JP5851984B2 - 血液学的腫瘍に対するエクスビボでの個別化医療試験を提供する方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、２００９年５月１９日に出願された米国仮特許出願番号６１／１７９６８５の優先権を主張し、それは、引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。
本発明の背景
本発明は、癌患者からの検体を用いて、複数の薬剤および薬剤併用に対する細胞毒性薬剤感受性プロファイルを決定するためのスクリーニングプラットフォームの使用に関する。非常に多くの薬剤と薬剤併用からでも、その迅速なデータ収集、分析および結果の報告により個別化医療試験として有用である、自動化したサンプル調製とフローサイトメトリーによる自動化した評価の両方を組み込んだ細胞ベースのスクリーニングプラットフォームが、本明細書に記述される。また、増殖性リンパ性疾患の治療に有用な薬剤の特定の併用も開示される。
関連技術の説明
癌患者から採取したエクスビボのサンプルでの腫瘍細胞の細胞毒性薬剤感受性プロファイルを評価するために利用できる多くの方法がある。血液学的腫瘍の細胞死を検出するためのエクスビボのアッセイは、過去４０年間に開発されてきており、化学療法感受性を識別するための多くのアッセイ法をもたらした。個別化腫瘍応答試験（ＩＴＲＴ）は、これらの方法が「癌患者から新たに摘出された生きた全腫瘍細胞に対する制癌治療効果」を説明するために最近提案された（Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇ．Ｊ．Ｋａｓｐｅｒｓ，Ｂ．Ｃｏｉｆｆｉｅｒ，Ｍ．Ｃ．Ｈｅｉｎｒｉｃｈ ａｎｄ Ｅ．Ｈ．Ｅｓｔｅｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００８，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：２３−４４）。腫瘍細胞の増殖を遅らせるか、あるいは阻止する薬剤の能力を研究するために設計された初期ＩＴＲＴ（例えば、クローン原性アッセイ）は、うまく機能しなかった。しかし、１９８０年代に、アッセイの結果と臨床成績（すなわち、臨床相関関係）間の良好な類似性を一貫して示している、細胞死についての多くのＩＴＲＴが開発された。
良好な臨床相関関係があっても、細胞死についての現在利用可能なＩＴＲＴは、個別化医療試験としてのそれらの利用が制限される望ましくない限定を受ける。例えば、クローン原性アッセイは、結果を生成するのに何日間よりもむしろ何週間を一般的に必要とし、それらの臨床的有用性を制限することになる（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９７７，１９７：４６１−４６３；Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９８３，５５：４２７−４３７；Ｓｅｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８３，３０８：１２９−１３４）。また、大多数のＩＴＲＴは、サンプルをエクスビボで薬剤とインキュベーションする効果を評価するために全細胞死を測定する。全細胞死を測定することは、腫瘍細胞対正常細胞に対する薬剤の効果を区別するＩＴＲＴの能力を制限する。現在、利用可能な複数のＩＴＲＴは、主にアッセイの最後での生細胞や生きた腫瘍細胞の割合を決定するために使用される方法に関して相互に異なる。
一部のＩＴＲＴは、細胞を直接に測定するけれども、大部分は代理マーカーを使用して間接的に細胞死を評価する。例えば、ＭＴＴ（メチル−チアゾリルテトラゾリウム）アッセイは、分光光度計を使用して定量することができる色の変化を引き起こす、ＭＴＴのホルマザンへのミトコンドリア還元を測定することにより生細胞数を推定する（Ｐｉｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９０，７６：２３２７−２３３６；Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８９，６０：２０６−２１０；Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８７，４７：９３６−９４２）。他のＩＴＲＴは、フルオレセインジアセテート加水分解（例えば、蛍光ミクロカルチャー細胞毒性アッセイ（ＦＭＣＡ））または細胞生存率の間接的なマーカーとして細胞ＡＴＰレベルを使用する（Ｒｈｅｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ １９９３，１７：２７１−２７６；Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９２，５０：１７７−１８５）。ＤｉＳＣ（分染染色細胞毒性）アッセイと、最近ではＴＲＡＣ（抗腫瘍化合物に対する腫瘍の応答）アッセイは、顕微鏡で生腫瘍細胞を判別する染色方法を使用している（Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２００９，１４６：３８４−３９５；Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ １９９６，２０：１４３−１５３；Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８３，４３：７４９−７５７）。
上記ＩＴＲＴは、患者の腫瘍細胞を細胞毒性薬剤と少なくとも４〜５日間、インキュベーションする必要がある。しかし、血液細胞は、人体外ではわずか２４〜４８時間後に重要な特性を失い始める。短いインキュベーション期間は、患者の治療の開始前にエクスビボでの細胞毒性プロファイルの評価を可能とし、それによってそれらの臨床的有用性を高め、個別化医療試験としてのより効果的な適用を可能にする。
細胞毒性薬剤は、アポトーシスを誘導することによって悪性細胞を除去することが示された（Ａｒａｇａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９８，１４０：１７１−１８２；Ｈａｎｎｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９７，８９：１８４５−１８５３）。アポトーシスは、一種の細胞死であり、当該分野では、一般的に「プログラムされた細胞死」として呼ばれ、それを、当該分野では、形態学的特徴および抗原性の特徴に応じて定義する。アポトーシスは、薬剤が標的細胞と接触する数時間以内に一般的に開始される（Ｄｅｌ Ｂｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆ １９９９，３２：２５−３７）。アポトーシスのプロセスの異なる態様を反映するマーカーに基づくアポトーシスに関する多くのアッセイ法がある：例えば、１）ＤｉＯＣ６またはＪＣ−１を使用するミトコンドリアの潜在的な膜の変化（Ｔａｂｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２，１６：１１５４−１１５９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２，１６：２２３−２３２）；２）アクリジンオレンジによる電気泳動または標識化を用いる末端デオキシヌクレオチジル転移酵素（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２，１６：２２３−２３２）でのＴｄｔによって同定されるヌクレオソーム間のＤＮＡの断片化（Ｔａｂｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２，１６（６）：１１５４−９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０００，３２：１９７−２０３；Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２，１２８：２７１−２７８；Ｏｆｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２００２，９：６３６−６４２）；または３）特異抗体を用いるポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）またはカスパーゼ−３のいずれかのタンパク質分解断片の同定（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００２，１２８（５）：２７１−８；Ｏｆｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２００２，９（６）：６３６−４２；Ｂｙｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００２，９９：１０３８−１０４３；Ｈａｓｅｎｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００４，２３：４５２３−４５３５；Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３，２２：９１０７−９１２０）。
アポトーシスの別のアッセイは、蛍光マーカー（すなわち、蛍光色素）に結合したアネキシンＶのフローサイトメトリーによる検出に基づいている。アネキシンＶは、アポトーシスを起こしている細胞の表面膜に現れるのみの外部化ホスファチジルセリン残基に結合する（Ｔａｂｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００２，１６（６）：１１５４−９；Ｎｉｍｍａｎａｐａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２，６２：５７６１−５７６９）。アポトーシスの測定は、フローサイトメトリーによって検出されるアネキシンＶ−蛍光複合体と結合する細胞の割合に応じて評価することができる。さらに、腫瘍細胞（正常細胞と比較して）の識別に使用されるいくつかのモノクローナル抗体の併用は、当該技術分野で知られている。表１は、蛍光色素と結合したとき、様々な分光学的検出法を用いて血液学的腫瘍細胞を識別するために使用できた様々なモノクローナル抗体の併用を要約する。
Figure 0005851984
 ＡＬＬ＝急性リンパ性白血病；ＣＬＬ＝慢性リンパ性白血病；ＮＨＬ＝非ホジキンリンパ腫；ＭＭ＝多発性骨髄腫；ＡＭＬ＝急性骨髄芽球性白血病
いくつかのＩＴＲＴ、特にＤｉＳＣとＴＲＡＣアッセイは、腫瘍細胞と正常細胞における細胞毒性の同時測定を可能にし、治療指数の決定を可能にする（Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．１９９６；２０：１４３−５３；Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ ２００４；４：１４５−５４）。
研究者らは、いくつかの科学的総説でＩＴＲＴの予測能力を示している。血液悪性腫瘍における１９２９の臨床相関関係の総説（Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｋａｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），２００８）および他の総説（例えば、Ｋａｓｐｅｒｓ ＧＪ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ２００５；１１０：４９−５７）は、特に薬剤耐性に関して陽性的中率の高割合を示している。複数の論文（表２）からの結果を統合して、Ｎａｇｏｕｒｎｅｙは、薬剤感受性に関して陽性的中率が８１．８％であり、薬剤耐性に対する陰性的中率が８３．３％であることを見つけた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒａｔｉｏｎａｌｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／ｃｏｎｔｅｎｔ１．ａｓｐｘ？ｒｉｄ＝３５とその中の書誌的文献（２０１０年５月７日訪問）から翻案された）。
Figure 0005851984
 Ｎ＝症例数；ＴＰ＝真陽性；ＴＮ＝真陰性；ＦＰ＝偽陽性；ＦＮ＝偽陰性；Ｒｅｆ．＝文献目録（明細書末尾の参考文献を参照）；ＡＬＬ＝急性リンパ性白血病；ＣＬＬ＝慢性リンパ球性白血病；ＡＭＬ＝急性骨髄芽球性白血病；ＮＨＬ＝非ホジキンリンパ腫
前向き無作為化比較対照臨床試験は、慢性リンパ性白血病の患者を多数使用して、現在、英国で実施されている（ＵＫ ＬＲＦ ＣＬＬ４ ｔｒｉａｌ， Ｃａｔｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００７，３７０：２３０−３９）。研究は、治療に対する患者の応答に関連する成果の要因としてＩＴＲＴの評価を伴っている（Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ｅｔ ａｌ：ＡＳＨ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｂｌｏｏｄ，２００６ １０８：９４ａ：Ａｂｓｔｒａｃｔ ３０３）。試験は１９９９年に開始され、以前に未治療のＣＬＬ患者７７７人を含んだ。患者は、クロラムブシル（Ｃｈｌ）またはフルダラビン＋／−シクロホスファミド（ＦｌｕまたはＦｌｕＣｙ）で治療された。この研究では、ＴＲＡＣアッセイが、患者の治療前に薬剤に対するエクスビボでの感受性を評価するために使用された。分析のために、患者はそれらのＩＴＲＴ結果に応じて３つのグループに分けられた：薬剤耐性（ＤＲ）、薬剤感受性（ＤＳ）、または中程度の耐性、感受性（ＤＩ）。その結果を表３にまとめる。
Figure 0005851984
 ＩＴＲＴ結果（ＤＳ、ＤＩ、およびＤＲ）と慢性リンパ性白血病患者での同じ薬
剤への応答の相関関係
結果は、各薬剤（ＣｈｌおよびＦｌｕ）および薬剤併用（ＦＩｕＣｙ）に対する患者の応答％（括弧内は患者数）で表わされる。
表３に示すように、ＩＴＲＴの結果は、患者の臨床応答とよく相関する。ＤＳであった４９％の患者のうち、それらのほとんど（９０％）は、化学療法の治療に反応したが、その一方、ＤＲであった９．５％の患者のうち、わずか３１％が化学療法に反応した。Ｃｈｌに対してＤＲであった２４人の患者のうち、７１％がＦｌｕに対してＤＳまたはＤＩであり、すべてがＦＩｕＣｙの併用に対してＤＳまたはＤＩのどちらかを示した。Ｆｌｕに対してＤＲである１４人の患者のうち、３６％のみが、ＦＩｕＣｙの併用に対してＤＳまたはＤＩであった。これらの結果は、ＩＴＲＴ結果を使用することにより、より良い臨床結果をもたらす、より有効な治療を誘導できたことを示唆している。
個別化医療試験の途方もなく大きい治療的な可能性があれば、より短いインキュベーション時間を用いてＩＴＲＴを開発することに関して、当該技術分野では緊急の必要性が存在する。治療選択枝を援助するそのようなアッセイ法の使用は、癌に罹患した患者の応答率、無増悪生存期間、および全生存期間を潜在的に増加させることができた。好ましくは、アッセイは、個々の腫瘍細胞死の評価を可能にし、短時間での細胞毒性プロファイルを達成するアッセイのインキュベーション時間を短縮するためのフローサイトメトリーを使用する。また、単独または併用して、有効であり得る多数の薬剤および薬剤濃度に関する、より広範な情報を提供するＩＴＲＴが望ましい。
以下の引用文献は、それらの全体が引用により本明細書に組み込まれる。
Ｌｅｏｎｅら， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ １９９１， ９：４９１−５０３． Ｂｏｓａｎｑｕｅｔら， Ｌａｎｃｅｔ １９９１， ３３７： ７１１−７１６． Ｈｏｎｇｏら， Ｃａｎｃｅｒ １９９０； ６５： １２６３−１２７２． Ｈｏｎｇｏら， ｅｄｓ． Ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ， ＰＡ： Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９３， ３１９． Ｋａｓｐｅｒｓら， ｅｄｓ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｃｈｕｒ： Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９３， ３２１−３２８． Ｌａｒｓｓｏｎら， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９２， ５０：１７７−１８５． Ｌａｔｈａｎら， Ｈａｅｍａｔｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓ １９９０， ３３：２９５−２９８． Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌら， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｐ １９８６， ７０：１２８３−１２９５． Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８３， ４３：７４９−７５７． Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃら， Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ １９９０， １４：４５９−４６６． Ｌａｎｇｋｅｒ ＳＴら， ｅｄｓ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｃｈｕｒ： Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９３， ２７９−２９１． Ｓｔａｉｂ Ｐら． Ａｄｖ Ｅｘｐｅｒ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９９， ４５７：４３７−４４４． Ｓａｎｔｉｎｉ Ｖ，ら， ｅｄｓ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｃｈｕｒ： Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９３， ３６５−３６８． Ｓａｒｇｅｎｔ ＪＭら，． Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９８９， ６０：２０６−２１０． Ｓｔｕｔｅ Ｎら， Ａｄｖ Ｅｘｐｅｒ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ １９９９， ４５７：４４５−４５２． Ｌａｒｓｓｏｎら， ｅｄｓ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｃｈｕｒ： Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９３：３９９−４０７． Ｂｅｋｓａｃ Ｍら， Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ Ｔｕｍｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９８８， ５： ２５３−２５７． Ｓａｎｔｉｎｉ Ｖら， Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １９８９， ７：２８７−９３． Ｔｉｄｅｆｅｌｔ Ｕら， Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９８９， ４３：３７４−３８４． Ｂｏｓａｎｑｕｅｔら， Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １９９９， １０６： ４７４−４７６． Ｓｉｌｂｅｒら， Ｂｌｏｏｄ １９９４，８４：３４４０−３４４６． Ｂｏｓａｎｑｕｅｔ ＡＧ．， ｅｄｓ． Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ． Ｃｈｕｒ： Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９３， ３７３−３８３． Ｓｅｖｉｎら， Ｇｙｎｅｃ Ｏｎｃｏｌ １９８８， ３１：１９１−２０４．
発明の要約
本発明は、患者のための個別化医療試験の開発に関係する。
一般的な実施形態では、本発明は、エクスビボアッセイを用いて薬剤に対する細胞の応答を分析するための組成物、方法、およびシステムに向けられる。全血サンプルを分析し、多数の変数を操作し、そして迅速に分析を完了する方法が、本明細書に記述される。
ひとつの実施形態では、薬剤に対する細胞の応答性を分析する方法であって、患者から採取された血液学的腫瘍から組織サンプルを得ること、少なくとも３５のアリコートに組織サンプルを分割すること、薬剤組成物をそれぞれ有する少なくとも３５のアリコートを併用すること、および少なくとも３５のアリコートのそれぞれにおける少なくとも１つの細胞集団のアポトーシスを測定することを含む方法が提供される。ひとつの実施形態では、血液学的腫瘍からの前記組織は、末梢血、骨髄、リンパ節、および脾臓からなる群から選択される組織である。別の実施形態では、前記サンプルは、凍結または凍結保存されたサンプルであり、前記凍結または凍結保存されたサンプルが、少なくとも３５のアリコートにサンプルを分割する前に解凍される。さらなる実施形態では、前記測定は、前記アリコートを薬剤組成物と併用する７２時間以内に完了する。さらなる実施形態では、前記測定は、前記アリコートを薬剤組成物と併用する約４８時間以内に完了する。さらなる実施形態では、前記測定は、前記アリコートを薬剤組成物と併用する約２４時間以内に完了する。さらなる実施形態では、前記測定は、フローサイトメーターを使用して実行される。さらなる実施形態では、特有の薬剤組成物を有するアリコートの数は、少なくとも約９６である。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも２つは、異なる濃度での同じ薬剤を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも１つは、複数の薬剤を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも１つは、非細胞毒性の複数の薬剤を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも１つは、患者に既に投与されている薬剤と同じであるか、または同じ治療カテゴリーにある非細胞毒性薬剤を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも１つは、非細胞毒性薬剤と細胞毒性薬剤を併用する。さらなる実施形態では、前記アポトーシスは、特定の細胞集団のために選択的に測定される。さらなる実施形態では、前記アポトーシスは、血液学的腫瘍を示す細胞集団のために測定される。さらなる実施形態では、前記血液学的腫瘍は、慢性リンパ性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非Ｍ３急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病Ｍ３、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病からなる群から選択される。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも１つは、フルダラビンまたはクロラムブシルのセルトラリン、パロキセチン、またはフルオキセチンとの併用を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物の少なくとも１つは、フルダラビンおよびシクロホスファミドを含む。さらなる実施形態では、前記方法は、血液学的腫瘍の組織サンプルからの細胞をマウスに注入すること；注入細胞を十分な時間マウス中で増殖させること；および、増殖した細胞をマウスから取り出し、ここで、前記注入、増殖、および取り出しが、アリコートを薬剤組成物と併用する前に行われることをさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は、測定ステップの結果をまとめたレポートを作成することをさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は、患者の医療に関わる当事者に前記レポートを提供することをさらに含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物は、５−アザシチジン、アレムツズマブ、アミノプテリン、アモナフィド、アムサクリン、ＣＡＴ−８０１５、ベバシズマブ、ＡＲＲ Ｙ５２０、三酸化ヒ素、ＡＳ１４１３、Ａｔｒａ、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ１１５２、バノキサントロン、ベヘノイルアラ−Ｃ、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＥＰ−７０１、クロラムブシル、クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、ＣＰＸ−３５１、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、脱グリコシル化−リシン−Ａ鎖−結合抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２イムノトキシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エラシタラビン、エンチノスタット、エプラツズマブ、エルウィナーゼ、エトポシド、エベロリムス、メシル酸エキサテカン、フラボピリドール、フルダラビン、ホロデシン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、ホモハリングトニン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンα２ａ、ヨウ素Ｉ１３１モノクローナル抗体ＢＣ８、イホスファミド、イソトレチノイン、ラロムスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドミド、レスタウルチニブ、マホスファミド、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾン、ミドスタウリン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、オブリメルセン、パクリタキセル、パノビノスタット、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピラルビシン、ＰＫＣ４１２、プレドニゾロン、プレドニゾン、ＰＳＣ−８３３、ラパマイシン、リツキシマブ、リバビリン、サパシタビン、ジナシクリブ、ソラフェニブ、ソラフェニブ、ＳＴＡ−９０９０、タクロリムス、タネスピマイシン、テムシロリムス、テニポシド、テラメプロコル、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チピファルニブ、トポテカン、トレオスルファン、トロキサシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボレロキシン、ボリノスタット、エトポシド、ゾスキダルからなる群から選択される化合物を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物は、酸化アルミニウム水和物、ロラゼパム、アミカシン、メロペネム、セフェピム、バンコマイシン、テイコプラニン、オンダンセトロン、デキサメタゾン、アムホテリシンＢ（リポソーム製剤）、カスポフギン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、Ｇ−ＣＳＦ、ラニチジン、ラスブリカーゼ、パラセタモール、メタミゾール、塩化モルヒネ、オメプラゾール、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリンからなる群から選択される化合物を含む。
別の実施形態では、薬剤への腫瘍細胞の応答性を解析する方法であって、患者から採取された血液学的腫瘍の組織サンプルを得ること；前記組織サンプルを少なくとも３５のアリコートに分割すること；少なくとも３５のアリコートを薬剤組成物と併用し、ここで、各アリコート中の薬剤組成物は、薬剤の同一性、濃度、またはそれらの併用の少なくとも１つが他のすべてのアリコートにおける薬剤組成物とは異なり、そして、前記薬剤組成物は、全体として少なくとも１つの非細胞毒性薬剤を含んでいること；薬剤組成物と併用される前記アリコートをインキュベーションすること；および、インキュベーションされた各アリコートに対して、前記薬剤組成物への少なくとも１種の腫瘍細胞の応答性を分析することを含む前記方法が提供される。ひとつの実施形態では、前記組織は、末梢血、骨髄、リンパ節、および脾臓からなる群から選択される。別の実施形態では、前記サンプルは、凍結または凍結保存されたサンプルであり、前記凍結または凍結保存されたサンプルは、少なくとも３５のアリコートにサンプルを分割する前に解凍される。さらなる実施形態では、前記分析は、前記アリコートを薬剤組成物と併用する７２時間以内に完了する。さらなる実施形態では、前記分析は、前記アリコートを薬剤組成物と併用する４８時間以内に完了する。さらなる実施形態では、前記分析は、前記アリコートを薬剤組成物と併用する２４時間以内に完了する。さらなる実施形態では、前記方法は、前記分析ステップの結果をまとめたレポートを作成することをさらに含む。さらなる実施形態では、前記方法は、患者の医療に関わる当事者に前記レポートを提供することをさらに含む。さらなる実施形態では、薬剤組成物と併用されるアリコートの数は、少なくとも約９６である。さらなる実施形態では、前記測定は、フローサイトメーターを使用して実行される。さらなる実施形態では、前記腫瘍細胞は、血液学的腫瘍を示す。さらなる実施形態では、前記血液学的腫瘍は、慢性リンパ性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非Ｍ３急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病Ｍ３、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病からなる群から選択される。さらなる実施形態では、前記方法は、組織サンプルからの腫瘍細胞をマウスに注入すること；前記注入腫瘍細胞を十分な時間マウス中で増殖させること；および、前記増殖した腫瘍細胞をマウスから取り出し、ここで、注入、増殖、および取り出しがアリコートを薬剤組成物と併用する前に行われることをさらに含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物は、５−アザシチジン、アレムツズマブ、アミノプテリン、アモナフィド、アムサクリン、ＣＡＴ−８０１５、ベバシズマブ、ＡＲＲ Ｙ５２０、三酸化ヒ素、ＡＳ１４１３、Ａｔｒａ、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ１１５２、バノキサントロン、ベヘノイルアラ−Ｃ、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＥＰ−７０１、クロラムブシル、クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、ＣＰＸ−３５１、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、脱グリコシル化−リシン−Ａ鎖−結合抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２イムノトキシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エラシタラビン、エンチノスタット、エプラツズマブ、エルウィナーゼ、エトポシド、エベロリムス、メシル酸エキサテカン、フラボピリドール、フルダラビン、ホロデシン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、ホモハリングトニン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンα２ａ、ヨウ素Ｉ１３１モノクローナル抗体ＢＣ８、イホスファミド、イソトレチノイン、ラロムスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドミド、レスタウルチニブ、マホスファミド、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾン、ミドスタウリン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、オブリメルセン、パクリタキセル、パノビノスタット、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピラルビシン、ＰＫＣ４１２、プレドニゾロン、プレドニゾン、ＰＳＣ−８３３、ラパマイシン、リツキシマブ、リバビリン、サパシタビン、ジナシクリブ、ソラフェニブ、ソラフェニブ、ＳＴＡ−９０９０、タクロリムス、タネスピマイシン、テムシロリムス、テニポシド、テラメプロコル、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チピファルニブ、トポテカン、トレオスルファン、トロキサシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボレロキシン、ボリノスタット、エトポシド、ゾスキダルからなる群から選択される化合物を含む。さらなる実施形態では、前記薬剤組成物は、酸化アルミニウム水和物、ロラゼパム、アミカシン、メロペネム、セフェピム、バンコマイシン、テイコプラニン、オンダンセトロン、デキサメタゾン、アムホテリシンＢ（リポソーム製剤）、カスポフギン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、Ｇ−ＣＳＦ、ラニチジン、ラスブリカーゼ、パラセタモール、メタミゾール、塩化モルヒネ、オメプラゾール、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリンからなる群から選択される化合物を含む。
さらなる実施形態では、患者の血液学的腫瘍の治療を促進する方法であって、腫瘍細胞を含む患者から得た組織サンプルを提供すること；サンプルの少なくとも６つの部分のそれぞれを別の薬剤または薬剤の併用とインキュベーションすること；サンプルのそれぞれの前記部分を、その部分の腫瘍細胞のアポトーシスの程度を把握するために分析すること；および最大級のアポトーシスを有する、少なくともその部分、薬剤、または薬剤の併用を示す分析ステップからの結果の印刷レポートまたは電子レポートを作成すること；を含む前記方法が提供される。ひとつの実施形態では、結果の前記レポートは、複数の薬剤または薬剤の併用の結果を示す。別の実施形態では、前記分析およびインキュベーションのステップは、他の部分と薬剤濃度で異なる付加的部分をさらに含む。
さらなる実施形態では、潜在的な薬剤治療計画への腫瘍細胞の応答を分析するための装置であって、複数のチャンバー；および前記複数のチャンバーのそれぞれで異なる薬剤または薬剤の併用；を含み、ここで、前記チャンバーは、全体的に、複数の薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー；細胞毒性薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー；および全体のチャンバーに合計で少なくとも１０の異なる薬剤；を含む、前記装置が提供される。ひとつの実施形態では、前記装置は、非細胞毒性薬剤を含む少なくとも１つのチャンバーをさらに含む。別の実施形態では、前記装置は、少なくとも１つのチャンバーが、細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤を含む。さらなる実施形態では、前記装置は、異なる濃度での同じ薬剤を含む少なくとも２つのチャンバーをさらに含む。さらなる実施形態では、前記装置は、少なくとも１つのチャンバーが、フルダラビンまたはクロラムブシルのセルトラリン、パロキセチン、またはフルオキセチンとの併用を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つのチャンバーは、フルダラビンおよびシクロホスファミドを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１０の異なる薬剤組成物の１つまたは複数は、５−アザシチジン、アレムツズマブ、アミノプテリン、アモナフィド、アムサクリン、ＣＡＴ−８０１５、ベバシズマブ、ＡＲＲ Ｙ５２０、三酸化ヒ素、ＡＳ１４１３、Ａｔｒａ、ＡＺＤ６２４４、ＡＺＤ１１５２、バノキサントロン、ベヘノイルアラ−Ｃ、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルボプラチン、ＣＥＰ−７０１、クロラムブシル、クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、クロファラビン、ＣＰＸ−３５１、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、脱グリコシル化−リシン−Ａ鎖−結合抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２イムノトキシン、デキサメタゾン、ドキソルビシン、エラシタラビン、エンチノスタット、エプラツズマブ、エルウィナーゼ、エトポシド、エベロリムス、メシル酸エキサテカン、フラボピリドール、フルダラビン、ホロデシン、ゲムシタビン、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、ホモハリングトニン、ヒドロコルチゾン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンα２ａ、ヨウ素Ｉ１３１モノクローナル抗体ＢＣ８、イホスファミド、イソトレチノイン、ラロムスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドミド、レスタウルチニブ、マホスファミド、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾン、ミドスタウリン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、オブリメルセン、パクリタキセル、パノビノスタット、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピラルビシン、ＰＫＣ４１２、プレドニゾロン、プレドニゾン、ＰＳＣ−８３３、ラパマイシン、リツキシマブ、リバビリン、サパシタビン、ジナシクリブ、ソラフェニブ、ソラフェニブ、ＳＴＡ−９０９０、タクロリムス、タネスピマイシン、テムシロリムス、テニポシド、テラメプロコル、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チピファルニブ、トポテカン、トレオスルファン、トロキサシタビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボレロキシン、ボリノスタット、エトポシド、ゾスキダルからなる群から選択される。さらなる実施形態では、少なくとも１０の異なる薬剤組成物の１つまたは複数は、酸化アルミニウム水和物、ロラゼパム、アミカシン、メロペネム、セフェピム、バンコマイシン、テイコプラニン、オンダンセトロン、デキサメタゾン、アムホテリシンＢ（リポソーム製剤）、カスポフギン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ボリコナゾール、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、Ｇ−ＣＳＦ、ラニチジン、ラスブリカーゼ、パラセタモール、メタミゾール、塩化モルヒネ、オメプラゾール、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリンからなる群から選択される。さらなる実施形態では、前記腫瘍細胞は、多発性骨髄腫（ＭＭ）を示し、そして前記チャンバーの少なくとも１つは、イダルビシン＋シタラビン＋ＶＰ−１６、ダウノルビシン＋シタラビン、イダルビシン＋シタラビン、ダウノキソーム＋シタラビン、ミトキサントロン＋シタラビン＋ＶＰ−１６、Ａｔｒａ＋イダルビシン、シタラビン＋ミトキサントロン＋Ａｔｒａからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤併用を含む。さらなる実施形態では、前記腫瘍細胞は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を示し、そして前記チャンバーの少なくとも１つは、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾロン、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋プレドニゾロン、フルダラビン＋シクロホスファミド＋リツキシマブ、ペントスタチン＋シクロホスファミド＋リツキシマブ、フルダラビン＋シクロホスファミド＋オファツムマブ、ペントスタチン＋シクロホスファミド＋オファツムマブ、フルダラビン＋シクロホスファミド＋アフツズマブ、ペントスタチン＋シクロホスファミド＋アフツズマブからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤併用を含む。さらなる実施形態では、前記腫瘍細胞は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を示し、そして前記チャンバーの少なくとも１つは、ビンクリスチン＋ダウノルビシン＋プレドニゾン、ビンクリスチン＋プレドニゾン＋ミトキサントロン＋シタラビン、メトトレキサート＋シタラビン＋ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン＋ビンクリスチン＋メトトレキサート＋シタラビン＋Ｌ−アスパラギナーゼ＋６−メルカプトプリン、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン、デキサメタゾン＋ダウノルビシン＋シクロホスファミド＋Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン＋プレドニゾン、メトトレキサート＋エトポシド＋シタラビン＋チオグアニン、メトトレキサート＋６−メルカプトプリン、ビンクリスチン＋ダウノルビシン＋Ｌ−アスパラギナーゼ＋シクロホスファミド＋プレドニゾン、テニポシド＋シタラビン、ビンクリスチン＋ダウノルビシン＋シクロホスファミド＋Ｌ−アスパラギナーゼ＋デキサメタゾン、ビンクリスチン＋Ｌ−アスパラギナーゼ、ビンクリスチン＋ダウノルビシン＋シタラビン＋Ｌ−アスパラギナーゼ＋イマチニブ＋プレドニゾン、ミトキサントロン＋シタラビン＋イマチニブ、メトトレキサート＋イマチニブ＋６−メルカプトプリン、テニポシド＋シタラビン＋イマチニブ、ビンクリスチン＋ダウノルビシン＋シクロホスファミド＋Ｌ−アスパラギナーゼ＋デキサメタゾン＋イマチニブからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤併用を含む。さらなる実施形態では、前記腫瘍細胞は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を示し、そして前記チャンバーの少なくとも１つは、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋プレドニゾン＋リツキシマブ、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンデシン＋プレドニゾン、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンデシン＋プレドニゾン＋インターフェロンα、シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、シクロホスファミド＋ビンクリスチン＋プレドニゾン＋リツキシマブ、ミトキサントロン＋クロラムブシル＋プレドニゾロン、ミトキサントロン＋クロラムブシル＋プレドニゾロン＋リツキシマブ、フルダラビン＋リツキシマブ、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンデシン＋プレドニゾン＋ブレオマイシン、メトトレキサート＋エトポシド＋イホスファミド＋シタラビン、メトトレキサート＋ビンクリスチン＋プレドニゾン、ドキソルビシン＋シクロホスファミド＋プレドニゾン＋、ビンクリスチン＋ブレオマイシン＋プレドニゾン＋、デキサメタゾン＋シタラビン＋シスプラチン＋、フルダラビン＋シクロホスファミド＋ミトキサントロン、シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋ビンクリスチン＋デキサメタゾン、メトトレキサート＋ヒドロコルチゾン＋シタラビン＋デキサメタゾン＋シクロホスファミド、ベンダムスチン＋ミトキサントロン、イホスファミド＋カルボプラチン＋エトポシド＋リツキシマブ、エトポシド＋プレドニゾン＋ビンクリスチン＋シクロホスファミド＋ドキソルビシン＋リツキシマブからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤併用を含む。さらなる実施形態では、前記腫瘍細胞は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を示し、そして前記チャンバーの少なくとも１つは、イダルビシ＋シタラビン＋ＶＰ−１６、ダウノルビシン＋シタラビン、イダルビシン＋シタラビン、ダウノキソーム＋シタラビン、ミトキサントロン＋シタラビン＋ＶＰ−１６、ＡＴＲＡ＋イダルビシン、シタラビン＋ミトキサントロン＋ＡＴＲＡ、ダウノルビシン＋シタラビン＋チオグアニン、ダウノルビシン＋シタラビン＋ＶＰ−１６、フルダラビン＋イダルビシン＋シタラビン＋Ｇ−ＣＳＦ、フルダラビン＋シタラビン＋Ｇ−ＣＳＦ、高用量シタラビン＋ＶＰ−１６＋ダウノルビシン、ゲムツズマブオゾガマイシン＋イダルビシン＋シタラビン、ゲムツズマブオゾガマイシン＋シタラビン、クロファラビン＋シタラビン、クロファラビン＋シタラビン＋イダルビシン、アムサクリン＋シタラビン＋ＶＰ−１６、ミトキサントロン＋ＶＰ−１６、イダルビシン＋シタラビン＋ＦＬＴ３阻害剤、シタラビン＋ＦＬＴ３阻害剤、シタラビン＋オーロラキナーゼ阻害剤、イダルビシン＋シタラビン＋パノビノスタット、フルダラビン＋イダルビシン＋シタラビン＋Ｇ−ＣＳＦ＋ゲムツズマブ、クラドリビン＋イダルビシン＋シタラビン、デシタビン＋バルプロ酸、ジェナセンス＋フルダラビン＋シタラビン、ジェナセンス＋ダウノルビシン＋シタラビン、ジェナセンス＋シタラビン、ジェナセンス＋ゲンツズマブ・オゾガマイシン、ＰＳＣ８３３＋ダウノルビシン＋シタラビン、ＰＳＣ８３３＋イダルビシン＋シタラビン、ＰＳＣ８３３＋ダウノルビシン＋シタラビン＋ＶＰ−１６、ボルテゾミブ＋イダルビシン＋シタラビンからなる群から選択される少なくとも１つの薬剤併用を含む。
さらなる実施形態では、フルダラビンまたはその薬学的に許容される塩とセルトラリンまたはその薬学的に許容される塩とを含む、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の治療用組成物が提供される。
１つの実施形態は、患者から採取された血液学的腫瘍の組織サンプルを得て、少なくとも３５のアリコートにその組織サンプルを分割し、それぞれ薬剤組成物を含む少なくとも３５のアリコートを合わせ、そして少なくとも３５のアリコートのそれぞれにおける少なくとも１つの細胞集団のアポトーシスを測定することを含む、薬剤に対する細胞の応答性を分析する方法を提供する。
別の実施形態は、薬剤に対する腫瘍組織の応答性を分析する方法を提供し、この方法は、患者から採取された血液学的腫瘍の組織サンプルを得て（組織サンプルは腫瘍細胞を含む）、前記組織サンプルを少なくとも３５のアリコートに分割し、少なくとも３５のアリコートを薬剤組成物と併用し、各アリコート中の薬剤組成物は、薬剤の同一性、濃度、またはそれらの併用の少なくとも１つが他のすべてのアリコートにおける薬剤組成物とは異なり、そして、前記薬剤組成物は、全体として少なくとも１つの非細胞毒性薬剤を含み、薬剤組成物と併用されるアリコートをインキュベーションし、そして、各インキュベーションされたアリコートに対して前記薬剤組成物への少なくとも１種の腫瘍細胞の応答性を分析することを含む。
血液学的腫瘍からの組織は、変更することができる。例えば、組織は、末梢血、骨髄、リンパ節、および脾臓からなる群から選択されてよい。当業者には、同じ原理が腫瘍細胞を含む血液学的腫瘍に関与する組織からの任意のサンプルに適用されることが周知であるが、ここでの説明は、簡単にするために血液サンプルに言及する。
１つの実施形態では、薬剤に対する細胞の応答性を分析するための方法は、最初の時点で患者から採取された血液サンプルを得て、血液サンプルの別のアリコートをいくつかの薬剤組成物と併用し、そして、アポトーシスに関してアリコートの各々における少なくとも１つの細胞集団を分析することを含む。いくつかの実施形態では、血液サンプルは、分析のために別の当事者にサンプルを送る当事者によって得られる。好ましい実施形態では、細胞毒性薬剤、非細胞毒性薬剤、およびそれらの併用に対する腫瘍血液細胞の応答を分析するための方法は、以下のステップを含む：ａ）最初の時点で患者から採取した血液サンプルを得ること；ｂ）サンプルを少なくとも５、１０、１５、２０、３５、５０、または１００のアリコートに分けること；ｃ）別々の薬剤組成物を各アリコートと併用すること；ｄ）アリコートを薬剤組成物とインキュベーションすること；ｅ）アリコート中の薬剤組成物に対する、アリコート中の少なくとも１つの腫瘍血液細胞型の応答性を分析すること；そして、ｆ）患者の血液サンプルを得た時点から４８時間以内に当該方法を完了すること。別の実施形態では、各アリコートと併用された薬剤組成物は、薬剤の同一性、濃度、または併用の少なくとも１つによって互いに異なる。
個別化医療試験などの方法が臨床的に機能するために、本方法は、好ましくは短い時間枠内で完了する。特に、この方法は、サンプルのインキュベーション時間に比べて短い時間枠で完了する。１つの実施形態では、分析は、サンプルを患者から採取した時点から約１２０時間以内に完了する。別の実施形態では、分析は、サンプルを患者から採取した時間から約９６時間以内に完了する。さらなる実施形態では、分析は、サンプルを患者から採取した時間から約７２時間以内に完了する。さらなる実施形態では、分析は、サンプルを患者から採取した時間から約４８時間以内に完了する。さらなる実施形態では、分析は、サンプルを患者から採取した時間から約２４時間以内に完了する。しかし、他の方法は、例えば、サンプルが凍結している場合、あるいはサンプルが細胞を増殖させるためにマウスに注入される場合、分析が完了する時間を延長する場合がある。１つの実施形態では、測定は、アリコートを薬剤組成物と併用する１２０時間以内に完了する。別の実施形態では、測定は、アリコートを薬剤組成物と併用する９６時間以内に完了する。さらなる実施形態では、測定は、アリコートを薬剤組成物と併用する７２時間以内に完了する。さらなる実施形態では、測定は、アリコートを薬剤組成物と併用する４８時間以内に完了する。さらなる実施形態では、測定は、アリコートを薬剤組成物と併用する２４時間以内に完了する。
患者から細胞サンプルを取得するための方法は、当該分野で公知である。１つの実施形態では、細胞サンプルは、全血から取得される。別の実施形態では、細胞サンプルは全血である。別の実施形態では、細胞サンプルは、全末梢血である。別の実施形態では、細胞サンプルは、骨髄から取得される。別の実施形態では、細胞サンプルは、リンパ節から取得される。別の実施形態では、細胞サンプルは、脾臓から取得される。別の実施形態では、細胞サンプルは、血液悪性疾患に関与している他のどの組織からも得られる。細胞サンプルは、取得後すぐに分析されてもよいし、あるいは、凝固を避けるために化学物質で処理して、後の時点で分析されてもよい。１つの実施形態では、血液サンプルは、血液凝固を防ぐためにヘパリンで処理される。別の実施形態では、骨髄サンプルは、血液凝固を防ぐためにヘパリンで処理される。別の実施形態では、血液または骨髄のサンプルは、血液凝固を防ぐためにＥＤＴＡで処理される。別の実施形態では、血液または骨髄のサンプルは、血液凝固を防ぐために、限定されるものではないが、トロンビン阻害剤を含む抗凝固剤で処理される。サンプルは、精製または分離ステップなしで使用されることが好ましく、それにより、細胞環境がインビボ環境に一層似てくる。
何千という薬剤組成物をサンプリングすることができる。本明細書に記載の方法は、個別化医療の処方のための多くの変数を評価するために、アリコートの形態で様々な濃度における多数の薬剤組成物の併用の分析が可能である。１つの実施形態では、この方法は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれ以上のアリコート（場合により薬剤組成物当たり）を、または前記の値のいずれか２つによって定義された範囲を分析する。別の実施形態では、この方法は、約９６以上のアリコートを分析する。さらに、薬剤組成物の数は、アリコートの数と共に変動することができる。１つの実施形態では、アリコートの数および異なる薬剤組成物の数の両方は、それぞれ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０より大きいか、または前記の値のいずれか２つによって定義された範囲である。別の実施形態では、アリコートの数および異なる薬剤組成物の数の両方は、それぞれ約５０より大きい。別の実施形態では、アリコートの数および異なる薬剤組成物の数の両方は、それぞれ約９６より大きい。
本発明者らは、かなりの数の非細胞毒性化合物が細胞アポトーシスを誘導することができるのを予想外にも発見した。非細胞毒性薬剤が腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが可能であることが多くはないが知られているが、これは非常にまれな事象と考えられてきた。本発明者らは、非細胞毒性薬剤のかなりの割合が、所定の血液学的腫瘍からの悪性細胞でのアポトーシスを誘導することを発見した。さらに、本明細書に記載の方法は、特定の非細胞毒性化合物がアポトーシスを誘導する細胞毒性化合物の能力を増強できることを意外にも示している。したがって、複数の薬剤の異なる種類の多剤療法の併用は、有益な治療効果を有する可能性がある。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、１つまたは複数の細胞毒性化合物を含む薬剤組成物に対する細胞応答を分析する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、１つまたは複数の非細胞毒性化合物を含む薬剤組成物に対する細胞応答を分析する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、１つまたは複数の細胞毒性化合物と１つまたは複数の非細胞毒性化合物を含む薬剤組成物に対する細胞応答を分析する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者に既に投与されている薬剤と同じか、あるいは同じ薬効分類である１つまたは複数の非細胞毒性化合物を含む１つまたは複数の薬剤組成物を分析する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者に既に投与されている薬剤と同じでない１つまたは複数の非細胞毒性化合物を含む１つまたは複数の薬剤組成物を分析する。１つの実施形態では、薬剤組成物は、その薬剤の異なる濃度を有する同じ薬剤を含むいくつかの組成物を含む。別の実施形態では、薬剤組成物は、薬剤のいくつかの異なる混合物を含む。別の実施形態では、薬剤組成物は、全体として少なくとも５種類の異なる薬剤を含む。
患者への投与に先立って、潜在的な薬剤治療計画は、細胞毒性効果を最適化することができる。様々な薬剤の併用について、本明細書に記載の方法によって作成された用量応答曲線は、最適な有効性が毒性の強い薬剤の低用量で達成できることを示しており、これはこれらの薬剤間の相乗効果を証明している。意外なことに、２つの細胞毒性薬剤のいくつかの併用は、薬剤個々の１つよりも有効ではなく、このことは、これらの細胞毒性薬剤が特定の併用では細胞保護薬（すなわち、陰性の協同作用）として挙動することがあることを示している。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者のための薬剤濃度を選択するために最適条件を利用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者に対する薬剤濃度を選択するためにＥＣ９０やＥＣ５０のいずれかを利用する。
個々の薬剤の効果に加えて、併用指数と用量減少指数を含む薬剤相互作用の詳細な分析は、効果的な多剤療法治療計画を識別するために使用することができる。両方の指数の精度の推定値は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４，２２：２７−５５）により記述された中央値効果法に基づいて正確な代数的推定アルゴリズム（すなわち、モンテカルロシミュレーション）で算出することができる。併用指数（ＣＩ）は、相加効果の観点から薬剤相互作用の程度の定量的な指標であり、ここで、相乗効果は、ＣＩ＜１で示され、相加効果は、ＣＩ≒１で示され、そして拮抗作用はＣＩ＞１で示される。用量減少指数（ＤＲＩ）は、相乗的な併用の各薬剤の用量が、単独での各薬剤の用量と比較して所定の効果レベルでどれだけ減少するかの尺度である。最近では、薬剤相互作用指数を評価するために、ＭｉｘＬｏｗ法（Ｂｏｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２００８，８：１３；Ｂｏｉｋ，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２００８，２７（７）：１０４０−６１）が、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４，２２：２７−５５）の中央値効果法の代替として提案されている。ＭｉｘＬｏｗ法の１つの利点は、濃度−応答曲線のパラメーターを推定するために使用される非線形混合効果モデルが、中央値効果法で使用される対数線形化と最小二乗分析よりも正確なパラメーター推定値を提供できることである。当業者は、これらの計算と関連する方法が、本明細書に記述される混合薬剤治療のための薬剤相互作用を分析するために使用できることを知るであろう。いくつかの実施形態では、複数の薬剤の併用は、増強、相乗作用、または用量減少について評価される。いくつかの実施形態では、薬剤相互作用を示すとして識別された併用が、治療のために選択される。
患者から抽出することができるサンプルの限られた量は、個別化医療試験のために試験することができる薬剤組成物の数を制限する。しかし、最近の開発は、患者の細胞の連続的な出所源となる複数のマウスを介して血液悪性腫瘍の患者の原発細胞を増殖させることができるマウスモデルを提供した（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，３２４：２５−５１；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，３２４：５３−７６）。これらのモデルは、最近、抽出された患者のサンプルよりも、より多くの薬剤組成物のエクスビボでのサンプリングを、特に薬剤の併用を可能にする。これらのモデルは、本明細書に記載の方法で使用することができると考えられる。例えば、サンプルは、マウスモデルなどの動物モデルから採取することが可能である。特に、これらのモデルは、化学療法の影響を緩和するために患者に与えられると、併用薬剤またはアジュバント薬剤の有効性を探索することを可能にする。これらのモデルはまた、治療効果の確率を高めるために個々の患者の治療に将来的には加えることができる承認された非細胞毒性の安全な薬剤の潜在的な有効性の探索を可能とする。さらに、患者サンプルから直接のヒト患者の細胞あるいはマウスモデルにより増殖したヒト患者の細胞を用いて、エクスビボの試験で特定された薬剤組成物の任意の薬剤併用の有効性は、インビボでのマウスモデルにおいて試験することができた。
個別化医療試験として、薬剤や薬剤の併用に対する細胞応答の概要を患者と介護者に提供することが望ましい。１つの実施形態では、この方法は、分析ステップの結果をまとめたレポートの作成を含む。別の実施形態では、この方法は、患者にレポートを提供することを含む。別の実施形態では、この方法は、患者の医療に責任がある当事者にレポートを提供することを含む。別の実施形態では、この方法は、分析ステップを解釈するための責任者にレポートを提供することを含む。
本開示は、また、例えば、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、およびＮＨＬの治療において有用な特定の薬剤の併用、およびリンパ増殖性疾患の治療におけるこれらの薬剤の併用の使用を含む。
１つの実施形態は、潜在的な薬剤治療計画への腫瘍細胞の応答を分析するための装置を提供し、それは、複数のチャンバーと複数のチャンバーのそれぞれに異なる薬剤または薬剤の併用を含む。１つの実施形態では、チャンバーは、全体として、複数の薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー、細胞毒性薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー、および全体のチャンバーに少なくとも合計１０の異なる薬剤を含む。１つの実施形態では、少なくとも１つのチャンバーは、非細胞毒性薬剤を含む。１つの実施形態では、少なくとも１つのチャンバーは、細胞毒性薬剤と非細胞毒性薬剤を含む。１つの実施形態では、少なくとも２つのチャンバーは、異なる濃度での同じ薬剤を含む。
本明細書に記述された任意の特徴または特徴の組み合わせは、任意のそのような組み合わせに含まれる特徴が、相互に矛盾しない限り、文脈、本明細書、および当業者の知識から明らかなように本発明の範囲に含まれる。本発明のさらなる利点および態様は、以下の詳細な説明で明白である。
図１は、フルオレセイン標識アネキシンＶを用いて、アポトーシス細胞上のホスファチジルセリン発現のフローサイトメトリーによる検出を示す。 図２は、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子再配列［ｔ（９；２２）陽性］を表示する前駆Ｂ−ＡＬＬ成人症例および定量的なフローサイトメトリーを用いるＣＤ１９陽性細胞のうちの白血病細胞と正常細胞の検出を示す。 図３は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者からのサンプルにおける末梢血（ＰＢ）または骨髄（ＢＭ）のエクスビボでの評価のためのプロトコルを例示する。 図４は、ＣＬＬ治療に対して現在承認されているいくつかの薬剤への９人の異なる患者のエクスビボでの応答を示す。 図５は、個々の患者に対しての個別化医療試験の処置を最適化する望ましい薬剤組成物の数を示す。 図６は、ＣＬＬの治療に対して承認された細胞毒性薬剤（すなわち、フルダラビン、クロラムブシル、およびミトキサントロン）と同様の有効性を有する悪性ＣＬＬサンプル中でアポトーシスを誘導するいくつかの非細胞毒性薬剤（すなわち、パロキセチン、フルオキセチン、セルタリン、グアナベンズ、およびアステミゾール）を示す。 図７は、ＣＬＬ患者からの全血サンプル中のパロキセチンの用量−応答曲線を示し、白血病細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞に関するパロキセチンのアポトーシス効果を比較する。 図８は、セルトラリンと現在ＣＬＬの治療に用いられている３つの薬剤（すなわち、フルダラビン、クロラムブシル、およびミトキサントロン）によるＣＬＬ患者の全血サンプル中のアポトーシス誘導に関する動力学的な相違を示す。 図９は、ＣＬＬサンプルでのアポトーシス誘導におけるパロキセチン（すなわち、ＳＳＲＩ）と同じ薬理学的分類の化合物の差異的効果を示す。 図１０は、合計２３の患者サンプルのうち、患者サンプルの数として表記されたヒット頻度を示し、それに対しては、非細胞毒性薬剤は、承認された細胞毒性薬剤と同じ有効性で白血病ＣＬＬ細胞を除去し、ほとんどの非細胞毒性薬剤が極めて少ない患者で有効であることを例示している。 図１１は、非細胞毒性薬剤セルトラリンによる、承認された細胞毒性薬剤クロラムブシルの有効性の増強を示す。 図１２は、細胞毒性薬剤ビンクリスチン、ミトキサントロン、およびシクロホスファミド（これらはＣＬＬの治療に使用される）により誘導されるアネキシンＶ陽性細胞の割合と、非細胞毒性薬剤オメプラゾールおよびアシクロビル（これらは、しばしば、化学療法による副作用の治療に処方される）により誘導されるアネキシンＶ陽性細胞の割合を示す。 図１３Ａ〜Ｃは、ＣＬＬ患者の個別化医療試験用の９６−ウェルプレートの設計を例示する。 図１４Ａ〜Ｆは、多発性骨髄腫患者の個別化医療試験用の９６−ウェルプレートの設計を例示する。 図１５は、ＰＥＴＨＥＭＡの治療プロトコルで投与された細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤を含む、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者の個別化医療試験のための９６−ウェルプレートの設計を例示する。ＭＴＸ：メトトレキサート；６ＭＰ：６−メルカプトプリン；ＡＲＡ−Ｃ：シタラビン；ＤＮＲ：ダウノルビシン；ＡＤＲＩＡ：アドリアマイシン；Ｍ：ミトキサントロン；ＶＰ−１６：エトポシド；ＶＭ−２６：テニポシド；ＣＦ：シクロホスファミド；ＩＦＯＳ：イホスファミド；Ｖ：ビンクリスチン；ＶＩＮＤ：ビンデシン；Ｌ−ＡＳＡ：アスパラギナーゼ；ＩＭＡＴ：イマチニブ；Ｒ：リツキシマブ；Ｐ：プレドニゾン；ＨＣ：ヒドロコルチゾン；ＤＸＭ：デキサメタゾン；ＦｏＩｉ：ロイコボリン；Ｍｅｓｎａ：メスナ；Ｏｍ：オメプラゾール；Ｏ：オンダンセトロン；Ａｌｌｏｐ：アロプリノール；ＧＣＳＦ：フィルグラスチム。 図１６は、ＰＥＴＨＥＭＡの治療プロトコルで投与された細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤を含む、骨髄異形成症候群患者の個別化医療試験のための９６−ウェルプレートの設計を例示する。 図１７は、ＰＥＴＨＥＭＡの治療プロトコルで投与された細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤を含む、急性骨髄芽球性白血病（Ｍ３ではない）患者の個別化医療試験のための９６−ウェルプレートの設計を例示する。Ｄａｕｎｏ：ダウノルビシン；Ｉｄａ：イダルビシン；ＡＲＡ−Ｃ：シタラビン；Ｍｉｔｏｘ：ミトキサントロン；ＶＰ１６：エトポシド；Ｆｌｕｄａ：フルダラビン；ＧＣＳＦ：フィルグラスチム；Ｏｎｄａｎｓ：オンダンセトロン；Ｃｏｔｒｉ：コトリモキサジール；ＡｃＦ：葉酸；Ａｌｏｐ：アロプリノール；Ｏｍ：オメプラゾール；Ｃａｒｂｏｐ：カルボプラチン；Ｄａｕｎｏ ｌｉｐｏ：リポソームダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｘｏｍｅ（登録商標））；ＡＭＳＡ：アムサクリン；ＧＯ：ゲムツズマブオゾガマイシン。 図１８は、ＰＥＴＨＥＭＡの治療プロトコルで投与された細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤を含む、急性骨髄芽球性白血病Ｍ３（前骨髄球性）患者の個別化医療試験のための９６−ウェルプレートの設計を例示する。ＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）：トレチノイン；Ｉｄａ：イダルビシン；Ｍｉｔｏｘ：ミトキサントロン；ＡＲＡ−Ｃ：シタラビン；６−ＭＰ：６−メルカプトプリン；ＭＴＸ：メトトレキサート；Ｏｎｄａｎｓ：オンダンセトロン；Ａｌｏｐ：アロプリノール；Ｏｍ：オメプラゾール；Ｄｅｘａ：デキサメタゾン；ＶＰ−１６：エトポシド；Ｆｌｕｄａ：フルダラビン；Ｃａｒｂｏｐ：カルボプラチン；Ｄａｕｎｏ ｌｉｐｏ：リポソームダウノルビシン；Ｄａｕｎｏ：ダウノルビシン；Ｃｏｔｒｉ：コトリモキサゾール；ＦＡｃ：葉酸。 図１９は、ＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４細胞株における細胞増殖阻害に対するセルトラリンの効果を示す。 図２０は、２４時間でのＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４細胞株におけるアポトーシスの誘導に対するセルトラリンの効果を示す。 図２１は、２４時間でのＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４細胞株における活性型カスパーゼ−３の誘導に対するセルトラリンの効果を示す。 図２２は、個々の薬剤（すなわち、リツキサミブ、フルダラビン、ミトキサントロン、およびシクロホスファミド（マホスファミド））のエクスビボでの有効性、およびＣＬＬサンプルでのこれらの個々の薬剤の併用による最大の耐性および感受性の多剤療法を示す。 図２３は、フルダラビン、シクロホスファミド（マホスファミド）、およびそれらの併用のエクスビボでの有効性を特徴づける５点用量応答曲線を有する、図２２と同じ実験の結果を示す。 図２４は、フルダラビン、シクロホスファミド（マホスファミド）、ミトキサントロン、およびそれらの併用のエクスビボでの有効性を特徴づける５点用量応答曲線を有する、図２４と同じ実験の結果を示す。 図２５は、フルダラビン、シクロホスファミド（マホスファミド）、リツキシマブ、およびそれらの併用のエクスビボでの有効性を特徴づける５点用量応答曲線を有する、図２４と同じ実験の結果を示す。 図２６は、２人の患者Ｐ２．０１４４（左）とＰ２．０１４９（右）に対する臨床プロトコルにおける５種類の異なる濃度でのフルダラビンとマホスファミドの単独および併用での効果を示す。 図２７は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８１，１１５（ｌ）：２０７−１６； Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４，２２：２７−５５）を用いて、図２６からのＣＬＬ患者Ｐ２．０１４９に見られるフルダラビンとマホスファミド（シクロホスファアミド）間の相乗効果の算出を示す。 図２８は、ＣＬＬサンプルの悪性細胞でのアポトーシスを誘導するためのフルダラビンとセルトラリンの有効性に対する、インキュベーション時間（薬剤曝露時間（０．５、４、および８時間）と全体的なインキュベーション時間（２４または４８時間）の両方）の効果を示す。 図２９は、２種類の薬剤の併用のための行列を表す。 図３０は、３種類の薬剤の併用のための行列を表す。 図３１は、４種類の薬剤の併用のための行列を表す。 図３２は、細胞追跡染料を使用する、末梢血白血球の３色多重化を示す。 図３３は、悪性細胞を区別し、アネキシンＶでアポトーシスを検出する、ＣＬＬサンプルにおいてウェルを多重化するために使用される蛍光色素染料を示す。
本発明は、スクリーニングプラットフォームを使用して複数の薬剤の併用についてエクスビボでのアポトーシス効果を評価するための組成物、システム、および方法を提供する。特に、本発明は、迅速なデータ収集、分析および結果の報告のために適合させたフローサイトメトリーによる自動化サンプル調製と自動化された評価の両方を組み込んだ細胞ベースのスクリーニングを実行する方法を提供する。フローサイトメトリー法の使用は、個々の細胞死の評価を可能にし、その単一細胞への分離は、エクスビボでのアッセイのインキュベーション時間の短縮を可能にし、それによって細胞毒性のプロファイリングに迅速な応答時間を提供することができる。細胞ベースのスクリーニングプラットフォームは、また、サンプル採取から２４〜７２時間で、すべてのスクリーニングと検証アッセイを完了するために使用することもできる。このタイムラインは、診断が血液学的腫瘍について行われた後、治療の開始前に、医師への結果の報告を可能とする。したがって、本明細書に記載の方法は、個別化医療のために使用することができ、承認薬に対する可能な新たな適応症を識別するために使用することができる。
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語が最初に定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
本明細書で使用されるように、「ＥＣ５０」と「ＥＣ９０」は、それぞれ最大アポトーシスの５０％と９０％を引き起こすために必要な薬剤濃度を意味する。
本明細書で使用されるように、「エクスビボ」は、インビトロでの原発性のヒト患者細胞を指し、ここで、細胞はその状態を維持するために、新しく抽出、凍結保存、あるいは凍結されることができる。いくつかの実施形態では、これらの細胞は、薬剤効果のインビトロでの評価のために解凍される。
本明細書で使用されるように、「エクスビボでの治療指数」は、腫瘍細胞死と正常細胞死との間の比率を指す。
本明細書で使用されるように、「Ｅｘｖｉｔｅｃｈ」は、自動サンプル調製、フローサイトメーターへの自動入力のためのＥＰＳシステム、および自動化された生物情報分析を組み込んだ統合プラットフォームを指す。
本明細書で使用されるように、「血液学的腫瘍」は、「血液学的悪性腫瘍」とも呼ばれるが、世界保健機関の分類（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ ＳＨ，Ｃａｍｐｏ Ｅ，Ｈａｒｒｉｓ ＮＬ，Ｊａｆｆｅ ＥＳ，Ｐｉｌｅｒｉ Ｓ，Ｓｔｅｉｎ Ｈ，Ｔｈｉｅｌｅ Ｊ，Ｖａｒｄｉｍａｎ ＪＷ（Ｅｄｓ）：ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｔ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（ＩＡＲＣ），Ｌｙｏｎ．４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｌｙｏｎ ２００８）に従って定義される一群の病気を指す。
本明細書で使用されるように、個別化腫瘍応答試験（ＩＴＲＴ）は、癌患者から新たに採取された全て生きた腫瘍細胞に対する制癌性の治療効果を記述する方法を指す。
本明細書で使用されるように、「多剤療法」は、複数の薬剤で患者を治療することを指す。
本明細書で使用されるように、「非細胞毒性」化合物または薬剤は、細胞毒性の化学療法剤または抗腫瘍剤として規制当局によって承認されていない化合物または薬剤を指す。
本明細書において使用されるように、「アリコート」は、別々の容器またはウェルに存在することができるか、あるいはチューブまたは他の媒体で形成することができるサンプルまたは画分を意味し、ここで、薬剤含量、薬剤の同一性、または薬剤濃度の違いは、サンプルがガスまたは非混和性液体（例えば、石油）により連続的であるか、あるいは分離されているかどうかにかかわらず、合同サンプル中でも維持されることができる。
本明細書で使用されるように、「薬剤組成物」は、単一の薬剤およびその種々の濃度、または薬剤の併用およびその種々の濃度を意味し、分析のためにアリコートにまたは治療のために患者に投与される。
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される塩」は、それが投与される生物に重大な刺激を起こさない、そして化合物の生物活性および特性を抑制しない化合物の製剤を指す。薬学的な塩は、常套的な実験によって得ることができる。
本明細書で使用されるように、「ウェル」または「チャンバー」は、本明細書に記載の方法を実行するのに十分なサンプルを保持する能力を有するすべての構造を指す。当業者は、「ウェル」または「チャンバー」が、例えば、プレートの凹部、表面張力によって作られるガラススライド上のスポット、またはマイクロ流体装置の部位を含むことができることを知っている。
本発明の現在好適な実施形態について、今度は詳細に言及され、その例が添付図面に提供される。可能な限り、同一または類似の参照番号が、同一または類似の部分を言及するために、図面および説明で使用されている。図面は、単純化された形態であり、正確な縮尺ではないことに留意すべきである。本明細書の開示は、特定の例示された実施形態に言及しているが、これらの実施形態は、一例として提示されるものであって、限定されるものではないことを理解すべきである。以下の詳細な説明の意図は、例示的な実施形態を説明するが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲に含まれるものとして、実施形態の全ての修正、代替、および均等物をカバーするものと解釈されるべきである。開示された方法は、当該分野で慣例的に使用される様々な医療処置と併用して用いることが可能である。
開示された方法は、本明細書に記述されている先行技術に比べていくつかの利点を有している。１つの利点は、その方法は、多くの薬剤組成物および異なるインキュベーション時間を含む多数の変数に対する細胞応答を分析できることである。別の利点は、この方法が薬剤に対する細胞の応答を分析する速さである。別の利点は、全血を分析し、したがって、より密接に患者のインビボの環境を模倣する能力である。さらに、本発明の方法は、多数の薬剤および薬剤組成物の用量応答曲線を生成することができる。一緒にされたこれらの方法は、患者を治療する多剤療法の治療計画を開発することの利点を与える。具体的な実施形態では、本方法は、血液疾患を患っている患者を治療する多剤療法の治療計画の開発を促す。
開示された方法は、各種機器の使用を受け入れることができ、１つまたは複数のサンプル調製ロボットおよび薬剤組成物への細胞応答性を分析する１つまたは複数のフローサイトメーターを含む。フローサイトメトリーは、当該分野での他のどんな単一細胞分析技術をもはるかに上回る速度で単一細胞分析を可能とする。これは、統計的に有意な数の細胞を他の代替技術を使用するよりも速く分析するのを可能にする。１つの実施形態では、フローサイトメトリーは、薬剤組成物に対する細胞の応答性を分析するために使用される。１つの実施形態では、分析は、サンプルを得た時間から約９６時間以内に完了する。別の実施形態では、分析は、サンプルを得た時間から約７２時間以内に完了する。別の実施形態では、分析は、サンプルを得た時間から約４８時間以内に完了する。別の実施形態では、分析は、サンプルを得た時間から約２４時間以内に完了する。本明細書に記載の方法のために有用なフローサイトメーターの一例が、米国特許第７，４５９，１２６号に提供されており、その内容は引用することによりそれら全体で、および限定されることなくフローサイトメーターを説明する目的を含むすべての目的のために、本明細書に取り込まれる。
サンプル調製ロボットとフローサイトメーターは、相互に統合される場合があるか、またはサンプル調製ロボットとフローサイトメーターは、互いに統合されない場合がある。１つの実施形態では、フローサイトメーターは、サンプル調製ロボットなしで使用される。特定の実施形態では、ＣＹＡＮ（登録商標）サイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）は、サンプル調製ロボットなしで使用される。当該分野で知られているさまざまな種類のサンプル調製ロボットと液体ハンドラーがある。１つの実施形態では、フローサイトメーターは、当該分野で知られている任意の適切なサンプル調製ロボットまたは液体ハンドラーで使用される。別の実施形態では、ＣＹＡＮ（登録商標）サイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）は、サイトメーターへのサンプルの送達を自動化するＥＰＳと呼ばれる少量の液体ハンドラーと統合されている。特定の実施形態では、ＥＰＳは、Ｔｅｃａｎ３６０液体ハンドラー（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。別の実施形態では、ＥＰＳは、シリンジポンプと各ウェルの内容物が、固定チップを通して吸引され、保持ループに移され、そしてサイトメーターに注入されるのを可能とするインタフェース切替え弁でカスタマイズされる。別の実施形態では、サンプル調製および化合物プレーティングは、ＢＩＯＭＥＫ（登録商標）３０００液体ハンドラー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて完了することができる。任意の数のウェルプレートを使用することができ、１つの特に有用なウェルプレートは、９６ウェルプレートである。様々な他のプレートのサイズも考慮されて、２４、４８、３８４、１５３６、３４５６、または９６００のウェルプレートを含む。サンプル調製ユニットは、操作されている間、化合物とサンプルが無菌を維持するのを可能にするフローキャビネット内に収めることができる。アッセイのセットアップ終了後、プレートはサンプルの分析システムにロードされる。
ＣＹＡＮ（登録商標）サイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）は、３レーザー９色検出機器であり、そして、当該分野で公知の方法論が、そのような近代的なフローサイトメーターのマルチレーザーおよびその結果として、複数のパラメーター測定能を最大限に活用するために開発された。１つの実施形態では、単一レーザーフローサイトメーターは、分析ステップのために使用される。別の実施形態では、マルチレーザー・フロー・サイトメーターは、分析ステップのために使用される。蛍光色素と共役化学の広範なセットの開発と最適化は、免疫グロブリンおよび小分子などの種々のリガンドが蛍光色素に結合できるようにする。光スペクトルの紫外線から赤外線領域までの発光線を有するレーザーは、これらの蛍光色素を励起することができる。その結果、多くのスペクトルの異なる試薬が、フローサイトメトリーなどの蛍光ベースの計測器での研究のために細胞を標識するのに使用することができる。これらの試薬は、当業者に周知である。１つの実施形態では、１つまたは複数の蛍光色素は、分析ステップの過程で使用される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の染色が、薬剤組成物に対する細胞の応答の分析に使用される。
分析に先立ってチューブでの不注意なサンプル混合を最小限にする当該分野で公知のいくつかの方法がある。エクスビボでのアッセイ中に不注意なサンプル混合を最小限に抑えることが知られている１つのそのような方法は、細胞のキャリーオーバーを除くために、全てのチューブがウェル間で洗浄されるのを可能にする容積移送式真空ポンプである。不注意なサンプル混合を最小限にするのに有用な別の方法は、エンドポイントアッセイである。エンドポイントアッセイは、化合物のキャリーオーバーが問題とならないため有利である。１つの実施形態では、アッセイは、エンドポイントアッセイを含む。
フローサイトメーターを用いるアッセイから得られたデータを収集および格納するためには、当該分野で公知のいくつかの方法がある。１つの実施形態では、ＥＰＳに組み込まれるソフトウェアは、各ウェルの注入とインキュベーション時間に関するタイミング情報を記録する。スクリーニングアッセイを実行するとき、２つの取得ファイルを収集することができる。１つの実施形態では、サイトメーターのソフトウェアにある１つのファイルには、機器によって分析された各細胞の実際のデータが含まれている。別の実施形態では、２番目のファイルは、ＥＰＳのソフトウェアやサイトメーターソフトウェアにあるタイミングファイルであり、これは機器によって分析された各細胞の実際のデータを含む。これらの各ファイルは、アッセイの実行の開始時、ウェルプレート、例えば９６ウェルプレートからスキャンされたバーコードに従って命名することができる。
ユーザーは、ＥＰＳ Ａｎａｌｙｚｅｒなどの分析ソフトウェアのプログラムに両方の機器からのすべてのファイルを読み込むことができる。このプログラムは、サイトメーターから取得したデータをグループに分離し、各グループの細胞と混合された化合物のウェル番号を割り当てるように設計されている。プログラムの別の使い方は、個々の集団が離散的に分析できるように蛍光リードアウトに基づいて個々の集団をゲーティングすることが含まれる。アッセイのセットアップに含まれる分析マーカーもまた評価される。１つの実施形態では、スクリーニングと検証アッセイのために、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（蛍光体に結合したアポトーシスのマーカー）は、アポトーシス経路に入る細胞から生細胞を区別するために使用される。
分析の完了後、ファイルがデータベースにアップロードされる。１つの実施形態では、データベースは、ＩＤＢＳ（Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ，ＵＫ）からのＡＣＴＩＶＩＴＹＢＡＳＥ（登録商標）である。データベースにファイルをアップロードすることは、各患者サンプルに対して活性な化合物を決定するためにデータを迅速に評価することができる。データが蓄積されるにつれて、バイオ情報科学ツールが構築、開発されてデータの解釈を容易にすることができる。一例として、取得したデータからのＥＣ５０、ＥＣ９０、最大アポトーシスなどの薬理学的基準は、多くの患者サンプル間で比較することができ、免疫表現型検査結果および遺伝情報と関連付けることができる。各アッセイスクリーンで取得した大量のデータを考慮して、柔軟なデータベース管理システムがスクリーニングプロセスにとって重要である。
このシステムは、アポトーシスを誘導する薬剤組成物の能力を測定することにより、エクスビボでの治療指数を決定することができる。図１と図２は、フローサイトメトリーを用いて、アポトーシス細胞を検出し、正常表現型と腫瘍表現型の間で区別する能力を表している。１つの実施形態では、この方法は、正常表現型と腫瘍表現型を区別するためにフローサイトメトリーを使用している。別の実施形態では、この方法は、正常表現型と腫瘍表現型を区別するためにフローサイトメトリーとモノクローナル抗体を使用している。別の実施形態では、この方法は、アポトーシス細胞を検出するためにフローサイトメトリーを使用している。特定の実施形態では、この方法は、アポトーシス細胞上のホスファチジルセリンの発現を検出するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合しているアネキシンＶを使用する。当該分野で知られているモノクローナル抗体と複数のパラメーター分析戦略との適切な併用の同時使用は、血液疾患の患者からのサンプル中に存在する残留正常細胞からの白血病細胞の識別が可能になる。１つの実施形態では、この方法は、血液または骨髄のサンプルのいずれかで悪性細胞と正常細胞の区別が可能となる。別の実施形態では、血液または骨髄中のいずれかにおける悪性細胞と正常細胞の区別は、Ｅｕｒｏｆｌｏｗ規範により開発された最近の方法論に従って実行される（ＥｕｒｏＦｌｏｗ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．２００８ Ｓｅｐ；７３（９）：８３４−４６；ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，１４ｔｈ ＥＨＡ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＤＥ ４ Ｊｕｎｅ ２００９：２０１０年に発行予定（印刷中））。
薬剤組成物のためのエクスビボのスクリーニングプロセスが、図３に模式的に示される。図３では、サンプルは、ヘパリンにより凝固が防止され、免疫表現型が検査され、そしてカウントされる。その後、サンプルは、約４，０００細胞／μＬの白血病細胞の濃度を達成するために希釈される。細胞懸濁液の４５μｌを５つの異なる濃度で薬理学的薬剤を含む９６−ウェルプレートに添加する。薬剤と薬剤の組み合わせをサンプルと約４８時間インキュベーションした後、赤血球を溶解し、悪性細胞を含む白血球を濃縮するために洗い流す。これにより、フローサイトメーターで評価する必要のある細胞の体積と数を大幅に減らすことで、スクリーニングプロセスをスピードアップする。蛍光標識抗体は、健康な細胞と悪性細胞とを区別するために添加され、蛍光標識したアネキシンＶは、悪性細胞内などの各細胞集団内でのアポトーシスのレベルを測定するために添加される。その後、スクリーニングが行われ、それぞれの薬剤組成物の活性が測定され、そして、その結果が分析、報告される。
１つの実施形態では、本方法は、サンプルをアリコートに分注し、そのアリコートをウェルプレートに分配することを含む。これらのウェルプレートは、様々な濃度で個々の薬剤または薬剤の併用を含む。１つの実施形態では、ウェルプレートは、細胞サンプルの導入前に様々な濃度で個々の薬剤またはその併用を含む。別の実施形態では、細胞サンプルは、個々の薬剤または併用の導入に先立って、様々な濃度でウェルに導入される。別の実施形態では、約２０、３０、５０、７５、１００、２００、３００、５００、７００、１０００、または２０００の化合物、前記の値の任意の２つで定義される範囲、または多くの化合物を含む、化合物の広範なライブラリーを使用することができる。
いくつかの実施形態では、アリコートは、ウェルあたり検出可能な数の疾患細胞を含む。１つの実施形態では、アリコートは、ウェルあたり約５００個以上の疾患細胞または腫瘍細胞を含む。別の実施形態では、アリコートはウェルあたり約５，０００個以上の疾患細胞または腫瘍細胞を含む。別の実施形態では、アリコートはウェルあたり約１０，０００個以上の疾患細胞または腫瘍細胞を含む。別の実施形態では、アリコートはウェルあたり約２０，０００個以上の疾患細胞または腫瘍細胞を含む。別の実施形態では、アリコートはウェルあたり約４０，０００個以上の疾患細胞または腫瘍細胞を含む。サンプルの試験は並行して実行され得る。１つの実施形態では、少なくとも２つのアリコートは、免疫表現型の識別を可能にするために並行して試験される。加えて、何らの薬剤を含まない対照ウェルは、薬剤治療に関連付けられないアポトーシスの自然レベルを識別するために含めることができる（図示せず）。１つの実施形態では、本方法は、サンプル中のアポトーシスの自然レベルを識別するために対照ウェルを使用する。
異なる薬剤組成物をアリコートとインキュベーションするための時間は、異なる場合がある。１つの実施形態では、時間は最大約２４時間である。別の実施形態では、時間は最大約４８時間である。別の実施形態では、時間は最大約７２時間である。別の実施形態では、時間は最大約９６時間である。別の実施形態では、時間は最大約１２０時間である。指定された時間のインキュベーションの後で、薬剤組成物に曝されるサンプルのアリコートは、緩衝剤で処理されて赤血球集団を溶解し、白血球集団を濃縮する。１つの実施形態では、当該分野で知られている緩衝剤は、赤血球集団を溶解するために使用される。それから、各ウェルは、フローサイトメトリーを用いてアポトーシスを検出する試薬と共にインキュベーションされる。１つの実施形態では、試薬はアネキシンＶである。
フローサイトメトリーを用いて、各細胞型に対する各薬剤の効果を評価すること、および各薬剤により誘導される選択的な細胞死のレベルを定量化することは可能である。それから、結果が評価され、必要に応じて、以前に同定された１０種類の最良の薬剤組成物や濃度などの最も関連性の高い結果をより詳細に確認するために、新しい試験をさらなるサンプルやアリコートを用いて開始することができる。白血病細胞などの腫瘍細胞でのアポトーシスを選択的に誘導することができる適切な薬剤または薬剤組成物の選択は、アッセイが患者のサンプルに対して実行された後に行うことができる。１つの実施形態では、約５〜２０種類の薬剤組成物が識別され、新鮮なサンプルで再試験される。特定の実施形態では、５種類の最良の薬剤組成物が識別され、新鮮なサンプルで再試験される。別の特定の実施形態では、１０種類の最良の薬剤組成物が識別され、新鮮なサンプルで再試験される。別の特定の実施形態では、２０種類の最良の薬剤組成物が識別され、新鮮なサンプルで再試験される。
本明細書で提供される方法は、様々な患者の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に対して現在承認されているいくつかの薬剤を分析するために使用されている。例えば、エクスビボの患者サンプルの悪性細胞でアポトーシスを誘導する際に個々に承認された細胞毒性薬剤の有効性が図４に提供される。図４は、薬剤応答において人により変動があることを証明し、個別化医療試験として本明細書に記載の方法の可能性を強調している。
１つの実施形態では、本方法は、患者のサンプルの９０％を超えるアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルの７５％を超えるアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルの５０％を超えるアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。
図４は、本明細書に記載の方法も患者のサンプルでアポトーシスを一般的に誘導しない薬剤組成物を検出できることを証明している。アポトーシスを誘導することができないことは、薬剤耐性に対する患者の遺伝的素因や薬剤に対する腫瘍固有の耐性の結果である可能性がある。どちらかの理由から薬剤組成物がアポトーシスを誘導することができないことを予測する能力が望まれる。１つの実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおける９０％未満のアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおける７５％未満のアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおける５０％未満のアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおける３０％未満のアポトーシスを誘導する薬剤組成物を識別する。
最近取得され、凝固を避けるためにヘパリン処理され、そして必要に応じて希釈された全末梢血または骨髄のサンプルなどの全サンプルの使用は、本明細書に記載の方法の有利な特徴である。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、血液サンプルを使用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、全血サンプルを使用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、全末梢血サンプルを使用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、骨髄サンプルを使用する。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、動物モデルから採取されたサンプルを使用する。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、マウスモデルから採取されたサンプルを使用する。共通のインビトロのアッセイだけが、腫瘍細胞を含み、そして対応する多形核リンパ球、赤血球、タンパク質、および他の血漿要素を洗浄により捨てる単核球画分を分離するので、全サンプルは有利である。これは薬剤の効果が評価される生物学的な環境を厳しく変える。対照的に、本明細書に記載の方法は、血漿中の赤血球だけでなく、各薬剤の約９０％〜９８％と一般に結合するアルブミンなどの蛋白質を維持することができる。
従って、本明細書に記載のアッセイに用いられる薬剤の濃度は、患者の血漿中に存在する実際の薬剤濃度に近いと考えることができる。全サンプルを使用することも重要であり、それは、腫瘍細胞のアポトーシス誘導についてキャンパスやリツキシマブなどの抗体の効果を観察するのを容易にするからである。アポトーシスの割合よりもむしろ細胞枯渇の割合などの異なる計量が重要である場合もある。両方の計量はアポトーシスを測定するけれども、細胞枯渇は、薬剤なしの対照のアリコートと比較して、もはや生きていない細胞をカウントする。直接的なアポトーシスの検出は、測定時にアポトーシスを受けている細胞をカウントする。その相違は、アポトーシス後、壊死に入り、もはやフローサイトメーターで検出することができない細胞の数である。測定の時間に応じて、これら２つのアッセイでは、異なる結果を報告する場合がある。例えば、より短い検出時間（例えば、２４時間）では、細胞枯渇と細胞アポトーシスは類似している。しかし、長い検出時間（例えば、４８〜７２時間）では、最初にアポトーシスを受けて、もはや検出できない細胞の数が増加するに従って、これらの測定値は異なる。アポトーシスを誘導するリツキシマブについて、それは、共通のインビトロアッセイで除去される単核球画分に見られる補体を必要とする。その結果、本明細書に記載の方法は、最初の細胞微小環境条件が分析されたサンプル中でかなり維持されるのを可能とする。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、実質的に最初の細胞微小環境を維持する。
本明細書に記載される自動化フローサイトメトリーのプラットフォームは、エクスビボでの患者の血液サンプル中の多数の薬剤組成物の変数をスクリーニングすることのできる初のプラットフォームである。このプラットフォームは、個々の患者におけるアポトーシス誘導のための複数の薬剤の併用の診査を可能とする。血液専門医は、治療プロトコル（例えば、臨床試験を通じて検証されるように）に正式に合意している薬剤と薬剤併用のみを一般的に利用するので、本明細書に記載の方法および装置は、既存の治療プロトコルにおける薬剤および薬剤組成物の評価を好ましくは含む。これらの治療プロトコルは、特定の国で認められるプロトコルを含むことができる。これらの治療プロトコルはまた、それらはもはや好ましい治療プロトコルでないとしても、古い承認されたプロトコルも含むことができる。新しい実験的なプロトコル（例えば、なお臨床試験のもの）もまた含まれ、承認薬剤またはまだ第ＩＩ相または第ＩＩＩ相臨床試験の薬剤の新しい薬剤組成物を含む。本明細書に記載の方法および装置は、また、承認薬と臨床試験の第ＩＩ相と第ＩＩＩ相の薬剤を含む、血液学的悪性腫瘍の各適応症のための薬剤の併用を評価することもできる。
個別化された患者の治療を導くために先に使用されたＩＴＲＴのエクスビボ試験は、個々の薬剤、または非常に少数の薬剤の併用に限定された。複数の薬剤の併用、例えば、ＥｘｖｉＴｅｃｈプラットフォームを使用して評価することによる著しい利点は、図２２で示される。図２２のＣＬＬ患者のサンプルでは、個々のＣＬＬ薬剤（左）は、効果がなく、このことは有効でない治療を示唆した。しかし、これらの同じ薬剤は、すべての白血病細胞（右）を除去するに際して非常に有効であった３種類の併用を生成したが、これは、薬剤感受性の治療としての可能性を示唆した。このように、逆の予測は、現在の治療プロトコルで使用されている個々の薬剤または薬剤併用のみを評価することによりなされたであろう。図２２は、血液学的腫瘍の効果的な治療のために極めて重要であり得た情報−臨床応答の欠如を予測する耐性プロトコル（中央）と良好な臨床応答を予測する高感受性プロトコル（右）を示している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の個別化医療試験は、各薬剤または薬剤併用の５種類の異なる濃度を評価する。これは単回投与のデータよりも有効性のより正確な薬理学的判断を提供する最小限の用量−応答曲線が決定されるのを可能にする。５点が、シグモイド用量応答曲線に適合するかどうかを分析することによって品質管理をまた容易にする。ＣＬＬサンプルについて、上記の図２２で説明したのと同じデータが、図２３〜２５における５点用量応答曲線に示される。
エクスビボでの薬剤併用の評価では、相乗効果とも呼ばれる併用された薬剤間に陽性または陰性の協同作用があるかどうかを判断することが重要である。このようなエクスビボでの協同作用は、患者のインビボでの協同作用を予測する可能性がある。薬剤間の陽性の相乗効果は、高い治療指数の毒性と比較して、有効性のありそうな増加を示す。細胞毒性薬剤の高い毒性の性質を考えると、それらの治療指数を増加させることは、治療上重要となり得た。したがって、薬剤の相乗効果を定量化するいくつかの努力があり、そして最も一般的に使用される方法は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙ（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４，２２：２７−５５）の方法である。図２６は、２人のＣＬＬ患者サンプルのフルダラビンとマホスファミド（シクロホスファミドの代謝物および有効成分）の相乗的併用を示しており、ここで、併用の潜在的な相乗効果を特徴づけるためにプログラムＣａｌｃｕｓｙｎ（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４，２２：２７−５５）を用いて協同指数（ＣＩ）が算出された。図２７は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法を使用して、図２６からの患者Ｐ２．０１４９に見られる相乗効果のより精巧な算出を示している。
薬剤と薬剤併用の有効性は、また、それらの動力学によって影響を受ける可能性がある。図２８は、承認された細胞毒性薬剤のフルダラビンと非細胞毒性抗うつ薬のセルトラリンによるＣＬＬサンプルの異なる動力学的挙動を示す。セルトラリン（右のパネル）は、２４時間以内にすべての悪性細胞を除くが（右上のパネル）、一方、フルダラビンは４８時間を必要とする（左下のパネル）。しかし、両方の薬剤は、最大のアポトーシスを誘導するためには、サンプルとの３０分だけのインキュベーションを必要とする。これは、アネキシンＶで測定されるアポトーシスを完全に検出できるには２４時間または４８時間を必要とするが、悪性細胞は、インキュベーションの短期間内にアポトーシスに関してプログラムされる。１つの実施形態では、薬剤組成物は、約１０分、１５分、２０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、または前掲値の任意の２つによって定義される範囲の期間、インキュベーションされる。別の実施形態では、アポトーシスは、インキュベーション開始後、約２４時間、４８時間、もしくは７２時間、または前掲値の任意の２つによって定義される範囲における時点で測定される。
本明細書に記載した方法論が示すように、このプラットフォームは、異なる組成や濃度を表わす薬剤と混合された血液サンプルを含む何百〜何千の個々のウェルを評価することができる。薬剤組成物の制限は、プラットフォームの処理能力よりもむしろ患者から得た血液学的サンプルのボリュームおよび細胞性によって規定される。ウェルあたり約２０，０００個の細胞などの各薬剤組成物に使用される小さいボリュームのため、通常のボリュームのサンプルよりも大きいボリュームのサンプルで、得られたサンプルあたり最大約１０，０００個以上の薬剤組成物またはサンプルあたり最大２０，０００個以上の薬剤組成物を評価することが可能である。そのような多数の併用は、個々の患者に投与することができる代替の多剤療法薬剤組成物を評価するのに十分である。１つの実施形態では、スクリーニングは、ウェルあたり最小値の約５００個の腫瘍細胞を用いて実行される。別の実施形態では、スクリーニングは、ウェルあたり約１，０００個の腫瘍細胞を用いて実行される。別の実施形態では、スクリーニングは、ウェルあたり合計約２０，０００個の腫瘍細胞を用いて実行される。別の実施形態では、スクリーニングは、ウェルあたり合計約５０，０００個の腫瘍細胞を用いて実行される。患者サンプルあたりの悪性細胞数は、実質的にゼロから十億を超える値に変動することが可能であり、そのため、細胞の総数に対するそれらの相対的な割合もまた変動する可能性がある。
図５は、個々の患者に最適な多剤療法治療を識別するのを探索することができる潜在的な薬剤組成物の数を示している。仮に、特定の適応症に対して承認された最大１５種類の薬剤は、図５の左側の最初の列で検討される。今後数年間で承認されることが期待されるいくつかの新しい薬剤と血液学的腫瘍のためのパイプラインの多くの薬剤がある。細胞毒性治療（すなわち、併用薬剤）の影響を緩和するために、血液学的腫瘍の患者に与えられる多くの非細胞毒性薬剤もあり、その範囲は、患者あたり５〜１０種類の薬剤が一般的である。これらの薬剤は、感染症を防止するための抗生物質や抗ウイルス剤に対する悪心のために、胃保護薬から制吐剤に変更する。図５で選ばれた１５種類の薬剤は、特定の適応症に対して考慮されるべき多くの承認された細胞毒性薬剤として代表するものであり、したがって、特定の臨床実務の代表とみなすことができる。図５の１５種類の薬剤の選択は、単なる例示であり、本発明を限定するものとして決して解釈されるべきではない。図５において、最大４種類の異なる薬剤の併用（２列目）は、５種類と６種類の薬剤を併用するプロトコルがあるとしても、代表的な平均の数として考えられた。本明細書に記載のウェルプレートの設計は、単一の９６ウェルプレートでの最大２２種類の薬剤の使用方法を例示する。さらに、異なる数の薬剤が、異なる数のウェルを有するプレートを用いて分析することができる。１つの実施形態では、約５種類の薬剤が分析のために選択される。別の実施形態では、約１０種類の薬剤が、分析のために選択される。別の実施形態では、約２０種類の薬剤が、分析のために選択される。別の実施形態では、約４０種類の薬剤が、分析のために選択される。
図５に例示されるように、第２番目の列で１５種類の薬剤のさまざまな併用の数は、１９４０であり、そして１４種類の薬剤に対しては、１４７０になる。これらの結果は、治療の決定を通知するために使用される可能性があるため、それらは、薬剤または薬剤併用毎に５種類の濃度（第３列）で好ましくは実行される。さらに、少なくとも２つのインキュベーション時間の評価は、動力学的パラメーター（第４列）の評価を可能とする。しかし、５用量および／または複数のインキュベーション時間の分析の実行は、限定として解釈されるべきではない。
前項で論じた変数（すなわち、異なる薬剤の数、複数の測定、様々な薬剤濃度、および様々なインキュベーション時間）のすべての場合であっても、最大約１０，０００種類または２０，０００種類の薬剤組成物を評価することができる自動化プラットフォームは、図５の非網掛け領域として示される仮想的なシナリオのすべてをカバーする。治療スペースは、現在の方法で図５の灰色で網掛け表示された領域を人が探索するのを可能にする。現在の方法で探索することができる薬剤組成物は、最大３０種類または３５種類であり、灰色で網掛け表示されている。表の残りの部分は、ＥｘｖｉＴｅｃｈのプラットフォームで探索できる薬剤組成物の新しいスペースを表す。現在利用可能なマニュアルのプラットフォームは、最大約３５種類の個々の状態を評価することができるだけであるので、個別化医療試験として、その潜在的な使用が制限されている。エクスビボの血液サンプル中の薬剤効果の自動化は、個別化医療適用にとって当然のことながら有利でかつ革新的となる。１つの実施形態では、この方法は、１，０００未満の薬剤組成物を分析する。別の実施形態では、この方法は、約１０，０００の薬剤組成物を分析する。別の実施形態では、この方法は、２０，０００未満の薬剤組成物を分析する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、最大約２０，０００の薬剤組成物の分析を可能とし、それは、最大１５種類の薬剤の１つ、２つ、３つ、または４つの薬剤併用をカバーする。いくつかの実施形態では、インキュベーション時間もまた変動する。例えば、図５（第４列）に示すように、１回のインキュベーション時間より多くを含めることは、試験する併用の数を増加させる。いくつかの実施形態では、ＥｘｖｉＴｅｃｈの使用は、患者への個別化治療に必要な大多数の薬剤組成物を表す、図５での非網掛け部分の測定を可能にする。
ＥｘｖｉＴｅｃｈプラットフォームはまた、何千という薬剤、特に悪性細胞のアポトーシスを選択的に誘導する薬剤を探索するために、患者サンプルあたり約１，０００の承認された薬剤をスクリーニングするために使用することができる。驚くべきことに、かなりの数の承認された非細胞毒性薬剤は、各適応症に対して承認された細胞毒性薬剤と同じ有効性で、悪性細胞のアポトーシスを誘導することが示された。図６は、血液悪性腫瘍に対して非承認の５種類の非細胞毒性薬剤（左）が、３種類の承認された細胞毒性ＣＬＬ薬剤（右）と同様の有効性でＣＬＬ悪性細胞を如何に除くかを示している。図７は、これらの薬剤の１つである抗うつ薬パロキセチンの用量応答を示し、健康なＴ細胞とＮＫ細胞に比べて悪性Ｂ細胞に優先的にアポトーシスを誘導することを証明している。図８は、これらの非細胞毒性薬剤の１つであるセルトラリンが、承認された細胞毒性ＣＬＬ薬剤（２４時間対４８時間）（左）よりも如何に速く悪性ＣＬＬ細胞を除去するかを示す。最も効果的な非細胞毒性薬剤５種類のうちの３種類は、抗うつ薬のパロキセチン、フルオキセチン、およびセルトラリン−同じ薬理学的ファミリーに属する薬剤である。図９は、６種類のセロトニン再取り込み阻害剤のうちの３種類のみが、悪性ＣＬＬ細胞でのアポトーシスを誘導するのに如何に有効であるかを示している。これは、これらの効果が必ずしも薬剤の薬理学的分類に関連していないこと、そして、本明細書で提案されているエクスビボでの個別化医療試験は、これらの活性を識別するために使用することができることを証明している。
複数の安全な非細胞毒性の承認薬剤が、腫瘍細胞に対して有効であった予想外の発見は、より広範な評価を促した。最初に、２，３のそのような薬剤のみが、任意の所定サンプルでも有効であったが、それらは非選択的な効果を放棄していた。２３種類のＣＬＬサンプル中の２，０００種類の薬剤のスクリーニングから由来する図１０は、これらの承認された非細胞毒性薬剤の有効性が患者により如何にして途方もなく変化することができるかを示している。薬剤が悪性細胞の８０％超を殺すならば、それは最も有効な細胞毒性薬剤と同様の基準であるが、薬剤は有効であると定義された。３種類の薬剤のみが、患者の８０％を超えて有効であった一方で、２２９種類の薬剤は、患者サンプルの２０％未満で有効であった。これは、非細胞毒性薬剤が、エクスビボで悪性細胞に対して有効であることを示すが、それらは、患者により非常に大きな度合いの変動を示す。それにもかかわらず、ほとんどすべてのＣＬＬ患者のサンプルでは、５〜１０種類の非細胞毒性薬剤が、エクスビボでの悪性細胞に対して有効であると認められた。インビボでのこの効果の予測可能性は不明であるが、薬剤動態学および他の要因（例えば、潜在的な役割を果たす製剤）を用いて、患者に投与される５〜１０種類の非細胞毒性薬剤の効果は、重要な治療的な利点を示すことができた。
エクスビボで有効な非細胞毒性薬剤のいくつかは、血液悪性腫瘍の患者に投与される細胞毒性薬剤の影響を緩和するために使用される薬剤（すなわち、併用薬）である。図１２は、プロトンポンプ阻害薬オメプラゾールと抗ウイルス薬アシクロビルが、細胞毒性薬剤の効果に似て悪性細胞に対してエクスビボで有意な効果を示したＣＬＬサンプルの一例を示している。表４は、これらの併用薬剤の一部を列挙する。
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非細胞毒性の承認薬剤の一部は、細胞毒性薬剤の効果（すなわち、化学増強剤として）を増強するのに治療的に有益であった。一例が、図１１に示され、ここで、抗うつ薬セルトラリンの低濃度は、細胞毒性薬剤のクロラムブシルの低濃度の効果を増強している。
本発明の方法は、多数の変数を分析することを目的とするのであるから、９６−ウェルプレートは、多剤療法治療の潜在的な変動を探索するように設計されている。より大きいまたはより少ない数のウェルを含む他のプレートもまた使用することができる。１つの実施形態では、１５３６ウェルプレートが使用される。別の実施形態では、３８４ウェルプレートが使用される。別の実施形態では、９６ウェルプレートが使用される。
図１３〜１８および実施例９〜１４は、以下の適応症のための患者サンプルの分析のための９６ウェル・プレート・フォーマットの使用を説明する：慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄芽球性白血病（Ｍ３ではない）、および急性骨髄芽球性白血病Ｍ３。各適応症に対するプレートの設計は、血液悪性腫瘍の治療のためのスペイン語プログラム（Ｐｒｏｇｒａｍａ ｐａｒａ ｅｌ Ｔｒａｔａｍｉｅｎｔｏ ｄｅ Ｈｅｍｏｐａｔｉａｓ Ｍａｌｉｇｎａｓ（ＰＥＴＨＥＭＡ））の適応症に対する治療プロトコルを現在満たす薬剤を含んでいる。
１つの実施形態では、本方法は、臨床機関の承認されたプロトコルから選択された薬剤を分析する。特定の実施形態では、本方法は、ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルから選択された薬剤を分析する。良い設計は、ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルの下で単剤療法のための処方薬を利用し、また単剤療法の薬剤の併用を利用する。さらに、設計は、ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルの副作用を緩和するために処方された薬剤を利用し、また、これらの薬剤の併用を利用する。
１つの実施形態では、本方法は、承認された医薬品、および臨床試験ではまだ未承認の薬剤を含む細胞毒性薬剤を分析する。別の実施形態では、本方法は、細胞毒性薬剤の併用を分析する。さらなる実施形態では、本方法は、細胞毒性薬剤の副作用を治療するために処方された薬剤を分析する。さらなる実施形態では、本方法は、細胞毒性薬剤の副作用を治療するために処方された薬剤の併用を分析する。さらに、良い設計は、細胞毒性薬剤と細胞毒性薬剤の副作用を治療するために処方された薬剤との併用を利用する。１つの実施形態では、本方法は、細胞毒性薬剤と細胞毒性薬剤の副作用を治療するために処方された薬剤との併用を分析する。別の実施形態では、本方法は、承認されたか、あるいは臨床試験で、任意のすべての適応症のために処方された任意のすべての非細胞毒性薬剤を分析する。さらなる実施形態では、本方法は、非細胞毒性薬剤の併用を分析する。例えば、プレートの設計は、細胞毒性薬剤と非細胞毒性薬剤の併用を利用することができる。１つの実施形態では、本方法は、細胞毒性薬剤と非細胞毒性薬剤の併用を分析する。
血液学的腫瘍のための治療は、血液専門医が同意した特定の限られた数の治療プロトコルで規定されている。これらのプロトコルは、各薬剤の用量とタイミングを含めて細胞毒性かつ付加的な併用剤に対する多剤療法治療計画を定める。そのプロトコルは、各患者の年齢、健康状態、および疾患の状態などの変数に応じて異なる。プロトコルはまた、国ごとに異なる場合があるが、通常は自国内によく従う。用量範囲と探索すべき条件の何十から何百を必要とする異なる薬剤組成物によるこれらのプロトコル内では、なおかなりのばらつきが残っている。１つの実施形態では、臨床的に検証された試薬は、細胞のアポトーシスを評価するために使用される。別の実施形態では、臨床的に検証された試薬は、腫瘍細胞のサブタイプを識別する抗体と組み合わせて使用される。別の実施形態では、腫瘍細胞のサブタイプを識別するために使用される試薬は、最近のＥｕｒｏｆｌｏｗの規範（ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＥｕｒｏＦｌｏｗ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｎｅｌｓ ｆｏｒ ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｎ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｎｏｒｍａｌ，ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ，１４ｔｈ ＥＨＡ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＤＥ ４ Ｊｕｎｅ ２００９：Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１０に刊行予定（印刷中））に従って定義される。別の実施形態では、薬剤組成物は、特定の国で使用される血液学的治療のためのプロトコルから選択される。別の実施形態では、薬剤組成物は、特定の国で使用される血液学的治療のための古いプロトコルから選択される。別の実施形態では、薬剤組成物は、血液学的治療のために承認された薬剤の新しい併用として定義されている、特定の国で使用される実験的なプロトコルから選択される。別の実施形態では、薬剤組成物は、血液学的治療の臨床試験で評価されている薬剤を含むプロトコルから選択される。
治療プロトコルで使用される各薬剤の効果は、好ましくは個々に探索されるべきである。しかし、この探索は、制限として解釈されるべきではない。本明細書に記載の方法を使用して、単剤療法薬剤は個別に探索されるだけでなく、薬剤は一般に併用でのみ投与される。例えば、通常は併用でのみ投与される薬剤の個々のスクリーニングは、これらの薬剤の個々の効果の測定を可能にするデータを提供することができる。
１つの実施形態では、単剤療法の薬剤は、個々に分析される。別の実施形態では、典型的には併用でのみ投与される薬剤は、個別に分析される。細胞毒性薬剤と併用して一般に使用される非細胞毒性薬剤はまた、探索されるべきである（例えば、図１２のように）。これは抗生物質、制吐剤（抗悪心薬）、制酸剤、抗ウイルス剤などを含む。１つの実施形態では、本方法は、患者のサンプルでアポトーシスを誘導するオメプラゾールの能力を分析する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルでアポトーシスを誘導するアシクロビルの能力を分析する。
パロキセチンおよびセルトラリンなどの一部の非細胞毒性薬剤が、フルダラビンおよびクロラムブシルなどの細胞毒性薬剤の効果をそれぞれ調節−それらの効力を増強する（例えば、図１１で示されるように）ことができることを証明するために、確かに本明細書に記載の方法は使用されている。図６が示すように、単独で投与されたこれらの非細胞毒性薬剤のいくつかは、承認された細胞毒性薬剤と同様の有効性で悪性細胞のエクスビボでのアポトーシスを誘導することができる。１つの実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおいてアポトーシスを誘導する非細胞毒性薬剤を使用する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおいてアポトーシスを誘導する非細胞毒性薬剤の併用を使用する。別の実施形態では、本方法は、患者のサンプルにおいてアポトーシスを誘導する細胞毒性薬剤と非細胞毒性薬剤の併用を使用する。
予想に反して、特定の非細胞毒性薬剤は、健康な細胞を傷つけることなく悪性細胞を除去するが、このことは、そのような薬剤が選択的に悪性細胞を攻撃することを示す（例えば、図１２に見られるように）。このような予想外の結果は、血液学的腫瘍の治療に対して遠大なる含みを持たせる可能性がある。１つの実施形態では、この方法は、腫瘍細胞のアポトーシスを選択的に誘導する非細胞毒性薬剤を使用する。１つの実施形態では、エクスビボでの治療指数は、約１より大きい。別の実施形態では、エクスビボでの治療指数は、約５よりも大きい。別の実施形態では、エクスビボでの治療指数は、約１０より大きい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、血液、骨髄、リンパ節、または脾臓のサンプルなどの血液学的腫瘍に関与している組織中の白血病細胞と正常細胞の区別を可能にする。
さらに、アポトーシスを誘導する非細胞毒性薬剤の能力は、薬剤の薬理学的クラス内（例えば、図９に示すように）だけでなく、薬剤の薬理学的クラス間で変化する。１つの実施形態では、本方法は、特定の適応症の治療のためにまたは特定の適応症の治療の副作用を緩和するために患者に投与された薬剤と同じ薬理学的クラスから選択された薬剤を分析する。特定の実施形態では、本方法は、選択的セロトニン再取り込み阻害剤を分析する。さらに、本明細書に記載の方法は、細胞毒性薬剤のみまたは非細胞毒性薬剤のみの分析に限定されるものではない。確かに、非細胞毒性薬剤の細胞毒性薬剤との併用が望ましい場合があるが、それは、そのような併用が、細胞毒性薬剤単独の能力と比べて、患者のサンプルでアポトーシスを誘導するずっと大きな能力を有するからである（例えば、図１１に見られるように）。
本システムは、通常、一緒に投与される細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤などの２つのクラスの薬剤の併用を完全に分析することができる。１つの実施形態では、細胞毒性薬剤が投与される患者に処方される非細胞毒性薬剤が分析される。例えば、本明細書に記載の方法は、細胞毒性薬剤のフルダラビンと非細胞毒性選択的セロトニン再取り込み阻害剤により治療された患者のサンプルを分析するために使用することができる。特定の実施形態では、この方法は、細胞毒性薬剤のフルダラビンと非細胞毒性薬剤のパロキセチンにより治療を受けた患者のサンプルを分析するために使用される。血液学的腫瘍の場合は、患者の薬剤療法治療計画は、複数の薬剤の併用を含めることができる。１つの実施形態では、血液学的適応症のために処方された薬剤は、様々な併用で分析される。例えば、各患者は、平均で８から１０種類の薬剤を投与することができた。１つの実施形態では、５種類以上の薬剤組成物が分析される。主要な適応症のいくつかのプレートの好ましい設計は、以下の実施例に示される。
血液学的腫瘍に対するプロトコルベースの治療の現在の戦略は、医薬品開発の停滞の帰結である。この停滞は、血液専門医が彼ら自身、特定の薬に慣れるのを可能とし、各薬剤の最適な併用の合理的な評価を発展させることを可能にした。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、薬剤組成物に対する現在の科学的予測を検証するために使用される。しかし、２つの要因が、プロトコルベースの治療の現在の戦略を劇的に変えている。第１に、図４に示すように、各患者が化学療法に異なる応答をするという認識が、最近、医学研究の最前線に個別化医療をもたらした。分子生物学的手法やヒトゲノムの解読がもたらした革命は、血液学的腫瘍患者のサンプルのゲノム解析に大きな焦点があてられている。しかし、ゲノム研究の１０〜１５年は、危険部分母集団における患者の層別化を可能にしたが、個々の患者に治療を個別化することができなかった。この認識の結果は、個別化医療試験を使用して個々の患者を最適な治療法と一致させたいという願望を生み出す。しかし、現在のプロトコルは、本明細書に記載のプラットフォームが探索（図５に示すように）することができる利用可能な治療スペースの１〜５％未満を探索すると推定される。第２に、最近では血液学的腫瘍のために承認されたかなりの数の新薬があり、そして、いくつかの後期臨床候補薬剤も存在する。したがって、これらの疾患は、何年もの間、処方された同じ古い薬剤のシナリオからここ２，３年で承認された多くの新薬のシナリオに急速に移行している。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、古い薬剤、新薬、後期臨床候補薬剤、またはこれらの併用を評価するために使用される。
本明細書に記載の方法は、個別の患者ごとに薬剤を選択するために、そして、同様の適応症と現在の薬剤治療計画への応答を有する患者に対して薬剤を選択する場合に便利となる治療プロトコルでの傾向を識別するのに有用である。すべての患者は、悪性細胞を除去するために、選択された濃度で彼らの血流や骨髄にこれらの化合物を含むことになる。本明細書に記載の多剤療法個別化医療試験の利点の１つは、時には同時に投与された８〜１０種類の薬剤に達する多くの異なる薬剤組成物を探索する能力である。１つの実施形態では、複数の薬剤は、患者に同時に投与される。別の実施形態では、複数の薬剤は、患者に連続して投与される。本明細書において提供される薬剤の多くは、併用での投与については評価されていなかった。以下の実施例に示すように、併用されたこれらの薬剤に対するアポトーシス誘導に関して、明確で劇的な効果を観察することができる。
別の利点は、個別化されたベースで最適な薬剤組成物を決定する能力である。図１０に示すように、特定の薬剤組成物に対する患者の応答について大量のばらつきが発生する。実際に、３種類の薬剤のみが、２３人の患者のサンプルの８０％超に対して腫瘍細胞の８０％を超えてアポトーシスを誘導した。対照的に、２２９種類の異なる薬剤は、２０％未満の患者サンプル（１〜４）に関して、腫瘍細胞の８０％を超えてアポトーシスを誘導した。これは、大部分の非細胞毒性薬剤が、非常に少数の患者に有効であることを示唆し、細胞毒性薬剤よりもより大きな程度の人から人による変化を証明している。しかし、血液学的腫瘍の患者は、一般的に細胞毒性薬剤の効果を緩和するために、５〜１０種類の非細胞毒性併用薬が投与される。従って、図１２のように、これらの併用薬の中で悪性細胞のエクスビボでのアポトーシスを誘導する際に、著しい有効性を示すサブグループを選択する相加効果は、意義深いものとなる。
個々の患者に対する潜在的に最も効果的な薬剤を識別することに加えて、これらの結果はまた、患者のサブグループへの層別化を可能にし、細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤を含むこれらのサブグループの新たな治療プロトコルを可能とする。１つの実施形態では、薬剤治療のプロトコルは、個々の患者ごとに選択される。別の実施形態では、薬剤治療のプロトコルは、１〜４人の患者のサンプルにおけるその有効性に基づいて選択される。別の実施形態では、薬剤治療のプロトコルは、５〜９人の患者のサンプルにおけるその有効性に基づいて選択される。別の実施形態では、薬剤治療のプロトコルは、１０〜１４人の患者のサンプルにおけるその有効性に基づいて選択される。別の実施形態では、薬剤治療のプロトコルは、１５〜１９人の患者のサンプルにおけるその有効性に基づいて選択される。別の実施形態では、薬剤治療のプロトコルは、２０人超の患者のサンプルにおけるその有効性に基づいて選択される。本明細書に記載の方法は、治療プロトコルについて現在利用し得るよりも多くの選択肢を提供する。
個別化医療試験の１つの利点は、個別に特定の薬剤の治療計画を最適化する能力である。多剤療法の治療計画では、いくつかの異なる薬剤が併用されて患者に投与される場合、個々の薬剤の薬剤動態と典型的な用量応答曲線は、型にはまらない場合がある。本明細書に記載の方法を使用して、最適な用量は、特定の患者の用量応答曲線における最適条件の認識に基づいて、腫瘍と正常細胞の両方について観察され得る。
様々な薬剤と薬剤の併用は、本明細書に記載の方法および装置で利用することができる。例えば、細胞毒性薬剤を含む薬剤の併用を使用することができる。また、非細胞毒性薬剤を含む薬剤の併用を使用することもできる。さらに、細胞毒性薬剤と非細胞毒性薬剤との薬剤の併用を使用することができる。
単独でまたは他の化合物と併用して使用することができる細胞毒性化合物のいくつかの例としては、フルダラビン（「１」として指定）、クロラムブシル（「２」として指定）、ミトキサントロン（「３」として指定）、ビンクリスチン（「４」として指定）、ミトキサントロン（「５」として指定）、シクロホスファミド（「６」として指定）、アドリアマイシン（「７」として指定）、およびドキソルビシン（「８」として指定）が挙げられる。
単独でまたは他の化合物と併用して使用することができる非細胞毒性化合物のいくつかの例としては、５−アザシチジン（「１」として指定）、アレムツズマブ（「２」として指定）、アミノプテリン（「３」として指定）、アモナフィド（「４」として指定）、アムサクリン（「５」として指定）、ＣＡＴ−８０１５（「６」として指定）、ベバシズマブ（「７」として指定）、ＡＲＲ Ｙ５２０（「８」として指定）、三酸化ヒ素（「９」として指定）、ＡＳ１４１３（「１０」として指定）、Ａｔｒａ（「１１」として指定）、ＡＺＤ６２４４（「１２」として指定）、ＡＺＤ１１５２（「１３」として指定）、バノキサントロン（「１４」として指定）、ベヘノイルアラ−Ｃ（「１５」として指定）、ベンダムスチン（「１６」として指定）、ブレオマイシン（「１７」として指定）、ブリナツモマブ（「１８」として指定）、ボルテゾミブ（「１９」として指定）、ブスルファン（「２０」として指定）、カルボプラチン（「２１」として指定）、ＣＥＰ−７０１（「２２」として指定）、クロラムブシル（「２３」として指定）、クロロデオキシアデノシン（「２４」として指定）、クラドリビン（「２５」として指定）、クロファラビン（「２６」として指定）、ＣＰＸ−３５１（「２７」として指定）、シクロホスファミド（「２８」として指定）、シクロスポリン（「２９」として指定）、シタラビン（「３０」として指定）、シトシンアラビノシド（「３１」として指定）、ダサチニブ（「３２」として指定）、ダウノルビシン（「３３」として指定）、デシタビン（「３４」として指定）、脱グリコシル化−リシン−Ａ鎖−結合抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２イムノトキシン（「３５」として指定）、デキサメタゾン（「３６」として指定）、ドキソルビシン（「３７」として指定）、エラシタラビン（「３８」として指定）、エンチノスタット（「３９」として指定）、エプラツズマブ（「４０」として指定）、エルウィナーゼ（「４１」として指定）、エトポシド（「４２」として指定）、エベロリムス（「４３」として指定）、メシル酸エキサテカン（「４４」として指定）、フラボピリドール（「４５」として指定）、フルダラビン（「４６」として指定）、ホロデシン（「４７」として指定）、ゲムシタビン（「４８」として指定）、ゲムツズマブ−オゾガマイシン（「４９」として指定）、ホモハリングトニン（「５０」として指定）、ヒドロコルチゾン（「５１」として指定）、ヒドロキシカルバミド（「５２」として指定）、イダルビシン（「５３」として指定）、イホスファミド（「５４」として指定）、イマチニブ（「５５」として指定）、インターフェロンα２ａ（「５６」として指定）、ヨウ素Ｉ１３１モノクローナル抗体ＢＣ８（「５７」として指定）、イホスファミド（「５８」として指定）、イソトレチノイン（「５９」として指定）、ラロムスチン（「６０」として指定）、Ｌ−アスパラギナーゼ（「６１」として指定）、レナリドミド（「６２」として指定）、レスタウルチニブ（「６３」として指定）、マホスファミド（「６４」として指定）、メルファラン（「６５」として指定）、メルカプトプリン（「６６」として指定）、メトトレキサート（「６７」として指定）、メチルプレドニゾロン（「６８」として指定）、メチルプレドニゾン（「６９」として指定）、ミドスタウリン（「７０」として指定）、ミトキサントロン（「７１」として指定）、ネララビン（「７２」として指定）、ニロチニブ（「７３」として指定）、オブリメルセン（「７４」として指定）、パクリタキセル（「７５」として指定）、パノビノスタット（「７６」として指定）、ペガスパルガーゼ（「７７」として指定）、ペントスタチン（「７８」として指定）、ピラルビシン（「７９」として指定）、ＰＫＣ４１２（「８０」として指定）、プレドニゾロン（「８１」として指定）、プレドニゾン、ＰＳＣ−８３３（「８２」として指定）、ラパマイシン（「８３」として指定）、リツキシマブ（「８４」として指定）、リバビリン（「８５」として指定）、サパシタビン（「８６」として指定）、ジナシクリブ（「８７」として指定）、ソラフェニブ（「８８」として指定）、ソラフェニブ（「８９」として指定）、ＳＴＡ−９０９０（「９０」として指定）、タクロリムス（「９１」として指定）、タネスピマイシン（「９２」として指定）、テムシロリムス（「９３」として指定）、テニポシド（「９４」として指定）、テラメプロコル（「９５」として指定）、サリドマイド（「９６」として指定）、チオグアニン（「９７」として指定）、チオテパ（「９８」として指定）、チピファルニブ（「９９」として指定）、トポテカン（「１００」として指定）、トレオスルファン（「１０１」として指定）、トロキサシタビン（「１０２」として指定）、ビンブラスチン（「１０３」として指定）、ビンクリスチン（「１０４」として指定）、ビンデシン（「１０５」として指定）、ビノレルビン（「１０６」として指定）、ボレロキシン（「１０７」として指定）、ボリノスタット（「１０８」として指定）、エトポシド（「１０９」として指定）、およびゾスキダル（「１１０」として指定）が挙げられる。
単独でまたは他の化合物と併用して使用することができる非細胞毒性化合物のいくつかの例としては、酸化アルミニウム水和物（「１１１」として指定）、ロラゼパム（「１１２」として指定）、アミカシン（「１１３」として指定）、メロペネム（「１１４」として指定）、セフェピム（「１１５」として指定）、バンコマイシン（「１１６」として指定）、テイコプラニン（「１１７」として指定）、オンダンセトロン（「１１８」として指定）、デキサメタゾン（「１１９」として指定）、アムホテリシンＢ（リポソーム製剤）（「１２０」として指定）、カスポフギン（「１２１」として指定）、イトラコナゾール（「１２２」として指定）、フルコナゾール（「１２３」として指定）、ボリコナゾール（「１２４」として指定）、トリメトプリム（「１２５」として指定）、スルファメトキサゾール（「１２６」として指定）、Ｇ−ＣＳＦ（「１２７」として指定）、ラニチジン（「１２８」として指定）、ラスブリカーゼ（「１２９」として指定）、パラセタモール（「１３０」として指定）、メタミゾール（「１３１」として指定）、塩化モルヒネ（「１３２」として指定）、オメプラゾール（「１３３」として指定）、パロキセチン（「１３４」として指定）、フルオキセチン（「１３５」として指定）、セルトラリン（「１３６」として指定）が挙げられる。
さらに、ほとんどの国では、特定の薬剤の併用は、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬ、およびＮＨＬの治療のための好ましいまたは標準的な細胞毒性療法を表す。これらの既存の治療法は、数字の識別子を割り当てることができ、以下の組み合わせで、さらなる薬剤とさらに併用して使用することができる。
♯．♯の番号形式で示される上記の数字の識別子を使用して、少なくとも１種類の細胞毒性化合物を含む、２種類の化合物の併用の例が以下にリストされるが、それらは、その併用に他の化合物をさらに含んでもよいし、含まなくてもよい。
1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 1.10, 1.11, 1.12, 1.13, 1.14, 1.15, 1.16, 1.17, 1.18, 1.19, 1.20, 1.21, 1.22, 1.23, 1.24, 1.25, 1.26, 1.27, 1.28; 1.29, 1.30, 1.31, 1.32, 1.33, 1.34, 1.35, 1.36, 1.37, 1.38, 1.39, 1.40, 1.41, 1.42, 1.43, 1.44, 1.45, 1.46, 1.47, 1.48, 1.49, 1.50, 1.51, 1.52, 1.53, 1.54, 1.55, 1.56, 1.57, 1.58, 1.59, 1.60, 1.61, 1.62, 1.63, 1.64, 1.65, 1.66, 1.67, 1.68, 1.69, 1.70, 1.71, 1.72, 1.73, 1.74, 1.75, 1.76, 1.77, 1.78, 1.79, 1.80, 1.81, 1.82, 1.83, 1.84, 1.85, 1.86, 1.87, 1.88, 1.89, 1.90, 1.91, 1.92, 1.93, 1.94, 1.95, 1.96, 1.97, 1.98, 1.99, 1.100, 1.101, 1.102, 1.103, 1.104, 1.105, 1.106, 1.107, 1.108, 1.109, 1.110, 1.111, 1.112, 1.113, 1.114, 1.115, 1.116, 1.117, 1.118, 1.119, 1.120, 1.121, 1.122, 1.123, 1.124, 1.125, 1.126, 1.127, 1.128, 1.129, 1.130, 1.131, 1.132, 1.133, 1.134, 1.135, 1.136; 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 2.10, 2.11, 2.12, 2.13, 2.14, 2.15, 2.16, 2.17, 2.18, 2.19, 2.20, 2.21, 2.22, 2.23, 2.24, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28; 2.29, 2.30, 2.31, 2.32, 2.33, 2.34, 2.35, 2.36, 2.37, 2.38, 2.39, 2.40, 2.41, 2.42, 2.43, 2.44, 2.45, 2.46, 2.47, 2.48, 2.49, 2.50, 2.51, 2.52, 2.53, 2.54, 2.55, 2.56, 2.57, 2.58, 2.59, 2.60, 2.61, 2.62, 2.63, 2.64, 2.65, 2.66, 2.67, 2.68, 2.69, 2.70, 2.71, 2.72, 2.73, 2.74, 2.75, 2.76, 2.77, 2.78, 2.79, 2.80, 2.81, 2.82, 2.83, 2.84, 2.85, 2.86, 2.87, 2.88, 2.89, 2.90, 2.91, 2.92, 2.93, 2.94, 2.95, 2.96, 2.97, 2.98, 2.99, 2.100, 2.101, 2.102, 2.103, 2.104, 2.105, 2.106, 2.107, 2.108, 2.109, 2.110, 2.111, 2.112, 2.113, 2.114, 2.115, 2.116, 2.117, 2.118, 2.119, 2.120, 2.121, 2.122, 2.123, 2.124, 2.125, 2.126, 2.127, 2.128, 2.129, 2.130, 2.131, 2.132, 2.133, 2.134, 2.135, 2.136; 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10, 3.11, 3.12, 3.13, 3.14, 3.15, 3.16, 3.17, 3.18, 3.19, 3.20, 3.21, 3.22, 3.23, 3.24, 3.25, 3.26, 3.27, 3.28; 3.29, 3.30, 3.31, 3.32, 3.33, 3.34, 3.35, 3.36, 3.37, 3.38, 3.39, 3.40, 3.41, 3.42, 3.43, 3.44, 3.45, 3.46, 3.47, 3.48, 3.49, 3.50, 3.51, 3.52, 3.53, 3.54, 3.55, 3.56, 3.57, 3.58, 3.59, 3.60, 3.61, 3.62, 3.63, 3.64, 3.65, 3.66, 3.67, 3.68, 3.69, 3.70, 3.71, 3.72, 3.73, 3.74, 3.75, 3.76, 3.77, 3.78, 3.79, 3.80, 3.81, 3.82, 3.83, 3.84, 3.85, 3.86, 3.87, 3.88, 3.89, 3.90, 3.91, 3.92, 3.93, 3.94, 3.95, 3.96, 3.97, 3.98, 3.99, 3.100, 3.101, 3.102, 3.103, 3.104, 3.105, 3.106, 3.107, 3.108, 3.109, 3.110, 3.111, 3.112, 3.113, 3.114, 3.115, 3.116, 3.117, 3.118, 3.119, 3.120, 3.121, 3.122, 3.123, 3.124, 3.125, 3.126, 3.127, 3.128, 3.129, 3.130, 3.131, 3.132, 3.133, 3.134, 3.135, 3.136; 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 4.10, 4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16, 4.17, 4.18, 4.19, 4.20, 4.21, 4.22, 4.23, 4.24, 4.25, 4.26, 4.27, 4.28; 4.29, 4.30, 4.31, 4.32, 4.33, 4.34, 4.35, 4.36, 4.37, 4.38, 4.39, 4.40, 4.41, 4.42, 4.43, 4.44, 4.45, 4.46, 4.47, 4.48, 4.49, 4.50, 4.51, 4.52, 4.53, 4.54, 4.55, 4.56, 4.57, 4.58, 4.59, 4.60, 4.61, 4.62, 4.63, 4.64, 4.65, 4.66, 4.67, 4.68, 4.69, 4.70, 4.71, 4.72, 4.73, 4.74, 4.75, 4.76, 4.77, 4.78, 4.79, 4.80, 4.81, 4.82, 4.83, 4.84, 4.85, 4.86, 4.87, 4.88, 4.89, 4.90, 4.91, 4.92, 4.93, 4.94, 4.95, 4.96, 4.97, 4.98, 4.99, 4.100, 4.101, 4.102, 4.103, 4.104, 4.105, 4.106, 4.107, 4.108, 4.109, 4.110, 4.111, 4.112, 4.113, 4.114, 4.115, 4.116, 4.117, 4.118, 4.119, 4.120, 4.121, 4.122, 4.123, 4.124, 4.125, 4.126, 4.127, 4.128, 4.129, 4.130, 4.131, 4.132, 4.133, 4.134, 4.135, 4.136; 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 5.10, 5.11, 5.12, 5.13, 5.14, 5.15, 5.16, 5.17, 5.18, 5.19, 5.20, 5.21, 5.22, 5.23, 5.24, 5.25, 5.26, 5.27, 5.28; 5.29, 5.30, 5.31, 5.32, 5.33, 5.34, 5.35, 5.36, 5.37, 5.38, 5.39, 5.40, 5.41, 5.42, 5.43, 5.44, 5.45, 5.46, 5.47, 5.48, 5.49, 5.50, 5.51, 5.52, 5.53, 5.54, 5.55, 5.56, 5.57, 5.58, 5.59, 5.60, 5.61, 5.62, 5.63, 5.64, 5.65, 5.66, 5.67, 5.68, 5.69, 5.70, 5.71, 5.72, 5.73, 5.74, 5.75, 5.76, 5.77, 5.78, 5.79, 5.80, 5.81, 5.82, 5.83, 5.84, 5.85, 5.86, 5.87, 5.88, 5.89, 5.90, 5.91, 5.92, 5.93, 5.94, 5.95, 5.96, 5.97, 5.98, 5.99, 5.100, 5.101, 5.102, 5.103, 5.104, 5.105, 5.106, 5.107, 5.108, 5.109, 5.110, 5.111, 5.112, 5.113, 5.114, 5.115, 5.116, 5.117, 5.118, 5.119, 5.120, 5.121, 5.122, 5.123, 5.124, 5.125, 5.126, 5.127, 5.128, 5.129, 5.130, 5.131, 5.132, 5.133, 5.134, 5.135, 5.136; 6.7, 6.8, 6.9, 6.10, 6.11, 6.12, 6.13, 6.14, 6.15, 6.16, 6.17, 6.18, 6.19, 6.20, 6.21, 6.22, 6.23, 6.24, 6.25, 6.26, 6.27, 6.28; 6.29, 6.30, 6.31, 6.32, 6.33, 6.34, 6.35, 6.36, 6.37, 6.38, 6.39, 6.40, 6.41, 6.42, 6.43, 6.44, 6.45, 6.46, 6.47, 6.48, 6.49, 6.50, 6.51, 6.52, 6.53, 6.54, 6.55, 6.56, 6.57, 6.58, 6.59, 6.60, 6.61, 6.62, 6.63, 6.64, 6.65, 6.66, 6.67, 6.68, 6.69, 6.70, 6.71, 6.72, 6.73, 6.74, 6.75, 6.76, 6.77, 6.78, 6.79, 6.80, 6.81, 6.82, 6.83, 6.84, 6.85, 6.86, 6.87, 6.88, 6.89, 6.90, 6.91, 6.92, 6.93, 6.94, 6.95, 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 6.100, 6.101, 6.102, 6.103, 6.104, 6.105, 6.106, 6.107, 6.108, 6.109, 6.110, 6.111, 6.112, 6.113, 6.114, 6.115, 6.116, 6.117, 6.118, 6.119, 6.120, 6.121, 6.122, 6.123, 6.124, 6.125, 6.126, 6.127, 6.128, 6.129, 6.130, 6.131, 6.132, 6.133, 6.134, 6.135, 6.136; 7.8, 7.9, 7.10, 7.11, 7.12, 7.13, 7.14, 7.15, 7.16, 7.17, 7.18, 7.19, 7.20, 7.21, 7.22, 7.23, 7.24, 7.25, 7.26, 7.27, 7.28; 7.29, 7.30, 7.31, 7.32, 7.33, 7.34, 7.35, 7.36, 7.37, 7.38, 7.39, 7.40, 7.41, 7.42, 7.43, 7.44, 7.45, 7.46, 7.47, 7.48, 7.49, 7.50, 7.51, 7.52, 7.53, 7.54, 7.55, 7.56, 7.57, 7.58, 7.59, 7.60, 7.61, 7.62, 7.63, 7.64, 7.65, 7.66, 7.67, 7.68, 7.69, 7.70, 7.71, 7.72, 7.73, 7.74, 7.75, 7.76, 7.77, 7.78, 7.79, 7.80, 7.81, 7.82, 7.83, 7.84, 7.85, 7.86, 7.87, 7.88, 7.89, 7.90, 7.91, 7.92, 7.93, 7.94, 7.95, 7.96, 7.97, 7.98, 7.99, 7.100, 7.101, 7.102, 7.103, 7.104, 7.105, 7.106, 7.107, 7.108, 7.109, 7.110, 7.111, 7.112, 7.113, 7.114, 7.115, 7.116, 7.117, 7.118, 7.119, 7.120, 7.121, 7.122, 7.123, 7.124, 7.125, 7.126, 7.127, 7.128, 7.129, 7.130, 7.131, 7.132, 7.133, 7.134, 7.135, 7.136; 8.9, 8.10, 8.11, 8.12, 8.13, 8.14, 8.15, 8.16, 8.17, 8.18, 8.19, 8.20, 8.21, 8.22, 8.23, 8.24, 8.25, 8.26, 8.27, 8.28; 8.29, 8.30, 8.31, 8.32, 8.33, 8.34, 8.35, 8.36, 8.37, 8.38, 8.39, 8.40, 8.41, 8.42, 8.43, 8.44, 8.45, 8.46, 8.47, 8.48, 8.49, 8.50, 8.51, 8.52, 8.53, 8.54, 8.55, 8.56, 8.57, 8.58, 8.59, 8.60, 8.61, 8.62, 8.63, 8.64, 8.65, 8.66, 8.67, 8.68, 8.69, 8.70, 8.71, 8.72, 8.73, 8.74, 8.75, 8.76, 8.77, 8.78, 8.79, 8.80, 8.81, 8.82, 8.83, 8.84, 8.85, 8.86, 8.87, 8.88, 8.89, 8.90, 8.91, 8.92, 8.93, 8.94, 8.95, 8.96, 8.97, 8.98, 8.99, 8.100, 8.101, 8.102, 8.103, 8.104, 8.105, 8.106, 8.107, 8.108, 8.109, 8.110, 8.111, 8.112, 8.113, 8.114, 8.115, 8.116, 8.117, 8.118, 8.119, 8.120, 8.121, 8.122, 8.123, 8.124, 8.125, 8.126, 8.127, 8.128, 8.129, 8.130, 8.131, 8.132, 8.133, 8.134, 8.135, 8.136; 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98.99, 98.100, 98.101, 98.102, 98.103, 98.104, 98.105, 98.106, 98.107, 98.108, 98.109, 98.110, 98.111, 98.112, 98.113, 98.114, 98.115, 98.116, 98.117, 98.118, 98.119, 98.120, 98.121, 98.122, 98.123, 98.124, 98.125, 98.126, 98.127, 98.128, 98.129, 98.130, 98.131, 98.132, 98.133, 98.134, 98.135, 98.136; 99.100, 99.101, 99.102, 99.103, 99.104, 99.105, 99.106, 99.107, 99.108, 99.109, 99.110, 99.111, 99.112, 99.113, 99.114, 99.115, 99.116, 99.117, 99.118, 99.119, 99.120, 99.121, 99.122, 99.123, 99.124, 99.125, 99.126, 99.127, 99.128, 99.129, 99.130, 99.131, 99.132, 99.133, 99.134, 99.135, 99.136; 100.101, 100.102, 100.103, 100.104, 100.105, 100.106, 100.107, 100.108, 100.109, 100.110, 100.111, 100.112, 100.113, 100.114, 100.115, 100.116, 100.117, 100.118, 100.119, 100.120, 100.121, 100.122, 100.123, 100.124, 100.125, 100.126, 100.127, 100.128, 100.129, 100.130, 100.131, 100.132, 100.133, 100.134, 100.135, 100.136; 101.102, 101.103, 101.104, 101.105, 101.106, 101.107, 101.108, 101.109, 101.110, 101.111, 101.112, 101.113, 101.114, 101.115, 101.116, 101.117, 101.118, 101.119, 101.120, 101.121, 101.122, 101.123, 101.124, 101.125, 101.126, 101.127, 101.128, 101.129, 101.130, 101.131, 101.132, 101.133, 101.134, 101.135, 101.136; 102.103, 102.104, 102.105, 102.106, 102.107, 102.108, 102.109, 102.110, 102.111, 102.112, 102.113, 102.114, 102.115, 102.116, 102.117, 102.118, 102.119, 102.120, 102.121, 102.122, 102.123, 102.124, 102.125, 102.126, 102.127, 102.128, 102.129, 102.130, 102.131, 102.132, 102.133, 102.134, 102.135, 102.136; 103.104, 103.105, 103.106, 103.107, 103.108, 103.109, 103.110, 103.111, 103.112, 103.113, 103.114, 103.115, 103.116, 103.117, 103.118, 103.119, 103.120, 103.121, 103.122, 103.123, 103.124, 103.125, 103.126, 103.127, 103.128, 103.129, 103.130, 103.131, 103.132, 103.133, 103.134, 103.135, 103.136; 104.105, 104.106, 104.107, 104.108, 104.109, 104.110, 104.111, 104.112, 104.113, 104.114, 104.115, 104.116, 104.117, 104.118, 104.119, 104.120, 104.121, 104.122, 104.123, 104.124, 104.125, 104.126, 104.127, 104.128, 104.129, 104.130, 104.131, 104.132, 104.133, 104.134, 104.135, 104.136; 105.106, 105.107, 105.108, 105.109, 105.110, 105.111, 105.112, 105.113, 105.114, 105.115, 105.116, 105.117, 105.118, 105.119, 105.120, 105.121, 105.122, 105.123, 105.124, 105.125, 105.126, 105.127, 105.128, 105.129, 105.130, 105.131, 105.132, 105.133, 105.134, 105.135, 105.136; 106.107, 106.108, 106.109, 106.110, 106.111, 106.112, 106.113, 106.114, 106.115, 106.116, 106.117, 106.118, 106.119, 106.120, 106.121, 106.122, 106.123, 106.124, 106.125, 106.126, 106.127, 106.128, 106.129, 106.130, 106.131, 106.132, 106.133, 106.134, 106.135, 106.136; 107.108, 107.109, 107.110, 107.111, 107.112, 107.113, 107.114, 107.115, 107.116, 107.117, 107.118, 107.119, 107.120, 107.121, 107.122, 107.123, 107.124, 107.125, 107.126, 107.127, 107.128, 107.129, 107.130, 107.131, 107.132, 107.133, 107.134, 107.135, 107.136; 108.109, 108.110, 108.111, 108.112, 108.113, 108.114, 108.115, 108.116, 108.117, 108.118, 108.119, 108.120, 108.121, 108.122, 108.123, 108.124, 108.125, 108.126, 108.127, 108.128, 108.129, 108.130, 108.131, 108.132, 108.133, 108.134, 108.135, 108.136; 109.110, 109.111, 109.112, 109.113, 109.114, 109.115, 109.116, 109.117, 109.118, 109.119, 109.120, 109.121, 109.122, 109.123, 109.124, 109.125, 109.126, 109.127, 109.128, 109.129, 109.130, 109.131, 109.132, 109.133, 109.134, 109.135, 109.136; 110.111, 110.112, 110.113, 110.114, 110.115, 110.116, 110.117, 110.118, 110.119, 110.120, 110.121, 110.122, 110.123, 110.124, 110.125, 110.126, 110.127, 110.128, 110.129, 110.130, 110.131, 110.132, 110.133, 110.134, 110.135, およびl10.136;。
♯．♯の番号形式で示される上記の数字の識別子を使用して、少なくとも２種類の非細胞毒性化合物を含む、２種類の化合物の併用の例が以下にリストされるが、それらは、その併用に他の化合物をさらに含んでもよいし、含まなくてもよい。
111.112, 111.113, 111.114, 111.115, 111.116, 111.117, 111.118, 111.119, 111.120, 111.121, 111.122, 111.123, 111.124, 111.125, 111.126, 111.127, 111.128, 111.129, 111.130, 111.131, 111.132, 111.133, 111.134, 111.135, 111.136; 112.113, 112.114, 112.115, 112.116, 112.117, 112.118, 112.119, 112.120, 112.121, 112.122, 112.123, 112.124, 112.125, 112.126, 112.127, 112.128, 112.129, 112.130, 112.131, 112.132, 112.133, 112.134, 112.135, 112.136; 113.114, 113.115, 113.116, 113.117, 113.118, 113.119, 113.120, 113.121, 113.122, 113.123, 113.124, 113.125, 113.126, 113.127, 113.128, 113.129, 113.130, 113.131, 113.132, 113.133, 113.134, 113.135, 113.136; 114.115, 114.116, 114.117, 114.118, 114.119, 114.120, 114.121, 114.122, 114.123, 114.124, 114.125, 114.126, 114.127, 114.128, 114.129, 114.130, 114.131, 114.132, 114.133, 114.134, 114.135, 114.136; 115.116, 115.117, 115.118, 115.119, 115.120, 115.121, 115.122, 115.123, 115.124, 115.125, 115.126, 115.127, 115.128, 115.129, 115.130, 115.131, 115.132, 115.133, 115.134, 115.135, 115.136; 116.117, 116.118, 116.119, 116.120, 116.121, 116.122, 116.123, 116.124, 116.125, 116.126, 116.127, 116.128, 116.129, 116.130, 116.131, 116.132, 116.133, 116.134, 116.135, 116.136; 117.118, 117.119, 117.120, 117.121, 117.122, 117.123, 117.124, 117.125, 117.126, 117.127, 117.128, 117.129, 117.130, 117.131, 117.132, 117.133, 117.134, 117.135, 117.136; 118.119, 118.120, 118.121, 118.122, 118.123, 118.124, 118.125, 118.126, 118.127, 118.128, 118.129, 118.130, 118.131, 118.132, 118.133, 118.134, 118.135, 118.136; 119.120, 119.121, 119.122, 119.123, 119.124, 119.125, 119.126, 119.127, 119.128, 119.129, 119.130, 119.131, 119.132, 119.133, 119.134, 119.135, 119.136; 120.121, 120.122, 120.123, 120.124, 120.125, 120.126, 120.127, 120.128, 120.129, 120.130, 120.131, 120.132, 120.133, 120.134, 120.135, 120.136; 121.122, 121.123, 121.124, 121.125, 121.126, 121.127, 121.128, 121.129, 121.130, 121.131, 121.132, 121.133, 121.134, 121.135, 121.136; 122.123, 122.124, 122.125, 122.126, 122.127, 122.128, 122.129, 122.130, 122.131, 122.132, 122.133, 122.134, 122.135, 122.136; 123.124, 123.125, 123.126, 123.127, 123.128, 123.129, 123.130, 123.131, 123.132, 123.133, 123.134, 123.135, 123.136; 124.125, 124.126, 124.127, 124.128, 124.129, 124.130, 124.131, 124.132, 124.133, 124.134, 124.135, 124.136; 125.126, 125.127, 125.128, 125.129, 125.130, 125.131, 125.132, 125.133, 125.134, 125.135, 125.136; 126.127, 126.128, 126.129, 126.130, 126.131, 126.132, 126.133, 126.134, 126.135, 126.136; 127.128, 127.129, 127.130, 127.131, 127.132, 127.133, 127.134, 127.135, 127.136; 128.129, 128.130, 128.131, 128.132, 128.133, 128.134, 128.135, 128.136; 129.130, 129.131, 129.132, 129.133, 129.134, 129.135, 129.136; 130.131, 130.132, 130.133, 130.134, 130.135, 130.136; 131.132, 131.133, 131.134, 131.135, 131.136; 132.133, 132.134, 132.135, 132.136; 133.134, 133.135, 133.136; 134.135, 134.136; および135.136。
図７に示すように、本明細書に記載の方法は、用量応答曲線の最適条件の遵守を提供する。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者のための薬剤の濃度を選択するために用量応答曲線を利用する。別の実施形態では、サンプル中の細胞の約７５％を超えてアポトーシスを誘導する薬剤の濃度が選択される。別の実施形態では、サンプル中の細胞の約５０％を超えてアポトーシスを誘導する薬剤の濃度が選択される。別の実施形態では、サンプル中の細胞の約２５％を超えてアポトーシスを誘導する薬剤の濃度が選択される。さらに、薬剤のＥＣ５０値などの標準的な薬剤濃度は、多剤療法の治療計画を管理するために必要な用量に対応しない場合がある。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者のための薬剤濃度を選択するために最適条件を利用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者のための薬剤濃度を選択するためにＥＣ５０を利用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、患者のための薬剤濃度を選択するためにＥＣ９０を利用する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍の状態に対する所望の薬剤組成と濃度を選択するために正常細胞の細胞応答を利用する。
本明細書に記載の方法は、また、細胞毒性薬剤組成物と非細胞毒性薬剤組成物の両方の動力学プロファイルを評価するために使用することができる。図８が示すように、個々の患者のための動力学は、種々の薬剤組成物によって異なる場合がある。１つの実施形態では、本明細書に記載の方法は、特定の適応症のための薬剤の動力学プロファイルを決定する。別の実施形態では、本明細書に記載の方法は、特定の適応症のための薬剤組成物の動力学プロファイルを決定する。いくつかの実施形態では、薬剤治療計画は、特定の適応症のための薬剤の動力学プロファイルに基づいて選択される。
図８は、また、本明細書に記載の方法が、異なる時間でアポトーシスを誘導する種々の薬剤組成物の能力を測定するのに有用であることを示している。さらに、本明細書に記載の方法は、異なる時間が経過した後に、種々の薬剤組成物間でアポトーシス誘導の相違を評価するために有用である。１つの実施形態では、この方法は、約１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、もしくは２４時間、あるいは前掲値の任意の２つで定義された範囲におけるアポトーシスの誘導を検出する。別の実施形態では、この方法は、約３６または４８時間でのアポトーシスの誘導を検出する。別の実施形態では、この方法は約７２時間でのアポトーシスの誘導を検出する。
図２８に示すように、関連測定値は、薬剤がプログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）を効果的に誘導する細胞とインキュベーションされる必要がある最小時間である。この測定では、同様の分析が薬剤組成物を１５分間インキュベーションし、次いで薬剤を洗浄し、アポトーシスを測定するために４８時間待って行うことができる。１つの実施形態では、本方法は、約３０分、４５分、１時間、２時間、もしくは４時間、または前掲値の任意の２つによって定義される範囲の時間、薬剤を洗浄する前にインキュベーションした後、アポトーシスの誘導を検出する。別の実施形態では、この方法は、約２４時間または４８時間後にアポトーシスの誘導を検出する。別の実施形態では、この方法は、約７２時間後にアポトーシスの誘導を検出する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を実施することができる装置が提供される。例えば、様々な濃度での個々の薬剤または薬剤の組み合わせを既に含むプレートは、細胞サンプルの導入前に提供することができる。あるいは、ウェルに既に導入された細胞サンプルを含む装置は、様々な濃度での個々の薬剤または薬剤の組み合わせを導入する前に提供することができる。
本明細書に記載の方法は、血液悪性腫瘍からのヒト患者由来初代細胞の増殖および拡大培養が可能であるマウスモデルの使用を活用することができる（Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；３２４：２５−５１；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；３２４：５３−７６）。これらのマウスモデルは、例えば、ＥｘｖｉＴｅｃｈプラットフォームを使用して、エクスビボでの試験のために利用可能な患者の細胞の数を拡大することができる。これは、かなり大きい数の薬剤および薬剤の併用を、これらのマウスモデルによって増殖したエクスビボでの患者細胞中で試験することを可能とし、同じマウスモデルでの最良の薬剤と薬剤の併用をインビボで試験することを可能にすることができる。１つの実施形態では、患者サンプルにおいてエクスビボで試験された薬剤組成物の有効性と毒性は、患者からの細胞を増殖させるために使用されるマウスモデルで検証される。別の実施形態では、細胞毒性薬剤の薬剤組成物は、マウスモデルのインビボでの評価が最高の薬剤組成物を用いて、マウスモデルのエクスビボでのサンプルで試験される。別の実施形態では、非細胞毒性薬剤と併用される細胞毒性薬剤、例えば、アジュバントおよび承認薬の薬剤組成物は、マウスモデルのインビボでの評価が最高の薬剤組成物を用いて、マウスモデルのエクスビボでのサンプルで試験される。別の実施形態では、非細胞毒性薬剤、例えば、アジュバントおよび承認薬の両方の薬剤組成物は、マウスモデルのインビボでの評価が最高の薬剤組成物を用いて、マウスモデルのエクスビボでのサンプルで試験される。
本方法の別の利点は、種々の薬剤組成物と薬剤濃度に対する患者の反応に関する個別レポートの生成能である。１つの実施形態では、本方法は、分析の結果をまとめたレポートの作成を含む。別の実施形態では、本方法は、患者へのレポートを提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、患者の医療に責任がある当事者にレポートを提供することを含む。別の実施形態では、本方法は、分析ステップを解釈するための責任者にレポートを提供することを含む。１つの実施形態では、レポートは、生データを含む。別の実施形態では、レポートには、用量応答曲線が含まれる。別の実施形態では、レポートは、薬剤組成と薬剤濃度に対する患者の応答の概要を含んでいる。
正確な用量は、薬剤ごとに基づいて決定されるが、ほとんどの場合、用量に関するいくつかの一般化が可能である。例えば、成人のヒト患者用の薬剤の用量は、例えば、１日あたり約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間の用量、または、好ましくは１日あたり約１０ｍｇ〜約１００ｍｇの間の用量である。剤形は、経口であってもよいが、好ましくは静脈内である。例えば、本発明の組成物は、連続静脈内注入により投与することが可能である。また、いくつかの実施形態では、投与形態は、皮下または筋肉内送達用に製剤化される。細胞毒性薬剤および非細胞毒性薬剤の用量範囲は、一般的に類似している。本明細書に記載される医薬組成物のどれもが、記載された化合物の薬学的に許容される塩を含む。化合物は、例えば、１週間、１カ月、またはそれ以上の連続的な治療の期間、投与することができる。さらに、当業者は、本発明の薬剤および薬剤組成物のための正確な処方、投与経路、および用量が、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択できることを知っている。例えば、投与される薬剤または薬剤の併用の量は、被験者の体重、病気の重症度、投与様式、または処方する医師の判断に基づき、治療される対象に依存する場合がある。
当業者は、多数の種々の修正が本発明の精神から逸脱することなく行うことができることを理解するであろう。従って、本明細書に開示された本発明の実施形態は、単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではないことを明らかに理解すべきである。本明細書で言及されるどの引用文献も、本明細書で議論される材料に対して、およびその全体として、引用により本明細書に取り込まれる。
実施例１：アポトーシスの正常細胞と腫瘍細胞のフローサイトメトリー検出
エクスビボでの治療指数は、アポトーシスを誘導する薬剤組成物の能力を測定することによって決定することができる。図１と図２は、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出し、正常細胞と腫瘍表現型を区別する能力を表している。図１では、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合した試薬アネキシンＶは、アポトーシス細胞上のホスファチジルセリンの発現を検出するために使用された。フルオレセインの強度は、ｙ軸上に表示され、細胞サイズは、ｘ軸上に表示される。図１は、アポトーシス細胞（左上ボックス）と生細胞（右下のクラスター）を識別する能力を示し、モノクローナル抗体と多重パラメーター分析戦略の適切な併用の同時使用は、血液疾患の患者由来のサンプル中に存在する残留正常細胞からの白血病細胞を識別できることを証明している。図２は、ＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子再配列［ｔ；（９；２２）陽性］を表示する前駆Ｂ−ＡＬＬの成人の症例を示している。２つの細胞のサブセットである白血病（淡い灰色）と正常（濃い灰色）は、定量的なフローサイトメトリーによって分析される複数のモノクローナル抗体を用いて、ＣＤ１９陽性細胞間で検出された。白血病細胞は、転座に関連した特有な表現型（ＣＤ３４の同種発現であるが、低い相対的に異種のＣＤ３８発現）を発現する。
実施例２：薬剤組成物のエクスビボでの評価のためのプロトコル
薬剤組成物のためのエクスビボでのスクリーニングのプロセスが、模式的に図３に示される。血液のサンプルは、任意の適切な大きさのウェルプレートに分配される小さなアリコートに分割することができる。これらのウェルプレートには、個々の薬剤または薬剤の併用がそれぞれ種々の濃度で含まれる。最適なアッセイの開発を容易にするために、サンプルをＲＰＭＩ培地で希釈し、ウェルあたり約２０，０００個の白血病細胞に濃縮する。並行して、別のアリコートは、正常細胞と病的細胞との識別および基本的なアポトーシスの検出のためのフローサイトメトリーを用いて、免疫表現型の識別のために試験される。どんな薬剤も含まない対照ウェルを含ませることができ（図示せず）、薬剤治療と関連しないアポトーシスの自然レベルを識別する。
約４８時間後、薬剤に曝露されたサンプルを有する各ウェルを緩衝液で処理して赤血球集団を溶解し、そして白血球集団を濃縮する。次いで、各ウェルは、腫瘍細胞と正常細胞を正確に検出し、識別する抗体の併用によるアポトーシス検出のためにアネキシンＶとインキュベーションされる。フローサイトメトリーを使用して、各細胞型に対する各薬剤の効果を評価すること、および各薬剤により誘導される選択的な細胞死のレベルを定量化することが可能である。
それから、結果を評価することができ、新たな試験は、以前の研究で同定されたベスト１０の薬剤の組成や濃度などの関連性の高い結果を確認するためにさらなるアリコートを用いて開始することができる。白血病細胞などの腫瘍細胞上に選択的にアポトーシスを誘導した適切な薬剤または薬剤の併用の選択は、アッセイが患者のサンプルに対して実行された後に行うことができる。
実施例３：個々の患者の応答は、現在、承認された種々の薬剤の慢性リンパ性白血病に対する細胞毒性効果を証明する。
本発明の方法は、様々な患者における３０μＭ濃度のクロラムブシル、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ミトキサントロン、およびドキソルビシン−現在、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に対して承認された５つの薬剤−の分析に使用されている。９つのエクスビボでの患者サンプルの悪性細胞におけるアポトーシス誘導に対して個別に承認された細胞毒性薬剤の有効性の結果は、図４に提供されている。図４は、薬剤反応の人から人への高い変動があることを示し、本明細書に記載の個別化医療試験のための重要な用途を強調している。
３０μＭ濃度での個々の薬剤治療に対する患者の応答に関しては、いくつかの薬剤は、アネキシンＶ陽性細胞で測定された患者サンプルにおける６０％未満のアポトーシスを誘導すると定義される不十分な患者応答を一般的に有した。さらに、図４は、患者の一部（特にＰ１．０１０５、Ｐ２．００１９、およびＰ２．０３５）が、ミトキサントロンに対してエクスビボで非常に耐性を示したことを表している。あるいは、星印で示される２人の患者については、ドキソルビシンだけが非常に有効であり、そして他の３種類の薬剤には、耐性があり、この種の試験は、これらの患者に治療を導くのは非常に有用であったことを示している。エクスビボでのアッセイから得られた結果は、薬効よりも薬剤耐性の予測において、より正確かもしれないが（例えば、表２に示すように）、薬剤が悪性細胞をエクスビボで殺さないならば、インビボでも同じ細胞を殺しそうではない。
実施例４：ＣＬＬサンプルにおける細胞毒性薬剤と非細胞毒性薬剤によるアポトーシスの誘導
エクスビボでのサンプルのアポトーシスを誘導する非細胞毒性薬剤の能力が、ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）患者から得られた末梢血サンプルを用いて検討された。約９００の市販の薬剤が、２３の異なる患者のサンプルで、１つずつエクスビボスクリーニングされた。図６は、これらのＣＬＬのエクスビボでのサンプル中の血液学的腫瘍に対するいくつかの臨床的に承認された細胞毒性薬剤といくつかの非細胞毒性薬剤の有効性を示している。その結果は、％アポトーシスとしてグラフ化されている。その結果が示すように、臨床的に承認された薬剤は、悪性細胞の７５％よりも多くアポトーシスを誘導する。試験された非細胞毒性薬剤は、左から右に、パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリン、グアナベンズ、およびアステミゾールであった。試験された細胞毒性薬剤は、左から右に、フルダラビン、クロラムブシル、およびミトキサントロンであった。図６は、非細胞毒性薬剤が、承認された細胞毒性薬剤と同様のエクスビボでの有効性で同じ悪性細胞を選択的に殺すことを示している。この予想外の結果は、これらの非細胞毒性薬剤が、図６で検討された患者に対して著しい治療効果を有することができたことを示している。
非細胞毒性薬剤によるアポトーシスの誘導のためのさらなる検証研究が実行された。図７は、悪性白血病細胞と非悪性のＴ細胞およびＮＫ細胞との間でのパロキセチンの細胞毒性効果の違いを比較する。約３０μＭ濃度で、パロキセチンは、白血病細胞のほぼ１００％でアポトーシスを誘導した。しかし、約３０μＭの同じ濃度で、パロキセチンは、Ｔ細胞とＮＫ細胞のわずか１５％でアポトーシスを誘導した。従って、図７は、パロキセチンが、エクスビボでの悪性ＣＬＬ細胞のアポトーシスを選択的に誘導し、非悪性のＮＫ細胞とＴ細胞に最小限に影響を及ぼすことを示す。
治療プロトコルで一般に処方される非細胞毒性薬剤は、悪性細胞に対する非常に選択性のアポトーシス効果を有することができる。そのような１つのケースは、ＣＬＬ患者について図１２に示され、それは種々の薬剤により誘導されるアネキシンＶ陽性細胞の割合を表示する。高い変動性が、ＣＬＬの治療で使用される様々な薬剤（すなわち、ビンクリスチン、ミトキサントロン、およびシクロホスファミド）の細胞毒性効果に観察された。驚いたことに、化学療法（すなわち、オメプラゾールおよびアシクロビル）による副作用を治療するために通常含まれている２種類の非細胞毒性化合物は、細胞毒性薬剤として同様のアポトーシスの割合を示した。従って、ここに提供されている例を含めて、本明細書に記載される非細胞毒性薬剤を含む個別化医療試験は、患者のための予想外の潜在的な治療利益を提供し得る。例えば、エクスビボでの試験に非細胞毒性薬剤を添加することは、標準的な治療法と相補的な新規で予想外の治療を可能とする。
実施例５：アポトーシスを誘導するために選択される薬剤の能力の２４時間および４８時間分析
アポトーシス誘導の動力学は、２４時間および４８時間の時点でアポトーシスを受けている細胞の割合を観察することによって評価された。図８は、非細胞毒性薬剤のセルトラリンが、承認細胞毒性薬剤より悪性ＣＬＬ細胞を速く除去することを示している。図８では、ＣＬＬと診断された患者から採取した全血サンプルは、薬剤治療に対するそれらの応答が分析された。全血サンプルは、セルトラリンまたはＣＬＬの治療に対して現在、承認されている３種類の薬剤（フルダラビン、クロラムブシル、またはミトキサントロン）のいずれかと共にインキュベーションされた。薬剤の添加に続いて、全血サンプルは、分析の前に２４時間または４８時間のどちらかの時間インキュベーションされた。図８の結果が示すように、アポトーシス誘導の反応速度は、他の臨床的に承認された３種類の薬剤（２４時間後のそれぞれ約４０％、４５％、および５０％のアポトーシス誘導）に対するよりも、セルトラリン（２４時間後の９０％を超えるアポトーシス誘導）に対する方が速い。従って、セルトラリンは、２４時間でほぼ完全にアポトーシスを誘導したが、一方、他のＣＬＬ薬剤は、最適な有効性のためには４８時間を必要とした。
エクスビボでのより速いアポトーシスは、インビボでの一層良好な有効性と解釈することができた。しかし、図８はまた、これら４種類の薬剤の有効性が、４８時間後でほぼ等しいことを示している。図８は、それぞれの患者に対する最適な治療を選択する複数のインキュベーション時間の評価をする際の有用性を強調している。さらに、図８は、いくつかの変数が最適な多剤療法治療の発展のために検討されなければならないことを示す（例えば、薬剤組成物およびインキュベーション時間）。
実施例６：同じ薬理学的クラスの薬剤によるアポトーシスの分化誘導
パロキセチンは、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）である。ＳＳＲＩクラスの化合物の他のメンバーは、薬剤のＳＳＲＩ薬理学的クラスが、普遍的なアポトーシス誘導の特性を有しているかどうかを判断するために試験された。図９は、悪性ＣＬＬ細胞でアポトーシスを誘導する６種類のＳＳＲＩ（パロキセチン、フルオキセチン、セルトラリン、シタロプラム、フルボキサミン、およびジメリジン）の能力をまとめたものである。図９の結果が証明するように、６種類の薬剤のうち、３種類のみ（パロキセチン、フルオキセチン、およびセルトラリン）が、臨床的に承認された細胞毒性薬剤と同様にアポトーシスを誘導する。同様の作用機序と同じ薬理学的プロファイルを共有する薬剤の間でこれらの違いは、薬理学的に類似した薬剤の中から選択するために、本明細書に記載のエクスビボ試験の方法論に対する必要性を強調している。これらの違いはまた、薬理学的クラスに関係なく、各薬剤のエクスビボでの試験の必要性を示している。これらの違いは、個別化医療試験を開発するために、多数の変数を検討する能力の重要性をさらに強調している。
実施例７：同一薬剤治療による８０％超のアポトーシス誘導を示す患者の頻度
非細胞毒性薬剤のアポトーシス効果は、承認された細胞毒性薬剤のアポトーシス効果（例えば、図４に示すように）よりも人により一層変動する。この変化は、図１０にも例示されている。ＣＬＬと診断された患者からの２３のサンプルの初期スクリーニング（全血または骨髄の併用）は、約２，０００の化合物（いくつかのサンプルは、すべての化合物をスクリーニングするのに十分ではなかった）を用いて実施された。スクリーニングは、それぞれの患者の白血病細胞集団に選択的にアポトーシスを誘導する化合物の能力を測定した。正常細胞集団でほとんどまたは全く効果を有しないけれども、白血病集団の８０％を超えるアポトーシスのレベルを化合物が誘導するならば、その化合物は特定の患者に対する「ヒット」と考えられた。
図１０の結果は、ごく少数の薬剤が患者サンプルの大半（８０〜１００％）に有効であったことを示す。同様に、１０種類のさらなる化合物のみが、患者サンプルの６０〜８０％で有効であった。４５種類の薬剤は、サンプルの４０〜６０％で有効であった。６６種類の薬剤は、サンプルの２０〜４０％で有効であった。２２９種類のさらなる薬剤は、サンプルの２０％未満で有効であった。これらの薬剤を添加することは、３５３種類の薬剤がこれらの２３種類のサンプルでエクスビボでのアポトーシス誘導に有効であったことを意味する。これらは、大部分は以前に血液悪性腫瘍の治療として注目されなかった薬剤であり、個別化医療試験の開発は、最適な薬剤療法の治療計画を決定するために、細胞毒性および非細胞毒性の両方の多数の薬剤のスクリーニングが必要になることを示す。そのような予想外のデータは、血液学的腫瘍の治療のための主要な臨床的意義を有することができる。
規制当局は、細胞毒性治療の影響を緩和することを目的として血液学的腫瘍患者への非細胞毒性薬剤の小規模なサブセットの使用を一般的に承認しているのみである。それにもかかわらず、ほとんどの他の非細胞毒性薬剤についてここで観察され、そして本明細書で請求されている潜在的な有効性は、個別化医療の概念がさらに発展するにつれて、やがて、こうした治療の一部になることができた。本明細書に記載の多剤療法の個別化医療試験は、個々の患者に対して潜在的に有用な非細胞毒性薬剤を識別することができ、これは、これまで利用できなかった新しい治療上有益なアプローチを表す。
実施例８：非細胞毒性薬剤による、承認された細胞毒性薬剤の有効性の増強
個別化医療のスクリーニング試験の潜在的な利点の一例としては、ＣＬＬ患者のサンプルに対するヒットとして同定された化合物セルトラリンは、クロラムブシルの応答を増強することができる。これを図１１に示す。クロラムブシルは、フルダラビン系の治療に耐えられない患者の約２５％においてＣＬＬの第一線治療のために使用される最も一般的な処方薬である。クロラムブシルは、非常に細胞毒性であり、そして複数の重篤な副作用を引き起こすので、用量を制限する方法を見つけることは、非常に患者の利益となる。この特定の試験では、セルトラリンは、ジェネリック製剤で使用可能であり、長年にわたって市場にある抗うつ剤である。示された濃度でのクロラムブシル単独は、多くのアポトーシスを誘導しなかったが（下の曲線）、セルトラリンの準最大量の存在は、アポトーシスのレベルを非常に高めた（上の曲線）。そのような例は、処方された化学療法処置の応答を増強する能力を有する可能性がある潜在的な併用療法の選択肢を示している。
これらの結果は、フローサイトメトリーを用いる方法などのハイスループットスクリーニングを使用して、個別化医療試験を開発する必要性を証明しており、化学療法戦略の副作用を緩和するために使用されるすべての承認された薬剤と特に非細胞毒性併用薬剤を含む可能な薬剤および薬剤併用の効果の探索を可能にしている。
実施例９：ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルに依るＣＬＬに対する多剤療法個別化医療（ＰＭ）試験の設計
ＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）の患者に対する個別化医療試験用９６−ウェルプレートの設計は、非細胞毒性薬剤を考慮することなく図１３に示される。各プレートにおいて、１列目は、陰性対照としてのＤＭＳＯの０．３４％溶液を含み、そして、１２列目は、陽性対照としてのパロキセチンの５０μＭ溶液とスタウロスポリンの５０μＭ溶液（ウェルＥ〜Ｈ）を含む。プレートの薬剤および薬剤併用は、従来の治療プロトコルでこの適応症に対して承認されたものである。各々の行では、ウェル２〜６および７〜１１は、２：３の希釈率で、これらの薬剤と薬剤併用の各々の５点用量応答を含む。従って、２列目および７列目は、その治療範囲に応じて各薬剤について確立された薬剤の最高濃度を含む。クロラムブシル（ＣＨ）；フルダラビン（ＦＩ）；マホスファミド（ＭＡ）；ドキソルビシン（ＤＯ）；ビンクリスチン（ＶＩ）；プレドニゾロン（Ｐｒ）；ミトキサントロン（ＭＩ）；２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）；フラボピリドール（ＦＬ）；メルファラン（ＭＥ）；ｍｅ−プレドニゾロン（ＭＥＰＲ）；ベンダムスチン（ＢＥ）；ペントスタチン（ＰＥ）；リツキシマブ（ＲＩＴ）；アレムツズマブ（ＡＬＥ）。
実施例１０：ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルに依るＭＭに対するＰＭ試験の設計
ＭＭ（多発性骨髄腫）の患者に対して個別化医療試験用９６−ウェルプレートの設計は、非細胞毒性薬剤を考慮することなく、図１４の６枚のパネルＡ〜Ｆに示される。プレートのレイアウトは、個々の薬剤を含む現在の治療プロトコルに従って作成された。各プレートにおいて、１列目は、陰性対照としてのＤＭＳＯの０．３４％溶液を含み、そして、１２列目は、陽性対照としてのパロキセチンの５０μＭ溶液とスタウロスポリンの５０μＭ溶液（ウェルＥ〜Ｈ）を含む。プレートの薬剤および薬剤併用は、従来の治療プロトコルでこの適応症に対して承認されたものである。各々の行では、ウェル２〜６および７〜１１は、２：３の希釈率で、これらの薬剤と薬剤併用の各々の５点用量応答を含む。従って、２列目および７列目は、その治療範囲に応じて各薬剤に対して確立された薬剤の最高濃度を含む。さらに、４〜６からのプレートは、すべての薬剤間の相乗効果を明らかにするために、承認されたプロトコルのすべての可能な二重の併用を含む。デキサメタゾン（Ｄ）；プレドニゾン（Ｐ）；メルファラン（Ｍ）；シクロホスファミド（Ｃ）；ドキソルビシン（Ａ）；ビンクリスチン（Ｖｉ）；カルムスチン（ＢＣＮＵ−Ｂ）；ボルテゾミブ（Ｖ）；タリドマイド（Ｔ）；レナリドマイド（Ｌ）； パナビノスタット（Ｐａ）；タネスピマイシン（Ｔｎ）；ペリホシン（Ｐｅ）；ボリノスタット（Ｖｏ）；ラパマイシン（Ｒａ）；エベロリムス（Ｅｖ）；テムシロリムス（Ｔｅ）、チピファミブ（Ｔｉ）；シスプラチン（ｃＰ）；エトポシド（Ｅ）。
実施例１１：ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルに依るＡＬＬのＰＭ試験の設計
ＡＬＬ（急性リンパ芽球性白血病）の患者に対する個別化医療試験用９６−ウェルプレートの設計は、図１５に示される。プレートのレイアウトは、単剤療法で使用される薬剤を含む現在の治療プロトコルに従って作成された。研究設計は、患者のサンプルでアポトーシスを誘導する以下の薬剤の能力を決定することを目的とする：メトトレキサート（ＭＴＸ）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）、ダウノルビシン（ＤＮＲ）、アドリアマイシン、ミトキサントロン（Ｍ）、エトポシド、テニポシド（ＶＭ−２６）、シクロホスファミド（ＣＦ）、イホスファミド（ＩＦＯＳ）、ビンクリスチン（Ｖ）、ビンデシン（ＶＩＮＤ）、アスパラギナーゼ（Ｌ−ＡＳＡ）、イマチニブ（ＩＭＡＴ）、リツキシマブ（Ｒ）、プレドニゾン（Ｐ）、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、デキサメタゾン（ＤＸＭ）、ロイコボリン（Ｆｏｌｉ）、メスナ、オメプラゾール（Ｏｍ）、オンダンセトロン（Ｏ）、アロプリノール（Ａｌｌｏｐ）、およびフィルグラスチム（ＧＣＳＦ）。この９６−ウェルプレートの設計は、数多くの化学療法戦略の同時比較を提供する。この設計はまた、単独でまたは単剤療法薬と併用して副作用を緩和するために使用されるアジュバント薬剤と薬剤の効果を試験もする。
実施例１２：ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルに依るＭＤＳのためのＰＰＭ試験の設計
ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）の患者に対する個別化医療試験用９６−ウェルプレートの設計は、図１６に示される。プレートのレイアウトは、単剤療法で使用される薬剤を含む現在の治療プロトコルに従って作成された。研究設計は、患者のサンプルでアポトーシスを誘導する以下の薬剤の能力を決定することを目的とする：エリスロポエチン（ＥＰＯ）、フィルグラスチム（ＧＣＳＦ）、サリドマイド、シクロスポリン（ＣＳＡ）、サイモグロブリン（ＡＴＧ）、三酸化ヒ素、アザシチジン、デシタビン、フルダラビン（Ｆｌｕｄａ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）、イダルビシン（Ｉｄａ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐ）、プレドニゾン（Ｐｒｅｄ）、オンダンセトロン（Ｏｎｄａｎｓ）、オメプラゾール（Ｏｍ）、アロプリノール（Ａｌｏｐ）、コトリモキサゾール（Ｃｏｔｒｉ）、および葉酸（ＡｃＦ）。この９６−ウェルプレートの設計は、数多くの化学療法戦略の同時比較を提供する。この設計はまた、単独でまたは単剤療法薬と併用して副作用を緩和するために使用されるアジュバント薬剤と薬剤の効果を試験もする。
実施例１３：ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルに依るＡＭＬのためのＰＭ試験の設計
ＡＭＬ（急性骨髄芽球性白血病、Ｍ３ではない）の患者に対する個別化医療試験用９６−ウェルプレートの設計は、図１７に示される。プレートのレイアウトは、単剤療法で使用される薬剤を含む現在の治療プロトコルに従って作成された。研究設計は、患者のサンプルでアポトーシスを誘導する以下の薬剤の能力を決定することを目的とする：ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏ）、イダルビシン（Ｉｄａ）、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘ）、エトポシド（ＶＰ１６）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａ）、フィルグラスチム（ＧＣＳＦ）、オメプラゾール（Ｏｍ）、オンダンセトロン（Ｏｎｄａｎｓ）、アロプリノール（Ａｌｏｐ）、コトリモキサゾール（Ｃｏｔｒｉ）、葉酸（ＡｃＦ）、アムサクリン（ＡＭＳＡ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐ）リポソームダウノルビシン（Ｄａｕｎｏ ｌｉｐｏ）、ゲンツズマブ・オゾガマイシン（ＧＯ）、およびヒドロキシ尿素。この９６−ウェルプレートの設計は、数多くの化学療法戦略の同時比較を提供する。この設計はまた、単独でまたは単剤療法薬と併用して副作用を緩和するために使用されるアジュバント薬剤と薬剤の効果を試験もする。
実施例１４：ＰＥＴＨＥＭＡ治療プロトコルに依るＡＭＬ−Ｍ３に対するＰＭ試験の設計
ＡＭＬ−Ｍ３（急性骨髄芽球性白血病Ｍ３）の患者に対する個別化医療試験用９６−ウェルプレートの設計は、図１８に示される。プレートのレイアウトは、単剤療法で使用される薬剤を含む現在の治療プロトコルに従って作成された。研究設計は、患者のサンプルでアポトーシスを誘導する以下の薬剤の能力を決定することを目的とする：トレチノイン（ＡＴＲＡ）、イダルビシン（Ｉｄａ）、ミトキサントロン（Ｍｉｔｏｘ）、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、オンダンセトロン（Ｏｎｄａｎｓ）、アロプリノール（Ａｌｏｐ）、オメプラゾール（Ｏｍ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、フルダラビン（Ｆｌｕｄａ）、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐ）、リポソーム・ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏ ｌｉｐｏ）、コトリモキサゾール（Ｃｏｔｒｉ）、および葉酸（ＦＡｃ）。この９６−ウェルプレートの設計は、数多くの化学療法戦略の同時比較を提供する。この設計はまた、単独でまたは単剤療法薬と併用して副作用を緩和するために使用されるアジュバント薬剤と薬剤の効果を試験もする。
実施例１５：原発性白血病細胞株におけるＭＴＴ増殖アッセイ
ＴＯＭ−１細胞は、Ｐｈ１−陽性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者の骨髄細胞に由来した。ＭＯＬＴ−４細胞は、ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株に由来した。標準のＭＴＴアッセイは、特定の細胞株で試験される個々の項目に対してＩＣ５０を決定するために行われた。ＭＴＴアッセイは、代謝性活性細胞により黄色のテトラゾリウム塩ＭＴＴを紫色のホルマザン結晶へ開裂することに基づいている。次いで、ホルマザンを可溶化し、濃度が５７０ｎｍにおける光学密度によって決定される。セルトラリンの６〜８種類の種々の濃度は、後処理２４時間の時点で３通りに分析された。
ＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４の原発性細胞株における２４時間後の細胞増殖の抑制に対するセルトラリンの効果が評価された。ＭＯＬＴ−４細胞株のＩＣ５０は４０μＭであり、ＴＯＭ−１細胞株のＩＣ５０は５０μＭであった（図１９）。
実施例１６：アポトーシス用ＥＬＩＳＡを用いるアポトーシスの測定
ワンステップサンドイッチＥＬＩＳＡは、実施例１５からのＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４細胞を用いて実施された。ワンステップサンドイッチＥＬＩＳＡは、アポトーシス誘導後の細胞の細胞質からの、あるいは壊死細胞から放出された場合のヒストン複合ＤＮＡ断片（モノ−およびオリゴヌクレオソーム）の定量化に基づいている。
ＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４原発性細胞株における２４時間でのアポトーシスの誘導に対するセルトラリンの効果が評価された。セルトラリンは、ＭＯＬＴ−４細胞でアポトーシス指数を７倍まで増加した（図２０）。
実施例１７：活性型カスパーゼ−３の測定
カスパーゼ−３の活性化は、セルトラリンの増加した濃度に曝露された２つの急性リンパ芽球性細胞株（ＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４）からの抽出物のウエスタンブロットを用いて測定された。抽出物は、２４時間および４８時間で採取された。活性型カスパーゼ３は、アポトーシスのマーカーとして役立つプロテアーゼである。
ＴＯＭ−１およびＭＯＬＴ−４原発性細胞株での２４時間での活性型カスパーゼ３の誘導に対するセルトラリンの効果が評価された。セルトラリンは、ＭＯＬＴ−４細胞で活性型カスパーゼ−３を劇的に誘導し、最大誘導が７０ｕｍの濃度で起きた（図２１）。
実施例１８：ＣＬＬサンプルでの多剤療法の併用のエクスビボでの効果
リツキシマブ、フルダラビン、ミトキサントロン、およびシクロホスファミドの多剤療法の併用が、ＣＬＬサンプル中、最大濃度で試験された。シクロホスファミドは、直接には試験されなかったが、むしろその代謝物マホスファミド（ヒト体内での活性化合物）で試験された。４つの主要な個々の薬剤は、耐性であった（すなわち、リツキシマブ、フルダラビン、ミトキサントロン、およびシクロホスファミド）（図２２、左側）。フルダラビンとリツキシマブでの多剤療法プロトコルもまた耐性であった（図２２、中央）。３つの多剤療法プロトコル（すなわち、フルダラビンおよびシクロホスファミド；フルダラビン、シクロホスファミド、およびミトキサントロン；ならびにフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブ）は、非常に感受性であり、基本的にすべての白血病細胞を除去した（右側）（図２２）。
５点応答曲線は、エクスビボでの有効性を特徴づけるために、フルダラビンおよびシクロホスファミド；フルダラビン、シクロホスファミド、およびミトキサントロン；ならびにフルダラビン、シクロホスファミド、およびリツキシマブの併用に対して生成された（図２３〜２５）。これらの曲線は、これらの薬剤の併用に対して著しい相乗効果を示し、本明細書に記載される薬剤の併用を評価することの重要性を強調している。
実施例１９：２人の患者における５種類の異なる濃度での単剤の効果
フルダラビン、マホスファミド、およびフルダラビンとマホスファミドの併用が、２人の患者Ｐ２．０１４４（図２６、左）とＰ２．０１４９（図２６、右）で５種類の濃度において試験された。併用指数（ＣＩ）は、各濃度の併用に対する相乗効果を特徴づけるために、プログラムＣａｌｃｕｓｙｎ（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ １９８４；２２：２７−５５；Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８１；１１５（ｌ）：２０７−１６）を用いて算出された（パネルの上部に示される）。ＣＩは、相加効果に関しての薬剤間相互作用の程度の定量的な尺度である。相乗効果は、ＣＩ＜１のときに発生し、相加効果は、ＣＩ≒１のときに発生し、そして拮抗作用は、ＣＩ＞１のときに発生する。用量減少指数（ＤＲＩ）は、相乗的な併用の各薬剤の用量が、各薬剤単独の用量と比較して所定の効果レベルでどれだけ減少し得るかの尺度である。
図２７は、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に基づくフラクション効果に対する併用指数を示す（上部パネル）。十字記号は、観測値を示す。黒線はモデルのシミュレーションに対応している。中央のパネルは、用量応答評価に基づく３つの異なる応答レベル（ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０）でのＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの方法に基づく薬剤相互作用のアイソボログラムを示している。各軸に描かれた点は、個別にそれぞれの薬剤に対するこれらの応答について推定された用量に相当する。直線は、併用のための相加効果の領域を表している。これらの線の下にある併用の用量の点は、薬剤の相乗作用を示す。図２６と図２７は、フルダラビンとマホスファミドの併用が、白血病ＣＬＬのＢ細胞に対する単一薬剤の効果と比較して細胞毒性を増強したことを証明する。
実施例２０：ＣＬＬサンプルの悪性細胞におけるアポトーシスを誘導する薬剤有効性に対するインキュベーション時間の効果
ＣＬＬサンプルでの悪性細胞のアポトーシスを誘導するフルダラビンとセルトラリンの有効性に対するインキュベーション時間の効果が試験された。図２８は、フルダラビン（左パネル）とセルトラリン（右パネル）の曲線を示し、そこでは、アポトーシスが２４時間（上のパネル）または４８時間（下のパネル）のいずれかで測定されたことを示している。どちらの場合も、薬剤を洗浄し、アポトーシスを測定するために２４時間または４８時間待つ前に、薬剤は３０分、４時間、または８時間、サンプルとともにインキュベーションされた。ＣＬＬ悪性細胞のアポトーシスを誘導する非細胞毒性薬剤のセルトラリンは、フルダラビンより速い反応速度を示した。
実施例２１：薬剤併用の数
計算は、１５種類の薬剤に対して、２種類の薬剤、３種類の薬剤、および４種類の薬剤の併用の数を評価するために行われた。
図２９は、１５種類の個々の薬剤から作ることができる特有な２種類の薬剤の併用の数を表す。各薬剤は番号で表され、網掛けセルは、２種類の薬剤の併用を表している。これは、２種類の薬剤の合計１０５種類の特有な併用となる。
図３０は、１５種類の個々の薬剤から作ることができる特有な３種類の薬剤の併用の数を表す。中央のボックスが網掛けの淡い灰色であるとき、各行列の一番上の行に記載されているすべての２種類の薬剤の併用は、左側の列上の単一薬剤と併用される。中央のボックスが網掛けの濃い灰色であるとき、各行列の一番下の行に記載されているすべての２種類の薬剤の併用は、左側の列上の単一薬剤と併用される。これは、３種類の薬剤についての合計４５５種類の特有な併用となる。
図３１は、１５種類の薬剤から作ることができる特有な４種類の薬剤の併用の数を表す。各列の左側に表示されている３種類の薬剤の併用は、網掛けの各ボックスの列の上部に表示されている個々の薬剤と併用される。各列の右側に記載されている３種類の薬剤の併用は、「Ｘ」を含む各ボックスの列の上部に表示されている個々の薬剤と併用される。これは、４種類の薬剤の合計１３６５種類の特有な併用となる。
実施例２２：タグ付きシステムを用いるＰＭ試験の設計
エクスビボでの個別化医療試験の処理能力は、異なる薬剤組成物を含むウェルを蛍光プローブで標識することによってさらに増加させることができる。標識されたウェルは、併合することができ、フローサイトメーターに共に通すことができ、各ウェルを個別に評価するのと比較して時間を節約することができる。達成されるその節約は、併合されたウェルの数にほぼ匹敵することができる。時間の節約は、より少ない時間でより多くの薬剤組成物を試験することができ、単位時間あたりのＥｘｖｉＴｅｃｈプラットフォームごとにより多くの試験の実行を可能にする。これは、非常に重要である処理能力の増加とコストの減少となる。
図３２と図３３は、蛍光色素染料を用いる多重化の例を示している。１つの実施形態では、蛍光色素染料は、例えば、異なるウェルに含まれる異なる薬剤組成物中の細胞を標識する試薬として使用される。別の実施形態では、蛍光色素染料は、例えば、異なるウェルに含まれる異なる薬剤組成物の存在下、細胞を標識する試薬としてその後使用される抗体を標識するために使用される。別の実施形態では、蛍光試薬は、例えば、異なるウェルに含まれる異なる薬剤組成物中の細胞を標識するために使用される量子ドットである。１つの実施形態では、多重化モードで評価することのできる薬剤組成物の数は、約２、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、もしくは約５０、またはそれより多い数、あるいは前掲値の任意の２つによって定義される範囲である。
図３２は、異なる細胞追跡染料を使用して、末梢血白血球の３色多重化を示す。溶解された末梢血を含む３つの連続したウェルは、異なる細胞追跡染料で個別に染色された。ウェル１は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（Ｐ２２６５２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色され、ウェル２は、ＤｉＲ（Ｄ１２７３１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色され、そして、ウェル３は、ＤｉＤ（Ｖ−２２８８９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色された。３つのウェルの内容物をそれから混合して、同時に得た。各細胞の追跡染料の特有な励起／発光スペクトルは、起源の異なる３つのウェルを反映する３つの異なる細胞集団の分離を可能にする。
ウェル１からの細胞は、ウェル２および３からの細胞よりもバイオレットレーザー検出器で強いシグナルを示す。逆に、ウェル２および３からの細胞は、ウェル１からの細胞に比べて赤色レーザー検出器で強いシグナルを示す。最後に、ウェル２および３からの細胞は、様々な発光ピークを示し、両方の赤色レーザー検出器の２変量プロット上でのそれらの分離を可能にしている。

Claims (7)

  1. 薬剤に対する細胞の応答性を分析する方法であって、
    血液学的腫瘍を有する患者から採取された全骨髄のサンプルを得ること；
    少なくとも３５のアリコートに前記全骨髄のサンプルを分割すること、ここで前記全骨髄のサンプルは、最初の細胞微小環境を維持する；
    前記少なくとも３５のアリコートのそれぞれを薬剤組成物と併用すること；および
    前記少なくとも３５のアリコートのそれぞれにおける少なくとも１つの細胞集団の細胞枯渇を測定すること；
    を含む方法。
  2. 薬剤への腫瘍細胞の応答性を分析する方法であって、
    血液学的腫瘍を有する患者から採取された全骨髄のサンプルを得ること；
    前記全骨髄のサンプルを少なくとも３５のアリコートに分割すること、ここで前記全骨髄のサンプルは、最初の細胞微小環境を維持する；
    前記少なくとも３５のアリコートのそれぞれを薬剤組成物と併用し、ここで、各アリコート中の薬剤組成物は、薬剤の同一性、濃度、またはそれらの併用の少なくとも１つが他のすべてのアリコートにおける薬剤組成物とは異なり、そして、前記薬剤組成物は、全体として少なくとも１つの非細胞毒性薬剤を含んでいること；
    薬剤組成物と併用される前記全骨髄のサンプルのアリコートをインキュベーションすること；および、
    インキュベーションされた各アリコートに対して、前記薬剤組成物への少なくとも１種の腫瘍細胞の応答性を分析すること；
    を含む前記方法。
  3. 前記分析が、前記アリコートを薬剤組成物と併用する７２時間以内に完了する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 薬剤組成物と併用されるアリコートの数が、少なくとも９６である、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記薬剤組成物の少なくとも１つが、非細胞毒性の薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記全骨髄のサンプルが、慢性リンパ性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、非Ｍ３急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病Ｍ３、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、および慢性骨髄性白血病からなる群から選択される血液学的新生物を示す細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
  7. 潜在的な薬剤治療計画への全骨髄のサンプルからの腫瘍細胞の応答を分析するための装置であって、ここで前記全骨髄は血液学的腫瘍を有する患者から採取され、前記全骨髄のサンプルは、最初の細胞微小環境を維持し、
    複数のチャンバー；および
    前記複数のチャンバーのそれぞれで異なる薬剤または薬剤の併用；
    を含み、ここで、前記チャンバーは、全体的に、
    複数の薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー；
    細胞毒性薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー；
    非細胞毒性薬剤を含む少なくとも１つのチャンバー；および
    全体のチャンバーに合計で少なくとも１０の異なる薬剤；
    を含む、前記装置。
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130226469A1 (en) * 2008-04-01 2013-08-29 Purdue Research Foundation Gate-free flow cytometry data analysis
US8491927B2 (en) * 2009-12-02 2013-07-23 Nimble Epitech, Llc Pharmaceutical composition containing a hypomethylating agent and a histone deacetylase inhibitor
EP2646830B1 (en) 2010-12-03 2016-04-13 Cellply S.R.L. Rapid screening of monoclonal antibodies
TWI503545B (zh) * 2010-12-24 2015-10-11 Methods of Screening Probiotics for Individual Differences
JP5987053B2 (ja) * 2011-05-12 2016-09-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド フレームワークシグネチャーペプチドを用いて動物サンプルにおける治療抗体を検出するための多重反応モニタリングｌｃ−ｍｓ／ｍｓ法
LT2776032T (lt) * 2011-11-09 2018-12-10 Bristol-Myers Squibb Company Hematologinių piktybinių navikų gydymas anti-cxcr4 antikūnu
KR101327533B1 (ko) * 2012-12-11 2013-11-08 사회복지법인 삼성생명공익재단 환자 맞춤형 항암제 선별용 시스템
KR102344774B1 (ko) * 2013-07-29 2021-12-28 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 자극을 동적으로 변화시키는 실-시간 피드백 시스템 제어 기술 플랫폼
EP2959904A1 (en) * 2014-06-27 2015-12-30 Institut De Recerca Contra La Leucemia Josep Carreras Methods for treating, diagnosing and prognosing a haematological malignancy
CN104606207A (zh) * 2015-02-09 2015-05-13 南京格耀生物科技有限公司 磺胺甲恶唑在制备抑制肿瘤细胞转移和扩散的药物中的应用
CN104958312A (zh) * 2015-05-14 2015-10-07 四川大学华西医院 一种治疗急性淋巴细胞白血病的联合用药物
EP3371595B1 (en) * 2015-11-04 2019-12-25 Vivia Biotech, S.L. Ex vivo method for testing cellular responsiveness of primary tumor cell populations to a drug or combination of drugs
CA3005076C (en) 2015-11-11 2024-01-02 Celator Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for selecting a treatment regimen for a subject with leukemia
JP7038353B2 (ja) 2016-04-13 2022-03-18 ヴィヴィア バイオテック，エス．エル エクスビボのｂｉｔｅ活性化ｔ細胞
CN106093394B (zh) * 2016-06-07 2017-12-26 中国人民解放军第二军医大学 Flt3蛋白在制备肝癌对索拉菲尼疗效评估试剂盒中的应用
AU2017283802B2 (en) 2016-06-14 2022-04-14 Cellply S.R.L. Screening kit and method
US20210189336A1 (en) 2017-10-18 2021-06-24 Vivia Biotech, S.L. Bite-activated car-t cells
CN111295588A (zh) 2017-10-31 2020-06-16 分子医学研究中心责任有限公司 确定测试化合物选择性的方法
US11116692B2 (en) 2018-06-07 2021-09-14 Gecko Alliance Group Inc. Method, system, computer program product and device for facilitating centralized control and monitoring over a network of a set of remote bathing unit systems
WO2020043716A1 (en) * 2018-08-27 2020-03-05 Katholieke Universiteit Leuven Pharmacological targeting of de novo serine/glycine synthesis
US20210358575A1 (en) * 2018-10-11 2021-11-18 Vivia Biotech Sl A method for determining the efficacy of treatment with a combination of drugs in a subject diagnosed with a disease and a method for classifying the utility of drug combinations in treatment of said subject
WO2020102595A1 (en) * 2018-11-14 2020-05-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Determining treatment response in single cells
EP3887395A4 (en) * 2018-11-30 2022-07-27 Intima Bioscience, Inc. METHODS FOR IDENTIFICATION OF IMMUNOMODULATORY GENES
CN112569342A (zh) * 2020-12-21 2021-03-30 中南大学 卡泊芬净和/或其可药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用及抗肿瘤药物
CN115531391B (zh) * 2022-11-03 2023-07-18 浙江大学 一种治疗白血病的药物及应用

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989006162A1 (en) * 1988-01-04 1989-07-13 Oncotech Incorporated Methods and apparatus assessing tumor resistance
US5366885A (en) * 1992-06-09 1994-11-22 Barranco Iii Sam C Method and kit for testing tumors for drug sensitivity
US5474909A (en) * 1992-08-07 1995-12-12 Anticancer, Inc. Noncolorimetric histoculture method for predicting drug response of tumors
AU2265695A (en) * 1995-01-17 1996-08-07 Pfizer Inc. The use of sertraline to treat cancer patients
US6825174B2 (en) * 1995-06-07 2004-11-30 East Carolina University Composition, formulations & method for prevention & treatment of diseases and conditions associated with bronchoconstriction, allergy(ies) & inflammation
US5736129A (en) * 1995-11-17 1998-04-07 Medenica; Rajko D. Flow cytometric pharmacosensitivity assay and method of cancer treatment
US5795909A (en) * 1996-05-22 1998-08-18 Neuromedica, Inc. DHA-pharmaceutical agent conjugates of taxanes
US6576636B2 (en) * 1996-05-22 2003-06-10 Protarga, Inc. Method of treating a liver disorder with fatty acid-antiviral agent conjugates
ATE302599T1 (de) * 1996-05-24 2005-09-15 Angiotech Pharm Inc Zubereitungen und verfahren zur behandlung oder prävention von krankheiten der körperpassagewege
US8828432B2 (en) * 1996-10-28 2014-09-09 General Mills, Inc. Embedding and encapsulation of sensitive components into a matrix to obtain discrete controlled release particles
US20030049618A1 (en) * 1997-03-07 2003-03-13 Ruben Steven M. 186 human secreted proteins
US7026447B2 (en) * 1997-10-09 2006-04-11 Human Genome Sciences, Inc. 53 human secreted proteins
US20030059471A1 (en) * 1997-12-15 2003-03-27 Compton Bruce Jon Oral delivery formulation
US6207717B1 (en) * 1999-01-12 2001-03-27 Dow Corning Corporation Entrapment of vitamins with an elastomeric silicone polyether
US6890904B1 (en) * 1999-05-25 2005-05-10 Point Therapeutics, Inc. Anti-tumor agents
US6911306B1 (en) * 1999-10-18 2005-06-28 Emory University TMS1 compositions and methods of use
CA2387801A1 (en) * 1999-11-04 2001-05-10 Human Genome Sciences, Inc. Uteroglobin-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
US6448030B1 (en) * 2000-02-18 2002-09-10 University Of Nevada-Las Vegas Method for predicting the efficacy of anti-cancer drugs
US7723303B2 (en) * 2000-08-24 2010-05-25 The Regents Of The University Of California Peptides and peptide mimetics to treat pathologies characterized by an inflammatory response
AU2002220265A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-15 University Of Vermont And State Agricultural College Compositions for inhibiting grb7
WO2002046750A2 (en) * 2000-11-13 2002-06-13 Vanderbilt University Methods of predicting chemotherapy response
US20050013853A1 (en) * 2000-11-29 2005-01-20 Irit Gil-Ad Anti-proliferative drugs
IL139975A0 (en) * 2000-11-29 2002-02-10 Univ Ramot Anti proliferative drugs
DE10064997A1 (de) * 2000-12-23 2002-06-27 Merck Patent Gmbh Benzoylpyridazine
ATE305467T1 (de) * 2001-01-31 2005-10-15 Pfizer Prod Inc Als inhibitoren von pde4-isozymen geeignete etherderivate
US7199124B2 (en) * 2001-02-02 2007-04-03 Takeda Pharmaceutical Company Limited JNK inhibitor
DE50212958D1 (de) * 2001-02-14 2008-12-11 Evotec Ag Dispensionsvorrichtung
JP4634694B2 (ja) * 2001-03-23 2011-02-16 ルイトポルド・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 脂肪アルコール薬物複合体
US20070021360A1 (en) * 2001-04-24 2007-01-25 Nyce Jonathan W Compositions, formulations and kit with anti-sense oligonucleotide and anti-inflammatory steroid and/or obiquinone for treatment of respiratory and lung disesase
US20040072824A1 (en) * 2001-06-01 2004-04-15 Adam Telerman Methods and compositions for the treatment of cancer
US7355042B2 (en) * 2001-10-16 2008-04-08 Hypnion, Inc. Treatment of CNS disorders using CNS target modulators
EP1469877A4 (en) * 2001-11-02 2008-08-20 Tanox Inc B-cell lymphoma-specific antigen for use in the diagnosis and treatment of malignant B cell lesions
WO2003062792A2 (en) * 2002-01-22 2003-07-31 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for determining drug responsiveness
GB0202337D0 (en) * 2002-02-01 2002-03-20 Univ Birmingham Cancer treatment
GB0203276D0 (en) * 2002-02-12 2002-03-27 Novartis Ag Organic compounds
DE10214388A1 (de) * 2002-03-30 2003-10-16 Cognis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung fester Mittel
WO2003102158A2 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 The Forsyth Institute Methods for increasing bone density
WO2004004661A2 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Point Therapeutics, Inc. Boroproline compound combination therapy
CN1389462A (zh) * 2002-07-12 2003-01-08 复旦大学 大叶蒟素及其同系物，和在制备药物组合物中的应用
US20060009378A1 (en) * 2002-11-14 2006-01-12 Itshak Golan Novel galectin sequences and compositions and methods utilizing same for treating or diagnosing arthritis and other chronic inflammatory diseases
US20040101477A1 (en) * 2002-11-27 2004-05-27 Xanthus Life Sciences, Inc. Individualization of therapy with anesthetics
US20050013854A1 (en) * 2003-04-09 2005-01-20 Mannino Raphael J. Novel encochleation methods, cochleates and methods of use
EP1631669A2 (en) * 2003-04-09 2006-03-08 Biodelivery Sciences International, Inc. Cochleate compositions directed against expression of proteins
US7329638B2 (en) * 2003-04-30 2008-02-12 The Regents Of The University Of Michigan Drug delivery compositions
US20050136043A1 (en) * 2003-08-07 2005-06-23 Ludwig Institute For Cancer Research TGFbeta signaling inhibitors
SE0302232D0 (sv) * 2003-08-18 2003-08-18 Astrazeneca Ab Novel Compounds
WO2005020933A2 (en) * 2003-09-02 2005-03-10 University Of South Florida Nanoparticles for drug-delivery
EP1687452A4 (en) * 2003-09-30 2008-08-06 Centocor Inc HUMAN HINGE-CORE MIMETICORPS, COMPOSITIONS, METHODS AND APPLICATIONS THEREOF
US20050143378A1 (en) * 2003-12-29 2005-06-30 Yun Anthony J. Treatment of conditions through pharmacological modulation of the autonomic nervous system
US9173847B2 (en) * 2003-10-10 2015-11-03 Veloxis Pharmaceuticals A/S Tablet comprising a fibrate
CA2545944A1 (en) * 2003-11-13 2005-06-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of trp channels as a treatment for cardiac hypertrophy and heart failure
WO2005072125A2 (en) * 2004-01-16 2005-08-11 Massachusetts Institute Of Technology Composite materials for controlled release of water soluble products
KR20060127136A (ko) * 2004-02-19 2006-12-11 노파르티스 아게 콜린에스테라아제 억제제의 혈관성 우울증을 치료하기 위한용도
KR101223366B1 (ko) * 2004-05-03 2013-01-16 헤르메스 바이오사이언스, 인코포레이티드 약물 전달에 유용한 리포좀
EP1768687A2 (en) * 2004-06-29 2007-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions related to the modulation of intercellular junctions
US20060009506A1 (en) * 2004-07-09 2006-01-12 Odyssey Thera, Inc. Drugs for the treatment of neoplastic disorders
ATE455777T1 (de) * 2004-07-23 2010-02-15 Medicines Co Leipzig Gmbh Substituierte pyridoä3',2':4,5üthienoä3,2- düpyrimidine und pyridoä3',2':4,5üfuroä3,2-dü- pyrimidine zur verwendung als inhibitoren der pda-4 und/oder tnf-alpha freisetzung
US7566548B2 (en) * 2004-08-13 2009-07-28 University Of Massachusetts Methods for identifying therapeutic agents and for treating disease
WO2006023347A1 (en) * 2004-08-20 2006-03-02 Alpharma, Inc. Paroxetine formulations
EP1627610A1 (en) * 2004-08-21 2006-02-22 TLT Medical Ltd Drug delivery throug application in nails
US7393662B2 (en) * 2004-09-03 2008-07-01 Centocor, Inc. Human EPO mimetic hinge core mimetibodies, compositions, methods and uses
EP1792519A4 (en) * 2004-09-10 2010-09-15 Otologics Llc ADJUSTABLE BONE CLAMP
US20060058966A1 (en) * 2004-09-15 2006-03-16 Bruckner Howard W Methods and systems for guiding selection of chemotherapeutic agents
US20060062734A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-23 Melker Richard J Methods and systems for preventing diversion of prescription drugs
CA2580694A1 (en) * 2004-09-23 2006-03-30 Alexander Michalow Methods for regulating neurotransmitter systems by inducing counteradaptations
CA2581775A1 (en) * 2004-09-27 2006-04-06 Sigmoid Biotechnologies Limited Dihydropyrimidine microcapsule - formulations
US20090011410A1 (en) * 2004-10-20 2009-01-08 Masato Mitsuhashi Method for tailoring administration of drugs by quantitation of mrna
DE602005011844D1 (de) * 2004-11-02 2009-01-29 Pfizer Sulfonylbenzimidazolderivate
JP2008519854A (ja) * 2004-11-12 2008-06-12 ノースウェスタン ユニバーシティ ヌクレオシドアナログ剤を用いて血液悪性疾患を治療する方法
WO2006069293A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Friedman Robert S Composition comprising n-acetylcysteine and further pain or anti- inflamm medications
US7709533B2 (en) * 2005-02-01 2010-05-04 Icagen, Inc. Imines as ion channel modulators
CN101201349B (zh) * 2005-03-17 2011-10-12 希森美康株式会社 试料分析装置和试料分析方法以及血液分析装置
WO2007053189A2 (en) * 2005-06-01 2007-05-10 Northwestern University Compositions and methods for altering immune function
US7655421B2 (en) * 2005-06-17 2010-02-02 Ciencia, Inc. Cytometer on a chip
TR201902033T4 (tr) * 2005-06-30 2019-03-21 Janssen Biotech Inc Anti-IL-23 antikorları, bileşimleri, yöntemleri ve kullanımları.
WO2007011292A1 (en) * 2005-07-21 2007-01-25 Astrazeneca Ab N-benzyl-morpholine derivatives as modulators of the chemokine receptor
WO2007015926A2 (en) * 2005-07-25 2007-02-08 Oregon Health And Science University Multiparameter flow cytometric cytometric cytotoxicity systems, methods, compositions and kits for evaluating the susceptibility of cancer
AR058071A1 (es) * 2005-10-03 2008-01-23 Astrazeneca Ab Derivados de dihidropirazolo (3,4-e)(1,4)diazepina. procesos de obtencion y composiciones farmaceuticas.
NZ566387A (en) * 2005-10-05 2010-05-28 Astrazeneca Uk Ltd Method to predict or monitor the response of a patient to an ErbB receptor drug by screening for mutations in an ErbB receptor
US20080318252A1 (en) * 2007-04-23 2008-12-25 Scott Kachlany Rapid assay to test anti-cancer drugs under physiological conditions
EA200801145A1 (ru) * 2005-12-02 2008-10-30 Пфайзер Лимитед Спироциклические производные хиназолина в качестве ингибиторов pde7
WO2007070852A2 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Acusphere, Inc. Processes for making particle-based pharmaceutical formulations for parenteral administration
WO2007103687A2 (en) * 2006-03-01 2007-09-13 Tristrata, Inc. Composition and method for topical treatment of tar-responsive dermatological disorders
JP2009536918A (ja) * 2006-03-06 2009-10-22 ファイザー株式会社 スルホニルベンゾイミダゾール誘導体
EP1996551A2 (en) * 2006-03-07 2008-12-03 AstraZeneca AB Piperidine derivatives, their process for preparation, their use as therapeutic agents and pharmaceutical compositions containing them.
US20090029958A1 (en) * 2006-03-08 2009-01-29 Lilian Alcaraz Phenethanolamine derivatives as beta2 adrenoreceptor agonists
TW200808763A (en) * 2006-05-08 2008-02-16 Astrazeneca Ab Novel compounds I
WO2007139895A2 (en) * 2006-05-24 2007-12-06 Cellumen, Inc. Method for modeling a disease
TW200815469A (en) * 2006-06-23 2008-04-01 Astrazeneca Ab Compounds
CA2656075A1 (en) * 2006-06-29 2008-01-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Butyl and butynyl benzyl amine compounds
CA2659655A1 (en) * 2006-08-08 2008-02-21 Alan M. Fogelman Salicylanilides enhance oral delivery of therapeutic peptides
US20080066739A1 (en) * 2006-09-20 2008-03-20 Lemahieu Edward Methods and systems of delivering medication via inhalation
DK2420497T3 (en) * 2006-09-26 2016-03-07 Celgene Corp 5-substituted quinazolinone derivatives as anticancer agents
US8841300B2 (en) * 2006-10-02 2014-09-23 Jerry M. Held Treatment for Parkinson's disease—combination high dose serotonergic synaptic reuptake inhibitor with phosphodiesterase inhibitor
ZA200902382B (en) * 2006-10-19 2010-08-25 Signal Pharm Llc Heteroaryl compounds, compositions thereof, and their use as protein kinase inhibitors
US7661326B2 (en) * 2006-10-26 2010-02-16 Beckman Coulter, Inc. Apparatus for aspirating and dispensing liquids in an automated analyzer
TW200825084A (en) * 2006-11-14 2008-06-16 Astrazeneca Ab New compounds 521
GB0625322D0 (en) * 2006-12-19 2007-01-24 Pharmakodex Ltd Pharmaceutical compositions
CA2677498C (en) * 2007-02-05 2016-05-17 Carbylan Biosurgery, Inc. Polymer formulations for delivery of bioactive agents
GB0704000D0 (en) * 2007-03-01 2007-04-11 Astrazeneca Ab Salts 670
US7846953B2 (en) * 2007-03-07 2010-12-07 Janssen Pharmaceutica, Nv Substituted phenoxy thiazolidinediones as estrogen related receptor-α modulators
GB0707127D0 (en) * 2007-04-13 2007-05-23 Zysis Ltd Pharmaceutical compositions
US20090004281A1 (en) * 2007-06-26 2009-01-01 Biovail Laboratories International S.R.L. Multiparticulate osmotic delivery system
US7943658B2 (en) * 2007-07-23 2011-05-17 Bristol-Myers Squibb Company Indole indane amide compounds useful as CB2 agonists and method
PL2200588T3 (pl) * 2007-09-25 2019-09-30 Solubest Ltd. Kompozycje zawierające lipofilowe związki aktywne i sposób ich wytwarzania
US8354417B2 (en) * 2007-09-26 2013-01-15 Celgene Corporation Solid forms comprising 3-(2,5-dimethyl-4-oxo-4H-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione, compositions comprising the same, and methods of using the same
US9125384B2 (en) * 2007-10-18 2015-09-08 Riken Mouse having human leukemic stem cell and leukemic non-stem cell amplified therein, and method for production thereof
WO2009052443A1 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Burnham Institute For Medical Research Naphthalene-based inhibitors of anti-apoptotic proteins
AU2008311824A1 (en) * 2007-10-19 2009-04-23 Burnham Institute For Medical Research Inhibitors of anti-apoptotic proteins
EP2249806A2 (en) * 2008-01-08 2010-11-17 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Resveratrol formulations
US8273774B2 (en) * 2008-05-27 2012-09-25 Astrazeneca Ab Phenoxypyridinylamide compounds
EP2304436A1 (en) * 2008-07-10 2011-04-06 Nodality, Inc. Methods for diagnosis, prognosis and treatment
TWI453207B (zh) * 2008-09-08 2014-09-21 Signal Pharm Llc 胺基三唑并吡啶，其組合物及使用其之治療方法
US20100099109A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Nodality, Inc., A Delaware Corporation Methods for Analyzing Drug Response
KR101046883B1 (ko) * 2008-11-19 2011-07-06 재단법인 아산사회복지재단 항암제 치료약제에 대한 감수성을 일괄적으로 결정하는 방법

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