移液管的尖端通过所述通孔从所述第二室插入所述第一室。
该装置尤其具有用于自动成像系统和分析的用途。因此，优选地，所述装置/培养装置适用于这样的系统。在非限制性实例中，培养装置可以是半透明的。用于成像，例如荧光成像的培养皿和培养板是本领域熟知的，并且是可商购的。用于本发明实践的可商购获得的培养板的非限制性实例是
Figure BDA0002476505890000151
384-孔、组织培养处理的黑盖、透明底板(Corning Inc.,Massachusetts,美国)或
Figure BDA0002476505890000152
384孔平底透明底黑色聚苯乙烯TC处理的微板(Product#3712)。另一个实例Perkin Elmer
Figure BDA0002476505890000153
如上所述，本发明方法的一个令人惊讶的技术优势是该方法确定/依赖于测试化合物对靶细胞的选择性，所述选择性在更接近地代表复杂细胞群内靶细胞的天然环境的环境中确定。也就是说，在本发明的方法中，优选维持天然存在的细胞-细胞相互作用。在这方面，技术人员知晓如何确定/评估/追踪/验证细胞-细胞相互作用的手段和方法。特别是，本领域技术人员可以区分天然存在的细胞-细胞相互作用和在制备细胞样品期间引入的相互作用。因此，技术人员理解，相同类型的细胞和/或不同类型的细胞在活生物体中相互作用。此外，本领域技术人员理解，包含在总细胞群体中的可区分的细胞亚组的细胞在活生物体中相互作用。在本发明中，优选地，细胞样品中包含的大多数细胞维持其天然发生的细胞-细胞相互作用。即，细胞样品中包含的大多数细胞，特别是至少50％的细胞，优选细胞样品中包含的60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的细胞与相同细胞或相同细胞类型的细胞或相同的可区分亚组的细胞相互作用，如体内那样。细胞-细胞相互作用可以使用本领域熟知的方法进行验证/评估/确定。例如，共聚焦显微镜可用于评估/确定/验证细胞-细胞相互作用是在天然环境中相互作用的细胞之间，还是在天然环境中不显示相互作用的细胞之间。这种非天然的细胞-细胞相互作用可能尤其是由于细胞聚集等原因。
此外，在本发明的方法中，优选大多数细胞处于生理相关状态，这意味着优选60％、70％、80％、90％、95％或100％的细胞处于生理相关状态。本发明方法中使用的上述处于生理相关状态的细胞百分比采用本领域熟知的方法确定/测定/评估。特别是，通过对细胞样品中包含的细胞进行定量来确定细胞样品是否包含以生理相关状态存在的细胞。这可以使用本领域熟知的方法来完成。特别是，定量可以通过与参考样品中的细胞相比较的图像分析来进行，例如在参考个体或多个参考个体(例如一个或多个健康供体)的外周血或骨髓中的细胞，其中细胞样品，特别是PBMC或骨髓细胞样品来自患病供体。细胞的定量是标准诊断工具。对于健康供体和患病供体，细胞样品(特别是PBMC和/或骨髓细胞)中包含的细胞亚群的阈值已被充分证明。因此，基于使用本发明的手段和方法评估的样品的差异，可以确定生理学相关性。例如，在Hallek等人(2008)Blood 111(12)中可以发现造血细胞中包含的细胞亚群的文献。因此，定量和进一步的手段和方法，例如使用显微镜确定细胞-细胞相互作用，使得可以确定细胞样品是否代表生理相关状态。
本发明人提供了允许分析包含细胞的样品的方法，所述细胞维持天然存在的细胞-细胞相互作用并且主要以生理相关状态存在。因此，在一个本发明的优选实施方案中，以单层的形式分析细胞。在这方面，本发明人已经发现，在以上公开的细胞密度孵育导致形成可成像的细胞单层，特别是PBMC或骨髓细胞。在将样品分成至少两部分(即步骤(b))之后和进一步分析之前形成单层。因此，本发明的方法还允许对细胞群、特别是PBMC群和/或骨髓群进行成像和/或显微镜分析。如本文所用的单层是指主要在成像装置的相同焦平面内发现的一层细胞，所述成像装置例如本领域已知或本文所述的显微镜或自动照相机。术语一层用于指该层内的细胞形成主要呈2维的培养物，即，所述培养物主要是一层单个细胞。即，在培养物内，发现大多数细胞不在其他细胞之上或其上方停留，并且不存在于聚集体(例如，由细胞的组组成，其通过包含停留在其他细胞之上或上方的细胞而在单细胞的层上方延伸)中。因此，本发明意义内的细胞单层、特别是PBMC单层，优选包括水平的细胞层、特别是PBMC细胞，其厚度为一个单一细胞高度、特别是PBMC高度。同样，本发明含义中的骨髓细胞单层优选包括具有一个单一骨髓细胞高度的厚度的骨髓细胞水平层。如本文所用，术语单层不排除在培养容器内可能发现细胞聚集体或多层构建体(即，具有高度大于一个细胞(特别是分别为PBMC细胞或一个骨髓细胞)的细胞培养物的区域)或无细胞的区域。反而，该术语用于指本发明的培养物的大部分其可成像或可视区(例如，通过显微镜方法)由一层细胞组成。这最容易由在细胞培养表面上提供一层细胞来实现。然而，如技术人员将理解的，其他形式的细胞样品也可用于本发明的方法中。
在使用非贴壁细胞的情况下，例如PBMC或骨髓细胞，已知这些细胞通常不与细胞培养表面形成强接触或不形成强的细胞间接触。因此，用于本发明的细胞单层，特别是用于本发明多个方面的PBMC单层并不被设想为必然等同于本领域所理解的贴壁细胞单层，即包含牢固附着、均匀铺展并覆盖大部分培养表面的细胞层。而是，在一些实施方案中，用于本发明的细胞单层、特别是PBMC单层可以包括高密度培养物，所述高密度培养物包括与一种或多种其他细胞直接接触但不一定附着于培养表面的大多数细胞，或者可以包括低密度培养物，其中细胞在单层内但不与培养物中的任何其他细胞(直接物理)接触。用于本发明某些方面的细胞单层也可以包括中等密度的培养物，具有细胞与一个或多个细胞接触的离散区域和细胞不与其他细胞接触的其他区域。
用于本发明方法的细胞、特别是PBMC、骨髓细胞或其他贴壁和非贴壁原代细胞可以从健康受试者(即不怀疑患有疾病或怀疑易患疾病)获得的样品中分离，或者可以从已知患有疾病或怀疑患有疾病的受试者获得的样品中分离。受试者的疾病状态的诊断可以通过本领域技术人员例如医师常规进行的标准方法进行。这些传统方法可以用本发明的方法补充或替代。例如，为了确定受试者是否患有或可能患有疾病，使用来自已知患有该疾病的受试者的样品确定疾病各自的特征性细胞-细胞相互作用模式。此外地或可选地，健康供体的细胞-细胞相互作用模式可用于确定很可能由相应疾病引起的差异。细胞相互作用模式在此是指根据本发明确定的一种或多种不同细胞类型或细胞群彼此相互作用的自然倾向(propensity)。
在孵育后，在(i)存在测试化合物的情况下孵育的所述至少一部分中和(ii)不存在测试化合物的情况下孵育的所述至少一部分中，确定表现出可区分的表型的至少两个亚群中的一个中的细胞数量，其是相对于表现出相同表型的总细胞群中的细胞数量而言的。技术人员知晓可用于计数特定表型的细胞的多种方法。在这方面，“表型”是指细胞的可观察到的特征或性状。表型是由生物体的遗传密码的表达、其基因型以及环境因素的影响和两者之间的相互作用而产生的。细胞的表型包括但不限于细胞整体或亚细胞部分二者的特定的细胞形态、大小，细胞成活力、蛋白质的表达、特定蛋白质在特定位置的定位、蛋白质的共定位、蛋白质的翻译后修饰，例如磷酸化、营养物摄取和消耗等。表型在性质上也是有功能的，因为特定性状仅在响应某些刺激时才表现出，所述刺激例如细胞因子、病原体或一些其他细胞外或细胞内刺激。
在本发明一个的优选实施方案中，步骤(d)中的可区分的表型是成活力，并且(i)如果在步骤(e)中确定的选择性＜1，则确定测试化合物选择性地减少步骤(d)所述的一个亚群的活细胞的数量，并且(ii)如果在步骤(e)中确定的选择性＞1，则确定测试化合物选择性地提高所述一个亚群的成活力和/或选择性地减少步骤(d)所述的一个亚群以外的一个或多个亚群的成活力。
随后，确定测试化合物诱导在前一步骤中作为亚群之一的一部分计数的细胞表型的选择性。在本发明中，这通过如紧邻的上文所述将(i)除以如紧邻的上文所述的(ii)来完成，其中如果(i)除以(ii)大于1，优选大于1.05、1.1、1.5、2、3，最优选大于5，则测试化合物选择性诱导(d)中提及的表型，且如果(i)除以(ii)小于1，优选小于0.95、0.9、0.7、0.5、0.3，最优选小于0.2，则测试化合物选择性抑制或减少(d)中提及的表型。
如所附实施例所示，所得到的测试化合物对靶细胞群的选择性，对在本方法实施过程中进行的不同测定中的总细胞数的变化更具备稳健性，需要测定的浓度点更少，并考虑了包含在总细胞群的不同细胞群的相互作用。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法，其中所述方法包括步骤(a)提供从受试者获得的样品，其包含在总群体细胞中的至少两个细胞亚群，其中至少一个亚群对应于癌细胞，并且至少一个亚群对应于非癌细胞；(b)将所述样品分成至少两部分；(c)在不存在测试化合物的情况下孵育步骤(b)中获得的至少一个部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育至少一个部分；(d)在(i)存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一个部分中以及(ii)不存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一个部分中，确定在对应于癌细胞的所述亚群中的至少一个中的活细胞的数量，其是相对于总细胞群中的活细胞的数量而言的；和(e)通过(i)除以(ii)确定受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应，其中如果得到的值小于1，优选小于0.95、0.9、0.8、0.6、0.4，最优选小于0.2，则受试者将响应于治疗或对该治疗有响应。
因此，本发明提供了用于诊断方法的方法，所述诊断方法用于确定受试者是否将响应于使用测试化合物、特别是治疗剂的治疗或对所述治疗有响应。如上所述，给定的测试化合物，特别是治疗剂，例如上文进一步列出的治疗剂之一，对于患有相同或相似疾病例如癌症的个体受试者可能表现出不同的治疗效果。因此，确定测试化合物，特别是治疗剂，单独对给定受试者的选择性是有利的。在本发明的上述方法中，测试化合物、特别是治疗剂的选择性可以以高度可靠的方式确定，与现有技术的方法相比，具有改进的可能性，与一种或多种供选测试化合物(特别是治疗剂)相比，确定为具有改进的选择性的测试化合物(特别是治疗剂)，将在体内环境中显示有利效果。
也就是说，使用本文提供的方法分析测试化合物对样品/图像内的细胞亚群的选择性可预测疾病状态对在供体中测试的疗法的响应；在这方面，本发明的方法提供了优于本领域现有方法的优点。
在一个实施方案中，将用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法重复用于至少两种测试化合物，并且如下确定受试者是否将响应于使用至少两种测试化合物的组合的治疗或对所述治疗有响应：从1.0中减去在(e)中获得的所述至少两种测试化合物中的每一种的值，并对所述至少两种测试化合物的各结果值求和，其中如果所得和大于-1，优选大于-0.5、0、0.5，最优选大于1，则确定受试者响应于对使用所述至少两种测试化合物的组合的治疗或对所述治疗有响应。
在本发明的一个实施方案中，本发明方法中使用的测试化合物可以包含多于一种化学物质。即，在一个实施方案中，本发明涉及本文公开的本发明的方法，其中测试化合物包含一种或多种化学物质。在本发明方法中使用的测试化合物中存在一种以上化学物质可以提供关于例如该至少两种化学物质之间的协同效应的有用信息。也就是说，化学物质可能在它们对给定靶细胞的选择性方面彼此影响。因此为了可靠地确定所述选择性和/或为了在本发明的方法中使用所确定的选择性，使用包含多于一种化学物质的测试化合物是有利的。
在本发明的另一个实施方案中，将在本发明方法的步骤(b)中获得的至少一个部分进一步分成至少两个部分，其中将所述至少两个部分中的每一个与不同浓度的测试化合物一起孵育。确定不同浓度的测试化合物的选择性和/或确定患有癌症的受试者是否将响应使用不同浓度的测试化合物的治疗或对所述治疗响应，可以提供进一步改善的结果，因为体内有效浓度可以根据施用的测试化合物的剂量和时间安排而变化。即，为了考虑与测试化合物浓度相关的潜在影响，在本发明的一个实施方案中，可以将测试化合物与本发明方法的步骤(b)中获得的至少两部分以不同浓度孵育。本领域技术人员知晓在本领域已知的方法中使用的典型浓度以确定测试化合物的选择性。也就是说，浓度通常为100μM至100pM，优选浓度为10μM至1μM的，更优选浓度为10μM、1μM和100nM。
在本发明的一个优选的实施方案中，特别是在将测试化合物以不同浓度与在本发明方法的步骤(b)中获得的一个或多个部分一起孵育的本发明的方法中，可以在步骤(e)中计算平均选择性，并用于确定最终选择性。平均选择性可以提供更可靠的量度，其相对于通过本领域已知的方法确定的选择性有更进一步的改进。
类似地，在本发明的一个实施方案中，本发明的方法包括在步骤(c)中，在不存在测试化合物的情况下孵育至少两部分和/或在存在测试化合物的情况下孵育至少两部分，以及在步骤(d)中，在(i)存在测试化合物的情况下孵育的所述至少两部分中和/或(ii)在不存在测试化合物的情况下孵育的所述至少两部分中，确定相对于总细胞群中的细胞数而言的所述至少两个亚群之一中的平均细胞数。对多个测定进行平均减少了由于自然样品变化而可能在单个测定中发生的潜在的不期望的影响。也就是说，平均可以显著地减少所获得的结果的预期误差，并且因此导致本发明的方法的更可靠的结果。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中将步骤(b)中获得的至少一个部分进一步分成至少两个部分，其中在步骤(c)中将所述至少两个部分中的每一个与不同浓度的测试化合物一起孵育，并且其中对于测试化合物的每个浓度独立地重复步骤(d)和(e)以确定测试化合物的每个浓度下的值，由此在步骤(e)之后计算所有浓度的平均值并且将其用于确定最终值。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中在步骤(b)中，将样品分成至少三个部分，在步骤(c)中，在不存在测试化合物的情况下孵育至少两部分，和/或在存在测试化合物的情况下孵育至少两部分，由此将在存在测试化合物的情况下孵育的每个部分是在存在相同浓度的所述测试化合物的情况下孵育，并且其中在步骤(d)中，对于(i)在存在测试化合物的情况下独立孵育的每个部分和/或(ii)在不存在测试化合物的情况下独立孵育的每个部分，确定表现出可区分的表型的至少两个亚群之一中的细胞数量，其是相对于表现出相同的可区分的表型的总细胞群体中的细胞数量而言的，并且确定(i)中获得的相对数量的平均值和/或(ii)中获得的相对数量的平均值。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中在步骤(b)中，将样品分成至少三部分，并且在步骤(c)中，在不存在测试化合物的情况下孵育至少一部分，和/或在存在至少两种不同浓度的测试化合物的情况下孵育至少两部分，并且在步骤(d)中，对于(i)在存在测试化合物的情况下独立孵育的每一部分和/或(ii)在不存在测试化合物的情况下独立孵育的每一部分，确定表现出可区分表型的至少两个亚群之一中的细胞数量，其是相对于显示相同的可区分表型的总细胞群中的细胞数量而言的，其中独立地确定每个浓度的(i)的平均值和/或确定(ii)的平均值，并且用于进一步的步骤，且其中在步骤(e)中，通过将每一浓度的(i)的平均值除以(ii)的平均值来确定测试化合物的每一个浓度的选择性/值，且通过平均每一浓度的选择性/值获得最终的选择性/值。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中对至少两种测试化合物重复所述方法，并且选择具有步骤(e)中获得的最低值的测试化合物用于治疗患有癌症的受试者。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的方法，其中对至少三种测试化合物重复所述方法，并且选择具有最高值的至少三种测试化合物中至少两种的组合用于治疗患有癌症的受试者，所述最高值如下获得：从1.0减去所述组合中的至少两种测试化合物中的每一种的在(e)中获得的值，并对所述组合中的至少两种测试化合物的各结果值求和。
因此，本发明还涉及确定若干测试化合物中的哪一种最可能为癌症患者提供最佳临床益处的方法，由此对两种或多种测试化合物重复本发明的方法，并且具有在本发明方法的步骤(e)中确定的最低值的测试化合物将是最可能为癌症患者提供最大临床益处的最佳测试化合物。因此，本发明还涉及所得测试化合物在治疗癌症中的用途和测试化合物在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，用于确定测试化合物的两种或多种不同组合(各自包含两种或多种测试化合物)中的哪一种将最可能给癌症患者带来最大的临床益处，由此，对两种或多种测试化合物重复本发明的方法，所述测试化合物包括两种或多种各测试化合物的不同组合。具有最高所得总和的两种或更多种测试化合物的组合是将最有可能给予患有癌症的患者最高临床益处的测试化合物的组合，所述最高所得总和是通过从1.0中减去在(e)中获得的包括各组合的至少两种测试化合物中的每一种的选择性值、并对所述至少两种测试化合物的各结果值求和而获得的。因此，本发明还涉及测试化合物的组合用于治疗癌症的用途。
如上详述，本发明的方法可用于确定测试化合物对包含在总细胞群中的细胞的选择性，其中总细胞群包含至少两个可区分的细胞亚群。原则上，任何细胞群都可用于本发明的方法中。然而，优选使用PBMC或骨髓细胞。有多种与PBMC或骨髓细胞样品中包含的细胞相关的疾病，特别是增殖性疾病，诸如癌症。因此，在本发明的方法中，特别是在用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法中，所述癌症优选是与PBMC或骨髓细胞或来自PBMC或骨髓细胞的细胞相关的癌症。技术人员知晓属于该定义的癌疾病，即与PBMC或骨髓细胞或来自PBMC或骨髓细胞的细胞相关的癌症类型。然而，本发明的方法不限于癌症。也就是说，本发明的方法可用于确定受试者是否将响应于下列ICD-10编码(不限于此)的以下疾病的治疗或对所述治疗有响应：A00-B99-某些传染性和寄生虫病；C00-C97恶性肿瘤；D70-77-血液形成系统的其他疾病；D80-89-某些涉及免疫机制的疾病，未在别处分类；D82-与其他主要缺陷相关的免疫缺陷；D83-常见的变异型免疫缺陷；D84-其他免疫缺陷；G35-37-中枢神经系统的疾病；I00-I03-急性风湿热；I05-I09-慢性风湿性心脏病；I01-风湿热伴有心脏受累；I06-风湿性主动脉瓣疾病；I09-风湿性心肌炎；I70-动脉粥样硬化；K50-克罗恩病；K51-结肠炎；K52-其他非感染性胃肠炎和结肠炎；M00-M19-关节病变；M05-血清阳性类风湿性关节炎；M06-其他类风湿性关节炎；M10-痛风；M11-其他结晶性关节病变；M35-干燥综合征；M32-系统性红斑狼疮；N70-77-女性盆腔器官的炎性疾病；P35-39-对围产期特异的感染；P50-P61-胎儿和新生儿的出血性和血液学病症；Z22-传染病携带者；Z23-需要针对单一细菌性疾病的免疫；和/或Z24-需要针对某些单一病毒性疾病的免疫。
为了愈加更为可靠地确定测试化合物的选择性和/或确定受试者是否将响应于治疗或对所述治疗有响应，在一个更优选的实施方案中，本发明的方法利用如下样品，所述样品是含有至少1％癌细胞和/或至少1％非癌细胞的组织样品。更优选地，组织样品含有至少2％癌细胞和/或至少2％非癌细胞，甚至更优选至少5％癌细胞和/或至少5％非癌细胞。最优选地，组织样品含有至少10％癌细胞和/或至少10％非癌细胞。
如上文进一步公开的，在本发明的方法中，优选将样品、特别是组织样品培养为单层。在样品来自包含非贴壁细胞的PBMC或骨髓中所含细胞的情况下，优选将组织样品培养为非贴壁细胞单层。因此，本发明提供了在成像研究中使用生理学相关的多群体细胞样品，特别是原代造血样品以高通量方式测定以下各项的方法：1)测试化合物的作用，例如基于单细胞分析、在整体水平上，用于化疗/免疫疗法/免疫抑制疗法的测试化合物对离体细胞群体诊断标志物或其他标志物的作用，2)该技术基于患者样品中的离体测定用于提供关于哪种化疗将对哪个患者有益的预测的能力，3)该技术用于确定许多刺激或刺激物(例如药物)对免疫功能的作用的能力，和4)随时间整合许多患者数据集以确定治疗评估的模式。原则上，任何细胞样品都可用于本发明的方法中，例如来自血液、骨髓、胸腔积液、脾匀浆、淋巴组织匀浆、皮肤匀浆的单核细胞。然而，优选使用单核细胞。如技术人员所知，本发明方法中所用的单核细胞样品尤其包括PBMC和骨髓细胞以及其他细胞。因此，细胞样品，优选用于本发明方法的单核原代细胞单层，可以包括PBMC和/或骨髓细胞。即，虽然本文提供的方法是针对一般细胞或PBMC描述的，但技术人员理解，这些方法也是针对骨髓细胞或其他细胞提供的。因此，本文提供了使用骨髓细胞的方法，用于确定测试化合物对包含在骨髓样品中的细胞的选择性的方法，以及用于确定患有或易患疾病的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法，其包括使用骨髓细胞。
在这方面，骨髓是骨内部的柔性组织。在人类中，红细胞是由长骨骨骺中的骨髓核心在称为血细胞生成的过程中产生的。可进行骨髓移植以治疗严重的骨髓疾病，包括某些形式的癌症，例如白血病。另外，骨髓干细胞已经成功地转化为功能性神经细胞，并且还可以用于治疗诸如炎性肠病的疾病。因此，骨髓细胞代表了治疗各种疾病的有价值的目标，例如癌疾病或炎性疾病如炎性肠病。因此，本文提供的使用从供体获得的骨髓样品的方法对于评估/确定供体是否患有疾病或倾向于患有疾病是非常有用的。此外，本文提供的使用骨髓细胞的方法在高通量药物筛选等中提供了多种优点。
WO2016/046346中通过提供单层克服了需要贴壁细胞(巨噬细胞、HeLa等)形成可染色和可成像的单层的观念。在如其中所述的单层之前，研究组不能在原始患者样品中实施基于影像的单细胞筛选技术，用于高通量测定化疗诱导的分子(生物标记)变化、癌性母细胞成活力评估和细胞-细胞接触，特别是在疾病状态在非贴壁细胞中表现或反映的情况下，例如在基于血液的疾病或病症如淋巴瘤和白血病中。为了解决这个问题，WO2016/046346的发明人提供了手段和方法以及方法学和图像分析线路，在此称为“pharmacoscopy”，其允许在单个图像中显现贴壁和非贴壁细胞，与本领域已知的方法相比，通常每次扰动仅需要1/10th的材料，并使通量和速度最大化。pharmacoscopy可以提供通过已知方法(例如，流式细胞术)收集的相同信息，但提供额外的有利信息，例如亚细胞表型(蛋白质定位/共定位)的测定和细胞微环境/邻近关系。此外，WO2016/046346描述的方法需要更少的细胞，因此需要更少的患者材料、更少的液体体积，并且几乎无人为干预；因此，pharmacoscopy大大增加了可以平行测试的分子扰动的数量，并产生更详细的评估。此外，不需要从固有的健康群体中分选患病细胞，pharmacoscopy可以追踪药物介导的表型变化，同时平行地控制脱靶药物效应。这些重要的对照是通过将测试化合物对靶细胞(例如癌细胞)的作用与来自相同供体的存在于相同孔中和相同成像场中的总细胞(例如健康细胞)相关联来进行的。本发明的方法使用WO2016/046346的方法，但包括另外令人惊讶和出乎意料的优点。特别是，现在可以更可靠地确定测试化合物的选择性和/或确定患有疾病、特别是癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应。这通过考虑测试化合物对样品代表中包含的脱靶细胞、特别是单层的非特异性作用来实现。
使用本发明的方法，可以有效和快速地分析大量测试化合物，即确定它们的选择性，使用大量单层，所述单层可以来自从例如患者/受试者获得的单个样品，特别是PBMC样品或骨髓样品。通常，可以在由这种单个样品获得的多个单层中研究至少1000、至少4000、至少8000、至少12000、至少16000、至少20000、至少24000、至少50000、至少75000或高达90000个或更多测试化合物的效果。在某些实施方案中，本文提供的单层可以使用同时具有高含量数据的多个通道进行成像和分析。可用的数据通道的数量仅取决于具体的成像软件和可用的染色方法，其领域迅速发展。当前可用的方法允许同时对至少两个通道，更典型地，4、5或8个通道的高含量数据进行成像、处理和分析。
在本发明的方法中，优选单层形式的细胞可以根据本领域已知和/或本文所述的任何方法成像，并且本文提供的方法可以使用本领域已知的任何成像技术。具体的成像方法不是关键的，并且可以根据本领域技术人员的知识来决定。成像可能需要或不需要使用染料或染色剂，可包括染色和非染色组分的成像，和/或可包括在染色剂可见或不可见的条件下成像(例如，在明视场中成像(其中荧光染色剂将不可见)和在UV照射下成像(其中荧光染色剂可见)，或其组合。在明视场条件下成像是本领域众所周知的和常规的，并且可以根据标准方法和/或如本文所述进行。另外地或备选地，根据本发明可以使用任何其他无标记成像。这种无标记方法是已知的，包括例如PhaseFocus成像(Phase Focus Ltd,Sheffield，UK)。
在本发明的优选实施方案中，使用自动化显微镜测定活的癌细胞和非癌细胞的数量。在甚至更优选的实施方案中，活细胞的数量被确定为非片段化的核的数量。确定细胞核断裂的方法包括但不限于用DAPI或Hoechst系列核染料的染料染色细胞核，并在荧光显微镜下评估其形态。
本发明的实施还可包括向细胞中加入可检测标记，优选单层，特别是PBMC单层(与无标记方法有关或无关)，所述标记可使用显微镜方法检测，以便选择性标记特定表型(诸如成活力)的细胞和/或可区分亚群的细胞。可检测标记可以标记本领域已知的离散细胞结构、组分或蛋白质。标记也可以连接于抗体以特异性标记并允许检测抗体抗原。在一个优选的实施方案中，可检测标记允许在可见光或紫外光下使标记可视化。因此，可检测标记可以是荧光的。许多可视标签是本领域已知的，并且适用于本发明。标记可以在没有进一步作用的情况下是可检测的，或者可以仅在进行第二步骤之后变得可检测，例如加入底物、暴露于酶反应或暴露于特定光波长。
细胞亚群，即如本文所用的可区分的亚群，特别是PBMC亚群或骨髓细胞亚群，可以通过在靶细胞表面上或细胞内部表达一种或多种标志物，由可检测标记来鉴定。备选地或另外地，亚群可以通过在靶细胞表面上或靶细胞内部缺乏一种或多种标志物的表达来定义。可能需要测试一种或多种标志物(例如，两种标志物、三种标志物、四种标志物等)的表达或不表达，以进一步确保表达或不表达标志物的细胞实际上是靶细胞，例如，所期望细胞亚群的成员。例如，针对不同标志物的抗体的“混合物”可以各自偶联(无论是直接还是间接)至相同标记或至不同标记。作为实例，针对不同标志物的抗体混合物可以各自含有结合相同标记的结合基序(例如，各自可以含有被相同第二抗体识别的相同物种的Fc，或者各自可以是生物素化的，并被相同的抗生物素蛋白偶联标记特异性结合)。任选地，可以使用两种或更多种不同的抗体或抗体混合物。优选地，使用至少两种可彼此区分的标记对细胞进行染色，从而允许鉴定表达靶细胞类型的至少两种不同标志物的细胞。细胞还可以使用至少三种、四种、五种或更多种可以彼此区分的不同标记进行染色，从而允许检测表达靶细胞类型的更多数量的标志物的细胞。任选地，如果细胞表达预选数量的标志物或标志物的某些预选组合，则可以将其鉴定为靶类型的细胞，或者如果细胞不表达预选标志物，则可以将其鉴定为靶类型的细胞。另外，靶细胞类型的标志物不必对靶细胞是独特的，只要它们允许将靶细胞与群体中的其他细胞区分开来即可。在PBMC的情况下，PBMC细胞群的主要组分由树突细胞的CD11C、巨噬细胞的CD14、T细胞的CD3(CD4或CD8与CD3)和B细胞的CD19代表。虽然上述标志物在这些主要类别的PBMC亚组上重叠，但是用这些标志物染色来鉴定PBMC亚群在本领域中被广泛接受。适用于本发明方法的其他标记可在CD标记手册(Becton,Dickinson和Co.2010,CA,美国)中找到。包含在骨髓细胞中的主要细胞亚群是嗜中性晚幼粒细胞、中性中幼粒细胞、分叶核嗜中性粒细胞、正成红细胞和淋巴细胞。
在本发明的实践中优选使用与可检测标记缀合的抗体。这样的抗体允许靶向离散的细胞结构，并且因此，这样的抗体(各自携带不同的标记)的混合物可以用于同时可视化多个靶标/细胞结构/细胞组分。染色期间必须小心以避免单层破坏。如技术人员所理解的，这对于使用基于抗体的标记是特别成问题的，因为它们的使用通常需要一个或多个洗涤步骤以消除未结合的标志物，所述未结合的标志物将干扰准确的可视化，即，将导致非特异性染色和/或测定“噪音”。因此，本发明包括用可检测标记，特别是基于抗体的标记，对细胞单层进行染色的方法，其最小化或消除染色后的洗涤要求。本发明的方法可以包括在没有洗涤的情况下以避免产生噪声信号的浓度添加可检测标记，这可以通过本领域熟知的方法和/或本文所述的方法来确定。因此，本发明包括使用浓度高于或低于抗体制造商推荐浓度的标记抗体。
对于一些示例性细胞群，如果给定标志物在细胞内显示特征性定位或模式，则仅认为细胞对于该标志物是阳性的。例如，如果细胞骨架中存在细胞骨架标记，则细胞可被认为是“阳性的”，如果存在一些弥漫性细胞质染色，则可被认为是“阴性的”。在这种情况下，可以在合适的条件下培养细胞(例如，作为贴壁培养物)以在细胞内建立特征性定位或模式。本领域普通技术人员容易确定用于细胞骨架组装(或建立亚细胞组织的其他过程)的合适培养条件和时间，其对于给定标志物的稳健检测可能必需的。另外，可以容易地选择标志物，其减少或消除对作为稳健染色的前提条件的贴壁培养的需要。
用于标记蛋白质的染料是本领域已知的。通常，染料是可以提供光学可检测信号，例如比色、发光、生物发光、化学发光、磷光或荧光信号的分子、化合物或物质。在本发明的一个优选实施方案中，染料是荧光染料。染料的非限制性实例(其中一些是可商购的)包括CF染料(Biotium,Inc.)、Alexa Fluor染料(Invitrogen)、DyLight染料(Thermo Fisher)、Cy染料(GE Healthscience)、IRDyes(Li-Cor Biosciences,Inc.)和HiLyte染料(Anaspec,Inc.)。在一些实施方案中，染料的激发和/或发射波长在350nm至900nm之间，或在400nm至700nm之间，或在450-650nm之间。
例如，染色可以包括使用多种可检测的标记，例如抗体、自身抗体或患者血清。在可见光和紫外光下可以观察到染色剂。染色剂可包含直接或间接偶联到有色试剂的抗体或能够产生有色试剂的酶。当抗体用作染色剂的组分时，标志物可直接或间接偶联至抗体。间接偶联的实例包括抗生物素蛋白/生物素偶联、通过二抗偶联及其组合。例如，细胞可以用结合靶特异性抗原的第一抗体染色，并且结合第一抗体的第二抗体或与第一抗体偶联的分子可以与可检测标志物偶联。使用间接偶联可以提高信噪比，例如通过减少背景结合和/或提供信号放大。
染色剂还可以包括直接或间接偶联(如上所述)到荧光标记的第一或第二抗体。所述荧光标记可以选自:Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、AlexaFluor 750和Alexa Fluor 790、异硫氰酸荧光素(FITC)、德克萨斯红、SYBR Green、DyLightFluors、绿色荧光蛋白(GFP)、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)、德克萨斯红染料、苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二酸、甲酚固紫、cresyl blueviolet、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛配基、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、TET(6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素)、HEX(6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素)、Joe(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、Tamra(四甲基罗丹明)、6-羧基罗丹明、Rox(羧基-X-罗丹明)、R6G(罗丹明6G)、酞菁、偶氮甲碱、花青(例如Cy3、Cy3.5、Cy5)、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、N,N-二乙基-4-(5'-偶氮苯并三唑基)-苯胺、氨吖啶和量子点。
本发明方法的其他示例性实施方案利用直接或间接偶联到荧光分子的抗体，如溴化乙锭、SYBR Green、异硫氰酸荧光素(FITC)、DyLight Fluors、绿色荧光蛋白(GFP)、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)、德克萨斯红染料、苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二酸、甲酚固紫、cresyl blue violet、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、地高辛配基、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、TET(6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素)、HEX(6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素)、Joe(6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素)5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、Tamra(四甲基罗丹明)、6-羧基罗丹明、Rox(羧基-X-罗丹明)、R6G(罗丹明6G)、酞菁、偶氮甲碱、花青(例如Cy3、Cy3.5、Cy5)、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、N,N-二乙基-4-(5'-偶氮苯并三唑基)-苯胺和氨吖啶。其他示例性荧光分子包括量子点，其描述于专利文献[参见，例如，U.S.Pat.Nos.6,207,299,6,322,901,6,576,291,6,649,138(表面改性方法，其中混合的疏水/亲水聚合物转移剂结合到量子点的表面)、U.S.Pat.Nos.6,682,596,6,815,064(用于合金化或混合壳)，其各自通过引用结合到本文中)]，和技术文献[诸如“Alternative Routestoward High Quality CdSe Nanocrystals,”(Qu等人,Nano Lett.,1(6):333-337(2001)]中。具有各种表面化学和荧光特性的量子点可从Invitrogen Corporation,Eugene,Oreg.,Evident Technologies(Troy,N.Y.)和Quantum Dot Corporation(Hayward,Calif.)等商购获得。量子点"还包括合金化的量子点，如ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN。合金量子点及其制备方法公开于例如US Application Publication No.2005/0012182和PCT公开WO 2005/001889中。
在标记本发明方法中使用的细胞之后(优选以单层的形式)，该方法可以进一步包括检测可检测标记的信号。根据可检测标志物发射的信号的种类，可以适当地调整检测方法。优选使用适于检测荧光发射标记的检测方法。检测方法也可以根据本领域已知的标准方法自动化。例如，存在各种计算方法，其使得本领域技术人员能够分析和解释细胞的显微图像或建立用于其分析的自动化方案。对于初级图像分析，包括显微镜图像中照明偏差的校正、从显微镜图像中识别单个细胞和测定标志物强度和纹理以及核和细胞大小和形状和位置参数，可以使用OpenSource软件CellProfiler(例如2.1.1版)。标志物阳性细胞(如CD34+祖细胞或成活力染料阳性细胞)的鉴定可以通过使用OpenSource软件CellProfilerAnalyst(例如2.0版)的机器学习来进行，且双阳性或三阳性细胞可以通过顺序门控策略来鉴定。用于进一步分析和命中选择的板概览(Plate-overviews)也可以使用CellProfilerAnalyst来创建。
Bioconductor(例如2.14版)中的cellHTS包或Pipeline Pilot(例如9.0版；Accelrys)均可用于初级图像分析之后的数据分析，包括平板效应归一化、基于对照的归一化和命中选择。
商业自动显微镜系统也可用于本发明的实践，例如PerkinElmer Operetta自动显微镜(PerkinElmer Technologies GmbH&Co.KG,Walluf,德国)，该系统可包括相应的图像分析软件，例如PerkinElmer的Harmony软件(例如3.1.1版)。根据本发明的方法，这种自动和/或商业系统可用于从显微图像中进行初级图像分析、阳性细胞选择和命中选择。
在该初级分析之后，进行本发明的方法以确定测试化合物对包含在含有至少两个可区分的细胞亚群的样品中的具有特定表型的细胞群的选择性，或者确定患有疾病、特别是癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应，其中所述方法包括基于其诱导上述表型、特别是细胞成活力的能力来确定测试化合物的选择性。
基于用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用本发明的测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法的结果，可以做出治疗决定，即，可以选择确定在受试者是否将响应用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应方面具有最有利结果的测试化合物来治疗受试者。
当在本发明的方法中计算数量的“平均值”或“平均数”时，应理解，这可以指算术平均值、几何平均值和/或相关统计测定，其目的在于基于与随机误差相关联的重复测定来估计变量的真实值。本领域技术人员还应当理解，在一些情况下，使用中位值而不是平均值可能是有利的(例如，在存在异常值但基础的随机变量是正态分布的情况下)。在一个优选的实施方案中，每当本发明的方法涉及“平均值”或“平均数”时，使用算术平均值。
当测试化合物包含多于一种化学物质时，测试化合物的浓度是指不同浓度的化学物质的特定组合，并且不同浓度的测试化合物是指包含具有不同浓度的测试化合物的至少一种化学物质。包含多于一种具有特定浓度的化学物质的测试化合物是指包含测试化合物的所有化学物质具有特定但不必相同的浓度。
“治疗”或“处理”指治疗性处置和预防性或防止性措施，其中目的是预防、改善或减缓(减轻)目标病理状况或病症，或与其相关的一种或多种症状。类似地，“有响应”或“响应”和类似术语是指目标病理状况或与其相关的一种或多种症状被预防、改善或减轻的指征。本文还使用这些术语表示延迟患有疾病(尤其是骨髓增生性疾病)或已经完成这些标记的适应症的患者的发作，抑制所述疾病或适应证(例如减少或阻止疾病或适应证的发展)、减轻所述疾病或适应证的影响，或延长所述疾病或适应证患者的寿命。需要治疗的患者包括诊断为患有疾病的患者、怀疑患有疾病的患者、倾向于患有疾病的患者以及要预防疾病的患者。因此，本文待治疗的哺乳动物可能已经被诊断为患有病症或者可能倾向或易患病症。
“响应”或“有响应”是指在治疗后显示至少一种改变的特征的受试者。受试者的改变的特征可以是目标病理状况或病症的改善或减缓。
如本文所用，术语“预防”或“防止”是指通过在受试者中施用预防剂或治疗剂防止癌症疾病的一种或多种症状的发生和/或复发或发作。
本文提供的手段和方法主要是针对原代造血细胞或所有单核细胞而描述的。如技术人员所理解的，原代造血细胞尤其包括PBMC和骨髓细胞。因此，本文提供的用于PBMC的手段和方法也是针对骨髓细胞以及任何其他单核细胞而公开的。
本发明方法中使用的测试化合物可以是治疗中使用的治疗剂/批准用于治疗疾病(特别是癌症)的治疗剂。在这方面，本发明含义内的“测试化合物”是分子，其包括但不限于多肽、肽、糖蛋白、核酸、合成和天然药物、拟肽、多烯、大环类、糖苷、萜烯、萜类化合物、脂族和芳族化合物及其衍生物。在一个优选的实施方案中，测试化合物是化学化合物，例如合成的和天然的药物。在另一个优选的实施方案中，测试化合物实现疾病、病症、病理学和/或与其相关的症状的改善和/或治愈。聚合物可以包封一种或多种用于本发明方法的测试化合物。
如紧邻的上文详述的，测试化合物也可选自已知的治疗剂。在这方面，合适的治疗剂包括但不限于Goodman和Oilman在The Pharmacological Basis of Therapeutics(例如，第9版)或The Merck Index(例如，第12版)中所呈现的那些。治疗剂的属包括但不限于影响炎症反应的药物、影响体液组成的药物、影响电解质代谢的药物、化疗剂(例如，用于过度增殖性疾病，特别是癌症，用于寄生虫感染，和用于微生物疾病)、抗肿瘤剂、免疫抑制剂、影响血液和血液形成器官的药物、激素和激素拮抗剂、维生素和营养素、疫苗、寡核苷酸和基因疗法。应当理解，本发明还包括组合物，其包括组合，例如两种或更多种活性剂(如两种药物)的混合物或共混物。
在一个实施方案中，治疗剂可以是药物或前药、抗体或疫苗。本发明的方法可用于评估向患者施用治疗剂是否引发对治疗剂或与治疗剂一起施用的递送媒介物、赋形剂、载体等的组分的响应。
治疗剂的确切性质不限制本发明。在非限制性实施方案中，本发明的方法可用于评估对任选地与赋形剂、载体或递送媒介物组合的合成小分子、天然存在的物质、天然存在的或合成产生的生物试剂或前述两种或更多种的任意组合的响应。
可以使用本领域熟知的方法来确定/评估/验证待分析样品中、特别是单层中包含的细胞的成活力。即，技术人员非常清楚如何确定/评估/验证细胞状态(stadium)的方法，例如细胞是否是有活力的、活的、死的或正在经历改变其状态的过程，例如在细胞凋亡或坏死中死亡。因此，特异性识别/标记特定状态中的细胞的已知标志物/染料可用于本发明的方法中。其包括对具有非完整膜的细胞具有选择性的染料/标记或对晚期细胞死亡或早期细胞凋亡具有选择性的染料/标记。例如，可以使用可固定的活/死绿(ThermoFisher,catalogue number L-23101)、针对细胞色素C的抗体，通过使用染料确定DNA更新或细胞增殖。如何确定/评估/验证本发明所用细胞样品中包含的细胞(特别是单层形式)的成活力的其他手段和方法是技术人员已知的。
可以使用本领域熟知的方法进行细胞样品(特别是单层，特别是PBMC单层或骨髓细胞单层)中包含的两种或更多种可区分的亚群的成活力和/或细胞-细胞相互作用的变化的测定/追踪/评估/验证。例如，使用显微镜，可以通过光学感知来确定/跟踪/评估/验证变化。然而，对于高通量应用，优选使用自动化方法，其确定/追踪/评估/验证单层中包含的各个亚群的成活力和/或细胞-细胞相互作用的变化。这种方法包括鉴定包含在细胞样品中的亚群，优选单层，例如通过可检测标记来鉴定。然后可以确定标记/检测的亚群是否显示细胞-细胞相互作用，其中细胞-细胞相互作用可以包括经由质膜的直接接触(如上所述)或间接接触。因此，引入标记细胞之间的距离参数，即上面定义的阈值，其决定相互作用的总数，即在标记细胞之间观察到多少细胞-细胞相互作用。在该方法中，一个可区分亚组的标记细胞可与第二可区分亚组的一个或多个细胞相互作用，对每个相互作用进行计数。将得到的数量与随机分布函数(即随机细胞-细胞相互作用)所预期的数量进行比较。然后，可以使用本发明的方法计算相互作用倾向，即相互作用得分，其确定相互作用是随机的还是定向的。按照这样的方案，在将一种或多种测试物质加入本发明的细胞样品之前和之后，允许测定/追踪/评估/验证由于所述一种或多种测试化合物引起的细胞-细胞相互作用的变化。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但仍将合适的方法和材料描述如下。如果有冲突，以本说明书，包括定义为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
除非另有说明，本文所述的一般方法和技术可根据本领域熟知的常规方法和如在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的方法来进行。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel等人,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)和Harlow和LaneAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1990)。
尽管在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明的各方面，但是这样的图示和描述将被认为是说明性或示例性的而非限制性的。但是应当理解，本领域的普通技术人员可以在所附权利要求的范围和精神内进行改变和修改。特别是，本发明覆盖具有来自上文和下文描述的不同实施方案的特征的任何组合的进一步实施方案。
本发明还覆盖了图中单独示出的所有其他特征，尽管它们可能未在之前或之后的描述中描述。此外，可以从本发明的其他方面的主题中放弃附图和说明书中描述的实施方案的单个替代方案及其特征的单个替代方案。
此外，在权利要求中，词语“包括”或“包含”不排除其他要素或步骤，并且单数形式的术语不排除多个。单个单元可以实现权利要求中所述的若干特征的功能。与属性或值有关的术语“基本上”、“约”、“近似”等特别地也确切地定义了属性或确切地定义值。权利要求中的任何引用标记不应被解释为限制范围。
专利或申请文件包含至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要的费用后由官方提供。
本发明还通过以下附图在一些方面进行说明。
图1：A.两条假设的剂量响应曲线，其显示癌A细胞和非癌B细胞的成活力，其作为细胞毒性测试化合物的药物浓度的函数。B.显示作为测试化合物浓度的函数的总细胞成活力和活的总细胞中活A细胞分数。这里，当总细胞成活力在起始值的5％以下时，活A细胞的分数被设定为0.8(即，在零测试化合物浓度时的分数)，这是由于以下事实：对少量细胞进行定量是与大的误差相关的。按照该方法，当按照本发明方法的步骤进行时，1的选择性将被可靠地归属为具有强的总细胞毒性的测试化合物。
图2:A.如本发明所述确定的细胞毒性测试化合物杀死癌细胞的选择性/值，其为在三个浓度点测定的测试化合物对癌A细胞和非癌B细胞的log EC50的差的函数(参见图1B)。B.如本发明所述确定的选择性/值，其为在400个浓度点测定的测试化合物对癌细胞和非癌细胞的log EC50的差的函数。使用本发明，在三个浓度点的测定已经足以获得选择性信息。然而，浓度点越多，选择性/值越精确地反映log EC50的差。
图3:使用本发明对各柔红霉素浓度确定的柔红霉素杀死AML母细胞(定义为CD34+、CD117+或CD34+/CD117+)的选择性/值，其显示为柔红霉素浓度的函数。在不同柔红霉素浓度下，对含有柔红霉素的疗法响应的患者比对基于柔红霉素的3+5+7诱导疗法无响应的患者具有使用本发明测定的更低的选择性/值。
图4：上图：根据本发明确定的、用于由柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷三种药物组成的“3+5+7”诱导疗法的响应者和无响应者的、在AML患者骨髓样品中柔红霉素+阿糖胞苷+依托泊苷组合杀死癌细胞(此处定义为表达CD34或CD117的细胞)的选择性/值。0.92的截止值允许将患者分类为响应者和非响应者，总分类准确度为0.85。中图：相对于在零药物浓度的癌细胞数量的、对所有药物浓度和组合取平均的癌细胞的数量。该度量仅允许以0.65的总分类准确度将患者分类为响应者和非响应者。下图：类似于中图，但是基于总细胞数。使用这个度量不可能进行准确的分类。
图5：当基于根据本发明确定的柔红霉素杀死AML母细胞的选择性和使用实施例4中描述的方法进行下游数据处理来预测AML患者对含有柔红霉素的3+5+7诱导疗法的响应时，接受者工作曲线下的面积最高(AUROC＝0.97)。这表明，与例如基于癌细胞的数量的响应预测(AUROC＝0.91)相比，根据本发明确定杀伤选择性/值是有利的。AML母细胞在此如图2中所定义。
图6：左：用2种或更多种FDA批准的药物的组合治疗血液学癌症患者。对于每个患者，组合选择性计算为1减去根据本发明确定的给予患者的药物的单个选择性之后的总和。组合选择性是相对于响应(PD＝进行性疾病，SD＝稳定的疾病，PR＝部分缓解，CR＝完全缓解)的图，并与响应相关。基于整合选择性，患者可以分为响应者(CR和PR)和非响应者(PD和SD)，其具有92％的准确度和0.84的AUROC。
图7:根据本发明确定的FDA批准的药物杀死患弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的CD20+细胞相对于CD20-细胞的选择性/值。患者对依鲁替尼的治疗有响应。
图8:根据本发明确定的FDA批准的药物杀死患B细胞淋巴母细胞性淋巴瘤患者的CD20+细胞相对于CD20-细胞的选择性/值。患者对硼替佐米和6-巯嘌呤的组合的治疗有响应。
图9:根据本发明确定的FDA批准的药物杀死患弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的CD79a+细胞相对于CD79a-细胞的选择性/值。患者对硼替佐米、克拉屈滨和地塞米松的组合治疗有响应。
图10:计算用不同浓度[X](log EC50对于A＝-2和log EC50对于B＝3，任意浓度标度)的化合物X处理后群体A和群体B的细胞成活力。因此，作为总活细胞(群体A+B)的分数的群体A活细胞数量被测定为A活/(A活+B活)。将对数剂量响应曲线拟合到由作为浓度[X]的函数A活/(A活+B活)所得到的S形曲线(黑线)，log EC50确定为拐点。log EC50A和logEC50B都不对应于从曲线拟合获得的log EC50(即黑线S形曲线的log EC50)，表明不能通过将对数曲线拟合至A活/(A活+B活)获得细胞成活力EC50A或EC50B。
实施例
实施例1
提供了模拟由细胞群A和B组成的细胞混合物对细胞毒性药物X的响应的合成数据。X以EC50A的log EC50(例如，图1A中的2.5)影响A，以log EC50B(例如，图1B中的3)影响B，为任意浓度标度。基于这些参数，假定标准4参数logistic(即S形)剂量-反应曲线，可以计算A和B细胞混合物中活细胞的数量和每种类型细胞的总数。在[X]＝0的浓度，假定10,000个细胞的总数量，比率A:B＝0.8:0.2。模拟了在总数仅为3个药物浓度下X杀死A相对于杀死B的选择性的确定。
使用本发明计算药物选择性。特别是，对于每个测定的药物浓度，计算活A细胞的数量和活B细胞的数量。根据本发明方法的步骤(d)，确定(i)在X以三种不同浓度存在时，显示可区分的表型(此处为成活力)的至少两个亚群之一(此处为A)中的活细胞数，其是相对于显示相同表型的总细胞群(此处为活A+活B)中的细胞数而言，其为Rx＝Ax/(Ax+Bx)，其中Ax和Bx表示三种不同浓度[X]的活A和B细胞数，和(ii)对于浓度[X]＝0，给出R0＝A0/(A0+B0)。然后，确定在[X]的每个浓度下作为Sx＝Rx/R0的选择性，并对所有Sx求平均值，以得到最终选择性S最终＝(S1+S2+S3)/3。
当使用本发明确定不同的成对的EC50A和EC50B的药物选择性时，令人惊奇地，它与X对A的log EC50和X对B的log EC50之差成线性比例(图2)。
实施例2
使用Ficoll密度梯度离心从新诊断为急性髓样白血病(AML)的未治疗的患者的20个骨髓样品中提取单核细胞。在采集骨髓样品后，所有20名患者按照“3+5+7”方案用柔红霉素、依托泊苷和阿糖胞苷进行治疗，其中10名患者有响应，10名患者无响应。
将单核细胞混悬在RPMI+10％FCS+青霉素/链霉素中，并以每孔50μL培养基中20,000个细胞的浓度接种到Perkin Elmer Cell Carrier 384孔细胞培养板中，其中所述孔预先装载不同浓度的阿糖胞苷、柔红霉素和依托泊苷的组合。所有可能的药物和浓度组合均在平板上表示，阿糖胞苷的服用浓度为0、1、3、10和20μM，柔红霉素的服用浓度为0、0.1、1、3和10μM，依托泊苷的服用浓度为0、1、3、10和20μM，从而得到3维药物滴定矩阵。根据WO2016/046346，使细胞形成单层，并将单层孵育18小时，通过加入含0.5％Tritox114的15μL 4％甲醛的PBS溶液固定，轻弹并用DAPI以及荧光标记的抗体染色以标记CD34和CD117阳性细胞。孵育1小时后，使用Opera Phenix自动共聚焦显微镜(Perkin Elmer)拍摄每个孔的图像。
标志物阳性细胞被认为是癌细胞，而标志物阴性细胞被认为是非癌细胞。通过使用CellProfiler计算图像分析仪软件计数完整的DAPI染色的细胞核来定量活细胞的总数，而片段化的细胞核因为死亡或濒死被丢弃。类似地，将活癌细胞的数量确定为具有完整DAPI染色细胞核的抗体染色细胞。
根据本发明，通过相对于对照孔(无药物，仅DMSO)中活的总细胞中活的癌细胞的分数，取活的总细胞中活的癌细胞的分数(对于仅有不同浓度的柔红霉素(图3))，来确定每种药物杀死癌群体的选择性。令人惊讶的是，这种措施单独可以区分响应者和非响应者。
为了考虑所有药物的贡献，根据本发明，通过相对于对照孔(无药物，仅DMSO)中的活的总细胞中活的癌细胞的分数，取在每种药物组合和浓度时活的总细胞中活的癌细胞的分数，并对药物的所有浓度和组合求平均值，来确定每种药物杀死癌细胞群体的选择性。使用0.92的截止值，可以将对药物组合有临床反应的患者与没有反应的患者区分开来(图4，上图)，总分类准确度为0.85。
实施例3
类似于实施例2，如果仅基于癌细胞(这里：CD34或CD117阳性细胞)的敏感性或总细胞群体的敏感性确定药物响应，则获得0.65或更小的分类准确度(图4，分别是中图和下图)。
实施例4
类似于实施例2和3，该实施例阐述了根据本发明确定的选择性如何可以用于下游分析以获得药物响应评分，该评分允许将患者愈加更为准确地分类为响应者和非响应者。对于每个患者样品和不同浓度的药物组合，根据本发明计算选择性，并在每个浓度点对响应者和非响应者取平均值。所得到的数据点贯穿四维剂量响应空间中的剂量响应表面，给响应者一个表面并给非响应者一个表面。通过确定剂量-响应空间中的每个点处的截止点来确定最佳地分隔两个剂量响应表面的表面，其允许在该特定药物剂量组合下对响应者和非响应者的最佳分类。通过将1分配给剂量响应空间中的每个点，即在分离的表面的响应者侧，并将-1分配给相对侧，来计算每个患者的响应评分。将在浓度空间中的每个点的、用总分类准确度加权的这些指标求和，得到最终的药物响应评分。例如，该反应评分使得可以将接受3+5+7诱导治疗的AML患者以超过90％的总分类准确率(图5)和0.97的受试者工作曲线下面积(AUROC)分成响应者和非响应者，而将相同模型基于用仅在零药物浓度下的癌细胞数量归一化的癌细胞数量时，得到仅0.91的AUROC，并且在将其基于细胞数时得到0.86的AUROC。
实施例5
将骨髓穿刺液、外周血、胸腔积液、腹水或由通常在PBMC或骨髓中发现的细胞组成的切除的淋巴结样品通过Ficoll梯度(骨髓、外周血、胸腔积液、腹水)(GE Healthcare)纯化，或匀浆并过滤(淋巴组织)，重悬于RPMI+10％FCS和青霉素/链霉素中。根据WO2016/046346，将所得的PBMC中常见的单核细胞的单细胞混悬液以每孔50μL培养基中20,000个细胞的浓度接种于384孔Perkin Elmer细胞载体成像板中，以形成非贴壁单层。板预先装载了在50nL DMSO中的140种不同的临床使用的抗癌药物或50nL DMSO作为对照，使得每种药物在加入50μL培养基和细胞后以每种药物和浓度至少3个技术重复的方式以1或10μM的终浓度存在，且DMSO浓度为0.1％v/v。
将单层培养过夜(18小时)。用于研究的活检物都是新鲜获得的，没有冷冻保存。如之前在Vladimer等人Nat Chem Biol 2017中所述进行免疫荧光染色、通过自动显微镜(Opera Phenix,Perkin Elmer)成像、图像分析(CellProfiler)和数据分析(Matlab)。用于鉴定靶癌细胞群的抗体是基于临床病理学报告和抗体反应性评估选择的，包括来自eBiosciences的CD3(HIT3a)、CD19(HIB19)、CD20(2H7)、CD79a(HM47)、CD34(4H11)、CD117(104ED2),和CD138(DL-101)。未染色的细胞被认为是非癌细胞。
根据本发明，对于每种药物和浓度，通过相对于对照孔(无药物，仅DMSO)中活的总细胞中活的癌细胞的平均分数，取活的总细胞中活的癌细胞的平均分数，来确定药物杀死癌细胞相对于非癌细胞的选择性。确定每种药物在两个浓度上的平均分数的这些商(quotient)。
与使用没有考虑根据本发明确定的值而选择的药物或使用根据本发明确定的值/选择性＞1的药物治疗的患者相比，用根据本发明确定的值/选择性＜1的药物治疗的患者具有更高的响应机会(即，实现完全或部分缓解)。
此外，当将药物的组合给予患者时，1减去给予患者的药物的各自值的总和越高(图6)，患者响应的机会越高。
实施例6
患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的69岁男性在先前的七系治疗后复发。样品的淋巴瘤细胞对测试的104种药物中的大多数都具有抗性，如根据本发明确定的相对于非癌细胞杀伤癌细胞的药物选择性＞1所示，而仅六种化合物显示显著的离体在靶(on-target)效应(图7)。顺铂和奥沙利铂在给定患者的历史、年龄和合并症的情况下被认为是不可行的，然而BTK抑制剂依鲁替尼显示出第二强的离体功效(根据本发明的值/选择性＝0.61，P<0.00048；图7)。在依鲁替尼治疗的第49天进行的PET-CT证实了患者完全缓解。
实施例7
一位51岁的患有前体B细胞淋巴母细胞淋巴瘤(B-LBL)的女性接受了三系在先治疗，并且疾病在用双特异性CD3-CD19抗体博纳吐单抗(blinatumomab)免疫治疗后是进行性的。从该女性胸腔积液中分离包含PBMC中常见细胞的细胞混合物。使用本发明确定了266种化合物选择性杀死包含在细胞混合物中的癌细胞相对于非癌细胞的能力。其揭示了蛋白酶体抑制剂硼替佐米能够选择性杀死癌症癌细胞(根据本发明确定的选择性＝0.50，P<0.001；图8)和硫代嘌呤6-巯基嘌呤，6-MP(根据本发明确定的值/选择性＝0.58，P<0.001；图8)。将6-MP和硼替佐米与抗CD20奥滨尤妥珠单抗组合。28天后，PET-CT证实了有部分响应。
实施例8
将患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者切除的淋巴结解离成单细胞，从而得到包含通常在PBMC中发现的细胞的复杂细胞混合物。在根据本发明确定266种化合物选择性杀死包含细胞混合物中癌细胞相对于非癌细胞的能力。患者对单一最强的离体作用药物硼替佐米(选择性＝0.59，P<0.0001；)与克拉屈滨(选择性＝0.73；P<0.0003)和地塞米松(值/选择性＝0.87；P<0.05；图9)的组合实现了完全缓解(图9)。
实施例9
该实施例描述了权利要求(1)和随后的特别是权利要求(1)和(2)的权利要求中描述的方法的实际应用。提供了一种血液癌症患者的包含40,000个细胞的组织样品。20,000个细胞是癌细胞，并且对于细胞表面标志物CD19染色阳性。剩余的细胞对其他细胞表面标志物染色阳性，包括CD3、4、8、11c、14、56等。将样品分成两部分，每部分20,000个细胞。第一个样品在RPMI+10％FCS中、在DMSO中的10μM硼替佐米(0.1％DMSO终浓度)存在下孵育，而第二个样品在RPMI+10％FCS+0.1％DMSO中孵育。在24小时孵育后，确定每个样品中每个细胞的成活力，其中此处的成活力是权利要求1和从属权利要求的步骤(d)中提及的“可区分的表型”。在硼替佐米处理的样品中，发现5,000个活细胞对CD19染色，并且发现10,000个活细胞对CD19染色呈阴性。在DMSO处理的样品中，发现分别有10,000个活细胞对CD19染色阳性和对CD19染色阴性。根据本发明，计算硼替佐米降低CD19阳性细胞的细胞成活力的选择性。
在步骤(d)之后，在(i)作为测试化合物的硼替佐米存在下孵育的至少一部分(此处是：5,000/15,000＝0.33)和(ii)在不存在测试化合物的情况下孵育的至少一部分(此处是：10,000/20,000＝0.5)中，计算在显示可区分的表型(此处是：成活力)的至少两个亚群之一(此处是：CD19阳性细胞)中的细胞数量，其是相对于在显示相同表型(即，成活力)的总细胞群(CD19阳性+CD19阴性细胞)中的细胞数量而言的。
在步骤(e)之后，通过将(i)(此处是：0.33)除以(ii)(此处是：0.50)来确定测试化合物(此处是：硼替佐米)在步骤(d)中提及的一个亚群(此处是：CD19阳性细胞)相对于所有其他亚群诱导(d)中提及的表型的选择性。由于0.33/0.50＝0.66，即小于1，所以测试化合物(此处是：硼替佐米)在步骤(d)中明确提及的一个群体(此处是：CD19阳性细胞)中选择性抑制步骤(d)的表型(此处是：成活力)。因此，根据本发明，我们可以得出结论：在给定的实施例中硼替佐米选择性地降低CD19阳性细胞的成活力。
实施例10
该实施例描述了本发明方法的进一步实际应用。提供了一种血液癌症患者的组织样品，其包含60,000个细胞。30,000个细胞是癌细胞，并且对细胞表面标志物CD79a染色阳性。剩余的细胞对其他细胞表面标志物染色阳性，包括CD3、4、8、11c、14、56等。使用适当标记的抗体作为染色试剂。将样品分成40,000个细胞和20,000个细胞的两部分。将40,000个细胞的第一部分进一步分成20,000个细胞的两个部分，在这里各表示为[1a]和[1b]。将部分[1a]和[1b]分别在RPMI+10％FCS中、在DMSO中的10μM和1μM硼替佐米(0.1％DMSO终浓度)存在下孵育，而将第二样品在RPMI+10％FCS+0.1％DMSO中孵育。为了清楚起见，这里仅选择CD79a作为假定的示例，并且可以用任何其他表面标志物来代替它。
在孵育24小时后，确定每个样品中每个细胞的成活力，其中成活力在此是如本发明中所用的“可区分的表型”。在硼替佐米处理的样品[1a]中，发现5,000个活细胞对CD79a染色，并且发现10,000个活细胞对CD79a染色阴性。在硼替佐米处理的样品[1b]中，发现8,000个活细胞对CD79a染色，并且发现10,000个活细胞对CD79a染色阴性。在DMSO处理的样品中，发现分别有10,000个活细胞对CD79a染色阳性和对CD79a染色阴性。根据本发明的方法计算硼替佐米降低CD79a阳性细胞的成活力的选择性。
对于部分[1a]和[1b]，在(i)作为测试化合物的相应浓度的硼替佐米存在下孵育的至少一部分中(此处是：对于[1a]，5,000/15,000＝0.33；对于[1b]，8,000/18,000＝0.44)和(ii)在不存在测试化合物的情况下孵育的至少一部分中(此处是：10,000/20,000＝0.5)，计算在显示可区分的表型(此处是：成活力)至少两个的亚群之一(此处是：CD79a阳性细胞)中的细胞数量，其是相对于显示相同表型(即，成活力)的总细胞群(CD79a阳性+CD79a阴性细胞)中的细胞数量而言的。
在步骤(e)之后，通过将(i)(此处是：对于[1a]为0.33，而对于[1b]为0.44)除以(ii)(此处是：0.50)来确定测试化合物(此处:硼替佐米)在步骤(d)中提及的一个亚群(此处是：CD79a阳性细胞)相对于所有其他亚群诱导(d)中提及的表型的选择性，并且将平均选择性计算为最终值/选择性，为(0.33/0.50+0.44/0.50)/2＝0.77。由于0.77小于1，因此测试化合物(此处为硼替佐米)在步骤(d)中明确提及的一个群体(此处为CD79阳性细胞)中选择性抑制步骤(d)的表型(此处为成活力)。因此，根据本发明，可以得出结论，在给定的实施例中硼替佐米选择性地降低CD79a阳性细胞的成活力。
样品来源的患者将对硼替佐米治疗有响应。为了清楚起见，这里仅选择CD79a作为假定的示例，并且可以用任何其他表面标志物来代替它。而且，为了说明的目的，仅任意选择了细胞数量。
实施例11
提供了一种血液癌症患者的组织样品，其包含60,000个细胞。30,000个细胞是癌细胞，并且对细胞表面标志物CD20染色阳性。剩余的细胞对其他细胞表面标志物染色阳性，包括CD3、4、8、11c、14、56等。使用适当标记的抗体作为染色试剂。将样品分成三部分，每部分20,000个细胞。将两部分各20,000个细胞分别在RPMI+10％FCS中、在DMSO中的10μM硼替佐米(DMSO终浓度为0.1％)存在下孵育，而将第三部分在RPMI+10％FCS+0.1％DMSO中孵育。请注意，为了清楚起见，这里CD20a仅被选作假定的示例，并且可以用任何其他表面标志物来代替它。
在24小时孵育后，确定每个样品中每个细胞的成活力，其中成活力在此是“可区分的表型”。在用10μM硼替佐米处理的两个样品中，分别发现5,000个活细胞对CD20a染色，并且发现10,000个活细胞对CD20a染色呈阴性。在DMSO处理的样品中，发现分别有10,000个活细胞对CD20染色阳性和CD20染色阴性。确定硼替佐米降低CD79a阳性细胞的成活力的选择性。
对于在10μM硼替佐米存在下孵育的两个部分，(i)在硼替佐米存在下孵育的各部分中，独立计算在显示可区分的表型(此处是：成活力)的至少两个亚群之一(此处是：CD20阳性细胞)中的细胞数量(即5,000/15,000＝0.33和5,000/15,000＝0.33)，其是相对于显示相同表型(即成活力)的总细胞群(CD20阳性+CD20阴性细胞)中的细胞数，和(ii)对于在不存在测试化合物的情况下孵育的各部分独立进行测定(此处是：10,000/20,000＝0.5)。然后形成(i)和(ii)的平均值，对于(i)得出0.33，对于(ii)得出0.5，并用于进一步的步骤，即，在步骤(e)中，通过用(i)的平均值除以(ii)的平均值来确定值/选择性，得到0.33/0.5＝0.66为最终值/选择性。
实施例12
本实施例说明，从拟合至表现出某表型的细胞占表现出相同表现的全部细胞的分数的剂量响应曲线不能获得准确的EC50值，所述全部细胞表现出相同表型。假定一种A型和B型细胞的混合物，比率A:B＝0.2:0.8。用细胞毒性化合物X处理该细胞混合物。化合物X杀死A细胞的能力定量为log EC50是3，化合物X杀死B细胞的能力定量为log EC50是-2，为任意浓度标度。计算活细胞总数(即活A+活B)中活A细胞数的分数，得到图10所示的S形曲线。可以清楚地看出，该曲线(实线)的拐点既不是X对A的作用也不是X对B的作用的剂量响应曲线的EC50的信息。
实施例13
本实施例说明，当将A和B细胞的细胞混合物引入微量滴定板以确定测试化合物X杀死A细胞相对于杀死B细胞的选择性时，总细胞数的10％标准偏差的影响。当使用测量作为浓度[X]的函数的A和B细胞的总数的经典方法来确定选择性，以拟合S形剂量响应曲线并测量X对A和B的EC50时，每个测量点将具有10％的标准偏差。使用本发明，总细胞数10％的变化对活细胞总数中活A细胞的分数没有影响。因此，本发明使得可以确定选择性，其对于细胞接种到测定板中的变化或操作期间细胞的损失更具有稳健性。

Claims (15)

1.用于确定测试化合物的选择性的方法，所述方法包括以下步骤:
(a)提供样品，其包含在总细胞群中的至少两个可区分的细胞亚群；
(b)将所述样品分成至少两部分；
(c)在不存在测试化合物的情况下孵育步骤(b)中获得的至少一个部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育步骤(b)中获得的至少一个部分；
(d)在
(i)存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一个部分中以及
(ii)不存在所述测试化合物的情况下孵育的所述至少一个部分中，
确定表现出可区分的表型的所述至少两个亚群中的一个中的细胞数量，其是相对于表现出相同表型的细胞的总群体中的细胞数量而言的；
(e)通过(i)除以(ii)确定测试化合物在步骤(d)中提及的一个亚群中诱导(d)中提及的表型相对于所有其他表型的选择性，其中如果(i)除以(ii)大于1，优选大于1.05、1.1、1.5、2、3，最优选大于5，则测试化合物选择性诱导(d)中提及的表型，并且如果(i)除以(ii)小于1，优选小于0.95、0.9、0.7、0.5、0.3，最优选小于0.2，则测试化合物选择性抑制或减少(d)中提及的表型。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)中的可区分的表型是成活力，且其中
(i)如果在步骤(e)中确定的选择性＜1，则确定测试化合物选择性地减少步骤(d)所述的一个亚群的活细胞的数量，并且
(ii)如果在步骤(e)中确定的选择性＞1，则确定测试化合物选择性地提高所述一个亚群的成活力和/或选择性地减少步骤(d)所述的一个亚群以外的一个或多个亚群的成活力。
3.用于确定患有癌症的受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应的方法，所述方法包括以下步骤:
(a)提供来自受试者的样品，所述样品包含在总群体细胞中的至少两个细胞亚群，其中至少一个亚群对应于癌细胞，并且至少一个亚群对应于非癌细胞；
(b)将所述样品分成至少两部分；
(c)在不存在测试化合物的情况下孵育(b)中获得的至少一个部分，并且在存在测试化合物的情况下孵育至少一个部分；
(d)在(i)所述测试化合物的存在下孵育的所述至少一部分中以及(ii)在所述测试化合物的不存在下孵育的所述至少一部分中，确定在对应于癌细胞的所述亚群中的至少一个中的活细胞的数量，其是相对于所述总细胞群中的活细胞的数量而言的；和
(e)通过(i)除以(ii)确定受试者是否将响应于使用测试化合物的治疗或对所述治疗有响应，其中如果得到的值小于1，优选小于0.95、0.9、0.8、0.6、0.4，最优选小于0.2，则受试者将响应于治疗或对治疗有响应。
4.权利要求3的方法，其中对至少两种测试化合物重复所述方法，并且通过从1.0中减去在(e)中获得的所述至少两种测试化合物中每一种的值，并对所述至少两种测试化合物的各结果值求和，来确定所述受试者是否将响应于所述至少两种测试化合物的组合的治疗或对所述治疗有响应，其中如果所述结果和大于-1，优选大于-0.5，0，0.5，最优选大于1，则确定受试者对使用所述至少两种测试化合物的组合的治疗有响应或对所述治疗有响应。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述测试化合物包括一种或多种化学物质。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中将步骤(b)中获得的至少一个部分进一步分成至少两个部分，其中在步骤(c)中将所述至少两个部分中的每一个与不同浓度的所述测试化合物一起孵育，且其中对于所述测试化合物的每个浓度独立地重复步骤(d)和(e)，以确定所述测试化合物的每个浓度下的选择性/值，由此在步骤(e)之后计算所有浓度下的平均选择性/值，并且将其用于确定最终选择性/值。
7.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中在步骤(b)中，将所述样品分成至少三个部分，并且在步骤(c)中，在不存在测试化合物的情况下孵育至少两个部分和/或在存在测试化合物的情况下孵育至少两个部分，由此在存在所述测试化合物的情况下孵育的每个部分是在存在相同浓度的所述测试化合物的情况下孵育，并且其中在步骤(d)中，对于(i)在存在测试化合物的情况下独立孵育的每个部分和/或(ii)在不存在测试化合物的情况下独立孵育的每个部分，确定表现出可区分的表型的至少两个亚群之一中的细胞数量，其是相对于表现出相同的可区分的表型的总细胞群体中的细胞数量而言的，
使用(i)中获得的相对数量的平均值和/或(ii)中获得的相对数量的平均值。
8.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中在步骤(b)中，将样品分成至少三个部分，并且在步骤(c)中，在不存在测试化合物的情况下孵育至少一部分，和/或在存在至少两种不同浓度的测试化合物的情况下孵育至少两部分，并且在步骤(d)中，对于(i)在存在测试化合物的情况下独立孵育的每一部分和/或(ii)在不存在测试化合物的情况下独立孵育的每一部分，确定表现出可区分表型的至少两个亚群之一中的细胞数量，其是相对于显示相同的可区分表型的总细胞群中的细胞数量而言的，
其中独立地确定每个浓度的(i)的平均值和/或确定(ii)的平均值，并且用于进一步的步骤，且其中在步骤(e)中，通过将每一浓度的(i)的平均值除以(ii)的平均值来确定测试化合物的每一个浓度的选择性/值，且通过平均每一浓度的选择性/值获得最终的选择性/值。
9.根据权利要求3或5-8中任一项的方法，其中对至少两种测试化合物重复所述方法，并且选择具有步骤(e)中获得的最低值的测试化合物用于治疗患有癌症的受试者。
10.根据权利要求4至8中任一项的方法，其中对至少三种测试化合物重复所述方法，并且选择具有最高值的至少三种测试化合物中至少两种的组合用于治疗患有癌症的受试者，所述最高值如下获得：从1.0减去所述组合中的至少两种测试化合物中的每一种的在(e)中获得的值，并对所述组合中的至少两种测试化合物的各结果值求和。
11.根据权利要求3至10的方法，其中所述癌症是与PBMC或骨髓细胞或来自PBMC或骨髓细胞的细胞相关的癌症。
12.根据权利要求1至11中任一项的方法，其中所述样品是含有至少1％癌细胞和/或至少1％非癌细胞的组织样品。
13.根据权利要求1至12的方法，其中所述组织样品被培养为非贴壁细胞单层。
14.根据权利要求13的方法，其中使用自动化显微镜测定活的癌细胞和非癌细胞的数量。
15.根据权利要求14的方法，其中活细胞的数量被确定为非片段化的核的数量。
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