ES2602474T3

ES2602474T3 - Angiogénesis que usa células madre placentarias

Info

Publication number: ES2602474T3
Application number: ES11766619.8T
Authority: ES
Inventors: Stewart Abbot; James Edinger; Aleksander Francki; Robert J. Hariri; Vladimir Jankovic; Aleksandr Kaplunovsky; Kristen Labazzo; Eric Law; Neerav Padliya; Jennifer Paredes; Jia-Lun Wang
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2010-04-07
Filing date: 2011-04-06
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2031-04-06
Also published as: KR20230054905A; AU2011237747A1; HUE029144T2; JP2016192966A; CY1118105T1; JP2022160449A; EP3088512B1; MX2012011542A; PL2556145T3; ZA201606733B; TW202011974A; SI2556145T1; US20180071343A1; KR101993254B1; KR20220015489A; SMT201600377B; KR20210029310A; JP2021006041A; IL222321A0; TW201902496A

Abstract

Una población de células adherentes derivadas de la placenta que son CD10+, CD34-, CD105+, y CD200+, como se determina por citometría de flujo, para su uso en un método para el tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, en donde dicha enfermedad o trastorno del sistema circulatorio es la enfermedad vascular periférica, enfermedad arterial periférica, úlcera diabética o isquemia crítica periférica.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

"placenta" incluye el cordón umbilical. Las células placentarias aisladas descritas en este documento, en ciertas realizaciones, se diferencian in vitro en condiciones de diferenciación, se diferencian in vivo, o ambos.

Tal como se usa en el presente documento, una célula de placenta es "positiva" para un marcador particular cuando ese marcador es detectable por encima de la línea de fondo. La detección de un marcador particular puede, por ejemplo, llevarse a cabo ya sea mediante el uso de anticuerpos, o por sondas de oligonucleótidos o cebadores basados en la secuencia del gen o ARNm que codifica el marcador. Por ejemplo, una célula de placenta es positiva para, por ejemplo, CD73 porque CD73 es detectable en células de la placenta en una cantidad mayor de forma detectable que la línea de fondo (en comparación con, por ejemplo, un control de isotipo). Una célula también es positiva para un marcador cuando ese marcador se puede utilizar para distinguir la célula de al menos otro tipo de células, o se puede utilizar para seleccionar o aislar la célula cuando está presente o se expresa por la célula. En el contexto de, por ejemplo, la detección mediada por anticuerpos, "positiva", cuando una indicación de un marcador de superficie celular particular está presente, significa que el marcador es detectable usando un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo marcado fluorescentemente, específico para ese marcador; "positiva" también se refiere a una célula que presenta el marcador en una cantidad que produce una señal, por ejemplo, en un citómetro, que es detectable por encima de la línea de fondo. Por ejemplo, una célula es "CD200+", cuando la célula es marcada de manera detectable con un anticuerpo específico frente a CD200, y la señal del anticuerpo es detectablemente más alta que la de un control (por ejemplo, la línea de fondo o un control de isotipo). A la inversa, "negativa" en el mismo contexto significa que el marcador de superficie celular no es detectable utilizando un anticuerpo específico para ese marcador comparado con un control (por ejemplo, la línea de fondo o un control de isotipo). Por ejemplo, una célula es "CD34-", cuando la célula no está marcada de manera reproducible y detectable con un anticuerpo específico para CD34 en un grado mayor que un control (por ejemplo, la línea de fondo o un control de isotipo). Los marcadores no detectados, o no detectables, usando anticuerpos se determinan que son positivos o negativos de una manera similar, usando un control apropiado. Por ejemplo, una célula o población de células se puede determinar que es OCT-4+ si la cantidad de ARN de OCT-4 detectado en el ARN de la célula o la población de células es de forma detectable mayor que el fondo tal como se determina, por ejemplo, por un método de detección de ARN tal como RT-PCR, transferencias de ranura, etc. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, se detectan los marcadores de grupo de diferenciación ("CD") usando anticuerpos. En ciertas realizaciones, OCT-4 se determinado que está presente, y una célula es "OCT-4+" si OCT-4 es detectable mediante RT-PCR.

Tal como se usa en el presente documento, la designación "bajo", cuando se refiere a la expresión de un marcador detectable en citometría de flujo, significa que el marcador se expresa en menos del 10% de células analizadas, o que la fluorescencia atribuible al marcador en, por ejemplo, citometría de flujo, está a menos de 1 log por encima de la línea de fondo.

Como se usa en el presente documento, "tratar" abarca la remediación, la mejora, disminución de la gravedad, o la reducción en el transcurso del tiempo de una enfermedad, un trastorno o una afección, o cualquier parámetro o síntoma de la misma.

4. Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secreción de proteínas angiogénicas seleccionadas por las células adherentes derivadas de la placenta.

La figura 2 muestra el efecto angiogénico de medio acondicionado de células adherentes derivadas de la placenta en la formación del tubo de células endoteliales humanas (HUVEC).

La figura 3 muestra el efecto angiogénico de medio acondicionado de células adherentes derivadas de la placenta sobre la migración de células endoteliales humanas.

La figura 4 muestra el efecto del medio acondicionado de células adherentes derivadas placentarias sobre la proliferación de células endoteliales humanas.

La figura 5 muestra la formación de tubos de HUVEC y las células adherentes derivadas de la placenta.

La figura 6 muestra la secreción de VEGF y de IL-8 por células adherentes derivadas de la placenta bajo condiciones hipóxicas y de normoxia.

La figura 7 muestra el efecto positivo de PDAC sobre la angiogénesis en modelo de angiogénesis de membrana corioalantoidea de pollo. bFGF: factor de crecimiento de fibroblastos básico (control positivo). MDAMB231: línea celular de cáncer de mama angiogénico (control positivo). Eje Y: grado de formación de vasos sanguíneos.

La figura 8 muestra el efecto positivo de medio acondicionado PDAC (sobrenadantes) sobre la angiogénesis en un modelo de angiogénesis de corioalantoides de pollo. bFGF: factor de crecimiento de fibroblastos básico (control positivo). MDAMB231: línea celular de cáncer de mama angiogénico (control positivo). Eje Y: grado de formación de vasos sanguíneos.

9 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Figura 9: Especies reactivas de oxígeno generadas por peróxido de hidrógeno presentes en cultivos de astrocitos, o co-cultivos de astrocitos y PDAC. Actividad ROS RFU: unidades de fluorescencia relativa de las especies reactivas de oxígeno.

5. Descripción detallada

La presente invención proporciona una población de células adherentes derivadas de la placenta que son CD10+, CD34-, CD05+, y CD200+, como se determina por citometria de flujo, para uso en un método para el tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, en donde enfermedad o trastorno del sistema circulatorio es una enfermedad vascular periférica, enfermedad arterial periférica, úlcera diabética o isquemia periférica crítica.

De acuerdo con la presente invención, los síntomas de dicha enfermedad vascular periférica son frio, hormigueo en pies que se vuelven rojos al colgarlos; dolor; o debilidad y cansancio en las piernas. Además, de acuerdo con la presente invención, los síntomas de dicha isquemia periférica crítica son dolor de reposo isquémico; dolor severo en las piernas y pies mientras el individuo no está en movimiento; llagas que no sanan en los pies o las piernas; dolor o entumecimiento en los pies; piel brillante, suave, seca de las piernas o pies; engrosamiento de las uñas de los pies; pulso ausente o bajo en las piernas o los pies; llagas abiertas; infecciones de la piel o úlceras que no sanan; o gangrena seca de las piernas o los pies.

De acuerdo con la presente invención, las células adherentes derivadas de la placenta son además una o más de CD45-, o CD90+, como se detecta por citometría de flujo. Además, de acuerdo con la presente invención, las células adherentes derivadas de la placenta son además OCT-4+, como se detecta por RT-PCR.

De acuerdo con la presente invención, las células adherentes derivadas de la placenta son administradas intravenosamente, intra-arterialmente, intramuscularmente, intradérmicamente, o subcutáneamente. Además, de acuerdo con la presente invención, aproximadamente 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, o x 1010 de dichas células adherentes derivadas de la placenta son administradas.

5.1 Angiogénesis y tratamiento de enfermedades o estados asociados o resultantes de la mala circulación sanguínea

En el presente documento se proporcionan, para uso en métodos de tratamiento de enfermedades o trastornos del sistema circulatorio en donde dicha enfermedad o trastorno del sistema circulatorio es la enfermedad vascular periférica, enfermedad arterial periférica, úlcera diabética o isquémica periférica crítica, células de la placenta adherentes al plástico de cultivo de tejidos, por ejemplo, PDAC, como se describe en la Sección 5.2, más adelante. En ciertas realizaciones, las PDAC son angiogénicas. Las PDAC son capaces de apoyar el crecimiento de las células endoteliales y las poblaciones de células endoteliales, y las células epiteliales y las poblaciones de células epiteliales, tanto in vitro como in vivo.

5.1.1 Enfermedades del sistema circulatorio

Las PDAC, poblaciones de tales células, y las poblaciones de células que comprenden PDAC, proporcionadas en este documento pueden usarse para tratar a individuos que exhiben una variedad de estados o condiciones de enfermedad que se beneficiarían de un aumento de la angiogénesis. Ejemplos de tales estados o condiciones de enfermedad incluyen infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, úlcera diabética, úlcera de decúbito, úlceras venosas, úlceras arteriales, quemaduras, fractura de no unión, la osteoartritis y la reparación del hueso maxilofacial. Las PDAC, y las poblaciones de dichas células, pueden, en ciertas realizaciones, ser utilizadas para promover la angiogénesis en los individuos que presentan pérdida de tejido traumática, o para prevenir la formación de cicatrices, o en individuos que tienen reemplazo total de la articulación o prótesis dentales.

Más específicamente, las PDAC, y las poblaciones de dichas células, proporcionadas en este documento, se pueden utilizar para el tratamiento de un individuo que tiene una insuficiencia del sistema circulatorio, por ejemplo, un individuo que tiene enfermedad vascular periférica o enfermedad de la arteria coronaria.

Se describen en el presente documento métodos para tratar a un paciente con una enfermedad cardíaca o lesión comprende la administración de una composición celular terapéutica a un paciente con una enfermedad o lesión del corazón o el sistema circulatorio, y la evaluación del paciente para la mejora de la función cardiaca, en el que dicha composición celular comprende las PDAC como se describen en el presente documento. La enfermedad cardíaca puede ser una cardiomiopatía. La miocardiopatía puede ser o bien idiopática o una cardiomiopatía con una causa conocida. La cardiomiopatía es ya sea isquémica o no isquémica en la naturaleza. La enfermedad del corazón o del sistema circulatorio puede comprender una o más de angioplastia, aneurisma, angina (angina de pecho), estenosis aórtica, aortitis, arritmias, arterioesclerosis, arteritis, hipertrofia septal asimétrica (ASH), aterosclerosis, fibrilación auricular y aleteo, endocarditis bacteriana, síndrome de Barlow (prolapso de la válvula mitral), bradicardia, enfermedad de Buerger (tromboangiitis obliterante), cardiomegalia, cardiomiopatía, carditis, enfermedad de la arteria carótida, coartación de la aorta, enfermedades congénitas del corazón (defectos congénitos del corazón), insuficiencia cardíaca congestiva (insuficiencia cardíaca), enfermedad de la arteria coronaria, síndrome de

10 5

15

25

35

45

55

Eisenmenger, embolia, endocarditis, eritromialgia, fibrilación, displasia fibromuscular, bloqueo cardíaco, soplo cardíaco, hipertensión, hipotensión, calcificación arterial infantil idiopática, enfermedad de Kawasaki (síndrome mucocutáneo ganglionar, enfermedad del nódulo linfático mucocutáneo, poliarteritis infantil), síndrome metabólico, angina microvascular, infarto de miocardio (ataques al corazón), miocarditis, taquicardia auricular paroxística (PAT), periarteritis nodosa (poliarteritis, poliarteritis nodosa), pericarditis, enfermedad vascular periférica, isquemia crítica de las extremidades, vasculopatía diabética, flebitis, estenosis de la válvula pulmonar (estenosis pulmonar), enfermedad de Raynaud, estenosis de la arteria renal, hipertensión renovascular, cardiopatía reumática, defectos septales, isquemia silenciosa, síndrome X, taquicardia, arteritis de Takayasu, tetralogía de Fallot, transposición de los grandes vasos, atresia tricúspide, tronco arterial, enfermedad cardíaca valvular, úlceras varicosas, venas varicosas, vasculitis, defecto septal ventricular, síndrome de Wolff-Parkinson-White o defecto de relieve endocárdico.

Además, la enfermedad del corazón o del sistema circulatorio comprende una o más de fiebre reumática aguda, pericarditis reumática aguda, endocarditis reumática aguda, miocarditis reumática aguda, enfermedades del corazón reumáticas crónicas, enfermedades de la válvula mitral, estenosis mitral, insuficiencia mitral reumática, enfermedades de la válvula aórtica, enfermedades de otras estructuras endocárdicas, enfermedad cardiaca isquémica (subaguda y aguda), angina de pecho, enfermedades de la circulación pulmonar (enfermedad cardíaca pulmonar aguda, embolia pulmonar, enfermedades del corazón pulmonar crónica), enfermedad del corazón cifoescoliótica, miocarditis, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibroelastosis endocardial, bloqueo auriculoventricular, arritmias cardíacas, degeneración miocárdica, enfermedades del sistema circulatorio incluyendo la enfermedad cerebrovascular, la oclusión y estenosis de las arterias precerebrales, la oclusión de las arterias cerebrales, enfermedades de las arterias, arteriolas y capilares (aterosclerosis, aneurisma), o enfermedades de venas y vasos linfáticos.

El tratamiento de un individuo con una cardiomiopatía con una composición celular terapéutica que comprende PDAC puede ser ya sea con o sin otro tipo de célula. El individuo experimenta los beneficios de la terapia, por ejemplo la capacidad de las células de apoyar el crecimiento de otras células, incluyendo las células madre o células progenitoras presentes en el corazón, desde el crecimiento de tejido o la vascularización del tejido, y la presencia de factores beneficiosos celulares, quimiocinas, citocinas y similares, pero las células no se integran o se multiplican en el individuo. Alternativamente, el paciente se beneficia del tratamiento terapéutico con las células, pero las células no sobreviven durante un período prolongado en el paciente. Las células pueden disminuir gradualmente en número, viabilidad o actividad bioquímica. La disminución de las células puede ser precedida por un periodo de actividad, por ejemplo de crecimiento, división, o actividad bioquímica. Las células no viables, senescentes o incluso muertas son capaces de tener un efecto terapéutico beneficioso.

La mejora de un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, en el que al individuo se administra las PDAC o composiciones terapéuticas de la invención, se puede evaluar o demostrar por la mejora detectable en uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno del sistema circulatorio.

La mejora de un individuo que tiene una enfermedad o trastorno del sistema circulatorio, en el que al individuo se administra las PDAC o composiciones terapéuticas que comprenden las PDAC, se puede evaluar o demostrar por la mejora detectable en uno o más indicios de la función cardíaca, por ejemplo, la demostración de la mejora detectable en uno o más gasto cardíaco de pecho (CO), índice cardiaco (CI), presiones de enclavamiento de la arteria pulmonar (PAWP), y el índice cardíaco (CI), % de la fracción de acortamiento (% FS), la fracción de eyección (EF), la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI); diámetro diastólico del final ventricular izquierdo (LVEDD), diámetro de sístole del fin del ventrículo izquierdo (LVESD), la contractilidad (por ejemplo dP/dt), bucles presión-volumen, las mediciones del trabajo cardíaco, un aumento en el funcionamiento atrial o ventricular; un aumento en la eficiencia de bombeo, una disminución en la tasa de pérdida de la eficiencia de bombeo, una disminución de la pérdida del funcionamiento hemodinámico; y una disminución de las complicaciones asociadas con la cardiomiopatía, en comparación con el individuo antes de la administración de las PDAC.

La mejora en un individuo que recibe las PDAC, o composiciones terapéuticas que comprenden PDAC, proporcionada en este documento también se puede evaluar mediante indicadores subjetivos, por ejemplo, la autoevaluación del individuo acerca de su estado de salud después de la administración.

El éxito de la administración de las células no es, en ciertas realizaciones, en base a la supervivencia en el individuo de las PDAC administradas. El éxito es, en cambio, sobre la base de una o más indicios de la mejora en la salud cardíaca o circulatoria, como se señaló anteriormente. Por lo tanto, las células no necesitan integrarse y batir con el corazón del paciente, o en los vasos sanguíneos.

Las PDAC pueden inducirse para diferenciarse a lo largo de linaje mesenquimal, por ejemplo, hacia un fenotipo cardiomiogénico, angiogénico o vasculogénico, o en células, tales como miocitos, cardiomiocitos, células endoteliales, células miocárdicas, células epicárdicas, células endoteliales vasculares, células musculares lisas (por ejemplo, células vasculares del músculo liso).

La administración de PDAC, o las composiciones terapéuticas que comprenden tales células, a un individuo en necesidad del mismo, se puede lograr, por ejemplo, mediante el trasplante, la implantación (por ejemplo, de las propias células o las células como parte de una combinación de células de la matriz), inyección (por ejemplo,

11 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

directamente al sitio de la enfermedad o afección, por ejemplo, directamente a un sitio isquémico en el corazón de un individuo que ha sufrido un infarto de miocardio), la infusión, la entrega a través de catéter, o cualquier otro medio conocido en la técnica para proporcionar terapia celular.

En una realización, las composiciones de células terapéuticas se proporcionan a un individuo en necesidad del mismo, por ejemplo, por inyección en uno o más sitios en el individuo. Por ejemplo, las composiciones de células terapéuticas pueden ser proporcionadas por inyección intracardiaca, por ejemplo, a un área isquémica en el corazón. Alternativamente, se pueden inyectar las células en la superficie del corazón, en un área adyacente, o incluso en una zona más remota. En realizaciones preferidas, las células pueden alojarse en la zona enferma o lesionada.

A un individuo que tiene una enfermedad o condición del sistema vascular o coronario se le puede administrar PDAC en cualquier momento que las células sean terapéuticamente beneficiosas. En ciertas realizaciones, por ejemplo, las PDAC o composiciones terapéuticas de la invención se administran a las 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o a los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 días del infarto de miocardio. La administración proximal en el tiempo a un infarto de miocardio, por ejemplo, a los 1-3 ó 1-7 días, es preferible la administración distal en el tiempo, por ejemplo, después de 3 ó 7 días después de un infarto de miocardio. En otras realizaciones, las células o las composiciones terapéuticas de la invención se administran a las 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o a los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 días del diagnóstico inicial de la enfermedad o condición.

También se describen en este documento kits para uso en el tratamiento de un infarto de miocardio. Los kits proporcionan una composición celular terapéutica que comprende PDAC, que se pueden preparar en una forma farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, mediante la mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un aplicador, junto con instrucciones de uso. Idealmente, el kit se puede utilizar in situ, por ejemplo en un consultorio médico, o por un proveedor de servicios de emergencia para ser aplicado a un paciente diagnosticado como que ha tenido un infarto de miocardio o evento cardiaco similar.

En realizaciones específicas de los métodos de tratamiento, las PDAC se administran con células madre (es decir, células madre que no son PDAC), mioblastos, miocitos, cardiomioblastos, cardiomiocitos, o progenitores de mioblastos, miocitos, cardiomioblastos, y/o cardiomiocitos.

Las PDAC, por ejemplo, una composición terapéutica que comprende las células, pueden ser administradas a un paciente con una enfermedad del corazón o del sistema circulatorio; y la evaluación del paciente para la mejora de la función cardiaca, en el que la composición de células terapéutica se administra como un complejo de células de la matriz. En ciertas realizaciones, la matriz es una estructura, preferiblemente bioabsorbible, que comprende al menos las células.

Con este fin, las poblaciones de PDAC pueden ponerse en contacto con, por ejemplo, incubados o cultivados en presencia de uno o más factores que estimulan la diferenciación de células madre o progenitoras a lo largo de una vía cardiogénica, angiogénica, hemangiogénica, o vasculogénica. Tales factores incluyen, pero no se limitan a factores, tales como factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, productos celulares, agentes de desmetilación, y otros factores que se conocen ahora o más tarde determinados para estimular la diferenciación, por ejemplo de células madre, a lo largo de vías o linajes cardiogénicos, angiogénicos, hemangiogénicos, o vasculogénicos.

Las PDAC pueden diferenciarse a lo largo de vías o linajes cardiogénicos, angiogénicos, hemangiogénicos, o vasculogénicos in vitro por el cultivo de las células en presencia de factores que comprenden al menos uno de un agente de desmetilación, una BMP (proteína morfogenética ósea), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), la proteína del factor Wnt, la proteína Hedgehog, y/o un factor anti-Wnt.

La inclusión de agentes de desmetilación tiende a promover la diferenciación de PDAC a lo largo de las líneas mesenquimales, hacia una vía cardiomiogénica. La diferenciación se puede determinar mediante, por ejemplo, la expresión de al menos uno de cardiomiosina, miosina esquelética, o GATA4, por ejemplo, tal como se determina por inmunotinción o RT-PCR; o mediante la adquisición de un ritmo de latido, espontáneo o inducido de otro modo; o por la capacidad de integrarse por lo menos parcialmente en el músculo cardiaco de un individuo sin inducir arritmias. Los agentes de desmetilación que se pueden utilizar para iniciar dicha diferenciación incluyen, pero no se limitan a, 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, dimetilsulfóxido, cloruro de queleritrina, ácido retinoico o sales de los mismos, ácido 2-amino-4-(etiltio)butírico, procainamida, y/o procaína.

Las PDAC puestas en contacto con uno o más factores identificados anteriormente pueden convertirse en células cardiomiogénicas, angiogénicas, hemangiogénicas, o vasculogénicas, o progenitores. Preferiblemente, al menos algunas de las células se integran al menos parcialmente en un sistema cardiovascular del receptor incluyendo, pero no limitado a músculo cardíaco, vascular y otras estructuras del corazón, los vasos sanguíneos cardíacos o periféricos, y similares. En ciertas realizaciones, las PDAC diferenciadas se diferencian en células que presentan dos o más características de las células cardiomiogénicas o sus progenitores, y son capaces de integrarse total o parcialmente en el corazón o la vasculatura de un destinatario. En realizaciones específicas, las células, cuando se

12 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

administran a un individuo, dan lugar a ningún aumento de arritmias, defectos del corazón, defectos de los vasos sanguíneos u otras anomalías del sistema circulatorio del individuo o su salud. En ciertas realizaciones, las PDAC actúan para promover la diferenciación de las células madre presentes de forma natural en el músculo cardíaco del paciente, vasos sanguíneos, sangre, o similares, se diferencian en sí mismas en, por ejemplo, cardiomiocitos, o al menos a lo largo de líneas cardiomiogénicas, angiogénicas, hemangiogénicas o vasculogénicas.

Las PDAC, y las poblaciones de tales células, se pueden proporcionar terapéuticamente o profilácticamente a un individuo, por ejemplo, un individuo que tiene una enfermedad, trastorno o condición o que afecte al corazón o al sistema circulatorio. Dichas enfermedades, trastornos o condiciones pueden incluir la insuficiencia cardíaca congestiva debido a aterosclerosis, cardiomiopatía, o lesión cardiaca, por ejemplo, una lesión isquémica, tal como de infarto de miocardio o de herida (aguda o crónica).

En ciertas realizaciones, al individuo se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de PDAC, por ejemplo, en una población de células que comprende las PDAC. En una realización específica, la población comprende aproximadamente 50% de PDAC. En otra realización específica, la población es una población sustancialmente homogénea de PDAC. En otras realizaciones la población comprende al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% , 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% o 99% de PDAC.

Las PDAC se pueden administrar a un individuo en forma de una composición terapéutica que comprende las células y otro agente terapéutico, tal como el factor de crecimiento tipo insulina (IGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), la interleuquina 18 (IL-8), un agente antitrombogénico (por ejemplo, heparina, derivados de heparina, uroquinasa, o PPack (dextrofenilalanina prolina arginina clorometilcetona), un compuesto de la antitrombina, un antagonista del receptor de plaquetas, un anticuerpo anti-trombina, un anticuerpo del receptor antiplaquetario, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, un inhibidor de la prostaglandina, y/o un inhibidor de plaquetas), un agente antiapoptótico (por ejemplo, la eritropoyetina (Epo), un análogo o derivado de Epo, o sus sales, trombopoyetina (TPO), IGF-I, IGF-II, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o un inhibidor de la caspasa), un agente anti-inflamatorio (por ejemplo, un inhibidor de la quinasa MAP p38, una estatina, un inhibidor de IL-6, un inhibidor de IL-1, pemirolast, tranilast, Remicade, Sirolimus, y o un compuesto anti-inflamatorio no esteroideo (por ejemplo, ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, Tepoxalin, tolmetina, o Suprofen)), un agente inmunosupresor o inmunomodulador (por ejemplo, un inhibidor de calcineurina, por ejemplo ciclosporina, tacrolimus, una inhibidor de mTOR tal como sirolimus o everolimus; un antiproliferativo tal como la azatioprina y/o micofenolato de mofetilo; un corticosteroide, por ejemplo, prednisolona o hidrocortisona; un anticuerpo tal como un anticuerpo del receptor monoclonal anti-IL-2R, Basiliximab, Daclizuma, anticuerpos policlonales anti-células T tales como anti-timocitos globulina (ATG), anti-linfocitos globulina (ALG), y/o el anticuerpo monoclonal OKT3 anti-células T, o células madre de la placenta adherentes como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 7.468.276, y la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. de publicación 2007/ 0275362), y/o un antioxidante (por ejemplo, probucol; vitaminas A, C, y/o E, coenzima Q-10, el glutatión, L cisteína, N acetilcisteína, o un derivado antioxidante, análogo o sal de cualquiera de los anteriores). En ciertas realizaciones, las composiciones terapéuticas que comprenden las PDAC comprenden además uno o más tipos de células, por ejemplo, células adultas (por ejemplo, fibroblastos o células endodérmicas), células madre y/o células progenitoras. Dichos agentes terapéuticos y/o uno o más tipos de células se pueden administrar a un individuo en necesidad de los mismos de forma individual o en combinaciones, o dos o más de tales compuestos o agentes.

En ciertas realizaciones, el individuo a tratar es un mamífero. En una realización específica el individuo a ser tratado es un ser humano. En realizaciones específicas, el individuo es un animal de ganado o un animal doméstico. En otras realizaciones específicas, el individuo a tratar es un caballo, oveja, vaca o buey, cerdo, perro o gato.

5.1.2 Tratamiento de enfermedad isquémica

Se proporcionan en este documento las PDAC de la invención para uso en un método de tratamiento de un individuo que tiene una alteración del flujo de sangre, por ejemplo, en la vasculatura periférica, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de PDAC. En ciertas realizaciones específicas, la isquemia es la enfermedad arterial periférica (PAD), por ejemplo, es isquemia crítica de las extremidades (CLI). En ciertas otras realizaciones, la isquemia es la enfermedad vascular periférica (PVD).

En una realización específica, dicha disrupción del flujo de la sangre es la isquemia crítica de las extremidades. En otra realización más específica, dicha CLI es una obstrucción severa de las arterias de las extremidades inferiores, lo que reduce notablemente el flujo de sangre. En otra realización más específica, dicha CLI se caracteriza por dolor isquémico en reposo, dolor severo en las piernas y los pies, mientras que el individuo no está en movimiento, úlceras que no cicatrizan en los pies o en las piernas, dolor o entumecimiento en los pies, piel brillante, lisa y seca de las piernas o los pies, engrosamiento de las uñas de los pies, pulso ausente o disminuido en las piernas o los pies, llagas abiertas, infecciones de la piel o úlceras que no cicatrizan, y/o gangrena seca (piel negra seca) de las piernas o los pies. En otra realización específica, el individuo que tiene CLI ha experimentado pérdida de al menos un dedo y/o extremidad conjunta. En otra realización específica del método, dicha cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de PDAC que resulta en la eliminación, una mejora detectable, disminución de la gravedad, o ralentización de la progresión de uno o más síntomas de la pérdida de la función del miembro y/o privación de

13

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12

5

15

25

35

45

55

En otra realización, una población de células útiles en los métodos y composiciones descritas en el presente documento es una población de células que comprende, por ejemplo, que está enriquecida en células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ y HLA-G-. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de células en dicha población de las células son células placentarias aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-. En otra realización, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% o de células en dicha población de células son células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-. En una realización específica de las poblaciones anteriores, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-son, además, CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-son, además, CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-son, además, OCT-4+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-son, además, CD200+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+, HLA-G-son, además, CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realización específica, dicha población celular se aísla lejos de las células placentarias que no son células de la placenta CD73+, CD105+, HLA-G-. En otra realización específica, la población de células se aísla lejos de células de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realización, las células placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento son CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos tipo embrionarios en una población de células de la placenta aisladas que comprende dichas células CD73+, CD105+ cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos tipo embrionarios. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, OCT-4+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, OCT-4+, CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ se aíslan lejos de células de la placenta que no son dichas células. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas CD73+, CD105+ son aisladas lejos de las células placentarias que no muestran estas características.

En otra realización, una población de células útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una población de células que comprende, por ejemplo, que está enriquecida en células de la placenta aisladas que son CD73+, CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos tipo embrionarios en una población de células placentarias aisladas que comprenden dichas células cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos tipo embrionarios. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de las células aisladas son dichas células de la placenta CD73+, CD105+. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+. En otra realización, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de células en dicha población de células son dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+. En una realización específica de las poblaciones anteriores, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, OCT-4+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, CD200+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+ son, además, CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realización específica, la población de células se aísla lejos de dichas células de la placenta que no son dichas células de la placenta aisladas CD73+, CD105+. En otra realización específica, la población de células se aísla lejos de las células de la placenta que no muestran estos marcadores.

En otra realización, las células placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento son OCT-4+ y facilitan la formación de una o más cuerpos tipo embrionarios en una población de células de la placenta aisladas que comprende dichas células cuando se cultivan en condiciones que permiten la formación de cuerpos tipo embrionarios. En una realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD34-, CD38-, o CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD200+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son aisladas lejos de las células placentarias que no son células de la placenta OCT-4+. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas OCT-4+ son aisladas lejos de las células placentarias que no muestran estas características.

En otra realización, una población de células útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una población de células que comprende, por ejemplo, que está enriquecida en células de la placenta aisladas que son OCT-4+ y facilitan la formación de una o más cuerpos tipo embrionarios en una población de células placentarias aisladas que comprenden dichas células cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos tipo embrionarios. En diversas realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al

19 5

15

25

35

45

55

menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de células en dicha población de las células aisladas son dichas células de la placenta OCT-4+. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichas células de la placenta aisladas OCT-4+. En otra realización, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99% de células en dicha población de células son dichas células de la placenta aisladas OCT-4+. En una realización específica de las poblaciones anteriores, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD34-, CD38-o CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD34-, CD38-y CD45-. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT4+ son, además, CD200+. En otra realización específica, dichas células de la placenta aisladas OCT-4+ son, además, CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38-, y CD45-. En otra realización específica, la población de células se aísla lejos de células de la placenta que no son dichas células. En otra realización específica, dicha población de células se aísla lejos de las células placentarias que no muestran estos marcadores.

En otra realización, las células placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritos en este documento son células de la placenta aisladas HLA-A,B,C+, CD45-, CD133-y CD34-. En otra realización, una población de células útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una población de células que comprende células de la placenta aisladas, en el que al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población aislada de células son células de la placenta aisladas, HLA-A,B,C+, CD45-, CD133-y CD34-. En una realización específica, dicha célula placentaria aislada o población de células placentarias aisladas se aísla lejos de células de la placenta que no son células de la placenta HLA-A,B,C+, CD45-, CD133-y CD34-. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En otra realización específica, dicha población aislada de células de la placenta están sustancialmente libres de componentes maternos; por ejemplo, al menos aproximadamente 40%, 45%, 5-0%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población aislada de células de la placenta no son de origen materno.

En otra realización, las células placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritos en este documento son células de la placenta aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117-y CD133-. En otra realización, una población de células útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una población de células que comprende células de la placenta aisladas, en el que al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son células de la placenta aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117-y CD133-. En una realización específica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aísla lejos de las células de la placenta que no son dichas células de la placenta aisladas. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117-y CD133 -no son de origen materno, es decir, tienen el genotipo fetal. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población aislada de células de la placenta, no son de origen materno. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas son aisladas lejos de las células placentarias que no muestran estas características.

En otra realización, las células placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento son células de la placenta aisladas CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, y CD117-. En otra realización, una población de células útiles para los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una población de células que comprende, por ejemplo, están enriquecidos en células de la placenta aisladas, en el que al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son células de la placenta aisladas CD10-, CD33-, CD44+, CD45-, y CD117-. En una realización específica, dicha célula placentaria aislada o población de células placentarias aisladas se aísla lejos de las células de la placenta que no son dichas células. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células son de origen no materno. En otra realización específica, dicha célula placentaria aislada o población de células placentarias aisladas se aísla lejos de las células placentarias que no muestran estos marcadores.

En otra realización, las células placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritos en el presente documento son células de la placenta aisladas CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117-. En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una población de células que comprende, por ejemplo, están enriquecida en células de la placenta aisladas CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117-, en el que al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población son células de la placenta CD10-, CD13-, CD33-, CD45-, y CD117-. En una realización específica, dichas células placentarias aisladas o población de células placentarias aisladas se aíslan lejos de las células de la placenta que no son dichas células. En otra realización específica, dichas células placentarias aisladas no son de origen materno. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,

20

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

deseado de la angiogénesis se acopla covalentemente a perlas teñidas internamente. Las perlas acopladas se dejan reaccionar con una muestra que contiene la diana de la angiogénesis. Después de una serie de lavados para eliminar la proteína no unida, se añade un anticuerpo de detección biotinilado específico para un epítopo diferente a la reacción. El resultado es la formación de un sándwich de anticuerpos alrededor del objetivo de la angiogénesis. A 5 continuación se añade estreptavidina-PE que se unen a los anticuerpos de detección biotinilados en la superficie de la perla. En resumen, los ensayos Multiplex se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se evaluó la cantidad de los respectivos factores de crecimiento angiogénicos en los medios acondicionados.

ELISA: Análisis cuantitativo de citocinas angiogénicas individuales/factores de crecimiento en el medio condicionado por células se llevó a cabo utilizando kits disponibles comercialmente de R & D Systems (Minneapolis, MN). En

10 breve, los ensayos de ELISA se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se evaluó la cantidad de los respectivos factores de crecimiento angiogénicos en el medio acondicionado.

El nivel de secreción de diversas proteínas angiogénicas por PDAC se muestra en la figura. 1.

Tabla 1 Multiplex y resultados de ELISA para los marcadores angiogénicos

Marcador PDAC: Positivo Negativo Secretoma Análisis ELISA, Multiplex

ANG: X X

EGF: X X

ENA-78: X X

FGF2: X X

Folistatina: X X

G-CSF: X X

GRO: X X

HGF: X X

IL-6: X X

IL-8: X X

Leptina: X X

MCP-1: X X

MCP-3: X X

PDGFB: X X

PLGF: X X

Rantes: X X

TGFB1: X X

Trombopoyetina: X X

TIMP1: X X

TIMP2: X X

Upar: X X

VEGF: X X

VEGFD: X X

49

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

imagen47

Claims

imagen1