ES2617379T3 - Forma de sal de un inhibidor de histona metiltransferasa EZH2 humana - Google Patents

Forma de sal de un inhibidor de histona metiltransferasa EZH2 humana Download PDF

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Kevin Wayne Kuntz
Kuan-Chun Huang
Hyeong Wook CHOI
Kristen SANDERS
Steven Mathieu
Arani CHANDA
Frank Fang
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Abstract

Hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-iljmetilj-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'- (morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida.

Description

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DESCRIPCION
Forma de sal de un inhibidor de histona metiltransferasa EZH2 humana Antecedentes de la invencion
Se estima que mas de 1,6 millones de personas seran diagnosticadas con cancer en 2012, Por ejemplo, el tipo mas comun de cancer en las mujeres es el cancer de mama, y esta enfermedad es responsable de uno de los mas altos indices de mortalidad entre todos los tipos de cancer que afectan a las mujeres. El tratamiento actual del cancer de mama se limita a la mastectoirna total o parcial, la radioterapia o la quimioterapia. Casi 230.000 de los casos de cancer en 2012 seran cancer de mama, lo cual resultara en 40.000 muertes. Vease, Siegel et al., Ca Cancer J Clin 2012; 62:10-29,
Un numero de muertes por cancer son causadas por cancer de la sangre, incluidos leucemias, mielomas y linfomas. En 2012, practicamente 80.000 de los casos de cancer seran linfomas, lo que provocara aproximadamente 20.000 muertes.
La radioterapia, la quimioterapia y la cirugfa son los metodos principales de tratamiento del cancer. No obstante, estas terapias son exitosas principalmente solo cuando el cancer se detecta en una etapa incipiente. Una vez que el cancer alcanza las etapas invasivas/metastasicas, las lmeas de celulas invasoras o metastasicas pueden escapar a la deteccion, provocando asf recafdas que requieren el uso de terapia altamente toxica. En este punto, tanto las celulas cancerosas como las celulas no afectadas del paciente se exponen a la terapia toxica, lo que resulta, entre otras complicaciones, en un debilitamiento del sistema inmunologico.
Por lo tanto, permanece la necesidad en la tecnica de nuevos metodos para tratar el cancer, tal como el cancer de mama o los linfomas, en un paciente.
Compendio de la invencion
Por consiguiente, en este documento se da a conocer el hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3- il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida:
imagen1
Tambien se da a conocer en el presente documento una forma de polimorfismo particular de hidrobromuro de N- ((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'- bifenil]-3-carboxamida ("Polimorfo A" o "Polimorfo A de hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3- il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida"). Como se describe en la presente invencion, la sal de hidrobromuro descrita en este documento, asf como tambien el Polimorfo A, exhiben propiedades ffsicas que pueden ser explotadas con el fin de obtener nuevas propiedades farmacologicas, y que pueden ser utilizadas en el desarrollo de sustancias farmaceuticas y farmacos.
En una realizacion, el hidrobromuro es cristalino. En otra realizacion, el hidrobromuro esta sustancialmente libre de impurezas. En otra realizacion, el hidrobromuro es un solido cristalino sustancialmente libre de hidrobromuro de N- ((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'- bifenil]-3-carboxamida amorfo.
En otro aspecto, se da a conocer en este documento una composicion farmaceutica que comprende el hidrobromuro anteriormente descrito, y un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
En un aspecto, el hidrobromuro anteriormente descrito se prepara usando un metodo que combina N-((4,6-dimetil-2- oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3- carboxamida con acido bromhidrico.
El polimorfismo A de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil- 4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida se puede definir de acuerdo con su patron de difraccion de rayos X
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por polvo. Por consiguiente, en una realizacion, el polimorfismo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene uno o mas picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados y aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados 2-teta. En otra realizacion, el polimorfismo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados y aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados 2-teta. Incluso en otra realizacion, el polimorfismo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/-0,3 grados 2-teta. Incluso en otra realizacion, el polimorfismo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo sustancialmente de acuerdo con la Figura 1. En otra realizacion, el polimorfismo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo sustancialmente de acuerdo con la Tabla 1.
El polimorfismo A tambien puede definirse de acuerdo con su termograma de calorimetna de barrido diferencial. En una realizacion, el polimorfismo exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial que tiene un pico caractenstico expresado en unidades de °C a una temperatura de 255 +/- 5°C. En una realizacion, el polimorfismo exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial de acuerdo con la Figura 3,
En un aspecto, el Polimorfo A se prepara usando un metodo que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con acido bromhndrico.
En otro aspecto, se da a conocer en este documento un metodo para recristalizar el Polimorfo A, que comprende las siguientes etapas: (a) disolver el Polimorfo A en un primer disolvente, y (b) anadir un segundo disolvente, de modo tal que dicho polimorfismo recristalice. En una realizacion, el primer disolvente es etanol y el segundo disolvente es MTBe. En otra realizacion, el metodo comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol, (b) calentar la mezcla, (c) anadir MTBE a la mezcla, formar un precipitado que comprende dicho polimorfismo y filtrar el precipitado de modo tal que dicho polimorfismo recristalice.
Incluso en otro aspecto, se da a conocer en este documento una composicion farmaceutica que comprende el Polimorfo Ay un vehfculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describe en este documento un metodo para tratar el cancer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de hidrobromuro anteriormente descrito, el Polimorfo A o una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de estos compuestos. Se pueden tratar una diversidad de tipos de cancer, incluidos linfoma no Hodgkin o cancer de mama.
Tambien se describe en este documento un metodo para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del compuesto de hidrobromuro anteriormente descrito, el Polimorfo A o una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de estos compuestos.
Incluso en otro aspecto, se da a conocer en este documento un metodo para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 in vitro, que comprende administrar el compuesto de hidrobromuro anteriormente descrito o el Polimorfo A.
Se da a conocer tambien en este documento el uso del compuesto de hidrobromuro anteriormente descrito, el Polimorfo A o una composicion farmaceutica que comprende cualquiera de estos compuestos, para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer en un sujeto que lo necesita.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 ilustra el patron de difraccion de rayos X por polvo del Polimorfo A (monohidrobromuro).
La Figura 2 ilustra el patron de difraccion de rayos X por polvo del dihidrobromuro del Compuesto La Figura 3 ilustra el termograma de calorimetna de barrido diferencial del Polimorfo A.
La Figura 4 ilustra la sorcion dinamica de vapor del Polimorfo A, que demuestra la baja higroscopicidad de este compuesto.
La Figura 5 ilustra el analisis HPLC del Polimorfo A durante tres dfas a una temperatura elevada. El Polimorfo A produjo impurezas mmimas durante este periodo.
La Figura 6 ilustra la sorcion dinamica de vapor de la sal de sodio del Compuesto I, que demuestra la higroscopicidad significativa de este compuesto.
La Figura 7 ilustra la sorcion dinamica de vapor de la sal hemisulfato del Compuesto I, que demuestra que este compuesto tiene higroscopicidad moderadamente alta.
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La Figura 8 expone los datos de calorimetna de barrido diferencial de la sal monohidrocloruro del Compuesto I, que indica que este compuesto es escasamente cristalino.
La Figura 9 ilustra el patron de difraccion de rayos X por polvo del intermedio sintetico 5.
La Figura 10 ilustra el patron de difraccion de rayos X por polvo del Polimorfo B.
La Figura 11 ilustra la estructura cristalina de rayos X del monohidrobromuro del Compuesto I.
Las Figuras 12-14 exponen los resultados de estudios in vivo del hidrobromuro del Compuesto I en una lmea celular de linfoma humano.
Las Figuras 15-16 muestran el efecto antineoplasico del hidrobromuro del Compuesto I en un modelo de xenoinjerto de linfoma de raton.
La Figura 17 ilustra el patron de difraccion de rayos X por polvo del intermedio sintetico 2.
Las Figuras 18A y B ilustran (A) el patron de difraccion de rayos X por polvo de la sal trihidrocloruro del Compuesto I y (B) la sorcion dinamica de vapor de la sal monohidruro del Compuesto I, que demuestra la higroscopicidad significativa de este compuesto.
Descripcion detallada de la invencion
Forma de sal HBr y Forma de Polimorfo A
Se da a conocer en la presente invencion el hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida:
imagen2
[0021] Tal como se emplea en la presente memoria, "Compuesto I" se refiere a N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- dihidropilidin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida. El hidrobromuro del Compuesto I se puede utilizar para inhibir la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2, o bien en un sujeto o in vitro. El hidrobromuro del Compuesto I tambien se puede utilizar para tratar el cancer en un sujeto que lo necesita.
El Compuesto I se puede protonar en uno o mas de sus sitios basicos, tales como los restos morfolina, anilina disustituida y/o piridona. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, se da a conocer en este documento el monohidrobromuro, dihidrobromuro o trihidrobromuro del Compuesto I. En una realizacion, se da a conocer en este documento el monohidrobromuro del Compuesto I. Cuando el compuesto es el monohidrobromuro, el compuesto se puede protonar en cualquier sitio basico. En una realizacion no limitativa, el Compuesto I se protona en el nitrogeno del sustituyente morfolino, proporcionando un monohidrobromuro del Compuesto I que tiene la siguiente estructura:
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Este monohidrobromuro particular puede denominarse "bromuro de 4-((3-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3- il)metil)carbamoil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-[1,1-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io". La Figura 11 ilustra la estructura cristalina de rayos X de esta forma de sal particular.
El hidrobromuro del Compuesto I posee una serie de propiedades ffsicas ventajosas frente a su forma base, asf como tambien otras sales de la base libre. En particular, el hidrobromuro del Compuesto I posee baja higroscopicidad en comparacion con otras formas de sal del Compuesto I. Para que un compuesto sea eficaz en una terapia, en general se requiere que el compuesto sea mmimamente higroscopico. Las formas de farmaco que son altamente higroscopicas pueden ser inestables, ya que la velocidad de disolucion de la forma de farmaco puede cambiar a medida que se conserva en entornos con humedad variable. A su vez, la higroscopicidad puede impactar en el manipuleo y la fabricacion a gran escala de un compuesto, ya que puede ser diffcil determinar el peso verdadero de un agente activo higroscopico al preparar una composicion farmaceutica que comprenda ese agente. El hidrobromuro del Compuesto I tiene baja higroscopicidad en comparacion con otras formas de sal del Compuesto I. Como tal, puede almacenarse durante periodos considerables, y no sufrir cambios nocivos en, por ejemplo, solubilidad, densidad o incluso composicion qmmica.
Ademas de las ventajas anteriores, el hidrobromuro del Compuesto I puede producirse en una forma altamente cristalina, que es util en la preparacion de formulaciones farmaceuticas, y suele mejorar el manipuleo, la manipulacion y el almacenamiento en general del compuesto de farmaco. En una realizacion preferida, la forma cristalina del hidrobromuro del Compuesto I es en una forma que se denomina "Polimorfo A".
La capacidad de una sustancia de existir en mas de una forma cristalina se define como polimorfismo, las distintas formas cristalinas de una sustancia particular se denominan "polimorfos". En general, el polimorfismo esta afectado por la capacidad de una molecula de una sustancia de cambiar su conformacion o de formar distintas interacciones intermoleculares o intra-moleculares, particularmente enlaces hidrogeno, que se refleja en diferentes configuraciones atomicas en las matrices cristalinas de los distintos polimorfos. En contraste, la forma externa general de una sustancia se conoce como "morfologfa", la cual refleja la forma externa del cristal y los planos presentes, sin referencia a la estructura interna. Los cristales pueden exhibir diferente morfologfa en funcion de diferentes condiciones, tales como, por ejemplo, mdice de crecimiento, agitacion y presencia de impurezas.
Los diferentes polimorfos de una sustancia pueden poseer distintas energfas de la matriz cristalina y, por lo tanto, en estado solido pueden demostrar distintas propiedades ffsicas tales como forma, densidad, punto de fusion, color, estabilidad, solubilidad, velocidad de disolucion, etc., que puede, a su vez, afectar la estabilidad, velocidad de disolucion y/o biodisponibilidad de un polimorfo determinado y su adecuacion para uso como producto farmaceutico y en composiciones farmaceuticas.
El Polimorfo A es altamente cristalino y exhibe baja higroscopicidad. Ademas, este polimorfo se puede obtener en forma reproducible, y ligeros cambios en las condiciones de cristalizacion no producen formas cristalinas diferentes.
Es conveniente el acceso a diferentes polimorfos del hidrobromuro del Compuesto I por una serie de motivos. Uno de ellos que los polimorfos individuales pueden incorporar distintas impurezas, o residuos qmmicos, tras la cristalizacion. Por ejemplo, las impurezas pueden eliminarse durante el proceso de convertir el Compuesto I en el Polimorfo A.
Sin desear estar influenciados por la teona, las formas polimorfas que exhiben formas cristalinas compactas poseen ventajas en terminos de facilidad de filtracion y facilidad de flujo. El Polimorfo A exhibe una forma cristalina compacta que por lo tanto posee estas ventajas.
En determinadas realizaciones, el Polimorfo A es identificable en funcion de los picos caractensticos en un analisis de difraccion de rayos X por polvo. La difraccion de rayos X por polvo, tambien denominada XRPD, es una tecnica cientffica que usa difraccion de rayos X, neutrones o electrones en polvo, materiales microcristalinos u otros materiales solidos para caracterizacion estructural de los materiales. En una realizacion, el Polimorfo A exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene uno o mas picos caractensticos expresados en grados 2-teta a
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aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados y aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados 2-teta. En otra realizacion, el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados y aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados 2-teta.
En una realizacion, el Polimorfo A exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 5 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados,
22.0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/-0,3 grados 2-teta. En otra realizacion, el Polimorfo A exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 6 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta. Incluso en otra realizacion, el Polimorfo A exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 7 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta. En otra realizacion, el Polimorfo A exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 8 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta. Incluso en otra realizacion, el Polimorfo A exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 9 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/-0,3 grados 2-teta. Incluso en otra realizacion, el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 10 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
Incluso en otra realizacion, el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 14,3 +/- 0,3 grados, aproximadamente 18,7 +/- 0,3 grados, aproximadamente 23,3 +/- 0,3 grados y aproximadamente 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
Incluso en otra realizacion, el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 10,1 +/- 0,3 grados, aproximadamente 14,3 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados, aproximadamente 18,7 +/- 0,3 grados, aproximadamente 20,6 +/- 0,3 grados, aproximadamente 20,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 21,8 +/- 0,3 grados, aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados, aproximadamente 23,3 +/- 0,3 grados y aproximadamente 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta. Incluso en otra realizacion, el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo sustancialmente de acuerdo con la Figura 1, En otra realizacion, el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo sustancialmente de acuerdo con los valores 2-teta enumerados en la Tabla 1,
Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "aproximadamente", cuando se utiliza en referencia a un valor de grados 2-teta, se refiere a un valor establecido +/- 0,3 grados 2-teta.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden el Polimorfo A se pueden identificar por comparacion de los patrones de difraccion de rayos X por polvo de las composiciones con un patron de difraccion de rayos X por polvo del Polimorfo A. Se ha de apreciar que las composiciones farmaceuticas que comprenden el Polimorfo A pueden exhibir patrones de difraccion de rayos X por polvo no identicos en comparacion con un patron de difraccion de rayos X por polvo del Polimorfo A puro.
En determinadas realizaciones, el Polimorfo A es identificable en funcion de un pico caractenstico observado en un termograma de calorimetna de barrido diferencial. La calorimetna de barrido diferencial, o DSC, es una tecnica termoanalttica en la que la diferencia en la cantidad de calor requerida para incrementar la temperatura de una muestra y la referencia se mide como una funcion de temperatura. En una realizacion, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial que tiene un pico caractenstico expresado en unidades de °C a una temperatura de aproximadamente 255 +/- 5°C. En otra realizacion, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial que tiene un solo pico endotermico observado en el intervalo de temperatura de 250-255°C. En otra realizacion, el Polimorfo A exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial sustancialmente de acuerdo con la Figura 3,
En determinadas realizaciones, el Polimorfo A puede contener impurezas. Los ejemplos no limitativos de impurezas incluyen formas polimorfas no deseadas, o moleculas organicas e inorganicas residuales tales como disolventes, agua o sales. En una realizacion, el Polimorfo A esta sustancialmente libre de impurezas. En otra realizacion, el Polimorfo A contiene menos de 10% en peso de impurezas totales. En otra realizacion, el Polimorfo A contiene menos de 5% en peso de impurezas totales. En otra realizacion, el Polimorfo A contiene menos de 1% en peso de impurezas totales. Incluso en otra realizacion, el Polimorfo A contiene menos de 0,1% en peso de impurezas totales.
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En determinadas realizaciones, el Polimorfo A es un solido cristalino sustancialmente libre del hidrobromuro del Compuesto I amorfo. Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "sustancialmente libre del hidrobromuro del Compuesto I amorfo" significa que el compuesto no contiene cantidades significativas del hidrobromuro del Compuesto I amorfo. En determinadas realizaciones, esta presente por lo menos aproximadamente 95% en peso del Polimorfo A cristalino. Incluso en otras realizaciones de la invencion, esta presente por lo menos aproximadamente 99% en peso del Polimorfo A cristalino.
En otra realizacion, el Polimorfo A esta sustancialmente libre del Polimorfo B.
La sal de la invencion, y su forma cristalina del Polimorfo A, se pueden hallar junto con otras sustancias o se pueden aislar. En algunas realizaciones, la sal de la invencion, o su forma cristalina, esta sustancialmente aislada. Por "sustancialmente aislada " se entiende que la sal o su forma cristalina esta por lo menos parcial o sustancialmente separada del entorno en el que se formo o detecto. La separacion parcial puede incluir, por ejemplo, una composicion enriquecida en la sal de la invencion. La separacion sustancial puede incluir composiciones que contienen por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 60%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 80%, por lo menos aproximadamente 90%, por lo menos aproximadamente 95%, por lo menos aproximadamente 97% o por lo menos aproximadamente 99% en peso del hidrobromuro del Compuesto I y el Polimorfo A. Los metodos para aislar compuestos y sus sales son habituales en la tecnica.
Tanto el hidrobromuro del Compuesto I como el Polimorfo A pueden ocurrir como cualquier tautomero razonable, o una mezcla de tautomeros razonables. Tal como se emplea en la presente memoria, "tautomero" hace referencia a uno de dos o mas isomeros estructurales que existen en equilibrio y se convierten facilmente de una forma isomerica a otra. Los ejemplos incluye tautomeros de ceto-enol, tales como acetona/propen-2-ol, y similares. El hidrobromuro del Compuesto I y el Polimorfo A pueden tener uno o mas tautomeros y por ende incluyen diversos isomeros, es decir, piridin-2(1H)-ona y el correspondiente piridin-2-ol. Todas las formas isomericas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente invencion.
Preparacion de la forma de sal HBr y el Polimorfo A
El hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A, pueden prepararse usando tecnicas conocidas. Convencionalmente, se prepara una forma de sal combinando en disolucion el compuesto de base libre y un acido que contiene el anion de la forma de sal deseada, y luego aislando el producto de sal solido a partir de la disolucion de reaccion (p. ej., cristalizacion, precipitacion, evaporacion, etc.). Se pueden emplear otras tecnicas formadoras de sales.
El Esquema 1 a continuacion senala una realizacion particular para la produccion de la base libre del Compuesto I, asf como tambien el hidrobromuro del Compuesto I. En smtesis, se somete a reaccion 3-amino-5-bromo-2- metilbenzoato de metilo (1) con dihidro-2H-piran-4(3H)-ona bajo condiciones de aminacion reductora para formar 5- bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo (2) en la etapa 1, En la etapa 2, se usa nuevamente la aminacion reductora para formar 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato (3). Este compuesto luego se somete a reaccion bajo condiciones de acoplamiento Suzuki en la etapa 3 para formar 5- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de metilo (4), que se hidroliza al correspondiente acido (5) en la etapa 4. En la etapa 5, se somete a reaccion acido (5) bajo condiciones de reaccion de acoplamiento de amida con hidrocloruro de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona para formar el Compuesto I.
Como se muestra, el Compuesto I puede luego someterse a reaccion con HBr acuoso para formar el hidrobromuro del Compuesto I.
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imagen4
Esquema 1
CH-.CHO
f | Y 1 NaBHfOAc);, YT
NaBHlOACJj
j—
Etapa 2
Eta pa
O' OMe
k.O
mWo
“s^jCTO
:
Ma,.COq
Eta pa 3
Eta pa 4
O NHjG f^YN
V
48% aq HBr.
Me' Me
Solvent
Etapa 5
Eta pa b
Compuesto I - HBr
Compuesto I
La srntesis descrita precedentemente tiene una serie de ventajas. Por ejemplo, utiliza un numero de intermedios que se pueden preparar en formas cristalinas que pueden aislarse. Al usar intermedios cristalinos, son necesarias tecnicas de purificacion mrnima (p. ej., cromatograffa), lo que lleva a un mejor rendimiento del Compuesto I final.
Por consiguiente, la presente invencion da a conocer el compuesto 1 intermedio en forma cristalina. En otra realizacion, se da a conocer en esta invencion el compuesto 2 intermedio en forma cristalina. La Figura 17 muestra un patron de difraccion de rayos X por polvo del compuesto 2 cristalino. Incluso en otra realizacion, el compuesto 5 intermedio es cristalino. La Figura 9 muestra un patron de difraccion de rayos X por polvo del compuesto 5 cristalino, En otras realizaciones, los compuestos 2 y/o 5 se producen en forma sustancialmente pura sin el uso de cromatograffa. El experto en la tecnica ha de apreciar que la cristalizacion de intermedios no necesariamente procede sin esfuerzo o de manera eficiente.
Tambien se da a conocer en este documento un metodo para preparar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3- il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida que comprende someter a reaccion acido 5-(Etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxflico (5) con una sal de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona. En una realizacion de este metodo, (5) esta en forma cristalina.
El Compuesto I se puede someter a reaccion con HBr acuoso en presencia de un disolvente apropiado para formar el Polimorfo A, una forma cristalina particular del hidrobromuro. En una realizacion, el Compuesto I se somete a reaccion con HBr acuoso en presencia de etanol y acetato de etilo para formar el Polimorfo A.
Una vez preparado el polimorfo, se puede recristalizar, usando el mismo disolvente (o disolventes) que se usaron para preparar el polimorfo, o un disolvente (o disolventes) distintos, para producir una composicion que tiene mejor cristalinidad. En general, el Polimorfo A puede recristalizarse disolviendo el polimorfo en uno o mas disolventes, opcionalmente calentando, seguido de una etapa de enfriamiento opcional, y luego aislando la estructura cristalina a traves de, p. ej., una etapa de filtracion. Despues de que el polimorfo es inicialmente disuelto en el primer disolvente (o combinacion de disolventes), se puede anadir un disolvente adicional, distinto en cualquier punto del proceso (antes o despues de calentar, antes o despues de enfriar, etc.) para producir la estructura cristalina deseada. Por ejemplo, se puede usar un primer disolvente para disolver el compuesto polimorfo, y luego se puede anadir un segundo disolvente (p. ej., un anti-disolvente) para causar que el polimorfo precipite de la disolucion. En una realizacion, se anade agua al primer disolvente para auxiliar en la disolucion del polimorfo.
Los ejemplos no limitativos de disolventes que pueden usarse para la recristalizacion del Polimorfo A son los siguientes: metanol, etanol, acetato de etilo, eter metil terc-butflico, agua, alcohol isopropflico, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo y 2-metiltetrahidrofurano, asf como tambien sus combinaciones. Los ejemplos no limitativos de combinaciones de disolventes que son utiles para la recristalizacion del Polimorfo A son (disolvente y anti-disolvente, en donde puede anadirse agua al primer disolvente para ayudar a disolver el polimorfo): metanol/agua y acetato de
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etilo, alcohol isoprc^lico/agua y acetato de etilo, tetrahidrofurano/agua y acetato de etilo, acetona y acetato de etilo, acetonitrilo/agua y acetato de etilo, etanol/agua y eter metil terc-butilico, alcohol isopropflico/agua y eter metil terc- butflico, etanol/agua y tetrahidrofurano, alcohol isopropflico/agua y acetona, y etanol/agua y acetato de etilo. En realizaciones particulares, las combinaciones de disolvente son metanol/agua y acetato de etilo, alcohol isopropflico/agua y acetato de etilo, etanol/agua y 2-metiltetrahidrofurano, y metanol/2-metiltetrahidrofurano.
En un aspecto, el Polimorfo A se prepara utilizando un metodo que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2- dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con acido bromhndrico.
En otro aspecto, se da a conocer en este documento un metodo para recristalizar el Polimorfo A, que comprende las siguientes etapas: (a) disolver el Polimorfo A en un primer disolvente, y (b) anadir un segundo disolvente, de modo tal que dicho polimorfo se recristalice. En una realizacion, el primer disolvente es etanol, y el segundo disolvente es MTBe. En otra realizacion, el metodo comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol, (b) calentar la mezcla, (c) anadir MTBE a la mezcla, formar un precipitado que comprende dicho polimorfo y filtrar el precipitado de modo tal que dicho polimorfo se recristalice.
Composiciones farmaceuticas
En otro aspecto, se da a conocer en la presente invencion una composicion farmaceutica que comprende el hidrobromuro del Compuesto I, y un vehnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. Tambien se da a conocer en este documento una composicion farmaceutica que comprende el Polimorfo A, y un vehnculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
La expresion "composicion farmaceutica" incluye preparaciones adecuadas para administracion a mairnferos, p. ej., seres humanos. Cuando los compuestos de la presente invencion se administran como productos farmaceuticos a mai^eras, p. ej., seres humanos, pueden administrarse per se o como una composicion farmaceutica que contiene, por ejemplo, 0,1% a 99,9% (mas preferiblemente, 0,5 a 90%) de ingrediente activo en combinacion con un vehnculo farmaceuticamente aceptable.
Los compuestos descritos en este documento (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I y el Polimorfo A) se pueden combinar con un vehnculo farmaceuticamente aceptable de acuerdo con tecnicas adecuadas de combinacion de productos farmaceuticos. Tal como se emplea en la presente memoria, "vehnculo farmaceuticamente aceptable" puede incluir todos y cada uno de los disolventes, diluyentes u otros vehnculos lfquidos, auxiliares de dispersion o suspension, agentes activos superficiales, agentes isotonicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes solidos, lubricantes y similares, segun sea adecuado para la forma farmaceutica deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, Decimosexta Edicion, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) describe diversos vehnculos empleados en la formulacion de composiciones farmaceuticas y tecnicas conocidas para su preparacion. Excepto que algun medio de vehnculo convencional sea incompatible con los compuestos, en el sentido de producir un efecto biologico indeseable u otra forma de interaccion perjudicial con cualquier otro componente(s) de la composicion farmaceutica, su uso se contempla dentro del alcance de la presente invencion. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehnculos farmaceuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitarse a ello, azucares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidon de mafz y almidon de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como mantequilla de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuate, aceite de algodon; aceite de cartamo, aceite de sesamo; aceite de oliva; aceite de mafz y aceite de soja; glicoles; tales como propilenglicol; esteres tales como etil oleato y etil laurato; agar; agentes tampon tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido algmico; agua apirogena; disolucion salina isotonica; disolucion de Ringer; alcohol etflico y disoluciones tampon de fosfato, asf como tambien otros lubricantes compatibles no toxicos tales como lauril sulfato sodico y estearato de magnesio, ademas de colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saponferos y perfumantes, conservantes y antioxidantes que tambien pueden estar presentes en la composicion, segun el criterio del formulador.
Asimismo, el vehnculo puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de la preparacion deseada para administracion, p. ej., oral, nasal, rectal, vaginal, parenteral (incluidas infusiones o inyecciones intravenosas). En la preparacion de composiciones para presentacion oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmaceuticos habituales. Los medios farmaceuticos habituales incluyen, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, saponferos, conservantes, colorantes y similares en el caso de preparaciones lfquidas orales (tales como por ejemplo suspensiones, disoluciones, emulsiones y elixires); aerosoles; o vehnculos tales como almidon, azucares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulacion, lubricantes, aglutinantes, desintegrantes y similares, en el caso de preparaciones orales (tales como por ejemplo polvos, capsulas y comprimidos).
Los agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato sodico y estearato de magnesio, ademas de colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, edulcorantes, saponferos y perfumantes, conservantes y antioxidantes pueden tambien estar presentes en las composiciones.
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Los ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: agua antioxidantes solubles, tales como acido ascorbico, hidrocloruro de cistema, bisulfato sodico, metabisulfito sodico, sulfito sodico y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, tocoferoles y similares; y agentes quelantes de metal, tales como acido cftrico, acido etilendiamina tetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.
Las composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos se pueden formular para tener cualquier concentracion deseada. En algunas realizaciones, la composicion se formula de manera tal que comprenda por lo menos una cantidad terapeuticamente eficaz. En algunas realizaciones, la composicion se formula de manera tal que comprenda una cantidad que no causana uno o mas efectos colaterales indeseados.
Dado que la forma cristalina del hidrobromuro del Compuesto I se mantiene mas facilmente durante su preparacion, las presentaciones solidas son una forma preferida para la composicion farmaceutica de la invencion. Las presentaciones solidas para administracion oral, tales como capsulas, comprimidos, pastillas, polvos y granulos, se prefieren particularmente. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir por tecnicas conocidas en el campo.
Las composiciones farmaceuticas incluyen aquellas adecuadas para administracion oral, sublingual, nasal, rectal, vaginal, topica, bucal y parenteral (incluidas subcutanea, intramuscular e intravenosa), aunque la ruta mas adecuada dependera de la naturaleza y la gravedad de la afeccion que se este tratando. Las composiciones pueden presentarse convenientemente en presentaciones unitarias, y prepararse mediante cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica de farmacia. En determinadas realizaciones, la composicion farmaceutica se formula para administracion oral en la forma de una pastilla, capsula, gragea o comprimido. En otras realizaciones, la composicion farmaceutica tiene la forma de una suspension.
Los compuestos que se dan a conocer en la presente invencion son adecuados como agentes activos en composiciones farmaceuticas que son particularmente eficaces para tratar trastornos asociados con EZH2, especialmente cancer. La composicion farmaceutica en diversas realizaciones tiene una cantidad farmaceuticamente eficaz del hidrobromuro del Compuesto I o el Polimorfo A, junto con otros excipientes, vehmulos, cargas, diluyentes y similares farmaceuticamente aceptables.
Una “cantidad terapeutica o farmaceuticamente eficaz" es una cantidad de un compuesto (el hidrobromuro del Compuesto I o el Polimorfo A), que cuando se administra a un paciente, palia un smtoma de una enfermedad o dolencia, p. ej., previene los diversos smtomas morfologicos y somaticos del cancer. En un ejemplo, una cantidad eficaz del hidrobromuro del Compuesto I o el Polimorfo A es la cantidad suficiente para tratar el cancer en un sujeto. La cantidad puede variar dependiendo de factores tales como la talla y el peso del sujeto, el tipo de enfermedad o el compuesto particular de la invencion. La cantidad del hidrobromuro del Compuesto I o el Polimorfo A que constituye una "cantidad eficaz " variara dependiendo del compuesto, la patologfa y su gravedad, la edad del paciente que se ha de tratar y similares. El experto en la tecnica puede determinar de manera rutinaria la cantidad eficaz, teniendo en cuenta sus conocimientos y la presente descripcion.
El esquema de administracion puede afectar lo que constituye una cantidad farmaceuticamente eficaz. El hidrobromuro del Compuesto I o el Polimorfo A, y las composiciones que comprenden alguno de estos compuestos, se pueden administrar al sujeto o bien antes o despues del inicio de una enfermedad. A su vez, se pueden administrar varias dosis divididas, asf como tambien dosis escalonadas a diario o secuencialmente, o la dosis se puede infundir continuamente, o puede ser una inyeccion en bolo. Ademas, las dosis pueden incrementarse o reducirse proporcionalmente segun lo indicado por las exigencias de la situacion terapeutica o profilactica.
Metodos de tratamiento
Los compuestos de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) inhiben la actividad de la histona metiltransferasa de EZH2 o su mutante y, por consiguiente, en un aspecto de la invencion, ciertos compuestos descritos en este documento son candidatos para uso en el tratamiento o la prevencion de ciertas condiciones y enfermedades. La presente descripcion da a conocer metodos para tratar condiciones y enfermedades cuyo curso puede estar influenciado por la modulacion del estado de metilacion de las histonas u otras protemas, en donde dicho estado de metilacion es mediado al menos en parte por la actividad de EZH2, La modulacion del estado de metilacion de las histonas a su vez influencia el nivel de expresion de genes diana activados por metilacion, y/o genes diana suprimidos por metilacion. El metodo incluye administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la presente invencion.
El trastorno en el que la metilacion de la protema mediada por EZH2 cumple una funcion puede ser cancer o una afeccion pre-cancerosa. La presente invencion da a conocer tambien el uso de un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) en el tratamiento del cancer o pre-cancer, cuyo curso se puede influenciar modulando la metilacion de la protema mediada por EZH2 o, para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de dicho cancer o pre-cancer. Los tipos de cancer ilustrativos que se pueden tratar incluyen linfomas, incluido linfoma no Hodgkin, linfoma folicular (FL) y linfoma difuso de celulas grandes B (DLBCL); melanoma; y leucemia, incluida CML. La afeccion pre-cancerosa ilustrativa incluye smdrome mielodisplasico (MDS; antes conocido como pre-leucemia).
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Incluso en otra realizacion, se describe en este documento un metodo para tratar un linfoma que comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del hidrobromuro del Compuesto I.
Incluso en otra realizacion, se describe en este documento un metodo para tratar un linfoma, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad eficaz del Polimorfo A.
La presente descripcion tambien da a conocer metodos para proteger contra un trastorno en el que la metilacion de protemas mediada por EZH2 cumple una funcion en un sujeto que lo necesita, administrando una cantidad terapeuticamente eficaz del compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) a un sujeto que necesita dicho tratamiento. El trastorno puede ser cancer, p. ej., cancer en el que la metilacion de protemas mediada por EZH2 cumple una funcion. La presente invencion tambien da a conocer el uso de un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) para la preparacion de un medicamento util para la prevencion de un trastorno proliferativo celular asociado, por lo menos en parte, con la metilacion de protemas mediada por EZH2.
Los compuestos de la presente invencion se pueden utilizar para modular la metilacion de protemas (p. ej., histona), p. ej., para modular la actividad de la enzima histona metiltransferasa o histona desmetilasa. Por lo menos algunos de los compuestos de la invencion se pueden emplear in vivo o in vitro para modular la metilacion de protemas. Se ha descrito que la metilacion de histona esta implicada en la expresion aberrante de ciertos genes en cancer, y en el silenciamiento de genes neuronales en celulas no neuronales. Por lo menos algunos compuestos descritos en este documento son candidatos adecuados para tratar estas enfermedades, es decir, para reducir la metilacion o restaurar la metilacion hasta aproximadamente su nivel en celulas normales equivalentes.
Se pueden emplear compuestos que son moduladores de metilacion para modular la proliferacion celular. Por ejemplo, en algunos casos, la proliferacion excesiva se puede reducir con agentes que disminuyen la metilacion, mientras que la proliferacion insuficiente se puede estimular con agentes que incrementan la metilacion. Por consiguiente, las enfermedades que se pueden tratar con los compuestos de la invencion pueden incluir enfermedades hiperproliferativas, tales como desarrollo de celulas benignas y desarrollo de celulas malignas.
Tal como se emplea en la presente memoria, un "sujeto que lo necesita" es un sujeto que tiene un trastorno en el que la metilacion de protemas mediada por EZH2 cumple una funcion, o un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar un trastorno en relacion con la poblacion general. Un sujeto que lo necesita puede tener una afeccion pre-cancerosa. Preferiblemente, un sujeto que lo necesita padece cancer. Un "sujeto" incluye a un mairnfero. El marnffero puede ser, p. ej., un mamffero humano u otro no humano adecuado, tal como un primate, raton, rata, perro, gato, vaca, caballo, cabra, camello, oveja o cerdo. El sujeto puede ser tambien un pajaro o ave. En una realizacion, el mam^era es un ser humano.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "trastorno proliferativo de las celulas" hace referencia a afecciones en las cuales el crecimiento desrregulado o anormal, o ambos, de las celulas, puede provocar el desarrollo de una afeccion o enfermedad no deseada, que puede ser o no cancerosa. Los trastornos proliferativos de las celulas ilustrativos que se pueden tratar con los compuestos de la invencion abarcan una diversidad de afecciones en las que la division celular esta desrregulada. Los trastornos proliferativos de las celulas ilustrativos incluyen, aunque sin limitarse a ello, neoplasias, tumores benignos, tumores malignos, condiciones pre-cancerosas, tumores in situ, tumores encapsulados, tumores metastasicos, tumores lfquidos, tumores solidos, tumores inmunologicos, tumores hematologicos, cancer, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas y celulas en proceso de division rapida. La expresion "celula en proceso de division rapida", tal como se emplea en la presente memoria, se define como cualquier celula que se divide a una velocidad que excede o es mayor que aquella esperada u observada entre celulas aledanas o yuxtapuestas dentro del mismo tejido. Un trastorno proliferativo de las celulas incluye una afeccion pre-cancerosa. Un trastorno proliferativo de las celulas incluye cancer. En un aspecto, los metodos que se dan a conocer en este documento se usan para tratar o mejorar un smtoma de cancer o para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. El termino "cancer" incluye tumores solidos, asf como tambien tumores hematologicos y/o malignidades. Una "celula pre-cancerosa" es una celula que manifiesta un trastorno proliferativo de las celulas que es una afeccion pre-cancerosa. Una "celula de cancer " o "celula cancerosa" es una celula que manifiesta un trastorno proliferativo de las celulas que es un cancer. Se puede emplear cualquier medio reproducible de medicion para identificar celulas de cancer o celulas pre-cancerosas. Las celulas cancerosas o las celulas pre-cancerosas se pueden identificar mediante tipificacion o clasificacion histologica de muestras de tejido (p. ej., una muestra de biopsia). Las celulas cancerosas o las celulas pre-cancerosas se pueden identificar a traves del uso de marcadores moleculares apropiados.
Las afecciones o trastornos no cancerosos ilustrativos que se pueden tratar usando uno o mas compuestos de la presente invencion incluyen, aunque sin limitarse a ello, artritis reumatoidea, inflamacion; enfermedad autoinmune; afecciones linfoproliferativas; acromegalia; espondilitis reumatoidea; artrosis; gota, otras afecciones artnticas; septicemia; choque septicemico; choque endotoxico; septicemia gramnegativa; smdrome de choque toxico; asma; smdrome de dificultad respiratoria aguda; enfermedad pulmonar obstructiva cronica; inflamacion pulmonar cronica; enfermedad inflamatoria de los intestinos; enfermedad de Crohn; psoriasis; eczema; colitis ulcerosa; fibrosis pancreatica; fibrosis hepatica; enfermedad renal aguda y cronica; smdrome del intestino irritable; piresis; restenosis; paludismo cerebral; accidente cerebrovascular y lesion isquemica; traumatismo neuronal; enfermedad de Alzheimer;
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enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; dolor agudo y cronico; rinitis alergica; conjuntivitis alergica; insuficiencia ca^aca cronica; smdrome coronario agudo; caquexia; paludismo; lepra; leishmaniasis; enfermedad de Lyme; smdrome de Reiter; sinovitis aguda; degeneracion macular, bursitis; tendinitis; tenosinovitis; hernia de disco o smdrome de prolapso del disco intervertebral; osteopetrosis; trombosis; restenosis; silicosis; sarcoidosis pulmonar; enfermedades de resorcion osea, tales como osteoporosis; reaccion de injerto frente a hospedante; esclerosis multiple; lupus; fibromialgia; sida y otras enfermedades vfticas tales como Herpes Zoster, Herpes Simple I o II, virus de la gripe y citomegalovirus; y diabetes mellitus.
Los tipos de cancer ilustrativos que se pueden tratar usando uno o mas compuestos de la presente invencion incluyen, aunque sin limitarse a ello, carcinoma adrenocortical, cancer relacionado con el sida, linfoma relacionado con el sida, cancer anal, cancer anorrectal, cancer del canal anal, cancer del apendice, atrocitoma cerebelar infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de celulas basales, cancer de piel (no melanoma), cancer biliar, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer del conducto biliar intrahepatico, cancer de vejiga, cancer de vejiga urinaria, cancer de huesos y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cancer de cerebro, tumor de cerebro, glioma del tronco encefalico, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, glioma de las vfas visuales e hipotalamico, cancer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoideo, cancer gastrointestinal, del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cancer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cancer cervical, cancer en ninos, leucemia linfodtica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, cancer colorrectal, linfoma de celulas T cutaneas, neoplasias linfoideas, micosis fungoides, smdrome de Seziary, cancer endometrial, cancer de esofago, tumor de celulas germinales extracraneales, tumor de celulas germinales extragonadales, cancer del conducto biliar extrahepatico, cancer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cancer de vesroula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoideo gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), tumor de celulas germinales, tumor de celulas germinales de ovario, glioma trofoblastico gestacional, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (tugado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarmgeo, melanoma intraocular, cancer ocular, tumores de islotes (pancreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cancer de rinon, cancer renal, cancer de laringe, leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfodtica cronica, leucemia mielogena cronica, leucemia de celulas vellosas, cancer de labio y de la cavidad bucal, cancer de tugado, cancer de pulmon, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de pulmon de celulas pequenas, linfoma relacionado con el sida, linfoma no Hodgkin, sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ojo), carcinoma de celulas merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cancer de cuello escamoso metastasico, cancer de la boca, cancer de la lengua, smdrome de neoplasias endocrinas multiples, micosis fungoides, smdromes mielodisplasicos, enfermedades mielodisplasicas/ mieloproliferativas, leucemia mielogena cronica, leucemia mieloide aguda, mieloma multiple, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer nasofarmgeo, neuroblastoma, cancer oral, cancer de la cavidad bucal, cancer orofarmgeo, cancer de ovario, cancer epitelial de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cancer pancreatico, cancer de islotes pancreaticos, cancer de la cavidad nasal y los senos paranasales, cancer paratiroideo, cancer peniano, cancer farmgeo, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasma celular/mieloma multiple, blastoma pleuropulmonar, cancer de prostata, cancer rectal, cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cancer de las glandulas salivales, familia Ewing de tumores sarcoma, sarcoma Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, cancer uterino, sarcoma uterino, cancer de piel (no melanoma), cancer de piel (melanoma), carcinoma de piel de celulas merkel, cancer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de estomago (gastrico), tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, cancer de testroulo, cancer de garganta, timoma, carcinoma de timoma y tfmico, cancer de tiroides, cancer de celulas transicionales de la pelvis renal y del ureter y otros organos urinarios, tumor trofoblastico gestacional, cancer uretral, cancer uterino endometrial, sarcoma uterino, cancer del cuerpo uterino, cancer vaginal, cancer vulvar y tumor de Wilm.
Un "trastorno proliferativo de las celulas del sistema hematologico" es un trastorno proliferativo de las celulas que implica celulas del sistema hematologico. Un trastorno proliferativo de las celulas del sistema hematologico puede incluir linfoma, leucemia, neoplasias mieloides, neoplasias de mastocitos, mielodisplasia, gamopatfa monoclonal benigna, granulomatosis linfomatoide, papulosis linfomatoide, policitemia vera, leucemia mielocftica cronica, metaplasia mieloide agnogenica y trombocitopenia esencial. Un trastorno proliferativo de las celulas del sistema hematologico puede incluir hiperplasia, displasia y metaplasia de las celulas del sistema hematologico. En un aspecto, las composiciones de la presente invencion se pueden usar para tratar un cancer seleccionado del grupo que consiste en un cancer hematologico de la presente invencion o un trastorno proliferativo de las celulas hematologico de la presente invencion, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. Un cancer hematologico de la presente invencion puede incluir mieloma multiple, linfoma (incluido linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfomas en ninos y linfomas de origen linfocftico y cutaneo), leucemia (incluida leucemia en ninos, leucemia de celulas vellosas, leucemia linfocftica aguda, leucemia mielocftica aguda, leucemia linfocftica cronica, leucemia mielocftica cronica, leucemia mielogena cronica y leucemia de mastocitos), neoplasias mieloides y neoplasias de mastocitos.
Un "trastorno proliferativo de las celulas del pulmon " es un trastorno proliferativo de las celulas que implica celulas del pulmon. Los trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir todas las formas de trastornos
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proliferativos de las celulas que afecten a las celulas pulmonares. Los trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir cancer de pulmon o una afeccion pre-cancerosa del pulmon, tumores o lesiones benignas del pulmon y tumores o lesiones malignas del pulmon, y lesiones metastasicas en tejido y organos en otra parte del cuerpo que no sea el pulmon. En un aspecto, las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar para tratar cancer de pulmon o trastornos proliferativos de las celulas del pulmon, o utilizarse para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. El cancer de pulmon puede incluir todas las formas de cancer del pulmon. El cancer de pulmon puede incluir neoplasias de pulmon malignas, carcinoma in situ, tumores carcinoides tfpicos y tumores carcinoides atipicos. El cancer de pulmon puede incluir cancer de pulmon de celulas pequenas ("SCLC"), cancer de pulmon de celulas no pequenas ("NSCLC"), carcinoma de celulas escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de celulas pequenas, carcinoma de celulas grandes, carcinoma de celulas adenoescamosas y mesotelioma. El cancer de pulmon puede incluir "carcinoma cicatricial", carcinoma broncoalveolar, carcinoma de celulas gigantes, carcinoma de celulas fusiformes y carcinoma neuroendocrino de celulas grandes. El cancer de pulmon puede incluir neoplasias pulmonares que tienen heterogeneidad ultraestructural e histologica (p. ej., tipo de celulas mixtas).
Los trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos de las celulas que afecten a las celulas del pulmon. Los trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir cancer de pulmon, afecciones pre-cancerosas del pulmon. Los trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia del pulmon. Los trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir hiperplasia inducida por amianto, metaplasia escamosa y metaplasia mesotelial reactiva benigna. Los trastornos de celulas proliferativas del pulmon pueden incluir el reemplazo del epitelio de la columna con epitelio escamoso estratificado y displasia mucosa. Los individuos expuestos a agentes ambientales perjudiciales inhalados tales como el humo del cigarrillo y el amianto pueden conllevar mayor riesgo de desarrollar trastornos proliferativos de las celulas del pulmon. Enfermedades pulmonares previas que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos de las celulas del pulmon pueden incluir enfermedad pulmonar intersticial cronica, enfermedad pulmonar necrotizante, esclerodermia, enfermedad reumatoidea, sarcoidosis, neumonitis intersticial, tuberculosis, neumomas repetidas, fibrosis pulmonar idiopatica, granuloma, amiantosis, alveolitis fibrosante y enfermedad de Hodgkin.
Un "trastorno proliferativo de las celulas del colon" es un trastorno proliferativo de las celulas del colon. Preferiblemente, el trastorno proliferativo de las celulas del colon es cancer de colon. En un aspecto, las composiciones de la presente invencion se pueden usar para tratar cancer de colon o trastornos proliferativos de las celulas del colon, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. El cancer de colon puede incluir todas las formas de cancer de colon. El cancer de colon puede incluir cancer de colon esporadico y hereditario. El cancer de colon puede incluir neoplasias de colon malignas, carcinoma in situ, tumores carcinoides tfpicos y tumores carcinoides atfpicos. El cancer de colon puede incluir adenocarcinoma, carcinoma de celulas escamosas y carcinoma de celulas adenoescamosas. El cancer de colon puede asociarse con un smdrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cancer colorrectal no poliposico hereditario, poliposis adenomatosa familiar, smdrome de Gardner, smdrome de Peutz-Jeghers, smdrome de Turcot y poliposis juvenil. El cancer de colon puede ser causado por un smdrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cancer colorrectal no poliposico hereditario, poliposis adenomatosa familiar, smdrome de Gardner, smdrome de Peutz- Jeghers, smdrome de Turcot y poliposis juvenil.
Los trastornos proliferativos de las celulas del colon pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos de las celulas que afectan a las celulas del colon. Los trastornos proliferativos de las celulas del colon pueden incluir cancer de colon, afecciones pre-cancerosas del colon, polipos adenomatosos del colon y lesiones metacronicas del colon. Un trastorno proliferativo de las celulas del colon puede incluir adenoma. Los trastornos proliferativos de las celulas del colon se pueden caracterizar por hiperplasia, metaplasia y displasia del colon. Las enfermedades de colon previas que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos de las celulas del colon pueden incluir cancer de colon anterior. La enfermedad actual que puede predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos de las celulas del colon puede incluir enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Un trastorno proliferativo de las celulas del colon pueden asociarse con una mutacion en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC. Un individuo puede tener un riesgo elevado de desarrollar un trastorno proliferativo de las celulas del colon debido a la presencia de una mutacion en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC.
Un "trastorno proliferativo de las celulas del pancreas" es un trastorno proliferativo de las celulas que implica a las celulas del pancreas. Los trastornos proliferativos de las celulas del pancreas pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos de las celulas que afectan a las celulas pancreaticas. Los trastornos proliferativos de las celulas del pancreas pueden incluir cancer de pancreas, un pre-cancer o una afeccion pre-cancerosa del pancreas, hiperplasia del pancreas y displasia del pancreas, tumores o lesiones benignas del pancreas y tumores o lesiones malignas del pancreas y lesiones metastasicas en tejido y organos del cuerpo distintos del pancreas. El cancer pancreatico incluye todas las formas de cancer de pancreas. El cancer pancreatico puede incluir adenocarcinoma ductal, carcinoma adenoescamoso, carcinoma de celulas gigantes pleomorficas, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de celulas gigantes tipo osteoclastos, quisteadenocarcinoma mucinoso, carcinoma acinar, carcinoma de celulas grandes no clasificadas, carcinoma de celulas pequenas, pancreatoblastoma, neoplasia papilar, quisteadenoma mucinoso, neoplasia qrnstica papilar y quisteadenoma seroso. El cancer pancreatico puede tambien
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incluir neoplasias pancreaticas que tienen heterogeneidad histologica y ultraestructural (p. ej., tipos de celulas mixtas).
Un "trastorno proliferativo de las celulas de la prostata" es un trastorno proliferativo de las celulas que implica a las celulas de la prostata. Los trastornos proliferativos de las celulas de la prostata pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos de las celulas que afectan a las celulas de la prostata. Los trastornos proliferativos de las celulas pueden incluir cancer de prostata, un pre-cancer o afeccion pre-cancerosa de la prostata, tumores o lesiones benignas de la prostata y tumores o lesiones malignas de la prostata, y lesiones metastasicas en tejido y organos del cuerpo distintos de la prostata. Los trastornos de las celulas proliferativas de la prostata pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la prostata.
Un "trastorno proliferativo de las celulas de la piel" es un trastorno proliferativo de las celulas que implica a las celulas de la piel. Los trastornos proliferativos de las celulas de la piel pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos de las celulas que afectan a las celulas de la piel. Los trastornos proliferativos de las celulas de la piel pueden incluir una afeccion pre-cancerosa de la piel, tumores o lesiones benignas de la piel, melanoma, melanoma maligno y otros tumores o lesiones malignas de la piel, y lesiones metastasicas en tejidos y organos del cuerpo que no sean la piel. Los trastornos proliferativos de las celulas pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la piel.
Un "trastorno proliferativo de las celulas del ovario" es un trastorno proliferativo de las celulas que implica a las celulas del ovario. Los trastornos proliferativos de las celulas del ovario pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos de las celulas que afectan a las celulas del ovario. Los trastornos proliferativos de las celulas del ovario pueden incluir una afeccion pre-cancerosa del ovario, tumores o lesiones benignas del ovario, cancer de ovario, tumores o lesiones malignas y lesiones metastasicas en tejido y organos del cuerpo distintos del ovario. Los trastornos proliferativos de las celulas de la piel pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de celulas del ovario.
Un "trastorno proliferativo de las celulas de la mama" es un trastorno proliferativo de las celulas que implica a las celulas de la mama. Los trastornos proliferativos de las celulas de la mama pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos que afectan a las celulas de la mama. Los trastornos proliferativos de las celulas de la mama pueden incluir cancer de mama, una afeccion pre-cancerosa de la mama, tumores o lesiones benignas de la mama y tumores o lesiones malignas de la mama, y lesiones metastasicas en tejido y organos del cuerpo distintos de la mama. Los trastornos de las celulas proliferativas de la mama pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la mama.
Un trastorno proliferativo de las celulas de la mama puede ser una afeccion pre-cancerosa de la mama. Las composiciones de la presente invencion se pueden usar para tratar una afeccion pre-cancerosa de la mama. Una afeccion pre-cancerosa de la mama puede incluir hiperplasia atfpica de la mama, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LCIS), neoplasia lobular y tumor o lesion de la mama de estadio 0 o grado 0 (p. ej., cancer de mama de estadio 0 o grado 0, o carcinoma in situ). Una afeccion pre-cancerosa de la mama se puede clasificar de acuerdo con el esquema de clasificacion TNM aceptado por el Comite Estadounidense Conjunto del Cancer (American Joint Committee on Cancer o AJCC), en donde al tumor primario (T) se le ha asignado un estadio de T0 o Tis; y donde a los ganglios linfaticos regionales (N) se les ha asignado un estadio de N0; y en donde a la metastasis distante (M) se le ha asignado un estadio de M0.
El trastorno proliferativo de las celulas de la mama puede ser cancer de mama. En un aspecto, las composiciones de la presente invencion se pueden usar para tratar cancer de mama, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. El cancer de mama puede incluir todas las formas de cancer de mama. El cancer de mama puede incluir cancer de mama epitelial primario. El cancer de mama puede incluir cancer en el que la mama este comprometida por otros tumores tales como linfoma, sarcoma o melanoma. El cancer de mama puede incluir carcinoma de la mama, carcinoma ductal de la mama, carcinoma lobular de la mama, carcinoma no diferenciado de la mama, cistosarcoma filoides de la mama, angiosarcoma de la mama y linfoma primario de la mama. El cancer de mama puede incluir cancer de mama de Estadio I, II, IIIA, IIIB, IIIC y IV. El carcinoma ductal de la mama puede incluir carcinoma invasivo, carcinoma invasivo in situ con componente intraductal predominante, cancer de mama inflamatorio y un carcinoma ductal de la mama con un tipo histologico seleccionado del grupo que consiste en comedo, mucinoso (coloide), medular, medular con infiltrado linfocftico, papilar, cirroso y tubular. El carcinoma lobular de la mama puede incluir carcinoma lobular invasivo con componente predominante in situ, carcinoma lobular invasivo y carcinoma lobular infiltrante. El cancer de mama puede incluir enfermedad de Paget, enfermedad de Paget con carcinoma intraductal y enfermedad de Paget con carcinoma ductal invasivo. El cancer de mama puede incluir neoplasias de mama que tienen heterogeneidad histologica y ultraestructural (p. ej., tipos de celulas mixtas).
Los compuestos de la presente invencion se pueden usar para tratar cancer de mama, o se pueden usar para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir cancer de mama familiar. Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir cancer de mama esporadico. Un cancer de mama que se ha de tratar puede ocurrir en un sujeto de sexo masculino. Un cancer de mama que se ha de tratar puede ocurrir en un sujeto de sexo femenino. Un cancer de mama que se ha de tratar puede ocurrir en un
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sujeto de sexo femenino pre-menopausico o en un sujeto femenino post-menopausico. Un cancer de mama que se ha de tratar puede ocurrir en un sujeto de 30 anos de edad o mas, o en un sujeto de 30 anos de edad o menos. Un cancer de mama que se ha de tratar ocurre en un sujeto de 50 anos o mas, o en un sujeto de 50 anos o menos. Un cancer de mama que se ha de tratar puede ocurrir en un sujeto de 70 anos o mas o en un sujeto de 70 anos o menos.
Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse para identificar una mutacion familiar o espontanea en BRCA1, BRCA2 o p53, Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse por tener una ampliacion del gen HER2/neu, por sobreexpresar HER2/neu o por tener un nivel bajo, intermedio o alto de expresion de HER2/neu. Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse para un marcador seleccionado del grupo que consiste en receptor de estrogenos (ER), receptor de progesterona (PR), receptor del factor de crecimiento epidermico humano - 2, Ki-67, CA15-3, CA 27-29 y c-Met. Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse como desconocido de ER, rico en ER o pobre en ER. Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse como ER-negativo ER- positivo. La tipificacion de ER de un cancer de mama puede realizarse por cualquier metodo reproductivo. La tipificacion de ER de un cancer de mama puede realizarse como se expone en Onkologie 27: 175-179 (2004). Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse como desconocido de PR, rico en PR o pobre en PR. Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse como PR-negativo o PR-positivo. Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse como positivo del receptor o negativo del receptor. Un cancer de mama que se ha de tratar puede tipificarse como asociado con niveles en sangre elevados de CA 15-3 o CA 27-29, o ambos.
Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir un tumor localizado de la mama. Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir un tumor de la mama asociado con una biopsia negativa del ganglio linfatico centinela (SLN). Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir un tumor de la mama asociado con una biopsia positiva del ganglio linfatico centinela (SLN). Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir un tumor de la mama asociado con uno o mas ganglios linfaticos axilares positivos, en donde los ganglios linfaticos axilares han sido clasificados mediante un metodo aplicable. Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir un tumor de la mama que ha sido tipificado por no presentar afectacion ganglionar (p. ej., ganglios negativos) por presentar un estado de afectacion de los ganglios positivo (p. ej., ganglios positivos). Un cancer de mama que se ha de tratar puede incluir un tumor de la mama que ha producido metastasis en otras partes del cuerpo. Un cancer de mama que se ha de tratar se puede clasificar por haber producido metastasis en un lugar seleccionado del grupo que consiste en hueso, pulmon, tugado o cerebro. Un cancer de mama que se ha de tratar se puede clasificar de acuerdo con una caractenstica seleccionada del grupo que consiste en metastastico, localizado, regional, local-regional, localmente avanzado, distante, multicentrico, bilateral, ipsilateral, contralateral, recien diagnosticado, recurrente e inoperable.
Un compuesto de la presente invencion se puede usar para tratar o prevenir un trastorno proliferativo de la mama, o para tratar o prevenir cancer de mama, en un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar cancer de mama en relacion con la poblacion en general, o se puede usar para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cancer de mama en relacion con la poblacion en general es un sujeto de sexo femenino con un antecedente familiar o personal de cancer de mama. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cancer de mama en relacion con la poblacion en general es un sujeto de sexo femenino que tiene una mutacion de la lmea germinal o espontanea en BRCA1 o BRCA2, o ambos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cancer de mama en relacion con la poblacion en general es un sujeto de sexo femenino con un antecedente familiar de cancer de mama y una mutacion de la lmea germinal o espontanea de BRCA1 o BRCA2, o ambos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cancer de mama en relacion con la poblacion en general es un sujeto de sexo femenino mayor de 30 anos de edad, mayor de 40 anos de edad, mayor de 50 anos de edad, mayor de 60 anos de edad, mayor de 70 anos de edad, mayor de 80 anos de edad o mayor de 90 anos de edad. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cancer de mama en relacion con la poblacion en general es un sujeto con hiperplasia atfpica de la mama, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobular in situ (LClS), neoplasia lobular o tumor o lesion de la mama en estadio 0 (p. ej., carcinoma in situ cancer de mama en estado 0 o grado 0).
Un cancer de mama que se ha de tratar puede clasificarse histologicamente de acuerdo con el sistema de Scarff- Bloom-Richardson, en donde a un tumor de mama se le ha asignado un puntaje de recuento de mitosis de 1, 2 o 3; un puntaje de pleomorfismo nuclear de 1, 2 o 3; un puntaje de formacion de tubulos de 1, 2 o 3; y un puntaje de Scarff-Bloom-Richardson total entre 3 y 9. A un cancer de mama que se ha de tratar se le puede asignar una clasificacion del tumor de acuerdo con el Panel de Consenso Internacional sobre el Tratamiento del Cancer de Mama (International Consensus Panel on the Treatment of Breast Cancer) seleccionado del grupo que consiste en grado 1, grado 1-2, grado 2, grado 2-3 o grado 3.
En una realizacion, se describe en este documento un metodo para tratar cancer de mama, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del hidrobromuro del Compuesto.
En otra realizacion, se describe en este documento un metodo para tratar el cancer de mama, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del Polimorfo A.
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Un cancer que se puede tratar puede clasificarse de acuerdo con el sistema de clasificacion TNM del American Joint Committee on Cancer (AJCC), en donde al tumor (T) se le ha sido asignado un estadio de TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c o T4d; y en donde a los ganglios linfaticos regionales (N) se les ha asignado un estadio de NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b o N3c; y en donde a una metastasis distante (M) se le puede asignar un estadio de MX, M0 o M1. Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar de acuerdo con una clasificacion del American Joint Committee on Cancer (AJCC) como de Estadio I, Estadio IIA, Estadio IIB, Estadio IIIA, Estadio IIIB, Estadio IIIC o Estadio IV. A un cancer que se ha de tratar se le puede asignar un grado de acuerdo con una clasificacion del AJCC como Grado GX (p. ej., el grado no puede ser evaluado), Grado 1, Grado 2, Grado 3 o Grado 4. Un cancer que se ha de tratar puede clasificarse de acuerdo con una clasificacion patologica del AJCC (pN) de pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b o pN3c.
Un cancer que se ha de tratar puede incluir un tumor que ha sido determinado menor o igual a aproximadamente 2 centimetres de diametro. Un cancer que se ha de tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 centimetres de diametro. Un cancer que se ha de tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene aproximadamente 3 centimetres de diametro o mas. Un cancer que se ha de tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene mas de 5 centimetres de diametro. Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar por aspecto microscopico asf como tambien estar bien diferenciado, moderadamente diferenciado, escasamente diferenciado o indiferenciado. Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar por aspecto microscopico con respecto a recuento de mitosis (p. ej., cantidad de division celular) o pleomorfismo nuclear (p. ej., cambio en las celulas). Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar por aspecto microscopico como asociado con areas de necrosis (p. ej., areas de celulas muertas o bajo degeneracion). Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar por tener cariotipo anormal, tener un numero anormal de cromosomas o tener uno o mas cromosomas que tienen aspecto anormal. Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar como aneuploide, triploide, tetraploide, o por tener ploidfa alterada. Un cancer que se ha de tratar se puede clasificar por tener translocacion cromosomica o una eliminacion o duplicacion de un cromosoma entero, o una region de eliminacion, duplicacion o ampliacion de una porcion de un cromosoma.
Un cancer que se ha de tratar se puede evaluar por citometria de ADN, citometna de flujo o citometna de imagen. Un cancer que se ha de tratar puede tipificarse por tener 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de celulas en el estadio de smtesis de la division celular (p. ej., en fase S de la division celular). Un cancer que se ha de tratar puede tipificarse por tener una baja fraccion de fase S o una alta fraccion de fase S.
Tal como se emplea en esta memoria, una "celula normal" es una celula que no puede clasificarse como parte de un "trastorno proliferativo de las celulas". Una celula normal carece del crecimiento desrregulado o anormal, o ambos, que puede conducir al desarrollo de una condicion indeseada o una enfermedad. Preferiblemente, una celula normal posee normalmente mecanismos de control del ciclo celular en funcionamiento.
Tal como se emplea en la presente memoria, "poner en contacto con una celula" se refiere a una condicion en la que un compuesto u otra composicion de materia esta en contacto directo con una celula, o esta lo suficientemente cerca como para inducir un efecto biologico deseado en una celula.
Tal como se emplea en la presente memoria, "compuesto candidato" hace referencia a un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien al Polimorfo A) que ha sido o sera ensayado en uno o mas ensayos biologicos in vitro o in vivo, con el fin de determinar si ese compuesto podria producir una respuesta biologica o medica deseada en una celula, tejido, sistema, animal o ser humano que busca un investigador o medico. Un compuesto candidato es un compuesto de la presente invencion. La respuesta biologica o medica puede ser el tratamiento del cancer. La respuesta biologica o medica puede ser el tratamiento o la prevencion de un trastorno proliferativo de las celulas. La respuesta o el efecto biologico tambien pueden incluir un cambio en la proliferacion o el crecimiento de las celulas in vitro o en un modelo animal, asf como tambien otros cambios biologicos que son observables in vitro. Los ensayos biologicos in vitro o in vivo pueden incluir, aunque sin limitarse a ello, ensayos de actividad enzimatica, ensayos de desplazamiento de movilidad electroforetica, ensayos de genes indicadores, ensayos de viabilidad celular in vitro y los ensayos que se describen en este documento.
Tal como se emplea en la presente memoria, "monoterapia" hace referencia a la administracion de un solo compuesto activo o terapeutico a un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, la monoterapia implicara la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto activo. Por ejemplo, la monoterapia del cancer con uno de los compuestos de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) a un sujeto que necesita el tratamiento del cancer. La monoterapia puede contrastarse con terapia de combinacion, en donde una combinacion de multiples compuestos activos se administra, preferiblemente con cada componente de la combinacion presente en una cantidad terapeuticamente eficaz. En un aspecto, la monoterapia con un compuesto de la presente invencion es mas eficaz que la terapia de combinacion en inducir un efecto biologico deseado.
Tal como se emplea en la presente memoria, "tratar" describe el control y el cuidado de un paciente para los fines de combatir una enfermedad, dolencia o trastorno e incluye la administracion de un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) para aliviar los smtomas o
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complicaciones de una enfermedad, dolencia o trastorno, o para eliminar la enfermedad, dolencia o trastorno. El termino "tratar" tambien puede incluir el tratamiento de una celula in vitro o de un modelo animal.
Un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, as^ como tambien el Polimorfo A) tambien se puede utilizar para prevenir una enfermedad, dolencia o trastorno, o se puede usar para identificar candidatos adecuados para dichos propositos. Tal como se emplea en la presente memoria, "prevenir" describe reducir o eliminar el inicio de los smtomas o complicaciones de la enfermedad, dolencia o trastorno.
Tal como se emplea en la presente memoria, se entiende que la expresion "aliviar" describe un proceso mediante el cual se reduce la gravedad de un signo o smtoma de un trastorno. Cabe destacar que un signo o smtoma se puede reducir sin ser eliminado. En una realizacion preferida, la administracion de las composiciones farmaceuticas de la invencion conduce a la eliminacion de un signo o smtoma, no obstante, no se requiere la eliminacion. Se espera que las dosis eficaces disminuyan la gravedad de un signo o smtoma. Por ejemplo, un signo o smtoma de un trastorno tal como cancer, que puede ocurrir en multiples sitios, se reduce si la gravedad del cancer disminuye dentro de por lo menos uno de multiples sitios.
Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "gravedad" describe el potencial del cancer de transformarse de un estado pre-canceroso o benigno a un estado maligno. Alternativamente o a su vez, la gravedad tiene como fin describir un estadio del cancer, por ejemplo, de acuerdo con el sistema TNM (aceptado por la Union Internacional contra el Cancer (International Union Against Cancer o UICC) y el American Joint Committee on Cancer (AJCC)) o con otros metodos reconocidos en la tecnica. Estadio del cancer hace referencia al grado o gravedad del cancer, en funcion de factores tales como el sitio del tumor primario, el tamano del tumor, la cantidad de tumores y el compromiso de los ganglios linfaticos (cancer diseminado hacia los ganglios linfaticos). Alternativamente o a su vez, la gravedad describe el grado del tumor por metodos reconocidos en la tecnica (vease, Instituto Nacional del Cancer (National Cancer Institute),
www.cancer.gov). El grado del tumor es un sistema utilizado para clasificar celulas cancerosas en terminos de que tan anormales lucen bajo un microscopio y que tan rapido es propenso a crecer y diseminarse el tumor. Se tienen en cuenta muchos factores a la hora de determinar el grado del tumor, incluidos la estructura y el patron de crecimiento de las celulas. Los factores espedficos utilizados para determinar el grado del tumor vanan con cada tipo de cancer. La gravedad tambien describe un grado histologico, tambien denominado diferenciacion, que hace referencia a cuanto se asemejan las celulas tumorales a las celulas normales del mismo tipo de tejido (vease, National Cancer Institute,
www.cancer.gov). Asimismo, la gravedad describe un grado nuclear, que se refiere al tamano y la forma del nucleo en las celulas tumorales y al porcentaje de celulas tumorales que se estan dividiendo (vease, National Cancer Institute,
www.cancer.gov).
En otro aspecto de la invencion, la gravedad describe el grado hasta el cual un tumor ha segregado factores de crecimiento, degradado la matriz extracelular, se ha vascularizado, perdido la adhesion a tejidos yuxtapuestos o ha formado metastasis. A su vez, la gravedad describe el numero de sitios en los cuales el tumor ha formado metastasis. Finalmente, la gravedad incluye la dificultad de tratar tumores de distintos tipos y sitios. Por ejemplo, los tumores inoperables, aquellos tipos de cancer que tienen mayor acceso a multiples sistemas corporales (tumores hematologicos e inmunologicos), y aquellos que son los mas resistentes a los tratamientos tradicionales se consideran los mas graves. En estas situaciones, prolongar la esperanza de vida del sujeto y/o reducir el dolor, disminuir la proporcion de celulas cancerosas o restringir las celulas a un sistema, y mejorar el estadio del cancer/grado del tumor/grado histologico/grado nuclear se consideran aliviar un signo o smtoma del cancer.
Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "smtoma" se define como una indicacion de enfermedad, dolencia, lesion o algo que no esta bien en el cuerpo. El individuo que experimenta los smtomas, los siente o nota, pero pueden no ser facilmente notorios para otras personas. Las otras personas se definen como no profesionales sanitarios.
Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "signo" tambien se define como una indicacion de que algo no esta bien en el cuerpo. Pero los signos se definen como cosas que pueden ser observadas por un medico, enfermero u otro profesional sanitario.
El cancer es un grupo de enfermedades que pueden causar practicamente cualquier signo o smtoma. Los signos y smtomas dependeran de donde este localizado el cancer, el tamano del cancer y cuanto afecta a los organos o estructuras aledanas. Si un cancer se propaga (forma metastasis), entonces los smtomas pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo.
A medida que el cancer se desarrolla, comienza a presionar los organos, vasos sangumeos y nervios aledanos. Esta presion crea algunos de los signos y smtomas del cancer. Si el cancer esta en una zona cntica, como ciertas partes del cerebro, incluso el tumor mas pequeno puede causar smtomas tempranos.
Pero algunas veces el cancer comienza en lugares en los que no causa ningun smtoma, hasta que ha crecido demasiado. El cancer de pancreas, por ejemplo, por lo general no crece tanto como para sentirse fuera del cuerpo. Algunos canceres de pancreas no causan smtomas hasta que comienzan a crecer alrededor de los nervios circundantes (esto provoca lumbalgia). Otros crecen alrededor del conducto coledoco, lo cual bloquea el flujo de bilis
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y provoca un color amarillo en la piel conocido como ictericia. Para el momento en que un cancer de pancreas causa estos signos o smtomas, por lo general ha alcanzado un estadio avanzado.
Un cancer puede tambien causar smtomas tales como fiebre, fatiga o perdida de peso. Esto puede deberse a que las celulas de cancer consumen parte del suministro de energfa del cuerpo o liberan sustancias que cambian el metabolismo corporal. O el cancer puede causar que el sistema inmunologico reaccione en formas que producen estos smtomas.
En ocasiones, las celulas de cancer liberan sustancias en el torrente circulatorio que causan smtomas que por lo general no se cree que provoquen cancer. Por ejemplo, algunos tipos de cancer del pancreas pueden liberar sustancias que provocan el desarrollo de coagulos de sangre en las venas de las piernas. Algunos tipos de cancer de pulmon producen sustancias de tipo hormonas que afectan los niveles de calcio en la sangre, afectan a los nervios y musculos, y causan debilidad y mareos
El cancer presenta varios signos o smtomas generales que ocurren cuando estan presentes una variedad de subtipos de celulas cancerosas. La mayona de las personas con cancer adelgazan en alguno momento con su enfermedad. Un adelgazamiento inexplicable (no intencional) de 10 libras o mas puede ser el primer signo de cancer, particularmente de algun tipo de cancer del pancreas, el estomago el esofago o el pulmon.
La fiebre es muy comun con el cancer, pero se observa con mayor frecuencia en la enfermedad avanzada. Practicamente todos los pacientes con cancer suelen tener fiebre en algun momento, especialmente si el cancer o su tratamiento afecta al sistema inmunologico y hace que al organismo le resulte diffcil combatir las infecciones. Con menos frecuencia, la fiebre puede ser un signo temprano de cancer, tal como con leucemia o linfoma.
La fatiga puede ser un smtoma importante a medida que el cancer avanza. Aunque puede ocurrir tempranamente en tipos de cancer tales como la leucemia, o si el cancer esta causando una perdida de sangre continua, como en algunos tipos de cancer de colon o estomago.
El dolor puede ser un smtoma temprano con algunos tipos de cancer tales como el cancer de hueso o el cancer de testmulo. Pero a menudo el dolor es un smtoma de la enfermedad avanzada.
Junto con los tipos de cancer de piel (vease la seccion siguiente), algunos tipos de cancer internos pueden provocar signos en la piel que pueden ser visibles. Estos cambios incluyen un aspecto mas oscuro de la piel (hiperpigmentacion), piel amarilla (ictericia) o roja (eritema); comezon o crecimiento excesivo del cabello.
Alternativamente o a su vez, los subtipos de cancer presentan signos o smtomas espedficos. Cambios en los habitos intestinales o en el funcionamiento de la vejiga podnan indicar cancer. La constipacion o la diarrea a largo plazo, o un cambio en el tamano de las heces, pueden ser signos de cancer de colon. El dolor con la orina, sangre en la orina o un cambio en el funcionamiento de la vejiga (tal como orina mas o menos frecuente) podnan asociarse con cancer de vejiga o de prostata.
Los cambios en el estado de la piel o la aparicion de una nueva afeccion en la piel podnan indicar cancer. El cancer de piel puede sangrar y lucir como llagas que no cicatrizan. Una llaga a largo plazo en la boca podna ser un cancer oral, especialmente en pacientes que fuman, mastican tabaco o beben alcohol con frecuencia. Las llagas en el pene o la vagina puede ser o bien signos de infeccion o de un cancer incipiente.
La hemorragia o secrecion inusual podna indicar cancer. La hemorragia inusual podna suceder en cancer incipiente o avanzado. La sangre en el esputo (flema) podna ser un signo de cancer de pulmon. La sangre en las heces (o heces oscuras o negras) podna ser un signo de cancer de colon o rectal. El cancer del cuello uterino o del endometrio (revestimiento del utero) puede causar hemorragia vaginal. La sangre en la orina puede ser un signo de cancer de vejiga o rinon. Una secrecion sanguinolenta del pezon puede ser un signo de cancer de mama.
Un engrosamiento o bulto en la mama o en otras partes del cuerpo podna indicar la presencia de un cancer. Muchos tipos de cancer pueden sentirse a traves de la piel, principalmente en la mama, el testmulo, los ganglios linfaticos y los tejidos blandos del cuerpo. Un bulto o engrosamiento puede ser un signo incipiente o tardm de cancer. Cualquier bulto o engrosamiento podna ser indicativo de cancer, especialmente si la formacion es nueva o ha aumentado de tamano.
La indigestion o la dificultad para deglutir podna indicar cancer. Si bien estos smtomas comunmente tienen otras causas, la indigestion o los problemas para deglutir pueden ser un signo de cancer del esofago, el estomago o la faringe (garganta).
Cambios recientes en una verruga o lunar podnan ser indicativos de cancer. Cualquier verruga, lunar o peca que cambia de color, tamano o forma, o que pierde sus bordes definidos, indica el desarrollo potencial de cancer. Por ejemplo, la lesion de la piel puede ser un melanoma.
Una tos o disfoma persistente podna ser indicativa de cancer. Una tos que no desaparece puede ser un signo de cancer de pulmon. La disfoma puede ser un signo de cancer de la laringe o la tiroides.
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Si bien los signos y smtomas enumerados anteriormente son los mas frecuentemente observados con el cancer, hay muchos otros menos comunes que no se mencionan aqrn. No obstante, todos los signos y smtomas de cancer reconocidos en la tecnica se contemplan y abarcan la presente invencion.
El tratamiento del cancer puede resultar en una reduccion del tamano de un tumor. Una reduccion del tamano de un tumor puede tambien denominarse "regresion del tumor". Preferiblemente, despues del tratamiento, el tamano del tumor se reduce en 5% o mas en relacion con su tamano anterior al tratamiento; mas preferiblemente, el tamano del tumor se reduce en 10% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 20% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 30% o mas; mas preferiblemente se reduce en 40% o mas; incluso mas preferiblemente, se reduce en 50% o mas; y lo mas preferiblemente, se reduce en mas de 75% o mas. El tamano de un tumor se puede medir con cualquier metodo de medicion reproducible. El tamano de un tumor se puede medir como un diametro del tumor.
Tratar el cancer puede resultar en una reduccion del volumen del tumor. Preferiblemente, despues del tratamiento, el volumen del tumor se reduce en 5% o mas en relacion con su tamano antes del tratamiento; mas preferiblemente, el volumen del tumor se reduce en 10% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 20% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 30% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 40% o mas; incluso mas preferiblemente, se reduce en 50% o mas; y lo mas preferiblemente, se reduce en mas de 75% o mas. El volumen del tumor se puede medir con cualquier metodo de medicion reproducible.
El tratamiento del cancer resulta en una reduccion del numero de tumores. Preferiblemente, despues del tratamiento, el numero de tumores se reduce en 5% o mas en relacion con el numero antes del tratamiento; mas preferiblemente, el numero del tumor se reduce en 10% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 20% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 30% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 40% o mas; incluso mas
preferiblemente, se reduce en 50% o mas; y lo mas preferiblemente, se reduce en mas de 75%. El numero de
tumores se puede medir mediante cualquier metodo reproducible de medicion. El numero de tumores se puede medir contando los tumores visibles a simple vista o en una ampliacion especificada. Preferiblemente, la ampliacion especificada es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cancer puede resultar en una reduccion del numero de lesiones metastasicas en otros tejidos u organos distantes del sitio del tumor primario. Preferiblemente, despues del tratamiento, el numero de lesiones metastasicas se reduce en 5% o mas en relacion con el numero antes del tratamiento; mas preferiblemente, el numero de lesiones metastasicas se reduce en 10% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 20% o mas; mas
preferiblemente, se reduce en 30% o mas; mas preferiblemente, se reduce en 40% o mas; incluso mas
preferiblemente, se reduce en 50% o mas; y lo mas preferiblemente, se reduce en mas de 75%. El numero de
lesiones metastasicas se puede medir por cualquier metodo de medicion reproducible. El numero de lesiones metastasicas se puede medir contando las lesiones metastasicas visibles a simple vista o en una ampliacion especificada. Preferiblemente, la ampliacion especificada es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cancer puede resultar en un incremento del tiempo de supervivencia promedio de una poblacion de sujetos tratados en comparacion con una poblacion que recibe vehmulo solo. Preferiblemente, el tiempo de supervivencia promedio aumenta por mas de 30 dfas; mas preferiblemente, por mas de 60 dfas; mas preferiblemente, por mas de 90 dfas; y lo mas preferiblemente, por mas de 120 dfas. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion se puede medir por cualquier metodo reproducible. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion se puede medir, por ejemplo, calculando para una poblacion la longitud promedio de supervivencia despues del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion puede medirse tambien, por ejemplo, calculando para una poblacion la longitud promedio de supervivencia despues de completar una primera tanda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cancer puede resultar en un incremento del tiempo de supervivencia promedio de una poblacion de sujetos tratados, en comparacion con una poblacion de sujetos no tratados. Preferiblemente, el tiempo de supervivencia promedio aumenta por mas de 30 dfas; mas preferiblemente, por mas de 60 dfas; mas preferiblemente, por mas de 90 dfas; y lo mas preferiblemente, por mas de 120 dfas. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion se puede medir por cualquier metodo reproducible. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion se puede medir, por ejemplo, calculando para una poblacion la longitud promedio de supervivencia despues del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion tambien se puede medir, por ejemplo, calculando para una poblacion la longitud promedio de supervivencia despues de completar una primera tanda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cancer puede resultar en un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion de sujetos tratados, en comparacion con una poblacion que recibe monoterapia con un farmaco que no es un compuesto de la presente invencion. Preferiblemente, el tiempo de supervivencia promedio aumenta por mas de 30 dfas; mas preferiblemente, por mas de 60 dfas; mas preferiblemente, por mas de 90 dfas; y lo mas preferiblemente, por mas de 120 dfas. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion se puede medir por cualquier medio reproducible. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion se puede medir, por ejemplo, calculando para una poblacion la longitud promedio de supervivencia despues del inicio del
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tratamiento con un compuesto activo. Un incremento en el tiempo de supervivencia promedio de una poblacion puede tambien medirse, por ejemplo, calculando para una poblacion la longitud promedio de supervivencia despues de completar una primera tanda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cancer puede resultar en una reduccion del mdice de mortalidad de una poblacion de sujetos tratados, en comparacion con una poblacion de sujetos que reciben vehmulo solo. El tratamiento del cancer puede resultar en una reduccion del mdice de mortalidad de una poblacion de sujetos tratados, en comparacion con una poblacion de sujetos no tratados. El tratamiento del cancer puede resultar en una reduccion del mdice de mortalidad de una poblacion de sujetos tratados, en comparacion con una poblacion que recibe monoterapia con un farmaco que no es un compuesto de la presente invencion. Preferiblemente, el mdice de mortalidad se reduce por mas de 2%; mas preferiblemente, por mas de 5%; mas preferiblemente, por mas de 10%; y lo mas preferiblemente, por mas de 25%. Una reduccion en el mdice de mortalidad de una poblacion de sujetos tratados se puede medir con cualquier metodo reproducible. Una reduccion en el mdice de mortalidad de una poblacion se puede medir, por ejemplo, calculando para una poblacion el numero promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo despues del inicio del tratamiento con un compuesto activo. Una reduccion en el mdice de mortalidad de una poblacion se puede medir, por ejemplo, calculando para una poblacion el numero promedio de muertes relacionadas con la enfermedad por unidad de tiempo despues del inicio de una primera tanda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cancer puede resultar en una reduccion del mdice de crecimiento del tumor. Preferiblemente, despues del tratamiento, el mdice de crecimiento del tumor se reduce en por lo menos 5% en relacion con el numero anterior al tratamiento; mas preferiblemente, el mdice de crecimiento del tumor se reduce en por lo menos 10%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 20%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 30%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 40%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 50%; incluso mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 50%; y lo mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 75%. El mdice de crecimiento del tumor se puede medir por cualquier metodo de medicion reproducible. El mdice de crecimiento del tumor se puede medir de acuerdo con un cambio en el diametro del tumor por unidad de tiempo.
El tratamiento del cancer puede resultar en un recrecimiento del tumor. Preferiblemente, despues del tratamiento, el recrecimiento del tumor es inferior a 5%; mas preferiblemente, el recrecimiento del tumor es inferior a 10%; mas preferiblemente, inferior a 20%; mas preferiblemente, inferior a 30%; mas preferiblemente, inferior a 40%; mas preferiblemente, inferior a 50%; incluso mas preferiblemente, inferior a 50%; y lo mas preferiblemente, inferior a 75%. El recrecimiento del tumor se puede medir por cualquier metodo de medicion reproducible. El recrecimiento del tumor se mide, por ejemplo, midiendo un incremento en el diametro de un tumor despues de una reduccion previa del tumor que siguio al tratamiento. Una reduccion en el recrecimiento del tumor se indica por la imposibilidad de los tumores de reaparecer despues de que cesa el tratamiento.
Tratar o prevenir un trastorno proliferativo de las celulas puede resultar en una reduccion del mdice de proliferacion celular. Preferiblemente, despues del tratamiento, el mdice de proliferacion celular se reduce por al menos 5%; mas preferiblemente, por al menos 10%; mas preferiblemente, por al menos 20%; mas preferiblemente, por al menos 30%; mas preferiblemente, por al menos 40%; mas preferiblemente, por al menos 50%; incluso mas preferiblemente, por al menos 50%; y lo mas preferiblemente, por al menos 75%. El mdice de proliferacion celular se puede medir con cualquier metodo de medicion reproducible. El mdice de proliferacion celular se mide, por ejemplo, midiendo el numero de celulas en proceso de division en una muestra de tejido por unidad de tiempo.
El tratamiento o la prevencion de un trastorno proliferativo de las celulas puede resultar en una reduccion en la proporcion de celulas proliferativas. Preferiblemente, despues del tratamiento, la proporcion de celulas que proliferan se reduce en por lo menos 5%; mas preferiblemente, en por lo menos 10%; mas preferiblemente, en por lo menos 20%; mas preferiblemente, en por lo menos 30%; mas preferiblemente, en por lo menos 40%; mas preferiblemente, en por lo menos 50%; incluso mas preferiblemente, en por lo menos 50%; y lo mas preferiblemente, en por lo menos 75%. La proporcion de celulas que proliferan se puede medir con cualquier metodo de medicion reproducible. Preferiblemente, la proporcion de celulas que proliferan se mide, por ejemplo, cuantificando el numero de celulas en proceso de division en relacion con el numero de celulas que no estan en proceso de division en una muestra de tejido. La proporcion de celulas que proliferan puede ser equivalente al mdice mitotico.
El tratamiento o la prevencion de un trastorno proliferativo de las celulas puede resultar en una reduccion del tamano de un area o zona de proliferacion celular. Preferiblemente, despues del tratamiento, el tamano de un area o zona de proliferacion celular se reduce en por lo menos 5% en relacion con su tamano antes del tratamiento; mas
preferiblemente, se reduce en por lo menos 10%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 20%; mas
preferiblemente, se reduce en por lo menos 30%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 40%; mas
preferiblemente, se reduce en por lo menos 50%; incluso mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 50%; y lo
mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 75%. El tamano de un area o zona de proliferacion celular se puede medir por cualquier medio de medicion reproducible. El tamano de un area o zona de proliferacion celular se puede medir como un diametro o ancho de un area o zona de proliferacion celular.
El tratamiento o la prevencion de un trastorno proliferativo de las celulas puede resultar en una reduccion del numero o la proporcion de celulas que tienen aspecto o morfologfa anormal. Preferiblemente, despues del tratamiento, el
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numero de celulas que tienen una morfologfa anormal se reduce en por lo menos 5% en relacion con su tamano antes del tratamiento; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 10%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 20%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 30%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 40%; mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 50%; incluso mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 50%; y lo mas preferiblemente, se reduce en por lo menos 75%. Un aspecto o morfologfa celular anormal se puede medir con cualquier metodo de medicion reproducible. Una morfologfa anormal se puede medir por microscopia, p. ej., usando un microscopio para cultivo celular invertido. Una morfologfa celular anormal puede adoptar la forma de pleomorfismo nuclear.
Tal como se emplea en la presente memoria, el termino "selectivamente" significa que tiende a ocurrir en una frecuencia mayor en una poblacion que en otra. Las poblaciones comparadas pueden ser poblaciones celulares. Preferiblemente, un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) actua selectivamente en una celula cancerosa o pre-cancerosa pero no en una celula normal. Preferiblemente, un compuesto de la presente invencion actua selectivamente para modular una diana molecular (p. ej., una protema diana metiltransferasa) pero no modula significativamente otra diana molecular (p. ej., una protema no diana metiltransferasa). La invencion tambien da a conocer un metodo para inhibir selectivamente la actividad de una enzima, tal como una protema metiltransferasa. Preferiblemente, un evento ocurre selectivamente en la poblacion A en relacion con la poblacion B, si ocurre mas de dos veces mas a menudo en la poblacion A en comparacion con la poblacion B. Un evento ocurre selectivamente si ocurre mas de cinco veces mas a menudo en la poblacion A. Un evento ocurre selectivamente si ocurre mas de diez veces mas a menudo en la poblacion A; mas preferiblemente, mas de cincuenta veces; incluso mas preferiblemente, mas de 100 veces; y lo mas preferiblemente mas de 1000 veces mas a menudo en la poblacion A en comparacion con la poblacion B. Por ejemplo, se dina que la muerte celular ocurre selectivamente en celulas cancerosas si ocurrio mas de dos veces mas a menudo en celulas cancerosas que en celulas normales.
Un compuesto de la presente invencion puede modular la actividad de una diana molecular (p. ej., una protema diana metiltransferasa). Modulacion se refiere a estimular o inhibir una actividad de una diana molecular. Preferiblemente, un compuesto de la presente invencion modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en por lo menos 2 veces en relacion con la actividad de la diana molecular bajo las mismas condiciones pero carente solamente de la presencia de dicho compuesto. Mas preferiblemente, un compuesto de la presente invencion modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces en relacion con la actividad de la diana molecular bajo las mismas condiciones pero carente solamente de la presencia de dicho compuesto. La actividad de una diana molecular se puede medir por cualquier metodo reproducible. La actividad de una diana molecular se puede medir in vitro o in vivo. Por ejemplo, la actividad de una diana molecular se puede medir in vitro con un ensayo de actividad enzimatica o ensayo de union de ADN, o la actividad de una diana molecular se puede medir in vivo ensayando la expresion de un gen indicador.
Un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) no modula de manera significativa la actividad de una diana molecular si la adicion del compuesto no estimula ni inhibe la actividad de la diana molecular en mas de 10% en relacion a la actividad de la diana molecular bajo las mismas condiciones pero carente de solamente de la presencia de dicho compuesto.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresion "selectiva de isoenzima" significa una inhibicion o estimulacion preferencial de una primera isoforma de una enzima en comparacion con una segunda isoforma de una enzima (p. ej., la inhibicion o estimulacion preferencial de una isoenzima de protema metiltransferasa alfa en comparacion con una isoenzima de protema metiltransferasa beta). Preferiblemente, un compuesto de la presente invencion demuestra un mmimo de diferencial de cuatro veces, preferiblemente un diferencial de diez veces, mas preferiblemente un diferencial de cincuenta veces, en la dosis requerida para lograr un efecto biologico. Preferiblemente, un compuesto de la presente invencion demuestra este diferencial en todo el intervalo de inhibicion, y el diferencial se ejemplifica en la CI50, es decir, una inhibicion del 50%, para una diana molecular de interes.
La administracion de un compuesto de la presente invencion a una celula o a un sujeto que la necesita puede producir la modulacion (es decir, la estimulacion o inhibicion) de una actividad de una protema metiltransferasa de interes.
El tratamiento del cancer o de un trastorno proliferativo de las celulas puede resultar en la muerte celular, y preferiblemente, la muerte celular resulta en una disminucion de por lo menos 10% en el numero de celulas de una poblacion. Mas preferiblemente, la muerte celular significa una reduccion de por lo menos 20%; mas preferiblemente, una reduccion de por lo menos 30%; mas preferiblemente, una reduccion de por lo menos 40%; mas preferiblemente, una reduccion de por lo menos 50%; lo mas preferiblemente, una reduccion de por lo menos 75%. El numero de celulas en una poblacion se puede medir por cualquier metodo reproducible. Un numero de celulas de una poblacion se puede medir por clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS), microscopia de inmunofluorescencia y microscopia de luz. Los metodos para medir la muerte celular se exponen en Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8, 2003- En un aspecto, la muerte celular ocurre por apoptosis.
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Preferiblemente, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invencion no es significativamente citotoxica para las celulas normales. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto no es significativamente citotoxica para las celulas normales si la administracion del compuesto en una cantidad terapeuticamente eficaz no induce la muerte celular en mas de 10% de las celulas normales. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto no afecta significativamente la viabilidad de las celulas normales si la administracion del compuesto en una cantidad terapeuticamente eficaz no induce la muerte celular en mas de 10% de las celulas normales. En un aspecto, la muerte celular ocurre por apoptosis.
Poner en contacto una celula con un compuesto de la presente invencion puede inducir o activar la muerte celular selectivamente en celulas cancerosas. Administrar a un sujeto que necesita un compuesto de la presente invencion puede inducir o activar la muerte celular selectivamente en celulas de cancer. Poner en contacto una celula con un compuesto de la presente invencion puede inducir la muerte celular selectivamente en una o mas celulas afectadas por un trastorno proliferativo de las celulas. Preferiblemente, la administracion a un sujeto que necesita un compuesto de la presente invencion induce la muerte celular selectivamente en una o mas celulas afectadas por un trastorno proliferativo de las celulas.
La presente invencion se refiere a un metodo para tratar o prevenir cancer (p. ej., cuyo curso puede estar influenciado por la modulacion de metilacion de protema mediada por EZH2) administrando un compuesto de la presente invencion (es decir, el hidrobromuro del Compuesto I, asf como tambien el Polimorfo A) a un sujeto que lo necesita, en donde la administracion del compuesto de la presente invencion resulta en uno o mas de los siguientes: prevencion de proliferacion de celulas cancerosas por acumulacion de celulas en una o mas fases del ciclo celular (p. ej., G1, G1/S, G2/M), o induccion de senescencia celular, o promocion de diferenciacion de celulas tumorales; promocion de muerte celular en celulas cancerosas mediante citotoxicidad, necrosis o apoptosis, sin una cantidad significativa de muerte celular en celulas normales, actividad antitumoral en animales con un mdice terapeutico de por lo menos 2. Tal como se emplea en la presente memoria, "mdice terapeutico" es la dosis maxima tolerada dividida por la dosis eficaz. La presente invencion tambien se refiere a un metodo utilizado para identificar candidatos adecuados para tratar o prevenir el cancer.
El experto en la materia puede consultar los textos para descripcion detallada de las tecnicas conocidas analizadas en este documento o tecnicas equivalentes. Estos textos incluyen Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a edicion), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18a (1990). Desde ya, tambien se pueden consultar estos textos para la preparacion o el uso de un aspecto de la invencion.
Ejemplos
Materiales y metodos Difraccion de rayos X por polvo
La PXRD para todas las muestras se tomo en un dispositivo Rigaku MultiFlex (Diana: Cu; voltaje del tubo: 40 kV; corriente del tubo: 30 mA).
Calorimetna de barrido diferencial
La DSC para todas las muestras se tomo en un dispositivo Mettler-Toledo DSC 1/700 (Condiciones de ejecucion: temperatura inicial 35°C, temp final 325°C, velocidad de calentamiento 30°C/min).
Cristalograffa de rayos X
Se monto un cristal de placa incolora de 0,28 x 0,22 x 0,06 mm en un lazo de nylon usando una muy pequena cantidad de aceite Paratone. Los datos se recogieron usando un difractometro Bruker basado en CCD (dispositivo acoplado a carga) equipado con un aparato de baja temperatura Oxford Cryostream que operaba a 173 K. Los datos se midieron usando barridos omega y phi de 0,5° por marco durante 45 s. El numero total de imagenes se baso en los resultados del programa COSMO en donde se esperaba que la redundancia fuese 4,0 y la totalidad hasta 100% de 0,83 A. Los parametros celulares se recuperaron usando el software APEX II y se redefinieron usando SAINT en todas las reflexiones observadas. La reduccion de los datos se efectuo usando el software SAINT que corrige Lp. Se aplicaron correcciones de graduacion y absorcion usando la tecnica de multibarrido SADABS, provista por George Sheldrick. Las estructuras se resuelven por el metodo directo, utilizando el programa SHELXS-97 y se refinan por el metodo de mmimos cuadraticos en F2, SHELXL- 97, que se incorporan en SHELXTL-PC V 6,10.
La estructura que se muestra en la Figura 11 se resolvio en el grupo espacial P2-i/c (# 14). Todos los atomos no de hidrogeno se redefinen de manera anisotropica. Los hidrogenos se calcularon por metodos geometricos y se refinaron como un modelo riding. El cristal utilizado para el estudio de difraccion no demostro descomposicion durante la recopilacion de los datos. Todos los dibujos se realizan a 50% elipsoides.
Sorcion dinamica de vapor
La DVS se midio en un sistema VTI Modelo SGA-100. Metodo de medicion: la humedad relativa (HR) se cambio en un modo controlado, en etapas de 5%, de 5,0% a 95,0% luego nuevamente a 5,0% usando el sistema de sorcion gravimetrica de vapor, y se midio el porcentaje de cambio en peso (% en peso) de la muestra en cada etapa.
5 HPLC
La HPLC se efectuo en una bomba cuaternaria de HPLC Agilent 1200, mezclando a baja presion con un desgasificador en lmea. Condiciones del metodo analftico: 8 jl muestra (20 mg de ER-581982-06 diluidos con 50 ml de metanol para proporcionar aproximadamente 0,4 mg/ml de disolucion) se inyectaron en un aparato Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (4,6 x 150 mm, 3,5 um). Condiciones de cromatograffa: fase movil A, agua con formiato de amonio 10 5mM; fase movil B, formiato de amonio 5 mM en 50/45/5 acetonitrilo/metanol/agua; caudal, 1,5 ml/min.; gradiente: isocratico a 10% B de 0 a 3 min; incremento lineal hasta 70% B de 3 a 7 min; isocratico a 70% B de 7 a 12 min; incremento lineal hasta 100% B de 12 a 15 min isocratico a 100% B de 15 a 20 min; temperatura de la columna, 35 °C; deteccion, UV 230 nm. Tiempo de retencion aproximado del Compuesto I = 10,7 min.
Smtesis del Polimorfo A
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15 COOH
Acido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico Una disolucion agitada de acido 2-metil-3-nitrobenzoico (100 g, 552 mmol) en H2SO4 conc. (400 ml), 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidinadiona (88 g, 308 mmol) se anadio en porciones a temperatura ambiente y la mezcla de reaccion se agito luego a temperatura ambiente durante 5 h. La mezcla de reaccion se vertio en agua enfriada con hielo, el solido precipitado se separo por filtracion, se lavo con agua y se 20 seco al vado para proporcionar el compuesto deseado en la forma de un solido (140 g, 98%). El compuesto aislado se transfirio directamente a la etapa siguiente. 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) 6 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H).
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5-Bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo A una disolucion agitada de acido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 25 1105 mmol) en DMF (2,8 l) a temperatura ambiente se le anadio carbonato de sodio (468 g, 4415 mmol) seguido de
la adicion de yoduro de metilo (626,6 g, 4415 mmol). La mezcla de reaccion resultante se calento a 60 °C durante 8 h. Despues de completar (monitoreo por TLC), la mezcla de reaccion se filtro (para eliminar el carbonato de sodio) y se lavo con acetato de etilo (1 l X 3). El filtrado combinado se lavo con agua (3 l X 5) y la fase acuosa se retroextrajo con acetato de etilo (1l X 3). Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron 30 y se concentraron a presion reducida para proporcionar el compuesto del tttulo en forma de un solido (290g, 97% de rendimiento). El compuesto aislado se transfirio directamente a la etapa siguiente. 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) 6 8,17
(s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H).
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3-Amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (1) A una disolucion agitada de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (290 g, 1058 mmol) en etanol (1,5 l) se le anadio cloruro de amonio acuoso (283 g, 5290 mmol disuelto en 1,5 35 l agua). La mezcla resultante se agito a 80°C, tras lo cual se anadio hierro en polvo (472 g, 8451 mmol) en porciones. La mezcla de reaccion resultante se calento a 80 °C durante 12 h. Tras completar segun lo determinado por TLC, la mezcla de reaccion se filtro en caliente sobre celite® y el lecho de celite se lavo con metanol (5 l) seguido de lavado con MeOH al 30% en DCM (5 l). El filtrado combinado se concentro al vacfo, el residuo obtenido se diluyo con disolucion acuosa de bicarbonato sodico (2 l) y se extrajo con acetato de etilo (5 l X 3). Las capas 40 organicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presion reducida para dar el compuesto del tttulo en forma de un solido (220 g, 85%). El compuesto se transfirio directamente a la etapa siguiente. 1H NMR (CDCla, 400 MHz) 6 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).
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5-Bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il) amino) benzoato de metilo (2) Se cargo un reactor con 3-amino-5- bromo-2-metilbenzoato de metilo (455,8 g, 1,87 mol), 1,2-Dicloroetano (4,56 l) y acido acetico (535 ml, 9,34 mol). A la mezcla se le anadieron dihidro-2H-piran-4(3H)-ona (280 g, 2,80 mol) y triacetoxiborohidruro de sodio (594 g, 2,80 5 mol) manteniendo la temperatura interna debajo de 40 °C. La mezcla se agito a 25 °C durante 2,5 h y luego la reaccion se inactivo con una disolucion de hidroxido sodico (448 g, 11,20 mol) en agua (5,61 l). Despues de agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente, la capa organica se separo y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3,65 l). Las capas organicas se combinaron, se lavaron con salmuera (1,5 l) y se concentraron al vado.
El residuo se trato con acetato de etilo (1,8 l) y se calento a 65-70 °C. La mezcla se agito a 65-70 °C durante 15 10 minutos para dar una disolucion clara y luego se trato con n-heptano (7,3 l) manteniendo la temperatura entre 60-70 °C. Una vez que se habfa anadido el heptano por completo a la disolucion, la mezcla se mantuvo a 65-70 °C por 15 minutos y luego se dejo enfriar hasta 18-22 °C durante 3 h. La suspension resultante se agito a 18-22 °C durante 4 h, se enfrio hasta 0-5 °C durante 1 h y se mantuvo a 0-5 °C durante 2 h. El precipitado se filtro, se lavo dos veces con n-heptano (1,4 l) y se seco al vado para dar el compuesto del tftulo (540 g, 88%). El patron de XRPD de este 15 compuesto se muestra en la Figura 17.
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5-Bromo-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2-metilbenzoato de metilo (3) A una disolucion agitada de 5-bromo- 2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il) amino) benzoato de metilo (14 g, 42,7 mmol) en dicloroetano (150 ml) se le anadieron acetaldehfdo (3,75 g, 85,2 mmol) y acido acetico (15,3 g, 256 mmol). La mezcla de reaccion resultante se 20 agito a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla se enfrio hasta 0 °C y se anadio triacetoxiborohidruro de sodio (27 g, 128 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Tras completar la reaccion segun lo determinado por TLC, se anadio disolucion acuosa de bicarbonato sodico a la mezcla de reaccion hasta obtener un pH 7-8, la fase organica se separo y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas organicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presion 25 reducida. El compuesto bruto se purifico por cromatograffa en columna (gel de sflice de malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo: hexano para dar el compuesto deseado en forma de un lfquido viscoso (14 g, 93%). 1H NMR (DMSO-de, 400 MHz) 6 7,62 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 3,80 (bs, 5H), 3,31 (t, 2H), 2,97-3,05 (m, 2H), 2,87-2,96 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 1,52-1,61 (m, 2H), 1,37-1,50 (m, 2H), 0,87 (t, 3H, J=6,8 Hz).
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30 5-(Etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de metilo (4): Una mezcla de 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato de metilo (580 g, 1,63 mol), 4-(4-(4,4,5,5- tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)benzil)morfolina (592 g, 1,95 mol), 1,4-dioxano (3,86 l), carbonato sodico (618 g, 5,83 mol) y agua (771 ml) se desgasifico burbujeando nitrogeno por la mezcla a 20 °C durante 20 minutos y se trato con tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0) (14,11 g, 12,21 mmol). La mezcla resultante se desgaseo durante otros 20 35 minutos y luego se calento hasta 87-89 °C por 17 h. Despues de enfriar hasta 20 °C, la mezcla se diluyo con acetato de etilo (5,80 l) y una disolucion de acido (R)-2-Amino-3-mercaptopropionico (232 g) en agua (2,320 l). Despues de agitar durante 1 h a 20 °C, la capa organica se separo y se lavo con una disolucion de acido (R)-2-Amino-3- mercaptopropionico (232 g) en agua (2,320 l). Las capas acuosas se combinaron y extrajeron con acetato de etilo (5,80 l). Las capas organicas se combinaron, se lavaron con una disolucion de hidroxido sodico (93 g) en agua (2,32
l) y se concentraron al vado a 35 °C para dar el compuesto del titulo en forma de un aceite anaranjado (1,21 kg, 164% de rendimiento).
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Acido 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometilH1,1'-bifenil]-3-carbox^lico (5): 5-(Etil(tetrahidro- 5 2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxilato de metilo (69,0 g, 152,5 mmol) (basado en el rendimiento teorico de la etapa previa) se suspendio en etanol (380 ml) y se trato con una disolucion de hidroxido sodico (24,84 g, 621,0 mmol) en agua (207 ml). La mezcla se agito a 40°C durante 18 h. Despues de enfriar hasta 05 °C, la mezcla se neutralizo hasta pH 6,5 con acido clorddrico 1 N (580 ml) manteniendo la temperatura debajo de 25 °C. Luego la mezcla se extrajo dos veces con una mezcla de diclorometano (690 ml) y metanol (69,0 ml). Las 10 capas organicas se combinaron y concentraron al vado para dar un producto bruto en la forma de un solido amarillo (127 g).
El producto bruto se disolvio en 2-metiltetrahidrofurano (656 ml) a 70 °C y luego se trato con IPA (828 ml). La mezcla se dejo enfriar hasta ta durante 3-4 h y luego se agito durante la noche a ta. El precipitado se filtro, se lavo dos veces con IPA (207 ml) y se seco al vado para dar el compuesto del titulo en forma de un solido blanquecino (53,54 15 g, 80%). El patron de XRPD de este compuesto se muestra en la Figura 9.
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N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)- [1,1'-bifenil]-3-carboxamida (Compuesto I): Una mezcla de acido 5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'- (morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxflico (540 g, 1,23 mol) e hidrocloruro de 3-(aminometil)-4,6-dimetil-dihidro- 20 piridin-2(1H)-ona (279 g, 1,48 mol) se suspendio en DMSO (2,70 l) y se trato con trietilamina (223 ml, 1,60 mol). La mezcla se agito a 25 °C durante 30 min y se trato con EDC-HCl (354 g, 1,85 mol) e hidrato de HOBT (283 g, 1,85 mol). La mezcla de reaccion se agito a ta durante 16 h. Despues de la adicion de trietilamina (292 ml, 2,09 mol), la mezcla se enfrio hasta 15 °C, se diluyo con agua (10,1 l) manteniendo la temperatura debajo de 30 °C, y se agito a 19-25 °C durante 4 h. El precipitado resultante se filtro, se lavo dos veces con agua (2,70 l) y se seco al vado para 25 dar un producto bruto (695 g, analisis peso-peso = 78%).
Para la purificacion adicional del producto, se efectuo recristalizacion. Un producto bruto (20,00 g, 34,92 mmol) se suspendio en una mezcla de etanol (190 ml) y agua (10,00 ml) y se calento a 75°C hasta obtener una disolucion clara. La disolucion se dejo enfriar a ta durante la noche. El precipitado se filtro, se lavo dos veces con una mezcla de etanol (30,0 ml) y agua (30,0 ml) y se seco al vado a 35 °C para dar el compuesto del titulo en forma de un solido 30 blanquecino (14,0 g, 70% recuperacion del bruto y 90% rendimiento en base al ensayo peso-peso).
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Bromuro de 4-((3'-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5'-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4'- metil-[1,1'-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (Polimorfo A): Una N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida bruta (595 g, 464 g en base
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al ensayo de peso-peso, 810,3 mmol) se suspendio en etanol (3,33 l). Despues de calentar hasta 70 °C, la mezcla se trato con 48% HBr acuoso (97 ml, 850,8 mmol) y se agito a 70 °C durante 30 min. La disolucion anaranjada-roja resultante se trato con acetato de etilo (3,33 l) manteniendo la temperatura encima de 60 °C. La mezcla se enfrio lentamente hasta ta durante 18 h. La mezcla se enfrio hasta 0 °C durante 1 h y se agito a esa temperatura durante 5,5 h. El precipitado resultante se filtro, se lavo dos veces con acetato de etilo (1,39 l) y se seco al vado para dar el compuesto del tftulo en forma de un solido blanquecino (515 g, 97% de rendimiento).
Recristalizacion del Polimorfo A: Bromuro de 4-((3'-(((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)carbamoil)-5'- (etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4'-metil-[1,1'-bifenil]-4-il)metil)morfolin-4-io (0,50 g, 0,77 mmol; 95,6% puro por HPLC) se suspendio en etanol (3,0 ml) y se calento hasta 80 °C hasta obtener una disolucion clara. A la disolucion se le anadio MTBE (5,0 ml) lentamente. La disolucion resultante se dejo enfriar hasta 18-22 °C durante 3 h y se agito a 18-22 °C durante 15 h. El precipitado se filtro, se lavo dos veces con MTBE (2 ml) y se seco al vado para dar 0,45 g del compuesto del tftulo (89% recuperacion, 96,6% puro por HPLC). El patron de difraccion de rayos X por polvo del Polimorfo A (monohidrobromuro) se muestra en la Figura 1. La Tabla 1, a continuacion, enumera los picos mas significativos.
Tabla 1
Picos (Grados 2-teta)
3,9
10,1
14,3
17,5
18,7
20,6
20,9
21,8
22,0
23,3
23,6
Evaluacion del hidrobromuro del Compuesto I y el Polimorfo A
Se preparo y evaluo un numero de formas de sal diferentes del Compuesto I, incluidas las sales de hidrocloruro, hidrobromuro, hemisulfato, fosfato sodico, fosfato, nitrato, maleato, malonato y L-tartrato. Entre ellas, la sal de hidrobromuro (HBr) tuvo las propiedades ffsico-qmmicas mas ventajosas en terminos de facilidad de preparacion e higroscopicidad.
Se llevaron a cabo estudios detallados de la base libre del Compuesto I, asf como tambien la sal de HCl de este compuesto. Se detectaron por lo menos cinco formas cristalinas distintas a partir de la forma libre del Compuesto I durante la evaluacion del polimorfo preliminar usando XRD y DSC. Debido al alto grado de variabilidad observado durante la cristalizacion de la forma libre, se investigaron formas cristalinas de otras sales. De las sales evaluadas, las formas de sal de monohidrocloruro, monohidrobromuro, hemisulfato, fosfato, maleato, L-tartrato y sodio fueron cristalinas. Las sales de fosfato y maleato fueron muy higroscopicas y el L-tartrato tuvo poca cristalinidad.
Fue diffcil obtener un alto grado de cristalinidad de la sal de HCl del Compuesto I. Se obtuvo una mezcla de material cristalino y amorfo independientemente de las condiciones de cristalizacion. Como se muestra en la Figura 8, los datos de DSC de la sal de monohidrocloruro del Compuesto I indican algun grado de no cristalinidad con una reaccion endotermica a 190,5°C. Ademas, se obtuvieron los datos de sorcion dinamica de vapor (DVS) para la sal
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de monohidrocloruro del Compuesto I y se hallo que exhidan cierta higroscopicidad: se observo un aumento de peso de 4 - 6% a 75% de humedad relativa (HR) a 25°C (Figura 18B). Esto puede atribuirse a una cierta cantidad de naturaleza no cristalina de la sal de monohidrocloruro. Vease, p. ej., la Figura 18A, que muestra un Compuesto I de trihidrocloruro amorfo. Dado que el nivel de cristalinidad no fue controlable, la sal de HCl no se considero para posterior desarrollo.
Como se muestra en la Figura 6, el analisis DVS de la sal de sodio del Compuesto I demostro higroscopicidad significativa: se observo un aumento de peso de aproximadamente 15% a 75% de humedad relativa (HR) a 25°C. Como se muestra en la Figura 7, la sal hemisulfato del Compuesto I demostro higroscopicidad moderadamente alta: se observo un aumento de peso de 9 - 11% a 75% humedad relativa (HR) a 25°C. Esto puede atribuirse a la naturaleza altamente no cristalina del compuesto, ya que los datos de DSC de la sal de hemisulfato indican un grado muy alto de no cristalinidad sin reaccion endotermica limpia.
De estos compuestos cristalinos, el monohidrobromuro fue el mas cristalino y el menos higroscopico (veanse las Figuras 1, 3 y 4). Asimismo, el monohidrobromuro es altamente estable y resiste a la generacion de impurezas (la Figura 5 ilustra el analisis HPLC del Polimorfo A durante tres dfas a temperatura elevada. El Polimorfo A produjo impurezas mrnimas durante tres dfas 100°C). Cabe destacar que se hallo que la sal de di-HBr del Compuesto I era principalmente amorfa (Figura 2).
Dos formas cristalinas diferentes del monohidrobromuro del Compuesto I (Polimorfos A y B) se obtuvieron de diferentes sistemas disolventes y se caracterizaron usando analisis XRD, DSC y TGA-DSC. Los datos de XRD y DSC para estas dos formas cristalinas diferentes de partidas representativas del Compuesto I se exponen en la Figura 1, la Figura 3 y la 10. El Polimorfo B se caracteriza por un patron de difraccion por polvo de XRD con picos a 8,5, 10,9, 16,7, 17,4, 20,9, 22,1 y 25,7 ±0,2 grados 2 teta (vease la Figura 10). Entre estos dos, se descubrio que el Polimorfo A era mas cristalino por naturaleza. Los estudios de adsorcion dinamica de vapor (DVS) demostraron que el polimorfo A es no higroscopico (Figura 4). En los analisis termicos, se observo un solo pico endotermico con una temperatura de inicio a aproximadamente 251 °C. Ademas, fue evidente a partir del analisis de DSC que la recristalizacion del polimorfo A aumenta significativamente la cristalinidad del material (vease la Figura 3).
En multiples operaciones a escala de laboratorio, el Polimorfo A se obtuvo de manera reproducible, y ligeros cambios en las condiciones de cristalizacion no resultaron en formas cristalinas diferentes.
Ensayos de enzimas PRC2 mutantes y de tipo silvestre
Materiales generales. Se adquirieron S-adenosilmetionina (SAM), S-adenosilhomocistema (SAH), bicine, KCl, Tween20, dimetilsulfoxido (DMSO) y gelatina de piel bovina (BSG) de Sigma-Aldrich con el mas alto nivel de pureza posible. Se adquirio ditiotreitol (dTT) de EMD. Se adquirio 3H-sAm de American Radiolabeled Chemicals con una actividad espedfica de 80 Ci/mmol. Se adquirieron Flashplates de estreptavidina de 384 pocillos de PerkinElmer.
Sustratos. Peptidos representativos de residuos de histona humanos H3, 21 - 44 que conternan o bien lisina no modificada 27 (H3K27me0) o lisina dimetilada 27 (H3K27me2) se sintetizaron con un motivo de marca de afinidad- enlazador C-terminal G(K-biotina) y un recubrimiento amida C-terminal amida de 21st Century Biochemicals. Los peptidos fueron purificados por cromatograffa de ffquidos de alta resolucion (HPLC) hasta una pureza mayor a 95% y se confirmaron por cromatograffa de ffquidos y espectrometna de masas (LC-MS). Las secuencias se exponen a continuacion.
H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEC ID NO: 1) H3K27me2:
ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotina)-amida (SEC ID NO: 2)
Se purificaron oligonucleosomas de eritrocitos de pollo a partir de sangre de pollo, de conformidad con los procedimientos establecidos.
Complejos de PRC2 recombinante. Se purificaron complejos de PRC2 humana como complejos enzimaticos de 4 componentes co-expresados en celulas de Spodoptera frugiperda (sf9) usando un sistema de expresion de baculovirus. Las subunidades expresadas fueron EzH2 de tipo silvestre (NM_004456) o EZH2 Y641F, N, H, S o C mutantes generados a partir del constructo EZH2 de tipo silvestre, eEd (NM_003797), Suz12 (NM_015355) y RbAp48 (NM_005610). La subunidad EED conterna una marca N-terminal FLAG que se utilizo para purificar todo el complejo de 4 componentes de los lisados celulares sf9. La pureza de los complejos alcanzo o excedio el 95% segun lo determinado por analisis SDS-PAGE y Agilent Bioanalyzer. Las concentraciones de concentraciones stock de enzimas (en general 0,3 - 1,0 mg/ml) se determinaron usando un ensayo Bradford contra un estandar de albumina de suero bovino (BSA).
Procedimiento general para ensayos de enzimas PRC2 en sustratos pepffdicos. Los ensayos se efectuaron todos en un tampon que consisffa en bicine 20 mM (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, 0,005% BSG y 0,002% Tween20, preparado el dfa del uso. Los compuestos en 100% DmSo (1 pl) se dispusieron en placas de fondo V de polipropileno con 384 pocillos (Greiner) usando un Platemate 2 X 3 equipado con una pipeta de 384 canales (Thermo). Se anadio DMSO (1 pl) a las columnas 11, 12, 23, 24, hileras A - H para control de senal maxima, y SAH, un producto e inhibidor de PRC2 conocido (1 pl) se anadio a las columnas 11,12, 23, 24, hileras I - P para control de senal minima. Un coctel
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(40 |jl) que contema la enzima PRC2 de tipo silvestre y el peptido H3K27me0 o cualquiera de las enzimas mutantes Y641 y H3K27me2 se anadio por Multidrop Combi (Thermo). Los compuestos se dejaron incubar con PRC2 durante 30 min a 25 °C, luego un coctel (10 jl) que contema una mezcla de no radiactivo y 3H-SAM se anadio para iniciar la reaccion (volumen final = 51 jl). En todos los casos, las concentraciones finales fueron las siguientes: la enzima PRC2 de tipo silvestre o mutante fue 4 nM, SAH en los pocillos de control de senal minima fue 1 mM y la concentracion de DMSO fue 1%. Las concentraciones finales del resto de los compuestos se indican en la Tabla 2 a continuacion. Los ensayos cesaron por adicion de SAM no radiactivo (10 jl) a una concentracion final de 600 jM, que diluye el 3H-SAM hasta un nivel en el que su incorporacion al sustrato peptfdico ya no es detectable. Se transfirieron luego 50 jl de la reaccion en la placa de polipropileno de 384 pocillos a una Flashplate de 384 pocillos, y los peptidos biotinilados se dejaron unir a la superficie de estreptavidina durante por lo menos 1h antes de lavarse tres veces con 0,1% Tween20 en una lavadora de placas Biotek ELx405. Las placas se leyeron luego en una lectora de placas PerkinElmer TopCount para medir la cantidad de peptido marcado con 3H unido a la superficie de la Flashplate, que se mide como desintegraciones por minuto (dpm) o alternativamente, se hace referencia como a los recuentos por minuto (cpm).
Tabla 2: Concentraciones finales de los componentes para cada variacion del ensayo en funcion de la identidad de EZH2 (EZH2 mutante Y641 o de tipo silvestre)
Enzima PRC2 (indicada por identidad de EZH2)
Peptido (nM) SAM no radiactivo (nM) 3H-SAM (nM)
Tipo silvestre
185 1800 150
Y641F
200 850 150
Y641N
200 850 150
Y641H
200 1750 250
Y641S
200 1300 200
Y641C
200 3750 250
Procedimiento general para el ensayo de enzimas PRC2 de tipo silvestre en sustrato de oligonucleosomas. Los ensayos se realizaron en un tampon que consistfa en bicine 20 mM (pH = 7,6), DTT 0,5 mM, 0,005% BSG, KCl 100 mM y 0,002% Tween20, preparado el dfa del uso. Los compuestos en 100% DMSO (1 jl) se dispusieron en placas de fondo V de polipropileno con 384 pocillos (Greiner) usando una Platemate 2 X 3 equipada con una pipeta de 384 canales (Thermo). Se anadio DMSO (1 jl) a las columnas 11, 12, 23, 24, hileras A - H para el control de senal maxima, y SAH, un producto e inhibidor de PRC2 conocido (1 jl), se anadio a las columnas 11,12, 23, 24, hileras I - P para el control de senal minima. Un coctel (40 jl) que contema la enzima PRC2 de tipo silvestre y oligonucleosoma de eritrocitos de pollo se anadio por Multidrop Combi (Thermo). Los compuestos se dejaron incubar con PRC2 durante 30 min a 25 °C, luego se anadio un coctel (10 jl) que contema una mezcla de no radiactivo y 3H- SAM para iniciar la reaccion (volumen final = 51 jl). Las concentraciones finales fueron las siguientes: la enzima PRC2 de tipo silvestre fue 4 nM, SAM no radiactivo fue 430 nM, 3H-SAM fue 120 nM, oligonucleosoma de eritrocitos de pollo fue 120 nM, SAH en los pocillos control de senal minima fue 1 mM y la concentracion de DMSO fue 1%. El ensayo ceso por adicion de SAM no radiactivo (10 jl) hasta una concentracion final de 600 jM, que diluye el 3H- SAM hasta un nivel en el que su incorporacion en el sustrato de oligonucleosoma de eritrocitos de pollo ya no es detectable. Se transfirieron luego 50 jl de la reaccion en la placa de polipropileno de 384 pocillos a una Flashplate de 384 pocillos, y los nucleosomas de eritrocitos de pollo se inmovilizaron a la superficie de la placa, que luego se lavo tres veces con 0,1 % Tween20 en una lavadora de placas Biotek ELx405. Las placas se leyeron luego en una lectora de placas PerkinElmer TopCount para medir la cantidad de oligonucleosoma de eritrocitos de pollo marcado con 3H unido a la superficie de Flashplate, que se mide como desintegraciones por minuto (dpm) o alternativamente, como recuentos por minuto (cpm).
%inh=IOO-(-----dPmcomp~dPmmm \ xl0Q
V dpmmax"dpmm;n /
donde dpm = desintegraciones por minuto, cmpd = senal en el pocillo de ensayo, y mm y max son los respectivos controles de senal minima y maxima.
Ajuste de CI50 de cuatro parametros
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en donde normalmente se permite que la parte superior y la parte inferior floten, pero pueden fijarse a 100 o 0 respectivamente en un ajuste de 3 parametros. Normalmente se permite que el coeficiente de Hill flote, pero tambien se puede fijar en 1 en un ajuste de 3 parametros. Y es el % de inhibicion y X es la concentracion del compuesto.
Los valores CI50 para los ensayos de la enzima PRC2 en sustratos peptidicos (p. ej., EZH2 de tipo silvestre y) se presentan en la siguiente Tabla 3.
Ensayo de metilacion de WSU-DLCL2
Se adquirieron celulas de suspension WSU-DLCL2 de DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania). Medio RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, suero bovino fetal inactivado por calor y D-PBS se adquirieron de Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU. El tampon de extraccion y el tampon de neutralizacion (5X) se adquirieron de Active Motif, Carlsbad, CA, EE. UU. Se adquirieron anticuerpo de conejo y anti-histona H3 de Abcam, Cambridge, MA, EE. UU. IgG anti-H3K27me3 de conejo e IgG anti-conejo conjugada a HRP se adquirieron de Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU. El sustrato TMB "Super Sensitive" fue provisto por BioFX Laboratories, Owings Mills, MD, EE. UU. La albumina de suero bovino libre de IgG se adquirio de Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU. Se adquirio PBS con Tween (10X PBST) de KPL, Gaithersburg, MD, EE. UU. Se adquirio acido sulfurico de Ricca Chemical, Arlington, TX, EE. UU. Se adquirieron placas ELISA Immulon de Thermo, Rochester, NY, EE. UU. Las placas de cultivo celular de fondo V se adquirieron de Coming Inc., Corning, NY, EE. UU. Las placas de polipropileno de fondo V se adquirieron de Greiner Bio-One, Monroe, NC, EE. UU.
Se mantuvieron celulas de suspension WSU-DLCL2 en medio de crecimiento (RPMI 1640 enriquecido con 10% v/v suero bovino fetal inactivado por calor y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) y se cultivaron a 37°C bajo 5% CO2, Bajo condiciones de ensayo, las celulas se incubaron en Medio de Ensayo (RPMI 1640 enriquecido con 20% v/v suero bovino fetal inactivado por calor y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) a 37°C bajo 5% CO2 en un agitador de placas.
Las celulas WSU-DLCL2 se sembraron en medio de ensayo a una concentracion de 50.000 celulas por ml en una placa de cultivo celular con fondo V de 96 pocillos con 200 jl por pocillo. El compuesto (1 jl) de placas de origen de 96 pocillos se anadio directamente a una placa celular de fondo en V. Las placas se incubaron en un agitador de placas de titulacion a 37°C, 5% CO2 por 96 horas. Despues de cuatro dfas de incubacion, las placas se centrifugaron a 241 x g por cinco minutos y se aspiro suavemente el medio de cada pocillo de la placa celular sin alterar el sedimento celular. El sedimento se re-suspendio en 200 jl de DPBS y las placas se centrifugaron nuevamente a 241 x g durante cinco minutos. El sobrenadante se aspiro y se enfrio (4°C). Se anadio tampon de extraccion (100 jl) por pocillo. Las placas se incubaron a 4°C en un agitador orbital durante dos horas. Las placas se centrifugaron a 3427 x g x 10 minutos. El sobrenadante (80 jl por pocillo) se transfirio a su respectivo pocillo en una placa de polipropileno con fondo V de 96 pocillos. El tampon de neutralizacion 5X (20 jl por pocillo) se anadio a la placa de polipropileno con fondo v que contema sobrenadante. Las placas de polipropileno con fondo en V que conteman la preparacion de histona en bruto (CHP) se incubaron en un agitador orbital x cinco minutos. Se anadieron preparaciones de histona en bruto (2 jl por pocillo) a cada pocillo respectivo en placas ELISA de 96 pocillos duplicadas que conteman 100 jl de tampon de recubrimiento (1X PBS + BSA 0,05% p/v). Las placas se sellaron e incubaron durante una noche a 4°C. .Al dfa siguiente, las placas se lavaron tres veces con 300 jl por pocillo 1X PBST. Los pocillos se bloquearon durante dos horas con 300 jl por pocillo de diluyente de ELISA ((PBS (1X) BSA (2% p/v) y Tween20 (0,05% v/v)). Las placas se lavaron tres veces con 1X PBST. Para la placa de deteccion de histona H3, se anadieron 100 jl por pocillo de anticuerpo anti-Histona H3 (Abcam, ab1791) diluido 1:10.000 en diluyente de ELISA. Para la placa de deteccion de trimetilacion de H3K27, se anadieron 100 jl por pocillo de anti-H3K27me3 diluido 1:2000 en diluyente de ELISA. Las placas se incubaron durante 90 minutos a temperature ambiente. Las placas se lavaron tres veces con 300 jl 1X PBST por pocillo. Para la deteccion de histona H3, se anadieron 100 jl de anticuerpo de IgG anti-conejo conjugado a HRP diluido hasta 1:6000 en diluyente de ELISA por pocillo. Para la deteccion de H3K27me3, se anadieron 100 jL por pocillo de anticuerpo IgG anti-conejo conjugado a HRP diluido a 1:4000 en diluyente de ELISA. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las placas se lavaron cuatro veces con 1X PBST 300 jl por pocillo. Se anadieron 100 jl por pocillo de sustrato TMB. Las placas de histona H3 se incubaron durante cinco minutos a temperatura ambiente. Las placas de H3K27me3 se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reaccion ceso con acido sulfurico 1N (100 jl por pocillo). La absorbancia por cada placa se leyo a 450 nm.
Primero se determino la relacion para cada pocillo por:
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valor H3K27me3 OD450 . valor histona H3 OD450
Cada placa incluyo ocho pocillos control de tratamiento con DMSO solamente (inhibicion mmima) asf como tambien ocho pocillos control para inhibicion maxima (pocillos de fondo).
El promedio de relacion para cada tipo de control se calculo y uso para determinar el porcentaje de inhibicion de cada pocillo de ensayo en la placa. El compuesto de prueba se diluyo en serie tres veces en DMSO por un total de diez concentraciones de prueba, comenzando a 25 pM. Se determino el porcentaje de inhibicion y se generaron las curvas de CI50 usando pocillos duplicados por concentracion del compuesto. Los valores CI50 para este presentan en la Tabla 3 a continuacion.
| / (Indice muestra de prueba individual) - (Indice promedio de fondo) \
Porcentaje de inhibicion = 100- --------;---------------------------------------------:-----------------------------------------------j
\V (Indice de inhibicion minima) - (Indice promedio de fondo) )
ensayo se
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Analisis de proliferacion celular
Se adquirieron celulas de suspension WSU-DLCL2 de DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Alemania). El medio RPMI/Glutamax, Penicilina-Estreptomicina, suero bovino fetal inactivado por calor se adquirieron de Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU. Las placas de polipropileno de fondo en V y 384 pocillos se adquirieron de Greiner Bio-One, Monroe, NC, EE. UU. Las placas blancas opacas de 384 pocillos para cultivo celular se adquirieron de Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU. Se adquirio Cell-Titer Glo® de Promega Corporation, Madison, WI, EE. UU. Se adquirio la lectora de placas SpectraMax M5 de Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, EE. UU.
Las celulas de suspension WSU-DLCL2 se mantuvieron en medio de crecimiento (RPMI 1640 enriquecido con 10% v/v suero bovino fetal inactivado por calor y se cultivaron a 37°C bajo 5% CO2. Bajo condiciones de ensayo, las celulas se incubaron en medio de ensayo (RPMI 1640 enriquecido con 20% v/v suero bovino fetal inactivado por calor y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina) a 37°C bajo 5% CO2,
Para la evaluacion del efecto de los compuestos en la proliferacion de la lmea celular WSU-DLCL2, las celulas de crecimiento exponencial se dispusieron en placas blancas opacas de 384 pocillos a una densidad de 1250 celula/ml en un volumen final de 50 pl de medio de ensayo. Una placa con origen del compuesto se preparo efectuando 3 diluciones en serie por triplicado de nueve puntos en DMSo, comenzando a 10 mM (la concentracion superior final del compuesto en el ensayo fue 20 pM y el DMSO fue 0,2%). Una almuota de 100 nl de la placa stock del compuesto se anadio a su respectivo pocillo en la placa celular. El control del 100% de inhibicion consistio en celulas tratadas con una concentracion final de 200 nM de estaurosporina y el control de 0% de inhibicion consistio en celulas tratadas con DMSO. Despues de la adicion de los compuestos, las placas de ensayo se incubaron durante 6 dfas a 37°C, 5% CO2, humedad relativa > 90% durante 6 dfas. La viabilidad celular se midio por cuantificacion del ATP presente en los cultivos celulares, anadiendo 35 pl de reactivo Cell Titer Glo® a las placas celulares. La luminiscencia se leyo en SpectraMax M5. La concentracion que inhibe la viabilidad celular por 50% se determino usando un ajuste de 4 parametros de las curvas de dosis y respuesta normalizadas. Los valores CI50 para este ensayo se presentan en la Tabla 3 a continuacion.
Tabla 3
peptido EZH2 IC50 v2 Y641F CI50 WSU prolif CI50 WSU ELISA CI50
Compuesto I (base libre)
0,01299 0,01107 0,369 0,29
Estudio in vivo - Lmea celular de linfoma humano SUDHL10 Ratones
Los ratones hembra Fox Chase SCID® (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl, Beijing Vitalriver Laboratory Animal Co., LTD) teman 6 - 8 semanas de vida y un peso corporal (BW) en el intervalo de 16,0-21,1 g en el D1 del estudio. Los animales recibieron alimento a voluntad con agua (esteril) y alimento en granulos secos esterilizado por radiacion. Los ratones fueron alojados en lechos de mazorca de mafz en micro-aislantes estaticos en un ciclo de luz de 12 horas a 20-22 °C (68-72 °F) y 40-60% de humedad. Todos los procedimientos cumplen con las recomendaciones de la Gma para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Guide for Care and Use of Laboratory Animals) con
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respecto a restricciones, cna, procedimientos quirurgicos, regulacion de alimentacion y Kquidos, y atencion veterinaria.
Cultivo de celulas tumorales
La lmea celular de linfoma humano SUDHL10 se obtuvo de DSMZ y se mantuvo en el CRO como cultivos en suspension en medio RPMI-1640 que contema 100 unidades/ml de penicilina G sal de sodio, 100 g/ml de estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Las celulas se cultivaron en matraces de cultivo de tejido en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmosfera de 5% CO2 y 95% aire. Solamente los cultivos debajo del pasaje 12 se usaron para implantacion
Implantacion de tumores in vivo
Se recogio la lmea celular de linfoma humano SUDHL10 durante el crecimiento de fase logantmica media y se resuspendio en PBS con 50% Matrigel™ (BD Biosciences). Cada raton recibio 1 x 107 celulas (0,2 ml suspension celular) subsiguientemente en el flanco derecho. Los tumores se midieron en dos dimensiones para vigilar el crecimiento a medida que el volumen medio alcanzaba el intervalo de 80-120 mm3 deseado. El tamano del tumor, en mm3, se calculo a partir de:
w1 * l
Volumen del tumor =----------
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en donde w = ancho y l = largo, en mm, del tumor. El peso del tumor se puede estimar con la hipotesis de que 1 mg es equivalente a 1 mm3 del volumen del tumor. Despues de 10 dfas los ratones con 72-256 mm3 tumores se clasificaron en cuatro grupos (n=16 por grupo) con volumenes del tumor medios de 173-179 mm3,
Artmulos de prueba
El hidrobromuro del Compuesto I se conservo a temperatura ambiente y se protegio de la luz. En cada dfa del tratamiento, se prepararon formulaciones frescas del compuesto suspendiendo el polvo en 0,5% carboximetilcelulosa sodica (NaCMC) y 0,1% Tween® 80 en agua desionizada. El vehmulo, 0,5% NaCMC y 0,1% Tween® 80 en agua desionizada, se uso para tratar el grupo control en el mismo esquema. Las formulaciones se conservaron fuera de la luz a 4 °C antes de la administracion.
Plan de tratamiento
Los ratones se trataron con dosis del hidrobromuro del Compuesto I en el intervalo de 125 - 500 mg/kg y con esquemas BID (dos veces al dfa, cada 12 h) durante 28 dfas por gavage oral. Cada dosis se administro en un volumen de 0,2 ml/20 g raton (10 ml/kg), y se ajusto segun el ultimo peso registrado de los animales individuales. El dfa 25, se seleccionaron los 8 ratones con los tumores mas pequenos por grupo para una valoracion final de la demora del crecimiento del tumor (observacion hasta 60 dfas). El resto de los animales se sometieron a eutanasia el dfa 28, 3h despues de la ultima dosis para recoleccion del tumor.
Analisis de la mediana del volumen del tumor (MTV) e inhibicion del crecimiento del tumor (TGI)
La eficacia del tratamiento se determino para cada grupo el ultimo dfa del tratamiento. Se determino la MTV(n), la mediana del volumen del tumor para el numero de animales, n, evaluables el ultimo dfa. El porcentaje de inhibicion del crecimiento del tumor (%TGI) se puede definir de varias maneras. Primero, la diferencia entre la MTV(n) del grupo control designado y la MTV(n) del grupo tratado con el farmaco se expresa como porcentaje de la MTV(n) del grupo control:
ww- )X100
Otra forma de calcular el %TGI consiste en tomar en cuenta el cambio del tamano del tumor desde el dfa 1 hasta el dfa n, en donde n es el ultimo dfa del tratamiento.
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AMTVco^ol = MTV(n)cor^ei - MTV{T}C^
= nTv(n)- tfri'CL}^
Analisis de demora del crecimiento del tumor
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Se mantuvieron vivos ocho ratones por grupo despues del ultimo dfa del tratamiento para analisis de demora del crecimiento del tumor. Los tumores se valoraron dos veces por semana, y cada animal de prueba fue sacrificado cuando su neoplasia alcanzo el volumen de valoracion final de 2000 mm3 o el ultimo dfa pre-especificado del estudio, lo que sucediera primero. Se efectuo un analisis de supervivencia Kaplan Meier. Toxicidad
Los animales se pesaron a diario en los dfas 1-5, y luego dos veces por semana hasta completar el estudio. Los ratones fueron examinados frecuentemente para detectar signos visibles de cualquier efecto colateral adverso relacionado con el tratamiento, los cuales fueron documentados. La toxicidad aceptable para la dosis maxima tolerada (MTD) se definio con una perdida de peso corporal (BW) promedio de menos de 20% durante la prueba, y no mas de 10% de mortalidad debida a muertes TR. Una muerte se clasifico como TR si fue atribuible a los efectos colaterales del tratamiento segun lo evidenciado por los signos clmicos y/o la autopsia, o debido a causas desconocidas durante el periodo de administracion. Una muerte se clasifico como NTR si hubo evidencia de que la muerte no estuvo relacionada con efectos colaterales del tratamiento. Las muertes NTR durante el intervalo de dosis habitualmente se categorizanan como NTRa (debido a un accidente o un error humano) o NTRm (debido a la diseminacion del tumor confirmada por autopsia por invasion y/o metastasis). Los animales tratados por la via oral que murieron por causas desconocidas durante el periodo de administracion se pueden clasificar como NTRu cuando el desempeno grupal no respalda una clasificacion TR y no es factible la autopsia para descartar un error en la dosis.
Muestreo
El dfa 28, los ocho ratones con los tumores mas grandes se sometieron a una muestra en un modo pre-especificado para evaluar la inhibicion de la diana en los tumores. Los tumores se extirparon de los ratones especificados bajo condiciones libres de RNAsa y se bisecaron. Se midio el peso total del tumor. El tejido tumoral congelado de cada animal se conservo en N2 lfquido y se pulverizo con un mortero.
Analisis estadfstico y grafico
Todos los analisis estadfsticos y graficos se realizaron con Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. Para ensayar la significacion estadfstica entre el control y los grupos tratados durante todo el transcurso del tratamiento, se empleo una prueba ANOVA de mediciones repetidas seguida de una prueba de comparacion multiple de Dunnet. Los resultados de los informes de Prism se exponen como no significativo (ns) en P > 0,05, significativo (simbolizado por "*") en 0,01 < P < 0,05, muy significativo ("**") en 0,001 < P < 0,01 y extremadamente significativo ("***") en P < 0,001. Para el grupo del estudio de demora de crecimiento del tumor, se presento el porcentaje de animales en cada grupo que sigue en el estudio frente a tiempo en un grafico de supervivencia Kaplan-Meier.
Extraccion de histona
Para el aislamiento de histonas, se homogeneizaron 60-90 mg de tejido de tumor en 1,5 ml de tampon de extraccion nuclear (Tris-HCl 10 mM, MgCh 10 mM, KCl 25 mM, 1% Triton X-100, 8,6% Sacarosa, mas un comprimido de inhibidor de proteasa de Roche 1836145) y se incubaron en hielo durante 5 minutos. Se recogieron los nucleos por centrifugacion a 600 g por 5 minutos a 4° C y se lavaron una vez en PBS. Se elimino el sobrenadante y las histonas se extrajeron durante una hora, con agitacion en vortex cada 15 minutos, con acido sulfurico fno 0,4 N. Los extractos se aclararon por centrifugacion a 10000 g durante 10 minutos a 4°C y se transfirieron a un tubo microcentnfugo nuevo que contema 10x volumen de acetona enfriada con hielo. Las histonas precipitaron a -20° C por 2 horas durante la noche se sedimentaron por centrifugacion a 10000 g durante 10 minutos y se resuspendieron en agua.
ELISA
Las histonas se prepararon en concentraciones equivalentes en tampon de recubrimiento (PBS+0,05%BSA) produciendo 0,5 ng/ul de muestra, y 100 ul de la muestra o el estandar se anadieron por duplicado a 2 placas ELISA de 96 pocillos (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Las placas se sellaron e incubaron durante toda la noche a 4°C. Al dfa siguiente, las placas se lavaron 3x con 300 ul/pocillo de PBST (PBS+0,05% Tween 20; 10X PBST, KPL #51-14-02) en una lavadora de placas Bio Tek. Las placas se bloquearon con 300 ul/pocillo de diluyente (PBS+2%BSA+0,05% Tween 20), se incubaron a TA durante 2 horas y se lavaron 3x con PBST. Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyente. Se anadieron a cada placa 100 ul/pocillo de anti-H3K27me3 (CST #9733, 50% stock de glicerol 1:1,000) o anti-total H3 (Abcam ab1791, 50% glicerol 1:10,000). Las placas se incubaron por 90 min a TA y se lavaron 3x con PBST. Se anadieron 100 ul/pocillo de anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) 1:2.000 a la placa H3K27Me3 y 1:6.000 a la placa H3 y se incubo durante 90 min a TA. Las placas se lavaron 4X con PBST. Para deteccion, se anadieron 100 ul/pocillo de sustrato TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) y las placas se incubaron en la oscuridad a TA durante 5 min. La reaccion ceso con 100 ul/pocillo de H2SO4 1N. La absorbancia a 450 nm se leyo en una lectora de microplacas SpectaMax M5.
Resultados:
Los ratones que portaban xenoinjertos de tumor SUDHL10 se trataron con el hidrobromuro del Compuesto I en la dosis maxima tolerada de 500 mg/kg BID y fracciones del MTD (1X y % MTD). Todas las dosis se toleraron bien durante 28 dfas sin ninguna perdida de peso importante. Hubo una muerte relacionada con el tratamiento en el
5
10
15
20
25
30
35
grupo de 500 mg/kg el dfa 15, debido a un error en la administracion. Todas las dosis resultaron en la inhibicion del crecimiento del tumor en comparacion con el vehnculo en el d^a 28 (Tabla 4), y los grupos BID de 250 mg/kg y 500 mg/kg BID indujeron regresiones (TGI > 100%).
Tabla 4:
Resumen de los valores de inhibicion de crecimiento del tumor inducida por el hidrobromuro del Compuesto I en xenoinjertos SUDHL10
Grupo
% TGI desde el dfa 1 % TGI desde el dfa 8
125 mg/kg BID
54 57
250 mg/kg BID
101 113
500 mg/kg BID
104 115
La Figura 12A muestra el crecimiento de tumores de xenoinjerto SUDHL10 con el transcurso del tiempo para los distintos grupos de tratamiento. El grupo BID de 125 mg/kg no fue significativamente distinto del grupo del vehnculo segun ANOVA de mediciones repetidas y post-prueba de Dunnet, pero el tamano del tumor terminal medio en el dfa 28 fue significativamente mas pequeno que el del grupo vehnculo (ANOVA de 2 vfas con post-prueba de Bonferroni, p < 0,0001). La administracion de 250 mg/kg BID y 500 mg/kg BID del hidrobromuro del Compuesto I durante 28 dfas indujo respuestas de regresion comparables, ya que los pesos de los tumores terminales en el dfa 28 fueron similares para esos 2 grupos (Figura 12B).
Las histonas aisladas de tumores recogidas el dfa 28 (3h despues de la ultima dosis) se sometieron a analisis ELISA para niveles de H3K27me3 globales. La Figura 13 muestra un claro descenso dependiente de la dosis de la marca de metilo H3K27me3 con el tratamiento del hidrobromuro del Compuesto I. Esta figura muestra la metilacion H3K27me3 global en tumores SUDHL10 de ratones tratados con el hidrobromuro del Compuesto I durante 28 dfas.
El dfa 25, se eligieron ocho ratones por grupo con los tumores mas pequenos para evaluar en un estudio de demora del crecimiento del tumor. Se evaluo el re-crecimiento de tumores despues del cese de la administracion de la dosis en el dfa 28. Los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron un tamano de 2000 mm3 o el dfa 60 (lo que sucediera primero). Estos datos se usaron para efectuar un analisis de supervivencia Kaplan Meier. La Figura 14A muestra que el re-crecimiento del tumor fue claramente dependiente de la dosis, y todos los ratones tratados con la dosis mas alta de 500 mg/kg BID por 28 dfas sobrevivieron hasta el dfa 60. Solamente 2 ratones debieron ser sacrificados en el grupo de 250 mg/kg antes del dfa 60. Los ratones en el grupo de 125 mg/kg tuvieron un claro beneficio de supervivencia frente a los ratones tratados con vehnculo, con un incremento en la mediana de supervivencia de 15,5 dfas (Figura 14B).
Efecto anti-cancer del hidrobromuro del Compuesto I sobre el modelo de xenoinjerto de raton Pfeiffer de linfoma difuso de celulas grandes B humano
El monohidrobromuro del Compuesto I se ensayo por su actividad antineoplasica en el modelo de xenoinjerto de raton Pfeiffer, que es un modelo de xenoinjerto de linfoma difuso de celulas grandes B. A ratones NSG hembra de 5 semanas de vida (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) se les implantaron subcutaneamente 20 a 25 mg de fragmentos de tumor. El tratamiento se inicio aproximadamente 31 dfas despues de la implantacion del tumor, cuando los tumores promedio alcanzaron aproximadamente 365 mm3, El esquema de tratamiento se describe en la Tabla 5.
Tabla 5. Esquema de administracion
Grupo
Num. de animales Tratamiento Ruta y esquema
A
9 Vehnculo (0,5% Metil Celulosa, 0,1% Tween-80) PO; qdx28
B
9 34,2 mg/kg Compuesto I (sal de HBr) PO; qdx28
5
10
15
20
25
30
35
Grupo
Num. de animales Tratamiento Ruta y esquema
C
9 114 mg/kg Compuesto I (sal de HBr) PO; qdx28
D
9 342 mg/kg Compuesto I (sal de HBr) PO; qdx28
E
9 1140 mg/kg Compuesto I (sal de HBr) PO; qdx12§
§ Debido a cuestiones de tolerabilidad del compuesto, solamente se administraron 12 dosis diarias a este grupo.
Se efectuo un seguimiento del volumen del tumor en todo el experimento. El volumen del tumor se midio dos veces por semana despues del comienzo del tratamiento. La carga del tumor (mg = mm3) se calculo a partir de mediciones calibradas con la formula para el volumen de un elipsoide prolato (LxW~)/2 en donde L y W son las respectivas mediciones de longitud y ancho ortogonal (mm).
El dfa 1 fue el dfa del primer tratamiento, y el dfa 28 fue el dfa del ultimo tratamiento. Este estudio finalizo 36 dfas despues de la ultima dosis, asf que el dfa 64 fue el d^a de finalizacion del estudio. Los criterios principales de valoracion utilizados para evaluar la eficacia en este estudio fueron las regresiones completas de los tumores (CR), los tamanos de los tumores entre los grupos y el porcentaje de inhibicion del tumor al final del estudio. Una respuesta completa se definio como una reduccion del tamano del tumor hasta un tamano no detectable (< 20mm3) al final del estudio. Los valores para porcentaje de inhibicion del tumor se calcularon a partir de la formula [1- (AT/AC)] x 100, en donde AT y AC son cambios en el valor del tumor medio (A crecimiento) para cada grupo tratado (T) y vefnculo control (C). To y Co (un dfa antes de la primera dosis) se usaron para el volumen inicial del tumor. Adicionalmente, los volumenes de los tumores que se tomaron un dfa despues de la ultima dosis (T29 y C29) se usaron para el calculo de AT y AC. Cuando el valor fue de mas de 100%, se concluyo como 100%. La formula utilizada para el calculo de porcentaje de inhibicion del tumor se expone a continuacion.
|" ~29 “ ■0 1
Porcentaje de inhibicion del tumor = A 1---------------------k X 100 %
— Co J
Durante el periodo de tratamiento, se descubrio que los animales no pueden tolerar el tratamiento diario de 1142 mg/kg del hidrobromuro del Compuesto I y tres animales en este grupo (grupo E) debieron ser sacrificados despues de la primera semana de tratamiento debido a una perdida de mas de 20% del peso corporal inicial. En consecuencia, la administracion del farmaco para este grupo ceso despues de 12 dosis. Los animales en otros tres grupos de administracion de la dosis, excepto un animal en el grupo D (342 mg/kg de hidrobromuro del Compuesto I), toleraron bien el tratamiento de 28 dfas con perdida de peso corporal minima. El peso corporal relativo de los ratones se grafico en la Figura 15. El peso corporal de los animales obtenido el dfa 0 se uso como el peso corporal inicial en el grafico.
El hidrobromuro del Compuesto I demostro potente y duradera actividad antineoplasica en el modelo de Pfeiffer con 100% de tasa de CR en tres de cuatro grupos de administracion (Tabla 6). Asimismo, no se observo el re- crecimiento del tumor incluso 36 dfas despues del cese del tratamiento. Esto sugiere que todas las celulas tumorales fueron inactivadas durante el tratamiento. Si bien se observo el re-crecimiento del tumor en el grupo con la dosis mas baja (grupo B, 34,2 mg/kg), se observo una clara actividad de estasis del tumor durante el periodo de tratamiento (Figura 16). El tumor solamente comenzo a crecer tras el cese del tratamiento (Figura 16). Este resultado indica que la actividad de estasis del tumor observada en el grupo B es en realidad una actividad inducida por el artfculo de prueba.
Tabla 6. Tabla con resumen de resultados
Grupo
Tratamiento CR TV (desviacion estandar media) Porcentaje de inhibicion del tumor Valor P€
A
Vefnculo 0 2882±2190 n/a n/a
B
34,2 mg/kg Comp I (HBr) 0 497±287 93% P<0,05
Grupo
Tratamiento CR TV (desviacion estandar media) Porcentaje de inhibicion del tumor Valor P€
C
114 mg/kg Comp I (HBr) 9 0 100% P<0,05
D
342 mg/kg Comp I (HBr) 8£ 0 100% P<0,05
E
1140 mg/kg Comp I (HBr) 6¥ 0 100% P<0,05
€ Analisis de varianza de una v^a (ANOVA) seguido de la prueba de comparacion multiple de Dunnett (software Prism version 5,02, Lake Forest, CA). £ 1 El animal fue sacrificado el dfa 36 debido a bajo peso corporal.
¥ 3 Los animales fueron sacrificados los dfas 7, 9 y 11, individualmente debido a bajo peso corporal.

Claims (36)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-iymetiy-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'- (morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida.
  2. 2. El compuesto segun la reivindicacion 1, que es un monohidrobromuro.
  3. 3. El compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicho compuesto es cristalino.
  4. 4. El compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto esta sustancialmente libre de impurezas.
  5. 5. El compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto es un solido cristalino sustancialmente libre de hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida amorfo.
  6. 6. Una composicion farmaceutica que comprende el compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, y un vehuculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  7. 7. Un metodo para preparar el compuesto segun la reivindicacion 1, que comprende combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo- 1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3- carboxamida con acido bromhidrico.
  8. 8. El polimorfo A del hidrobromuro de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-iymetiy-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4- il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida.
  9. 9. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene uno o mas picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados y aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados 2-teta.
  10. 10. El polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 17,5 +/- 0,3 grados y aproximadamente 22,0 +/- 0,3 grados 2-teta.
  11. 11. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene uno o mas picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, aproximadamente 14,3 +/- 0,3 grados, aproximadamente 18,7 +/- 0,3 grados, aproximadamente 23,3 +/- 0,3 grados y aproximadamente 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  12. 12. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 5 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
  13. 10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  14. 13. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 6 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
  15. 10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  16. 14. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 7 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
  17. 10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  18. 15. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 8 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
  19. 10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  20. 16. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 9 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
  21. 10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  22. 17. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene por lo menos 10 picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados,
  23. 10.1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  24. 18. El polimorfo segun la reivindicacion 8, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo que tiene picos caractensticos expresados en grados 2-teta a aproximadamente 3,9 +/- 0,3 grados, 10,1 +/- 0,3 grados, 14,3 +/- 0,3 grados, 17,5 +/- 0,3 grados, 18,7 +/- 0,3 grados, 20,6 +/- 0,3 grados, 20,9 +/- 0,3 grados, 21,8 +/- 0,3 grados, 22,0 +/- 0,3 grados, 23,3 +/- 0,3 grados y 23,6 +/- 0,3 grados 2-teta.
  25. 19. El polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-18, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo sustancialmente de acuerdo con la Figura 1.
  26. 20. El polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-19, en donde el polimorfo exhibe un patron de difraccion de rayos X por polvo sustancialmente de acuerdo con la Tabla 1.
  27. 21. El polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-20, en donde el polimorfo exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial que tiene un pico caractenstico expresado en unidades de °C a una temperatura de 255 +/- 5°C.
  28. 22. El polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-21, en donde el polimorfo exhibe un termograma de calorimetna de barrido diferencial sustancialmente de acuerdo con la Figura 3.
  29. 23. Un metodo para preparar el polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-22, que comprende
    combinar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-iljmetilj-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-
    (morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida con acido bromhHdrico.
  30. 24. Un metodo para recristalizar el polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-22, que comprende las siguientes etapas: (a) disolver el Polimorfo A en un primer disolvente, y (b) anadir un segundo disolvente, de modo tal que dicho polimorfo se recristalice.
  31. 25. El metodo segun la reivindicacion 24, en donde el primer disolvente es etanol, y el segundo disolvente es MTBE.
  32. 26. El metodo segun la reivindicacion 16, que comprende (a) disolver el Polimorfo A en etanol, (b) calentar la mezcla, (c) anadir MTBE a la mezcla, formar un precipitado que comprende dicho polimorfo, y filtrar el precipitado de modo tal que dicho polimorfo se recristalice.
  33. 27. Una composicion farmaceutica que comprende el polimorfo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8-22, y un vehuculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
  34. 28. Un compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, un polimorfo segun cualquiera de las reivindicaciones 8-22 o una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 6 o 27 para uso en un metodo para tratar el cancer.
  35. 29. Un compuesto, un polimorfo o una composicion farmaceutica para uso segun la reivindicacion 28, en donde el cancer es linfoma no Hodgkin, linfoma folicular (FL), linfoma difuso de celulas grandes B (DLBCL) o cancer de mama.
  36. 30. Un metodo para preparar N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-iljmetilj-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)- 4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida, que comprende someter a reaccion acido 5-(Etil(tetrahidro- 2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxflico (5) con una sal de 3-(aminometil)-4,6- dimetil-dihidro-piridin-2(1H)-ona.
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ES (3) ES2931316T3 (es)
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SI (2) SI3184523T1 (es)
WO (1) WO2013155317A1 (es)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3438B1 (ar) 2011-04-13 2019-10-20 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
WO2013075084A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Constellation Pharmaceuticals Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
US9085583B2 (en) 2012-02-10 2015-07-21 Constellation—Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
RU2658911C2 (ru) 2012-04-13 2018-06-26 Эпизайм, Инк. Солевая форма ингибитора гистон-метилтрансферазы ezh2 человека
WO2013155464A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
US9562041B2 (en) 2012-05-16 2017-02-07 Glaxosmithkline Llc Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
US10092572B2 (en) * 2012-10-15 2018-10-09 Epizyme, Inc. Substituted benzene compounds
NZ746054A (en) 2012-10-15 2020-07-31 Epizyme Inc Methods of treating cancer
WO2014151142A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
SG11201508203TA (en) 2013-04-30 2015-11-27 Glaxosmithkline Ip No 2 Ltd Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
US9556157B2 (en) 2013-07-10 2017-01-31 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
US9969716B2 (en) 2013-08-15 2018-05-15 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Indole derivatives as modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
EA038869B1 (ru) 2013-10-16 2021-10-29 Эпизим, Инк. Кристаллические формы гидрохлорида n-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2h-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамида, фармацевтические композиции на их основе и способы их применения
JP2016533364A (ja) * 2013-10-18 2016-10-27 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置する方法
US9738630B2 (en) 2013-11-19 2017-08-22 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of lysine methyl transferase
CN116019921A (zh) 2013-12-06 2023-04-28 Epizyme股份有限公司 用于治疗癌症的组合疗法
SG10201811128RA (en) 2014-06-17 2019-01-30 Epizyme Inc Ezh2 inhibitors for treating lymphoma
ES2725928T3 (es) 2014-06-20 2019-09-30 Constellation Pharmaceuticals Inc Formas cristalinas de 2-((4S)-6-(4-clorofenil)-1-metil-4H-benzo[c]isoxazolo[4,5-e]azepin-4-il)acetamida
JP2017532338A (ja) 2014-10-16 2017-11-02 エピザイム，インコーポレイティド 癌を治療する方法
ES2947819T3 (es) * 2014-11-17 2023-08-21 Epizyme Inc Método para el tratamiento del cáncer con N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
TW201636344A (zh) 2014-12-05 2016-10-16 美國禮來大藥廠 Ｅｚｈ２抑制劑
JP2018513865A (ja) 2015-04-20 2018-05-31 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置するための併用療法
JP6890097B2 (ja) 2015-06-10 2021-06-18 エピザイム，インコーポレイティド リンパ腫を処置するためのｅｚｈ２阻害剤
KR20180042356A (ko) 2015-08-24 2018-04-25 에피자임, 인코포레이티드 암 치료 방법
TW201718598A (zh) 2015-08-27 2017-06-01 美國禮來大藥廠 Ｅｚｈ２抑制劑
US10577350B2 (en) 2015-08-28 2020-03-03 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Crystalline forms of (R)-N-((4-methoxy-6-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyridin-3-yl)methyl)-2-methyl-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroethyl)piperidin-4-yl)ethyl)-1H-indole-3-carboxamide
JP2019503391A (ja) 2016-01-29 2019-02-07 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置するための併用療法
JP7121660B2 (ja) 2016-06-01 2022-08-18 エピザイム，インコーポレイティド 癌を処置するためのｅｚｈ２阻害剤の使用
EP3471830A4 (en) 2016-06-17 2020-02-26 Epizyme Inc EZH2 INHIBITORS TO TREAT CANCER
CN109843870A (zh) 2016-10-19 2019-06-04 星座制药公司 Ezh2抑制剂的合成
US11214561B2 (en) * 2017-01-25 2022-01-04 Ancureall Pharmaceutical (Shanghai) Co., Ltd. Histone methyltransferase EZH2 inhibitor, preparation method and pharmaceutical use thereof
WO2018183885A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
WO2018223030A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Epizyme, Inc. Use of ezh2 inhibitors for treating cancer
CA3074720A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
CA3104209A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Fondation Asile Des Aveugles Inhibition of prc2 subunits to treat eye disorders
KR20220066892A (ko) 2019-08-22 2022-05-24 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ｔ 세포 요법 및 제스트 동족체 2의 인핸서 (ｅｚｈ2) 억제제의 병용 요법 및 관련 방법
BR112022012258A2 (pt) * 2019-12-20 2022-08-30 Epizyme Inc Sal cristalino de bromidreto de um inibidor de ezh2, sua preparação e composição farmacêutica útil para o tratamento de câncer
WO2022208552A1 (en) * 2021-03-31 2022-10-06 Msn Laboratories Private Limited, R&D Center Crystalline forms of [1,1'-Biphenyl]-3-carboxamide, N-[(1,2-dihydro-4,6-dimethyl-2-oxo-3-pyridinyl)methyl]-5-[ethyl(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)amino]-4-methyl-4'-(4-morpholinylmethyl)-, hydrobromide (1:1) and process for its preparation thereof

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0733729A (ja) 1993-07-26 1995-02-03 Kirin Brewery Co Ltd Ｎ−シアノ−ｎ′−置換−アリールカルボキシイミダミド化合物の製造法
ATE180468T1 (de) 1993-12-27 1999-06-15 Eisai Co Ltd Anthranilsäure derivate
DE19516776A1 (de) 1995-05-10 1996-11-14 Boehringer Ingelheim Int Chromatin-Regulatorgene
US5741819A (en) 1995-06-07 1998-04-21 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Arylsulfonylaminobenzene derivatives and the use thereof as factor Xa inhibitors
JP3906935B2 (ja) 1995-12-18 2007-04-18 杏林製薬株式会社 Ｎ−置換ジオキソチアゾリジルベンズアミド誘導体及びその製造法
AU6060099A (en) 1998-09-30 2000-04-17 Procter & Gamble Company, The 2-substituted ketoamides
UA71587C2 (uk) 1998-11-10 2004-12-15 Шерінг Акцієнгезелльшафт Аміди антранілової кислоти та їхнє застосування як лікарських засобів
US6710058B2 (en) 2000-11-06 2004-03-23 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Monocyclic or bicyclic carbocycles and heterocycles as factor Xa inhibitors
TWI287004B (en) 2000-12-28 2007-09-21 Shionogi & Co A pyridone derivative having an affinity effect for cannabinoid 2 type receptor
US7700293B2 (en) 2001-08-02 2010-04-20 The Regents Of The University Of Michigan Expression profile of prostate cancer
TW200303304A (en) * 2002-02-18 2003-09-01 Astrazeneca Ab Chemical compounds
ES2333214T3 (es) 2002-02-19 2010-02-18 SHIONOGI &amp; CO., LTD. Antipruriticos.
TW200306155A (en) 2002-03-19 2003-11-16 Du Pont Benzamides and advantageous compositions thereof for use as fungicides
US7442685B2 (en) 2003-06-13 2008-10-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill DOT1 histone methyltransferases as a target for identifying therapeutic agents for leukemia
JP2007531757A (ja) * 2004-03-30 2007-11-08 カイロン コーポレイション 抗癌剤としての置換チオフェン誘導体
JP5160885B2 (ja) 2004-06-01 2013-03-13 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 再構成ヒストンメチルトランスフェラーゼ複合体及びそのモジュレーターの識別方法
JO2787B1 (en) 2005-04-27 2014-03-15 امجين إنك, Alternative amide derivatives and methods of use
WO2006130720A2 (en) 2005-06-02 2006-12-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Purification, characterization and reconstitution of a ubiquitin e3 ligase
FR2889526B1 (fr) 2005-08-04 2012-02-17 Aventis Pharma Sa 7-aza-indazoles substitues, compositions les contenant, procede de fabrication et utilisation
NZ593684A (en) 2005-10-19 2012-11-30 Gruenenthal Chemie Novel vanilloid receptor ligands and their use for producing medicaments
CN101291910A (zh) 2005-10-21 2008-10-22 默克公司 钾通道抑制剂
WO2007053480A2 (en) 2005-10-28 2007-05-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Protein demethylases comprising a jmjc domain
US8163749B2 (en) 2005-12-14 2012-04-24 Bristol-Myers Squibb Company Six-membered heterocycles useful as serine protease inhibitors
US8524467B2 (en) 2006-01-20 2013-09-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Diagnostic and therapeutic targets for leukemia
KR20080110905A (ko) 2006-05-15 2008-12-19 아이알엠 엘엘씨 테레프탈라메이트 화합물 및 조성물, 및 ｈｉｖ 인테그라제억제제로서의 그들의 용도
WO2007136592A2 (en) 2006-05-18 2007-11-29 Amphora Discovery Corporation 2-0x0-l,2-dihydr0quin0line derivatives, compositions, and uses thereof as antiproliferative agents
WO2008108825A2 (en) 2006-10-10 2008-09-12 Burnham Institute For Medical Research Neuroprotective compositions and methods
MX2009008531A (es) 2007-02-16 2009-08-26 Amgen Inc Cetonas de heterociclilo que contienen nitrogeno y su uso como inhibidores de c-met.
WO2008104077A1 (en) 2007-02-28 2008-09-04 Methylgene Inc. Small molecule inhibitors of protein arginine methyltransferases (prmts)
WO2008113006A1 (en) 2007-03-14 2008-09-18 Xenon Pharmaceuticals Inc. Methods of using quinolinone compounds in treating sodium channel-mediated diseases or conditions
DE102007017884A1 (de) 2007-04-13 2008-10-16 Grünethal GmbH Neue Vanilloid-Rezeptor Liganden und ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln
US20090012031A1 (en) 2007-07-03 2009-01-08 The Regents Of The University Of Michigan EZH2 Cancer Markers
DE102007047737A1 (de) * 2007-10-05 2009-04-30 Merck Patent Gmbh Piperidin- und Piperazinderivate
AU2008319308B2 (en) 2007-10-31 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. P2X3, receptor antagonists for treatment of pain
WO2009077766A1 (en) 2007-12-19 2009-06-25 Cancer Research Technology Limited Pyrido[2,3-b]pyrazine-8-substituted compounds and their use
WO2009124137A2 (en) 2008-04-01 2009-10-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Method of suppressing gene transcription through histone lysine methylation
US20100113415A1 (en) 2008-05-29 2010-05-06 Rajapakse Hemaka A Epha4 rtk inhibitors for treatment of neurological and neurodegenerative disorders and cancer
AU2009279616A1 (en) 2008-08-08 2010-02-11 New York Blood Center Small molecule inhibitors of retroviral assembly and maturation
FR2934995B1 (fr) 2008-08-14 2010-08-27 Sanofi Aventis Composes d'azetidines polysubstitues, leur preparation et leur application en therapeutique
WO2010111653A2 (en) 2009-03-27 2010-09-30 The Uab Research Foundation Modulating ires-mediated translation
WO2011011366A2 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Constellation Pharmaceuticals Agents for stimulating activity of methyl modifying enzymes and methods of use thereof
CA2784899A1 (en) 2009-12-30 2011-07-07 Avon Products, Inc. Topical lightening composition and uses thereof
ES2528269T3 (es) * 2010-05-07 2015-02-06 Glaxosmithkline Llc Azaindazoles
WO2011140325A1 (en) 2010-05-07 2011-11-10 Glaxosmithkline Llc Indazoles
SI2566327T1 (sl) * 2010-05-07 2017-07-31 Glaxosmithkline Llc Indoli
KR102373074B1 (ko) 2010-09-10 2022-03-11 에피자임, 인코포레이티드 인간 ｅｚｈ2의 억제제 및 이의 사용 방법
US9175331B2 (en) 2010-09-10 2015-11-03 Epizyme, Inc. Inhibitors of human EZH2, and methods of use thereof
US20130310379A1 (en) 2010-11-19 2013-11-21 Constellation Pharmaceuticals Modulators of methyl modifying enzymes, compositions and uses thereof
JP5908493B2 (ja) 2010-12-01 2016-04-26 グラクソスミスクライン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＬＬＣ インドール
AU2011336272A1 (en) 2010-12-03 2013-06-20 Epizyme, Inc. 7-deazapurine modulators of histone methyltransferase, and methods of use thereof
WO2012118812A2 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Epizyme, Inc. Substituted 6,5-fused bicyclic heteroaryl compounds
TWI598336B (zh) 2011-04-13 2017-09-11 雅酶股份有限公司 經取代之苯化合物
JO3438B1 (ar) 2011-04-13 2019-10-20 Epizyme Inc مركبات بنزين مستبدلة بأريل أو أريل غير متجانس
KR102587175B1 (ko) 2012-03-12 2023-10-06 에피자임, 인코포레이티드 인간 ｅｚｈ2의 억제제 및 이의 사용 방법
RU2658911C2 (ru) 2012-04-13 2018-06-26 Эпизайм, Инк. Солевая форма ингибитора гистон-метилтрансферазы ezh2 человека
WO2013155464A1 (en) 2012-04-13 2013-10-17 Epizyme, Inc. Combination therapy for treating cancer
US9562041B2 (en) 2012-05-16 2017-02-07 Glaxosmithkline Llc Enhancer of zeste homolog 2 inhibitors
NZ746054A (en) 2012-10-15 2020-07-31 Epizyme Inc Methods of treating cancer
EA038869B1 (ru) 2013-10-16 2021-10-29 Эпизим, Инк. Кристаллические формы гидрохлорида n-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2h-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамида, фармацевтические композиции на их основе и способы их применения

Also Published As

Publication number Publication date
KR102120883B1 (ko) 2020-06-09
CA2870005C (en) 2021-06-22
ES2745016T3 (es) 2020-02-27
BR112014025508B1 (pt) 2020-11-17
CA2870005A1 (en) 2013-10-17
EP2836491B1 (en) 2016-12-07
AU2013245878A1 (en) 2014-10-30
PL3628670T3 (pl) 2023-02-20
EP3184523B1 (en) 2019-06-19
CN108358899A (zh) 2018-08-03
US10821113B2 (en) 2020-11-03
IL282732B (en) 2022-12-01
US20210137936A1 (en) 2021-05-13
AU2018200168A1 (en) 2018-02-01
EP4190777A1 (en) 2023-06-07
US11491163B2 (en) 2022-11-08
JP6255382B2 (ja) 2017-12-27
HUE045353T2 (hu) 2019-12-30
US9872862B2 (en) 2018-01-23
IL266165B (en) 2021-06-30
PT3184523T (pt) 2019-09-26
KR102438340B1 (ko) 2022-08-30
US20190269692A1 (en) 2019-09-05
LT2836491T (lt) 2017-03-27
RS55690B1 (sr) 2017-07-31
SI2836491T1 (sl) 2017-06-30
SG11201406468YA (en) 2015-01-29
DK2836491T3 (en) 2017-03-06
MX362339B (es) 2019-01-11
JP6634058B2 (ja) 2020-01-22
ES2931316T3 (es) 2022-12-28
PL2836491T3 (pl) 2017-08-31
DK3628670T3 (da) 2022-12-05
JP2018002742A (ja) 2018-01-11
HUE031976T2 (en) 2017-08-28
CN104603130B (zh) 2018-04-27
KR20150002730A (ko) 2015-01-07
AU2018200168B2 (en) 2019-08-29
IL235045B (en) 2019-05-30
RU2014145544A (ru) 2016-06-10
MX2014012380A (es) 2015-07-23
US10245269B2 (en) 2019-04-02
DK3184523T3 (da) 2019-08-19
CY1122883T1 (el) 2022-03-24
US20170143729A1 (en) 2017-05-25
WO2013155317A1 (en) 2013-10-17
IL282732A (en) 2021-06-30
IL282732B2 (en) 2023-04-01
HUE060881T2 (hu) 2023-04-28
NZ700761A (en) 2016-09-30
AU2013245878B2 (en) 2017-10-12
PT3628670T (pt) 2022-12-02
US20150065503A1 (en) 2015-03-05
EP2836491A1 (en) 2015-02-18
IL266165A (en) 2019-06-30
SG10201608577RA (en) 2016-12-29
RS59392B1 (sr) 2019-11-29
US9394283B2 (en) 2016-07-19
EP3628670A1 (en) 2020-04-01
HRP20191653T1 (hr) 2020-02-21
JP2018199740A (ja) 2018-12-20
SG10201912109QA (en) 2020-02-27
IL235045A0 (en) 2014-12-31
IN2014DN09068A (es) 2015-05-22
PT2836491T (pt) 2017-02-08
KR20200066380A (ko) 2020-06-09
KR20220123339A (ko) 2022-09-06
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